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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024056288
(43)【公開日】2024-04-23
(54)【発明の名称】神経変性疾患抑制剤
(51)【国際特許分類】
A61K 36/284 20060101AFI20240416BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240416BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240416BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240416BHJP
A61K 35/00 20060101ALI20240416BHJP
A61K 36/68 20060101ALI20240416BHJP
A61K 36/23 20060101ALI20240416BHJP
A61K 36/736 20060101ALI20240416BHJP
A61K 36/9068 20060101ALI20240416BHJP
A61K 36/346 20060101ALI20240416BHJP
A61K 36/756 20060101ALI20240416BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240416BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240416BHJP
【ＦＩ】
A61K36/284
A61P25/00
A61P25/16
A61P25/28
A61K35/00
A61K36/68
A61K36/23
A61K36/736
A61K36/9068
A61K36/346
A61K36/756
A61K31/7105
A61K48/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022163069
(22)【出願日】2022-10-11
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和４年４月１９日に、ｈｔｔｐｓ：／／ｋａｋｅｎ．ｎｉｉ．ａｃ．ｊｐ／ｊａ／ｇｒａｎｔ／ＫＡＫＥＮＨＩ－ＰＲＯＪＥＣＴ－２２Ｋ１５３０４／で公開されている日本学術振興会のウェブサイトにて発表
(71)【出願人】
【識別番号】504174180
【氏名又は名称】国立大学法人高知大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002837
【氏名又は名称】弁理士法人アスフィ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】宮村 充彦
(72)【発明者】
【氏名】常風 興平
(72)【発明者】
【氏名】石田 智滉
(72)【発明者】
【氏名】川田 敬
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4C087
4C088
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084MA52
4C084NA14
4C084ZA02
4C084ZA16
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA16
4C087AA01
4C087AA02
4C087CA20
4C087MA52
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA16
4C088AB22
4C088AB26
4C088AB30
4C088AB40
4C088AB52
4C088AB62
4C088AB81
4C088AC20
4C088BA40
4C088MA52
4C088NA14
4C088ZA02
4C088ZA16
(57)【要約】
【課題】本発明は、安全で、神経細胞を有効に保護することにより神経変性疾患を予防または治療することが可能な製剤を提供することを目的とする。
【解決手段】本発明に係る神経変性疾患抑制剤は、車前子、人参、杏仁、牛膝、沢瀉、忍冬、生姜、乾姜、桔梗、黄柏、及び蒼朮から選択される１以上の生薬に由来する細胞外小胞を有効成分として含むことを特徴とする。
【選択図】なし
【解決手段】本発明に係る神経変性疾患抑制剤は、車前子、人参、杏仁、牛膝、沢瀉、忍冬、生姜、乾姜、桔梗、黄柏、及び蒼朮から選択される１以上の生薬に由来する細胞外小胞を有効成分として含むことを特徴とする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
車前子、人参、杏仁、牛膝、沢瀉、忍冬、生姜、乾姜、桔梗、黄柏、及び蒼朮から選択される１以上の生薬に由来する細胞外小胞を有効成分として含むことを特徴とする神経変性疾患抑制剤。
【請求項2】
前記生薬が蒼朮である請求項１に記載の神経変性疾患抑制剤。
【請求項3】
前記細胞外小胞が、ａｔｈ－ｍｉＲ１６６ｆ、ａｔｈ－ｍｉＲ１６２ａ－５ｐ、及びａｔｈ－ｍｉＲ１６２ｂ－５ｐから選択される１以上のｍｉＲＮＡを含む請求項１に記載の神経変性疾患抑制剤。
【請求項4】
