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特開2024-59492コロナウイルス感染症の予後を予測するための、データの取得方法およびキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024059492
(43)【公開日】2024-05-01
(54)【発明の名称】コロナウイルス感染症の予後を予測するための、データの取得方法およびキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20240423BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240423BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240423BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240423BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240423BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
G01N33/53 B
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022167185
(22)【出願日】2022-10-18
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業」「新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）患者の網羅的遺伝子・タンパク発現解析を用いた新規分子病態バイオマーカー開発と臨床応用」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】松本 寿健
(72)【発明者】
【氏名】吉村 旬平
(72)【発明者】
【氏名】小倉 裕司
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ53
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR62
4B063QR66
4B063QS10
4B063QS14
4B063QS25
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】コロナウイルス感染症患者の予後を予測するために利用できる、データの取得方法およびキットを提供する。
【解決手段】本発明の一実施形態に係る、コロナウイルス感染症の予後を予測するためのデータの取得方法は、生体から採取した生体サンプルにおける、ＰＲＬの発現量、ＴＬＲ３の発現量、および、ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比、のいずれか一つ以上を検出する工程を有する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明の一実施形態に係る、コロナウイルス感染症の予後を予測するためのデータの取得方法は、生体から採取した生体サンプルにおける、ＰＲＬの発現量、ＴＬＲ３の発現量、および、ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比、のいずれか一つ以上を検出する工程を有する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
生体から採取した生体サンプルにおける、ＰＲＬの発現量、ＴＬＲ３の発現量、および、ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比、のいずれか１つ以上を検出する工程を有する、コロナウイルス感染症の予後を予測するためのデータの取得方法。
【請求項2】
上記コロナウイルス感染症は、ＣＯＶＩＤ－１９、または、重症呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である、請求項１に記載のデータの取得方法。
【請求項3】
上記生体における、死亡、重症化、または、回復を予測するための、請求項１に記載のデータの取得方法。
【請求項4】
上記生体サンプルは、血液、唾液、尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、髄液、尿、または、便である、請求項１に記載のデータの取得方法。
【請求項5】
上記生体は、コロナウイルス感染症におけるフェイズ１以前の生体である、請求項１に記載のデータの取得方法。
【請求項6】
ＰＲＬの発現量を検出するための物品、および、ＴＬＲ３の発現量を検出するための物品からなる群から選択される少なくとも１つを備えている、コロナウイルス感染症の予後を予測するためのキット。
【請求項7】
上記ＰＲＬの発現量を検出するための物品は、ＰＲＬのｍＲＮＡを検出するためのプローブ若しくはプライマー、または、ＰＲＬのタンパク質を認識する抗体であり、
上記ＴＬＲ３の発現量を検出するための物品は、ＴＬＲ３のｍＲＮＡを検出するためのプローブ若しくはプライマー、または、ＴＬＲ３のタンパク質を認識する抗体である、請求項６に記載のキット。
上記ＴＬＲ３の発現量を検出するための物品は、ＴＬＲ３のｍＲＮＡを検出するためのプローブ若しくはプライマー、または、ＴＬＲ３のタンパク質を認識する抗体である、請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、コロナウイルス感染症の予後を予測するための、データの取得方法およびキットに関する。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルス感染症の一種であるＣＯＶＩＤ－１９が世界中に拡大し、２０２０年１月３０日に、世界保健機関（ＷＨＯ）によってパンデミックが宣言された。日本では、２０２０年１月に患者が報告されてから、患者数は急激に増加している。
【0003】
ＣＯＶＩＤ－１９の特徴的な症状として、呼吸器の症状が挙げられる。例えば、患者において上気道炎が発症し、当該上気道炎が進行すると、肺炎を発症して呼吸不全に陥ることがある。
【0004】
より具体的に、ＣＯＶＩＤ－１９では、ウイルスが血中に移行すると、当該ウイルスが、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）として、免疫担当細胞上のパターン認識受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体）に結合する。ウイルスがパターン認識受容体に結合すると、転写因子が活性化され、活性化された転写因子は核内のＤＮＡに結合し、当該ＤＮＡからｍＲＮＡが転写され、当該ｍＲＮＡからタンパク質が翻訳され、当該タンパク質（例えば、サイトカイン）によって炎症反応が進行する。ＣＯＶＩＤ－１９は、ウイルス性敗血症であると考えられており、患者の炎症反応が過剰になると、全身性炎症症候群を発症して多臓器障害をきたすと考えられている。
【0005】
それ故に、ＣＯＶＩＤ－１９の治療には、ビピラビルなどの抗ウイルス薬とともに、過剰な炎症を抑える抗炎症治療薬が用いられている。
【0006】
コロナウイルス感染症の予後は、患者によって多種多様である。コロナウイルス感染症の予後を早期に予測することができれば、臨床的に大きな意義がある。例えば、コロナウイルス感染症の患者が、将来、重症化、回復、または、死亡の何れの予後をたどる可能性が高いか早期に予測できれば、それに応じた治療計画を立てることが可能となり、医療現場の負担軽減につながる。それ故に、コロナウイルス感染症の予後を予測するための技術の開発が、強く求められている。
【0007】
このような状況下において、ＣＯＶＩＤ－１９の分子メカニズムの解明を目指す研究が多くなされている。非特許文献１に示されるように、ＣＯＶＩＤ－１９のバイオマーカーとして、血清フェリチン、プロカルシトニン、および、ＩＬ－６等が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Velavan TP, Meyer CG. Mild versus severe COVID-19: Laboratory markers. Int J Infect Dis. 2020; 95: 304-307
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかしながら、上述したバイオマーカーを含む従来の技術は、コロナウイルス感染症の予後を予測することができない。
【0010】
本発明の一態様は、コロナウイルス感染症の予後を予測するための技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、生体から採取した生体サンプルにおける、ＰＲＬの発現量、ＴＬＲ３の発現量、または、ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比を検出することで、コロナウイルス感染症の予後を予測することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明の一態様は、以下の構成を含む。
【0012】
〔１〕生体から採取した生体サンプルにおける、ＰＲＬの発現量、ＴＬＲ３の発現量、および、ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比、のいずれか１つ以上を検出する工程を有する、コロナウイルス感染症の予後を予測するためのデータの取得方法。
【0013】
〔２〕上記コロナウイルス感染症は、ＣＯＶＩＤ－１９、または、重症呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である、〔１〕に記載のデータの取得方法。
【0014】
〔３〕上記生体における、死亡、重症化、または、回復を予測するための、〔１〕または〔２〕に記載のデータの取得方法。
【0015】
〔４〕上記生体サンプルは、血液、唾液、尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、髄液、尿、または、便である、〔１〕～〔３〕の何れかに記載のデータの取得方法。
【0016】
〔５〕上記生体は、コロナウイルス感染症におけるフェイズ１以前の生体である、〔１〕～〔４〕の何れかに記載のデータの取得方法。
【0017】
〔６〕ＰＲＬの発現量を検出するための物品、および、ＴＬＲ３の発現量を検出するための物品からなる群から選択される少なくとも１つを備えている、コロナウイルス感染症の予後を予測するためのキット。
【0018】
〔７〕上記ＰＲＬの発現量を検出するための物品は、ＰＲＬのｍＲＮＡを検出するためのプローブ若しくはプライマー、または、ＰＲＬのタンパク質を認識する抗体であり、
上記ＴＬＲ３の発現量を検出するための物品は、ＴＬＲ３のｍＲＮＡを検出するためのプローブ若しくはプライマー、または、ＴＬＲ３のタンパク質を認識する抗体である、〔６〕に記載のキット。
