特開 2024-55622 デハロコッコイデス属細菌の培養方法及び塩素化エチレン類の浄化方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024055622

(43)【公開日】2024-04-18

(54)【発明の名称】デハロコッコイデス属細菌の培養方法及び塩素化エチレン類の浄化方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20240411BHJP

   C02F 3/00 20230101ALI20240411BHJP

   C02F 3/34 20230101ALI20240411BHJP

   B09C 1/10 20060101ALI20240411BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

C12N1/20 F

C12N1/20 D

C02F3/00 G

C02F3/34 Z

B09C1/10 ZAB

【審査請求】未請求

【請求項の数】6

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022162703

(22)【出願日】2022-10-07

(71)【出願人】

【識別番号】507416805

【氏名又は名称】株式会社テクノスルガ・ラボ

(71)【出願人】

【識別番号】304021277

【氏名又は名称】国立大学法人 名古屋工業大学

(71)【出願人】

【識別番号】000003621

【氏名又は名称】株式会社竹中工務店

(74)【代理人】

【識別番号】100205914

【弁理士】

【氏名又は名称】堀越 総明

(74)【代理人】

【識別番号】100162189

【弁理士】

【氏名又は名称】堀越 真弓

(72)【発明者】

【氏名】吉田 奈央子

(72)【発明者】

【氏名】山▲崎▼ 祐二

(72)【発明者】

【氏名】久田 貴義

【テーマコード（参考）】

4B065

4D004

4D040

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065BB02

4B065BB03

4B065BD50

4B065CA55

4D004AA41

4D004AB06

4D004AC07

4D004CA18

4D040DD03

4D040DD11

(57)【要約】

【課題】デハロコッコイデス属細菌をケグ様の金属製の耐圧培養容器を用いて培養する際に、安定的に大量培養できる方法を提供する。
【解決手段】本発明のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、金属製の耐圧培養容器を用いてデハロコッコイデス属細菌を培養する方法であって、デハロコッコイデス属細菌を、培養液中の（ａ）鉄含有イオンが１ｍＭ以下、（ｂ）クロム含有イオンが２３μＭ以下、及び（ｃ）ニッケル含有イオンが１．５ｍＭ以下、の濃度範囲を保持するように培養する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

金属製の耐圧培養容器を用いてデハロコッコイデス属細菌を培養する方法であって、
デハロコッコイデス属細菌を、培養液中の
（ａ）鉄含有イオンが１ｍＭ以下、
（ｂ）クロム含有イオンが２３μＭ以下、及び
（ｃ）ニッケル含有イオンが１．５ｍＭ以下、の濃度範囲を保持するように培養することを特徴とする、デハロコッコイデス属細菌の培養方法。

【請求項2】

さらに、前記培養液中の
（ａ）鉄含有イオンが３００μＭ以下、
（ｂ）クロム含有イオンが１０μＭ以下、及び
（ｃ）ニッケル含有イオンが１ｍＭ以下、の濃度範囲を保持するように培養することを特徴とする、請求項１に記載のデハロコッコイデス属細菌の培養方法。

【請求項3】

前記金属製の耐圧培養容器として、チタン製の耐圧培養容器を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のデハロコッコイデス属細菌の培養方法。

【請求項4】

前記デハロコッコイデス属細菌は、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３で特定されるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株であることを特徴とする請求項１又は２に記載のデハロコッコイデス属細菌の培養方法。

【請求項5】

前記鉄含有イオンは、Ｆｅ^２＋であり、
前記クロム含有イオンは、Ｃｒ^３＋であり、
前記ニッケル含有イオンは、Ｎｉ^２＋であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のデハロコッコイデス属細菌の培養方法。

【請求項6】

請求項１又は２に記載の培養方法で培養されたデハロコッコイデス属細菌を、前記金属製の耐圧培養容器ごと塩素化エチレン類により汚染された汚染サイトに運搬し、該汚染サイトに前記耐圧培養容器から取り出したデハロコッコイデス属細菌を供給することにより、汚染サイトの塩素化エチレン類を浄化する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はデハロコッコイデス属細菌の培養方法に関し、具体的には、デハロコッコイデス属細菌を効率的に大量培養し、この大量培養されたデハロコッコイデス属細菌により、塩素化エチレン類を浄化する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

デハロコッコイデス（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ）属細菌は、地下水や土壌の汚染物質であるテトラクロロエチレン（ＰＣＥ）やトリクロロエチレン（ＴＣＥ）等の塩素化エチレン類を、無害なエチレンまで還元的に脱塩素化することができる細菌である。それゆえ、このデハロコッコイデス属細菌を利用して、塩素化エチレン類（ＣＥｓ）で汚染された土壌・地下水を浄化するバイオレメディエーションが期待されている。例えば、本願発明者による特許文献１には、バイオレメディエーションに有用なデハロコッコイデス属細菌として、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株が開示されており、このＮＩＴ０１株はトリクロロエチレン及び１，１，２－トリクロロエタンをエチレンに分解できることが記載されている。

【0003】

デハロコッコイデス属細菌によるバイオレメディエーションを実施するためには、大量のデハロコッコイデス属細菌の培養物を準備し、汚染サイトに運ぶ必要がある。デハロコッコイデス属細菌は絶対嫌気性細菌であることから、数十ミリリットル程度の小スケールでの嫌気培養は安定的に行えるものの、数リットルを超える大スケールでの安定的な嫌気培養は非常に難しく、さらに、その培養物を嫌気状態を維持したまま汚染サイトに運ぶことも困難であるという問題があった。