経口剤である請求項１に記載の神経変性疾患抑制剤。
【請求項5】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、及び大脳皮質基底核変性症から選択される１以上の神経変性疾患である請求項１に記載の神経変性疾患抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、安全で、神経細胞を有効に保護することにより神経変性疾患を予防または治療することが可能な製剤に関するものである。
【背景技術】
【0002】
神経変性疾患とは、脳や脊髄にある神経細胞の中で、ある特定の神経細胞群、例えば認知機能に関係する神経細胞や運動機能に関係する細胞が徐々に障害を受け脱落してしまう疾患である。脱落する神経細胞により症状は異なり、神経変性疾患としては、例えば、パーキンソン病など運動機能に障害が生じる疾患、脊髄小脳変性症や一部の痙性対麻痺など、体のバランスが取り難くなる疾患、筋萎縮性側索硬化症など筋力の低下が認められる疾患、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、大脳皮質基底核変性症など、認知機能が障害される疾患が挙げられる。
【0003】
神経変性疾患は、突然発症したり急激に悪化したりすることは少なく、徐々に進行することが多い。よって、神経変性疾患の予防薬や治療薬としては、毎日といった恒常的な投与が可能な安全なものが好ましい。例えば特許文献１に記載の神経変性疾患の予防剤及び／又は治療剤は、ローズマリーなど特定の植物の抽出物を有効成分とする。特許文献２に記載の年齢関連性神経変性疾患軽減用組成物は、全コーヒー果実抽出物を含む。
【0004】
ところで、近年、その細胞間情報伝達物質としての役割が明らかにされて以来、細胞外小胞であるエクソソームが注目を集めている。エクソソームは、ほとんどの細胞で内部形成されて細胞外に放出される、通常、３０～２００ｎｍ程度の小胞であり、細胞膜と同様の構成の脂質二重膜の内部に、脂質、タンパク質、核酸などの細胞成分を含んでいる。細胞外小胞としては、エクソソームの他に、マイクロベシクルやアポトーシス小胞が知られている。マイクロベシクルは、直径１００～１０００ｎｍの粒子であり、細胞膜から細胞外へ直接分泌される以外、エクソソームと明確に区別は難しい。アポトーシス小胞は、直径１～５μｍ程度の粒子であり、細胞のプログラム細胞死により生じ、遺伝物質の情報伝達を担っているとの報告がある。
【0005】
また、細胞外小胞は、ドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）のための利用も検討されている（特許文献３，４、及び非特許文献１，２）。
【0006】
更に、エクソソーム自体の薬効に関しても検討されている。例えば特許文献５には、免疫系エンハンサー、サイレンサーおよびモジュレーターとしての植物エクソソームの使用が記載されている。特許文献６には、杜仲葉由来のエクソソームを含むウイルス感染症改善剤が開示されている。非特許文献３には、ブドウ由来の細胞外小胞が、腸幹細胞を誘導し、デキストラン硫酸ナトリウムにより引き起こされた大腸炎からマウスを保護することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開２０２１－６３０１８号公報
【特許文献2】特開２０２０－１４３０７５号公報
【特許文献3】特表２０１９－５３５８３９号公報
【特許文献4】特表２０２２－５０７７１０号公報
【特許文献5】特表２０２１－５３６２５７号公報
【特許文献6】特開２０２１－１９３０７０号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Ｂａｏｍｅｉ Ｗａｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．２２，ｎｏ．３，５２２－５３４（２０１４）
【非特許文献2】Ｗｅｎｂｏ Ｎｉｕら，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，２０２１，２１，１４８４－１４９２
【非特許文献3】Ｓｏｎｇｗｅｎ Ｊｕら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．２１，ｎｏ．７，１３４５－１３５７（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上述したように、神経変性疾患は神経細胞の脱落により発症するが、まだ不明な点も多く、十分に有効な薬剤は未だ存在しないのが現状である。
そこで本発明は、安全で、神経細胞を有効に保護することにより神経変性疾患を予防または治療することが可能な製剤を提供することを目的とする。
そこで本発明は、安全で、神経細胞を有効に保護することにより神経変性疾患を予防または治療することが可能な製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特定の生薬由来の細胞外小胞が神経変性疾患抑制剤の有効成分として有用であることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
以下、本発明を示す。
【0011】
［１］ 車前子、人参、杏仁、牛膝、沢瀉、忍冬、生姜、乾姜、桔梗、黄柏、及び蒼朮から選択される１以上の生薬に由来する細胞外小胞を有効成分として含むことを特徴とする神経変性疾患抑制剤。
