特開 2024-60569 本態性高血圧症を検出するためのバイオマーカー、それを用いた検出方法及び検出試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024060569

(43)【公開日】2024-05-02

(54)【発明の名称】本態性高血圧症を検出するためのバイオマーカー、それを用いた検出方法及び検出試薬

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20240424BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240424BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N33/53 D

【審査請求】未請求

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023120090

(22)【出願日】2023-07-24

(31)【優先権主張番号】P 2022167955

(32)【優先日】2022-10-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】505457994

【氏名又は名称】学校法人東京医科大学

(71)【出願人】

【識別番号】505155528

【氏名又は名称】公立大学法人横浜市立大学

(71)【出願人】

【識別番号】000003300

【氏名又は名称】東ソー株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002860

【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】横山 詩子

(72)【発明者】

【氏名】近森 大志郎

(72)【発明者】

【氏名】冨山 博史

(72)【発明者】

【氏名】高橋 梨紗

(72)【発明者】

【氏名】石川 義弘

(72)【発明者】

【氏名】小堀 宏樹

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CA26

2G045DA36

(57)【要約】

【課題】本態性高血圧症を客観的かつ迅速に検出することができるマーカー、およびそれを用いた本態性高血圧症を検出する方法等を提供する。
【解決手段】 ミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）を、本態性高血圧症を検出するためのバイオマーカーとして使用し、ヒト体液中のＭＹＨ１１の濃度を測定し、その濃度が基準値よりも高い場合には、本態性高血圧症が検出されたとし、当該基準値は、本態性高血圧症が認められなかったヒト体液中のＭＹＨ１１濃度である方法。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）からなる、本態性高血圧症を検出するためのバイオマーカー。

【請求項2】

ヒト体液中のＭＹＨ１１の濃度を測定し、その測定値から本態性高血圧症を検出する方法。

【請求項3】

ＭＹＨ１１の濃度が基準値よりも高い場合には、本態性高血圧症が検出されたとし、当該基準値は、本態性高血圧症が認められなかったヒト体液中のＭＹＨ１１濃度である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記体液が、血清又は血漿である、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

ＭＹＨ１１の濃度を測定する方法が免疫学的測定法である、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項6】

ＭＹＨ１１を特異的に認識する抗体を用いて行われる、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ＭＹＨ１１を特異的に認識する抗体を含有することを特徴とする、請求項５に記載の方法に使用するための検出試薬又は検出キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト体液中のミオシン重鎖１１（Ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ １１；ＭＹＨ１１）の濃度を指標として、本態性高血圧症を検出する方法等に関する。

【背景技術】

【0002】

高血圧は、本態性高血圧（原因がはっきりしないもの）と二次性高血圧（原因が特定できるもの）に分けられる。日本人の高血圧の約９割が本態性高血圧であり、生活習慣などの環境因子や遺伝的因子により起こるものである。一方、二次性高血圧は若年者に多く、血圧を上昇させるホルモンの異常や心臓・腎臓・血管の病気などで起こるものである。

【0003】

現在、本態性高血圧症の診断には家庭血圧測定が推奨されているが、自己測定では正しく計測できていない場合があり、患者自身がデータを選んで報告してしまう報告バイアスも存在する。
家庭血圧測定では、ガイドラインに則った方法で１日２回以上７日間の測定平均が求められているが、厳密に実行することは困難なケースがある。
別の方法として、カフ・オシロメトリック法による自動血圧計を用いて非観血的に２４時間自由行動下に血圧を測定する方法ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ （ＡＢＰＭ）があるが、その日の活動性や睡眠状態により値は変動するため、１回のＡＢＰＭでは血圧の再現性は十分ではない。さらに、装置が高価であり被装着者の負担も大きいことから日常診療に用いることは容易ではない（非特許文献１）。

【0004】

本邦では約４３００万人が本態性高血圧症に罹患していると推定され、このうち適切に血圧がコントロールされているのはわずか２８％であり、残りの３１００万人のうち、自らの本態性高血圧症を認識していない者が１４００万人、認識しているが未治療の者が４５０万人、治療を受けているが管理不良の者が１２５０万人と推計されている。近年、２０１７年に米国（ＡＣＣ／ＡＨＡ２０１７）、２０１８年に欧州（ＥＳＣ／ＥＳＨ２０１８）、２０１９年に本邦（ＪＳＨ２０１９）において高血圧症の治療ガイドライン（非特許文献１）が発表され、降圧目標値が定められた疾患が増えた。