上記ＴＬＲ３の発現量を検出するための物品は、ＴＬＲ３のｍＲＮＡを検出するためのプローブ若しくはプライマー、または、ＴＬＲ３のタンパク質を認識する抗体である、〔６〕に記載のキット。
【発明の効果】
【0019】
本発明の一態様によれば、コロナウイルス感染症の予後を予測するための技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ＲＮＡシークエンシングを用いてｍＲＮＡ発現の倍率変化解析および上流解析を行った結果、重症と非重症の間で有意に変化していたｍＲＮＡを示す図である。
【図2】ＲＮＡシークエンシングを用いてｍＲＮＡ発現の倍率変化解析および上流解析を行った結果、重症と非重症の間で有意に変化していたｍＲＮＡを示す図である。
【図3】ＲＮＡシークエンシングを用いた解析の結果、重症と非重症の間で有意に変化していた３１のｍＲＮＡについて、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて再評価を行った結果を示す図である。
【図4】検証集団内で、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて５つの候補ＲＮＡの発現レベルを評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ～Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【0022】
〔１．コロナウイルス感染症の予後を予測するためのデータの取得方法〕
本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症の予後を予測するためのデータの取得方法は、生体から採取した生体サンプルにおける、ＰＲＬの発現量、ＴＬＲ３の発現量、および、ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比、のいずれか１つ以上を検出する工程を有する。
本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症の予後を予測するためのデータの取得方法は、生体から採取した生体サンプルにおける、ＰＲＬの発現量、ＴＬＲ３の発現量、および、ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比、のいずれか１つ以上を検出する工程を有する。
【0023】
本明細書中、「ＰＲＬ」は、プロラクチン（Prolactin）の略称であり、「ＴＬＲ３」は、Ｔｏｌｌ様受容体－３（Toll-like receptor 3）の略称である。
【0024】
本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症の予後を予測するためのデータの取得方法によれば、生体の、死亡、重症化、または、回復を予測することができる。
【0025】
上記ＰＲＬの発現量が基準値よりも高ければ、生体は、重症化および／または死亡する可能性が高いと考えられる。一方、上記ＰＲＬの発現量が基準値よりも低ければ、生体は、回復する可能性が高いと考えられる。上記基準値としては、例えば、健常者から採取したサンプルにおけるＰＲＬの発現量、基準となる対照サンプル（例えば、健常者から採取したサンプルにおけるＰＲＬの発現量をもとに設定した、所定の濃度のｍＲＮＡまたはタンパク質を含む溶液）を用いることができる。
【0026】
より具体的に、ＰＲＬの発現量を「Ａ」とし、基準値を「Ｂ」とする。例えば、「Ａ＞Ｂ」、「Ａ≧１．５×Ｂ」、「Ａ≧２．０×Ｂ」、「Ａ≧５．０×Ｂ」または「Ａ≧１０．０×Ｂ」であれば、生体は、重症化および／または死亡する可能性が高いと考えられる。例えば、「Ｂ＞Ａ」、「Ｂ≧１．５×Ａ」、「Ｂ≧２．０×Ａ」、「Ｂ≧５．０×Ａ」または「Ｂ≧１０．０×Ａ」であれば、生体は、回復する可能性が高いと考えられる。
【0027】
上記ＴＬＲ３の発現量が基準値よりも低ければ、生体は、重症化および／または死亡する可能性が高いと考えられる。一方、上記ＴＬＲ３の発現量が基準値よりも高ければ、生体は、回復する可能性が高いと考えられる。上記基準値としては、例えば、健常者から採取したサンプルにおけるＴＬＲ３の発現量、基準となる対照サンプル（例えば、健常者から採取したサンプルにおけるＴＬＲ３の発現量をもとに設定した、所定の濃度のｍＲＮＡまたはタンパク質を含む溶液）を用いることができる。
【0028】
より具体的に、基準値を「Ｃ」とし、ＴＬＲ３の発現量を「Ｄ」とする。例えば、「Ｃ＞Ｄ」、「Ｃ≧１．５×Ｄ」、「Ｃ≧２．０×Ｄ」、「Ｃ≧５．０×Ｄ」または「Ｃ≧１０．０×Ｄ」であれば、生体は、重症化および／または死亡する可能性が高いと考えられる。例えば、「Ｄ＞Ｃ」、「Ｄ≧１．５×Ｃ」、「Ｄ≧２．０×Ｃ」、「Ｄ≧５．０×Ｃ」または「Ｄ≧１０．０×Ｃ」であれば、生体は、回復する可能性が高いと考えられる。
【0029】
上述した「Ｂ」および「Ｃ」の具体的な値は、後述する「Ｆ」の値を満たす値であればよく、各々、限定されない。
【0030】
上記ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比が基準値よりも高ければ、生体は、重症化および／または死亡する可能性が高いと考えられる。一方、上記ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比が基準値よりも低ければ、生体は、回復する可能性が高いと考えられる。上記基準値としては、例えば、健常者から採取したサンプルにおけるＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比、基準となる対照サンプル（例えば、健常者から採取したサンプルにおけるＰＲＬおよびＴＬＲ３の発現量をもとに設定した、所定の濃度のＰＲＬまたはＴＬＲ３のｍＲＮＡまたはタンパク質を含む溶液）のＰＲＬ量とＴＬＲ３量との比を用いることができる。
【0031】
より具体的に、ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比を「Ｅ」とし、基準値を「Ｆ」とする。例えば、「Ｅ＞Ｆ」、「Ｅ≧１．５×Ｆ」、「Ｅ≧２．０×Ｆ」、「Ｅ≧５．０×Ｆ」または「Ｅ≧１０．０×Ｆ」であれば、生体は、重症化および／または死亡する可能性が高いと考えられる。例えば、「Ｆ＞Ｅ」、「Ｆ≧１．５×Ｅ」、「Ｆ≧２．０×Ｅ」、「Ｆ≧５．０×Ｅ」または「Ｆ≧１０．０×Ｅ」であれば、生体は、回復する可能性が高いと考えられる。
【0032】
「Ｆ」の具体的な値は、５０以上の任意の値、１００以上の任意の値、１５０以上の任意の値、２００以上の任意の値、２５０以上の任意の値、３００以上の任意の値であってもよい。「Ｆ」の値の上限値は、限定されず、例えば、１０００、５００、４００、または、３００であってもよい。
【0033】
本実施の形態のデータの取得方法では、上記ＰＲＬの発現量は、ＰＲＬのｍＲＮＡの発現量、または、ＰＲＬのタンパク質の発現量であり得る。本実施の形態のデータの取得方法では、上記ＴＬＲ３の発現量は、ＴＬＲ３のｍＲＮＡの発現量、または、ＴＬＲ３のタンパク質の発現量であり得る。コロナウイルス感染症の予後をより正確に予測するという観点から、上記ＰＲＬの発現量は、ＰＲＬのｍＲＮＡの発現量であることが好ましく、上記ＴＬＲ３の発現量は、ＴＬＲ３のｍＲＮＡの発現量であることが好ましい。
【0034】
上記ＰＲＬのｍＲＮＡの発現量、ＴＬＲ３のｍＲＮＡの発現量、ＰＲＬのタンパク質の発現量、および、ＴＬＲ３のタンパク質の発現量を検出する方法は、限定されず、公知の方法を用いることができる。上記ＰＲＬのｍＲＮＡの発現量、および、ＴＬＲ３のｍＲＮＡの発現量を検出する方法としては、例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシング、ノーザンブロット法を挙げることができる。上記ＲＬのタンパク質の発現量、および、ＴＬＲ３のタンパク質の発現量を検出する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法を挙げることができる。
【0035】
上記ＰＲＬのｍＲＮＡは、以下の（１）～（３）の何れかのポリヌクレオチドであってもよい：
（１）データベースＧｅｎｂａｎｋにおけるアクセッション番号「Gene ID: 5617」（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5617）の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（２）上記アクセッション番号「Gene ID: 5617」の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＲＬ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、
（３）上記アクセッション番号「Gene ID: 5617」の塩基配列と配列同一性が９０％以上のポリヌクレオチドからなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１）データベースＧｅｎｂａｎｋにおけるアクセッション番号「Gene ID: 5617」（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5617）の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（２）上記アクセッション番号「Gene ID: 5617」の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＲＬ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、
（３）上記アクセッション番号「Gene ID: 5617」の塩基配列と配列同一性が９０％以上のポリヌクレオチドからなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0036】
上記ＰＲＬのタンパク質は、以下の（４）～（６）の何れかのポリペプチドであってもよい：
（４）データベースＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」（https://www.uniprot.org/uniprotkb/P01236/entry）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（５）上記アクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するポリペプチド、または、
（６）上記アクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」のアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のポリペプチドからなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するポリペプチド。