［２］ 前記生薬が蒼朮である前記［１］に記載の神経変性疾患抑制剤。
［３］ 前記細胞外小胞が、ａｔｈ－ｍｉＲ１６６ｆ、ａｔｈ－ｍｉＲ１６２ａ－５ｐ、及びａｔｈ－ｍｉＲ１６２ｂ－５ｐから選択される１以上のｍｉＲＮＡを含む前記［１］または［２］に記載の神経変性疾患抑制剤。
［４］ 経口剤である前記［１］～［３］のいずれかに記載の神経変性疾患抑制剤。
［５］ 前記神経変性疾患が、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、及び大脳皮質基底核変性症から選択される１以上の神経変性疾患である前記［１］～［４］のいずれかに記載の神経変性疾患抑制剤。
［２］ 前記生薬が蒼朮である前記［１］に記載の神経変性疾患抑制剤。
［３］ 前記細胞外小胞が、ａｔｈ－ｍｉＲ１６６ｆ、ａｔｈ－ｍｉＲ１６２ａ－５ｐ、及びａｔｈ－ｍｉＲ１６２ｂ－５ｐから選択される１以上のｍｉＲＮＡを含む前記［１］または［２］に記載の神経変性疾患抑制剤。
［４］ 経口剤である前記［１］～［３］のいずれかに記載の神経変性疾患抑制剤。
［５］ 前記神経変性疾患が、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、及び大脳皮質基底核変性症から選択される１以上の神経変性疾患である前記［１］～［４］のいずれかに記載の神経変性疾患抑制剤。
【発明の効果】
【0012】
本発明に係る神経変性疾患抑制剤の有効成分である細胞外小胞は、漢方薬の原料である生薬由来のものであることから比較的安全であると考えられる。また、本発明に係る神経変性疾患抑制剤は、神経細胞による炎症性メディエーターの産生を抑制できることから、神経細胞の炎症を直接抑制できる。更に、炎症性サイトカインなどによって発現が誘導され、神経細胞の保護作用を示すヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）の神経細胞による発現を促進することが可能である。よって、本発明に係る神経変性疾患抑制剤は、安全で有効な神経変性疾患の抑制剤として、産業上非常に優れている。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明に係る神経変性疾患抑制剤は、有効成分として、車前子、人参、杏仁、牛膝、沢瀉、忍冬、生姜、乾姜、桔梗、黄柏、及び蒼朮から選択される１以上の生薬に由来する細胞外小胞を含む。以下、細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を「ＥＶｓ」と略記する場合がある。なお、本発明において、「抑制」とは、神経変性疾患の発症を防ぐ予防や、発症した神経変性疾患の症状を軽減や寛解などする治療を含む概念である。
【0015】
細胞外小胞とは、細胞外に放出される、脂質二重層で覆われた核をもたない粒子の総称であり、核酸、タンパク質、脂質、各種代謝産物を含み、その産生機構から、エクソソーム、アポトーシス小胞、マイクロベシクルに分類される。アポトーシス小胞は、直径１～５μｍ程度の粒子であり、細胞のプログラム細胞死により生じ、遺伝物質の情報伝達を担っているとの報告がある。エクソソームは、ほとんどの細胞で内部形成されて細胞外に放出される、通常、３０～２００ｎｍ程度の小胞である。マイクロベシクルは、直径１００～１０００ｎｍの粒子であり、細胞膜から細胞外へ直接分泌される以外、エクソソームと明確に区別は難しい。
【0016】
ＥＶｓのサイズは、一般的に、３０ｎｍ以上、２００ｎｍ以下程度、更には５０ｎｍ以上、１６０ｎｍ以下程度であることから、血液脳関門を透過することができ、脳内の神経細胞の炎症を抑制し且つ保護できる可能性がある。
【0017】
本発明に係る神経変性疾患抑制剤の有効成分であるＥＶｓは、特定の生薬から常法により得ることができる。例えば、目的の生薬由来ＥＶｓの膜タンパク質に特異的な抗体を表面に有する磁気ビーズを用いる方法、目的の生薬由来ＥＶｓの溶解度を下げる試薬を用いて遠心分離する方法、超遠心法などで目的の生薬由来ＥＶｓを得ることができる。例えば超遠心法では、生薬またはその粉砕物から熱水抽出物を得、濾過や遠心分離などを繰り返すことによりＥＶｓ抽出液を得る。この際、孔径が０．５μｍ以上のフィルターでの濾過や、５０，０００×ｇ以下で１分間以上、３０分間以下といった通常の条件の遠心分離では、ＥＶｓは液分に分散している。よって、これら通常の濾過や遠心分離などを繰り返すことにより、不純物を除去することができる。次いで、ＥＶｓを含む抽出液を、１００，０００×ｇ以上で３０分間以上、５時間以下といった超遠心分離により、ＥＶｓを沈殿として得ることができる。かかる超遠心分離により、ＥＶｓを可溶性成分から分離することができる。
【0018】
