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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024056156
(43)【公開日】2024-04-23
(54)【発明の名称】メチオニン制限剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7076 20060101AFI20240416BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240416BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240416BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7076
A61P3/00
A61P43/00 105
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022162868
(22)【出願日】2022-10-11
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和４年４月７日にＡｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ 第２１巻、５号および国立大学法人広島大学のウェブサイトにて発表
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的先端研究開発支援事業（全ライフコースを対象とした個体の機能低下機構の解明「Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）代謝が関与する寿命延長メカニズムの解明」）委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】水沼 正樹
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA18
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZC19
4C086ZC21
4C086ZC52
(57)【要約】
【課題】簡便かつ継続的なメチオニン量の低減を可能にするメチオニン制限剤を提供する。
【解決手段】本発明に係るメチオニン制限剤は、Ｓ－アデノシルホモシステイン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とするメチオニン制限剤である。
【選択図】図１
【解決手段】本発明に係るメチオニン制限剤は、Ｓ－アデノシルホモシステイン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とするメチオニン制限剤である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｓ－アデノシルホモシステイン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、メチオニン制限剤。
【請求項2】
ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを活性化する、請求項１に記載のメチオニン制限剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はメチオニン制限剤に関し、特にＳ－アデノシルホモシステインを有効成分として含むメチオニン制限剤に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、生物中においてアミノ酸の一種であるメチオニン量を低減（メチオニン制限）することで生物の寿命を延長できることが知られている。
【0003】
例えば、非特許文献１では必須アミノ酸であるＬ－メチオニンの食餌中の濃度を０．８６％から０．１７％に生涯にわたって減少させた結果、雄のＦｉｓｃｈｅｒ３４４ラットの寿命が３０％延長されたことが開示されている。また非特許文献１におけるメチオニン制限は、低メチオニン食餌により行われたことが開示されている。
【0004】
他方、非特許文献２ではヒトの寿命延長戦略としてビーガン食によるメチオニン制限が有効でありうることが開示されている。例えば、豆類やナッツ類などの植物性タンパク質は動物性タンパク質よりもメチオニンの量が少ない傾向にあり、ビーガン食によるメチオニン制限が実行可能であることが開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Orentreich, N., Matias, J. R., DeFelice, A., & Zimmerman, J. A. (1993). Low methionine ingestion by rats extends life span. The Journal of Nutrition, 123, 269-274.
【非特許文献2】McCarty, M. F., Barroso-Aranda, J., & Contreras, F. (2009). The low-methionine content of vegan diets may make methionine restriction feasible as a life extension strategy. Medical Hypothesis, 72, 125-128.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
メチオニンは肉類・乳製品などの様々な食品に多く含まれていることが知られている。そのため、これまでのメチオニン制限では、例えば上述の非特許文献２に開示されているような低脂肪性ビーガン食によるものや、カロリー制限によるものなどが用いられてきた。しかし、いずれも動物にとって負担の大きい方法であり、継続してメチオニンを制限することは難しいという問題があった。また、これまでにメチオニン制限を可能とする物質は知られていなかった。これらの事情から、簡便かつ継続的にメチオニン制限を行うことは困難であるという問題があった。
【0007】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便かつ継続的なメチオニン制限を可能にするメチオニン制限剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｓ－アデノシルホモシステインを有効成分として含ませることで、メチオニンを有効に制限できるメチオニン制限剤を提供できることを見出して本発明を完成した。
