ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人大阪大学
特開2024-59493ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法、キットおよびバイオマーカーの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024059493
(43)【公開日】2024-05-01
(54)【発明の名称】ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法、キットおよびバイオマーカーの使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240423BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【請求項の数】3
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022167186
(22)【出願日】2022-10-18
(71)【出願人】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】川▲崎▼ 貴裕
(72)【発明者】
【氏名】武田 吉人
(72)【発明者】
【氏名】熊ノ郷 淳
(57)【要約】
【課題】ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法、キットおよびバイオマーカー等を実現する。
【解決手段】本開示のＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法は、被験体から採取された試料においてＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出する工程を含む。
【選択図】なし
【解決手段】本開示のＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法は、被験体から採取された試料においてＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出する工程を含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験体から採取された試料においてＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出する工程を含む、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法。
【請求項2】
ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出するための物品を備える、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するためのキット。
【請求項3】
ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を含むバイオマーカーの、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法、キットおよびバイオマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
２０１９年末より世界的に蔓延したコロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）は、治療薬およびワクチンの開発が進められているにもかかわらず、感染爆発を繰り返し、医療のひっ迫を招いている。一般に、ＣＯＶＩＤ－１９患者の約８０％が軽症のまま回復するが、残りの約１０～２０％が重症化するとされている。しかしながらＣＯＶＩＤ－１９に対する患者の応答は様々であるため、現在のところ、重症化リスクのある患者を予測するための有効な手段は見つかっていない。
【0003】
重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の全身性免疫応答をより良く理解するために、いくつかの研究では、シングルセルＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）、プロテオミクスおよびメタボロミクスを含むマルチオミクス解析が行われている。例えば非特許文献１では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑと血漿のプロテオミクスおよびメタボロミクスとを行い、異なるＣＯＶＩＤ－１９重症度の患者間での免疫応答の変化が明らかにされている。また、非特許文献２では、ＣＯＶＩＤ－１９患者の細胞外小胞（ＥＶ）のリピドミクスおよびプロテオミクスにより、疾患の異なるステージの間でのＥＶラフト脂質の代謝における変化が示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Su Y et. al., Cell. 183(6):1479-1495, 2020
【非特許文献2】Lam SM et. al., Nat Metab. ;3(7):909-922, 2021
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、上述のような従来技術は、主に免疫細胞の調節障害に着目しており、十分な数のタンパク質をカバーしたプロテオミクスは行われていなかった。それゆえ、従来技術では、重症ＣＯＶＩＤ－１９の鍵となり、難治化を予測するために有用なバイオマーカーとなり得るタンパク質が十分に調査されていなかった。
【0006】
本発明の一態様は、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法、キットおよびバイオマーカー等を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、次世代プロテオミクス解析と、末梢血のシングルセル解析および肺のシングル核解析とを組み合わせることにより、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質が重症ＣＯＶＩＤ－１９のバイオマーカー候補となり得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明の一態様は、以下の構成を含む。
＜１＞被験体から採取された試料においてＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出する工程を含む、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法。
＜２＞ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出するための物品を備える、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するためのキット。
＜３＞ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を含むバイオマーカーの、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するための使用。
＜１＞被験体から採取された試料においてＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出する工程を含む、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法。
＜２＞ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出するための物品を備える、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するためのキット。
＜３＞ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を含むバイオマーカーの、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するための使用。
【発明の効果】
【0008】
本発明の一態様によれば、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法、キットおよびバイオマーカー等を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】実施例におけるグループ２とグループ３とを比較する２３７６種の血清ＥＶタンパク質のボルケーノプロット、および、グループ２とグループ３とを区別する１２種のバイオマーカー候補タンパク質の主成分分析結果を示す図である。
【図2】実施例におけるグループ２とグループ３との比較において１．５を超える変化倍率で有意にアップレギュレーションされていたか０．６７未満の変化倍率で有意にダウンレギュレーションされていたＥＶタンパク質についてIngenuity Pathway Analysisにより決定された上位１０個のカノニカルパスウェイ、ならびに上位１０個の疾患および機能を示す図である。
【図3】実施例におけるグループ２および３とグループ１とを比較する２３７６種の血清ＥＶタンパク質のボルケーノプロット、および、グループ２および３とグループ１とを区別する１７４種のバイオマーカー候補タンパク質の主成分分析結果を示す図である。
【図4】実施例におけるグループ２および３とグループ１との比較において２を超える変化倍率で有意にアップレギュレーションされていたか０．５未満の変化倍率で有意にダウンレギュレーションされていたＥＶタンパク質についてIngenuity Pathway Analysisにより決定された上位１０個のカノニカルパスウェイ、ならびに上位１０個の疾患および機能を示す図である。
【図5】実施例におけるプロテオミクスで検出されたＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を含むタンパク質の原因調節分子および代表的な因果関係ネットワークを示す図である。
【図6】実施例において健常群およびＣＯＶＩＤ－１９患者群のノンターゲットプロテオミクス解析により決定されたＭＡＣＲＯＨ２Ａ１のレベルを表す図である。
【図7】実施例における健常群および重症ＣＯＶＩＤ－１９患者群（グループ２および３）の血清ＥＶのイムノブロット結果を示す図である。
【図8】実施例におけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１によるＣＯＶＩＤ－１９重症度グループの診断に対するＲＯＣ解析結果を示す図である。
【図9】実施例におけるＣＯＶＩＤ－１９患者および対照の肺組織切片の組織学的解析結果、ならびにＭＡＣＲＯＨ２Ａ１陽性細胞の割合を示す図である。
【図10】実施例において細胞集団ごとに、またはＭＡＣＲＯＨ２Ａ１のｍＲＮＡ転写レベルによって着色した、ＣＯＶＩＤ－１９患者群および健常群のＰＢＭＣのＵＭＡＰ可視化結果を示す図である。
【図11】実施例における各重症度での各細胞タイプの割合を示す図である。
【図12】実施例におけるＰＢＭＣの各細胞でのＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現を示すドットプロットを表す図である。
【図13】実施例におけるＰＢＭＣの各細胞での、示されたグループ間のＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の差次的発現解析結果を示す図である。
【図14】実施例における単球の各サブタイプでの、示されたグループ間のＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の差次的発現解析結果を示す図である。
【図15】実施例の致死ＣＯＶＩＤ－１９患者および対照群から得られた肺のｓｎＲＮＡデータ解析結果を埋め込んだＵＭＡＰ可視化結果を示す図である。
【図17】実施例の対照群および致死ＣＯＶＩＤ－１９患者群におけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子のＲＮＡ発現レベル（ｌｏｇ正規化）によって着色したＵＭＡＰ可視化結果を示す図である。
【図18】実施例における対照群およびＣＯＶＩＤ－１９患者群の各肺細胞でのＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現レベルを表すバイオリンプロットを示す図である。
【図19】実施例における単球およびマクロファージでのＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の差次的発現解析結果を示す図である。
【図20】実施例において１μｇ／ｍＬのＩＦＮγを用いて、または用いずに、１μｇ／ｍＬのＲ８４８、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳまたは１μｇ／ｍＬのＰａｍ３ＣＳＫ４で４８時間処理した後、ＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１細胞のイムノブロット解析結果を示す図である。