ＥＶｓを分離すべき生薬は、車前子、人参、杏仁、牛膝、沢瀉、忍冬、生姜、乾姜、桔梗、黄柏、及び蒼朮から選択される１以上の生薬である。車前子は、オオバコ（Ｐｌａｎｔａｇｏ ａｓｉａｔｉｃａ Ｌｉｎｎｅ（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ））の種子である。人参は、オタネニンジン（Ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ（Ｐａｎａｘ ｓｃｈｉｎｓｅｎｇ Ｎｅｅｓ）（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ））の細根を除いた根、又はこれを軽く湯通ししたものである。杏仁は、ホンアンズ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ Ｌｉｎｎｅ）、アンズ（Ｐｒｕｎｕｓ ａｒｍｅｎｉａｃａ Ｌｉｎｎｅ ｖａｒ．ａｎｓｕ Ｍａｘｉｍｏｗｉｃｚ）、又はＰｒｕｎｕｓ ｓｉｂｉｒｉｃａ Ｌｉｎｎｅ（Ｒｏｓａｃｅａｅ）の種子である。牛膝は、Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ ｂｉｄｅｎｔａｔａ Ｂｌｕｍｅ、又はヒナタイノコズチ（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓ ｆａｕｒｉｅｉ Ｈ．Ｌｅｖｅｉｌｌｅ ｅｔ Ｖａｎｉｏｔ（Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ））の根である。沢瀉は、サジオモダカ（Ａｌｉｓｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ Ｊｕｚｅｐｃｚｕｋ（Ａｌｉｓｍａｔａｃｅａｅ））の塊茎で、通例、周皮を除いたものである。忍冬は、スイカズラ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂｅｒｇ（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ））の葉および茎である。生姜は、ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｒｏｓｃｏｅ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ））の根茎で、ときに周皮を除いたものである。乾姜は、ショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｒｏｓｃｏｅ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ））の根茎を湯通し又は蒸したものである。桔梗は、キキョウ（Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｓ Ａ．Ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ（Ｃａｍｐａｎｕｌａｃｅａｅ））の根である。黄柏は、キハダ（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ ａｍｕｒｅｎｓｅ Ｒｕｐｒｅｃｈｔ）又は（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ ｃｈｉｎｅｎｓｅ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（Ｒｕｔａｃｅａｅ））の周皮を除いた樹皮である。蒼朮は、ホソバオケラ Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｌａｎｃｅａ Ｄｅ Ｃａｎｄｏｌｌｅ、シナオケラ（Ａｔｒａｃｔｙｌｏｄｅｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｋｏｉｄｚｕｍｉ）又はそれらの種間雑種（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）の根茎である。
【0019】
細胞外小胞は、脂質二重膜中に核酸やタンパク質を含むものであることから、内部に含まれる核酸やタンパク質が神経変性疾患の抑制作用を示している可能性がある。本発明者らが試験した結果、神経変性疾患の抑制作用を示す細胞外小胞には、ａｔｈ－ｍｉＲ１６６ｆ、ａｔｈ－ｍｉＲ１６２ａ－５ｐ、及びａｔｈ－ｍｉＲ１６２ｂ－５ｐ等のｍｉＲＮＡが含まれていた。
【0020】
本発明に係る神経変性疾患抑制剤の剤形は特に制限されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、液剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの内服剤；エアゾール剤などの吸入剤；注射剤；坐剤などとすることができ得、内服剤などの経口剤が好ましい。本発明に係る神経変性疾患抑制剤は、剤形に応じて様々な添加成分を配合してもよい。例えば、基材、賦形剤、着色剤、滑沢剤、矯味剤、乳化剤、増粘剤、湿潤剤、安定剤、保存剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、界面活性剤、抗酸化剤、佐薬、緩衝剤、ｐＨ調整剤、甘味料、香料などを添加することができる。また、これら添加剤の配合量は、本発明の作用効果を妨げない様な量である限り、必要に応じて適宜設定することができる。更に、他の薬効成分を添加してもよい。
【0021】
本発明に係る神経変性疾患抑制剤は、非常に優れた神経細胞の炎症抑制作用や保護作用を示す一方で、生薬に含まれる成分を有効成分としているために、安全性が比較的高く、恒常的な使用も可能であり得ると考えられる。よって、例えば、神経変性疾患の軽減や寛解のために一日あたり複数回の服用も可能であり得、また、神経変性疾患の予防などを目的として恒常的な服用も可能であり得る。