【0009】
具体的に、本発明に係るメチオニン制限剤は、Ｓ－アデノシルホモシステイン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とする。
【0010】
本発明に係るメチオニン制限剤は、メチオニン代謝系におけるＳ－アデノシルメチオニン（以下、単に「ＳＡＭ」ともいう）合成を活性化し、ＳＡＭの原料であるメチオニンの量を減少させることを原理とするものである。通常、メチオニン代謝系では、生体内においてメチオニンとＡＴＰを原料としてＳＡＭを合成し、このＳＡＭのメチル基を他の分子に供与することでＳ－アデノシルホモシステイン（以下、単に「ＳＡＨ」ともいう）を合成している。今回、本発明者らは、このようなメチオニン代謝系において、ＳＡＨを有効成分として含むメチオニン制限剤を投与するとＳＡＭ合成が活性化し、これにより、ＳＡＭの原料であるメチオニン（Ｍｅｔ）が消費され、細胞内のメチオニン量を低減（メチオニン制限）できることを明らかにした。このため、ＳＡＨを利用することで簡便かつ継続的なメチオニン制限を可能にするメチオニン制限剤を提供することができる。
【0011】
本発明に係るメチオニン制限剤は、ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを活性化することができる。
【0012】
このようにすると、細胞内のメチオニン量を減少させることに加え、生物の寿命を延長することもできる。
【発明の効果】
【0013】
本発明に係るメチオニン制限剤によると、メチオニン代謝系におけるＳ－アデノシルメチオニン合成を活性化し、細胞内のメチオニンの量を減少させることができる。このため、簡便かつ継続的なメチオニン制限を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明を実施するための形態を説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【0016】
＜メチオニン制限剤＞
本実施形態に係るメチオニン制限剤について以下説明する。なお、本明細書において「メチオニン制限剤」とは、細胞内のメチオニン量を低減する剤のことを指す。
本実施形態に係るメチオニン制限剤について以下説明する。なお、本明細書において「メチオニン制限剤」とは、細胞内のメチオニン量を低減する剤のことを指す。
【0017】
本発明の一実施形態は、下記化学式（Ｉ）により表されるＳ－アデノシルホモシステイン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むメチオニン制限剤である。
【0018】
【化1】
【0019】
本実施形態において、Ｓ－アデノシルホモシステインの薬学的に許容可能な塩は、特に制限されることはなく、例えば塩酸塩又はスルホン酸塩などを用いることができる。
【0020】
本実施形態において、メチオニン制限剤中のＳ－アデノシルホモシステイン又はその薬学的に許容可能な塩の含有量は、有効成分として含むものであればよく、細胞内のメチオニン量を低減できる限りにおいて、その含有量は特に制限されない。例えば、本実施形態に係るメチオニン制限剤は、該制限剤の全重量を基準として、Ｓ－アデノシルホモシステイン又はその薬学的に許容可能な塩を、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、３重量％、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％又は１００重量％で含むものであってよい。
【0021】
本実施形態において、メチオニン制限剤は、製剤添加物を含むものであってもよい。製剤添加物は、後述する剤形に応じて適宜選択することができる。製剤添加物としては、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ｐＨ安定剤、ビヒクル、防腐剤及び結合剤などが挙げられ、その種類は特に制限されない。また製剤添加物の含有量も特に制限されず、細胞内のメチオニン量を低減できる限りにおいて、適宜調節することができる。例えば、有効成分であるＳ－アデノシルホモシステイン又はその薬学的に許容可能な塩と製剤添加物の含有量を合計して１００重量％となるように調節することができる。
【0022】
本実施形態において、メチオニン制限剤の剤形は特に制限されず、任意である。例えば、経口剤であってよいし、注射剤であってもよい。経口剤としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤及び舌下などが挙げられる。
【0023】
本実施形態において、メチオニン制限剤の投与方法は特に制限されず、任意である。例えば、経口投与、注射投与などが挙げられる。
【0024】
本実施形態において、メチオニン制限剤が適用される対象は、細胞内のメチオニン量を低減できる限りにおいて特に制限されない。例えば、対象は哺乳類動物、線虫、酵母などである。哺乳類動物も特に制限されないが、例えばヒト、ネズミ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ及びネコなどである。
【0025】
図１を参照しつつ、本実施形態に係るメチオニン制限剤によるメチオニン制限の原理について説明する。なお、図１中、太線の上矢印は増加を示し、太線の下矢印は減少を示す。図１の上側に示すように、通常、メチオニン代謝系では、生体内でメチオニン（Ｍｅｔ）とアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）からＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）が合成される。そして、このＳＡＭがメチル基を他の分子に供与することでＳ－アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）が合成される。今回、本発明者らは、このようなメチオニン代謝系において、ＳＡＨを有効成分として含むメチオニン制限剤を投与するとＳＡＭ合成が活性化し、これにより、ＳＡＭの原料であるメチオニン（Ｍｅｔ）が消費され、細胞内のメチオニン量を低減（メチオニン制限）することを明らかにした。