【0004】

そこで、非特許文献１では、絶対嫌気性菌の大量培養にあたり、耐圧容器である市販の金属製のビア樽（ケグ）を用いることが提案されている。この金属製のビア樽を培養容器とすることにより、培養容器に液体培地を入れた状態でオートクレーブ滅菌することができ、オートクレーブ後のガス置換も容易であり、培養後には培養容器ごと培養物を運ぶことができるという利点を有する。一例として、特許文献２には、５ガロンのビア樽（コーネリアスタイプ）を利用して、デハロコッコイデス属細菌を大量培養したことが開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０２１－３１号公報

【特許文献2】特開２０２１－１６３６８号公報

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】“市販のビア樽（ケグ）などの耐圧力容器を用いた大量培養”、[online]、独立行政法人製品評価技術基盤機構 ホームページ、［2022年9月1日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：https://www.nite.go.jp/nbrc/industry/support/cultivation.html＞

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかしながら、本願発明者は、バイオレメディエーションに適用するため、市販のステンレス製のビア樽（ケグ）を耐圧培養容器として用い、デハロコッコイデス属細菌の大量培養を繰り返し実施していたところ、塩素化エチレン類の脱塩素化が停止し、デハロコッコイデス属細菌の活動や増殖も止まってしまう事象が生じることを見出した。

【0008】

したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、デハロコッコイデス属細菌をケグ様の金属製の耐圧培養容器を用いて培養する際に、安定的に大量培養できる方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本願発明者は、オートクレーブ可能な市販のビア樽（ケグ）はステンレス鋼から形成されており、大量培養容器として本願発明者が試験を行っていたケグもＳＵＳ３０４鋼で形成されていた点に着目し、この種のステンレス容器から溶出又は剥離等した成分が、デハロコッコイデス属細菌の培養に影響を及ぼした可能性があると仮説を立て、研究を進めていった。その結果得られた知見に基づき、本発明を完成するに至った。

【0010】

上記課題を解決するため、本発明のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、金属製の耐圧培養容器を用いてデハロコッコイデス属細菌を培養する方法であるところ、デハロコッコイデス属細菌を、培養液中の（ａ）鉄含有イオンが１ｍＭ以下、（ｂ）クロム含有イオンが２３μＭ以下、及び（ｃ）ニッケル含有イオンが１．５ｍＭ以下、の濃度範囲を保持するように培養する。これにより、金属製の耐圧培養容器を用いた際においても、デハロコッコイデス属細菌による塩素化エチレン類の脱塩素化が阻害され難くなるため、培養液中での塩素化エチレン類の脱塩素化が進行すると共に細菌数も増え、安定的に大量培養することができる。

【0011】

また、上述の培養方法において、培養液中の（ａ）鉄含有イオンが３００μＭ以下、（ｂ）クロム含有イオンが１０μＭ以下、及び（ｃ）ニッケル含有イオンが１ｍＭ以下、の濃度範囲を保持するように培養することも好ましい。これにより、金属製の耐圧培養容器を用いた際においても、デハロコッコイデス属細菌による塩素化エチレン類の脱塩素化がより阻害され難くなるため、培養液中での塩素化エチレン類の脱塩素化が進行すると共に細菌数も増え、安定的に大量培養することができる。

【0012】

また、本発明の培養方法は、金属製の耐圧培養容器として、チタン製の耐圧培養容器を用いることも好ましい。これにより、培養液中の各種金属イオンの濃度範囲に影響を与えず、上述した濃度範囲を保持できる耐圧培養容器の金属材料として、好適な材料が選択される。

【0013】

また、本発明の培養方法におけるデハロコッコイデス属細菌は、受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３で特定されるＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株であることも好ましい。これにより、本発明において、好適なデハロコッコイデス属細菌が選択される。このＮＩＴ０１株は、塩素化エチレン類のみならず、塩素化エタン類をも脱塩素化することができるため、塩素化脂肪族化合物で汚染された汚染サイトの浄化に有用な菌株である。

【0014】

また、本発明の培養方法において、鉄含有イオンは、Ｆｅ^２＋であり、クロム含有イオンは、Ｃｒ^３＋であり、ニッケル含有イオンは、Ｎｉ^２＋であることも好ましい。これにより、培養液中で所定の濃度範囲を保持すべき金属イオンとして、特に好適なものが選択される。

【0015】

さらに、本発明の塩素化エチレン類を浄化する方法は、上述の培養方法で培養されたデハロコッコイデス属細菌を、金属製の耐圧培養容器ごと塩素化エチレン類により汚染された汚染サイトに運搬し、この汚染サイトに耐圧培養容器から取り出したデハロコッコイデス属細菌を供給することにより行われる。これにより、デハロコッコイデス属細菌を耐圧培養容器内で安定的に大量培養することができ、この耐圧培養容器ごと汚染サイトまで運搬することができるため、容易かつ迅速に汚染サイトに耐圧培養容器内のデハロコッコイデス属細菌を供給して、汚染サイトの塩素化エチレン類を脱塩素化して浄化することができる。