【0005】

血圧と相関する血中蛋白としては、ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ（非特許文献２）、ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ－Ａ（非特許文献３）、ｌｏｎｇ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ ＮＲ＿１０４１６０（非特許文献４）、ｈａｓ＿ｍｉＲ－３６５６（非特許文献５）、ｈａｓ＿ｃｉｒｃ＿００１４２４３（非特許文献６）が論文報告されている。非特許文献２～５は３４名～８６名を対象とした小規模検討であり、これらの血中蛋白により高血圧症を検出できると言える程度の相関関係は実証されていない。また、非特許文献６は１７８名を対象としているが、本態性高血圧症の検出はＴｈｅ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ＲＯＣ ｃｕｒｖｅ （ＡＵＣ）＝０．７３２であり、必ずしも十分な検出能とはいえない。
また、これらの報告を含めて本態性高血圧症を検出するバイオマーカーは見出されていない。

【0006】

ＭＹＨ１１はミオシン重鎖のサブタイプであり、血管平滑筋で特異的に高発現する構造タンパクであり、通常は細胞内に存在している。ＭＹＨ１１と血圧との関連は遺伝子改変動物やヒト高血圧症での遺伝子発現変化の観点からも報告がないため、血圧との関連を推定できるものではない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】高血圧治療ガイドライン２０１９ 日本高血圧学会

【非特許文献2】Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．， ２０２０；４２（３）：２６６－２７０． ｄｏｉ： １０．１０８０／１０６４１９６３．２０１９．１６３２３４０．

【非特許文献3】Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．， ２０１３ Ｄｅｃ；１８（８）：７１６－２０． ｄｏｉ： １０．３１０９／１３５４７５０Ｘ．２０１３．８４７１２２．

【非特許文献4】Ａｍ． Ｊ． Ｔｒａｎｓｌ．， Ｒｅｓ． ２０２０ Ｏｃｔ １５；１２（１０）：６０６０－６０７５．

【非特許文献5】Ｊ． Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．， ２０２２ Ｆｅｂ １；４０（２）：３１０－３１７． ｄｏｉ： １０．１０９７／ＨＪＨ．００００００００００００３０１０．

【非特許文献6】Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． Ｍｅｄ．， ２０１９ Ｍａｒ；１７（３）：１７２８－１７３６． ｄｏｉ： １０．３８９２／ｅｔｍ．２０１８．７１０７．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、本態性高血圧症を客観的かつ迅速に検出することができるマーカー、およびそれを用いた本態性高血圧症を検出する方法等を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。

【0010】

［１］ミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）からなる、本態性高血圧症を検出するためのバイオマーカー。
［２］ヒト体液中のＭＹＨ１１の濃度を測定し、その測定値から本態性高血圧症を検出する方法。
［３］ＭＹＨ１１の濃度が基準値よりも高い場合には、本態性高血圧症が検出されたとし、当該基準値は、本態性高血圧症が認められなかったヒト体液中のＭＹＨ１１濃度である、［２］に記載の方法。
［４］前記体液が、血清又は血漿である、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］ＭＹＨ１１の濃度を測定する方法が免疫学的測定法である、［２］～［４］の何れかに記載の方法。
［６］ＭＹＨ１１を特異的に認識する抗体を用いて行われる、［５］に記載の方法。
［７］ＭＹＨ１１を特異的に認識する抗体を含有することを特徴とする、［５］又は［６］に記載の方法に使用するための検出試薬又は検出キット。

【発明の効果】

【0011】

本発明により、ＭＹＨ１１を測定することにより、本態性高血圧を客観的かつ迅速に検出することができる。なお、後述の実施例が示すように、１１３名規模の検討におけるＭＹＨ１１のＴｈｅ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ＲＯＣ ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）＝０．８８５は、非特許文献６に開示されるｈａｓ＿ｃｉｒｃ＿００１４２４３よりも高く、優れた検出能を示した。これによって、例えば適切な治療介入が可能となり、臨床的、経済的価値が非常に高いと考えられる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】実施例１で、健常者と本態性高血圧症患者群において、ＭＹＨ１１を測定した結果を示す図である。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔでの検討結果ではｐ＜０．０００１を示した。