さらに、図１の中央に示すように、上述の機構によって細胞内のメチオニン（Ｍｅｔ）量が減少すると、それに連動してＴＯＲ複合体１（ＴＯＲＣ１）の阻害が起こり、該複合体の機能が低下する。なお、ＴＯＲ複合体１（ＴＯＲＣ１）とは、真核生物に広く保存されたセリン・スレオニンキナーゼ複合体であり、タンパク質の合成、代謝、老化、発癌などに関与するものである。そのため、ＴＯＲ複合体１（ＴＯＲＣ１）の機能が低下することにより、生物の寿命を延長することができる。続いて、図１の下側に示すように、上述の機構によって細胞内のメチオニン（Ｍｅｔ）量が減少すると、オートファジーの活性化も誘発する。なお、オートファジーとは、栄養飢餓に応答して不要となったタンパク質などを分解し、必要ならば分解で得たアミノ酸を再利用するシステムであり、特に長寿にはオートファジーの誘導が重要な役割を果たしている場合が多く報告されている。そのため、オートファジーの活性化により、上述のＴＯＲ複合体１（ＴＯＲＣ１）の機能低下と相まって、生物の寿命を延長することができる。
【0026】
また、図１の左上側に示すように、本実施形態に係るメチオニン制限剤は、ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化することができる。このような活性化したＡＭＰＫは異化反応を促進することができ、生物の寿命を延長することができる。これは、上述した細胞内のメチオニン制限とは関係なく起こるものであり、別ルートとしてＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化を引き起こす。なお、以上のメチオニン制限剤による作用効果については、後の実施例にて詳細に示される。
【0027】
上述したように、本実施形態に係るメチオニン制限剤は、メチオニン代謝系におけるＳＡＭ合成を活性化し、ＳＡＭの原料であるメチオニンの量を減少させることができる。このため、簡便かつ継続的なメチオニン制限を可能にする。
【0028】
＜メチオニン制限剤の製造方法＞
本実施形態に係るメチオニン制限剤の製造方法は、特に制限されない。例えば、本実施形態に係るメチオニン制限剤の有効成分である、市販されているＳ－アデノシルホモシステインを購入し、適宜精製を行ったうえで製剤添加物と混合させ、公知の方法により製剤化して製造できる。なお製剤添加物は必須ではないため、Ｓ－アデノシルホモシステインのみを用いて製剤化して製造するものであってもよい。また、市販されているＳ－アデノシルホモシステインのかわりに、化学合成したＳ－アデノシルホモシステインを用いるものであってもよい。Ｓ－アデノシルホモシステインの化学合成方法は特に制限されず、当業者において既知の合成方法であれば適宜使用することができる。また、本実施形態において、メチオニン制限剤の有効成分として、Ｓ－アデノシルホモシステインを含有する酵母を用いることもできる。このような酵母としては、例えば酒酵母などが挙げられる。
本実施形態に係るメチオニン制限剤の製造方法は、特に制限されない。例えば、本実施形態に係るメチオニン制限剤の有効成分である、市販されているＳ－アデノシルホモシステインを購入し、適宜精製を行ったうえで製剤添加物と混合させ、公知の方法により製剤化して製造できる。なお製剤添加物は必須ではないため、Ｓ－アデノシルホモシステインのみを用いて製剤化して製造するものであってもよい。また、市販されているＳ－アデノシルホモシステインのかわりに、化学合成したＳ－アデノシルホモシステインを用いるものであってもよい。Ｓ－アデノシルホモシステインの化学合成方法は特に制限されず、当業者において既知の合成方法であれば適宜使用することができる。また、本実施形態において、メチオニン制限剤の有効成分として、Ｓ－アデノシルホモシステインを含有する酵母を用いることもできる。このような酵母としては、例えば酒酵母などが挙げられる。
【実施例0029】
以下に、本発明に係るメチオニン制限剤について詳細に説明するための実施例を示す。
【0030】
（メチオニン制限剤）
上記化学式（Ｉ）で表されるＳ－アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）（シグマ社製）を購入し、メチオニン制限剤として用いた。メチオニン制限剤中のＳＡＨの含有量は１００重量％である。
上記化学式（Ｉ）で表されるＳ－アデノシルホモシステイン（ＳＡＨ）（シグマ社製）を購入し、メチオニン制限剤として用いた。メチオニン制限剤中のＳＡＨの含有量は１００重量％である。
【0031】
（メチオニン制限剤による酵母中における各アミノ酸含量の変化）
酵母野生株を合成液体培地で対数期（Ａ６００ｎｍ＝０．２）まで培養した。その合成液体培地にＳＡＨの最終濃度が１ｍＭとなるようにメチオニン制限剤を添加し、さらに８時間培養した（Ａ６００ｎｍ＝０．４）。コントロールは、上記メチオニン制限剤の添加と同じ細胞濃度まで増殖させたものを使った（Ａ６００ｎｍ＝０．４）。細胞を集菌し（ＯＤ６００＝３０）、ポアサイズ０．４５μｍのフィルターで濾過した。内部カチオン標準物質はメチオニンスルホン、内部アニオン標準物質は２－モルフォリノエタンスルホン酸を用いた。凍結乾燥した試料を５０μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解し、キャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析計（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ、アジレント・テクノロジー社製）による分析を行った。分析の結果を図２に示す。なお、図２中、縦軸は相対アミノ酸含量としており、これはコントロールの酵母細胞のアミノ酸の値をそれぞれ１とし、メチオニン制限剤を添加した場合の酵母細胞のアミノ酸の値と比較した値である。また、図２中、横軸はアミノ酸の種類としており、Ｍはメチオニン、Ｖはバリン、Ｌはロイシン、Ｋはリシン、Ｉはイソロイシン、Ｓはセリン、Ｆはフェニルアラニン、Ｈはヒスチジン、Ｅはグルタミン酸、Ｑはグルタミン、Ｐはプロリン、Ｇはグリシン、Ｙはチロシン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン、Ｎはアスパラギン、Ａはアラニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｒはアルギニンを示す。また、図２中、それぞれの値は平均値±標準偏差を示し、ｎｓは有意差なし、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す（ｔ検定）。