【発明の効果】

【0016】

本発明によれば、以下のような優れた効果を有するデハロコッコイデス属細菌の培養方法及びそれを用いた塩素化エチレン類の浄化方法を提供することができる。
（１）各金属イオンの培養液中の濃度範囲を所定濃度以下とすることにより、デハロコッコイデス属細菌による塩素化エチレン類の脱塩素化が阻害され難くなるため、培養液中での塩素化エチレン類の脱塩素化が進行すると共に細菌数も増え、安定的に大量培養することができる。
（２）耐圧培養容器としてチタン製の容器を選択することにより、培養液中の各種金属イオンの濃度範囲に影響を与えないため、培養液中での塩素化エチレン類の脱塩素化が阻害されず、安定した大量培養を繰り返し行うことができる。
（３）金属製の耐圧培養容器内でデハロコッコイデス属細菌を安定的に大量培養することにより、この培養容器ごと汚染サイトまで運搬することができるため、容易かつ迅速に汚染サイトに培養容器内のデハロコッコイデス属細菌を供給して、汚染サイトの塩素化エチレン類を脱塩素化して浄化することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】実施例１における（Ａ）鉄の金属片を添加した培養液及び（Ｂ）ＳＵＳ３１６の金属片を添加した培養液での塩素化エチレン類（ＣＥｓ）の濃度と細胞密度を示すグラフである。

【図2】実施例１におけるＳＵＳ３０４の金属片を添加した培養液での塩素化エチレン類（ＣＥｓ）の濃度と細胞密度を示すグラフである。

【図3】実施例１におけるチタンの金属片を添加した培養液での塩素化エチレン類（ＣＥｓ）の濃度と細胞密度を示すグラフである。

【図4】実施例１における培養試験後の各培養液中の金属片の様子を示す写真である。

【図5】実施例２における培養試験前後の各金属片の表面の様子を示す写真である。

【図6】実施例４における（Ａ）対照区及び（Ｂ）～（Ｅ）鉄イオンを種々濃度で添加した培養液での塩素化エチレン類の濃度を示すグラフである。

【図7】実施例４におけるクロムイオンを種々濃度で添加した培養液での塩素化エチレン類の濃度を示すグラフである。

【図8】実施例４におけるニッケルイオンを種々濃度で添加した培養液での塩素化エチレン類の濃度を示すグラフである。

【図9】実施例５において用いたチタン製の耐圧培養容器を示す写真である。

【図10】実施例５におけるチタン製の耐圧培養容器にて、大量培養を繰り返し実施した際の培養液での塩素化エチレン類の濃度と細胞密度を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、本発明のデハロコッコイデス属細菌の培養方法について、以下詳細に説明する。本実施形態に係るデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、金属製の耐圧培養容器を用いてデハロコッコイデス属細菌を培養する方法であって、デハロコッコイデス属細菌を、培養液中の鉄含有イオン、クロム含有イオン及びニッケル含有イオンがそれぞれ所定の濃度範囲を保持するように培養する。

【0019】

本実施形態において用いられるデハロコッコイデス属細菌としては、塩素化エチレン類又は塩素化エタン類のような有機ハロゲンを脱ハロゲン化できるデハロコッコイデス属細菌（Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｓｐ．）であればよく、より具体的には、この種の有機ハロゲンの脱ハロゲン呼吸により、エネルギーを獲得して増殖するデハロコッコイデス属細菌が好ましい。本実施形態においては、具体的には、特に限定されないが、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉが好適に用いられ得る。このうち、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３）、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＣＢＤＢ１株又はこれらの変異株が好ましく、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株が特に好ましく用いられる。また、デハロコッコイデス属細菌としては、単独の株又は単独の種を培養することも、複数種類の株又は複数の種を共培養することも可能である。さらに、本発明の作用効果を減じない範囲において、デハロコッコイデス属細菌以外の他の細菌と共培養することも可能である。

【0020】

上述したＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株（以下、「ＮＩＴ０１株」ともいう。）は、４ｍＭのトリクロロエチレン（ＴＣＥ）をエチレンに分解する特性、及び１，１，２－トリクロロエタンをエチレンに分解する特性を備えたデハロコッコイデス属細菌である。このＮＩＴ０１株は、硝酸、亜硝酸、硫酸、亜硫酸、チオ硫酸及び酸素の還元能は有しておらず、塩素化エチレン類等の有機ハロゲンの還元的脱塩素化によってのみ生育可能な菌株である。このＮＩＴ０１株は、以下のとおり特許微生物の寄託機関に国内寄託がなされている。
（１）受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３
（２）受託日：２０１９年２月２５日
（３）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）

【0021】

なお、本発明において、塩素化エチレン類とは、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）、ｃｉｓ－１，２－ジクロロエチレン（ｃｉｓ－ＤＣＥ）、１，１－ジクロロエチレン（１，１－ＤＣＥ）又は塩化ビニル（ＶＣ）等が挙げられ、塩素化エタン類とは、１，２－ジクロロエタン、１，１，２－トリクロロエタン及び１，１，１－トリクロロエタン等が挙げられる。

【0022】

本実施形態においては、デハロコッコイデス属細菌を金属製の耐圧培養容器を用いて培養するところ、培養液中の鉄含有イオンが１ｍＭ以下、クロム含有イオンが２３μＭ以下、及びニッケル含有イオンが１．５ｍＭ以下、の濃度範囲を保持するように培養することが重要である。これらの濃度範囲を超えて培養液中にこれらの金属イオンが含まれるようになると、デハロコッコイデス属細菌による塩素化エチレン類の脱塩素化が阻害され、菌の生育が阻害される。具体的には、培養液中の鉄含有イオンは１ｍＭ以下の濃度範囲に保持することが好ましく、３００μＭ以下の濃度範囲に保持することがより好ましい。また、培養液中のクロム含有イオンは２３μＭ以下の濃度範囲に保持することが好ましく、１０μＭ以下の濃度範囲に保持することがより好ましい。そして、培養液中のニッケル含有イオンの濃度範囲は１．５ｍＭ以下の濃度範囲に保持することが好ましく、１ｍＭ以下の濃度範囲に保持することが好ましい。なお、鉄含有イオンとは、鉄が含まれるイオン種であるところ、Ｆｅ^２＋又はＦｅ^３＋であることが好ましく、Ｆｅ^２＋であることがより好ましい。また、クロム含有イオンとは、クロムが含まれるイオン種であるところ、Ｃｒ^３＋、ＣｒＯ_４ ^２－又はＣｒ_２Ｏ_７ ^２－であることが好ましく、Ｃｒ^３＋であることがより好ましい。また、ニッケル含有イオンとは、ニッケルを含むイオン種であるところ、Ｎｉ^２＋又はＮｉ^３＋であることが好ましく、Ｎｉ^２＋であることがより好ましい。