【図2】実施例１で、ＭＹＨ１１による本態性高血圧症の検出能を受信者動作特性（ＲＯＣ）解析により評価した結果を示す図である。

【図3】実施例２で、血中ＭＹＨ１１と平均血圧のとの相関を示す図である。

【図4】実施例３で、血中ＭＹＨ１１と拡張期血圧のとの相関を示す図である。

【図5】比較例１で、血中ＭＹＨ１１とｈｓＣＲＰとの相関を示す図である。

【図6】比較例２で、健常者と本態性高血圧症患者群において、ｈｓＣＲＰを測定した結果を示す図である。

【図7】実施例４で全自動化学発光酵素免疫測定装置用の測定試薬で測定した結果と、実施例１でサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した結果との相関を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明の第一の態様は、本態性高血圧症を検出するためのバイオマーカーである。本発明のバイオマーカーは、ヒト体液中に存在するＭＹＨ１１からなる。

【0014】

後述の実施例が示す通り、本態性高血圧症が認められたヒト体液中のＭＹＨ１１の濃度（レベルともいう）は、本態性高血圧症が認められなかったそれに比べて有意に高い。そのため、検体中のＭＹＨ１１は、本態性高血圧症を検出するための指標となり得る。

【0015】

本態様の別の側面は、ＭＹＨ１１の、本態性高血圧症を検出するためのバイオマーカーとしての使用である。

【0016】

かかる知見に基づく本発明の第二の態様は、ヒト体液中のＭＹＨ１１濃度を測定し、その測定値から本態性高血圧症を検出する方法である。この方法は、通常はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で行われる。また、ヒト体液中におけるＭＹＨ１１の濃度の測定は、通常イムノアッセイで行われる。降圧剤を検討する際にヒト体液中のＭＹＨ１１濃度を測定する事で、その治療方針を選択する為の判断材料が提出される。

【0017】

なお、本発明の方法は、本態性高血圧症を検出する段階までを含むものであり、その診断の最終的な判断行為は含まれない。医師は、本発明の方法による検出結果等を参照して、本態性高血圧症の有無を診断したり治療方針を決定したりする。したがって、本発明の方法は、本態性高血圧症を診断するための判断材料を提供する方法と言い換えることができる。

【0018】

ヒト検体中のＭＹＨ１１は、試料中のＭＹＨ１１タンパク質又はその断片の測定により調べることができる。ＭＹＨ１１は、組織タンパク質であるが、ＭＹＨ１１全長タンパク質及びその断片には、遊離して存在するものの他、他のタンパク質等と結合ないしは会合した形態で検体中に存在するものが包含される。従って、本発明においてバイオマーカーとして使用される「ＭＹＨ１１」という語には、検体中に遊離して存在するＭＹＨ１１全長タンパク質及びその部分断片、並びに他のタンパク質又はタンパク質断片と結合ないしは会合した形態で検体中に存在するＭＹＨ１１及びその部分断片が包含される。

【0019】

本発明における検体とは、ヒト体液であり、血液（全血、血清、血漿等）等を用いることができるが、血清又は血漿を用いることが望ましい。本発明の方法に用いられる検体は、被験者から採取された、すなわち単離された検体を指す。検体を採取されるヒト（被験者）は、通常、本態性高血圧症患者又はそれが疑われる患者である。

【0020】

本発明の方法の測定を行う時期は、本態性高血圧症治療を始める前であってもよい。他の方法による本態性高血圧症の検出結果と共に、本発明の方法による検出結果を合わせる
ことで、治療を行う判断の一助となる。
また、本発明の方法の測定を行う時期は、本態性高血圧症に対し加療した後であってもよい。例えば、降圧剤を投与した後の経過観察において本発明の方法による検出結果を参照することで、本態性高血圧症の経過を判定でき、その後の治療を行う判断の一助となる。