酵母野生株を合成液体培地で対数期（Ａ６００ｎｍ＝０．２）まで培養した。その合成液体培地にＳＡＨの最終濃度が１ｍＭとなるようにメチオニン制限剤を添加し、さらに８時間培養した（Ａ６００ｎｍ＝０．４）。コントロールは、上記メチオニン制限剤の添加と同じ細胞濃度まで増殖させたものを使った（Ａ６００ｎｍ＝０．４）。細胞を集菌し（ＯＤ６００＝３０）、ポアサイズ０．４５μｍのフィルターで濾過した。内部カチオン標準物質はメチオニンスルホン、内部アニオン標準物質は２－モルフォリノエタンスルホン酸を用いた。凍結乾燥した試料を５０μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解し、キャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析計（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ、アジレント・テクノロジー社製）による分析を行った。分析の結果を図２に示す。なお、図２中、縦軸は相対アミノ酸含量としており、これはコントロールの酵母細胞のアミノ酸の値をそれぞれ１とし、メチオニン制限剤を添加した場合の酵母細胞のアミノ酸の値と比較した値である。また、図２中、横軸はアミノ酸の種類としており、Ｍはメチオニン、Ｖはバリン、Ｌはロイシン、Ｋはリシン、Ｉはイソロイシン、Ｓはセリン、Ｆはフェニルアラニン、Ｈはヒスチジン、Ｅはグルタミン酸、Ｑはグルタミン、Ｐはプロリン、Ｇはグリシン、Ｙはチロシン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン、Ｎはアスパラギン、Ａはアラニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｒはアルギニンを示す。また、図２中、それぞれの値は平均値±標準偏差を示し、ｎｓは有意差なし、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す（ｔ検定）。
【0032】
図２のグラフの左端に示すように、メチオニン制限剤を添加することで、コントロールの場合と比較して酵母細胞内のメチオニン（Ｍ）のみが有意に減少していたことが分かった。この結果から、本実施例に係るメチオニン制限剤は、生体内のメチオニン量を低減（メチオニン制限）できることが分かった。
【0033】
（メチオニン制限剤による酵母中のＳＡＭ量とＭｅｔ量の変化）
酵母野生株を、メチオニンの代わりに安定同位体［ｍｅｔｈｙｌ－１３Ｃ］Ｍｅｔを２０ｍｇ／Ｌ含む合成液体培地で一晩前培養した。その後、新たにメチオニンの代わりに安定同位体［ｍｅｔｈｙｌ－１３Ｃ］Ｍｅｔを２０ｍｇ／Ｌ含む合成液体培地で対数増殖期（Ａ６００ｎｍ＝０．２）まで培養した。これらの手順は、メチオニンの外部供給源が［ｍｅｔｈｙｌ－１３Ｃ］Ｍｅｔのみであることを保証するためのものである。その後、培養液を２つに分け、一方に１ｍＭのメチオニン制限剤の水溶液を加え、さらに８時間培養した（Ａ６００ｎｍ＝０．４）。もう一方はコントロールとし、対数増殖期まで培養した（Ａ６００ｎｍ＝０．４）。［メチル－１３Ｃ］Ｍｅｔ及び［メチル－１３Ｃ］ＳＡＭの含有量は、ｍｇ乾燥菌体重量あたりのｎｍｏｌとして表した。［ｍｅｔｈｙｌ－１３Ｃ］由来のＭｅｔ及びＳＡＭの抽出は、細胞を集菌し（ＯＤ６００ｎｍ＝１５）、２０ｍＬの冷水で２回洗浄した後、１ｍＬの１０％過塩素酸で１時間抽出した。上清をＭｉｌｌｉ－Ｑ水で希釈し、キャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析計（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ）による分析を行った。分析の結果を図３に示しており、（ａ）は酵母細胞内の［メチル－１３Ｃ］Ｍｅｔ量、（ｂ）は酵母細胞内の［メチル－１３Ｃ］ＳＡＭ量を示す。なお、図３中、－はコントロール、＋は介入群を示す。また、図３中、それぞれの値は平均値±標準偏差を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１（ｔ検定）を示す。
酵母野生株を、メチオニンの代わりに安定同位体［ｍｅｔｈｙｌ－１３Ｃ］Ｍｅｔを２０ｍｇ／Ｌ含む合成液体培地で一晩前培養した。その後、新たにメチオニンの代わりに安定同位体［ｍｅｔｈｙｌ－１３Ｃ］Ｍｅｔを２０ｍｇ／Ｌ含む合成液体培地で対数増殖期（Ａ６００ｎｍ＝０．２）まで培養した。これらの手順は、メチオニンの外部供給源が［ｍｅｔｈｙｌ－１３Ｃ］Ｍｅｔのみであることを保証するためのものである。その後、培養液を２つに分け、一方に１ｍＭのメチオニン制限剤の水溶液を加え、さらに８時間培養した（Ａ６００ｎｍ＝０．４）。もう一方はコントロールとし、対数増殖期まで培養した（Ａ６００ｎｍ＝０．４）。［メチル－１３Ｃ］Ｍｅｔ及び［メチル－１３Ｃ］ＳＡＭの含有量は、ｍｇ乾燥菌体重量あたりのｎｍｏｌとして表した。［ｍｅｔｈｙｌ－１３Ｃ］由来のＭｅｔ及びＳＡＭの抽出は、細胞を集菌し（ＯＤ６００ｎｍ＝１５）、２０ｍＬの冷水で２回洗浄した後、１ｍＬの１０％過塩素酸で１時間抽出した。上清をＭｉｌｌｉ－Ｑ水で希釈し、キャピラリー電気泳動－飛行時間型質量分析計（ＣＥ－ＴＯＦＭＳ）による分析を行った。分析の結果を図３に示しており、（ａ）は酵母細胞内の［メチル－１３Ｃ］Ｍｅｔ量、（ｂ）は酵母細胞内の［メチル－１３Ｃ］ＳＡＭ量を示す。なお、図３中、－はコントロール、＋は介入群を示す。また、図３中、それぞれの値は平均値±標準偏差を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１（ｔ検定）を示す。
【0034】
図３（ａ）に示すように、メチオニン制限剤を添加することで、細胞内［メチル－１３Ｃ］Ｍｅｔ量は有意に減少したことが分かった。これは上述の結果とも一致している。一方で、図３（ｂ）に示すように、メチオニン制限剤を添加することで、細胞内［メチル－１３Ｃ］ＳＡＭ量は有意に増加したことが分かった。この結果から、本実施例に係るメチオニン制限剤は、酵母細胞内のＳＡＭ合成を促進することでＳＡＭの原料であるメチオニン（Ｍｅｔ）を消費し、酵母細胞内のメチオニン量を低減していることが推察された。
【0035】
（メチオニン制限剤による酵母のオートファジーへの影響）