【0023】

本発明においては、デハロコッコイデス属細菌を金属製の耐圧培養容器を用いて培養する。金属製の耐圧培養容器を用いることにより、培養容器に液体培地を入れた状態でオートクレーブ滅菌することができ、オートクレーブ後のガス置換も容易であり、培養後には培養容器ごと培養物を運ぶことができるという利点を有する。特に限定されないが、非特許文献１において紹介されていたように、いわゆるケグ様の金属製耐圧容器が好ましく、蓋部にサンプリングのための孔部を設けるような改造が施された構造とすることが好ましい。ここで、市販のケグは鉄又はステンレスから形成されているところ、後述する実施例に示すように、鉄又はステンレスで形成された培養容器を用いて、オートクレーブと培養とを複数回繰り返すと、鉄又はステンレスに含まれている金属イオン成分が培養液中に溶出し、デハロコッコイデス属細菌の生育を阻害することがわかった。そのため、金属製の耐圧培養容器としては、培養液中の鉄含有イオンが１ｍＭ以下、クロム含有イオンが２３μＭ以下、及びニッケル含有イオンが１．５ｍＭ以下、の濃度範囲を保持できるものを用いることが好ましく、培養液中の鉄含有イオンが３００μＭ以下、クロム含有イオンが１０μＭ以下、及びニッケル含有イオンが１ｍＭ以下、の濃度範囲を保持できるものを用いることがより好ましい。

【0024】

金属製の耐圧培養容器として、より具体的には、後述する実施例５に示すように、チタンで形成された耐圧培養容器を用いることが好ましい。チタンとしては純チタンが好ましく、例えば、ＪＩＳ規格における１種、２種、３種及び４種の純チタンが好適に用いられ得る。これにより、耐食性に優れ、培養液中の鉄含有イオンを１ｍＭ以下、クロム含有イオンを２３μＭ以下及びニッケル含有イオンを１．５ｍＭ以下、の濃度範囲に確実に保持することができるため、安定的なデハロコッコイデス属細菌の大量培養を行うことができる。また、培養容器をチタンで形成することにより、容器自体も軽量となるため、汚染サイトへ培養物を培養容器ごと運ぶ際にも、運搬が容易となるメリットも有する。なお、上述したように、培養液中の鉄含有イオンが１ｍＭ以下、クロム含有イオンが２３μＭ以下、及びニッケル含有イオンが１．５ｍＭ以下、の濃度範囲を保持できるものであれば、純チタンのみならず、チタン合金を用いることも可能である。

【0025】

デハロコッコイデス属細菌の培養液としては、後述する実施例１で用いたＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地をベースとした培養液の他、デハロコッコイデス属細菌の培養液として用いられている、あらゆる組成の培地が使用できる。また、培養液の組成は、接種するデハロコッコイデス属細菌の種類等や培養条件等によって適宜改変することが可能である。培養液には、炭素源、還元剤、電子受容体源、電子供与体源、無機塩類、微量元素、ビタミン類が含まれていることが好ましく、このうち、電子受容体源としては、接種するデハロコッコイデス属細菌の塩素化エチレン類の分解特性に応じた塩素化エチレン類を含有させることが好ましい。例えば、上述したＮＩＴ０１株はトリクロロエチレン（ＴＣＥ）をエチレンにまで分解する特性を備えているので、電子受容体としてトリクロロエチレンを添加することができる。培養液のｐＨは、接種したデハロコッコイデス属細菌の増殖に適したｐＨに調整されるが、通常、６．５～７．５のほぼ中性を呈するｐＨが好ましい。

【0026】

デハロコッコイデス属細菌は、絶対嫌気性細菌であるため、培養は嫌気的に行われる。そのため、水素及び二酸化炭素の混合ガス雰囲気下で培養を行うことが好ましい。水素及び二酸化炭素の混合ガスにおける水素ガスは、デハロコッコイデス属細菌の電子供与体源として使用される。なお、電子供与体源として水素ガスを使用せずに他の有機酸から水素を発生する微生物と混合して用いる場合には、窒素及び二酸化炭素の混合ガス雰囲気下で培養を行うことが可能である。また、培養温度は、接種したデハロコッコイデス属細菌の増殖に適した温度に設定されるが、通常、２５℃～３５℃が好ましく、２５～３０℃程度の室温がより好ましい。

【0027】

培地へのデハロコッコイデス属細菌の接種にあたっては、事前培養を行っておき、この事前培養した培養液を、新たに培養する培養液に添加して接種することが好ましい。培養期間は適宜設定でき、所望のデハロコッコイデス属細菌の細菌数（菌体密度）となるまで培養することができる。一例として、１週間～２ヶ月程度とすることが好ましく、２週間～１．５ヵ月とすることがより好ましい。