【0021】

ヒト検体中のＭＹＨ１１を測定する方法は、免疫測定法、液体クロマトグラフィー法、電気泳動法、質量分析法等定量性のある測定法であれば特に限定されないが、免疫測定法は大掛かりな機器類が不要であり測定操作も簡便なので、本発明においても好ましく用いることができる。
免疫測定自体はこの分野において周知である。免疫測定法を反応形式に基づいて分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等があり、また、標識に基づいて分類すると、酵素免疫分析、放射免疫分析、蛍光免疫分析等がある。本発明においては、定量的検出が可能な免疫測定方法のいずれを用いてもよい。特に限定されないが、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ等のサンドイッチ法を好ましく用いることができる。
本発明に用いられる抗体の製法は特に限定はなく、典型的には、マウス、ウサギ等の非ヒト動物で調製された非ヒト動物ポリクローナル又はモノクローナル抗体である。また、上述の通りＭＹＨ１１のアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列も公知であるので、常法のハイブリドーマ法等によりＭＹＨ１１の特定部位を特異的に認識するＭＹＨ１１抗体を調製して用いてもよい。

【0022】

本発明に用いられる抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。ポリクローナル抗体として抗血清を用いてもよい。本発明において、ポリクローナル抗体という語には、精製前の抗血清も包含される。また、抗体に代えて該抗体の抗原結合性断片を用いることもできる。以下、本明細書において、文脈からそうではないことが明らかな場合を除き、「抗体」という語には当該抗体の抗原結合性断片も包含される。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗原結合性断片は、いずれも周知の常法により調製することができる。

【0023】

具体的には、ＭＹＨ１１の特定部位を認識するポリクローナル抗体は、例えば、当該部位を特異的に認識するモノクローナル抗体を複数種混合して得ることができる。又は、化学合成等の周知の手法により調製したＭＹＨ１１の当該部位を含むポリペプチド、又はこれらをコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として適宜アジュバントと共に非ヒト動物に免疫し、該動物から採取した血液から抗血清を得て、該抗血清中のポリクローナル抗体（非ヒト動物抗可溶性ＭＹＨ１１ポリクローナル抗体）を精製することで得ることができる。免疫は、被免疫動物中での抗体価を上昇させるため、通常数週間かけて複数回行なう。抗血清中の抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、アフィニティーカラム精製等により行なうことができる。

【0024】

モノクローナル抗体の周知の作製方法の一例として、ハイブリドーマ法を挙げることができる。具体的には、例えば、上記のように免疫した非ヒト動物から脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、ＭＹＨ１１の特定部位と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて培養上清から非ヒト動物抗ＭＹＨ１１特定部位を特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることができる。

【0025】

「抗原結合性断片」とは、例えば免疫グロブリンのＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）_２断片のような、当該抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している抗体断片を意味する。このような抗原結合性断片もイムノアッセイに利用可能であることは周知であり、もとの抗体と同様に有用である。Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）_２断片は、周知の通り
、抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。なお、抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）_２断片に限定されるものではなく、対応抗原との結合性を維持しているいかなる断片であってもよく、遺伝子工学的手法により調製されたものであってもよい。また、例えば、遺伝子工学的手法により、一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ： ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を大腸菌内で発現させた抗体を用いることもできる。ｓｃＦｖの作製方法も周知であり、上記の通りに作製したハイブリドーマのｍＲＮＡを抽出し、一本鎖ｃＤＮＡを調製し、免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行なって免疫グロブリンＨ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、それで大腸菌を形質転換し、大腸菌からｓｃＦｖを回収することによりｓｃＦｖを作製することができる。このようなｓｃＦｖも「抗原結合性断片」に包含される。

【0026】

免疫測定法自体は周知の技術であるが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、ＭＹＨ１１に結合する抗体を固相に不動化し（固相化抗体）、試料と反応させ、必要に応じて洗浄後、固相化抗体と同一又は異なる部位でＭＹＨ１１に結合する抗体に標識を付した標識抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した標識抗体を測定する。