（４）データベースＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」（https://www.uniprot.org/uniprotkb/P01236/entry）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（５）上記アクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するポリペプチド、または、
（６）上記アクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」のアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のポリペプチドからなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するポリペプチド。
【0037】
上記ＴＬＲ３のｍＲＮＡは、以下の（７）～（９）の何れかのポリヌクレオチドであってもよい：
（７）データベースＧｅｎｂａｎｋにおけるアクセッション番号「Gene ID: 7098」（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=DetailsSearch&Term=7098）の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（８）上記アクセッション番号「Gene ID: 7098」の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＬＲ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、
（９）上記アクセッション番号「Gene ID: 7098」の塩基配列と配列同一性が９０％以上のポリヌクレオチドからなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（７）データベースＧｅｎｂａｎｋにおけるアクセッション番号「Gene ID: 7098」（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=DetailsSearch&Term=7098）の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（８）上記アクセッション番号「Gene ID: 7098」の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＬＲ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、
（９）上記アクセッション番号「Gene ID: 7098」の塩基配列と配列同一性が９０％以上のポリヌクレオチドからなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0038】
上記ＴＬＲ３のタンパク質は、以下の（１０）～（１２）の何れかのポリペプチドであってもよい：
（１０）データベースＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」（https://www.uniprot.org/uniprotkb/O15455/entry）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１１）上記アクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するポリペプチド、または、
（１２）上記アクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」のアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のポリペプチドからなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するポリペプチド。
（１０）データベースＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」（https://www.uniprot.org/uniprotkb/O15455/entry）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１１）上記アクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するポリペプチド、または、
（１２）上記アクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」のアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のポリペプチドからなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するポリペプチド。
【0039】
上記アクセッション番号「Gene ID: 5617」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ヒトのＰＲＬのｍＲＮＡに相当する。上記アクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒトのＰＲＬのタンパク質に相当する。上記アクセッション番号「Gene ID: 7098」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ヒトのＴＬＲ３のｍＲＮＡに相当する。上記アクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヒトのＴＬＲ３のタンパク質に相当する。
【0040】
本明細書において、「ＰＲＬ活性」とは、プロラクチンが有する生理活性のうちの少なくとも１つを意図する。プロラクチンが有する生理活性としては、例えば、タンパク質（例えば、カゼイン、ラクトアルブミン）の産生誘導、および、ラクトースの産生誘導が挙げられる。特定のポリペプチドが、プロラクチンが有する生理活性の少なくとも１つ（好ましくは２つ以上）を有していれば、当該特定のポリペプチドはＰＲＬ活性を有するポリペプチドである、と判断することができる。なお、プロラクチンが有する生理活性は、公知の方法によって測定することができる。
【0041】
本明細書において、「ＴＬＲ３活性」とは、Ｔｏｌｌ様受容体－３が有する生理活性のうちの少なくとも１つを意図する。Ｔｏｌｌ様受容体－３が有する生理活性としては、例えば、インターフェロンの産生誘導、および、サイトカインの産生誘導が挙げられる。特定のポリペプチドが、Ｔｏｌｌ様受容体－３が有する生理活性の少なくとも１つ（好ましくは２つ以上）を有していれば、当該特定のポリペプチドはＴＬＲ３活性を有するポリペプチドである、と判断することができる。なお、Ｔｏｌｌ様受容体－３が有する生理活性は、公知の方法によって測定することができる。
【0042】
本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントな条件」は、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、同一性が高い核酸同士が、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。
【0043】
一例を示すと、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６～２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。
【0044】
他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
【0045】
本明細書にて、「１個もしくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、５０個以内、４５個以内、４０個以内、３５個以内、３０個以内、２５個以内、２０個以内、１５個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、２個以内、または、１個のアミノ酸であることが好ましい。アミノ酸配列中、アミノ酸が欠失、置換、欠失、挿入、および／または付加される位置は、特に限定されない。
【0046】
本明細書において、塩基配列の配列同一性、および、アミノ酸配列の配列同一性は、公知の方法にしたがって決定することができる。塩基配列の配列同一性、および、アミノ酸配列の配列同一性は、例えば、配列分析ツールであるＢＬＡＳＴによって、デフォルトパラメータを用いて算出され得る。同一性の検索は、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ２．７．１（２０１７年１０月１９日に発行）を用いて行うことができる。塩基配列の同一性、および、アミノ酸配列の同一性は、共に、９０％以上であることが好ましく、９１％以上であることがより好ましく、９２％以上であることがより好ましく、９３％以上であることがより好ましく、９４％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９６％以上であることがより好ましく、９７％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがより好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
【0047】
上記生体は、ヒトであってもよく、非ヒトである哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマなど）であってもよいが、ヒトであることが好ましい。
【0048】
上記生体は、コロナウイルス感染症の患者であり得る。コロナウイルス感染症の患者は、コロナウイルスを検出するためのＰＣＲ検査によって陽性と判定された患者であり得る。コロナウイルス感染症の患者は、ＣＴスキャン等によって肺炎と診断された患者であり得る。コロナウイルス感染症の患者は、入院が必要であると診断された患者であってもよく、入院が不要であると診断された患者であってもよい。コロナウイルス感染症の患者は、酸素投与が必要と診断された患者であってもよく、酸素投与が不要と診断された患者であってもよい。コロナウイルス感染症の患者は、コロナウイルス感染症の重症患者であってもよく、コロナウイルス感染症の非重症患者であってもよい。コロナウイルス感染症の重症患者は、人工呼吸器による管理が必要であると診断された患者であり得る。コロナウイルス感染症の非重症患者は、人工呼吸器による管理が不要であると診断された患者であり得る。
【0049】