メチオニン制限剤による酵母のオートファジーへの影響を確認するために、ＧＦＰ－Ａｔｇ８ ｃｌｅｖａｇｅアッセイを行った。なお、ＧＦＰ－Ａｔｇ８ ｃｌｅｖａｇｅアッセイは、オートファジーの活性を測る周知の生化学的手法である。Ａｔｇ８はオートファゴソーム形成に必須の因子で、オートファゴソーム膜上に存在し、液胞内に運搬された後、分解される。Ａｔｇ８に蛍光タンパク質であるＧＦＰを融合させるとＧＦＰは強固な構造のために分解されずにＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で遊離ＧＦＰとして検出され、この量をもってオートファジー活性を評価することができる。本試験では、まず、Nair, U., Thumm, M., Klionsky, D. J., & Krick, R. (2011). GFP-Atg8 protease protection as a tool to monitor autophagosome biogenesis. Autophagy, 7, 1546-1550に開示される方法に準じてＧＦＰ－Ａｔｇ８発現プラスミドを保有する酵母細胞を作製し、当該酵母細胞をウラシル欠乏させた液体ＳＤ培地にて対数期（Ａ６００ｎｍ＝０．２）まで増殖させた。ＳＤＣ培地にＳＡＨの最終濃度が１ｍＭとなるようにメチオニン制限剤を添加し、さらに８時間培養した（Ａ６００ｎｍ＝０．４）。コントロールとして、液体ＳＤＣ培地で対数期（Ａ６００ｎｍ＝０．４）まで細胞を増殖させたものを使用した。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を最終濃度約９％まで添加し、少なくとも５分間氷上で静置した。細胞を冷したアセトンで２回洗浄し、乾燥させた。ペレットを１００μＬの尿素バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ尿素、１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｘ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）に再懸濁した。１％ Ｔｗｅｅｎ２０を加え、室温で等量のガラスビーズでボルテックスして溶解し、その後６５℃で１０分間加熱した。さらに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと抗ＧＦＰ抗体及び抗ＰＳＴＡＩＲ抗体を用いたイムノブロッティングを用いて分析を行った。ウェスタンブロッティングの結果のシグナルの定量化にはＩｍａｇｅＪを用い、統計解析にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用いた。分析の結果を図４に示す。なお、図４中のグラフは、遊離ＧＦＰの量をＣｄｃ２８量で規格化した相対強度を示している。また、図４中、それぞれの値は平均値±標準偏差を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１（ｔ検定）を示す。
メチオニン制限剤による酵母のオートファジーへの影響を確認するために、ＧＦＰ－Ａｔｇ８ ｃｌｅｖａｇｅアッセイを行った。なお、ＧＦＰ－Ａｔｇ８ ｃｌｅｖａｇｅアッセイは、オートファジーの活性を測る周知の生化学的手法である。Ａｔｇ８はオートファゴソーム形成に必須の因子で、オートファゴソーム膜上に存在し、液胞内に運搬された後、分解される。Ａｔｇ８に蛍光タンパク質であるＧＦＰを融合させるとＧＦＰは強固な構造のために分解されずにＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で遊離ＧＦＰとして検出され、この量をもってオートファジー活性を評価することができる。本試験では、まず、Nair, U., Thumm, M., Klionsky, D. J., & Krick, R. (2011). GFP-Atg8 protease protection as a tool to monitor autophagosome biogenesis. Autophagy, 7, 1546-1550に開示される方法に準じてＧＦＰ－Ａｔｇ８発現プラスミドを保有する酵母細胞を作製し、当該酵母細胞をウラシル欠乏させた液体ＳＤ培地にて対数期（Ａ６００ｎｍ＝０．２）まで増殖させた。ＳＤＣ培地にＳＡＨの最終濃度が１ｍＭとなるようにメチオニン制限剤を添加し、さらに８時間培養した（Ａ６００ｎｍ＝０．４）。コントロールとして、液体ＳＤＣ培地で対数期（Ａ６００ｎｍ＝０．４）まで細胞を増殖させたものを使用した。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を最終濃度約９％まで添加し、少なくとも５分間氷上で静置した。細胞を冷したアセトンで２回洗浄し、乾燥させた。ペレットを１００μＬの尿素バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．５］、１ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ尿素、１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｘ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）に再懸濁した。１％ Ｔｗｅｅｎ２０を加え、室温で等量のガラスビーズでボルテックスして溶解し、その後６５℃で１０分間加熱した。さらに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと抗ＧＦＰ抗体及び抗ＰＳＴＡＩＲ抗体を用いたイムノブロッティングを用いて分析を行った。ウェスタンブロッティングの結果のシグナルの定量化にはＩｍａｇｅＪを用い、統計解析にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用いた。分析の結果を図４に示す。なお、図４中のグラフは、遊離ＧＦＰの量をＣｄｃ２８量で規格化した相対強度を示している。また、図４中、それぞれの値は平均値±標準偏差を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１（ｔ検定）を示す。
【0036】
図４に示すように、メチオニン制限剤を添加することで、遊離－ＧＦＰの量が増加したことが分かった。この結果から、本実施例に係るメチオニン制限剤は、酵母におけるオートファジーを誘導できることが分かった。
【0037】
（メチオニン制限剤による線虫のＭｅｔ量の変化）
