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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024062871
(43)【公開日】2024-05-10
(54)【発明の名称】ヒラメ類の性識別方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240501BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20240501BHJP
C12Q 1/6879 20180101ALI20240501BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C12Q1/6844 Z ZNA
C12Q1/6879 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】19
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022171001
(22)【出願日】2022-10-25
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り １．発行日 令和４年９月５日 ２．刊行物名 令和４年度 日本水産学会秋季大会 講演要旨集 ３．公開者 坂本崇、服部ヒカルドショウヘイ、熊沢渓一郎、中本正俊、中野佑紀、藤加菜子、山口寿哉、北野健、山本榮一 ［刊行物等］ １．開催日 令和４年９月５日～７日 ２．集会名 令和４年度 日本水産学会秋季大会 ３．公開者 坂本崇、服部ヒカルドショウヘイ、熊沢渓一郎、中本正俊、中野佑紀、藤加菜子、山口寿哉、北野健、山本榮一 ［刊行物等］ １．ウェブサイトの掲載 令和４年９月１６日 ２．ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｇｅｎｅ．２０２２．１００７５４８ ３．公開者 坂本崇、服部ヒカルドショウヘイ、熊沢渓一郎、中本正俊、中野佑紀、藤加菜子、山口寿哉、北野健、山本榮一
(71)【出願人】
【識別番号】504196300
【氏名又は名称】国立大学法人東京海洋大学
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(72)【発明者】
【氏名】坂本 崇
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS32
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】ヒラメ類の遺伝的な性を正確に識別し得る方法の提供。
【解決手段】ヒラメ類のａｍｈ（抗ミュラー管ホルモン）遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さおよび／または該ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程を含んでなる、ヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法。
【選択図】図２
【解決手段】ヒラメ類のａｍｈ（抗ミュラー管ホルモン）遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さおよび／または該ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程を含んでなる、ヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒラメ類のａｍｈ（抗ミュラー管ホルモン）遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さおよび／または該ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程を含んでなる、ヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法。
【請求項2】
前記ヒラメ類のａｍｈ遺伝子が配列番号１で表されるヌクレオチド配列の少なくとも一部を有するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記発現調節領域が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列における第１番～第９１１番の領域内の少なくとも一部である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記発現調節領域のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを核酸増幅法により増幅することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記発現調節領域のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを電気泳動により検出することを含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記発現調節領域において、配列番号１の第３６４番～第３７３番および／または第５３５番～第８０８番に対応するヌクレオチド配列を含む領域の欠失が存在する場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記発現調節領域において、１０ｂｐ以上のヌクレオチド残基の欠失が存在する場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記一塩基多型に対応するヌクレオチド残基が、以下の（１）～（５）から選択される、請求項１に記載の方法：
（１）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２1３４番目のヌクレオチド残基、
（２）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基、
（３）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基、
（４）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基、
（５）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基。
（１）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２1３４番目のヌクレオチド残基、
（２）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基、
（３）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基、
（４）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基、
（５）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基。
【請求項9】
以下のいずれかを同定する工程を含んでなる、請求項８に記載の方法。
（１）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（２）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基であるかまたはグアニン（Ｇ）残基であるか、
（３）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはアデニン（Ａ）残基であるか、
（４）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（５）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか。
（１）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（２）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基であるかまたはグアニン（Ｇ）残基であるか、
（３）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはアデニン（Ａ）残基であるか、
（４）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（５）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか。
【請求項10】
（１）において、
前記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
前記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基のみである場合、あるいはシトシン（Ｃ）残基またはチミン（Ｔ）残基である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、請求項８または９に記載の方法。
前記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
前記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基のみである場合、あるいはシトシン（Ｃ）残基またはチミン（Ｔ）残基である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
（２）において、
前記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
前記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基がグアニン（Ｇ）残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、請求項８または９に記載の方法。
前記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
前記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基がグアニン（Ｇ）残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項12】
（３）において、
前記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
前記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基がアデニン（Ａ）残基残基のみである場合、あるいはアデニン（Ａ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、請求項８または９に記載の方法。
前記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
前記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基がアデニン（Ａ）残基残基のみである場合、あるいはアデニン（Ａ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項13】
（４）において、
前記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
前記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の性を遺伝的な雄と判定する、請求項８または９に記載の方法。
前記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
前記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の性を遺伝的な雄と判定する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項14】
（５）において、
前記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
前記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはアデニン（Ａ）である場合、ヒラメ類の性を遺伝的な雄と判定する、請求項８または９に記載の方法。
前記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
前記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはアデニン（Ａ）である場合、ヒラメ類の性を遺伝的な雄と判定する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項15】
前記同定工程が、前記ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを核酸増幅法により増幅することを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記ヒラメ類がヒラメ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ある、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
請求項１に記載の方法に用いるための核酸分子であって、
ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含み、かつ
前記ポリヌクレオチドが、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列および／またはヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基を含む、核酸分子。
ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含み、かつ
前記ポリヌクレオチドが、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列および／またはヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基を含む、核酸分子。
【請求項18】
請求項１に記載の方法に用いるためのプライマーペアであって、
ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにおいて、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域および／またはエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。
ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにおいて、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域および／またはエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。
【請求項19】
請求項１７に記載の核酸分子および／または請求項１８に記載のプライマーペアを含んでなる、ヒラメ類の遺伝的な性の識別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒラメ類の性を識別する方法に関する。より詳細には、ヒラメ類のａｍｈ（Ａｎｔｉ－Ｍｕｌｌｅｒｉｎａ Ｈｏｒｍｏｎｅ：抗ミュラー管ホルモン）遺伝子における発現調節領域のヌクレオチド配列の長さや、ａｍｈ遺伝子中の特定の一塩基多型を利用してヒラメ類の遺伝的な性を検査する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒラメ類は北東アジア（日本、韓国、中国）の漁業および養殖業において商業的重要性が高い養殖対象種である。性決定は、遺伝的にはＸＸ－ＸＹの雄性異型生殖システム（非特許文献１）、環境的には性ステロイドと水温（非特許文献１）によって制御されている（非特許文献２）。
【0003】
一般にヒラメ類の雌は性成熟後の成長速度が雄よりも優れているため、雌性生産の向上のために雌性発生やＸＸ遺伝子型間の交配（正常な雌との偽雄）による全ＸＸ子孫生産が採用されている。また、病気に対する感受性などの雌特有の形質も、ほとんどの魚種で雌が好まれる要因となっている（非特許文献３）。しかしながら、雄の遺伝的要因がないと思われるにもかかわらず、一部の個体は自然に雌が雄に性転換し、ＸＸ子孫の中に好ましくない表現型の雄が生まれる場合がある（非特許文献２）。２２℃前後の温暖な水温が雄性化に影響を与える大きな要因であるとも考えられるが、他のストレス要因も関与している可能性がある（非特許文献４）。しかしながら、ヒラメ類の遺伝的な雌雄の正確な識別を可能とする手法は本発明者らの知る限り何ら報告されていない。
【0004】
したがって、ヒラメ類の遺伝的な雌雄の正確な識別を可能とする手法が依然として求められているといえる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｅ．１９９９．Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｓｅｘ－ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｉｒａｍｅ，Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ（Ｔｅｍｍｉｎｃｋ ｅｔ Ｓｃｈｌｅｇｅｌ）．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１７３，２３５－２４６．
【非特許文献2】Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．，Ｋｏｂｉｒａ，Ｈ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，Ｅ．， Ｙａｚａｗａ，Ｔ．，Ｈｉｒａｉ，Ｔ．，Ｋａｍｅｉ，Ｙ．，Ｋｉｔａｎｏ，Ｔ．，２０１０．Ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃａｕｓｅｓ ｍａｓｃｕｌｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｆｅｍａｌｅ ｍｅｄａｋａ ｂｙ ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｔｉｓｏｌ．Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．７７，６７９-６８６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｍｒｄ．２１２０３
【非特許文献3】Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｃ．Ｄａｖｉｄ， Ｋ．Ｂ． ２０１２．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｇｅｎｄｅｒ ａｎｄ Ｓｅｘ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｃａｔｆｉｓｈ ｔｏ Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｉｃｔａｌｕｒｉ．Ｊ．ＷｏｒｌｄＡｑｕａｃ．Ｓｏｃ．４３，７３３－７３８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊ．１７４９－７３４５．２０１２．００５８８．ｘ