上記生体は、コロナウイルス感染症におけるフェイズ１以前の生体であることが好ましい。上記生体は、コロナウイルス感染症における発症日（例えば、発熱が観察された日）当日の生体であることがより好ましい。換言すれば、上記生体サンプルは、コロナウイルス感染症におけるフェイズ１以前の生体から採取されたものであることが好ましい。上記生体サンプルは、コロナウイルス感染症における発症日（例えば、発熱が観察された日）当日の生体から採取されたものであることがより好ましい。
【0050】
上記構成であれば、コロナウイルス感染症の初期において、予後を予測することができる。本明細書において、フェイズ１とは、入院した日を１日目としたときに、１日目～２日目の期間を意味する。本明細書において、フェイズ２とは、入院した日を１日目としたときに、６日目～１４日目の期間を意味する。
【0051】
上記生体サンプルとしては、例えば、血液、唾液、尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、髄液、尿、または、便を挙げることができる。より正確に、かつ、容易にコロナウイルス感染症の予後を予測することができるという観点から、上記生体サンプルの中では、血液が好ましい。上記血液は、全血であってもよく、血漿であってもよく、血清であってもよいが、好ましくは全血である。
【0052】
本発明の一実施形態に係るデータの取得方法によって予後が予測されるコロナウイルス感染症は、ＣＯＶＩＤ－１９または重症呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）であることが好ましく、ＣＯＶＩＤ－１９であることがより好ましい。当該構成であれば、より正確にコロナウイルス感染症の予後を予測することができる。
【0053】
なお、ＣＯＶＩＤ－１９は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる感染症である。一方、重症呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）は、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶによって引き起こされる感染症である。コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶとは類似のウイルスであり、ＣＯＶＩＤ－１９と重症呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）とは類似の感染症である。それ故に、本発明の一実施形態に係るデータの取得方法によれば、ＣＯＶＩＤ－１９および重症呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の予後をより正確に予測することができる。
【0054】
〔２．キット〕
本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症の予後を予測するためのキットは、ＰＲＬの発現量を検出するための物品、および、ＴＬＲ３の発現量を検出するための物品からなる群から選択される少なくとも１つを備えている。
本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症の予後を予測するためのキットは、ＰＲＬの発現量を検出するための物品、および、ＴＬＲ３の発現量を検出するための物品からなる群から選択される少なくとも１つを備えている。
【0055】
本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症の予後を予測するためのキットを用いれば、本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症の予後を予測するためのデータの取得方法を実施することができ、これによって、コロナウイルス感染症の予後を予測することができる。
【0056】
〔１．コロナウイルス感染症の予後を予測するためのデータの取得方法〕において既に記載した事項については、以下では説明を省略する。
【0057】
本明細書において「キット」とは、任意の用途に用いられる、任意の試薬などの組み合わせであり得る。この用途は、医学用途であってもよいし、研究用途であってもよい。
【0058】
上記ＰＲＬの発現量を検出するための物品としては、ＰＲＬのｍＲＮＡを検出するためのプローブ若しくはプライマー、または、ＰＲＬのタンパク質を認識する抗体が挙げられる。
【0059】
上記ＰＲＬのｍＲＮＡを検出するためのプローブまたはプライマーは、例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシング、ノーザンブロット法によってＰＲＬのｍＲＮＡを検出するための、プローブまたはプライマーであり得る。
【0060】
より具体的に、上記ＰＲＬのｍＲＮＡを検出するためのプローブまたはプライマーは、例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシング、ノーザンブロット法によって、以下の（１）～（３）の何れかのポリヌクレオチドを検出するためのプローブまたはプライマーであってもよい：
（１）データベースＧｅｎｂａｎｋにおけるアクセッション番号「Gene ID: 5617」（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5617）で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（２）上記アクセッション番号「Gene ID: 5617」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＲＬ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、
（３）上記アクセッション番号「Gene ID: 5617」で表される塩基配列と配列同一性が９０％以上のポリヌクレオチドからなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１）データベースＧｅｎｂａｎｋにおけるアクセッション番号「Gene ID: 5617」（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5617）で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（２）上記アクセッション番号「Gene ID: 5617」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＲＬ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、
（３）上記アクセッション番号「Gene ID: 5617」で表される塩基配列と配列同一性が９０％以上のポリヌクレオチドからなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0061】
上記ＰＲＬのタンパク質を認識する抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法によってＰＲＬのタンパク質を検出するための、抗体であり得る。
【0062】
より具体的に、上記ＰＲＬのタンパク質を認識する抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法によって、以下の（４）～（６）の何れかのポリペプチドを検出するための抗体であってもよい：
（４）データベースＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」（https://www.uniprot.org/uniprotkb/P01236/entry）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（５）上記アクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するポリペプチド、または、
（６）上記アクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のポリペプチドからなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するポリペプチド。
（４）データベースＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」（https://www.uniprot.org/uniprotkb/P01236/entry）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（５）上記アクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するポリペプチド、または、
（６）上記アクセッション番号「P01236 ・ PRL_HUMAN」で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のポリペプチドからなり、かつ、ＰＲＬ活性を有するポリペプチド。
【0063】
上記ＴＬＲ３の発現量を検出するための物品としては、ＴＬＲ３のｍＲＮＡを検出するためのプローブ若しくはプライマー、または、ＴＬＲ３のタンパク質を認識する抗体が挙げられる。
【0064】
上記ＴＬＲ３のｍＲＮＡを検出するためのプローブまたはプライマーは、例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシング、ノーザンブロット法によってＴＬＲ３のｍＲＮＡを検出するための、プローブまたはプライマーであり得る。
【0065】
より具体的に、上記ＴＬＲ３のｍＲＮＡを検出するためのプローブまたはプライマーは、例えば、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシング、ノーザンブロット法によって、以下の（７）～（９）の何れかのポリヌクレオチドを検出するためのプローブまたはプライマーであってもよい：
（７）データベースＧｅｎｂａｎｋにおけるアクセッション番号「Gene ID: 7098」（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=DetailsSearch&Term=7098）で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（８）上記アクセッション番号「Gene ID: 7098」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＬＲ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、