線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ野生株）におけるＭｅｔ量の変化を確認するために、ＨＳＰ－６遺伝子のプロモーター領域とＧＦＰを融合したｈｓｐ－６ｐ：：ＧＦＰ線虫を用いて、ｈｓｐ－６ｐ：：ＧＦＰレポーターアッセイを実施した。Amin, M. R., Mahmud, S. A., Dowgielewicz, J. L., Sapkota, M., & Pellegrino, M. W. (2020). A novel gene-diet interaction promotes organismal lifespan and host protection during infection via the mitochondrial UPR. PLoS Genetics, 16, e1009234に基づく当該アッセイでは、細胞内のメチオニン量が減少するとｈｓｐ－６遺伝子が増加することが報告されており、この量をもって線虫におけるＭｅｔ量の変化を評価することができる。本試験では、まず、同調した卵を、未処理、Ｍｅｔ単独（１０ｍＭ）、メチオニン制限剤単独（５０、１００μＭ）、及びＭｅｔ（１０ｍＭ）とメチオニン制限剤（１００μＭ）を含むＯＰ５０菌を塗布したＮＧＭプレートに置いた。３日後、成虫の１日目を、固定化のために２０ｍＭ テトラミソールを用いた２％寒天パッドをスライドガラスにマウントした。蛍光画像は、Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２顕微鏡と１０Ｘ／０．２５対物レンズを使用して取得し、ＺＥＮ２０１２ソフトウェアを使用して処理した。取得した画像はＩｍａｇｅＪで腸内のＧＦＰ強度を測定することによりスコア化した。分析の結果を図５に示す。なお、図５の上側の写真中スケールバーは１００μｍであり、図５の下側のグラフの縦軸は線虫の腸内における相対的なＧＦＰ強度を定量化したものを示している。また、図５中、ｎｓは有意差なし、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。なお、検定はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎにて行っている。
線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ野生株）におけるＭｅｔ量の変化を確認するために、ＨＳＰ－６遺伝子のプロモーター領域とＧＦＰを融合したｈｓｐ－６ｐ：：ＧＦＰ線虫を用いて、ｈｓｐ－６ｐ：：ＧＦＰレポーターアッセイを実施した。Amin, M. R., Mahmud, S. A., Dowgielewicz, J. L., Sapkota, M., & Pellegrino, M. W. (2020). A novel gene-diet interaction promotes organismal lifespan and host protection during infection via the mitochondrial UPR. PLoS Genetics, 16, e1009234に基づく当該アッセイでは、細胞内のメチオニン量が減少するとｈｓｐ－６遺伝子が増加することが報告されており、この量をもって線虫におけるＭｅｔ量の変化を評価することができる。本試験では、まず、同調した卵を、未処理、Ｍｅｔ単独（１０ｍＭ）、メチオニン制限剤単独（５０、１００μＭ）、及びＭｅｔ（１０ｍＭ）とメチオニン制限剤（１００μＭ）を含むＯＰ５０菌を塗布したＮＧＭプレートに置いた。３日後、成虫の１日目を、固定化のために２０ｍＭ テトラミソールを用いた２％寒天パッドをスライドガラスにマウントした。蛍光画像は、Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２顕微鏡と１０Ｘ／０．２５対物レンズを使用して取得し、ＺＥＮ２０１２ソフトウェアを使用して処理した。取得した画像はＩｍａｇｅＪで腸内のＧＦＰ強度を測定することによりスコア化した。分析の結果を図５に示す。なお、図５の上側の写真中スケールバーは１００μｍであり、図５の下側のグラフの縦軸は線虫の腸内における相対的なＧＦＰ強度を定量化したものを示している。また、図５中、ｎｓは有意差なし、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。なお、検定はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎにて行っている。
【0038】
図５のコントロール、１００μＭ ＳＡＨの結果に示すように、メチオニン制限剤単独により処理することで、コントロールと比較してＧＦＰの蛍光が有意に強くなったことが分かった。すなわち、メチオニン制限剤の処理によって線虫内のｈｓｐ－６ｐ：：ＧＦＰが増加したことが分かり、細胞内のメチオニン量は減少したことが分かった。一方、Ｍｅｔ単独（１０ｍＭ Ｍｅｔ）で処理した場合、ＧＦＰの蛍光は見られず、線虫内においてｈｓｐ－６ｐ：：ＧＦＰの増加は見られなかった。また、Ｍｅｔとメチオニン制限剤の両方で処理した場合、１００μＭ メチオニン制限剤単独処理の場合と比較して、ＧＦＰの蛍光が有意に減少したことが分かった。すなわち、メチオニン制限剤の処理によって線虫内のｈｓｐ－６ｐ：：ＧＦＰが増加したことが分かり、細胞内のメチオニン量は減少したことが分かった。これらの結果から、本実施例に係るメチオニン制限剤は、線虫のメチオニン量を低減（メチオニン制限）できることが分かった。
【0039】
（メチオニン制限剤による線虫のオートファジーへの影響）
線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ野生株）のＨＬＨ－３０：：ＧＦＰ株を用いて、オートファジーの評価を行った。ＨＬＨ－３０は線虫のオートファジーを調節する因子として知られており、細胞内におけるＨＬＨ－３０の核局在化がオートファジーのアップレギュレートに関連することが知られている。まず、Settembre, C., Zoncu, R., Medina, D. L., Vetrini, F., Erdin, S., Erdin, S., Huynh, T., Ferron, M., Karsenty, G., Vellard, M. C., Facchinetti, V., Sabatini, D. M., & Ballabio, A. (2012). A lysosome-to-nucleus signalling mechanism senses and regulates the lysosome via mTOR and TFEB. Embo Journal, 31, 1095-1108に開示される方法に準じて線虫のＨＬＨ－３０：：ＧＦＰ株を作製し、当該株の同調した卵を、未処理又はメチオニン制限剤（ＳＡＨ濃度５０μＭ）を添加した大腸菌ＯＰ５０株を含むＮＧＭプレートに置いた。