【非特許文献4】Ｍａｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．Ｌ．，Ｇｏｄｗｉｎ，Ｊ．，Ｈｏｌｌｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｒ．，Ｓｈａｍｅｙ，Ｒ．，Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｈ．Ｖ．，Ｂｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，２０１３．Ｍａｓｃｕｌｉｎｉｚｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｏｌｏｒ ａｎｄ ｃｏｒｔｉｓｏｌ ｉｎ ａ ｆｌａｔｆｉｓｈ ｗｉｔｈ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｅｘ－ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｇｒ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｌ．５３，７５５-７６５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｉｃｂ／ｉｃｔ０９３
【発明の概要】
【0006】
本発明者らは、今般、鋭意検討した結果、ヒラメ類のａｍｈ（Ａｎｔｉ－Ｍｕｌｌｅｒｉｎａ Ｈｏｒｍｏｎｅ：抗ミュラー管ホルモン）遺伝子における発現調節領域のヌクレオチド配列の長さや、ａｍｈ遺伝子中の特定の一塩基多型がヒラメ類正確な遺伝的な雌雄判別の指標となることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【0007】
したがって、本発明は、ヒラメ類の遺伝的な性を正確に識別し得る方法を提供することを目的とする。
【0008】
本発明の一実施態様によれば、以下が提供される。
[１]ヒラメ類のａｍｈ（抗ミュラー管ホルモン）遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さおよび／または該ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程を含んでなる、ヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法。
[２]上記ヒラメ類のａｍｈ遺伝子が配列番号１で表されるヌクレオチド配列にコードされるものである、[１]に記載の方法。
[３]上記発現調節領域が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列における第１番～第９１１番のヌクレオチド領域内の少なくとも一部である、[２]に記載の方法。
[４]上記発現調節領域のヌクレオチド配列によりコードされるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを核酸増幅法により増幅することを含んでなる、[１]に記載の方法。
[５]上記発現調節領域を含むヌクレオチド領域をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを電気泳動により検出することを含んでなる、[４]に記載の方法。
[６]上記発現調節領域において、配列番号１の第３６４番～第３７３番および／または第５３５番～第８０８番に対応するヌクレオチド配列を含む領域の欠失が存在する場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、[１]に記載の方法。
[７]上記発現調節領域において、１０ｂｐ以上のヌクレオチド残基の欠失が存在しない場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定する、[１]に記載の方法。
[８]上記一塩基多型に対応するヌクレオチド残基が、以下の（１）～（５）から選択される、[１]に記載の方法：
（１）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基、
（２）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基、
（３）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基、
（４）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基、
（５）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基。
[９]以下のいずれかを同定する工程を含んでなる、[８]に記載の方法。
（１）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（２）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基であるかまたはグアニン（Ｇ）残基であるか、
（３）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはアデニン（Ａ）残基であるか、
（４）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（５）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか。
[１０]（１）において、
上記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基のみである場合、あるいはシトシン（Ｃ）残基またはチミン（Ｔ）残基である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、[８]または[９]に記載の方法。
[１１]（２）において、
上記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基がグアニン（Ｇ）残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、[８]または[９]に記載の方法。
[１２]（３）において、
上記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基がアデニン（Ａ）残基残基のみである場合、あるいはアデニン（Ａ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、[８]または[９]に記載の方法。
[１３]（４）において、
上記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の性を遺伝的な雄と判定する、[８]または[９]に記載の方法。
[１４]（５）において、
上記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはアデニン（Ａ）である場合、ヒラメ類の性を遺伝的な雄と判定する、[８]または[９]に記載の方法。
[１５]上記同定工程が、上記ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部によりコードされかつ上記ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを核酸増幅法により増幅することを含んでなる、[１]に記載の方法。
[１６]上記ヒラメ類がヒラメ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ある、[１]に記載の方法。
[１７][１]に記載の方法に用いるための核酸分子であって、
ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含み、かつ
上記ポリヌクレオチドが、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列および／またはヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基を含む、核酸分子。
[１８][１]に記載の方法に用いるためのプライマーペアであって、
ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにおいて、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域および／またはエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。
[１９][１７]に記載の核酸分子および／または[１８]に記載のプライマーペアを含んでなる、ヒラメ類の遺伝的な性の識別用キット。
[１]ヒラメ類のａｍｈ（抗ミュラー管ホルモン）遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さおよび／または該ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程を含んでなる、ヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法。
[２]上記ヒラメ類のａｍｈ遺伝子が配列番号１で表されるヌクレオチド配列にコードされるものである、[１]に記載の方法。
[３]上記発現調節領域が、配列番号１で表されるヌクレオチド配列における第１番～第９１１番のヌクレオチド領域内の少なくとも一部である、[２]に記載の方法。
[４]上記発現調節領域のヌクレオチド配列によりコードされるポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを核酸増幅法により増幅することを含んでなる、[１]に記載の方法。
[５]上記発現調節領域を含むヌクレオチド領域をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを電気泳動により検出することを含んでなる、[４]に記載の方法。
[６]上記発現調節領域において、配列番号１の第３６４番～第３７３番および／または第５３５番～第８０８番に対応するヌクレオチド配列を含む領域の欠失が存在する場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、[１]に記載の方法。
[７]上記発現調節領域において、１０ｂｐ以上のヌクレオチド残基の欠失が存在しない場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定する、[１]に記載の方法。
[８]上記一塩基多型に対応するヌクレオチド残基が、以下の（１）～（５）から選択される、[１]に記載の方法：
（１）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基、
（２）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基、
（３）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基、
（４）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基、
（５）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基。
[９]以下のいずれかを同定する工程を含んでなる、[８]に記載の方法。
（１）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（２）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基であるかまたはグアニン（Ｇ）残基であるか、
（３）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはアデニン（Ａ）残基であるか、
（４）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（５）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか。
[１０]（１）において、
上記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基のみである場合、あるいはシトシン（Ｃ）残基またはチミン（Ｔ）残基である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、[８]または[９]に記載の方法。
[１１]（２）において、
上記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基がグアニン（Ｇ）残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、[８]または[９]に記載の方法。
[１２]（３）において、
上記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基がアデニン（Ａ）残基残基のみである場合、あるいはアデニン（Ａ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する、[８]または[９]に記載の方法。
[１３]（４）において、
上記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の性を遺伝的な雄と判定する、[８]または[９]に記載の方法。
[１４]（５）において、
上記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはアデニン（Ａ）である場合、ヒラメ類の性を遺伝的な雄と判定する、[８]または[９]に記載の方法。
[１５]上記同定工程が、上記ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のヌクレオチド配列の少なくとも一部によりコードされかつ上記ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを核酸増幅法により増幅することを含んでなる、[１]に記載の方法。
[１６]上記ヒラメ類がヒラメ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）ある、[１]に記載の方法。
[１７][１]に記載の方法に用いるための核酸分子であって、
ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含み、かつ
上記ポリヌクレオチドが、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列および／またはヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基を含む、核酸分子。
[１８][１]に記載の方法に用いるためのプライマーペアであって、
ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにおいて、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域および／またはエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する領域を核酸増幅法において増幅しうる、プライマーペア。
[１９][１７]に記載の核酸分子および／または[１８]に記載のプライマーペアを含んでなる、ヒラメ類の遺伝的な性の識別用キット。
【0009】
本発明によれば、集団内の遺伝的差異やゲノムの組換えによる影響を受けること無く、正確にヒラメ類の遺伝的な性を識別することができる。また、本発明によれば、性成熟前に生きたままでヒラメ類の遺伝的な性を識別できる。また、本発明によれば、ａｍｈ遺伝子における発現調節領域のヌクレオチド配列の長さや一塩基多型を指標としてヒラメ類の性別を簡易迅速に判別できる。かかる本発明は、雌雄を早期に確定しうることから、養成する親魚の雌雄の尾数の調整や雌雄による出荷時期の調整において特に有利に利用することができる。また、表現型では判定できない遺伝的な雄と性転換した（偽）雄とを区別することができ、全雌生産時の親魚選抜に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】Ａは、ファミリーＡのヒラメ連鎖群９（ＬＧ９）のＰｏｌｉ１８５ＴＵＦのオートラジオグラフ（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈ）である。雄親からの２１２ｂｐの低い方のアレルは、このファミリーの雄が受け継ぐユニークなアレルであった。 Ｂは、ファミリーＡのヒラメ連鎖群９（ＬＧ９）－雄の連鎖地図と、ファミリーＢのヒラメ連鎖群９（ＬＧ９）－雌の連鎖地図である。マーカー間の地図距離をセンチメートル単位（ｃＭ）で示す。ファミリーＡでは点線で囲んだ３５マーカーが性決定遺伝子座に完全連鎖した近い位置にマップされ、ファミリーＢでは点線で囲んだ４６マーカーが完全連鎖した近い位置にマップされた。直線で囲んだ１２マーカーは、ファミリーＡおよびＢで共通に完全連鎖しており、性決定遺伝子座に極近接したマーカーであることが検出された。これにより、この性決定遺伝子座領域に存在する遺伝子が雄から遺伝することにより、子孫が雄になることが証明された。
【図2】ヒラメ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）のＸ染色体連鎖型ａｍｈ遺伝子（Ｘ染色体上のａｍｈをコードする対立遺伝子：以下、「ａｍｈｘ」ともいう）とＹ染色体連鎖型ａｍｈ遺伝子（Ｙ染色体上のａｍｈをコードする対立遺伝子：以下、「ａｍｈｙ」ともいう）の５’上流領域の増幅パターンおよび構造を示す。 Ａは、表現型の雌であるＸＸ個体と雄であるＸＹ個体にてＰＣＲにより増幅したａｍｈｘとａｍｈｙの５’上流領域のアガロースゲル電気泳動の写真である。推定プロモーターが欠失したため、ａｍｈｙバンドはａｍｈｘより短くなる。これにより、遺伝的な性を判別することができる。 Ｂは、ａｍｈｙとａｍｈｘの構造を示す模式図である。５’上流領域における３つのａｍｈｙ特異的欠失、両方の開始コドンおよび停止コドン、エクソン２におけるＳＮＰの位置を示す。エクソン２におけるチミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）はそれぞれａｍｈｙおよびａｍｈｘに遺伝的に強く連鎖していた。１～７の番号を付したボックスはそれぞれの番号を持つエクソン、その間のボックスはイントロンを表す。矢印は、Ａで使用したプライマーの位置を示す。
【図3】Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓの性分化に伴うａｍｈｙ，ａｍｈｘ，ａｍｈｒＩＩ，ｃｙｐ１９ａ１ａ ｍＲＮＡの発現解析の結果を示す。 Ａは、稚魚の体幹におけるｑＲＴ－ＰＣＲによる発現プロファイリングにおいて、ａｍｈｙはＸＹ遺伝子型でのみ特異的に発現し、孵化後２５日目にピークがあったことを示すグラフである。これにより、ＸＹ個体におけるａｍｈｙ特異的な発現が雄化に強く関わっていることが証明された。 Ｂは、稚魚の体幹におけるｑＲＴ－ＰＣＲによる発現プロファイリングにおいて、ａｍｈｘは同時期にはほとんど検出されなかったが、孵化後７０日目と８０日目に弱い発現が検出されたことを示すグラフである。 ＣおよびＤは、同時期のａｍｈｒＩＩ（Ｃ）およびｃｙｐ１９ａ１ａ ｍＲＮＡ（Ｄ）の定量分析の結果を示すグラフである。Ｄにおいて、ｃｙｐ１９ａ１ａのみ性差のある発現が孵化後８０日目のＸＸサンプルで検出された。 Ｅは、性分化開始前後のＸＹ生殖腺に限定したａｍｈリボプローブの空間局在を示す写真である。孵化後１００日目には、生殖細胞が分布してシストを形成するＸＹ生殖腺の腹端でシグナルが認識された。一方で、卵巣腔（ＯＣ）が明瞭なＸＸ生殖腺では、ａｍｈの検出可能なシグナルは見つからなかった。 ＦはＸＹにおけるａｍｈｙとａｍｈｘの発現量とＸＸにおけるａｍｈｘとの関係を示すグラフである。絶対発現量はａｍｈｙより全般的に低いが、なぜかＸＸの個体はＸＹよりａｍｈｘを多く発現していた。差は一元配置分散分析（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）とＴｕｒｋｅｙ ｐｏｓｔテストにより、ｐ＜０．０５で有意とみなした。