（９）上記アクセッション番号「Gene ID: 7098」で表される塩基配列と配列同一性が９０％以上のポリヌクレオチドからなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（７）データベースＧｅｎｂａｎｋにおけるアクセッション番号「Gene ID: 7098」（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=DetailsSearch&Term=7098）で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（８）上記アクセッション番号「Gene ID: 7098」で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＴＬＲ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または、
（９）上記アクセッション番号「Gene ID: 7098」で表される塩基配列と配列同一性が９０％以上のポリヌクレオチドからなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0066】
上記ＴＬＲ３のタンパク質を認識する抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法によってＴＬＲ３のタンパク質を検出するための、抗体であり得る。
【0067】
より具体的に、上記ＴＬＲ３のタンパク質を認識する抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法によって、以下の（１０）～（１２）の何れかのポリペプチドを検出するための抗体であってもよい：
（１０）データベースＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」（https://www.uniprot.org/uniprotkb/O15455/entry）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１１）上記アクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するポリペプチド、または、
（１２）上記アクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のポリペプチドからなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するポリペプチド。
（１０）データベースＵｎｉＰｒｏｔにおけるアクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」（https://www.uniprot.org/uniprotkb/O15455/entry）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（１１）上記アクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」で表されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するポリペプチド、または、
（１２）上記アクセッション番号「O15455 ・ TLR3_HUMAN」で表されるアミノ酸配列と配列同一性が９０％以上のポリペプチドからなり、かつ、ＴＬＲ３活性を有するポリペプチド。
【0068】
上記プローブおよびプライマーの塩基配列および長さは、限定されず、適宜、設定され得る。
【0069】
上記抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または、これらの断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、または、Ｆｖ）であってもよい。上記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、または、これらの断片であってもよい。
【0070】
上記抗体は、周知の方法（例えば、（１）ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）」、および、（２）岩崎ら、「単クローン抗体 ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）にしたがって作製することができる。
【0071】
モノクローナル抗体は、当該分野において周知の方法（例えば、（１）ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５－４９７（１９７５））、（２）トリオーマ法、（３）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２（１９８３））、および、（４）ＥＢＶ－ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７－９６（１９８５）））にしたがって作製することができる。
【0072】
キメラ抗体とは、定常領域がヒトの抗体の定常領域に置き換えられている抗体を意図する。キメラ抗体は、周知方法にしたがって作製され得る（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３を参照）。
【0073】
ヒト化抗体とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ：complementarity determining region）以外がヒトの抗体の構造に置き換えられている抗体を意図する。
【0074】
ヒト抗体とは、ヒトの抗体生産に関与する遺伝子が導入されたトランスジェニック動物を用いて作製された抗体を意図する（例えば、欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３を参照）。
【0075】
Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、および、Ｆｖは、抗体の全体をプロテアーゼ（例えば、パパイン、または、ペプシン）によって分解し、必要に応じて、分解物を更に還元することによって得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、および、Ｆｖは、抗体を生産するハイブリドーマから、これらのｃＤＮＡを単離し、当該ｃＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主に導入することによって得ることができる。この場合には、抗体フラグメントは、抗体フラグメントと別のタンパク質との融合タンパク質として得ることもできる。
【0076】
本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症の予後を予測するためのキットは、上述した構成以外に、試薬および／または補助的な物質を備えていてもよい。本発明の一実施形態に係るコロナウイルス感染症の予後を予測するためのキットは、上述した構成、試薬および／または補助的な物質を格納する、１つ以上の格納容器（ボックス、ボトル、ディッシュなど）を備えていてもよい。本発明の一実施形態は、生体サンプルとして血液を用い得る。それ故に、一実施形態において、キットは、血液を採取するために注射器を備えていることが好ましい。
【0077】
〔３．その他〕
本発明は、以下のように構成することもできる。
本発明は、以下のように構成することもできる。
【0078】
〔１〕生体における、ＰＲＬの発現量、ＴＬＲ３の発現量、および、ＰＲＬの発現量とＴＬＲ３の発現量との比、のいずれか１つ以上を検出する工程を有する、コロナウイルス感染症の予後の予測方法。
【0079】
〔２〕上記コロナウイルス感染症は、ＣＯＶＩＤ－１９、または、重症呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である、〔１〕に記載の予測方法。
【0080】
〔３〕上記生体における、死亡、重症化、または、回復を予測するための、〔１〕または〔２〕に記載の予測方法。
【0081】
〔４〕上記生体サンプルは、血液、唾液、尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、鼻汁、髄液、尿、または、便である、〔１〕～〔３〕の何れかに記載の予測方法。
【0082】
〔５〕上記生体は、コロナウイルス感染症におけるフェイズ１以前の生体である、〔１〕～〔４〕の何れかに記載の予測方法。
【0083】
本発明の一実施形態によれば、コロナウイルス感染症の予後を予測することができる。それ故に、本発明の一実施形態は、持続可能な開発目標（ＳＤＧｓ）の目標３「すべての人に健康と福祉を」の達成に貢献できる。
【実施例0084】
〔方法〕
本試験は、ヘルシンキ宣言の原則に従った。また、本試験は、大阪大学病院の施設内倫理委員会により承認された（許可番号：８８５［大阪大学クリティカルケアコンソーシアム新規オミックスプロジェクト；Ｏｃｃｏｎｏｍｉｘ Ｐｒｏｊｅｃｔ］）。全ての血液試料の採取の際には、当該患者もしくはその親族および当該健常ボランティアからのインフォームドコンセントを得た。
本試験は、ヘルシンキ宣言の原則に従った。また、本試験は、大阪大学病院の施設内倫理委員会により承認された（許可番号：８８５［大阪大学クリティカルケアコンソーシアム新規オミックスプロジェクト；Ｏｃｃｏｎｏｍｉｘ Ｐｒｏｊｅｃｔ］）。全ての血液試料の採取の際には、当該患者もしくはその親族および当該健常ボランティアからのインフォームドコンセントを得た。
【0085】
〔集団データ〕
本発明者らは、２つの観察集団由来のデータを使用した：発見集団と検証集団である。患者フロー、試料、および解析について、以下に説明する。
本発明者らは、２つの観察集団由来のデータを使用した：発見集団と検証集団である。患者フロー、試料、および解析について、以下に説明する。
【0086】
上記発見集団は、２０２０年７月から２０２１年２月に大阪大学医学部附属病院に入院したＣＯＶＩＤ－１９患者、および健常ボランティアから構成された。すべての患者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ＰＣＲおよび胸部コンピュータ断層撮影法を用いて、ＣＯＶＩＤ－１９に罹患していると診断された。患者は、臨床医によって直ちに急性呼吸不全を有していると認められ、またはＩＣＵに入院と判定され、他病院から移送された。臨床データは電子医療記録から収集され、性別、年齢、併存疾患、ボディマスインデックス（ＢＭＩ）、入院時の臨床検査データ、入院時のＰ／Ｆ比、Sequential Organ Failure Assessment（ＳＯＦＡ）スコア、入院前のステロイド治療、入院開始からの日数および２８日死亡率が含まれる。対照群は、発見集団のうち、一般のポスター広告を介して登録した健常ボランティア（ＨＶｓ）から構成される。患者由来の血液試料は、１日目（大阪大学医学部附属病院への入院１日目）、および６～１４日目に得た。また、上記ＨＶｓ由来の血液試料は、１回採取した。全血ＲＮＡ発現をＲＮＡシークエンシングにより評価した。
【0087】