【0027】

標識抗体の測定は、標識物質からのシグナルを測定することにより行なうことができる。シグナルの測定方法は、標識物質の種類に応じて適宜選択される。例えば、酵素標識の場合、該酵素に対応した発色基質、蛍光基質又は発光基質等の基質を該酵素と反応させ、その結果発生する発色や発光等のシグナルを吸光光度計やルミノメータ等の適当な機器で測定することにより、酵素活性を求め測定対象物を測定することができる。例えば、標識物質としてＡＬＰを用いる場合、３－（４－メトキシスピロ（１，２－ジオキセタン－３，２’－トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン）－４－イル）フェニルホスフェート２ナトリウム（例えば商品名ＡＭＰＰＤ）などの発光基質を用いることができる。標識抗体は、標識物質が当該抗体に直接結合されていてもよいし、ビオチン又はハプテン等の特異結合分子を抗体に結合させ、標識物質を結合した特異結合分子のパートナー（ストレプトアビジン又はハプテン抗体等）を反応させることにより、間接的に標識物質が結合されていてもよい。ＭＹＨ１１を種々の濃度で含む濃度既知の標準試料について、抗ＭＹＨ１１抗体又はその抗原結合性断片を用いて免疫測定を行ない、標識からのシグナルの量と標準試料中のＭＹＨ１１の濃度との相関関係をプロットして検量線を作成しておき、ＭＹＨ１１が未知の検体について同じ操作を行なって標識からのシグナル量を測定し、測定値をこの検量線に当てはめることにより、検体中のＭＹＨ１１を定量することができる。

【0028】

ヒト体液中のＭＹＨ１１レベルが高いか否かは、本態性高血圧症が認められなかった患者群の体液中の、ＭＹＨ１１レベルから統計学的に適切に算出して定められた基準値を閾値とし、この閾値との比較により判断することができる。そして、ＭＹＨ１１レベルの測定値が、この基準値よりも高い場合には、本態性高血圧症が検出されたとすることができる。この閾値は、年代ごと（例えば、３０歳未満、３０歳代、４０歳代、５０歳代など）、性別ごと、人種ごとに設定してもよい。
医師は、ヒト体液中のＭＹＨ１１レベルに基づいて本態性高血圧症が検出された結果等を参照して、最終的に本態性高血圧症の有無を診断したり治療方針を決定したりする。

【0029】

本発明の本態性高血圧症を検出する方法は、本態性高血圧症治療の方針の一助とすることができる。すなわち、本発明により、患者における本態性高血圧症を治療する方法であって、
（ｉ）患者から採取した体液中のＭＹＨ１１濃度を測定する工程、
（ｉｉ）前記測定値が予め設定した基準値を超える場合に、本態性高血圧症が検出されたと同定する工程、及び
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で本態性高血圧症が検出されたと同定された患者に対して該高血圧症の診断を行い、治療を施す工程、を含む方法が提供される。治療としては、特に限定されないが、降圧剤の投与等の薬物療法が好ましい。

【0030】

また本発明の第三の態様は、ＭＹＨ１１を特異的に認識する抗体を含有する、本態性高血圧症を検出する方法に使用するための試薬に関する。

【0031】

この検出試薬は、ＭＹＨ１１を特異的に認識する抗体ないし抗原結合性断片のみからなっていてもよいし、これら抗体又はその抗原結合性断片の安定化等に有用な他の成分をさらに含んでいてもよい。また、これら抗体又はその抗原結合性断片は、標識物質ないしはビオチン等の特異結合分子が結合した形態や、プレート、粒子等の固相に固定化された形態であってもよい。

【0032】

本発明の第四の態様はまた、上記した本発明の検出試薬を含む、本態性高血圧症を検出するキットであってもよい。当該キットは免疫測定キットであり、免疫測定に必要な他の試薬類等も含んでいてよい。免疫測定に必要な他の試薬類は周知である。例えば、当該キットには、上記した検出試薬のほか、検体希釈液、洗浄液、及び、標識抗体に使用されている標識物質が酵素の場合には該酵素の基質液等がさらに含まれ得る。また、キットには通常、使用説明書が含まれる。

【0033】

本態様の別の側面は、ＭＹＨ１１を特異的に認識する抗体の、本態性高血圧症を検出するための試薬又はキットの製造における使用である。また別の側面は、ＭＹＨ１１を特異的に認識する抗体の、本態性高血圧症の検出における使用である。また別の側面は、本態性高血圧症の検出のために使用される、ＭＹＨ１１を特異的に認識する抗体である。