【図21】実施例において１μｇ／ｍＬのＩＦＮγを用いて、または用いずに、示された濃度のＴＮＦαで４８時間処理した後、ＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１細胞のイムノブロット解析結果を示す図である。
【図22】実施例の血清ＥＶプロテオミクス、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよび肺組織のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑにおいて解析した分子ネットワークにおける上位１０個のパスウェイを示す図である。
【図23】ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の上流の分子ネットワークであって、実施例におけるグループ２とグループ３との比較においてｐ＜０．０５、かつ変化倍率が１．５を超えるか、または０．６７未満であるＥＶタンパク質の分子ネットワークを表す図である。
【図24】ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の上流の分子ネットワークであって、実施例におけるグループ２および３とグループ１との比較においてＰＢＭＣ由来の単球のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現解析において有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている遺伝子の分子ネットワークを表す図である。
【図25】ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の上流の分子ネットワークであって、実施例における対照と致死ＣＯＶＩＤ－１９との比較において肺由来の単球のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現解析において有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている遺伝子の分子ネットワークを表す図である。
【図26】ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の下流の分子ネットワークであって、実施例におけるグループ２とグループ３との比較においてｐ＜０．０５、かつ変化倍率が１．５を超えるか、または０．６７未満であるＥＶタンパク質の分子ネットワークを表す図である。
【図27】ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の下流の分子ネットワークであって、実施例におけるグループ２および３とグループ１との比較においてＰＢＭＣ由来の単球のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現解析において有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている遺伝子の分子ネットワークを表す図である。
【図28】ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の下流の分子ネットワークであって、実施例における対照と致死ＣＯＶＩＤ－１９との比較において肺由来の単球のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現解析において有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている遺伝子の分子ネットワークを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の一実施形態について、以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。遺伝子名について本明細書中では便宜的に斜字体で表記しないが、図面中では斜字体で表記する。
【0011】
本発明者らは上述の課題を解決するためにまず、細胞外小胞の一種であるエクソソームに着目した。血液はバイオマーカーの理想的なリソースであると考えられるが、血液に含まれるタンパク質の９９％がアルブミンなどの夾雑物であるため、プロテオミクス解析の対象とするには不利であった。これに対し、エクソソームをプロテオミクス解析の対象とすれば、上記夾雑物を除いた状態で解析できる。また、エクソソームは脂質二重膜で包まれているため、サンプル中のプロテアーゼからの分解を逃れた病因タンパクをそのまま保持していると考えられる。また、本発明者らは、エクソソームの抽出法として、従来に比べて高い純度で抽出可能であり、エクソソームへのダメージが少ない方法であるホスファチジルセリンアフィニティー法（MagCapture）を採用した。
【0012】
さらに本発明者らは、質量分析においても次世代プロテオミクスとされるData independent acquisition（ＤＩＡ）法を使用した。ＤＩＡ法は従来の質量分析に比べて、微少なタンパク質の定量に優れており、これまでよりも更に網羅的な解析が可能である。また、プロテオミクス解析のみでは、同定した分子の生体内での挙動に関する考察および同定した分子が病態にどのように関わっているのかといった考察を行うには不十分であると本発明者らは考えた。そこで、ＣＯＶＩＤ－１９患者血液から採取したＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよびＣＯＶＩＤ－１９肺炎の肺組織のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑを組み合わせることで、同定したバイオマーカーの病的意義も併せて検討した。
【0013】
その結果、本発明者らは、重症例の間（難治例と非難治例との間）の比較で有意に増加しており、かつ重症度に応じて有意に増加するタンパク質として、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を同定した。ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑにおいて、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子は単球において局所的に発現しており、非重症例に比べて重症例で増加していた。また、以前に生成された肺組織のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑデータの解析からも、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子が単球およびマクロファージにおいて高度に発現しており、対照に比べてＣＯＶＩＤ－１９患者で有意に増加していることが見出された。
【0014】
〔１．ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法〕
本発明の一実施形態に係るＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法は、被験体から採取された試料においてＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出する工程を含む。当該方法を以下では単に「評価方法」とも称する。本発明の一実施形態において、上記評価方法は、あくまで補助的方法のみを意図し、医師が行う患者の診断方法とは異なる。上記評価方法をＣＯＶＩＤ－１９患者の診断に適用することは可能であり、当該方法から得られた結果をもとに、医師が診断を行うことができる。このため、上記評価方法は、被験体から採取された試料においてＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出する工程を含む、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するためのデータの取得方法であると換言することもできる。
本発明の一実施形態に係るＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価する方法は、被験体から採取された試料においてＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出する工程を含む。当該方法を以下では単に「評価方法」とも称する。本発明の一実施形態において、上記評価方法は、あくまで補助的方法のみを意図し、医師が行う患者の診断方法とは異なる。上記評価方法をＣＯＶＩＤ－１９患者の診断に適用することは可能であり、当該方法から得られた結果をもとに、医師が診断を行うことができる。このため、上記評価方法は、被験体から採取された試料においてＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出する工程を含む、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するためのデータの取得方法であると換言することもできる。
【0015】
ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質（Core histone macro-H2A.1, Uniprot ID: O75367）がＣＯＶＩＤ－１９に関連していることは本発明者らにより初めて見出されたことである。ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質は、ヒストンＨ２Ａのバリアントの一種であり、２つのアイソフォームＭＡＣＲＯＨ２Ａ１．１およびＭＡＣＲＯＨ２Ａ１．２を有する。
【0016】
ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出するための試料としては、被験体から採取された血液、喀痰、気管支肺胞洗浄液、唾液、髄液、尿、便等が挙げられ、中でも血液が好ましい。上記血液は、全血であってもよく、血漿または血清であってもよい。ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質の検出は、インビトロで行われ得る。
【0017】
上記被験体は、ヒトであってもよく、非ヒトである哺乳動物であってもよい。被験体は、ＣＯＶＩＤ－１９患者であり得る。ＣＯＶＩＤ－１９は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる感染症である。ＣＯＶＩＤ－１９患者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのＰＣＲ検査によって陽性と判定された患者であり得る。また、ＣＯＶＩＤ－１９患者は、ＣＴスキャン等によって肺炎と診断された患者であり得る。ＣＯＶＩＤ－１９患者は、入院が必要であると診断された患者であってもよく、入院が不要であると診断された患者であってもよい。ＣＯＶＩＤ－１９患者は、酸素投与が必要と診断された患者であってもよく、酸素投与が不要と診断された患者であってもよい。ＣＯＶＩＤ－１９患者は、デキサメタゾンなどのステロイドを投与されていてもよい。
【0018】
本明細書において「重症」とはLiving guidance for clinical management of COVID-19 (WHO, 2021)における「重症(Critical disease)」の条件を満たす状態を意味する。重症ＣＯＶＩＤ－１９患者は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症、敗血症性ショックの症状を示している患者であり得る。重症ＣＯＶＩＤ－１９患者は、人工呼吸器による管理が必要であると診断された患者であり得る。非重症ＣＯＶＩＤ－１９患者は、人工呼吸器による管理が不要であると診断された患者であり得る。本明細書において、「難治化」とは、デキサメタゾンなどのステロイドを投与した後に、再度ステロイドの投与が必要になることを意味する。
【0019】
試料は、いずれのタイミングで採取されてもよく、複数回採取されてもよい。試料は、採取からＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質の検出に用いられるまでの間、冷凍保存されてもよい。
【0020】
ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質の検出方法は特に限定されず、免疫測定法であってもよく、質量分析法であってもよい。免疫測定法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ法、イムノクロマトグラフィー法、免疫沈降法、ビオチン－アビジン法、電気化学発光免疫測定法（ECLIA；Electro chemiluminescence immunoassay）、化学発光酵素免疫測定法（CLEIA;chemiluminecent enzyme immunoassay）等が挙げられる。