【0028】

本発明の培養方法により培養されたデハロコッコイデス属細菌を供給する汚染サイトとしては、例えば、土壌、地下水、廃棄物処理場、廃水ピット、水処理場、河川等が挙げられる。また、本発明のデハロコッコイデス属細菌を汚染サイトに供給する方法としては、特に限定されないが、汚染物の形態に合わせて、デハロコッコイデス属細菌を汚染物に直接、添加又は混合等させてもよく、デハロコッコイデス属細菌を含有する浄化剤を汚染物に散布する方法のほか、デハロコッコイデス属細菌を支持体に固定化又は担持させた状態で用いてもよい。デハロコッコイデス属細菌の供給量は、汚染サイトにおける塩素化エチレン類の濃度等によって任意に設定可能であるが、例えば、地下水に１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度を添加することが好ましい。また、予備実験を通じて汚染サイトに適したデハロコッコイデス属細菌の供給量を設定することが可能である。

【0029】

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。

【実施例0030】

［実施例１］
１．金属片を添加した培養液におけるデハロコッコイデス属細菌の生育状態の検討
本実施例では、発明者がステンレス製のビア樽を培養容器として用いた際に、デハロコッコイデス属細菌の生育の阻害が認められたことから、鉄板、ステンレス板（２種）及びチタン板の金属片をそれぞれ培養液に入れ、デハロコッコイデス属細菌の生育状態に影響を及ぼすかどうか、検討を行った。デハロコッコイデス属細菌の生育状態は、培養液に添加した塩素化エチレン類（ＣＥｓ）の脱塩素化の進行レベル及び菌体密度で確認した。

【0031】

デハロコッコイデス属細菌の培養は、以下表１に示す試験培地を用いて行った。具体的には、以下表２～表４に示す組成のＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地を調製し、５０ｍＬ容量のバイアル瓶に２０ｍＬずつ入れた後、以下表５に示す新品の金属片をそれぞれバイアル瓶１つあたり同種４枚ずつ入れたものを試験区とし、金属片を添加しないものを対照区とした。この液体培地をＮ_２：ＣＯ_２＝４：１（ｖ／ｖ）のガスで置換して嫌気条件とした後、金属片が入った状態の各試験区及び対照区のＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地をバイアル瓶ごとオートクレーブ滅菌し、冷却した。なお、ＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地の成分のうち、ビタミン溶液とＴｉ（ＩＩＩ）－ニトリロ三酢酸水溶液については、ろ過滅菌により冷却後のＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地に添加した。冷却後の各バイアル瓶中のＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地に、炭素源として酢酸を最終濃度が５ｍＭとなるように加え、さらに、電子受容体としてトリクロロエチレン（ＴＣＥ）を最終濃度が１ｍＭとなるように加えた。電子供与体としてＨ_２を供給するため、各バイアル瓶のヘッドスペースのガスをＨ_２：ＣＯ_２＝４：１（ｖ／ｖ）に置換して、以下表１に示す組成の試験培地を調製した。

【0032】

【表1】

【0033】

【表2】

【0034】

【表3】

【0035】

【表4】

【0036】

【表5】

【0037】

対照区及び試験区の各バイアル瓶に、事前に培養していたデハロコッコイデス属細菌をバイアル瓶中の試験培地の５ｖ／ｖ％の量を接種し、室温にて静置培養を行った。デハロコッコイデス属細菌としては、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３）を用いた。

【0038】

培養開始後、一定期間毎にバイアル瓶のヘッドスペースガスをガスタイトシリンジで回収し、ガスクロマトグラフィー（型番：ＧＣ－２０１４、株式会社島津製作所製品）により、試験培地に添加したトリクロロエチレン（ＴＣＥ）をはじめとする塩素化エチレン類（ＣＥｓ）の濃度を測定した。また、培養液のサンプリングも併せて行い、培養液中のデハロコッコイデス属細菌の細胞密度を測定した。なお、細胞密度の測定は、蛍光染料（ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製品）の核酸染色による蛍光顕微鏡を用いた直接検鏡法により計測した。また、各試験区の培養液及び金属片の状態について、目視にて確認を行った。

【0039】

試験区のうち、塩素化エチレン類の脱塩素化が完了した試験区（試験区３及び４）については、培養液から金属片４枚を取り出し、新たに調製したＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地を２０ｍＬ入れたバイアル瓶にその金属片を再度入れ、上述と同様の材料及び方法により、表１に示す試験培地を調製して２回目のデハロコッコイデス属細菌の培養試験を行った。１回目の培養試験と同様の方法により、一定期間毎に塩素化エチレン類（ＣＥｓ）の濃度と、培養液中のデハロコッコイデス属細菌の細胞密度を測定した。また、各試験区の培養液及び金属片の状態について、目視にて確認を行った。

【0040】

図１～図３に培養試験の結果を示す。図１（Ａ）は試験区１（鉄）、図１（Ｂ）は試験区２（ＳＵＳ３１６）の培養液における塩素化エチレン類（ＣＥｓ）の濃度（μＭ）と細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を示す。また、図２（Ａ）は試験区３（ＳＵＳ３０４）の１回目の培養試験のデータであり、図２（Ｂ）は同試験区３の２回目の培養試験のデータである。さらに、図３（Ａ）は、試験区４（チタン）の１回目の培養試験のデータであり、図３（Ｂ）は同試験区４の２回目の培養試験のデータである。各グラフ中における「ＮＣ」は対照区の培養液における塩素化エチレン類の濃度と細胞密度を示している。