【図4】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたａｍｈ変異体ヒラメの作製に関する図である。 Ａの上段は、ａｍｈ遺伝子座を標的としたｃｒＲＮＡの位置を示す模式図である。エクソン（白枠）、非翻訳領域（灰色枠）、イントロン（横線）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるｃｒＲＮＡの標的配列（矢印）を示している。標的配列間の数字は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるおおよその欠失量を示す。 Ａの下段は、野生型ａｍｈと、２つの標的領域の割合が異なる典型的な変異型ａｍｈの塩基配列を示す。下線は２つのｃｒＲＮＡ標的配列を示す。横線は野生型配列、破線は欠失をそれぞれ示す。スラッシュは長い配列の省略を示す。括弧内の数字は、欠失（－）または挿入（＋）の大きさを示す。 Ｂは、孵化後２００日目の野生型およびａｍｈ変異体ヒラメの生殖腺の組織像である。コントロール群では、遺伝的雄性生殖腺は多数の精原細胞を含む典型的な精巣を、遺伝的雌性生殖腺は多数の卵母細胞と卵巣の形態的特徴を示す卵巣腔（ＯＣ）を保有する典型的な卵巣を、それぞれ示している。ａｍｈ変異体では、遺伝的な雄と雌の生殖腺は、多くの卵母細胞と卵巣腔を含む典型的な正常卵巣を示している。スケールバーは５０μｍである。これにより、ａｍｈ遺伝子の機能が、雄化に関わっていることが証明された。
【発明の具体的説明】
【0011】
ヒラメ類の性を識別する方法
本発明のヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法は、ヒラメ類のａｍｈ（抗ミュラー管ホルモン）遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さおよび／または該ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程を含んでなることを特徴とする。
本発明のヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法は、ヒラメ類のａｍｈ（抗ミュラー管ホルモン）遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さおよび／または該ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程を含んでなることを特徴とする。
【0012】
本発明のヒラメ類とは、ヒラメ科とダルマガレイ科も属する魚の総称をいい、好ましくはカレイ目カレイ亜目ヒラメ科の魚類である。好適な例としては、ヒラメ（英名：Ｂａｓｔａｒｄ ｈａｌｉｂｕｔ；Ｏｌｉｖｅ ｆｌｏｕｎｄｅｒ；Ｊａｐａｎｅｓｅ ｆｌｏｕｎｄｅｒ、学名Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）が挙げられる。
【0013】
また、ａｍｈ（Ａｎｔｉ－Ｍｕｌｌｅｒｉｎａ Ｈｏｒｍｏｎｅ：抗ミュラー管ホルモン）はＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）スーパーファミリーに属する糖たんぱく質として知られている。ａｍｈ遺伝子配列における上述のような発現調節領域内の配列長多型および位置の特定の一塩基多型がヒラメ類正確な雌雄判別の指標となることは意外な事実である。
【0014】
本発明の一実施態様によれば、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のヌクレオチド配列は、以下の配列番号１で表されるヌクレオチド配列の少なくとも一部を有するものである。
【0015】
５’－ＧＴＡＴＧＡＡＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＣＡＴＣＧＡＧＧＧＧＡＣＣＣＴＣＴＣＴＡＣＧＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＡＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧＧＡＣＡＡＡＣＴＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＴＡＣＣＡＣＡＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＴＧＣＡＡＴＴＴＣＡＡＣＡＣＴＡＧＡＴＡＴＣＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＡＡＣＣＴＴＴＡＡＧＴＧＧＣＡＴＧＡＴＡＡＡＡＴＡＴＧＡＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＴＧＡＣＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＣＡＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＧＡＧＴＴＡＣＴＴＣＡＡＡＣＴＧＴＡＴＴＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＴＧＴＴＡＣＴＡＣＡＴＴＡＧＧＴＴＡＴＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＴＣＡＣＣＴＣＡＧＧＡＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＴＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＡＡＴＡＣＡＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＡＡＧＴＣＡＴＡＧＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＧＣＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＡＣＡＣＧＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＧＣＧＴＧＴＴＡＧＴＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＡＧＡＡＡＡＡＡＧＧＡＣＴＧＡＣＡＧＣＡＣＧＧＡＣＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＣＧＧＴＧＡＡＧＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＡＣＴＣＣＡＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＡＴＴＣＡＴＧＣＣＣＴＧＴＴＴＧＴＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＡＣＡＴＴＴＧＡＴＧＴＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＴＴＧＣＡＴＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＧＴＣＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＧＡＴＴＣＣＴＣＡＡＡＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＡＧＴＴＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＣＣＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＣＡＣＣＧＴＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＣＣＧＡＣＧＧＴＧＡＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＣＴＧＣＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＣＡＴＣＧＧＧＡＴＣＡＧＴＣＴＴＡＣＴＧＧＡＧＣＴＣＧＣＣＡＡＧＧＡＡＡＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＴＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＡＧＴＧＴＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣＡＡＡＣＡＴＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＧＣＴＴＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＧＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＧＣＧＴＴＴＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＴＡＡＡＧＧＴＧＡＣＧＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＡＣＴＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＡＴＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＣＴＣＴＧＴＴＡＴＡＴＧＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＴＡＧＧＴＧＴＡＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＧＴＧＣＡＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＴＣＴＧＴＧＴＧＣＡＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＣＡＧＴＡＣＡＴＡＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＴＣＡＧＡＣＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＣＴＧＴＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＧＡＴＣＴＧＡＧＴＡＡＧＡＴＣＣＣＡＧＴＴＴＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＧＴＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＡＴＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＣＣＧＡＡＣＣＴＴＡＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＴＧＧＴＧＡＧＡＡＡＴＴＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＡＴＣＡＡＴＡＴＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＧＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＧＴＡＧＡＣＧＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＡＣＡＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＧＣＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＧＡＴＧＴＣＴＴＧＣＣＴＣＡＧＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＴＧＧＧＣＴＴＧＴＣＣＴＣＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＧＧＧＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＣＣＣＡＣＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＴＣＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴＧＣＴＴＣＡＧＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＡＣＴＧＡＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＡＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＴＧＣＧＴＴＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＧＣＡＣＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＧＴＣＴＴＡＴＴＧＴＣＴＡＴＡＧＣＡＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＡＡＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＴＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＧＴＡＡＴＣＣＴＧＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＴＴＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＴＡＣＣＧＣＧＣＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＣＧＴＡＣＣＴＡＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＡＧＧＡＧＴＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＧＣＧＧＧＣＴＣＣＡＡＴＧＡＣＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧＧＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＧＧＣＡＴＣＴＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＡＣＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＴＧＣＡＣＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＧＡＧＡＧＣＧＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＴＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＧＡＡＣＧＡＡＣＡＴＧＧＴＡＣＴＴＡＴＣＴＣＴＣＣＧＴＴＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＧＣＣＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＴＡＴＴＣＡＴＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＡＧＴＴＧＴＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＣＴＧＴＡＧＣＴＴＧＴＴＡＧＡＴＧＡＡＧＴＡＡＧＴＧＴＣＡＴＡＴＧＣＡＣＡＣＴＧＴＴＡＡＴＡＣＡＣＡＴＡＴＴＴＡＴＴＣＡＧＧＧＡＧＧＴＣＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＡＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧＴＴＣＣＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＡＣＴＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＴＡＴＡＣＡＴＧＴＴＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＧＡＴＧＴＴＡＴＧＡＴＴＣＡＡＧＴＡＴＣＡＧＴＡＴＴＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＴＧＴＴＴＧＴＡＡＡＴＣＴＧＴＣＴＴＡＡＧＡＡＧＴＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＧＣＡＣＡＴＴＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＴＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡＴＡＴＧＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＡＴＡＡＡＴＴＴＡＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＴＴＴＣＴＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＣＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡ－３’（配列番号１）
【0016】
配列番号１において、下線部は、上流側から順に、ａｍｈ遺伝子のプロモーター開始地点（配列番号１の第２４１番～第２４９番に相当）、後述する雄における発現制御領域の二つの欠失領域（配列番号１の第３６４番～第３７３番および第５３５番～第８０８番に相当）、開始コドン（配列番号１の第９１２～第９１４番に相当）、開始コドンから第２８９番目、第４９３番目、第６３１番目、第９２４番目、第１４４５番目、第２０１４番目、第２１３４番目、第２５４４番目および第２５４６番目の一塩基多型に対応するヌクレオチド残基（配列番号１の第１２００番、第１４０４番、第１５４２番、第１８３５番、第２３５６番、第２９２５番、第３０４５番、第３４５５番および第３４５７番に相当）を示す。
【0017】
ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さを同定する工程
本発明の一実施態様によれば、ａｍｈ遺伝子の発現調節領域の長さを指標として、ヒラメ類の遺伝的な性を識別することができる。