【0021】
上記評価方法は、試料中のＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質のレベルを定量する工程を含んでいてもよい。また、上記評価方法は、測定されたＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質のレベルを、予め設定された基準値と比較する工程を含んでいてもよい。上記基準値は受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線などから求められたカットオフ値であってもよい。ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質は実施例にて重症度が高くなるにつれて有意に増加していた。従って、例えば、試料中のＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質のレベルが上記基準値より高い場合に、重症化または難治化のリスクが高いと判断してもよい。
【0022】
上記評価方法は、ＳＰＰ２タンパク質（Secreted phosphoprotein 24, Uniprot ID: Q13103）、ＣＬＴＡタンパク質（Clathrin light chain A, Uniprot ID: P09496）、ＣＮＤＰ２タンパク質（Cytosolic non-specific dipeptidase, Uniprot ID: Q96KP4）からなる群より選択される１種以上のタンパク質を検出する工程をさらに含んでいてもよい。これらのタンパク質を以下では便宜的に「他のタンパク質」とも称する。また、上記評価方法は、これらのタンパク質のレベルを定量する工程、これらのタンパク質のレベルを予め設定された基準値と比較する工程を含んでいてもよい。例えばＳＰＰ２タンパク質は実施例に示すように難治例と非難治例との間の比較、ならびに重症例と非重症例との間の比較の両方において０．５未満または２を超える変化倍率で有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされていたタンパク質の１つである。また、ＣＬＴＡタンパク質およびＣＮＤＰ２タンパク質は、重症例と非重症例との間の比較において０．５未満または２を超える変化倍率で有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされ、かつボンフェローニ補正を行った場合でも有意であった。中でもＳＰＰ２タンパク質は実施例にて重症度が高くなるにつれて減少していた。従って、例えば、試料中のＳＰＰ２タンパク質のレベルが上記基準値より低い場合に、重症化または難治化のリスクが高いと判断してもよい。
【0023】
〔２．キット〕
本発明の一実施形態には、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出するための物品を備える、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するためのキットも包含される。
本発明の一実施形態には、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を検出するための物品を備える、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するためのキットも包含される。
【0024】
ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質の検出方法は、上述した通りである。上記キットは、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質のレベルを定量するための物品を備えていてもよい。上記キットは、上述の他のタンパク質を検出するための物品、他のタンパク質のレベルを定量するための物品を備えていてもよい。これらの物品としては、特に限定されないが、例えば抗体などが挙げられる。
【0025】
また、上記キットは、キットの使用に必要となる薬剤、器具、容器、説明書などを備えていてもよい。上記キットは、例えば上述の検出方法を実施するために必要となる物品を備えていてもよい。
【0026】
本発明の一実施形態には、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を含むバイオマーカーの、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するための使用も包含される。さらに、バイオマーカーとして上述の他のタンパク質を併用してもよい。
【0027】
なお本発明の一実施形態は、ＣＯＶＩＤ－１９の治療薬の選択に応用することができる。すなわち、感染性疾患の治療薬の研究開発を支援することができる。これにより、持続可能な開発目標（ＳＤＧｓ）の目標３「すべての人に健康と福祉を」の達成に貢献できる。
【0028】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例0029】
本発明の一実施例について以下に説明する。
【0030】
〔研究計画〕
プロテオミクス解析のために、１２人のＣＯＶＩＤ－１９患者および４人の健常者（健康的な対照）を登録した。ＣＯＶＩＤ－１９患者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡに対するＰＣＲ検査により、ＣＯＶＩＤ－１９であると診断された。ＣＯＶＩＤ－１９重症度は、Living guidance for clinical management of COVID-19 (WHO, 2021)により非重症または重症に分類した。そのうちの重症患者は大阪大学医学部附属病院へ、非重症患者は国立病院機構大阪刀根山医療センターへ、２０２０年７月から２０２１年２月の間に入院した患者の中からエントリーした。健常群は、ＣＯＶＩＤ－１９が流行する前に大阪大学医学部附属病院にて公募した。全ての重症患者は人工呼吸器により管理されており、挿管されていた。全てのＣＯＶＩＤ－１９患者は、デキサメタゾンを処方され、デキサメタゾン処置の終わりに血清サンプルを採取し、－８０℃で保管した。これらの患者の医療記録はレトロスペクティブな分析であった。この研究において、重症例のうち、ＣＯＶＩＤ－１９肺炎がその後の経過で悪化し、デキサメタゾンの再投与を必要とした重症例を、難治例に分類し、デキサメタゾンの再投与を必要としない残りの重症例を非難治例に分類した。これらのサンプルを用いて、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による定量的プロテオミクスを実施した。
プロテオミクス解析のために、１２人のＣＯＶＩＤ－１９患者および４人の健常者（健康的な対照）を登録した。ＣＯＶＩＤ－１９患者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡに対するＰＣＲ検査により、ＣＯＶＩＤ－１９であると診断された。ＣＯＶＩＤ－１９重症度は、Living guidance for clinical management of COVID-19 (WHO, 2021)により非重症または重症に分類した。そのうちの重症患者は大阪大学医学部附属病院へ、非重症患者は国立病院機構大阪刀根山医療センターへ、２０２０年７月から２０２１年２月の間に入院した患者の中からエントリーした。健常群は、ＣＯＶＩＤ－１９が流行する前に大阪大学医学部附属病院にて公募した。全ての重症患者は人工呼吸器により管理されており、挿管されていた。全てのＣＯＶＩＤ－１９患者は、デキサメタゾンを処方され、デキサメタゾン処置の終わりに血清サンプルを採取し、－８０℃で保管した。これらの患者の医療記録はレトロスペクティブな分析であった。この研究において、重症例のうち、ＣＯＶＩＤ－１９肺炎がその後の経過で悪化し、デキサメタゾンの再投与を必要とした重症例を、難治例に分類し、デキサメタゾンの再投与を必要としない残りの重症例を非難治例に分類した。これらのサンプルを用いて、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による定量的プロテオミクスを実施した。
【0031】
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑについて対象としたＣＯＶＩＤ－１９患者は、大阪大学医学部附属病院へ入院した患者である。ＣＯＶＩＤ－１９重症度および診断は、プロテオミクス解析と同様に決定した。これらのうち、重症例は、プロテオミクス解析と同じ患者であった。
【0032】
この研究は、ヒトを対象とした医学研究に関するヘルシンキ宣言に従って行われた。また、この研究は、大阪大学医学部附属病院および国立病院機構大阪刀根山医療センターの倫理委員会によって承認されている。全ての患者群および健常群からは書面でのインフォームド・コンセントを得た。
【0033】
〔プロテオミクスのためのＥＶの単離〕
血清サンプルを８０℃で１０分間煮沸し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを不活化した。次いで、MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS Ver.2 (FUJIFILM Wako, Japan)を用いて製造業者の指示に従い、ＥＶを単離した。ＥＶのサイズ分布および数は、NanoSight nanoparticle tracking analysis (Malvern Instruments, Malvern, UK)によって測定した。
血清サンプルを８０℃で１０分間煮沸し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを不活化した。次いで、MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS Ver.2 (FUJIFILM Wako, Japan)を用いて製造業者の指示に従い、ＥＶを単離した。ＥＶのサイズ分布および数は、NanoSight nanoparticle tracking analysis (Malvern Instruments, Malvern, UK)によって測定した。
【0034】
〔プロテオミクス解析〕
血清ＥＶのプロテオミクス解析をFutami Y, et al. Int Immunol. 2022;34(6):327-340に従って実施した。要約すると、エクソソーム溶出物に１２０ｍＭのデオキシコール酸ナトリウムと、５００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を含む１０×相間移動溶解剤（ＰＴＳ）バッファと、１２０ｍＭのＮ－ラウロイルサルコシン酸ナトリウムとを加えた後、９５℃で煮沸した。サンプルに１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を加えた後、３７℃で３０分間保持し、次いで２０ｍＭのヨードアセトアミドを加えて、遮光して３７℃で３０分アルキル化を行った。次いで１μｇのトリプシン(Wako-Chemical, Tokyo, Japan)および２ｍＡＵのＬｙｓＣ(Wako-Chemical, Tokyo, Japan)により３７℃で一晩消化した。消化した溶液に１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、洗浄剤を２０，０００×ｇで１０分間の遠心分離により沈殿させた。断片化されたペプチドを含む上清にC18-SCX StageTipを加えることにより脱塩し、さらに遠心エバポレーターにより乾燥させた。HTC-PAL autosampler (CTC Analytics, Zwingen, Switzerland)およびUltiMate 3000 Nano LC system (Thermo Scientific, Bremen, Germany)をOrbitrap Fusion Lumos mass spectrometer (Thermo Scientific)に接続することにより、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを実施した。分析カラム(75 μm × 20 cm, packed in-house with ReproSil-Pur C18-AQ, 1.9 μm resin, Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany)にて５％～３０％の溶媒Ｂのグラジエント（溶媒Ａ、０．１％ギ酸（ＦＡ）；溶媒Ｂ、０．１％ＦＡおよび９９．９％アセトニトリル）を４５分用いて、２８０ｎＬ／分の流速でペプチドを分離した。Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometerの操作は、５ＧＰＦ（gas-phase fractionation）－ＤＩＡモード（フラグメント分解度は５０，０００、プリカーサー分解度は１２０，０００、ＭＳ１およびＭＳ２のＡＧＣターゲットは１ｅ６および２ｅ５、ＭＳ１およびＭＳ２の最大ＩＩＴは２５０ｍｓおよび８６ｍｓ、ＮＣＥは３０、プリカーサー分離ウインドウは２ｍ／ｚ）で行い、４１８～４９４ｍ／ｚ、４９０～５６６ｍ／ｚ、５６２～６３８ｍ／ｚ、６３４～７１０ｍ／ｚおよび７０６～７８２ｍ／ｚ（５ｘＧＰＦ）をカバーした。個々のサンプルの解析は、ＤＩＡモード（フラグメント分解度は３０，０００、プリカーサー分解度は１２０，０００、ＭＳ１およびＭＳ２のＡＧＣターゲットは４ｅ５および２ｅ５、ＭＳ１およびＭＳ２の最大ＩＩＴは１００ｍｓおよび５４ｍｓ、ＮＣＥは３０、プリカーサー分離ウインドウは８ｍ／ｚ）で実施した。ＤＩＡデータの解析は、ＤＩＡ－ＮＮ（バージョン１．７．１２）により、デフォルトの設定（スキャンウインドウ設定、自動質量精度許容差）を用いて行った。サーチ結果を修正し、次いで１％プリカーサーレベルにフィルタリングした。ＭＳファイルはユニプロットヒューマンデータベースを用いて調べた。