【0022】
本発明に係る神経変性疾患抑制剤の使用量は、患者の状態、年齢、性別などに応じて適宜調整すべきであり、特に制限されない。例えば、本発明に係る神経変性疾患抑制剤の投与量は、神経変性疾患の抑制作用が認められる範囲で適宜調整すればよいが、例えば、ヒトに対する１日あたり及び体重１ｋｇあたりの細胞外小胞の投与量が、０．１ｍｇ以上、２００ｍｇ以下程度となるように、１日当たり１回以上、５回以下程度投与することができる。なお、前記の患者には、神経変性疾患の症状や特徴が認められる者に限定されず、神経変性疾患の症状や特徴は認められないが、神経変性疾患を予防すべき者も含まれるものとする。また、患者には、ヒトの他、愛玩動物などヒト以外の動物が含まれるものとする。
【0023】
本発明の神経変性疾患は、神経細胞の炎症を直接抑制できる他、炎症などから神経細胞を保護する酵素の発現を誘導することができる。また、本発明の神経変性疾患の有効成分である細胞外小胞は植物由来のものであり、安全性が比較的高いと考えられるので、神経変性疾患の症状の緩和や寛解の目的の他、神経変性疾患の予防目的の薬剤として、或いは神経変性疾患の予防効果を有する健康食品または健康飲料として、恒常的に継続して使用することもでき得る。更に、本発明に係る神経変性疾患抑制剤は、その有効成分のサイズによっては、血液脳関門を透過することができ、脳組織へ直接作用することも可能であり得る。よって、特に脳組織中の神経細胞に関する疾患、例えば、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、及び大脳皮質基底核変性症などに有効である可能性がある。
【実施例0024】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【0025】
実施例１： 生薬由来細胞外小胞
（１）生薬由来細胞外小胞の単離
図１に示す生薬（２０ｇ）に水（４００ｍＬ）を加え、穏やかに３０分間煮沸した後、濾過した。得られた濾液を８，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を回収し、更に２０，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を回収し、０．８μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。濾液を１４０，０００×ｇで５０分間超遠心分離した。上清を除去することにより、ペレット状の生薬由来細胞外小胞（ＥＶｓ）を得た。
（１）生薬由来細胞外小胞の単離
図１に示す生薬（２０ｇ）に水（４００ｍＬ）を加え、穏やかに３０分間煮沸した後、濾過した。得られた濾液を８，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を回収し、更に２０，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を回収し、０．８μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過した。濾液を１４０，０００×ｇで５０分間超遠心分離した。上清を除去することにより、ペレット状の生薬由来細胞外小胞（ＥＶｓ）を得た。
【0026】
（２）抗炎症効果を指標としたスクリーニング
マウスミクログリアＢＶ－２細胞の培養液に、各生薬から分画したＥＶｓを２０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、培養液に内毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ）を０．５μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で２４時間刺激した。２４時間後に培養上清を回収し、炎症の指標となる一酸化窒素（ＮＯ）の産生量をＧｒｉｅｓｓ法で測定した。
比較のために、ＥＶｓおよびＬＰＳを用いない以外は同様の条件でインキュベートのみした非処理細胞（ｎｏｒｍａｌ）、ＥＶｓを用いない以外は同様の条件でインキュベートのみした対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）、及びＥＶｓの代わりにステロイド系抗炎症薬であるデキサメタゾンを１．０μＭ添加した陽性対照の一酸化窒素（ＮＯ）の産生量を同様に測定した。
測定は４例ずつ実施し、平均値を算出した。結果を図１に示す。図１中、「＊」はＡＮＯＶＡに続くＤｕｎｎｅｔ’ｓテストによりｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
マウスミクログリアＢＶ－２細胞の培養液に、各生薬から分画したＥＶｓを２０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、培養液に内毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ）を０．５μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で２４時間刺激した。２４時間後に培養上清を回収し、炎症の指標となる一酸化窒素（ＮＯ）の産生量をＧｒｉｅｓｓ法で測定した。