ＲＮＡの統計学的の結果に基づき、ＣＯＶＩＤ－１９患者にて、以下の３１のＲＮＡの顕著な発現変化がＲＮＡシークエンシングにて検出された；ＡＬＯＸ１５、ＣＤ１７７、ＣＥＢＰＢ、ＣＹＰ１９Ａ１、ＥＲＮ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＨＤＣ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＲＦ１、ＬＧＡＬＳ２、ＬＩＮＣ００６７６、ＬＩＮＣ０１０９３、ＬＲＲＣ７０、ＬＲＲＮ１、ＬＲＲＮ３、ＭＡＰＫ１４、ＭＹＤ８８、ＮＦＫＢＩＡ、ＯＬＡＨ、ＯＳＭ、ＰＡＲＰ９、ＰＩＤ１、ＰＲＬ、ＳＥＬＰＬＧ、ＳＰＩ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３およびＴＬＲ３。上記３１のＲＮＡについて、Ｂｉｏｍａｒｋ ＨＤを用いて定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を行った。
【0088】
検証集団は、２０２１年３月から２０２１年１０月に大阪大学医学部附属病院または大阪急性期・総合医療センターに入院したＣＯＶＩＤ－１９患者であって、ＩＣＵで治療を受け、１日目の血液試料が採取されたＣＯＶＩＤ－１９患者から構成される。全てのＣＯＶＩＤ－１９患者は、ＲＴ－ＰＣＲを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を有していると診断され、また、コンピュータ断層撮影法を用いて肺炎に罹患していると診断された。人口統計学的変動（性別、年齢、併存疾患、ＢＭＩ、入院時の臨床検査データ、入院時のＰ／Ｆ比、ＳＯＦＡスコア、入院前のステロイド治療、入院開始からの日数および２８日死亡率）は、上記患者の退院または死亡まで、１日目（大阪大学医学部附属病院または大阪急性期・総合医療センターへの入院日）および６～１４日目に上記患者から収集された。血液試料は、解析まで－３０℃で保存した。全血ＲＮＡ発現は、上記発見集団と同様の方法（Ｂｉｏｍａｒｋ ＨＤ）を用いて測定した。
【0089】
ＣＯＶＩＤ－１９で入院している上記患者由来の血液の臨床検査は、各病院の中央検査室で体系的に実施された。
【0090】
〔疾患重篤度の定義：重症および非重症〕
Ａｃｕｉｔｙスコアは、世界保健機関のordinal outcomes scale（COVID-19 Therapeutic Trial Synopsis. 「https://www.who.int/publications-detail-redirect/covid-19-therapeutic-trial-synopsis」参照）に基づき、Ａ１：死亡、Ａ２：人工呼吸器管理、生存、Ａ３：酸素吸入を伴う入院、Ａ４：酸素吸入を伴わない入院、Ａ５：退院に分類された。疾患重篤度は、最大Ａｃｕｉｔｙスコア（Ａｃｕｉｔｙ ｍａｘ１または２）に基づいて分類した。本発明者らは、本実施例の患者集団において、観察されたAcuity maxがＡ１またはＡ２の患者を「重症」、Ａ３、４およびＡ５の患者を「非重症」と定義した。
Ａｃｕｉｔｙスコアは、世界保健機関のordinal outcomes scale（COVID-19 Therapeutic Trial Synopsis. 「https://www.who.int/publications-detail-redirect/covid-19-therapeutic-trial-synopsis」参照）に基づき、Ａ１：死亡、Ａ２：人工呼吸器管理、生存、Ａ３：酸素吸入を伴う入院、Ａ４：酸素吸入を伴わない入院、Ａ５：退院に分類された。疾患重篤度は、最大Ａｃｕｉｔｙスコア（Ａｃｕｉｔｙ ｍａｘ１または２）に基づいて分類した。本発明者らは、本実施例の患者集団において、観察されたAcuity maxがＡ１またはＡ２の患者を「重症」、Ａ３、４およびＡ５の患者を「非重症」と定義した。
【0091】
〔試料採取のタイミングの定義：フェイズ１およびフェイズ２〕
試料採取のタイミングは、３つの集団で異なる。それゆえ本発明者らは、理解しやすくするため、２つの異なるタイプの測定タイミングを定義した：フェイズ１（１～２日目）およびフェイズ２（６～１４日目）である。本実施例では、１日目は入院日を参照する。
試料採取のタイミングは、３つの集団で異なる。それゆえ本発明者らは、理解しやすくするため、２つの異なるタイプの測定タイミングを定義した：フェイズ１（１～２日目）およびフェイズ２（６～１４日目）である。本実施例では、１日目は入院日を参照する。
【0092】
〔臨床転帰の定義：早期回復および回復遅延〕
侵襲的人工呼吸管理（invasive mechanical ventilation, ＩＭＶ）を伴うＣＯＶＩＤ－１９患者の３０％近くが、長期化したＩＭＶに起因して、気管切開を必要とする（Sancho et al., 2021）。長期化したＩＭＶ管理は、長期にわたる入院滞在およびＩＣＵリソースの莫大な使用につながり得、したがって、通常ＩＣＵ管理を必要とする他の疾患の患者からベッドを奪うことにつながり得る。実際、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの期間に、他の疾患由来の死亡率の増加が報告されている（Bodilsen et al., 2021; Kursumovic et al., 2021）。本発明者らは、本発明者らの先行研究の中で実施したように（Ebihara et al., 2022）、患者の臨床転帰を定義した；１２日間以下ＩＭＶによって治療された、またはＩＭＶによって治療されていない患者を早期回復とし、１２日間より長くＩＭＶによって治療された、または２８日非生存であった患者を回復遅延とした。本発明者らは、派生集団のＣＯＶＩＤ－１９患者を、早期回復および回復遅延に基づいて２群に分け、評定した。
侵襲的人工呼吸管理（invasive mechanical ventilation, ＩＭＶ）を伴うＣＯＶＩＤ－１９患者の３０％近くが、長期化したＩＭＶに起因して、気管切開を必要とする（Sancho et al., 2021）。長期化したＩＭＶ管理は、長期にわたる入院滞在およびＩＣＵリソースの莫大な使用につながり得、したがって、通常ＩＣＵ管理を必要とする他の疾患の患者からベッドを奪うことにつながり得る。実際、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの期間に、他の疾患由来の死亡率の増加が報告されている（Bodilsen et al., 2021; Kursumovic et al., 2021）。本発明者らは、本発明者らの先行研究の中で実施したように（Ebihara et al., 2022）、患者の臨床転帰を定義した；１２日間以下ＩＭＶによって治療された、またはＩＭＶによって治療されていない患者を早期回復とし、１２日間より長くＩＭＶによって治療された、または２８日非生存であった患者を回復遅延とした。本発明者らは、派生集団のＣＯＶＩＤ－１９患者を、早期回復および回復遅延に基づいて２群に分け、評定した。
【0093】
〔ＲＮＡシークエンシング〕
ＲＮＡ発現は、本発明者らの先行研究の中で実施した方法と同様の方法で評価した。簡潔には、発見集団にて、BD Bioscience社（San Jose, CA）のＰＡＸｇｅｎｅ（商品商標）血液ＲＮＡシステムを用いた白血球の全ＲＮＡ分離を実施した；４０人のフェイズ１およびフェイズ２のＣＯＶＩＤ－１９患者由来、並びに１６人のＨＶｓ由来の白血球の全ＲＮＡである。解析に用いる全ての血液試料は、採血管に収集し、さらなる解析まで－３０℃で保存した。Illumina社の（San Diego, CA）ＴｒｕＳｅｑ鎖状ｍＲＮＡ試料プレップキットを用い、製造者の取扱説明書に従ってライブラリ調製を実施した。
ＲＮＡ発現は、本発明者らの先行研究の中で実施した方法と同様の方法で評価した。簡潔には、発見集団にて、BD Bioscience社（San Jose, CA）のＰＡＸｇｅｎｅ（商品商標）血液ＲＮＡシステムを用いた白血球の全ＲＮＡ分離を実施した；４０人のフェイズ１およびフェイズ２のＣＯＶＩＤ－１９患者由来、並びに１６人のＨＶｓ由来の白血球の全ＲＮＡである。解析に用いる全ての血液試料は、採血管に収集し、さらなる解析まで－３０℃で保存した。Illumina社の（San Diego, CA）ＴｒｕＳｅｑ鎖状ｍＲＮＡ試料プレップキットを用い、製造者の取扱説明書に従ってライブラリ調製を実施した。
【0094】
BD Bioscience社（San Jose, CA）のＰＡＸｇｅｎｅ（商品商標）血液ＲＮＡシステムを用いた白血球の全ＲＮＡ分離を実施した。ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ＨＴ Ｋｉｔ（Takara Bio, Mountain View, CA）を用い、製造者の取扱説明書に従って全長ｃＤＮＡを作製した。Illumina社のＮｅｘｔｅｒａＤＮＡライブラリ調製キット（Illumina）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒキットの取扱説明書に従って、Illuminaライブラリを調製した。ＤＮＡライブラリは、ＭＧＩＥａｓｙユニバーサルライブラリ変換キット（App-A社）を用いて、ＤＮＢＳＥＱのためのライブラリに変換した。ＤＮＢＳＥＱ－Ｇ４００ＲＳプラットフォーム上、２×１００塩基対－エンドモードにてシークエンシングを実施した。
【0095】
シークエンスされた読み取り結果を、Ｂｏｗｔｉｅ２，ｖｅｒｓｉｏｎ２．２．３およびＳＡＭｔｏｏｌｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ０．１．１９と組み合わせたＴｏｐＨａｔ，ｖｅｒｓｉｏｎ２．０．１３を用いて、ヒト参照ゲノム（ｈｇ１９）にマッピングした。マッピングされたフラグメント１００万当たりのエキソンキロベース当たりのフラグメントを、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ２．２．１を用いて算出した。遺伝子－レベル発現粗読み取りカウントを、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓを用いて算出し、ＤＥＳｅｑアルゴリズムを用いて比較ＲＮＡ発現レベルを算出した。
【0096】
〔定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）〕
ＲＴ－ｑＰＣＲは、先行研究を若干改良した（McGrath et al., 2022；Magray et al., 2022）、Ｂｉｏｍａｒｋ ＨＤ（商品商標）微小流体システム（Fluidigm社）で実施した。当該システムは、１回の試験で評定するために、個々のｃＤＮＡ試料および４８の個々のプライマーがセットされ、選択された試料から標的遺伝子を増幅するｑＰＣＲ技術を用いるものである。
ＲＴ－ｑＰＣＲは、先行研究を若干改良した（McGrath et al., 2022；Magray et al., 2022）、Ｂｉｏｍａｒｋ ＨＤ（商品商標）微小流体システム（Fluidigm社）で実施した。当該システムは、１回の試験で評定するために、個々のｃＤＮＡ試料および４８の個々のプライマーがセットされ、選択された試料から標的遺伝子を増幅するｑＰＣＲ技術を用いるものである。