数日後、成虫１日目の線虫を２０ｍＭ テトラミソールを用いて２％寒天パッドで対物スライドにマウントし、固定化した。蛍光画像は、Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２顕微鏡と１０Ｘ／０．２５対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を用いて取得し、ＺＥＮ２０１２ソフトウェアを使用して処理した。すべてのサンプルはマウント後５分以内に撮影した。分析の結果を図６に示す。なお、顕微鏡画像は以下のように分類した：ｎｏｎｅ，ＧＦＰが細胞質に拡散し、細胞質と核の間に強度差がない；ｌｏｗ，ＧＦＰが一部の腸管細胞で細胞質より強く核に局在する；ｍｅｄｉｕｍ，ＧＦＰがすべての腸管細胞で細胞質より強く核に局在する；ｈｉｇｈ，ＧＦＰがすべての腸管細胞の核にのみ局在している。また、図６中、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。なお、検定はｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ ｔｅｓｔにて行っている。
線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ野生株）のＨＬＨ－３０：：ＧＦＰ株を用いて、オートファジーの評価を行った。ＨＬＨ－３０は線虫のオートファジーを調節する因子として知られており、細胞内におけるＨＬＨ－３０の核局在化がオートファジーのアップレギュレートに関連することが知られている。まず、Settembre, C., Zoncu, R., Medina, D. L., Vetrini, F., Erdin, S., Erdin, S., Huynh, T., Ferron, M., Karsenty, G., Vellard, M. C., Facchinetti, V., Sabatini, D. M., & Ballabio, A. (2012). A lysosome-to-nucleus signalling mechanism senses and regulates the lysosome via mTOR and TFEB. Embo Journal, 31, 1095-1108に開示される方法に準じて線虫のＨＬＨ－３０：：ＧＦＰ株を作製し、当該株の同調した卵を、未処理又はメチオニン制限剤（ＳＡＨ濃度５０μＭ）を添加した大腸菌ＯＰ５０株を含むＮＧＭプレートに置いた。数日後、成虫１日目の線虫を２０ｍＭ テトラミソールを用いて２％寒天パッドで対物スライドにマウントし、固定化した。蛍光画像は、Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２顕微鏡と１０Ｘ／０．２５対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を用いて取得し、ＺＥＮ２０１２ソフトウェアを使用して処理した。すべてのサンプルはマウント後５分以内に撮影した。分析の結果を図６に示す。なお、顕微鏡画像は以下のように分類した：ｎｏｎｅ，ＧＦＰが細胞質に拡散し、細胞質と核の間に強度差がない；ｌｏｗ，ＧＦＰが一部の腸管細胞で細胞質より強く核に局在する；ｍｅｄｉｕｍ，ＧＦＰがすべての腸管細胞で細胞質より強く核に局在する；ｈｉｇｈ，ＧＦＰがすべての腸管細胞の核にのみ局在している。また、図６中、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。なお、検定はｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ ｔｅｓｔにて行っている。
【0040】
図６に示すように、メチオニン制限剤で処理をすることで、未処理の場合と比較してｌｏｗとｍｅｄｉｕｍの割合が増加したことが分かった。従って、ＧＦＰの核局在化が誘導されることが分かり、すなわちＨＬＨ－３０の核局在化が誘導されることが分かった。この結果から、本実施例に係るメチオニン制限剤は、線虫のオートファジーを誘導できることが分かった。
【0041】
（メチオニン制限剤による線虫の寿命への影響）
寿命測定は、抗生物質無添加の固形ＮＧＭプレート上で行った。線虫の餌となる大腸菌ＯＰ５０株をＬＢ培地で３７℃で１２～１６時間培養し、ＮＧＭプレートに播種した。すべての線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ野生株）は測定前に少なくとも２世代継代した。卵を持った１日目の成虫線虫を、未添加又は各濃度のメチオニン制限剤（ＳＡＨの濃度で１０、５０μＭ）を含むＮＧＭ上で６時間の時限産卵により同期化させた。数日後、２０～３０匹の同期した若齢成虫を６０μＭ ５－フルオロ－２’デオキシウリジン（ＦＵｄＲ）とメチオニン制限剤を含むＮＧＭ又はＦＵｄＲのみのＮＧＭプレートに移した。生存率は、若齢成虫を置いた時を０としてプロットし、数日おきに生死を測定し、スコア化した。生存曲線はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を用いて作成した。ｐ値はｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）ｔｅｓｔにより決定した。測定した結果を図７に示す。なお、図７中、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。また、検定はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎにて行っている。