血清ＥＶのプロテオミクス解析をFutami Y, et al. Int Immunol. 2022;34(6):327-340に従って実施した。要約すると、エクソソーム溶出物に１２０ｍＭのデオキシコール酸ナトリウムと、５００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を含む１０×相間移動溶解剤（ＰＴＳ）バッファと、１２０ｍＭのＮ－ラウロイルサルコシン酸ナトリウムとを加えた後、９５℃で煮沸した。サンプルに１０ｍＭのトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を加えた後、３７℃で３０分間保持し、次いで２０ｍＭのヨードアセトアミドを加えて、遮光して３７℃で３０分アルキル化を行った。次いで１μｇのトリプシン(Wako-Chemical, Tokyo, Japan)および２ｍＡＵのＬｙｓＣ(Wako-Chemical, Tokyo, Japan)により３７℃で一晩消化した。消化した溶液に１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加え、洗浄剤を２０，０００×ｇで１０分間の遠心分離により沈殿させた。断片化されたペプチドを含む上清にC18-SCX StageTipを加えることにより脱塩し、さらに遠心エバポレーターにより乾燥させた。HTC-PAL autosampler (CTC Analytics, Zwingen, Switzerland)およびUltiMate 3000 Nano LC system (Thermo Scientific, Bremen, Germany)をOrbitrap Fusion Lumos mass spectrometer (Thermo Scientific)に接続することにより、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを実施した。分析カラム(75 μm × 20 cm, packed in-house with ReproSil-Pur C18-AQ, 1.9 μm resin, Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany)にて５％～３０％の溶媒Ｂのグラジエント（溶媒Ａ、０．１％ギ酸（ＦＡ）；溶媒Ｂ、０．１％ＦＡおよび９９．９％アセトニトリル）を４５分用いて、２８０ｎＬ／分の流速でペプチドを分離した。Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometerの操作は、５ＧＰＦ（gas-phase fractionation）－ＤＩＡモード（フラグメント分解度は５０，０００、プリカーサー分解度は１２０，０００、ＭＳ１およびＭＳ２のＡＧＣターゲットは１ｅ６および２ｅ５、ＭＳ１およびＭＳ２の最大ＩＩＴは２５０ｍｓおよび８６ｍｓ、ＮＣＥは３０、プリカーサー分離ウインドウは２ｍ／ｚ）で行い、４１８～４９４ｍ／ｚ、４９０～５６６ｍ／ｚ、５６２～６３８ｍ／ｚ、６３４～７１０ｍ／ｚおよび７０６～７８２ｍ／ｚ（５ｘＧＰＦ）をカバーした。個々のサンプルの解析は、ＤＩＡモード（フラグメント分解度は３０，０００、プリカーサー分解度は１２０，０００、ＭＳ１およびＭＳ２のＡＧＣターゲットは４ｅ５および２ｅ５、ＭＳ１およびＭＳ２の最大ＩＩＴは１００ｍｓおよび５４ｍｓ、ＮＣＥは３０、プリカーサー分離ウインドウは８ｍ／ｚ）で実施した。ＤＩＡデータの解析は、ＤＩＡ－ＮＮ（バージョン１．７．１２）により、デフォルトの設定（スキャンウインドウ設定、自動質量精度許容差）を用いて行った。サーチ結果を修正し、次いで１％プリカーサーレベルにフィルタリングした。ＭＳファイルはユニプロットヒューマンデータベースを用いて調べた。
【0035】
〔プロテオームのバイオインフォマティクス解析〕
プロテオームにおける生物学的に関連するパスウェイおよび分子ネットワークを解析するために以下のツールを用いた。エンリッチメント解析にはCytoscape (ver 3.8.0)のClue GO/Clue Pedia plugin (ver 2.5.7)、上流解析およびエンリッチメント解析にはIngenuity Pathways Analysis (IPA, Qiagen. Inc. Redwood City, CA, USA)を用いた。
プロテオームにおける生物学的に関連するパスウェイおよび分子ネットワークを解析するために以下のツールを用いた。エンリッチメント解析にはCytoscape (ver 3.8.0)のClue GO/Clue Pedia plugin (ver 2.5.7)、上流解析およびエンリッチメント解析にはIngenuity Pathways Analysis (IPA, Qiagen. Inc. Redwood City, CA, USA)を用いた。
【0036】
〔プロテオームおよびトランスクリプトームの分子ネットワーク解析〕
ＥＶプロテオミクス、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ、肺のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑの分子ネットワーク解析には、KeyMolnet (viewer program version 6.2, contents version 9.7.20210930154837, KM Data Inc, [https://www.km-data.jp])を用いた。
ＥＶプロテオミクス、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ、肺のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑの分子ネットワーク解析には、KeyMolnet (viewer program version 6.2, contents version 9.7.20210930154837, KM Data Inc, [https://www.km-data.jp])を用いた。
【0037】
〔統計解析〕
統計解析は、JMP Pro 13 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)を用いて行った。両側検定でｐ値＜０．０５である場合に統計学的に有意であるとした。カテゴリカル変数はフィッシャーの正確検定、連続変数は対応のないスチューデントのｔ検定に供した。プロテオミクスの主成分分析および線形回帰分析はＲによって行った。
統計解析は、JMP Pro 13 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)を用いて行った。両側検定でｐ値＜０．０５である場合に統計学的に有意であるとした。カテゴリカル変数はフィッシャーの正確検定、連続変数は対応のないスチューデントのｔ検定に供した。プロテオミクスの主成分分析および線形回帰分析はＲによって行った。
【0038】
〔細胞培養および刺激〕
ＴＨＰ－１細胞をＲＰＭＩ培地で培養し、５ｎｇ／ｍＬのホルボールミリスタートアセタート／イオノマイシン（ＰＭＡ）で４８時間刺激した。次いで細胞を、ＬＰＳ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、Ｒ８４８またはインターフェロンγ（ＩＦＮγ）で処理した。４８時間後、細胞溶解液を採取した。
ＴＨＰ－１細胞をＲＰＭＩ培地で培養し、５ｎｇ／ｍＬのホルボールミリスタートアセタート／イオノマイシン（ＰＭＡ）で４８時間刺激した。次いで細胞を、ＬＰＳ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、Ｒ８４８またはインターフェロンγ（ＩＦＮγ）で処理した。４８時間後、細胞溶解液を採取した。
【0039】
〔透過型電子顕微鏡観察〕
血清サンプル由来のＥＶを、ホルムバールおよび炭素で被覆したニッケルの網上に吸着させ、次いで２％パラホルムアルデヒドで固定した。これらのサンプルを抗ＣＤ９（MM2/57; Thermo Fisher Scientific）とともにインキュベートした。
血清サンプル由来のＥＶを、ホルムバールおよび炭素で被覆したニッケルの網上に吸着させ、次いで２％パラホルムアルデヒドで固定した。これらのサンプルを抗ＣＤ９（MM2/57; Thermo Fisher Scientific）とともにインキュベートした。
【0040】
〔ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのための被験体およびＰＢＭＣの標本採取〕
末梢血サンプルは、大阪大学医学部附属病院および大阪大学大学院医学系研究科にてＣＯＶＩＤ－１９患者群（ｎ＝１０）および健常群（ｎ＝５）から採取した。ＣＯＶＩＤ－１９患者群および健常群の両方において血液はヘパリンチューブに採取し、ＰＢＭＣは、Leucosep (Greiner Bio-One)密度勾配遠心分離法を用いて製造業者の指示に従い単離した。血液は、全てのサンプルにおいて採取から３時間以内に処理し、使用するまで－８０℃で保存した。
末梢血サンプルは、大阪大学医学部附属病院および大阪大学大学院医学系研究科にてＣＯＶＩＤ－１９患者群（ｎ＝１０）および健常群（ｎ＝５）から採取した。ＣＯＶＩＤ－１９患者群および健常群の両方において血液はヘパリンチューブに採取し、ＰＢＭＣは、Leucosep (Greiner Bio-One)密度勾配遠心分離法を用いて製造業者の指示に従い単離した。血液は、全てのサンプルにおいて採取から３時間以内に処理し、使用するまで－８０℃で保存した。
【0041】
〔ドロップレットに基づくシングルセルシークエンシング〕
Chromium Single Cell V(D)J Reagent Kits (v1.1 Chemistry) User Guideに概説されたプロトコルに従い、シングルセル懸濁液を10x Genomics Chromium Controller (10x Genomics, USA)によって処理した。Chromium Next GEM Single Cell 5’ Library & Gel Bead Kit v1.1 (Cat# PN-1000167), Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit (Cat# PN-1000127)およびSingle Index Kit T Set A (Cat# PN-1000213)を処理に用いた。製造業者の推奨に従い、１つのサンプルあたり約１６５００個の生きた細胞を、10x Genomics Chromium Controllerの各ポートにサンプルを混合することなく別々に充填し、ライブラリーの調製およびシークエンシングのために１００００個のシングルセルゲルビーズエマルジョンを生成した。続いてこのエマルジョン、すなわちシングルセルおよびバーコードビーズを含む油滴（ＧＥＭ）を、Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific)中で逆転写し、セルバーコードおよびユニークな分子インデックス（ＵＭＩ）によってタグ付けされたｃＤＮＡを得た。
Chromium Single Cell V(D)J Reagent Kits (v1.1 Chemistry) User Guideに概説されたプロトコルに従い、シングルセル懸濁液を10x Genomics Chromium Controller (10x Genomics, USA)によって処理した。Chromium Next GEM Single Cell 5’ Library & Gel Bead Kit v1.1 (Cat# PN-1000167), Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit (Cat# PN-1000127)およびSingle Index Kit T Set A (Cat# PN-1000213)を処理に用いた。製造業者の推奨に従い、１つのサンプルあたり約１６５００個の生きた細胞を、10x Genomics Chromium Controllerの各ポートにサンプルを混合することなく別々に充填し、ライブラリーの調製およびシークエンシングのために１００００個のシングルセルゲルビーズエマルジョンを生成した。続いてこのエマルジョン、すなわちシングルセルおよびバーコードビーズを含む油滴（ＧＥＭ）を、Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific)中で逆転写し、セルバーコードおよびユニークな分子インデックス（ＵＭＩ）によってタグ付けされたｃＤＮＡを得た。