比較のために、ＥＶｓおよびＬＰＳを用いない以外は同様の条件でインキュベートのみした非処理細胞（ｎｏｒｍａｌ）、ＥＶｓを用いない以外は同様の条件でインキュベートのみした対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）、及びＥＶｓの代わりにステロイド系抗炎症薬であるデキサメタゾンを１．０μＭ添加した陽性対照の一酸化窒素（ＮＯ）の産生量を同様に測定した。
測定は４例ずつ実施し、平均値を算出した。結果を図１に示す。図１中、「＊」はＡＮＯＶＡに続くＤｕｎｎｅｔ’ｓテストによりｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
【0027】
図１に示される結果の通り、試験した生薬のうち、車前子、人参、杏仁、牛膝、沢瀉、忍冬、生姜、乾姜、桔梗、黄柏、及び蒼朮に由来するＥＶｓの処理により、一酸化窒素の産生が有意に抑制された。また、その中でも蒼朮由来ＥＶｓの活性が最も高かった。
【0028】
（３）ＥＶｓのサイズ測定
一酸化窒素産生抑制活性が最も高かった蒼朮由来ＥＶｓを透過型電子顕微鏡（「ＪＥＭ－２０００ＥＸ」日本電子社製）で観察し、また、得られた画像を粒子解析ソフトで解析して粒度分布を算出した。蒼朮由来ＥＶｓの透過型電子顕微鏡像を図２（１）に、粒度分布を図２（２）に示す。
図２に示す通り、蒼朮由来ＥＶｓの直径は５０～３６５ｎｍであり、平均粒子径は１５９．４±５．７ｎｍであった。
一酸化窒素産生抑制活性が最も高かった蒼朮由来ＥＶｓを透過型電子顕微鏡（「ＪＥＭ－２０００ＥＸ」日本電子社製）で観察し、また、得られた画像を粒子解析ソフトで解析して粒度分布を算出した。蒼朮由来ＥＶｓの透過型電子顕微鏡像を図２（１）に、粒度分布を図２（２）に示す。
図２に示す通り、蒼朮由来ＥＶｓの直径は５０～３６５ｎｍであり、平均粒子径は１５９．４±５．７ｎｍであった。
【0029】
実施例２： 蒼朮由来細胞外小胞の炎症性メディエーターへの影響
マウスミクログリアＢＶ－２細胞の培養液に、陽性対照としてステロイド系抗炎症薬であるデキサメタゾンを１．０μＭ、又は蒼朮由来ＥＶｓを０～２０μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、培養液に内毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ）を０．５μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で２４時間刺激した。
２４時間後に培養上清を回収し、炎症の指標となる一酸化窒素（ＮＯ）の産生量をＧｒｉｅｓｓ法で測定し、炎症性サイトカインであるＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαの産生量をサイトカイン測定ＥＬＩＳＡキット（「Ｑｕａｎｔｋｉｎａｓｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ」Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で測定した。また、対照群として、デキサメタゾン、ＥＶｓおよびリポ多糖のいずれも添加せず、同条件でインキュベートした培地中の各炎症性メディエーター濃度も同様に測定した。
測定は４例ずつ実施し、平均値を算出した。培地中のＮＯ濃度を図３（１）に、ＩＬ－１β濃度を図３（２）に、ＩＬ－６濃度を図３（３）に、ＴＮＦα濃度を図３（４）に示す。なお、図３中、「＊」は、ＡＮＯＶＡに続くＤｕｎｎｅｔ’ｓテストによりＥＶｓを添加しない対照群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
図３に示される結果の通り、ＬＰＳの刺激によりＢＶ－２細胞による炎症性メディエーターであるＮＯ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαの産生量が増加したが、蒼朮由来ＥＶｓにより用量依存的に炎症性メディエーターの産生量は低下し、添加量によってはステロイド系抗炎症薬であるデキサメタゾンと同等か更に優れる炎症性メディエーター産生抑制効果が認められた。
マウスミクログリアＢＶ－２細胞の培養液に、陽性対照としてステロイド系抗炎症薬であるデキサメタゾンを１．０μＭ、又は蒼朮由来ＥＶｓを０～２０μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、培養液に内毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ）を０．５μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で２４時間刺激した。
２４時間後に培養上清を回収し、炎症の指標となる一酸化窒素（ＮＯ）の産生量をＧｒｉｅｓｓ法で測定し、炎症性サイトカインであるＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαの産生量をサイトカイン測定ＥＬＩＳＡキット（「Ｑｕａｎｔｋｉｎａｓｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ」Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で測定した。また、対照群として、デキサメタゾン、ＥＶｓおよびリポ多糖のいずれも添加せず、同条件でインキュベートした培地中の各炎症性メディエーター濃度も同様に測定した。