寿命測定は、抗生物質無添加の固形ＮＧＭプレート上で行った。線虫の餌となる大腸菌ＯＰ５０株をＬＢ培地で３７℃で１２～１６時間培養し、ＮＧＭプレートに播種した。すべての線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ野生株）は測定前に少なくとも２世代継代した。卵を持った１日目の成虫線虫を、未添加又は各濃度のメチオニン制限剤（ＳＡＨの濃度で１０、５０μＭ）を含むＮＧＭ上で６時間の時限産卵により同期化させた。数日後、２０～３０匹の同期した若齢成虫を６０μＭ ５－フルオロ－２’デオキシウリジン（ＦＵｄＲ）とメチオニン制限剤を含むＮＧＭ又はＦＵｄＲのみのＮＧＭプレートに移した。生存率は、若齢成虫を置いた時を０としてプロットし、数日おきに生死を測定し、スコア化した。生存曲線はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を用いて作成した。ｐ値はｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）ｔｅｓｔにより決定した。測定した結果を図７に示す。なお、図７中、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。また、検定はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎにて行っている。
【0042】
図７に示すように、メチオニン制限剤を溶解した培地（１０μＭ ＳＡＨ、５０μＭ ＳＡＨ）で処理した線虫については、コントロール（ＳＡＨ ０μＭ）の場合と比較して線虫の生存率が高くなったことが分かった。この結果から、本実施例に係るメチオニン制限剤は、線虫の寿命を延長できることが分かった。
【0043】
（メチオニン制限剤による線虫のＡＭＰ依存性プロテインキナーゼへの影響）
まず、ＳＡＨ未添加の培地及びＳＡＨ濃度が１、１０、５０、１００μＭとなるようにメチオニン制限剤をそれぞれ添加したＮＧＭプレートに成虫線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ野生株）を移して静置し、卵を産ませた。その後、同培地上で３０００個の同調した卵を２日間培養した。Ｌ４ステージまで成長した線虫をそれぞれ回収し、Ｍ９バッファーを用いて２回洗浄した。それらの線虫を１００μＬのタンパク質溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。その線虫を１０秒間のソニケーションを２回用いて溶解させた。溶解液は４℃で最大速度でスピンダウンし、上清は－２０℃で保存した。サンプルバッファーを加え、９５℃で５分間煮沸し、１６μｇのサンプルをロードしてＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。ブロットをＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで１時間ブロッキングし、一次抗体として抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体又は抗チューブリン抗体を用いて、４℃で一晩静置した。それぞれの二次抗体を用いてさらに１時間反応させた。最後に、ＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステムを使用して、タンパク質のシグナルを検出した。分析の結果を図８に示す。なお、図８中のグラフは、野生株線虫をＳＡＨ未処理又は１、１０、５０、１００μＭのＳＡＨで処理した場合のＡＭＰＫリン酸化レベル（Ｐｈｏｓ．ＡＭＰＫ）をα－ｔｕｂｕｌｉｎ量で規格化した相対強度を示している。また、図８中、＊はｐ＜０．０５を示す。なお、検定はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎにて行っている。
まず、ＳＡＨ未添加の培地及びＳＡＨ濃度が１、１０、５０、１００μＭとなるようにメチオニン制限剤をそれぞれ添加したＮＧＭプレートに成虫線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ野生株）を移して静置し、卵を産ませた。その後、同培地上で３０００個の同調した卵を２日間培養した。Ｌ４ステージまで成長した線虫をそれぞれ回収し、Ｍ９バッファーを用いて２回洗浄した。それらの線虫を１００μＬのタンパク質溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ－４０、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。その線虫を１０秒間のソニケーションを２回用いて溶解させた。溶解液は４℃で最大速度でスピンダウンし、上清は－２０℃で保存した。サンプルバッファーを加え、９５℃で５分間煮沸し、１６μｇのサンプルをロードしてＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。ブロットをＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（ＴＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで１時間ブロッキングし、一次抗体として抗リン酸化ＡＭＰＫ抗体又は抗チューブリン抗体を用いて、４℃で一晩静置した。それぞれの二次抗体を用いてさらに１時間反応させた。最後に、ＢｉｏＲａｄ ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステムを使用して、タンパク質のシグナルを検出した。分析の結果を図８に示す。なお、図８中のグラフは、野生株線虫をＳＡＨ未処理又は１、１０、５０、１００μＭのＳＡＨで処理した場合のＡＭＰＫリン酸化レベル（Ｐｈｏｓ．ＡＭＰＫ）をα－ｔｕｂｕｌｉｎ量で規格化した相対強度を示している。また、図８中、＊はｐ＜０．０５を示す。なお、検定はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎにて行っている。
【0044】
図８に示すように、メチオニン制限剤による処理をすることで、コントロール（０μＭ ＳＡＨ）の場合と比較して、Ｐｈｏｓ．ＡＭＰＫ／α－ｔｕｂｕｌｉｎの値が上昇したことが分かった（１、１０、５０、１００μＭ ＳＡＨ）。この結果から、本実施例に係るメチオニン制限剤は、ＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化できることが分かった。
【0045】
上述の結果から、本実施例に係るメチオニン制限剤は、酵母及び線虫のメチオニン代謝系におけるＳ－アデノシルメチオニン合成を活性化し、細胞内のメチオニンの量を減少できることが分かった。従って、簡便かつ継続的なメチオニン制限を可能にするメチオニン制限剤として有用であることが分かった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