本発明の一実施態様によれば、ａｍｈ遺伝子の発現調節領域の長さを指標として、ヒラメ類の遺伝的な性を識別することができる。
【0018】
本発明の一実施態様によれば、ヒラメ類の雌雄の指標となる発現調節領域は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列における第１番～第９１１番のヌクレオチド領域内の少なくとも一部または全部の領域（ａｍｈ遺伝子の開始コドンより上流）とされる。配列番号１に示される通り、ａｍｈ遺伝子のプロモーター（配列番号１の第２４１番～第２４９番のヌクレオチド配列：ＡＴＣＡＣＡＡＡＡ）も当該領域内に存在している。
【0019】
本発明の発現調節領域は、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の遺伝的な性の調整に寄与し、雌雄の指標となる限りにおいて領域の長さは適宜設定してよく、配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、通常は第１番～第９１１番、好ましくは第２４１番～第９１１番、より好ましくは第３６４番～第９１１番としてもよい。
【0020】
また、ヒラメ類が遺伝的に雄である場合、aｍｈ遺伝子の発現調節領域は、配列番号１において下線で示される１０残基（配列番号１の第３６４番～第３７３番のヌクレオチド配列：ＴＧＡＣＧＡＴＧＧＣ）と２７４残基（配列番号１の第５３５番～第８０８番のヌクレオチド配列：ＡＴＴＴＡＡＴＡＣＡＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＣＴＧＴＴＴＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＡＡＧＴＣＡＴＡＧＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＣＴＴＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＧＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＡＧＧＴＧＴＧＴＡＡＧＡＧＣＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＧＣＡＧＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＴＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＡＣＡＣＧＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＧＡＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＧＣＧＴＧＴＴＡＧＴＧＡＧＡＡＧ）の領域を欠失することが本発明者らの検討により明らかとなった。したがって、本発明の実施態様によれば、ヒラメ類の雄が有するＹ染色体上のａｍｈをコードする対立遺伝子、すなわち、Ｙ染色体連鎖型ａｍｈ遺伝子の発現調節領域中の上記領域が欠失することを指標として、ヒラメ類の遺伝的な性を簡易かつ迅速に識別することができる。
【0021】
したがって、上記発現調節領域において、配列番号１の第３６４番～第３７３番または第５３５番～第８０８番に対応するヌクレオチド配列を含む領域の欠失が存在する場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する。また、さらなる精度の向上の観点からは、配列番号１の第３６４番～第３７３番および第５３５番～第８０８番に対応するヌクレオチド配列を含む領域の欠失が存在する場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定する。
【0022】
また、本発明の一実施態様によれば、上記発現調節領域において、配列番号１の第３６４番～第３７３番または第５３５番～第８０８番に対応するヌクレオチド配列を含む領域の欠失が存在しない場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定する。また、さらなる精度の向上の観点からは、配列番号１の第３６４番～第３７３番および第５３５番～第８０８番に対応するヌクレオチド配列を含む領域の欠失が存在しない場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定する。
【0023】
本発明の好ましい実施態様によれば、上記発現調節領域の上記欠失が存在する場合、欠失領域の長さは、例えば、配列番号１の第１番～ａｍｈ遺伝子の開始コドン前までの１～９１１ｂｐの範囲であってもよいが、第３６４番～第３７３番および第５３５番～第８０８番のサイズを考慮すれば、１０ｂｐ以上または２７４ｂｐ以上、好ましくは１０～６７１ｂｐまたは２７４～３７７ｂｐ、より好ましいは１０～２８４ｂｐである。
【0024】
本発明では、例えば、被験体であるヒラメ類の個体の一部、例えば鰭（尾鰭、背鰭、胸鰭、腹鰭、尻鰭）、血液、腎臓筋肉などの核が存在する組織から試料を採取し、得られた試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製して得られた核酸試料を用いることができる。また、得られた核酸試料を鋳型として、例えば、後述するプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施し、得られた核酸試料を用いることができる。核酸増幅法としては、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【0025】
したがって、本発明の一実施態様によれば、ヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法は、ａｍｈ遺伝子の上記発現調節領域のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを核酸増幅法により増幅することを含んでなる。かかる実施態様においては、当業者に広く知られた技術常識に従い、核酸増幅法に用いるプライマーおよび核酸増幅の反応条件を適宜選択することができる。
【0026】
本発明の方法の好ましい一つの態様において、核酸増幅法は、ａｍｈ遺伝子の上記発現調節領域のヌクレオチド配列を含む領域を増幅対象とするプライマーのペアを用いて実施することができる。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーは、増幅の対象となる領域の塩基配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域の塩基配列中における５’末端部分の塩基配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖の塩基配列中における５’末端部分の塩基配列を有するものとすることができる。
核酸増幅法等のターゲット領域の検出方法のさらなる詳細は、後述する一塩基多型を同定する工程に準じて実施することができる。
核酸増幅法等のターゲット領域の検出方法のさらなる詳細は、後述する一塩基多型を同定する工程に準じて実施することができる。
【0027】
また、本発明の好ましい実施態様によれば、ヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法は、ａｍｈ遺伝子の上記発現調節領域のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを電気泳動により検出することをさらに含んでなる。電気泳動としては、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等が挙げられる。この場合、上記発現調節領域に対応する特定の長さのポリヌクレオチドのバンドが検出されるか否かにより、ヒラメ類の遺伝的な性を迅速に識別することができる。
【0028】
ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程
本発明の一実施態様によれば、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程を含んでなる。ヒラメ類の遺伝的な性のより正確な識別の観点からは、発現調節領域のヌクレオチド配列の長さと組み合わせて、エクソン２、３、４、６または７における一塩基多型をヒラメ類の遺伝的な性の峻別の指標とすることが好ましい。
本発明の一実施態様によれば、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程を含んでなる。ヒラメ類の遺伝的な性のより正確な識別の観点からは、発現調節領域のヌクレオチド配列の長さと組み合わせて、エクソン２、３、４、６または７における一塩基多型をヒラメ類の遺伝的な性の峻別の指標とすることが好ましい。
【0029】
本発明の一実施態様によれば、エクソン２、３、４、６または７における一塩基多型は、以下の（１）～（５）に相当する。
（１）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２８９番目（エクソン２：配列番号１の第１２００番）、第６３１番目（エクソン３：配列番号１の第１５４２番）、第９２４番目（エクソン３配列番号１の第１８３５番）、第２０１４番目（エクソン７：配列番号１の第２９２５番）または第２１３４番目（エクソン７：配列番号１の第３０４５番）のヌクレオチド残基、
（２）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第４９３番目（エクソン２：配列番号１の第１４０４番）のヌクレオチド残基、
（３）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第１４４５番目（エクソン６：配列番号１の第２３５６番）のヌクレオチド残基、
（４）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４４番目（エクソン７：配列番号１の第３４５５番）のヌクレオチド残基、
（５）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４６番目（エクソン７：配列番号１の第３４５７番）のヌクレオチド残基。
ここで、後述する表８にも示される通り、上記括弧内はヌクレオチド残基が存在するエクソンと配列番号１において相当する番号を示す。
（１）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２８９番目（エクソン２：配列番号１の第１２００番）、第６３１番目（エクソン３：配列番号１の第１５４２番）、第９２４番目（エクソン３配列番号１の第１８３５番）、第２０１４番目（エクソン７：配列番号１の第２９２５番）または第２１３４番目（エクソン７：配列番号１の第３０４５番）のヌクレオチド残基、
（２）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第４９３番目（エクソン２：配列番号１の第１４０４番）のヌクレオチド残基、
（３）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第１４４５番目（エクソン６：配列番号１の第２３５６番）のヌクレオチド残基、
（４）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４４番目（エクソン７：配列番号１の第３４５５番）のヌクレオチド残基、
（５）ａｍｈ遺伝子の開始コドンから第２５４６番目（エクソン７：配列番号１の第３４５７番）のヌクレオチド残基。
ここで、後述する表８にも示される通り、上記括弧内はヌクレオチド残基が存在するエクソンと配列番号１において相当する番号を示す。
【0030】
本発明の一実施態様によれば、ヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法は、以下のいずれかを同定する工程を含んでなる。
（１）開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（２）開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基であるかまたはグアニン（Ｇ）残基であるか、
（３）開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはアデニン（Ａ）残基であるか、
（４）開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（５）開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか。
（１）開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（２）開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基であるかまたはグアニン（Ｇ）残基であるか、
（３）開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはアデニン（Ａ）残基であるか、
（４）開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか、
（５）開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるか。
【0031】
また、本発明の一実施態様によれば、（１）において、
上記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基のみである場合、あるいはシトシン（Ｃ）残基またはチミン（Ｔ）残基である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定することができる。
上記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基のみである場合、あるいはシトシン（Ｃ）残基またはチミン（Ｔ）残基である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定することができる。
【0032】
また、本発明の一実施態様によれば、（２）において、
上記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基がグアニン（Ｇ）残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定することができる。
上記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基がグアニン（Ｇ）残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定することができる。
【0033】
また、本発明の一実施態様によれば、（３）において、
上記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基がアデニン（Ａ）残基残基のみである場合、あるいはアデニン（Ａ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定することができる。
上記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基がアデニン（Ａ）残基残基のみである場合、あるいはアデニン（Ａ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定することができる。
【0034】
また、本発明の一実施態様によれば、（４）において、
上記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の性を遺伝的な雄と判定することができる。
上記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはグアニン（Ｇ）である場合、ヒラメ類の性を遺伝的な雄と判定することができる。
【0035】
また、本発明の一実施態様によれば、（５）において、
上記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはアデニン（Ａ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定することができる。
上記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基のみである場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雌と判定し、
上記開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基がチミン（Ｔ）残基残基のみである場合、あるいはチミン（Ｔ）残基またはアデニン（Ａ）である場合、ヒラメ類の遺伝的な性を雄と判定することができる。
【0036】
また、ヒラメ類の遺伝的な性のより正確な識別の観点からは、（４）または（５）の一塩基多型の遺伝型（ヌクレオチド残基）を指標とすることが好ましく、（５）を指標とすることがより好ましい。
【0037】
本発明では、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定する工程において、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基を含むポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドを核酸増幅法により増幅することが好ましい。
【0038】
核酸増幅法としては、発言制御領域の場合と同様、例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。
【0039】
本発明の方法の好ましい一つの態様において、核酸増幅法は、ヒラメ類のaｍｈ遺伝子の（１）～（５）のいずれかに位置するヌクレオチド残基に対応する残基を含む領域を増幅対象とするプライマーのペアを用いて実施することができる。このようなプライマーペアを構成する２本のプライマーは、増幅の対象となる領域の塩基配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。例えば、プライマーペアの一方のプライマーを、増幅対象領域の塩基配列中における５’末端部分の塩基配列を有するものとし、他方のプライマーを、増幅対象領域の相補鎖の塩基配列中における５’末端部分の塩基配列を有するものとすることができる。
【0040】
上記核酸増幅法を用いる場合、プライマーの鎖長は１５～１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８～５０ヌクレオチド、さらに特に好ましくは１８～４０ヌクレオチドとされる。このような鎖長を有するプライマーは、特に夾雑物を含む核酸試料を用いて核酸増幅法を実施する上で好ましいものである。
【0041】
核酸増幅法により得られた増幅産物の塩基配列の解析は、例えば、シークエンス用プライマーを用いるダイレクトシークエンス法等により容易に行なうことができる。このような方法は当技術分野において周知であり、例えば、市販のキットを用いて実施することができる。
【0042】
また、本発明の方法において、核酸増幅法を用いる場合、アレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、プライマーの一方をヒラメ類のａｍｈ遺伝子（１）～（５）のいずれかに位置するヌクレオチド残基における一塩基多型に対合できるように設計し、他方を（１）～（５）のヌクレオチド残基における一塩基多型を含まない領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に該一塩基多型が存在する場合には増幅産物が得られ、該一塩基多型が存在しない場合には増幅産物が得られない。したがって、この場合には、増幅産物の有無を検出することにより一塩基多型の有無を判定することができる。