【0041】

図１（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、鉄又はＳＵＳ３１６の金属片を添加した培養液では、塩素化エチレン類の脱塩素化が途中で停止した。また、図２（Ａ）に示すように、ＳＵＳ３０４の金属片を添加した１回目の培養試験では、対照区（ＮＣ）と比較すると塩素化エチレン類の脱塩素化の完了までに時間を要したが、対照区と同傾向の菌数増殖が観察された。この培養液から取り出した金属片を用いて２回目の培養試験を行ったところ、図２（Ｂ）に示すように、塩素化エチレン類の脱塩素化は途中で停止した。一方で、図３（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、純チタンの金属片を添加した培養液では、塩素化エチレン類の脱塩素化の遅れや停止は観察されず、対照区（ＮＣ）の培養液と同様の塩素化エチレン類の脱塩素化ならびに菌数増殖が観察された。

【0042】

また、試験区１～４の培養試験終了後の培養液中の金属片の状態を示す写真を図４に示す。鉄（試験区１）及びＳＵＳ３１６（試験区２）は１回目の培養試験後の写真であり、ＳＵＳ３０４（試験区３）とチタン（試験区４）は２回目の培養試験後の写真である。図４の写真に示すように、鉄、ＳＵＳ３１６及びＳＵＳ３０４の金属片を添加した培養液においては、培養液に黒い沈殿物が観察されたが、チタンの金属片を添加した培養液では沈殿物は観察されなかった。この黒い沈殿物は、金属片から溶出した鉄等の金属イオンが硫化物イオンと反応したことにより生じた金属硫化物と推測された。

【0043】

［実施例２］
２．デハロコッコイデス属細菌の培養液に添加した金属片の表面状態の観察
上述した実施例１で培養液に添加した各試験区の金属片について、培養前後の表面形状を走査電子顕微鏡（ＪＳＭ－７８００Ｆ、日本電子株式会社製品）を用いて撮影した。実施例１の試験区１（鉄）及び試験区２（ＳＵＳ３１６）に係る金属片は１回目の培養試験後のものであり、実施例１の試験区３（ＳＵＳ３０４）及び試験区４（チタン）に係る金属片は、２回目の培養試験後のものである。走査電子顕微鏡の電子銃の加速電圧は５．０ｋＶとし、顕微鏡倍率は１０００倍とした。なお、培養前の金属片は、表面に付着した油分等を落とすためにアセトンで洗浄してから観察を行った。また、培養後の金属片については、洗剤で洗浄した後に観察を行った。

【0044】

培養前後の各金属片を走査電子顕微鏡で観察した結果を図５に示す。培養後の鉄の金属片をみると、培養前に比べ表面の凹凸が増加しており、培養によって表面形状が大きく変化したことがわかった。ＳＵＳ３１６については、培養前からひび割れたような凹凸があり、培養後も顕著な変化は見られなかった。ＳＵＳ３０４では培養前には直線状の凹凸が観察されるだけであったが、培養後には表面にひび割れたような形状変化が観察された。チタンの金属片については、培養前後で表面形状に変化は観察されなかった。このうち、特に、鉄及びＳＵＳ３０４の金属片は培養前後での表面形状の変化が大きいことから、培養によって、金属片を構成する成分が培養液に溶出したものと考えられた。溶出成分としては、鉄板及び下表６に示すステンレス鋼を構成する成分を考慮すると、少なくとも鉄イオンが溶出し、さらにクロムイオン及びニッケルイオンが溶出した可能性も考えられた。

【0045】

【表6】

【0046】

［実施例３］
３．鉄系金属片を添加した培養液中の総鉄イオン濃度の測定
上述した実施例２において、鉄及びステンレスの金属片表面の変化が観察されたことから、金属片からは少なくとも鉄イオンが培養液中に溶出した可能性が考えられた。これを確認するため、実施例１における対照区及び試験区１～３の培養試験後の培養液に含まれる総鉄イオン濃度を測定した。

【0047】

表７に示すように、実施例１の試験区１（鉄）及び試験区２（ＳＵＳ３１６）に係る培養液は１回目の培養試験後のものであり、実施例１の試験区３（ＳＵＳ３０４）に係る培養液は、２回目の培養試験後のものである。また、デハロコッコイデス属細菌の培養を実施していない液体培地そのものとして、表２に示すＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地の総鉄イオン濃度も測定した。なお、総鉄イオン濃度は次のようにして測定した。各培養液をフィルターろ過して得たサンプル液０．２～２．５ｍＬに対し、最終濃度が１４４ｍＭとなるように塩化ヒドロキシルアンモニウムを添加し、次に、最終濃度が０．８２ｍＭとなるように１，１０－フェナントロリン塩酸塩を添加した。そして、１ｍＬの酢酸緩衝液を添加し、ＭｉｌｌｉＱ水で５ｍＬまでメスアップした。この混合液を攪拌後、微量分光光度計を用いて波長５１０ｎｍで吸光度を測定した。結果を以下表７に示す。

【0048】

【表7】

【0049】

デハロコッコイデス属細菌を培養するための培養液には、一般的に微量元素として鉄イオンが７～１０μＭ程度含まれる（表４に示すＳＬ－１０微量元素溶液参照）。表７に示すように、ＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地のみの総鉄イオン濃度は、９．２μＭであり、金属片が添加されていない対照区の培養液中の総鉄イオン濃度は８．５μＭであった。このことから、デハロコッコイデス属細菌は、塩素化エチレン類の脱塩素化の際に、鉄をほぼ消費しないことが示唆された。