【実施例0034】

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【0035】

＜作製例１＞ＭＹＨ１１ Ｃ末端領域を認識するモノクローナル抗体（ＭＹＶＦ５ｒ０８Ｍ０２， ＭＹＶＦ５ｒ０６Ｍ０５）の作製
既知のＲａｔ腸骨リンパ免疫法により、ＭＹＨ１１ Ｃ末端領域を認識するモノクローナル抗体を複数作製し、そのうち２種を選択した。

【0036】

即ち、免疫には哺乳動物細胞を用いた組換えＭＹＨ１１を用いた。ＭＹＨ１１を含むＯＲＦ（株式会社ダナフォーム）を購入し、ＭＹＨ１１ Ｃ末端領域をＰＣＲ法にて増幅し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いてｐＥＣＥ Ｖｅｃｔｏｒに導入した。作製したプラスミドにより、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔを形質転換し、一過性発現にて組換えＭＹＨ１１ Ｃ末端領域を得た。これを免疫抗原とし、Ｒａｔモノクローナル抗体（ＭＹＶＦ５ｒ０８Ｍ０２， ＭＹＶＦ５ｒ０６Ｍ０５）を得た。

【0037】

＜作製例２＞ビオチン化検出抗体の作製
得られたモノクローナル抗体ＭＹＶＦ５ｒ０６Ｍ０５はＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（同仁化学研究所）を用いてＢｉｏｔｉｎラベル化を行い、ビオチン化ＭＹＶＦ５ｒ０６Ｍ０５とした。

【0038】

＜実施例１＞自作抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによるミオシン重鎖１１測定
本態性高血圧症血漿検体は、本態性高血圧症と診断された患者８２名より採取した。陰
性対照の健常者の血漿検体は、本態性高血圧症及びそのリスクファクターのない日本人健常者３１名より採取した。

【0039】

作製例１で得られたＲａｔモノクローナル抗体（ＭＹＶＦ５ｒ０８Ｍ０２）を２００ｎｇ／ウェルになるようカーボネート緩衝液（ｐＨ９．８）で希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に固相化した。４℃にて一晩反応後、ＴＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）により３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＴＢＳ溶液を２００μＬ／ウェルにて各ウェルに添加し、室温で２時間放置した。

【0040】

ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄を行なった後、本態性高血圧症患者８２名の血漿検体、又は本態性高血圧症及びそのリスクファクターのない日本人健常者３１名の血漿検体を、１％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ－Ｔ溶液にて１０倍希釈し５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。

【0041】

ＴＢＳ－Ｔにより３回洗浄を行なった後、作製例２で得られたビオチン化ＭＹＶＦ５ｒ０６Ｍ０５抗体を、１％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ－Ｔ溶液で１μｇ／ｍＬになるよう希釈し、５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間放置した。ＴＢＳ－Ｔにより３回洗浄を行なった後、１％ウシ血清アルブミンを含むＴＢＳ－Ｔ溶液で５００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（フナコシ株式会社）溶液を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。ＴＢＳ－Ｔにより４回洗浄を行ない、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光値（ＭＹＨ１１＿Ｓｉｇｎａｌ）を測定した。

【0042】

結果を図１に示す。健常者（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、本態性高血圧症患者群では明らかに血中ＭＹＨ１１が有意に高値であった。

【0043】

【表1】

【0044】

表１及び図２は、ＭＹＨ１１による本態性高血圧症の検出能をＲＯＣ解析により評価した結果である。この結果より、独立変数である血漿中のＭＹＨ１１濃度と二分変数である動脈硬化の有無というアウトカムとの関係が有意に強いということが示された。また、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ）０．８８５であった。