【0043】
本発明の方法の別の好ましい一つの態様において、上述の一塩基多型により特定の制限酵素による認識配列が失われるかまたは生成する場合には、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用する方法、例えば、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法を用いることができる。このような方法は、例えば、上述の核酸増幅法において上記制限酵素認識配列を包含する領域を増幅するようなプライマーペアを用い、得られた増幅断片をこの制限酵素で消化した後、得られる断片の数およびそれらの鎖長を調べることにより実施することができる。このような方法は当技術分野において周知であり、当業者であれば、適切な制限酵素、プライマー、増幅反応条件、制限酵素反応条件等を適宜設定することができる。
【0044】
また、本発明の方法の別の好ましい一つの態様において、プローブを用いたハイブリダイゼーション法等により、上記同定工程を実施することができる。このようなプローブは、当該領域の塩基配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。したがって、本発明によれば、当該プローブと被検体であるヒラメ類の個体由来の核酸試料とのハイブリダイゼーションを行ない、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、ヒラメ類の性を識別する方法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在は、ヒラメ類の性決定遺伝子ａｍｈにおける該一塩基多型の存在を示す。このハイブリダイゼーション法を用いる方法は、上述の核酸増幅法を用いる方法により得られる増幅産物である核酸試料に対して適用することもできる。
【0045】
ハイブリダイゼーション法に用いられる場合の、プローブの鎖長は１５～１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、さらに好ましくは１８～５０ヌクレオチド、さらに特に好ましくは１８～４０ヌクレオチドとされる。このような鎖長を有するプローブは、特に夾雑物を含む核酸試料を用いてハイブリダイゼーション法を実施する上で好ましいものである。
【0046】
ハイブリダイゼーション法によるヒラメ類の遺伝的な性の識別に当たっては、ストリンジェントな条件下において、核酸試料と上述のプローブとのハイブリダイゼーションの有無を検出することにより、上記第１６９番目のヌクレオチド残基における一塩基多型を検出することができる。本発明の方法において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。
「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【0047】
核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とこれによる一塩基多型の検出法としては、当技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いることができ、これらの方法の詳細については、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）を参照することができる。
【0048】
本発明の方法において、ハイブリダイゼーション法により一塩基多型を検出する場合、上述のプローブを基板上に固定したＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップと被験体であるヒラメ類の個体由来の核酸試料とをハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ハイブリダイゼーションの有無を検出してもよい。したがって、本発明によれば、上述のプローブを基板上に固定してなる、（１）～（５）のヌクレオチド残基における一塩基多型を検出しうるＤＮＡチップ、さらには、このＤＮＡチップを用いて該一塩基多型を検出する工程を含んでなる、ヒラメ類の遺伝的な性を識別する方法が提供される。本発明において基板に結合させるプローブの鎖長は特に制限されないが、好ましくは１５～１００ヌクレオチド、より好ましくは１５～５０ヌクレオチド、さらに好ましくは１７～２５ヌクレオチドとされる。このようなＤＮＡチップを用いて一塩基多型を検出する技術は当技術分野において周知であり（ポストシークエンスのゲノム科学、第１巻「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」、松原謙一・榊佳之、中山書店、ｐ１２８－１３５、２０００年）、当業者であれば、上述のプローブを用いて適切なＤＮＡチップを作製し、このＤＮＡチップを用いて該一塩基多型を検出することができる。
【0049】
また、本発明の方法の別の一つの態様として、ＳＮａＰｓｈｏｔＴＭ法またはＰｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法などのプライマーエクステンション法、あるいはＴａｑＭａｎＰＣＲ法などの遺伝子型決定法（タイピング法）を用いて上記第１６９番目のヌクレオチド残基における一塩基多型を検出することもできる。これらの手法は当業者に公知であり、その操作手順および使用するプライマーおよび／またはプローブの具体的な塩基配列は、当業者であれば容易に決定することができる。しかしながら、これらに限定されるものではなく、遺伝子の一塩基多型を検出しうる方法であれば、いかなる方法を用いることもできる。
【0050】
核酸分子／プライマーペア
本発明の別の態様として、本発明の方法に用いるための核酸分子が提供される。本発明の好ましい核酸分子は、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含み、かつ
上記ポリヌクレオチドが、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列および／またはヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基を含む。
本発明の別の態様として、本発明の方法に用いるための核酸分子が提供される。本発明の好ましい核酸分子は、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド断片を含み、かつ
上記ポリヌクレオチドが、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列および／またはヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基を含む。
【0051】
本発明の一実施態様によれば、上記核酸分子において、ヒラメ類の雌雄の指標となる発現調節領域は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列における第１番～第９１１番のヌクレオチド領域内の少なくとも一部または全部の領域（ａｍｈ遺伝子の開始コドンより上流）とされる。
【0052】
また、本発明の一実施態様によれば、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の遺伝的な性の指標とする観点から、上記核酸分子において、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドは、配列番号１の第３６４番～第３７３番または第５３５番～第８０８番に対応するヌクレオチド配列を含む領域を含んでなる。
【0053】
また、本発明の一実施態様によれば、上記核酸分子において、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する残基は、以下の（１）～（５）に相当する。
（１）開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基、
（２）開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基、
（３）開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基、
（４）開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基、
（５）開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基。
（１）開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基、
（２）開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基、
（３）開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基、
（４）開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基、
（５）開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基。
【0054】
本発明の好ましい一つの態様において、本発明の核酸分子はハイブリダイゼーション法におけるプローブとして使用することができる。このようなプローブとして用いられる核酸分子は、当該領域の塩基配列に基づいて当業者が適宜設計することができる。ハイブリダイゼーション法におけるプローブとして用いられる場合の、核酸分子の鎖長は上述の通りである。
【0055】
本発明の別の実施態様によれば、本発明の方法に用いるためのプライマーペアが提供される。本発明の別の好ましい実施態様によれば、プライマーペアは、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドまたはこれに相補的なポリヌクレオチドにおいて、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域またはエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応する領域を核酸増幅法において増幅しうる。プライマーの鎖長等の詳細は上述の通りである。
【0056】
試薬／キット
本発明において、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さおよび／または一塩基多型を指標としたヒラメ類の性の識別法を実施するために必要な試薬をまとめてキットとすることができる。
したがって、本発明の一実施態様によれば、ヒラメ類の性の識別のためのキットは、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さを同定しうる試薬を備えたものである。
また、本発明の好ましい実施態様によれば、ヒラメ類の性の識別のためのキットは、ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定しうる試薬を備えたものである。また、本発明のより好ましい実施態様によれば、ヒラメ類の性の識別のためのキットは、以下のいずれかを備えたものである。
（１）ヒラメ類のａｍｈ遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて、開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるかを同定しうる試薬；
（２）ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のコードするポリヌクレオチドにおいて、開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基であるかまたはグアニン（Ｇ）残基であるかを同定しうる試薬；
（３）ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のコードするポリヌクレオチドにおいて、開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはアデニン（Ａ）残基であるかを同定しうる試薬；
（４）ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のコードするポリヌクレオチドにおいて、開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるかを同定しうる試薬；
（５）ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のコードするポリヌクレオチドにおいて、開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるかを同定しうる試薬；
本発明において、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さおよび／または一塩基多型を指標としたヒラメ類の性の識別法を実施するために必要な試薬をまとめてキットとすることができる。
したがって、本発明の一実施態様によれば、ヒラメ類の性の識別のためのキットは、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さを同定しうる試薬を備えたものである。
また、本発明の好ましい実施態様によれば、ヒラメ類の性の識別のためのキットは、ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型を同定しうる試薬を備えたものである。また、本発明のより好ましい実施態様によれば、ヒラメ類の性の識別のためのキットは、以下のいずれかを備えたものである。
（１）ヒラメ類のａｍｈ遺伝子をコードするポリヌクレオチドにおいて、開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基が、シトシン（Ｃ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるかを同定しうる試薬；
（２）ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のコードするポリヌクレオチドにおいて、開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基が、チミン（Ｔ）残基であるかまたはグアニン（Ｇ）残基であるかを同定しうる試薬；
（３）ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のコードするポリヌクレオチドにおいて、開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはアデニン（Ａ）残基であるかを同定しうる試薬；
（４）ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のコードするポリヌクレオチドにおいて、開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基が、グアニン（Ｇ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるかを同定しうる試薬；
（５）ヒラメ類のａｍｈ遺伝子のコードするポリヌクレオチドにおいて、開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基が、アデニン（Ａ）残基であるかまたはチミン（Ｔ）残基であるかを同定しうる試薬；
【0057】
本発明のキットは、上述の本発明による核酸分子および／または本発明によるプライマーペアを試薬として含んでなるものであってもよい。
【0058】
また、本発明のキットは、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子が発現するタンパク質において、ａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列の長さや、ａｍｈ遺伝子中の（１）～（５）のいずれかの一塩基多型に対応するアミノ酸残基の変異を識別し得る抗体を試薬として包含していてもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【0059】
ヒラメ類の性の識別用マーカー／マーカーとしての使用
また、本発明においては、ａｍｈ遺伝子の発現制御領域の長さや上記一塩基多型を同定しうる限りにおいて、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子由来のポリヌクレオチドまたはそれらの断片をブリの性の識別マーカーとして利用することができる。
また、本発明においては、ａｍｈ遺伝子の発現制御領域の長さや上記一塩基多型を同定しうる限りにおいて、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子由来のポリヌクレオチドまたはそれらの断片をブリの性の識別マーカーとして利用することができる。
【0060】
したがって、本発明の別の実施態様によれば、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の発現調節領域のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドからなる、ヒラメ類の遺伝的な性の識別用マーカーが提供される。また、本発明の別の好ましい実施態様によれば、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードし、ａｍｈ遺伝子のエクソン２、３、４、６または７における一塩基多型に対応するヌクレオチド残基を含んでなるポリヌクレオチドからなる、ヒラメ類の遺伝的な性の識別用マーカーが提供される。また、本発明の別のより好ましい実施態様によれば、ヒラメ類のａｍｈ遺伝子の少なくとも一部をコードし、以下のうち少なくとも一つのヌクレオチド残基を含んでなるポリヌクレオチドからなる、ヒラメ類の遺伝的な性の識別用マーカーが提供される。
（１）開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基、
（２）開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基、
（３）開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基、
（４）開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基、
（５）開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基。
（１）開始コドンから第２８９番目、第６３１番目、第９２４番目、第２０１４番目または第２１３４番目のヌクレオチド残基、
（２）開始コドンから第４９３番目のヌクレオチド残基、
（３）開始コドンから第１４４５番目のヌクレオチド残基、
（４）開始コドンから第２５４４番目のヌクレオチド残基、
（５）開始コドンから第２５４６番目のヌクレオチド残基。
【0061】
さらに別の態様によれば、ヒラメ類の遺伝的な性の識別用マーカーとしての、上記いずれかのポリヌクレオチドの使用が提供される。
【0062】
上記核酸分子、プライペア、キット、ヒラメ類の遺伝的な性の識別用マーカーおよびマーカーとしての使用については、本発明のヒラメの識別方法に準じて当業者は好適に実施することができる。