【0050】

他方、表７に示すように、鉄の金属片を添加した試験区１の培養液中の総鉄イオン濃度は約１ｍＭ、ＳＵＳ３１６の金属片を添加した試験区２の培養液中の総鉄イオン濃度は６７μＭ、及びＳＵＳ３０４の金属片を添加した試験区３の培養液中の総鉄イオン濃度は２７６μＭであった。試験区１（鉄）の結果より、少なくとも、培養液中の総鉄イオン濃度が１ｍＭにおいて、デハロコッコイデス属細菌の塩素化エチレン類の脱塩素化が阻害され、生育に影響を及ぼすことが示唆された。その一方で、試験区２（ＳＵＳ３１６）及び試験区３（ＳＵＳ３０４）の培養液に含まれる総鉄イオン濃度は、試験区１（鉄）の培養液に含まれる総鉄イオン濃度よりも大幅に低く（７％～２７％程度）、このような低い総鉄イオン濃度であっても、塩素化エチレン類の脱塩素化が阻害されていることがわかった。このことから、（ｉ）ステンレス鋼を構成する他の金属成分によって塩素化エチレン類の脱塩素化が阻害される可能性、又は（ｉｉ）総鉄イオン濃度が６７μＭで塩素化エチレン類の脱塩素化が阻害される可能性、の両方が考えられた。特に（ｉ）においては、表６に示すステンレス鋼を構成する成分を考慮すると、クロム及びニッケルの含有量が多いことから、これらの金属イオンが溶出することによって塩素化エチレン類の脱塩素化が阻害される可能性が検討された。総鉄イオン濃度の測定結果によれば、試験区２（ＳＵＳ３１６）の金属片から、表６のＳＵＳ３１６の成分組成と同じ割合で鉄、クロム及びニッケルが溶出したと仮定すると、試験区２の培養液中には鉄イオンが６７μＭ、クロムイオンが１９μＭ、ニッケルイオンが４５μＭ溶出した可能性がある。また、試験区３（ＳＵＳ３０４）の金属片から、表６のＳＵＳ３０４の成分組成と同じ割合で鉄、クロム及びニッケルが溶出したと仮定すると、試験区３の培養液中には鉄イオンが２７６μＭ、クロムイオンが７２μＭ、ニッケルイオンが４５μＭ溶出した可能性がある。

【0051】

［実施例４］
４．金属イオンを添加した培養液におけるデハロコッコイデス属細菌の生育状態の検討
鉄、クロム及びニッケルがデハロコッコイデス属細菌の生育に与える影響を確認するため、これらの金属イオンを培養液に添加してデハロコッコイデス属細菌の培養試験を行った。上述した実施例１で用いた金属片の替わりに、以下表８に示す金属イオンを同表に示す添加濃度となるようにＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地に添加して各試験区４－１～４－１０の試験培地を調製した以外は、実施例１と同様にして、デハロコッコイデス属細菌の培養試験を行った。デハロコッコイデス属細菌としては、実施例１と同様にＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株を用いた。室温で静置培養を行い、一定期間毎にバイアル瓶のヘッドスペースガスをガスタイトシリンジで回収し、ガスクロマトグラフィー（型番：ＧＣ－２０１４、株式会社島津製作所製品）により塩素化エチレン類（ＶＣ：塩化ビニル、ｃｉｓ－ＤＣＥ：ｃｉｓ－１，２－ジクロロエチレン、ＴＣＥ：トリクロロエチレン）及びエチレン（ＥＴＨ）の濃度を測定した。

【0052】

【表8】

【0053】

図６～図８に培養試験の結果を示す。図６（Ａ）は対照区、図６（Ｂ）は試験区４－１（Ｆｅ^２＋、６８μＭ）、図６（Ｃ）は試験区４－２（Ｆｅ^２＋、２７３Ｍ）、図６（Ｄ）は試験区４－３（Ｆｅ^２＋、１ｍＭ）及び図６（Ｅ）は試験区４－４（Ｆｅ^２＋、５ｍＭ）の培養液における塩素化エチレン類の濃度（μＭ）を示す。また、図７（Ａ）は試験区４－５（Ｃｒ^３＋、２３μＭ）、試験区４－６（Ｃｒ^３＋、７２μＭ）及び試験区４－７（Ｃｒ^３＋、５００μＭ）の培養液における塩素化エチレン類の濃度（μＭ）を示す。また、図８（Ａ）は試験区４－８（Ｎｉ^２＋、１ｍＭ）、試験区４－９（Ｎｉ^２＋、２ｍＭ）及び試験区４－１０（Ｎｉ^２＋、５ｍＭ）の培養液における塩素化エチレン類の濃度（μＭ）を示す。各グラフ中における四角形のマーカーはトリクロロエチレン（ＴＣＥ）、菱形のマーカーはｃｉｓ－１，２－ジクロロエチレン（ｃｉｓ－ＤＣＥ）、三角形のマーカーは塩化ビニル（ＶＣ）及び丸形のマーカーはエチレン（ＥＴＨ）を示している。

【0054】

図６～図８によれば、Ｆｅ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｎｉ^２＋を培養液に添加した際、添加濃度が高くなるほど、塩素化エチレン類の脱塩素化の阻害が大きくなることが明らかとなった。このうち、鉄イオン（Ｆｅ^２＋）については、添加濃度が６８μＭ及び２７３μＭでは、塩素化エチレン類の脱塩素化の阻害は全く観察されなかったが（図６（Ｂ）及び（Ｃ））、添加濃度が１ｍＭにおいて阻害傾向が認められ（図６（Ｄ））、添加濃度が５ｍＭでは塩素化エチレン類の脱塩素化が完全に阻害された（図６（Ｅ））。