測定は４例ずつ実施し、平均値を算出した。培地中のＮＯ濃度を図３（１）に、ＩＬ－１β濃度を図３（２）に、ＩＬ－６濃度を図３（３）に、ＴＮＦα濃度を図３（４）に示す。なお、図３中、「＊」は、ＡＮＯＶＡに続くＤｕｎｎｅｔ’ｓテストによりＥＶｓを添加しない対照群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
図３に示される結果の通り、ＬＰＳの刺激によりＢＶ－２細胞による炎症性メディエーターであるＮＯ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαの産生量が増加したが、蒼朮由来ＥＶｓにより用量依存的に炎症性メディエーターの産生量は低下し、添加量によってはステロイド系抗炎症薬であるデキサメタゾンと同等か更に優れる炎症性メディエーター産生抑制効果が認められた。
【0030】
実施例３： 細胞外小胞の抗炎症効果
マウスミクログリアＢＶ－２細胞の培養液に、蒼朮由来ＥＶｓを２０μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、培養液に内毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ）を０．５μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で６時間刺激した。
その後、ＢＶ－２細胞から全ＲＮＡを抽出し、炎症の指標となるＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦα、及び一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ２）のｍＲＮＡ発現量を調べた。また、炎症性サイトカインなどによって発現が誘導され、細胞の保護作用を示すヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）のｍＲＮＡ発現量も調べた。全ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ社製の「ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ」を用いて抽出し、各ｍＲＮＡの発現量をＴｈｅｒｍｏ社製の「ＴａｑＭａｎTM Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」を用いたＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により測定した。
比較のために、ＥＶｓおよびＬＰＳを用いない以外は同様の条件でインキュベートのみした非処理細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＬＰＳを用いない以外は同様の条件でインキュベートのみした細胞、及びＥＶｓを用いない以外は同様の条件でインキュベートのみした細胞の各ｍＲＮＡの発現量を同様に測定した。
ＩＬ－１β ｍＲＮＡの相対的発現量を図４（１）に、ＩＬ－６ ｍＲＮＡの相対的発現量を図４（２）に、ＴＮＦα ｍＲＮＡの相対的発現量を図４（３）に、ＨＯ－１ ｍＲＮＡの相対的発現量を図４（４）に、ＮＯＳ２ ｍＲＮＡの相対的発現量を図４（５）に示す。なお、図４中、「＊」は、ＡＮＯＶＡに続くＤｕｎｎｅｔ’ｓテストによりＥＶｓを添加しない対照群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
マウスミクログリアＢＶ－２細胞の培養液に、蒼朮由来ＥＶｓを２０μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で３時間インキュベートした。次いで、培養液に内毒素であるリポ多糖（ＬＰＳ）を０．５μｇ／ｍＬ添加し、３７℃で６時間刺激した。
その後、ＢＶ－２細胞から全ＲＮＡを抽出し、炎症の指標となるＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦα、及び一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ２）のｍＲＮＡ発現量を調べた。また、炎症性サイトカインなどによって発現が誘導され、細胞の保護作用を示すヘムオキシゲナーゼ－１（ＨＯ－１）のｍＲＮＡ発現量も調べた。全ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ社製の「ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ」を用いて抽出し、各ｍＲＮＡの発現量をＴｈｅｒｍｏ社製の「ＴａｑＭａｎTM Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」を用いたＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により測定した。
比較のために、ＥＶｓおよびＬＰＳを用いない以外は同様の条件でインキュベートのみした非処理細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＬＰＳを用いない以外は同様の条件でインキュベートのみした細胞、及びＥＶｓを用いない以外は同様の条件でインキュベートのみした細胞の各ｍＲＮＡの発現量を同様に測定した。