【実施例0063】
以下の実施例に基づいて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0064】
倫理規定
本研究は、東京海洋大学（ＴＵＭＳＡＴ）の「実験動物の飼養および使用に関する指針」にしたがって実施された。東京海洋大学における魚類を用いた実験は、機関指針を遵守する限り特別な許可を必要とせず，本研究も同様である。
本研究は、東京海洋大学（ＴＵＭＳＡＴ）の「実験動物の飼養および使用に関する指針」にしたがって実施された。東京海洋大学における魚類を用いた実験は、機関指針を遵守する限り特別な許可を必要とせず，本研究も同様である。
【0065】
本研究で使用した魚の出所
性連鎖マイクロサテライトマーカーを同定するため、鳥取県水産試験場（日本、鳥取県）において、第二極体の保持（減数分裂性雌性化）により産まれた雌（Ａ－雌：ＸＸ）と、正常な二倍体魚同士の交配により得られた正常雄（Ａ－雄：ＸＹ）によりファミリー（ファミリーＡ）を作成した。幼生は、平均全長２０～５０ｍｍとなった孵化後４１～７０日から低用量のエストロゲン（エストラジオール－１７β；Ｅ２）を投与した（餌重量０．３μｇ／ｇ）。エストロゲン処理の目的は、自然発生的な雌雄逆転を抑制することであった。幼生は水温２０℃の一定条件下で飼育した。孵化から９ヶ月後、生殖腺の目視検査により子孫の性別を決定した。表現型の雌雄の割合はそれぞれ４６．２％（ｎ＝３６）と５３．８％（ｎ＝４２）であった。親とそのＦ１子孫のジェノタイピングにより遺伝地図が構築された。
性連鎖マイクロサテライトマーカーを同定するため、鳥取県水産試験場（日本、鳥取県）において、第二極体の保持（減数分裂性雌性化）により産まれた雌（Ａ－雌：ＸＸ）と、正常な二倍体魚同士の交配により得られた正常雄（Ａ－雄：ＸＹ）によりファミリー（ファミリーＡ）を作成した。幼生は、平均全長２０～５０ｍｍとなった孵化後４１～７０日から低用量のエストロゲン（エストラジオール－１７β；Ｅ２）を投与した（餌重量０．３μｇ／ｇ）。エストロゲン処理の目的は、自然発生的な雌雄逆転を抑制することであった。幼生は水温２０℃の一定条件下で飼育した。孵化から９ヶ月後、生殖腺の目視検査により子孫の性別を決定した。表現型の雌雄の割合はそれぞれ４６．２％（ｎ＝３６）と５３．８％（ｎ＝４２）であった。親とそのＦ１子孫のジェノタイピングにより遺伝地図が構築された。
【0066】
性決定遺伝子座の精密地図を作成するため、ホルモン処理により性転換した雌（Ｂ－雌：ＸＹ）と性転換した雄（Ｂ－雄：ＸＸ）を交配し、マイクロサテライトマーカーＰｏｌｉ３０ＭＨＦＳとＰｏｌｉ３１ＭＨＦＳを用いてスクリーニングした別のファミリー（ファミリーＢ）を作製した。子孫の性別は、生後８ヶ月の生殖腺の目視検査により決定した。マッピングには合計３８のファミリーＢ個体（雄２５、雌１３）を使用した。雌雄を逆転させた個体を用いたのは、雌と雄では組換え率が異なるからである。雌はセントロメア付近で組換え率が高いが、雄はテロメア付近で組換え率が高いのである。我々は、ファミリーＡとファミリーＢを用いた連鎖解析により、Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓの性決定遺伝子座の特徴をより正確に把握することができると期待した。
【0067】
後述するＹ染色体連鎖型ａｍｈ遺伝子（ａｍｈｙ）の有無と表現型性別の関連性解析には、由良川河口域（日本、舞鶴湾）で捕獲された野生稚魚を使用した。稚魚は標準体長５０ｍｍ以上で、野生ですでに表現型の性別が決定されていると思われる。これらの稚魚は地引網で採集され、水産研究・教育機構・養殖研究所・上浦庁舎（大分県）でさらに１年間飼育され、実体顕微鏡による目視で全個体の生殖腺性別を決定した。遺伝子解析のために、各個体の尾鰭からゲノムＤＮＡをフェノール／クロロホルムまたはＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出した。
【0068】
実験魚の飼育条件
遺伝子発現解析用のサンプルは、性決定遺伝子候補のエクソン２に一塩基多型（ＳＮＰ）が存在することから選択した一対の交配から得た（配列決定の項の説明参照）。孵化と稚魚の飼育は、紫外線処理した海水で１８℃、１００日間、一定の光サイクル（１６時間明／８時間暗）の下で行った。幼生・稚魚は孵化後２０日から８０日の間、５日または１０日ごとに計測・サンプリングした（表１参照）。残りの魚はサンプリングし、生殖腺組織学により表現型の性別を決定した（孵化後１００日）。尾鰭は性遺伝子型判定用にエタノールで固定し、体幹は発現解析用にＲＮＡＬａｔｅｒ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．， Ａｕｓｔｉｎ， ＵＳＡ）または４％パラフォルムアルデヒドで固定した。
遺伝子発現解析用のサンプルは、性決定遺伝子候補のエクソン２に一塩基多型（ＳＮＰ）が存在することから選択した一対の交配から得た（配列決定の項の説明参照）。孵化と稚魚の飼育は、紫外線処理した海水で１８℃、１００日間、一定の光サイクル（１６時間明／８時間暗）の下で行った。幼生・稚魚は孵化後２０日から８０日の間、５日または１０日ごとに計測・サンプリングした（表１参照）。残りの魚はサンプリングし、生殖腺組織学により表現型の性別を決定した（孵化後１００日）。尾鰭は性遺伝子型判定用にエタノールで固定し、体幹は発現解析用にＲＮＡＬａｔｅｒ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．， Ａｕｓｔｉｎ， ＵＳＡ）または４％パラフォルムアルデヒドで固定した。
【0069】
【表1】
【0070】
マイクロサテライトマーカーによるジェノタイピングと性決定遺伝子座の連鎖解析
マイクロサテライトジェノタイピングは、０．２ ｐｍｏL／μLの非標識プライマーと０．０３ ｐｍｏL／μLのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ－３３Ｐ］ＡＴＰで末端標識したもの、および１×バッファー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１％ウシ血清アルブミン、０．０２ ＵのＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡからなる１０μL反応溶液で行われた。各マイクロサテライトマーカーには特定のアニーリング温度が使用された。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ(商標)ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）を用い、以下の条件で行った：９５℃での初期変性２分、９５℃３０秒、アニーリング温度１分、７２℃１分、７２℃３分の最終伸長を３５サイクル行った。増幅産物を１０μLのローディングバッファー（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、キシレンシアノール）と混合し、９５℃で１０分間変性させた後、氷上で急冷した。その後、各サンプル２μｌを６％変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１比）にロードした。電気泳動後、ゲルを標準ゲル乾燥機で３０分間乾燥させ、イメージングプレート（ＦＵＪＩＦＩＬＭ、東京、日本）に一晩暴露した。イメージングプレートはＢｉｏ－ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ， ＢＡＳ１０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）でスキャンした。
マイクロサテライトジェノタイピングは、０．２ ｐｍｏL／μLの非標識プライマーと０．０３ ｐｍｏL／μLのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ－３３Ｐ］ＡＴＰで末端標識したもの、および１×バッファー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１％ウシ血清アルブミン、０．０２ ＵのＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅおよび５０ｎｇのテンプレートＤＮＡからなる１０μL反応溶液で行われた。各マイクロサテライトマーカーには特定のアニーリング温度が使用された。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ(商標)ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）を用い、以下の条件で行った：９５℃での初期変性２分、９５℃３０秒、アニーリング温度１分、７２℃１分、７２℃３分の最終伸長を３５サイクル行った。増幅産物を１０μLのローディングバッファー（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、キシレンシアノール）と混合し、９５℃で１０分間変性させた後、氷上で急冷した。その後、各サンプル２μｌを６％変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１比）にロードした。電気泳動後、ゲルを標準ゲル乾燥機で３０分間乾燥させ、イメージングプレート（ＦＵＪＩＦＩＬＭ、東京、日本）に一晩暴露した。イメージングプレートはＢｉｏ－ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ， ＢＡＳ１０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）でスキャンした。
【0071】
日本産ヒラメの性決定遺伝子座を同定するための連鎖解析は、３つのステップで行われた。ステップ１では、Ａ家４４個体（雄２２個体、雌２２個体）の６３個のマイクロサテライトマーカーの父方遺伝対立遺伝子の分離を解析し、性連鎖の有無を検討した。これらのマーカーは、日本産ヒラメの遺伝的連鎖地図のすべての連鎖群（ＬＧ）を代表するように選択された。これらのマーカーのうち、父方に遺伝する対立遺伝子の分離を解析し、雌雄連鎖の有無を調べた。各遺伝子座の遺伝子型と表現型の性との連鎖は、Ｍａｐ Ｍａｎａｇｅｒ ＱＴソフトウェアプログラムを用いて検定した。ＬＯＤスコアが３．０を超えるマーカーを性連鎖の可能性があるマーカーとした。ステップ２では、性連鎖マーカーと、同じＬＧにマッピングされた他のマーカーを用いて、ファミリーＡの全個体（雄４２個体、雌３６個体）の遺伝子型を決定した。ステップ３では、性決定遺伝子座の精密マッピングのために、同じＬＧ（ＬＧ ９）上の５９個のマーカーを用いて、ファミリーＢの個体（雄２５個体、雌１３個体）の遺伝子型決定を行った。地図はＭａｐＣｈａｒｔ ｖ２．０ を用いて作成した。
【0072】
性連鎖マイクロサテライトマーカーを含むスキャフォールドの塩基配列解析
若狭湾の野生個体群から捕獲したヒラメのドラフトゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄｓとＰａｃＢｉｏ ｌｏｎｇ ｒｅａｄｓを用いた全ゲノムショットガンアセンブリによって構築した。このゲノムアセンブリは、ＤＤＢＪのデータベースにアクセッション番号ＢＲＶＫ０１０００００１－ＢＲＶＫ０１００２７９０で登録されている。
若狭湾の野生個体群から捕獲したヒラメのドラフトゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｓｈｏｒｔ ｒｅａｄｓとＰａｃＢｉｏ ｌｏｎｇ ｒｅａｄｓを用いた全ゲノムショットガンアセンブリによって構築した。このゲノムアセンブリは、ＤＤＢＪのデータベースにアクセッション番号ＢＲＶＫ０１０００００１－ＢＲＶＫ０１００２７９０で登録されている。
【0073】
性連鎖マイクロサテライトマーカーは、ＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．，Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．，１９９０．Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５，４０３-４１０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ００２２－２８３６（０５）８０３６０－２）を用いて、Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓ ゲノムのドラフトスキャフォールドと比較した。その結果、Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓゲノムを構成する遺伝子が特定され、その遺伝子は ＧＥＮＳＣＡＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｇｉｓｈ， Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．，Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．， １９９０． Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２１５，４０３-４１０． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ００２２－２８３６（０５）８０３６０－２）によって解析された。同定された遺伝子の潜在的な役割は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのアノテーションに基づいて推測された（２０２１．ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ ｉｎ ２０２１． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４９，Ｄ４８０-Ｄ４８９． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋａａ１１００）。
【0074】
再シーケンスと性連鎖ＳＮＰｓのスクリーニング
野生捕獲Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓ １７個体のゲノムをＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘプラットフォームで１５０－ｂｐペアエンドリードで配列決定した。ライブラリーの構築と配列決定は、ＢＧＩ（中国、深セン）が行った。低品質配列はＴｒｉｍｏｍａｔｉｃ ｖ３．６（Ｂｏｌｇｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．，Ｕｓａｄｅｌ，Ｂ．２０１４．Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ：Ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｒｉｍｍｅｒ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０： ２１１４-２１２０． ｐｍｉｄ：２４６９５４０４）を用いて切り落とし、ＢＷＡ－ｍｅｍ ｖ０．７．１２（Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ， ２００９）を用いてデフォルトパラメータで参照としてａｍｈ含有スキャフォールド（７８６．９２０ ｂｐ）に対してマッピングを行った。ＳＮＰ検出はＳａｍｔｏｏｌｓ ｍｐｉｌｅｕｐ（Ｇａｒｒｉｓｏｎ， Ｅ．， Ｍａｒｔｈ， Ｇ． ２０１２． Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｒｉａｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｈｏｒｔ－ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． ａｒＸｉｖ：３９０７ｖ２ ２０１２．）を用い、ｍｉｎｉｍｕｍ ｃｏｖｅｒａｇｅ＝１０， ｍａｘｉｍｕｍ ｃｏｖｅｒａｇｅ＝５０のパラメータで実施した。ＶｃｆｌｉｂソフトウェアのＶｃｆｆｉｌｔｅｒを用いて低品質配列に由来する変異を除去した後、ＶＣＦｔｏｏｌｓを用いて高精度多型をパラメータｍａｃ７，ｍａｘ０ｍａｃ７，ｍａｘ－ｍｉｓｓｉｎｇ－ｃｏｕｎｔ ０でフィルタリングした（Ｄａｎｅｃｅｋ，Ｐ．，Ａｕｔｏｎ，Ａ．，Ａｂｅｃａｓｉｓ，Ｇ．，Ａｌｂｅｒｓ，Ｃ．Ａ．，Ｂａｎｋｓ， Ｅ．，ＤｅＰｒｉｓｔｏ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｎｄｓａｋｅｒ， Ｒ．Ｅ．，Ｌｕｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｍａｒｔｈ，Ｇ．Ｔ．，Ｓｈｅｒｒｙ，Ｓ．Ｔ．，ＭｃＶｅａｎ，Ｇ．，Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．２０１１．Ｔｈｅ ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌ ｆｏｒｍａｔ ａｎｄ ＶＣＦｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７，２１５６-２１５８．１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ３３０）。
野生捕獲Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓ １７個体のゲノムをＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘプラットフォームで１５０－ｂｐペアエンドリードで配列決定した。ライブラリーの構築と配列決定は、ＢＧＩ（中国、深セン）が行った。低品質配列はＴｒｉｍｏｍａｔｉｃ ｖ３．６（Ｂｏｌｇｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．，Ｕｓａｄｅｌ，Ｂ．２０１４．Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ：Ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｔｒｉｍｍｅｒ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０： ２１１４-２１２０． ｐｍｉｄ：２４６９５４０４）を用いて切り落とし、ＢＷＡ－ｍｅｍ ｖ０．７．１２（Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ， ２００９）を用いてデフォルトパラメータで参照としてａｍｈ含有スキャフォールド（７８６．９２０ ｂｐ）に対してマッピングを行った。ＳＮＰ検出はＳａｍｔｏｏｌｓ ｍｐｉｌｅｕｐ（Ｇａｒｒｉｓｏｎ， Ｅ．， Ｍａｒｔｈ， Ｇ． ２０１２． Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｒｉａｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｈｏｒｔ－ｒｅａｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． ａｒＸｉｖ：３９０７ｖ２ ２０１２．）を用い、ｍｉｎｉｍｕｍ ｃｏｖｅｒａｇｅ＝１０， ｍａｘｉｍｕｍ ｃｏｖｅｒａｇｅ＝５０のパラメータで実施した。ＶｃｆｌｉｂソフトウェアのＶｃｆｆｉｌｔｅｒを用いて低品質配列に由来する変異を除去した後、ＶＣＦｔｏｏｌｓを用いて高精度多型をパラメータｍａｃ７，ｍａｘ０ｍａｃ７，ｍａｘ－ｍｉｓｓｉｎｇ－ｃｏｕｎｔ ０でフィルタリングした（Ｄａｎｅｃｅｋ，Ｐ．，Ａｕｔｏｎ，Ａ．，Ａｂｅｃａｓｉｓ，Ｇ．，Ａｌｂｅｒｓ，Ｃ．Ａ．，Ｂａｎｋｓ， Ｅ．，ＤｅＰｒｉｓｔｏ，Ｍ．Ａ．，Ｈａｎｄｓａｋｅｒ， Ｒ．Ｅ．，Ｌｕｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｍａｒｔｈ，Ｇ．Ｔ．，Ｓｈｅｒｒｙ，Ｓ．Ｔ．，ＭｃＶｅａｎ，Ｇ．，Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．２０１１．Ｔｈｅ ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌ ｆｏｒｍａｔ ａｎｄ ＶＣＦｔｏｏｌｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２７，２１５６-２１５８．１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｒ３３０）。