【0097】
Fluidigm社の手順により、ＨＶｓのｃＤＮＡ試料由来およびＣＯＶＩＤ－１９患者のｃＤＮＡ試料由来の標的遺伝子の予備的増幅を実施した。簡潔には、各々のプライマー濃度が５００ｎＭであるプライマーストック（プライマーは、Integrated DNA Technology社から１００μＭストックで供給された）を作製するため、各々のプライマー（フォワードおよびリバース）１μｌを１５２μｌの核酸が含まれていない水と混合し、単一のプライマープールを作製した。続いて、１０５．６μｌのＰｒｅＡｍｐマスターミックス（Fluidigm社）、１３２．０μｌの上記５００ｎＭプライマープールおよび１５８．４μｌの核酸が含まれていない水を含むマスターミックスを調製した。９６ウェルＰＣＲプレート中、適切なウェルに３．７５μｌの上記マスターミックスを添加した。上記ウェルに、１．２５μｌの適切なｃＤＮＡを添加した。以下の条件下で、ＳｉｍｐｌｉＡｍｐサーマルサイクラー（Thermo Fisher Scientific社）を用いてＰＣＲ産物を増幅した：９５℃で２分の初期変性、続いて１４サイクルの９５℃で１５秒の変性および６０℃で４分のアニーリング。
【0098】
上記ＰＣＲ産物は、上記予備的増幅反応のすべての構成物を除去するために、エキソヌクレアーゼＩで処理した。２４μｌのエキソヌクレアーゼＩ １０×反応緩衝液（New England Biolabs社）、４８μｌのエキソヌクレアーゼＩ（New England Biolabs社）、および１６８μｌの核酸が含まれていない水を含むマスターミックスを調製した。予備的増幅を行った試料を含む９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに、２μｌのエキソヌクレアーゼＩマスターミックスを添加した。エキソヌクレアーゼ消化は、Fluidigm社の手順により、上記ＳｉｍｐｌｉＡｍｐサーマルサイクラーを用いて実施した。上記消化反応の後、上記ＰＣＲプレートをさらなる解析まで－８０℃の冷凍庫で保存した。
【0099】
製造者の取扱説明書に従って、３００μｌの対照ライン（ミネラルオイル）を用い、Ｊｕｎｏ（商品商標）システム（Fluidigm社）を用いて、４８．４８ＩＦＣチップを準備した。続いて、２５μｌの２×アッセイローディング試薬（Fluidigm社）、２２．５μｌのＤＮＡ懸濁緩衝液（TEKnova社）および２．５μｌの前調製されたプライマーストックを混合することにより、各標的遺伝子に対するプライマーミックスを調製した。全部で、各々５μＭの濃度の、７つのプライマーミックスを調製した。いずれのプライマーも欠くプライマーミックスは、ＮＰＣとして作用する。参照色素（Integrated DNA Technology社）を添加した１８０μｌの２×ＳＳＯ Ｆａｓｔ（商品商標）Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲマスターミックス（Bio-rad社）および１８μｌの２０×ＤＮＡ結合色素（Fluidigm社）を混合することにより、マスターミックスを調製した。
【0100】
本発明者らが調製した５μｌの上記プライマーミックスを、上記４８．４８ＩＦＣチップ中の該当する注入口に添加した。同量の試料混合物を上記４８．４８ＩＦＣチップ中の上記注入口に分注した。各ウェルに、２．７５μｌのマスターミックス、および２．２５μｌのエキソヌクレアーゼ処理済の予備的増幅されたｃＤＮＡ試料または核酸が含まれていない水を添加した。製造者の取扱説明書に従って、上記チップをＪｕｎｏ（商品商標）システム（Fluidigm社）によって準備し、ｑＰＣＲプログラムを実行する機器上に装填した。上記機器は、次のように設定された：９５℃で１分ホットスタートし、続いて２０サイクルの９５℃で５秒の変性、５８℃で２０秒のアニーリング、次いで各増加する温度増分の間で３秒を有する５８℃から９８℃の融解曲線解析。
【0101】
回収されたすべてのｑＰＣＲデータを、FluidigmリアルタイムＰＣＲ解析ソフトウェア（Fluidigm社）中で解析した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＤＰＨを、上記ソフトウェア中の参照遺伝子、およびこの供給されたデルタ－デルタＣｔ値（ΔΔＣｔ）およびハウスキーピング遺伝子に対する倍率変化値および両集団から選択した遺伝子として指定した。
【0102】
〔統計学的解析〕
発見集団において、本発明者らは疾患の進行と関連すると考えられる３つの下位集合を作成した；ＨＶｓおよびＣＯＶＩＤ－１９患者、重症および非重症、および早期回復フェイズ１およびフェイズ２。各下位集合内において、２６，３５４のＲＮＡの発現の差異を評価した。ＲＮＡシークエンシングの統計学的解析は、先行研究を若干改良した方法で実施した。ＨＶｓとＣＯＶＩＤ－１９患者との間の発現を比較するため、ｌｏｇ２正規化されたＲＮＡ ＦＰＫＭ値を用いたＲ２３中のｃｍｄｓｃａｌｅコマンドを伴う多次元尺度法を実施した。上記早期回復患者内のフェイズ１およびフェイズ２のみならず、重症および非重症、患者とＨＶｓとの間の発現リスト中の有意な変化をも特定するために、火山プロット解析を行った。有意であることは、最小ｌｏｇ２倍率変化の絶対値が１.２より大きいこと、および、ＦＤＲが０．１より小さいことによって定義した。有意差を示した２０の遺伝子をさらなる解析に使用した。
発見集団において、本発明者らは疾患の進行と関連すると考えられる３つの下位集合を作成した；ＨＶｓおよびＣＯＶＩＤ－１９患者、重症および非重症、および早期回復フェイズ１およびフェイズ２。各下位集合内において、２６，３５４のＲＮＡの発現の差異を評価した。ＲＮＡシークエンシングの統計学的解析は、先行研究を若干改良した方法で実施した。ＨＶｓとＣＯＶＩＤ－１９患者との間の発現を比較するため、ｌｏｇ２正規化されたＲＮＡ ＦＰＫＭ値を用いたＲ２３中のｃｍｄｓｃａｌｅコマンドを伴う多次元尺度法を実施した。上記早期回復患者内のフェイズ１およびフェイズ２のみならず、重症および非重症、患者とＨＶｓとの間の発現リスト中の有意な変化をも特定するために、火山プロット解析を行った。有意であることは、最小ｌｏｇ２倍率変化の絶対値が１.２より大きいこと、および、ＦＤＲが０．１より小さいことによって定義した。有意差を示した２０の遺伝子をさらなる解析に使用した。
【0103】
上記遺伝子の上流の調節因子を評価するため、上記データを、ＩＰＡ（QIAGEN社，https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ ingenuity-pathway-analysis，Kramer, A. et al., 2014）内でのｚ－スコアとＰ値の算出を伴う、上流調節因子解析を行った。上記ｚ－スコアは、対象の調節因子の下流の遺伝子発現パターンを用いて、上流の調節因子の活性化の状態を予測する。ｚ－スコアの絶対値が２より大きく、Ｐ値が０．０５より小さい場合に、上記上流の調節因子が活性化されたと判断した。有意差を示した２０の遺伝子の上流の調節因子をさらなる解析に使用し、ＨＶｓおよびＣＯＶＩＤ－１９患者、重症および非重症、および早期回復フェイズ１およびフェイズ２の各下位集合間で有意な発現変化が観察される、３１の候補ＲＮＡを特定した。
【0104】
ＲＮＡシークエンシングの統計学的解析の結果に基づき、３１のＲＮＡについて、Ｂｉｏｍａｒｋ ＨＤを用いたＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。ウィルコクソンの順位和検定でｐが０．０５より小さい場合に、統計学的に有意であると判断した。検証集団において、発見集団の候補の妥当性を検査した。患者を２８日生存者と２８日非生存者の２つの群に分けた。発見集団の候補は、２群間で、ウィルコクソンの順位和検定により比較した。上記生存者と上記非生存者との間で有意に変化した（両側Ｐ値が０．０５より小さい）ＲＮＡを鍵ｍＲＮＡとして抽出した。鍵ｍＲＮＡとその比を用いて受信者操作特性（Receiver Operating Characteristic, ＲＯＣ）曲線を描いた。生存を予測する精度を評価するため、ＲＯＣ曲線の下部の領域（Area Under the ROC Curves, ＡＵＣｓ）を算出した。最大ＡＵＣを有するＲＯＣのカットオフ値に基づき、検証集団を２つの群に分けた。上記２つの群を臨床の表現型として定義し、上記表現型を臨床データと比較した。表現型をベースライン特性および２８日目と比較するために、フィッシャーの直接確率検定およびクラスカル・ウォリスの順位和検定を用いた。カプラン・マイヤー曲線を用いて死亡率を図解し、上記表現型をログランク検定によって比較した。両側Ｐが０．０５より小さい場合に、統計学的に有意であると判断した。全ての統計学的解析に対して、R environment for statistical computing, version 4.0.2（R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria）を用いて、完全にスクリプトされたデータ管理パスウェイを作成した。カテゴリー変数を数値と百分率で報告し、有意差をχ２またはフィッシャーの直接確率検定によって検出した。連続型変数を平均値と標準誤差を用いて描いた、または、連続型変数をマン・ホイットニーＵ検定または中央値と四分位範囲（ＩＱＲ）値を用いて描いたクラスカル・ウォリスの順位和検定を用いて比較した。第１の発見集団および第２の発見集団内の血漿のプロテオミクス、または検証集団内の血漿タンパク質のレベルに欠測値はなかった。
【0105】
〔結果〕
〔１．発見集団からの候補ＲＮＡの探索〕
試験期間中、本発明者らは、４０人の患者と１６人の健常ボランティアを発見集団内に登録した。上記集団は３５人の重症患者および５人の非重症患者を含んでいた。上記重症患者の間には、１２人の早期回復患者および２３人の回復遅延患者がそれぞれ存在した。本発明者らは、下位集団（ＣＯＶＩＤ－１９患者対健常ボランティア、重症対非重症、および早期回復フェイズ１対フェイズ２）由来の候補ｍＲＮＡを特定するため、倍率変化解析および上流解析を行った。本発明者らは上記解析から１２０の候補ＲＮＡを選択した。上記１２０候補ＲＮＡのうち、３１のＲＮＡ発現レベルが、重症と非重症の間で有意に変化していた。有意に変化していた３１のＲＮＡを図１、２に示した。図１、２中、「Non-Critical」は非重症群、「Critical」は重症群、「Control」は対照群であることを示す。＊＊＊はクラスカル・ウォリスの順位和検定で両側Ｐ値＜０．００１であることを示し、＊＊は同検定で両側Ｐ値＜０．０１であることを示し、＊は同検定で両側Ｐ値＜０．０５であることを示し、ＮＳは同検定で統計学的に有意差がないことを示す。
〔１．発見集団からの候補ＲＮＡの探索〕