【0042】
次に、製造業者のプロトコルに従ってｃＤＮＡを増幅し、シングルセルライブラリーを生成した。定量化は、Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA assay (Agilent, High-Sensitivity DNA Kit, Cat# 5067-4626)によって行った。続いて、増幅したｃＤＮＡを、酵素により断片化し、末端を修復し、ポリＡ鎖を付加した。増幅したｃＤＮＡのクリーンアップおよびサイズ選択は、SPRIselect magnetic beads (Beckman-Coulter, SPRIselect, Cat# B23317)を用いて行った。サイズ選択された断片にIllumina sequencing adaptersを連結し、SPRIselect magnetic beadsを用いてクリーンアップした。最後に、サンプルインデックスを選択および増幅し、SPRIselect magnetic beadsを用いて小分子側および高分子側の両側からサイズ選択を行った。最終的なライブラリーの質は、Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA assayを用いて評価した。次いで、サンプルをNovaSeq6000 (Illumina, USA)でペアエンドモードにて配列決定し、遺伝子発現のために１細胞あたり最低２００００個のペアエンドリードを得た。
【0043】
〔ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータのアラインメント、定量化および質の制御〕
Cell Ranger 5.0.0 (10x Genomics, USA)を用いてドロップレットライブラリーを処理した。シークエンスリードは、GRCh38ヒトリファレンスゲノムを用いてＳＴＡＲによって並べた（Dobin, A. et al. Bioinformatics. 2013;29:15-21）。カウントマトリックスは、dropESTを用いて得られたＢＡＭファイルから作成した（Petukhov, V. et al. Genome Biol. 2018;19:78）。１０００個未満のＵＭＩまたは２００００超のＵＭＩを有する細胞、並びにミトコンドリア遺伝子またはヘモグロビン遺伝子由来のリードの１０％超を含む細胞は、質が低いと考えられたため、さらなる解析からは除いた。さらに、Scrublet (v0.2.1)を用いて、各サンプルについて推定される重複を除去した（Wolock, S. L. et al. Cell Syst. 2019;8:281-91.e9）。
Cell Ranger 5.0.0 (10x Genomics, USA)を用いてドロップレットライブラリーを処理した。シークエンスリードは、GRCh38ヒトリファレンスゲノムを用いてＳＴＡＲによって並べた（Dobin, A. et al. Bioinformatics. 2013;29:15-21）。カウントマトリックスは、dropESTを用いて得られたＢＡＭファイルから作成した（Petukhov, V. et al. Genome Biol. 2018;19:78）。１０００個未満のＵＭＩまたは２００００超のＵＭＩを有する細胞、並びにミトコンドリア遺伝子またはヘモグロビン遺伝子由来のリードの１０％超を含む細胞は、質が低いと考えられたため、さらなる解析からは除いた。さらに、Scrublet (v0.2.1)を用いて、各サンプルについて推定される重複を除去した（Wolock, S. L. et al. Cell Syst. 2019;8:281-91.e9）。
【0044】
〔ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの計算パイプラインおよび解析〕
データのスケーリング、変形、クラスタリング、次元削減、差次的発現解析および可視化には、ＲのパッケージSeurat(v3.2.2)を用いた（Stuart, T. et al. Cell. 2019;177:1888-1902.e21）。SCTransform()関数を用いてデータをスケーリングおよび変形し、細胞の質（ミトコンドリア由来のリードの割合）に起因する不要なばらつきを除去するために線形回帰を行った。統合のため、SelectIntegrationFeatures()関数を用いて３０００個の共有された変動性の高い遺伝子（ＨＶＧ）を同定した。次いで、これらの遺伝子からFindIntegrationAnchors()関数を用いて個々のデータセットの間の「アンカー」を同定し、これらのアンカーをIntegrateData()関数に入力してバッチ効果を補正した全ての細胞の発現マトリックスを生成した。主成分分析（ＰＣＡ）およびＵＭＡＰ（uniform manifold approximation and projection）については、３０個の主成分による次元削減を行った（McInnes, L. et al. arXiv. 2018.）。ＰＣＡ削減の３０の次元を用いた最近傍のグラフを、FindNeighbors()関数を用いて計算し、次いでFindClusters()関数を用いてクラスタリングを行った。
データのスケーリング、変形、クラスタリング、次元削減、差次的発現解析および可視化には、ＲのパッケージSeurat(v3.2.2)を用いた（Stuart, T. et al. Cell. 2019;177:1888-1902.e21）。SCTransform()関数を用いてデータをスケーリングおよび変形し、細胞の質（ミトコンドリア由来のリードの割合）に起因する不要なばらつきを除去するために線形回帰を行った。統合のため、SelectIntegrationFeatures()関数を用いて３０００個の共有された変動性の高い遺伝子（ＨＶＧ）を同定した。次いで、これらの遺伝子からFindIntegrationAnchors()関数を用いて個々のデータセットの間の「アンカー」を同定し、これらのアンカーをIntegrateData()関数に入力してバッチ効果を補正した全ての細胞の発現マトリックスを生成した。主成分分析（ＰＣＡ）およびＵＭＡＰ（uniform manifold approximation and projection）については、３０個の主成分による次元削減を行った（McInnes, L. et al. arXiv. 2018.）。ＰＣＡ削減の３０の次元を用いた最近傍のグラフを、FindNeighbors()関数を用いて計算し、次いでFindClusters()関数を用いてクラスタリングを行った。
【0045】
細胞の同一性は、FindMarkers()関数およびパラメータ「test.use=wilcox」を用いて各クラスターに対する差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を見出し、これらのマーカーを既知の細胞タイプ特異的遺伝子と比較することにより、決定した。これにより９つの細胞クラスターを得た。ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の免疫細胞タイプ特異的発現を明らかにするため、ＲのパッケージNebulosa (v1.0.0)からplot_density()関数を用いて密度プロットを生成し（Alquicira-Hernandez, J. & Powell, J. E. Bioinformatics. 2021:1-3. doi:10.1093/bioinformatics/btab003）、DotPlot()関数を用いてドットプロットを生成した。FindMarkers()関数およびパラメータ「test.use=wilcox」を用いて、各細胞タイプにおいてグループ３とグループ２、グループ２および３とグループ１、グループ２および３と健常群、ＣＯＶＩＤ－１９患者群全体と健常群の４組の比較からＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の差次的発現解析を行った。
【0046】
単球として標識されたドロップレットを抽出し、再統合して、上述した手順を用いて更なるサブクラスタリングを行った。統合後、上記のようにクラスタリング、クラスターアノテーションおよび差次的発現解析を行った。
【0047】
〔ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑデータセットの解析〕
ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺組織のシングルセルトランスクリプトームデータを解析するために、公開されたデータセット（Melms JC, et al., Nature. 2021;595(7865):114-119）を用いた。Melms JCらは、迅速な剖検を受けた１９人のＣＯＶＩＤ－１９肺炎患者およびＣＯＶＩＤ－１９の流行前に肺切除または剖検を受けた７人の対照の肺から１１６，３１４個の核のシングル核ＲＮＡシークエンシング（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）を行った。ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現レベルはＣＯＶＩＤ－１９患者群の肺と対照群の肺とで別々に調べた。ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現レベルの有意差は、ウィルコクソンの順位和検定により評価した。ｓｎＲＮＡデータの解析にはＲのパッケージSeurat(v4.1.1)を用いた。
ＣＯＶＩＤ－１９患者の肺組織のシングルセルトランスクリプトームデータを解析するために、公開されたデータセット（Melms JC, et al., Nature. 2021;595(7865):114-119）を用いた。Melms JCらは、迅速な剖検を受けた１９人のＣＯＶＩＤ－１９肺炎患者およびＣＯＶＩＤ－１９の流行前に肺切除または剖検を受けた７人の対照の肺から１１６，３１４個の核のシングル核ＲＮＡシークエンシング（ｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ）を行った。ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現レベルはＣＯＶＩＤ－１９患者群の肺と対照群の肺とで別々に調べた。ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現レベルの有意差は、ウィルコクソンの順位和検定により評価した。ｓｎＲＮＡデータの解析にはＲのパッケージSeurat(v4.1.1)を用いた。
【0048】
〔ウェスタンブロット〕
cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche)を含むRIPA Lysis and Extraction Buffer (no. 89900; Thermo Fisher Scientific)を用いて、培養した細胞を溶解し、次いで遠心分離して細胞／組織の破片を沈殿させた。溶解液は標準ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、イムノブロット法により解析した。以下のタンパク質に対する抗体を用いた；ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１（no. 8551; Cell Signaling Technology）、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１．１（no.12455; Cell Signaling Technology）、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１．２（no. 4827; Cell Signaling Technology）、ｐ－ｐ６５（no. 3033; Cell Signaling Technology）、β－アクチン（no. 2128; Cell Signaling Technology）、ｉＮＯＳ（no. 39898; Cell Signaling Technology）、ＣＤ９（no. AHS0902; Thermo Fisher Scientific）、ＣＤ６３（no. MEX002-3; MBL）、カルネキシン（no. ab22595; Abcam）、ハプトグロビン（no. ab131236; Abcam）、フロチリン（no. 610821; BD Biosciences）。
cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche)を含むRIPA Lysis and Extraction Buffer (no. 89900; Thermo Fisher Scientific)を用いて、培養した細胞を溶解し、次いで遠心分離して細胞／組織の破片を沈殿させた。溶解液は標準ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、イムノブロット法により解析した。以下のタンパク質に対する抗体を用いた；ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１（no. 8551; Cell Signaling Technology）、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１．１（no.12455; Cell Signaling Technology）、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１．２（no. 4827; Cell Signaling Technology）、ｐ－ｐ６５（no. 3033; Cell Signaling Technology）、β－アクチン（no. 2128; Cell Signaling Technology）、ｉＮＯＳ（no. 39898; Cell Signaling Technology）、ＣＤ９（no. AHS0902; Thermo Fisher Scientific）、ＣＤ６３（no. MEX002-3; MBL）、カルネキシン（no. ab22595; Abcam）、ハプトグロビン（no. ab131236; Abcam）、フロチリン（no. 610821; BD Biosciences）。
【0049】
〔免疫組織化学分析〕
大阪大学医学部附属病院の３つのＣＯＶＩＤ－１９剖検例に由来するパラフィンで固定した肺組織サンプルおよび非ＣＯＶＩＤ－１９対照に由来する３つの外科標本を用いて、免疫染色を行った。これらのサンプルの免疫組織化学染色および病理学者の所見のレビューは、アプライドメディカルリサーチ社（日本、大阪）により行われた。抗原の回収は、サンプルの脱パラフィン後、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９）中で１２５℃、１５分間オートクレーブすることにより行った。内在性ペルオキシダーゼ活性は、３％ウシ血清アルブミンを用いて室温で１時間ブロックした。サンプルのスライドは、抗Ｈ２ＡＦＹ抗体（no. abx103005; Abexa）とともに４℃で一晩インキュベートした。次いでそれらを、ホースラディッシュペルオキシダーゼと複合体化した抗ウサギ二次抗体（02-6102; Invitrogen）を用いて室温で３０分間インキュベートした。
大阪大学医学部附属病院の３つのＣＯＶＩＤ－１９剖検例に由来するパラフィンで固定した肺組織サンプルおよび非ＣＯＶＩＤ－１９対照に由来する３つの外科標本を用いて、免疫染色を行った。これらのサンプルの免疫組織化学染色および病理学者の所見のレビューは、アプライドメディカルリサーチ社（日本、大阪）により行われた。抗原の回収は、サンプルの脱パラフィン後、ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ９）中で１２５℃、１５分間オートクレーブすることにより行った。内在性ペルオキシダーゼ活性は、３％ウシ血清アルブミンを用いて室温で１時間ブロックした。サンプルのスライドは、抗Ｈ２ＡＦＹ抗体（no. abx103005; Abexa）とともに４℃で一晩インキュベートした。次いでそれらを、ホースラディッシュペルオキシダーゼと複合体化した抗ウサギ二次抗体（02-6102; Invitrogen）を用いて室温で３０分間インキュベートした。
【0050】
〔組織学的解析〕
上述の抗Ｈ２ＡＦＹ抗体で染色した免疫組織化学サンプルを用いて、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１陽性細胞の割合を評価した。画像は、BZ-X Analyzer software (キーエンス社、大阪、日本)を用いて製造業者の指示に従い処理および再構築した。１つのサンプルあたり３つのランダムに選択した視野において、１つの視野内の細胞の総数に対するＤＡＢ陽性細胞の数の比率を算出し、３つの視野の平均値をそのサンプルのＭＡＣＲＯＨ２Ａ１陽性細胞の割合として用いた。全ての定量的測定は、同じ光学的条件下の同等の領域において行った。
上述の抗Ｈ２ＡＦＹ抗体で染色した免疫組織化学サンプルを用いて、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１陽性細胞の割合を評価した。画像は、BZ-X Analyzer software (キーエンス社、大阪、日本)を用いて製造業者の指示に従い処理および再構築した。１つのサンプルあたり３つのランダムに選択した視野において、１つの視野内の細胞の総数に対するＤＡＢ陽性細胞の数の比率を算出し、３つの視野の平均値をそのサンプルのＭＡＣＲＯＨ２Ａ１陽性細胞の割合として用いた。全ての定量的測定は、同じ光学的条件下の同等の領域において行った。
【0051】
〔ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）〕
ＥＶの数およびサイズ分布の解析は、Yoshioka Y et al., Nat Commun 2014: 5: 3591に従い、ブルーレーザーシステムを備えたNanoSight LM10HS（NanoSight, Amesbury, UK）を用いて行った。要約すると、単離されたＥＶを、ＰＢＳを用いて２０倍に希釈した上でナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を行った。ＮＴＡソフトウェアを用いたさらなる解析のために、全てのイベントは６０秒の動画に記録した。各粒子のブラウン運動をフレーム間で追跡し、Stokes-Einsteinの式を用いてサイズを算出した。
ＥＶの数およびサイズ分布の解析は、Yoshioka Y et al., Nat Commun 2014: 5: 3591に従い、ブルーレーザーシステムを備えたNanoSight LM10HS（NanoSight, Amesbury, UK）を用いて行った。要約すると、単離されたＥＶを、ＰＢＳを用いて２０倍に希釈した上でナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を行った。ＮＴＡソフトウェアを用いたさらなる解析のために、全てのイベントは６０秒の動画に記録した。各粒子のブラウン運動をフレーム間で追跡し、Stokes-Einsteinの式を用いてサイズを算出した。
【0052】
〔結果〕
このレトロスペクティブな研究では、１２人のＣＯＶＩＤ－１９患者および４人の健常者を含むプロテオミクス解析を行った。１２人のＣＯＶＩＤ－１９患者のうち、非重症例が４人、重症かつ難治例が４人、重症かつ非難治例が４人であった。ここで、非重症例をグループ１、重症かつ非難治例をグループ２、重症かつ難治例をグループ３に分類した。患者のベースライン特性を評価したところ、ＣＯＶＩＤ－１９患者群間、またはＣＯＶＩＤ－１９患者群と健常群との間で年齢、性別、合併症の頻度に有意な差はなかった。サンプル採取の時点でのステロイド投与の期間は、グループ１と、グループ２および３との間でのみ有意な差が見られた（図示せず）。
このレトロスペクティブな研究では、１２人のＣＯＶＩＤ－１９患者および４人の健常者を含むプロテオミクス解析を行った。１２人のＣＯＶＩＤ－１９患者のうち、非重症例が４人、重症かつ難治例が４人、重症かつ非難治例が４人であった。ここで、非重症例をグループ１、重症かつ非難治例をグループ２、重症かつ難治例をグループ３に分類した。患者のベースライン特性を評価したところ、ＣＯＶＩＤ－１９患者群間、またはＣＯＶＩＤ－１９患者群と健常群との間で年齢、性別、合併症の頻度に有意な差はなかった。サンプル採取の時点でのステロイド投与の期間は、グループ１と、グループ２および３との間でのみ有意な差が見られた（図示せず）。
【0053】
健常者およびＣＯＶＩＤ－１９患者の両方の血清から採取したＥＶを、透過型電子顕微鏡で観察したところ、形態に大きな差はなかった。また、健常者およびＣＯＶＩＤ－１９患者の血清ＥＶ、健常者の血清およびＡ５４９細胞溶解液のイムノブロット解析の結果、ＣＤ９、ＣＤ６３およびフロチリン－１の発現が確認されたが、カルネキシンおよびハプトグロビンの発現は陰性であった。さらに、採取したＥＶを、NanoSightナノ粒子トラッキング解析により測定したところ、健常群とＣＯＶＩＤ－１９患者群との間で粒子のサイズにも数にも有意な差は見られなかった。これらのデータの図示は省略する。
【0054】
ＤＩＡによるノンターゲットプロテオミクスでは、全部で３０４６種のタンパク質が検出され、このうち２３７６種のタンパク質が２種以上のペプチド断片とともに同定された。これらのタンパク質から、バイオマーカー分子の候補を以下のように絞った。まず、（ａ）グループ２（非難治例）とグループ３（難治例）との比較、（ｂ）グループ２および３（重症例）とグループ１（非重症例）との比較を行った。次に、（ａ）および（ｂ）においてｐ＜０．０５、かつ倍率変化が０．５未満または２を超えるタンパク質をスクリーニングした。さらに、年齢および性別で調整した線形回帰解析において疾患重症度の順に優位に増加または減少しているタンパク質をスクリーニングした。
【0055】
図１は、グループ２とグループ３とを比較する上記の２３７６種の血清ＥＶタンパク質のボルケーノプロット、および、グループ２とグループ３とを区別する１２種のバイオマーカー候補タンパク質の主成分分析結果を示す図である。図１のボルケーノプロットより、重症例の間（グループ２とグループ３との間）の比較では、１２種のタンパク質が、０．５未満または２を超える変化倍率で有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされていた。表１はこの１２種のタンパク質を示す。これらのうち、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質（Core histone macro-H2A.1）はｐ値が最も低かった。
【0056】
【表1】
【0057】
これらのタンパク質のうち６種は、グループ２に比べてグループ３で増加しており、残りの６種は減少していた。図１の主成分分析の散布図は、１２種のタンパク質の最初の２つの主成分に基づくグループ２およびグループ３の分類を示している。主成分分析の「explained var.」は寄与率を意味している。図１の主成分分析では、これらの同定されたタンパク質は、グループ２および３の両方においてよく分離していた。
【0058】
さらに、上流調節因子を探すためIngenuity Pathway Analysis（ＩＰＡ）を用い、エンリッチメント解析を行い、調節不全のパスウェイの特定を増加させるため、変化倍率の基準を緩めた。表２は、グループ２とグループ３との比較において１．５を超える変化倍率で有意にアップレギュレーションされていたか０．６７未満の変化倍率で有意にダウンレギュレーションされていたＥＶタンパク質を示す。
【0059】
【表2】
【0060】
図２は、グループ２とグループ３との比較において１．５を超える変化倍率で有意にアップレギュレーションされていたか０．６７未満の変化倍率で有意にダウンレギュレーションされていたＥＶタンパク質についてIngenuity Pathway Analysisにより決定された上位１０個のカノニカルパスウェイ、ならびに上位１０個の疾患および機能を示す図である。表２の２９種のタンパク質のＩＰＡにより、カノニカルパスウェイの解析では「Ｔｈ１経路」が多いこと、疾患および機能の解析では「細胞間のシグナリングおよび相互作用」、「細胞運動」、「血液学系の発達および機能」および「免疫細胞交通」が多いことが明らかになり、重症ＣＯＶＩＤ－１９の発症機序と一致していた。図２で示される疾患および機能の主要なカテゴリーにおける１位の「細胞間のシグナリングおよび相互作用」において多い機能的パスウェイをアノテーションしたところ、「マクロファージの動員」および「マクロファージの接着」といったマクロファージの機能に関するものが含まれていた（図示せず）。
【0061】
図３は、グループ２および３とグループ１とを比較する上記の２３７６種の血清ＥＶタンパク質のボルケーノプロット、および、グループ２および３とグループ１とを区別する１７４種のバイオマーカー候補タンパク質の主成分分析結果を示す図である。図３のボルケーノプロットより、重症例と非重症例との間の比較（グループ２および３と、グループ１との間の比較）では、１７４種のタンパク質が、０．５未満または２を超える変化倍率で有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされていた。表３はこの１７４種のタンパク質を示す。これらのうち、ＣＬＴＡタンパク質（Clathrin light chain A）およびＣＮＤＰ２タンパク質（Cytosolic non-specific dipeptidase）はボンフェローニ補正を行った場合でも有意であった（ｐ＝２．１×１０－５）。