【0075】
ａｍｈ遺伝子のＳＮＰを検出するため、野生捕獲したＰ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓ（雌２０、雄８）を用いて直接塩基配列の解析を行った。ＰＣＲ断片を特定のプライマーを用いて増幅し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００キャピラリーシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）上でＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法を用いて塩基配列を決定した。配列はＧＥＮＥＴＹＸ ｖ１２．０（ＧＥＮＥＴＹＸ， 東京， 日本）を用いて解析した。
【0076】
ＸＸ型およびＸＹ型のＰ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓにおけるａｍｈの比較配列解析
ａｍｈ遺伝子のエクソン、イントロン、５′および３′－フランキング領域を含む配列を増幅するために、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＸＸおよびＸＹ魚の尾鰭からＤＮＡが抽出された。ＰＣＲは、Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）と以下の表２に示すプライマーを用いて、総量１０μｌで行った。増幅はＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ Ｔ ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ＢＡＳＩＣ ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ （Ｂｉｏｍｅｔｒａ ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。断片をゲルから切り出し、精製し、ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローン化した。配列決定は前のセクションで述べたように行った。
ａｍｈ遺伝子のエクソン、イントロン、５′および３′－フランキング領域を含む配列を増幅するために、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＸＸおよびＸＹ魚の尾鰭からＤＮＡが抽出された。ＰＣＲは、Ｅｘ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）と以下の表２に示すプライマーを用いて、総量１０μｌで行った。増幅はＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ Ｔ ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ＢＡＳＩＣ ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ （Ｂｉｏｍｅｔｒａ ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。断片をゲルから切り出し、精製し、ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローン化した。配列決定は前のセクションで述べたように行った。
【0077】
【表2】
【0078】
ＲＡＣＥ－ＰＣＲによる３′非翻訳領域
ａｍｈｙの５′および３′非翻訳領域を単離するために、ａｍｈを発現する遺伝的雄稚魚（孵化後５５日）の生殖腺を使用した。Ｘ特異的ａｍｈ遺伝子（ａｍｈｘ）の５′および３′非翻訳領域を単離するために、ＸＸ成熟雌の卵巣組織を使用した。抽出したＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴ ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ） Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＵＳＡ） を用いて逆転写し、製造者の指示にしたがって以下の表３に示したプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲで増幅された断片は、前のセクションで説明したように、クローン化され、配列決定された。
ａｍｈｙの５′および３′非翻訳領域を単離するために、ａｍｈを発現する遺伝的雄稚魚（孵化後５５日）の生殖腺を使用した。Ｘ特異的ａｍｈ遺伝子（ａｍｈｘ）の５′および３′非翻訳領域を単離するために、ＸＸ成熟雌の卵巣組織を使用した。抽出したＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴ ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ） Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＵＳＡ） を用いて逆転写し、製造者の指示にしたがって以下の表３に示したプライマーを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲで増幅された断片は、前のセクションで説明したように、クローン化され、配列決定された。
【0079】
【表3】
【0080】
ａｍｈ遺伝子の５′上流領域増幅による性遺伝子型判定
尾鰭試料を５０ ｍＭ ＮａＯＨで９５℃、５分間処理し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した後、短時間遠心分離してＤＮＡ鋳型を単離した。ＤＮＡを含む水相を、ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏ（東洋紡績、大阪、日本）およびプライマーａｍｈＦｗ１ ５′－ＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＴＴＧＣＡＣＡＧＣ－３′（配列番号２６）およびａｍｈＲｖ１ ５′－ＣＴＴＧＡＣＡＡＡＣＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＴＡ－３′（配列番号２７）を用いて以下の条件で遺伝子型判定に使用した。９４℃で２分間の初期変性、９５℃で３０秒、６４℃で３０秒、６８℃で１分の３５サイクル、６８℃で３分間の最終伸長。増幅産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で可視化した。２本のバンド（９３１ ｂｐと６８７ ｂｐ）を有する試料を遺伝子型雄（ＸＹ）とし、１本のバンド（９３１ ｂｐ）を有する試料を遺伝子型雌（ＸＸ）としてスコアリングを行った。
尾鰭試料を５０ ｍＭ ＮａＯＨで９５℃、５分間処理し、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した後、短時間遠心分離してＤＮＡ鋳型を単離した。ＤＮＡを含む水相を、ＫＯＤ Ｆｘ Ｎｅｏ（東洋紡績、大阪、日本）およびプライマーａｍｈＦｗ１ ５′－ＡＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＴＴＧＣＡＣＡＧＣ－３′（配列番号２６）およびａｍｈＲｖ１ ５′－ＣＴＴＧＡＣＡＡＡＣＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＴＡ－３′（配列番号２７）を用いて以下の条件で遺伝子型判定に使用した。９４℃で２分間の初期変性、９５℃で３０秒、６４℃で３０秒、６８℃で１分の３５サイクル、６８℃で３分間の最終伸長。増幅産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色で可視化した。２本のバンド（９３１ ｂｐと６８７ ｂｐ）を有する試料を遺伝子型雄（ＸＹ）とし、１本のバンド（９３１ ｂｐ）を有する試料を遺伝子型雌（ＸＸ）としてスコアリングを行った。
【0081】
ｑＲＴ－ＰＣＲによる性分化期の発現解析
ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｋ．Ｋ．，東京，日本）を用いて、製造者の指示にしたがって稚魚の体幹からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽 出した。ＲＮＡサンプル（１μｇ）をデオキシリボヌクレアーゼＩ増幅グレード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてオリゴ（ｄＴ）１２－１８で製造業者の指示にしたがって逆転写を行った。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、ａｍｈｙとａｍｈｘ の両方に対応する Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）と特異的 ＴａｑＭａｎ ｍｉｎｏｒ－ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ（ＭＧＢ）プローブまたはｃｙｐ１９ａ１ａとａｍｈｒＩＩのＴＢ Ｇｒｅｅｎ（商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）（共にタカラバイオインチ、日本、滋賀）を用いて２０μｌ の反応量で行った。増幅は１μｌの一次鎖ｃＤＮＡ（約２５ｎｇ）と５ｐｍｏｌの各プライマーを用いて、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）で行われた。転写量は、４つの希釈点を持つ標準曲線法を用いて定量し、ｅｌｆ１ａの値に対して正規化した。
ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｋ．Ｋ．，東京，日本）を用いて、製造者の指示にしたがって稚魚の体幹からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽 出した。ＲＮＡサンプル（１μｇ）をデオキシリボヌクレアーゼＩ増幅グレード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてオリゴ（ｄＴ）１２－１８で製造業者の指示にしたがって逆転写を行った。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）は、ａｍｈｙとａｍｈｘ の両方に対応する Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）と特異的 ＴａｑＭａｎ ｍｉｎｏｒ－ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ（ＭＧＢ）プローブまたはｃｙｐ１９ａ１ａとａｍｈｒＩＩのＴＢ Ｇｒｅｅｎ（商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（商標）（共にタカラバイオインチ、日本、滋賀）を用いて２０μｌ の反応量で行った。増幅は１μｌの一次鎖ｃＤＮＡ（約２５ｎｇ）と５ｐｍｏｌの各プライマーを用いて、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）で行われた。転写量は、４つの希釈点を持つ標準曲線法を用いて定量し、ｅｌｆ１ａの値に対して正規化した。
【0082】
組織学的性比の決定とｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによるａｍｈ転写産物の局在化
実験期間終了後に稚魚の体幹を採取し、４％パラホルムアルデヒド溶液で一晩固定した後、昇順エタノール系列で脱水し、無水エタノールで保存した。試料はＰａｒａｐｌａｓｔ Ｐｌｕｓ（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ） に包埋し、厚さ６ μｍで横方向に切り出し、スライドグラスにマウントした。切片はヘマトキシリン・エオジンで染色し、顕微鏡で観察して生殖腺の性別を判定した。
生殖腺の組織分化が始まる前（３５日後）と後（１００日後）に採取した稚魚を用い、先に述べた手順でｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った（３４）。プローブは、以前の研究（３５）で使用したものと同じプライマーを用いて合成した。ハイブリダイゼーションは、横切片を６３℃で一晩行った。ＮＢＴ／ＢＣＩＰを製造者の推奨にしたがってシグナル検出に使用した（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｃｈｗｅｉｚ）。
実験期間終了後に稚魚の体幹を採取し、４％パラホルムアルデヒド溶液で一晩固定した後、昇順エタノール系列で脱水し、無水エタノールで保存した。試料はＰａｒａｐｌａｓｔ Ｐｌｕｓ（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＵＳＡ） に包埋し、厚さ６ μｍで横方向に切り出し、スライドグラスにマウントした。切片はヘマトキシリン・エオジンで染色し、顕微鏡で観察して生殖腺の性別を判定した。
生殖腺の組織分化が始まる前（３５日後）と後（１００日後）に採取した稚魚を用い、先に述べた手順でｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った（３４）。プローブは、以前の研究（３５）で使用したものと同じプライマーを用いて合成した。ハイブリダイゼーションは、横切片を６３℃で一晩行った。ＮＢＴ／ＢＣＩＰを製造者の推奨にしたがってシグナル検出に使用した（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｃｈｗｅｉｚ）。
【0083】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９によるａｍｈ遺伝子の機能欠損
合成ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、株式会社ファスマック（日本、神奈川県）より入手した。ａｍｈに対する２つのｃｒＲＮＡの配列は、Ｔａｒｇｅｔ １ ５′－ＣＵＡＵＣＵＧＣＡＧＣＵＣＧＵＡＧＵＡｇｕｕａｇｃｕａｕｇｕｕｇｕｕｇ－３′（配列番号２８）および Ｔａｒｇｅｔ ２ ５′－ＡＡＵＵＡＡＡＡＡＧＣＡＣＡＵＵＵＧｇｕｕａｇｃｕａｕｇｕｕｇｕｕｇ－３′（配列番号２９）であった。これらの配列は、Ｓａｗａｍｕｒａら（Ｓａｗａｍｕｒａ，Ｒ．，Ｏｓａｆｕｎｅ，Ｎ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ， Ｆ．， Ｋｉｔａｎｏ， Ｔ． ２０１７．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ Ｆ０ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｍｅｄａｋａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ｇｅｎｅ． Ｃｅｌｌ ２２，７５６－７６３．ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｇｔｃ．１２５１１．）に基づき設計された。種類のｃｒＲＮＡ（２５０ｎｇ／μＬ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（５００ｎｇ／μＬ）およびＣａｓ９タンパク質（７５０ｎｇ／μＬ；富山、日本原産）を混合し、マイクロインジェクター（ＩＭ－９Ｂ、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ、東京、日本）を用いて直ちに受精卵に注入した。実験対照として、２種類のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含まないＣａｓ９タンパク質を注入した。
合成ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、株式会社ファスマック（日本、神奈川県）より入手した。ａｍｈに対する２つのｃｒＲＮＡの配列は、Ｔａｒｇｅｔ １ ５′－ＣＵＡＵＣＵＧＣＡＧＣＵＣＧＵＡＧＵＡｇｕｕａｇｃｕａｕｇｕｕｇｕｕｇ－３′（配列番号２８）および Ｔａｒｇｅｔ ２ ５′－ＡＡＵＵＡＡＡＡＡＧＣＡＣＡＵＵＵＧｇｕｕａｇｃｕａｕｇｕｕｇｕｕｇ－３′（配列番号２９）であった。これらの配列は、Ｓａｗａｍｕｒａら（Ｓａｗａｍｕｒａ，Ｒ．，Ｏｓａｆｕｎｅ，Ｎ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ， Ｆ．， Ｋｉｔａｎｏ， Ｔ． ２０１７．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ Ｆ０ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｍｅｄａｋａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ｇｅｎｅ． Ｃｅｌｌ ２２，７５６－７６３．ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｇｔｃ．１２５１１．）に基づき設計された。種類のｃｒＲＮＡ（２５０ｎｇ／μＬ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（５００ｎｇ／μＬ）およびＣａｓ９タンパク質（７５０ｎｇ／μＬ；富山、日本原産）を混合し、マイクロインジェクター（ＩＭ－９Ｂ、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ、東京、日本）を用いて直ちに受精卵に注入した。実験対照として、２種類のｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含まないＣａｓ９タンパク質を注入した。
【0084】
人工受精、マイクロインジェクション、実験魚の飼育は、独立行政法人水産研究・教育機構南勢フィールドステーションで行った。卵と精子は、３歳の雌と雄のものを使用した。これらの卵と精子をプラスチックビーカーサンプラーで混合し、滅菌海水（１８℃）で活性化し、人工受精を行った。２００日後に各魚から生殖腺を分離し、片方の小葉は組織学的分析に、もう片方は性遺伝子型判定に使用した。すべての魚は、２－フェノキシエタノール（和光ケミカルズ）の過量投与によって完全に安楽死させたことを確認した後、サンプリングした。