試験期間中、本発明者らは、４０人の患者と１６人の健常ボランティアを発見集団内に登録した。上記集団は３５人の重症患者および５人の非重症患者を含んでいた。上記重症患者の間には、１２人の早期回復患者および２３人の回復遅延患者がそれぞれ存在した。本発明者らは、下位集団（ＣＯＶＩＤ－１９患者対健常ボランティア、重症対非重症、および早期回復フェイズ１対フェイズ２）由来の候補ｍＲＮＡを特定するため、倍率変化解析および上流解析を行った。本発明者らは上記解析から１２０の候補ＲＮＡを選択した。上記１２０候補ＲＮＡのうち、３１のＲＮＡ発現レベルが、重症と非重症の間で有意に変化していた。有意に変化していた３１のＲＮＡを図１、２に示した。図１、２中、「Non-Critical」は非重症群、「Critical」は重症群、「Control」は対照群であることを示す。＊＊＊はクラスカル・ウォリスの順位和検定で両側Ｐ値＜０．００１であることを示し、＊＊は同検定で両側Ｐ値＜０．０１であることを示し、＊は同検定で両側Ｐ値＜０．０５であることを示し、ＮＳは同検定で統計学的に有意差がないことを示す。
【0106】
ＲＮＡ発現レベルのさらに正確な評定のために、上記３１のＲＮＡについて、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて再評価した。その結果、３つの下位集団すべてにおいて、５つのＲＮＡ（ＩＬ１８Ｒ１、ＬＧＡＬＳ２、ＭＡＰＫ１４、ＰＲＬおよびＴＬＲ３）の発現が有意に変化していた（図３）。図３－３０１～３０５は、健常ボランティア（ＨＶｓ）と重症および非重症の各ＲＮＡ発現レベルを示す。図３－３０１～３０５中、「Non-Critical」は非重症群、「Critical」は重症群、「Control」はＨＶｓ群であることを示す。図３－３０６～３１０は、健常ボランティア（ＨＶｓ）とフェイズ１とフェイズ２の各ＲＮＡ発現レベルを示す。図３－３０６～３１０中、「Phase 1」はフェイズ１群、「Phase 2」はフェイズ２群、「Control」はＨＶｓ群であることを示す。図３－３０１～３１０中、＊＊＊はクラスカル・ウォリスの順位和検定で両側Ｐ値＜０.００１、＊＊は同検定で両側Ｐ値＜０.０１であることを示し、＊は同検定で両側Ｐ値＜０．０５であることを示し、ＮＳは同検定で統計学的に有意差がないことを示す。このようにして本発明者らは、５つのＲＮＡを上記発見集団の候補として得た。
【0107】
〔２．ＲＴ－ｑＰＣＲによる５つの候補ＲＮＡの検証〕
バイオマーカー候補としての５つのＲＮＡの堅牢性を確かめるために、本発明者らは、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて、独立した検証集団でこれらの候補を評定した。本発明者らは、１５３人のＣＯＶＩＤ－１９患者を上記検証集団に包含した。上記集団は１４５人の重症患者および８人の非重症患者を含んでいた。９人の患者（５．９％）がＩＣＵ入院から２８日以内に死亡した。これらのＲＮＡの関連性を評定するため、本発明者らは、検証集団内で、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて５つの候補ＲＮＡの発現レベルを評価した。上記５つの候補ＲＮＡの間で、２８日非生存者と比較した２８日生存者内のＰＲＬが有意に増加し、ＴＬＲ３が有意に減少した（図４）。図４中、「Survivor」は２８日生存者群を意味し、「Non-survivor」は２８日非生存者群を示す。＊はウィルコクソンの順位和検定で両側Ｐ値＜０．０５であることを示し、ＮＳは同検定で統計学的に有意差がないことを示す。
バイオマーカー候補としての５つのＲＮＡの堅牢性を確かめるために、本発明者らは、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて、独立した検証集団でこれらの候補を評定した。本発明者らは、１５３人のＣＯＶＩＤ－１９患者を上記検証集団に包含した。上記集団は１４５人の重症患者および８人の非重症患者を含んでいた。９人の患者（５．９％）がＩＣＵ入院から２８日以内に死亡した。これらのＲＮＡの関連性を評定するため、本発明者らは、検証集団内で、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いて５つの候補ＲＮＡの発現レベルを評価した。上記５つの候補ＲＮＡの間で、２８日非生存者と比較した２８日生存者内のＰＲＬが有意に増加し、ＴＬＲ３が有意に減少した（図４）。図４中、「Survivor」は２８日生存者群を意味し、「Non-survivor」は２８日非生存者群を示す。＊はウィルコクソンの順位和検定で両側Ｐ値＜０．０５であることを示し、ＮＳは同検定で統計学的に有意差がないことを示す。
【0108】
このようにして本発明者らは、ＰＲＬおよびＴＬＲ３がＣＯＶＩＤ－１９患者の予後に関連する２つの鍵ＲＮＡであると判断した。
【0109】
〔３．悪い予後のＣＯＶＩＤ－１９患者を良い予後のＣＯＶＩＤ－１９患者から識別するＲＮＡエンドタイプの特定〕
悪い予後を有する患者内の上記２つのＲＮＡの発現変化の特性を考慮して、本発明者らは、ＲＮＡ表現型の候補指標として、ＰＲＬ、ＴＬＲ３およびＰＲＬ／ＴＬＲ３比を評価した。ＲＯＣ曲線を用いて、いくつかのタンパク質マーカー（ＣＲＰおよびＦＤＰ）ならびに重篤スコア（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩおよびＳＯＦＡ）をＰＲＬ、ＴＬＲ３およびＰＲＬ／ＴＬＲ３と比較した。ＰＲＬに対するＡＵＣは、０．７２１（９５％ＣＩ；０．５６６～０．８７６）であった。ＴＬＲ３に対するＡＵＣは、０．７１６（９５％ＣＩ；０．６２３～０．８２０）であった。ＰＲＬ／ＴＬＲ３に対するＡＵＣは、０．７９３（９５％ＣＩ；０．６９３～０．８９２）であった。上記タンパク質マーカーＣＲＰおよびＦＤＰに対するＡＵＣは、それぞれ０．４７７（９５％ＣＩ；０．２９１～０．６６４）および０．６５８（９５％ＣＩ；０．４８０～０．８３７）であった。ＡＵＣ解析は、ＰＲＬ、ＴＬＲ３およびＰＲＬ／ＴＬＲ３比が、タンパク質マーカーおよび重篤スコアよりも予後の識別にさらに適切であることを示した（図５－５０１、５０２）。ＲＯＣ曲線の結果より、本発明者らは、ＰＲＬ／ＴＬＲ３比の閾値を２９４．８で設定した。図５－５０１、５０２中、「Sensitivity」は感度であることを示し、「1-specificity」は特異度であることを示す。「Factor」は解析対象のＲＮＡを示し、（Area Under the ROC Curves, ＡＵＣｓ）はＲＯＣ曲線の下部の領域を示し、９５％ＣＩは信頼区間を示す。
悪い予後を有する患者内の上記２つのＲＮＡの発現変化の特性を考慮して、本発明者らは、ＲＮＡ表現型の候補指標として、ＰＲＬ、ＴＬＲ３およびＰＲＬ／ＴＬＲ３比を評価した。ＲＯＣ曲線を用いて、いくつかのタンパク質マーカー（ＣＲＰおよびＦＤＰ）ならびに重篤スコア（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩおよびＳＯＦＡ）をＰＲＬ、ＴＬＲ３およびＰＲＬ／ＴＬＲ３と比較した。ＰＲＬに対するＡＵＣは、０．７２１（９５％ＣＩ；０．５６６～０．８７６）であった。ＴＬＲ３に対するＡＵＣは、０．７１６（９５％ＣＩ；０．６２３～０．８２０）であった。ＰＲＬ／ＴＬＲ３に対するＡＵＣは、０．７９３（９５％ＣＩ；０．６９３～０．８９２）であった。上記タンパク質マーカーＣＲＰおよびＦＤＰに対するＡＵＣは、それぞれ０．４７７（９５％ＣＩ；０．２９１～０．６６４）および０．６５８（９５％ＣＩ；０．４８０～０．８３７）であった。ＡＵＣ解析は、ＰＲＬ、ＴＬＲ３およびＰＲＬ／ＴＬＲ３比が、タンパク質マーカーおよび重篤スコアよりも予後の識別にさらに適切であることを示した（図５－５０１、５０２）。ＲＯＣ曲線の結果より、本発明者らは、ＰＲＬ／ＴＬＲ３比の閾値を２９４．８で設定した。図５－５０１、５０２中、「Sensitivity」は感度であることを示し、「1-specificity」は特異度であることを示す。「Factor」は解析対象のＲＮＡを示し、（Area Under the ROC Curves, ＡＵＣｓ）はＲＯＣ曲線の下部の領域を示し、９５％ＣＩは信頼区間を示す。
【0110】
〔４．ＰＲＬ／ＴＬＲ３比に基づく患者の転帰の比較〕
本発明者らは、１５３人の患者を２つの群に分けた。１つは高ＰＲＬ／ＴＬＲ３比群であり、１つは低ＰＲＬ／ＴＬＲ３比群である。また本発明者らは、この２群のＲＮＡエンドタイプによる患者の転帰を比較した。上記高ＰＲＬ／ＴＬＲ３群には４７人の患者、上記低ＰＲＬ／ＴＬＲ３群には１０６人の患者が存在した。ＲＮＡエンドタイプは、年齢、性別、いずれの併存疾患、Ｐ／Ｆ比、ＳＯＦＡ、との関連性を示さなかった（表１および図６－６０１～６０３）。図－６０１～６０３中、「P/F ratio」、「SOFA score」はそれぞれ入院時のＰ／Ｆ比、ＳＯＦＡスコアを示し、「APACHE II score」はＩＣＵに入院した時点でのＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアを示す。ＮＳは統計学的に有意差がないことを示す。
本発明者らは、１５３人の患者を２つの群に分けた。１つは高ＰＲＬ／ＴＬＲ３比群であり、１つは低ＰＲＬ／ＴＬＲ３比群である。また本発明者らは、この２群のＲＮＡエンドタイプによる患者の転帰を比較した。上記高ＰＲＬ／ＴＬＲ３群には４７人の患者、上記低ＰＲＬ／ＴＬＲ３群には１０６人の患者が存在した。ＲＮＡエンドタイプは、年齢、性別、いずれの併存疾患、Ｐ／Ｆ比、ＳＯＦＡ、との関連性を示さなかった（表１および図６－６０１～６０３）。図－６０１～６０３中、「P/F ratio」、「SOFA score」はそれぞれ入院時のＰ／Ｆ比、ＳＯＦＡスコアを示し、「APACHE II score」はＩＣＵに入院した時点でのＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアを示す。ＮＳは統計学的に有意差がないことを示す。
【0111】
２８日での死亡率の累積発生は、高ＰＲＬ／ＴＬＲ３群で１７．０％（ｎ＝８）、低ＰＲＬ／ＴＬＲ３群で０．９％（ｎ＝１）であった。カプラン・マイヤー解析により、エンドタイプと２８日死亡率との関係性を示した（ｐ＜０．０１）（図６－６０４）。ｐはログランク検定での両側Ｐ値を示す。
【0112】
院内死亡率も、低ＰＲＬ／ＴＬＲ３群に比べて、高ＰＲＬ／ＴＬＲ３群で有意に高かった（２３．４％対９．４％、ｐ＝０．０４）（表２）。上記２群の間に、２８日目での、人工呼吸器離脱の日数およびＩＣＵ滞在の長さの差はなかった（それぞれｐ＝０．５４およびｐ＝０．９９）。図６－６０４中、「Probability of survival」は生存確率を示し、「Days」は入院開始からの日数を示す。点線（High）はＰＲＬ／ＴＬＲ３比の高い群、実線（Low）はＰＲＬ／ＴＬＲ３比の低い群を示す。ｐは２８日時点での、高ＰＲＬ／ＴＬＲ３群との間のｐ値を示す。
【0113】
【表1】
【0114】
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0115】
本発明の一態様は、コロナウイルス感染症患者の予後を予測し、コロナウイルス感染症治療や研究に利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】