【0045】

＜実施例２＞
実施例１にて測定した検体の電子カルテを参照し、血中ＭＹＨ１１と平均血圧との相関を検証した。

【0046】

解析結果を表２及び図３に示す。Ｓｐｅａｒｍａｎで検証した結果、Ｐ＝０．０１０７であり相関性が示された。

【0047】

【表2】

【0048】

＜実施例３＞
実施例１にて測定した検体の電子カルテを参照し、血中ＭＹＨ１１と拡張期血圧との相関を検証した。

【0049】

解析結果を表３及び図４に示す。Ｓｐｅａｒｍａｎで検証した結果、Ｐ＝０．００４１であり相関性が示された。

【0050】

【表3】

【0051】

＜比較例１＞
実施例１にて測定した検体の電子カルテを参照し、ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｈｓＣＲＰ）の測定結果がある１１２検体について、ＭＹＨ１１とｈｓＣＲＰとの相関を検証した。

【0052】

解析結果を表４及び図５に示す。Ｓｐｅａｒｍａｎで検証した結果、Ｐ＝０．７２３であり相関性は認められなかった。

【0053】

【表4】

【0054】

＜比較例２＞
実施例１にて測定した検体のうち、ｈｓＣＲＰの測定結果がある１１２検体についてｈｓＣＲＰ値を電子カルテから参照し、健常者（ｃｏｎｔｒｏｌ）と本態性高血圧症患者群を比較した結果を図６に示す。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔでｐ＝０．５７
７であり、有意差は確認できなかった。

【0055】

＜作製例３＞ ＭＹＨ１１のＡＩＡ－ＣＬ２４００測定試薬の調製
固相側にＭＹＶＦ５ｒ０８Ｍ０２抗体、検出側にＭＹＶＦ５ｒ０６Ｍ０５抗体を用いて、ＭＹＨ１１のＡＩＡ－ＣＬ２４００測定試薬を以下の通り調製した。
２つのセルを有するカップを用いて、ＡＩＡ－ＣＬ２４００測定試薬を作製した（以下、中身に即して、カップの一方のセルを微粒子側のセル、他方のセルをコンジュゲート側のセルと呼ぶ）。
ＭＹＶＦ５ｒ０８Ｍ０２抗体を固定化した微粒子を含む溶液を微粒子側のセルに分注し、コンジュゲート側のセルには、アルカリホスファターゼを標識した抗ＭＹＶＦ５ｒ０６Ｍ０５抗体を含む溶液を分注した。溶液を凍結乾燥し、アルミシールし、ＭＹＨ１１のＡＩＡ－ＣＬ２４００測定試薬とし、測定に供した。

【0056】

＜実施例４＞ 臨床検体の評価
作製例３で調製した測定試薬を用いて、実施例１で評価した本態性高血圧症の検体のうち３２検体を測定した。評価用装置は全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＩＡ－ＣＬ２４００（東ソー（株）製：製造販売届出番号１３Ｂ３Ｘ９０００２００００１８）を用いた。全自動化学発光酵素免疫測定装置ＡＩＡ－ＣＬ２４００によるＭＹＨ１１の測定は、以下の手順で行った。
（１）サンプル１０μＬと界面活性剤を含む希釈液４０μＬを、作製例３で作製したＭＹＨ１１のＡＩＡ－ＣＬ２４００測定試薬の微粒子側のセルに自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で５分間の抗原抗体反応を行い、
（３）Ｂ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離後、界面活性剤を含む緩衝液にて洗浄を行い、
（４）コンジュゲート側のセルで別途溶解されたアルカリホスファターゼ標識抗体を微粒子側のセルに分注し、
（５）３７℃恒温下で３分間の抗原抗体反応を行い、
（６）Ｂ／Ｆ分離後、界面活性剤を含む緩衝液にて洗浄を行い、
（７）微粒子側のセルに３－（５－ｔｅｒｔ－ブチル－４，４－ジメチル－２，６，７－トリオキサビシクロ［３．２．０］ヘプト－１－イル）フェニルリン酸エステルジナトリウム塩（ＤＩＦＵＲＡＴ）を添加し、単位時間当たりのアルカリホスファターゼによるＤＩＦＵＲＡＴの分解で得られる化学発光強度をもって測定値（ｃｐｓ）とし、実施例１で得られたＥＬＩＳＡ測定結果と比較した。

【0057】

結果を図７に示す。実施例１のサンドイッチＥＬＩＳＡで得られた測定結果と実施例４のＡＩＡ－ＣＬ２４００測定試薬で得られた結果との相関係数はＲ^２＝０．９６１５であり、大きな乖離は見られなかった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】