ＩＬ－１β ｍＲＮＡの相対的発現量を図４（１）に、ＩＬ－６ ｍＲＮＡの相対的発現量を図４（２）に、ＴＮＦα ｍＲＮＡの相対的発現量を図４（３）に、ＨＯ－１ ｍＲＮＡの相対的発現量を図４（４）に、ＮＯＳ２ ｍＲＮＡの相対的発現量を図４（５）に示す。なお、図４中、「＊」は、ＡＮＯＶＡに続くＤｕｎｎｅｔ’ｓテストによりＥＶｓを添加しない対照群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。
【0031】
図４に示される結果の通り、ＬＰＳの刺激によりＢＶ－２細胞による炎症性メディエーターであるＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαと、一酸化窒素合成酵素のｍＲＮＡ発現量が有意に増加したが、蒼朮由来ＥＶｓによりこれら発現量は有意に低下した。また、ＬＰＳによる刺激の有無にかかわらず、蒼朮由来ＥＶｓは、炎症性サイトカインなど対して細胞を保護する作用を示すヘムオキシゲナーゼ－１の発現を有意に増加させた。
【0032】
実施例４： ｍｉＲＮＡ発現解析
ＲＮＡ抽出キット（「ｍｉＲｎｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、添付のプロトコールに従って、蒼朮由来ＥＶｓから全ＲＮＡを抽出した。Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｊａｐａｎへ、ＲＮＡ配列解析を依頼した。ＴｒｕＳｅｑ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用い、添付の指示に従って、ライブラリを調製した。ＲＮＡ試料の品質は、電気泳動システム（「Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ」Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって評価した。ライブラリの配列は、シーケンスシステム（「ＨｉＳｅｑ２５００」Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）で決定した。得られた配列読み取りデータは、クリーンなデータの作製のために、低品質読み取りデータ、反復配列、及びアダプター配列の除去を含むフィルターにかけた。次に、読み取りデータを、ｍｉＲＢａｓｅ ｖ２２．１（２０２２年 ３月； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）、及びＲＮＡ ｃｅｎｔｒａｌ ｖ１４．０（２０２２年３月； ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｃｅｎｔｒａｌ．ｏｒｇ）を使ってアラインメントに付し、既知のｍｉＲＮＡとその他のＲＮＡタイプに分類した。同定された配列読み取りデータのうち、切り出された潜在的ｍｉＲＮＡヘアピンのランドフォールドｐ値が０．０５以下のものを解析に付した。蒼朮由来ＥＶｓに含まれる各成熟ｍｉＲＮＡの読み取り数を表１に示す。
ＲＮＡ抽出キット（「ｍｉＲｎｅａｓｙ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、添付のプロトコールに従って、蒼朮由来ＥＶｓから全ＲＮＡを抽出した。Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｊａｐａｎへ、ＲＮＡ配列解析を依頼した。ＴｒｕＳｅｑ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用い、添付の指示に従って、ライブラリを調製した。ＲＮＡ試料の品質は、電気泳動システム（「Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ」Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって評価した。ライブラリの配列は、シーケンスシステム（「ＨｉＳｅｑ２５００」Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）で決定した。得られた配列読み取りデータは、クリーンなデータの作製のために、低品質読み取りデータ、反復配列、及びアダプター配列の除去を含むフィルターにかけた。次に、読み取りデータを、ｍｉＲＢａｓｅ ｖ２２．１（２０２２年 ３月； ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）、及びＲＮＡ ｃｅｎｔｒａｌ ｖ１４．０（２０２２年３月； ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｃｅｎｔｒａｌ．ｏｒｇ）を使ってアラインメントに付し、既知のｍｉＲＮＡとその他のＲＮＡタイプに分類した。同定された配列読み取りデータのうち、切り出された潜在的ｍｉＲＮＡヘアピンのランドフォールドｐ値が０．０５以下のものを解析に付した。蒼朮由来ＥＶｓに含まれる各成熟ｍｉＲＮＡの読み取り数を表１に示す。
【0033】
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】