【0062】
【表3】
【0063】
これらのタンパク質のうち１１６種は、グループ１に比べてグループ２および３で増加しており、残りの５８種は減少していた。図３の主成分分析の散布図は、１７４種のタンパク質の最初の２つの主成分に基づくグループ２およびグループ３、ならびにグループ１の分類を示している。図３の主成分分析では、これらの同定されたタンパク質は、グループ１と、グループ２および３との両方においてもよく分離していた。
【0064】
図４は、グループ２および３とグループ１との比較において２を超える変化倍率で有意にアップレギュレーションされていたか０．５未満の変化倍率で有意にダウンレギュレーションされていたＥＶタンパク質についてIngenuity Pathway Analysisにより決定された上位１０個のカノニカルパスウェイ、ならびに上位１０個の疾患および機能を示す図である。ＩＰＡにより、カノニカルパスウェイの解析では「補体系」および「急性期反応シグナリング」が多いこと、疾患および機能の解析では「感染症」および「生体の損傷および異常」が多いことが明らかになった。図４で示される疾患および機能の主要なカテゴリーにおける１位の「感染症」において多い機能的パスウェイをアノテーションしたところ、「重症ＣＯＶＩＤ－１９」が最も高いランクであった（図示せず）。
【0065】
これらのプロテオミクス解析の結果から、グループ２とグループ３との間の比較、ならびにグループ２および３とグループ１との間の比較の両方において０．５未満または２を超える変化倍率で有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされていた２種のタンパク質（ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質およびＳＰＰ２タンパク質）を見出した（表４）。表５は、表１に挙げられたタンパク質のうち、年齢および性別で調整した線形回帰解析において疾患重症度の順に優位に増加または減少していたタンパク質を示す（ＦＤＲ(False Discovery Rate)＜０．０５）。表６は、表２に挙げられたタンパク質のうち、年齢および性別で調整した線形回帰解析において疾患重症度の順に優位に増加または減少していたタンパク質を示す（ＦＤＲ＜０．０５）。表４～６に共通して疾患重症度の順に優位に増加または減少（ＦＤＲ＜０．０５）していた唯一のタンパク質として、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を同定した。表４～６においてβは回帰係数を表す。
【0066】
【表4】
【0067】
【表5】
【0068】
【表6】
【0069】
図５は、プロテオミクスで検出されたＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質を含むタンパク質の原因調節分子および代表的な因果関係ネットワークを示す図である。表２に挙げられたタンパク質に関するＩＰＡを用いた因果関係ネットワーク解析により、アシルＣｏＡシンテターゼ１（ＡＣＳＬ１）とＭＡＣＲＯＨ２Ａ１との間の調節関係が特定された。ＡＣＳＬ１は、図４にて多かったカテゴリー「感染症」および「生体の損傷および異常」のアノテーションに含まれていた分子である（図示せず）。さらに、表３に挙げられたタンパク質に関するＩＰＡを用いた因果関係ネットワーク解析により、リジンデメチラーゼ２Ｂ（ＫＤＭ２Ｂ）を介したＣＯＶＩＤ－１９とＭＡＣＲＯＨ２Ａ１との間の調節関係が示された。
【0070】
これらの結果から、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質は、健常群、非重症例、重症例の順に増加する分子であって、難治例および非難治例、重症例および非重症例を区別できる分子であることが明らかになった。すなわちＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質は、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化のリスクを評価するために最も有望なバイオマーカーである。
【0071】
図６は、健常群およびＣＯＶＩＤ－１９患者群のノンターゲットプロテオミクス解析により決定されたＭＡＣＲＯＨ２Ａ１のレベルを表す図である。図６のデータはボックスプロットで示され、「＊＊」はｐ＜０．００１で有意差があることを表す。図６の通り、プロテオミクスにおけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１の定量的なタンパク質の値は、他のグループに比べてグループ３で高かった。このことは、血清ＥＶのイムノブロットでも観察された。図７は、健常群および重症ＣＯＶＩＤ－１９患者群（グループ２および３）の血清ＥＶのイムノブロット結果を示す図である。図７のデータは２つの独立した実験を表す。
【0072】
図８は、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１によるＣＯＶＩＤ－１９重症度グループの診断に対するＲＯＣ解析結果を示す図である。ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１のＡＵＣ値（９５％ＣＩ（信頼区間））を、ＣＲＰおよびＤ－ダイマーと比較したＲＯＣ解析により評価した。図８では、グループ３とグループ２との間の比較におけるＡＵＣは０．６３（０．１７～０．９３）であり、この値は血清ＣＲＰおよびＤ－ダイマーの値を超えていた。一方、グループ２および３とグループ１との間の比較におけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１のＡＵＣは０．８４（０．４７～０．９７）であり、この値は血清ＣＲＰの値より低いが、Ｄ－ダイマーの値よりは高かった。
【0073】
さらに、ＣＯＶＩＤ－１９患者および対照において剖検した肺組織切片の免疫組織化学染色を行い、肺におけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１のレベルを調べた。図９は、ＣＯＶＩＤ－１９患者および対照の肺組織切片の組織学的解析結果、ならびにＭＡＣＲＯＨ２Ａ１陽性細胞の割合を示す図である。図９では、ヘマトキシリン－エオシン染色（ＨＥ染色）結果と、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１陽性細胞の免疫組織化学染色結果とを示している。さらに図９ではBZ-X Analyzer softwareを用いて決定した上記ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１陽性細胞の割合をボックスプロットで示している。図９は、３人のＣＯＶＩＤ－１９患者および３人の対照から得られた結果を代表している。「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを表す。図９より、繊維症の病巣に残された肺胞マクロファージおよび２型肺胞上皮細胞の核においてＭＡＣＲＯＨ２Ａ１タンパク質の発現の増加が観察された。それゆえ、プロテオミクス解析によって同定されたＭＡＣＲＯＨ２Ａ１は、重症例において、血清ＥＶだけではなく肺でも局所的に増加しており、ＣＯＶＩＤ－１９難治例の発症機序に密接に関連したバイオマーカー候補であることが示唆された。
【0074】
次に、このＭＡＣＲＯＨ２Ａ１の重症ＣＯＶＩＤ－１９の発症機序における関与を調べるために、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを行い、免疫細胞におけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１の発現を調べた。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは、１０人のＣＯＶＩＤ－１９患者および５人の健常者の末梢血サンプルを用いて行った。ＣＯＶＩＤ－１９患者のサンプルは、プロテオミクス解析と同じ重症度のグループに従い、３人の非重症患者および７人の重症患者（４人の非難治例および３人の難治例）から採取した。患者のベースライン特性を評価したところ、性別、標本採取時のステロイド投与の期間および合併症の頻度においてグループ間で有意な差はなかったが、健常群は、ＣＯＶＩＤ－１９患者群より若い傾向にあった（図示せず）。
【0075】
一体化したシングルセル解析パイプラインの後、全てのサンプルのＰＢＭＣから９１８３０個の高品質の細胞を得た。既知のマーカー遺伝子のＲＮＡ発現に基づき、９種の細胞サブセットをアノテーションした。図１０は、細胞集団ごとに、またはＭＡＣＲＯＨ２Ａ１のｍＲＮＡ転写レベルによって着色した、ＣＯＶＩＤ－１９患者群および健常群のＰＢＭＣのＵＭＡＰ可視化結果を示す図である。図１０に示す通り、９つの細胞タイプへの分離が示された。図１０において「ＨＳＰＣ」は造血幹前駆細胞を意味する。
【0076】
図１１は、各重症度での各細胞タイプの割合を示す図である。図１１のデータはボックスプロットで示している。「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを表す。図１１に示す通り、グループ３と健常群との間でＣＤ４＋Ｔ細胞の割合に差が見られたものの、それ以外では、健常群と、各重症度レベルのＣＯＶＩＤ－１９患者群との間で、各細胞タイプの割合に差はなかった。図１２は、ＰＢＭＣの各細胞でのＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現を示すドットプロットを表す図である。図１２のドットの色は平均の発現レベルを表し、ドットのサイズはＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子を発現している集団の割合に比例している。図１０および１２に示す通り、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現レベルは特に単球および樹状細胞で増強されていた。
【0077】
次に、差次的発現（ＤＥ）遺伝子を解析し、異なるＣＯＶＩＤ－１９重症度レベルの間で各細胞タイプにおけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現の変化を調べた。図１３は、ＰＢＭＣの各細胞での、示されたグループ間のＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の差次的発現解析結果を示す図である。「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差があることを表す。図１３のＤＥ解析により、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現は、主にＰＢＭＣ、特に単球でアップレギュレーションされていることが明らかになった。また、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現は、単球においてのみ、非重症例に比べて重症例で有意にアップレギュレーションされていた。
【0078】
単球はさらに古典的単球、非古典的単球、中間単球の３つのサブタイプに分類される。図１４は、単球の各サブタイプでの、示されたグループ間のＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の差次的発現解析結果を示す図である。「＊」はｐ＜０．０５、「＊＊」はｐ＜０．０１、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差があることを表す。図１４のＤＥ解析により、３つの単球サブタイプの全てにおいて、非重症例および健常群に比べて重症例でＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現が有意にアップレギュレーションされていることが示された。このことから、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子は、単球の機能を介して重症ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の発症機序に関与していることが示唆された。
【0079】
ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子のＣＯＶＩＤ－１９肺炎における関与をさらに調べるために、１９人のＣＯＶＩＤ－１９患者の剖検標本および７つの対照標本を用いて以前に生成された、肺組織のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑデータ（Melms JC et al., Nature. 2021;595(7865):114-119）を解析した。図１５は、致死ＣＯＶＩＤ－１９患者および対照群から得られた肺のｓｎＲＮＡデータ解析結果を埋め込んだＵＭＡＰ可視化結果を示す図である。図１５により１９種の細胞タイプが同定された。図１６は、対照群およびＣＯＶＩＤ－１９患者群での図１９の各細胞タイプの相対的寄与を示す棒グラフを表す図である。図１６に示す通り、ＣＯＶＩＤ－１９患者では対照群に比べて、タイプ１および２の肺胞上皮細胞の割合が減少し、マクロファージ、単球および繊維芽細胞の割合が増加していた。
【0080】
図１７は、対照群および致死ＣＯＶＩＤ－１９患者群におけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子のＲＮＡ発現レベル（ｌｏｇ正規化）によって着色したＵＭＡＰ可視化結果を示す図である。図１８は、対照群およびＣＯＶＩＤ－１９患者群の各肺細胞でのＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の発現レベルを表すバイオリンプロットを示す図である。図１９は、単球およびマクロファージでのＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の差次的発現解析結果を示す図である。図１９のｙ軸は対照群に対する致死ＣＯＶＩＤ－１９群の発現の変化を示す。「＊＊」はｐ＜０．０１、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差があることを表す。図１７～１９に示す通り、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子は、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの結果と一致して、対照群に比べてＣＯＶＩＤ－１９患者において単球での発現レベルが高く、マクロファージでも同様の傾向が見られた。これらの発見は、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子が、循環性免疫細胞だけでなくＣＯＶＩＤ－１９肺炎の肺における単球でもアップレギュレーションされていることを示した。これにより、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子が、単球およびマクロファージにおける機能を介してＣＯＶＩＤ－１９肺炎の発症機序に関与し得ることが示唆された。
【0081】
これらの発見に基づき、ウイルス感染への応答における先天免疫系の刺激がこれらのオミクス解析と同様にＭＡＣＲＯＨ２Ａ１を誘導するか調べた。ヒト単球細胞株であるＴＨＰ－１細胞をＰＭＡで刺激してマクロファージへの分化を誘導し、次いでＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンドおよびＩＦＮγによる刺激を加えた。図２０は、１μｇ／ｍＬのＩＦＮγを用いて、または用いずに、１μｇ／ｍＬのＲ８４８、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳまたは１μｇ／ｍＬのＰａｍ３ＣＳＫ４で４８時間処理した後、ＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１細胞のイムノブロット解析結果を示す図である。「ｍｅｄ」は無刺激（すなわち培養液のみ）を意味する。図２０に示す通り、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１は、Ｒ８４８、ＬＰＳおよびＰａｍ３ＣＳＫ４を用いたＴＬＲの刺激により誘導された。さらに、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１の主要なアイソフォームであるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１．２は、Ｒ８４８刺激に加えてＩＦＮγ刺激によって、より強く誘導された。
【0082】
一方、図２１は、１μｇ／ｍＬのＩＦＮγを用いて、または用いずに、示された濃度のＴＮＦαで４８時間処理した後、ＰＭＡで分化させたＴＨＰ－１細胞のイムノブロット解析結果を示す図である。図２１に示す通り、ＴＮＦαによる処理は、ＩＦＮγを用いたか否かにかかわらずＭＡＣＲＯＨ２Ａ１を誘導しなかった。結論として、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１は、ＣＯＶＩＤ－１９感染に伴い肺または循環血液中の単球において誘導され、おそらくＴＬＲシグナリング経路またはＩＦＮγ刺激を介したウイルス感染への応答において誘導されると考えられる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染への応答において、ＴＬＲシグナリングおよびＩＮＦγなどのサイトカインの分泌を含む免疫応答が単球におけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１の発現を促進する。次いで、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１が循環性エクソソームにおいて分泌され、非重症ＣＯＶＩＤ－１９患者に比べて重症ＣＯＶＩＤ－１９患者においてより多くなると考えられる。
【0083】
最後に、血清ＥＶプロテオミクス、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよび肺のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑの全体の傾向を統合するために、これらの調査で同定された分子に対してKeyMolnetを用いた分子ネットワーク解析を行った。KeyMolnetの始点終点ネットワーク検索アルゴリズムを用いることにより、統計学的に最も有意な関係性を有するターゲットの高度に複雑なネットワークが生成された。各分子ネットワークでは、最も高い関与を示す上位１０個のパスウェイがHScore（超幾何分布によるスコア値）の順に列挙された。
【0084】
図２２は、血清ＥＶプロテオミクス、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよび肺組織のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑにおいて解析した分子ネットワークにおける上位１０個のパスウェイを示す図である。図２２では、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の上流の分子ネットワークの試験と下流の分子ネットワークの試験とを示す。図２２の「血清ＥＶプロテオミクス」は、グループ２とグループ３との比較においてｐ＜０．０５、かつ変化倍率が１．５を超えるか、または０．６７未満であるＥＶタンパク質のネットワークにおける上位１０個のパスウェイを示す。図２２の「ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ」は、グループ２および３とグループ１との比較においてＰＢＭＣ由来の単球のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現解析において有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている遺伝子のネットワークにおける上位１０個のパスウェイを示す。図２２の「肺組織のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑ」は、対照と致死ＣＯＶＩＤ－１９との比較において肺由来の単球のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現解析において有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている遺伝子のネットワークにおける上位１０個のパスウェイを示す。
【0085】
図２３～２５は、血清ＥＶプロテオミクス、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよび肺組織のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑにおけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の上流の分子ネットワークの解析および「エストロゲンシグナリング」関連分子のエンリッチメントを表す。図２３～２５において明るく強調された分子は、「エストロゲンシグナリング」関連分子である。図２３は、グループ２とグループ３との比較においてｐ＜０．０５、かつ変化倍率が１．５を超えるか、または０．６７未満であるＥＶタンパク質の分子ネットワークを表す図である。図２４は、グループ２および３とグループ１との比較においてＰＢＭＣ由来の単球のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現解析において有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている遺伝子の分子ネットワークを表す図である。図２５は、対照と致死ＣＯＶＩＤ－１９との比較において肺由来の単球のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現解析において有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている遺伝子の分子ネットワークを表す図である。
【0086】
図２６～２８は、血清ＥＶプロテオミクス、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよび肺組織のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑにおけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の下流の分子ネットワークの解析、ならびに「ｐ１６０ ＳＲＣシグナリング経路」および「ＳＴＡＴによる転写調節」関連分子のエンリッチメントを表す。図２６～２８において明るく強調された分子は、「ｐ１６０ ＳＲＣシグナリング経路」および「ＳＴＡＴによる転写調節」関連分子である。図２６は、グループ２とグループ３との比較においてｐ＜０．０５、かつ変化倍率が１．５を超えるか、または０．６７未満であるＥＶタンパク質の分子ネットワークを表す図である。図２７は、グループ２および３とグループ１との比較においてＰＢＭＣ由来の単球のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現解析において有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている遺伝子の分子ネットワークを表す図である。図２８は、対照と致死ＣＯＶＩＤ－１９との比較において肺由来の単球のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑの差次的発現解析において有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされている遺伝子の分子ネットワークを表す図である。
【0087】
図２２より、血清ＥＶプロテオミクスのＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の上流の分子ネットワークの試験では、エストロゲンシグナリングにおいて最も高い関与が観察された。エストロゲンシグナリングは、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよび肺組織のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑの上流の分子ネットワークの試験においても最も高い関与を示した。次に、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の下流の分子ネットワークを調べると、血清ＥＶプロテオミクス、ＰＢＭＣのｓｃＲＮＡ－ｓｅｑおよび肺組織のｓｎＲＮＡ－ｓｅｑにおいて、「ｐ１６０ ＳＲＣシグナリング経路」および「ＳＴＡＴによる転写調節」が共通して高い関与を示すことが見出された。図２３～２８に示すように、ＭＡＣＲＯＨ２Ａ１の上流および下流の調節関係を含む分子は、これらのパスウェイに属する分子を含んでいた。これらの結果は、３つ全てのオミクス解析に共通するパスウェイを明らかにし、単球におけるＭＡＣＲＯＨ２Ａ１遺伝子の機能は血清ＥＶのプロテオミクスをある程度反映していることを示した。
【産業上の利用可能性】
【0088】
本発明の一態様は、ＣＯＶＩＤ－１９患者の重症化または難治化の予測に利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