【0055】

また、クロムイオン（Ｃｒ^３＋）については、添加濃度が２３μＭでは塩素化エチレン類の弱い脱塩素化の進行が観察されたが（図７（Ａ））、添加濃度が７２μＭ及び５００μＭでは、ｃｉｓ－ＤＣＥが僅かに増加するだけであり、脱塩素化の阻害が確認された（図７（Ｂ）及び（Ｃ））。また、ニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）については、添加濃度が１ｍＭでは脱塩素化が終了したが（図８（Ａ））、添加濃度が２ｍＭ及び５ｍＭでは、脱塩素化は全く進行しなかった（図８（Ｂ）及び（Ｃ））。

【0056】

本実施例の結果から、デハロコッコイデス属細菌の生育の阻害、すなわち、塩素化エチレン類の脱塩素化の阻害の原因となる主な成分及びその濃度として、鉄の金属片を培養液に添加した場合には、１ｍＭを超える濃度の鉄イオンであること、ステンレスの金属片を培養液に添加した場合には、２３μＭを超える濃度のクロムイオンであることが示唆された。

【0057】

［実施例５］
５．チタン製の耐圧培養容器を用いたデハロコッコイデス属細菌の大量培養
ステンレス製のビア樽（ケグ）の耐圧培養容器の替わりに、純チタン（ＪＩＳ規格におけるチタン２種）でケグ様の耐圧培養容器を作製した（図９）。容量は１８Ｌとした。非特許文献１に示されているように、上蓋にはサンプリングポートを設けた。このチタン製耐圧培養容器に、表２に示すＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地を１０Ｌ入れ、Ｎ_２：ＣＯ_２＝４：１（ｖ／ｖ）の混合ガスで置換して嫌気条件とした後、耐圧培養容器ごとオートクレーブ滅菌した。オートクレーブ後に耐圧培養容器を氷水に浸して冷却し、ヘッドスペースのガスをＨ_２：ＣＯ_２＝４：１（ｖ／ｖ）に置換した。なお、ＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地の成分のうちのビタミン溶液とＴｉ（ＩＩＩ）－ニトリロ三酢酸水溶液については、冷却後の培地にろ過滅菌により添加した。ＤＨＢ－ＣＯ_３－Ｂｒ培地に炭素源として酢酸を最終濃度が５ｍＭとなるように加え、さらに、電子受容体としてトリクロロエチレン（ＴＣＥ）を最終濃度が１ｍＭとなるように加え、実施例１同様の表１に示す組成の試験培地を１０Ｌ規模で調製した。この１０Ｌの試験培地に、事前に培養していたＤｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株を試験培地の１６ｖ／ｖ％量を接種し、室温にて静置培養を行った。培養開始後、実施例１と同様の方法により、一定期間毎に塩素化エチレン類（ＣＥｓ）の濃度と、培養液中のデハロコッコイデス属細菌の細胞密度を測定した。

【0058】

チタン製耐圧培養容器内の塩素化エチレン類の脱塩素化が完了した時点で１回目の培養試験の終了とし、同じ耐圧培養容器を用いて上記と同内容での大量培養試験を６回繰り返し行った。なお、６回目の培養試験においては、耐圧培養容器内の塩素化エチレン類の脱塩素化が完了した時点で試験終了とせず、さらにトリクロロエチレン（ＴＣＥ）を最終濃度が１ｍＭとなるように追加添加して培養を継続し、その後の耐圧培養容器内の塩素化エチレン類の濃度と、培養液中のデハロコッコイデス属細菌の細胞密度を測定した。

【0059】

図１０に培養試験の結果を示す。図１０（Ａ）は１回目、図１０（Ｂ）は２回目、図１０（Ｃ）は４回目、図１０（Ｄ）は５回目及び図１０（Ｅ）は６回目の培養液における塩素化エチレン類の濃度（μＭ）と細胞密度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を示す。各グラフ中における四角形のマーカーはトリクロロエチレン（ＴＣＥ）、菱形のマーカーはｃｉｓ－１，２－ジクロロエチレン（ｃｉｓ－ＤＣＥ）、三角形のマーカーは塩化ビニル（ＶＣ）及び丸形のマーカーはエチレン（ＥＴＨ）の濃度を示し、クロス形のマーカーは細胞密度を示している。

【0060】

図１０に示すように、チタン製耐圧培養容器を用いてデハロコッコイデス属細菌を培養することにより、安定的な大量培養を実現できることがわかった。Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株による１ｍＭのトリクロロエチレンの脱塩素化はわずか１２～２８日程度で完了し、順調な生育状況が観察された。また、脱塩素化の完了時には細胞密度が２．８～７．７×１０^７まで増加した。さらに、図１０（Ｅ）に示すように、６回目の培養試験の際には、１ｍＭのトリクロロエチレンの脱塩素化が完了した培養液に対し、１ｍＭのトリクロロエチレンを追加添加したところ、わずか８日で追加添加したトリクロロエチレンの脱塩素化が完了し、細胞密度が３．５×１０^７から４．０×１０^７に増加した。

【0061】

このように、デハロコッコイデス属細菌の培養にあたり、チタン製の耐圧培養容器を用いることによって、従来のステンレスや鉄製の耐圧培養容器とは異なり、塩素化エチレン類の脱塩素化は阻害されず、同じ容器を繰り返し用いても大量培養を安定的に実施できることがわかった。

【産業上の利用可能性】

【0062】

本発明に係るデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、塩素化エチレン類等で汚染された汚染サイトのバイオレメディエーションによる浄化に有用であり、地下水や土壌の浄化に利用され得る。

【受託番号】

【0063】

受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０２８９３、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｍｃｃａｒｔｙｉ ＮＩＴ０１株、受託日：２０１９年２月２５日、寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】