【0085】
変異の塩基配列解析
単離した生殖腺からＩＳＯＧＥＮ（商標）（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）を用いて、メーカーの説明書にしたがってゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＰＣＲはＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、以下のａｍｈ特異的プライマーを用いて行った。Ｆｏｒｗａｒｄ ５′－ＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣ－３′（配列番号３０）およびＲｅｖｅｒｓｅ ５′－ＡＴＴＡＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧ－３′（配列番号３１）。ＰＣＲ条件は、９５℃２分の予熱、９５℃１５秒、５９℃３０秒、７２℃２分の３５サイクル、７２℃５分の最終伸長であった。増幅されたＰＣＲ断片は、ＴＡ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ，東京、日本）を用いてサブクローニングした後、前述のように塩基配列を決定した。
単離した生殖腺からＩＳＯＧＥＮ（商標）（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ社）を用いて、メーカーの説明書にしたがってゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＰＣＲはＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、以下のａｍｈ特異的プライマーを用いて行った。Ｆｏｒｗａｒｄ ５′－ＴＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣ－３′（配列番号３０）およびＲｅｖｅｒｓｅ ５′－ＡＴＴＡＧＣＴＧＴＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧ－３′（配列番号３１）。ＰＣＲ条件は、９５℃２分の予熱、９５℃１５秒、５９℃３０秒、７２℃２分の３５サイクル、７２℃５分の最終伸長であった。増幅されたＰＣＲ断片は、ＴＡ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ，東京、日本）を用いてサブクローニングした後、前述のように塩基配列を決定した。
【0086】
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ）を用いて、遺伝子発現について一元配置分散分析とＴｕｋｅｙ検定により群間差の有意性を決定した。差は、ｐ＜０．０５で統計的に有意であるとみなされた。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ）を用いて、遺伝子発現について一元配置分散分析とＴｕｋｅｙ検定により群間差の有意性を決定した。差は、ｐ＜０．０５で統計的に有意であるとみなされた。
【0087】
【0088】
【表4】
【0089】
ファミリーＡの全個体について、連鎖解析のステップ１で同定した性連鎖マーカーとＬＧ ９の追加マイクロサテライトマーカーを用いたところ、ファミリーＡでは組換えのない性決定遺伝子座と完全に連鎖するマーカーが２９個見つかった。ファミリーＢを用いたファインマッピングでは、組換えのない性決定遺伝子座と完全に連鎖した４６マーカーを同定した。その中で、性決定遺伝子座と完全に連鎖し、両家で共通しているマーカーを１２個検出した（図１Ｂ、表２）。
【0090】
性連鎖型マイクロサテライトマーカーを含むスキャフォールドの塩基配列解析
Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓのゲノムアセンブリから、１，０００ｂｐ以上の長さのスキャフォールドが２，７９０個得られた。最長スカフォールドは１．８１Ｍｂ、Ｎ５０は３５７．０ ｋｂ、平均スカフォールド長は２１７．０ｋｂ、アセンブリのサイズは６０５．６Ｍｂであった。１２個の性連鎖性マイクロサテライトマーカーは、１１個のスキャフォールドに分布していた（表２）。
Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓのゲノムアセンブリから、１，０００ｂｐ以上の長さのスキャフォールドが２，７９０個得られた。最長スカフォールドは１．８１Ｍｂ、Ｎ５０は３５７．０ ｋｂ、平均スカフォールド長は２１７．０ｋｂ、アセンブリのサイズは６０５．６Ｍｂであった。１２個の性連鎖性マイクロサテライトマーカーは、１１個のスキャフォールドに分布していた（表２）。
【0091】
【表5】
【0092】
これらのスキャフォールドには、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのアノテーションに基づき、合計１８１個の遺伝子が予測された（表６）。このうち、ａｍｈ遺伝子は、一部の硬骨魚類における雄性決定への関与が報告されていることから、この遺伝子を選択した。
【0093】
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【表6-4】
【表6-5】
【表6-6】
【0094】
ＳＮＰと性表現型との連鎖解析
ａｍｈ遺伝子に６９個のＳＮＰを検出し、そのうち１５個が雄性と強く関連していた（表７）。
ａｍｈ遺伝子に６９個のＳＮＰを検出し、そのうち１５個が雄性と強く関連していた（表７）。
【0095】
【表7】
【0096】
ＸＸおよびＸＹ個体におけるａｍｈ遺伝子のコーディング領域および非コーディング領域の詳細な解析により、エクソン２、３、４、６、７に９つのＳＮＰマーカーが検出されたが、いずれも非同義置換ではなかった（表８）。
【0097】
【表8】
【0098】
ａｍｈ遺伝子のプロモーター領域におけるサイズ多型
開始コドンから５′上流の領域を増幅し、生成物をゲル電気泳動したところ、バンドパターンに性特異的多型が見られた；遺伝的雌は１本のバンドを持ち、遺伝的雄は２本のバンドを持った。雄の２本のバンドのうち１本は雌のバンドと同じ大きさであり、もう１本のバンドはやや短かった（図２Ａ）。配列解析の結果、雄特有のバンドは、２７４ｂｐ、１０ｂｐ、２７ｂｐまたは３２ｂｐの３つのセグメントで、それぞれ－１４ｂｐ、－４４９ｂｐ、－９７２ｂｐの位置に欠損があった（この位置は、参照として用いたａｍｈｘの遺伝子配列に対応する；図２Ｂ）。ａｍｈｙとａｍｈｘのコード領域の配列はほぼ同一であり、推定プロモーターが異なるａｍｈの２つの対立遺伝子が存在し、エクソンの一部で検出されたＳＮＰは同義置換であるため理論的には同一のタンパク質をコードしていることを示している。本研究で提供したＰ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓゲノムデータベースとの検索により、他の染色体にはａｍｈのホモログは確認されなかった。
開始コドンから５′上流の領域を増幅し、生成物をゲル電気泳動したところ、バンドパターンに性特異的多型が見られた；遺伝的雌は１本のバンドを持ち、遺伝的雄は２本のバンドを持った。雄の２本のバンドのうち１本は雌のバンドと同じ大きさであり、もう１本のバンドはやや短かった（図２Ａ）。配列解析の結果、雄特有のバンドは、２７４ｂｐ、１０ｂｐ、２７ｂｐまたは３２ｂｐの３つのセグメントで、それぞれ－１４ｂｐ、－４４９ｂｐ、－９７２ｂｐの位置に欠損があった（この位置は、参照として用いたａｍｈｘの遺伝子配列に対応する；図２Ｂ）。ａｍｈｙとａｍｈｘのコード領域の配列はほぼ同一であり、推定プロモーターが異なるａｍｈの２つの対立遺伝子が存在し、エクソンの一部で検出されたＳＮＰは同義置換であるため理論的には同一のタンパク質をコードしていることを示している。本研究で提供したＰ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓゲノムデータベースとの検索により、他の染色体にはａｍｈのホモログは確認されなかった。
【0099】
ａｍｈｙと雄の表現型との関連性解析
ａｍｈｙの有無によって遺伝子型の性別が推定される雌雄を用いた関連性解析では、マイクロサテライトマーカーの同定に用いた飼育個体の表現型の性別および遺伝子型と完全な関連性が認められた。また、日本海の舞鶴湾で捕獲された野生個体においても、雌２０匹がａｍｈｙ陰性、雄８匹がａｍｈｙ陽性であり、完全な関連が確認された。Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓがＸＸ－ＸＹ性決定システムを持つことを考えると、最初の対立遺伝子はＹ染色体上にあり、その反対はＸ染色体上にあると推測される。このため、薄い方のバンドをＹ染色体連鎖型ａｍｈ遺伝子（ａｍｈｙ）、１つ上のバンドをＸ染色体連鎖型ａｍｈ遺伝子（ａｍｈｘ）と名づけた。エクソン２の３９ｂｐに見つかった同義のＳＮＰは、ａｍｈｙ特異的欠失のうちの２つと高い相関を示した。
なお、後述する図３においてａｍｈ遺伝子の発現解析をする際に、遺伝子発現後（ｍＲＮＡの状態）は、発現調節領域内の塩基配列長多型は検出できないが、ａｍｈｙおよびａｍｈｘに連鎖したエクソン２のチミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）の多型により、ａｍｈｙ、ａｍｈｘのどちらが発現しているかを識別できることから、図３の解析に用いられた。
ａｍｈｙの有無によって遺伝子型の性別が推定される雌雄を用いた関連性解析では、マイクロサテライトマーカーの同定に用いた飼育個体の表現型の性別および遺伝子型と完全な関連性が認められた。また、日本海の舞鶴湾で捕獲された野生個体においても、雌２０匹がａｍｈｙ陰性、雄８匹がａｍｈｙ陽性であり、完全な関連が確認された。Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓがＸＸ－ＸＹ性決定システムを持つことを考えると、最初の対立遺伝子はＹ染色体上にあり、その反対はＸ染色体上にあると推測される。このため、薄い方のバンドをＹ染色体連鎖型ａｍｈ遺伝子（ａｍｈｙ）、１つ上のバンドをＸ染色体連鎖型ａｍｈ遺伝子（ａｍｈｘ）と名づけた。エクソン２の３９ｂｐに見つかった同義のＳＮＰは、ａｍｈｙ特異的欠失のうちの２つと高い相関を示した。
なお、後述する図３においてａｍｈ遺伝子の発現解析をする際に、遺伝子発現後（ｍＲＮＡの状態）は、発現調節領域内の塩基配列長多型は検出できないが、ａｍｈｙおよびａｍｈｘに連鎖したエクソン２のチミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）の多型により、ａｍｈｙ、ａｍｈｘのどちらが発現しているかを識別できることから、図３の解析に用いられた。
【0100】
性分化に伴うａｍｈｙの発現解析
ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現解析では、ＸＹサンプルでは孵化後２０日から８０日にかけてａｍｈｙの転写物が検出され、２５日にピークがあった（図３Ａ）。一方、ａｍｈｘ ｍＲＮＡの発現は両遺伝子型において同時期に非常に低いか検出されなかった（図３Ｂ）。ａｍｈｒＩＩの発現は２５日齢から検出され、５５日齢以降徐々に増加した（図３Ｃ）。ｃｙｐ１９ａ１ａの発現は孵化後６０日目から増加し、ＸＸサンプルでは孵化後６５日目から発現が増加することがわかった（図３Ｄ）。ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによるａｍｈ ｍＲＮＡの局在解析では、ＸＹ遺伝子型においてのみ生殖腺性分化前および性分化中の生殖腺に陽性シグナルが認められた（図３Ｅおよび図３Ｆ）。孵化後３５日目には推定セルトリ細胞にシグナルが検出されたが、精巣分化の特徴が明確に検出される孵化後１００日目には、生殖腺腹側の生殖細胞のシストを取り囲む推定セルトリ細胞に強いシグナルが観察された。一部のサンプルではｑＲＴ－ＰＣＲによりａｍｈｘの発現が検出されたが、そのレベルはａｍｈｙの発現レベルと比較して極めて低く（図３Ｆ）、ＸＹ生殖腺で検出されたｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎシグナルはおそらくａｍｈｙの発現であることが示唆された。
ｑＲＴ－ＰＣＲによる発現解析では、ＸＹサンプルでは孵化後２０日から８０日にかけてａｍｈｙの転写物が検出され、２５日にピークがあった（図３Ａ）。一方、ａｍｈｘ ｍＲＮＡの発現は両遺伝子型において同時期に非常に低いか検出されなかった（図３Ｂ）。ａｍｈｒＩＩの発現は２５日齢から検出され、５５日齢以降徐々に増加した（図３Ｃ）。ｃｙｐ１９ａ１ａの発現は孵化後６０日目から増加し、ＸＸサンプルでは孵化後６５日目から発現が増加することがわかった（図３Ｄ）。ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによるａｍｈ ｍＲＮＡの局在解析では、ＸＹ遺伝子型においてのみ生殖腺性分化前および性分化中の生殖腺に陽性シグナルが認められた（図３Ｅおよび図３Ｆ）。孵化後３５日目には推定セルトリ細胞にシグナルが検出されたが、精巣分化の特徴が明確に検出される孵化後１００日目には、生殖腺腹側の生殖細胞のシストを取り囲む推定セルトリ細胞に強いシグナルが観察された。一部のサンプルではｑＲＴ－ＰＣＲによりａｍｈｘの発現が検出されたが、そのレベルはａｍｈｙの発現レベルと比較して極めて低く（図３Ｆ）、ＸＹ生殖腺で検出されたｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎシグナルはおそらくａｍｈｙの発現であることが示唆された。
【0101】
飼育実験終了時（孵化後１００日目）の表現型性別を１８尾の稚魚の生殖腺組織学で解析したところ、卵巣が分化している個体はすべてａｍｈｙ陰性ＸＸ（ｎ＝８）、精巣が分化している個体はすべてａｍｈｙ陽性ＸＹ（ｎ＝１０）であることが分かった。
【0102】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ システムを用いたａｍｈ変異体ヒラメの作製
ａｍｈの日本産ヒラメにおける役割を明らかにするため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いてａｍｈ変異体ヒラメを作製した。ａｍｈの機能領域を欠失させる広範囲な欠失変異を得るために、２つの標的配列を選択した（Ｓａｗａｍｕｒａ，Ｒ．，Ｏｓａｆｕｎｅ， Ｎ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｆ．，Ｋｉｔａｎｏ，Ｔ．２０１７． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ Ｆ０ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｍｅｄａｋａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ｇｅｎｅ． Ｃｅｌｌ ２２， ７５６－７６３． ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｇｔｃ．１２５１１）。ｃｒＲＮＡの標的配列は、３′末端に保存されたＴＧＦ－βドメインをコードするａｍｈ遺伝子のエクソン７に設計された。我々は、約６８０ｂｐの領域を欠失させることによって、コードされたＡｍｈタンパク質は機能を欠くだろうと予想した（図４Ａ）。２つのｃｒＲＮＡを受精卵に共打ちし、子ガメを孵化後２００日目まで飼育し、変異率を調べた。ａｍｈ－ｍｕｔａｎｔのアンプリコンＤＮＡ断片を配列解析で調べたところ、２つの標的配列の間に６８２ ｂｐまたは６８４ ｂｐの欠失があり、両方の標的配列にいくつかのインデル変異が見られた（図４Ａ）。遺伝子のある雄魚の広域欠失率は８１．３％、７５．０％、７５％であり、遺伝子のある雌魚の広域欠失率は７５．０％、７１．４％であった（表９）。
ａｍｈの日本産ヒラメにおける役割を明らかにするため、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いてａｍｈ変異体ヒラメを作製した。ａｍｈの機能領域を欠失させる広範囲な欠失変異を得るために、２つの標的配列を選択した（Ｓａｗａｍｕｒａ，Ｒ．，Ｏｓａｆｕｎｅ， Ｎ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｆ．，Ｋｉｔａｎｏ，Ｔ．２０１７． Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉａｌｌｅｌｉｃ Ｆ０ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｍｅｄａｋａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ｇｅｎｅ． Ｃｅｌｌ ２２， ７５６－７６３． ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｇｔｃ．１２５１１）。ｃｒＲＮＡの標的配列は、３′末端に保存されたＴＧＦ－βドメインをコードするａｍｈ遺伝子のエクソン７に設計された。我々は、約６８０ｂｐの領域を欠失させることによって、コードされたＡｍｈタンパク質は機能を欠くだろうと予想した（図４Ａ）。２つのｃｒＲＮＡを受精卵に共打ちし、子ガメを孵化後２００日目まで飼育し、変異率を調べた。ａｍｈ－ｍｕｔａｎｔのアンプリコンＤＮＡ断片を配列解析で調べたところ、２つの標的配列の間に６８２ ｂｐまたは６８４ ｂｐの欠失があり、両方の標的配列にいくつかのインデル変異が見られた（図４Ａ）。遺伝子のある雄魚の広域欠失率は８１．３％、７５．０％、７５％であり、遺伝子のある雌魚の広域欠失率は７５．０％、７１．４％であった（表９）。
【0103】
【表9】
【0104】
Ａｍｈ機能の喪失はＰ． ｏｌｉｖａｃｅｕｓの雄－雌の性転換を引き起こす
Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓのａｍｈ変異体の表現型を調べるために、孵化後２００日目の野生型（コントロール）およびａｍｈ変異体の生殖巣の組織学的解析を実施した。生殖腺の組織学的観察から、コントロール群では、遺伝子の雄生殖腺はすべて多数の精原細胞を含む典型的な精巣であり（図４Ｂ）、遺伝子の雌生殖腺はすべて多数の卵母細胞と卵巣腔を保有する、卵巣の形態的特徴を有する典型的な卵巣であることが判明した。ａｍｈ－ｍｕｔａｎｔでは、遺伝子の雄と雌の生殖腺はすべて、多くの卵母細胞と卵巣腔を含む典型的な正常卵巣であった。これらの結果は、Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓにおいてＡｍｈの機能喪失が雄－雌の性転換を引き起こしたことを示している。
Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓのａｍｈ変異体の表現型を調べるために、孵化後２００日目の野生型（コントロール）およびａｍｈ変異体の生殖巣の組織学的解析を実施した。生殖腺の組織学的観察から、コントロール群では、遺伝子の雄生殖腺はすべて多数の精原細胞を含む典型的な精巣であり（図４Ｂ）、遺伝子の雌生殖腺はすべて多数の卵母細胞と卵巣腔を保有する、卵巣の形態的特徴を有する典型的な卵巣であることが判明した。ａｍｈ－ｍｕｔａｎｔでは、遺伝子の雄と雌の生殖腺はすべて、多くの卵母細胞と卵巣腔を含む典型的な正常卵巣であった。これらの結果は、Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓにおいてＡｍｈの機能喪失が雄－雌の性転換を引き起こしたことを示している。
【0105】
考察
近年、魚類のゲノム解読プロジェクトが増加し、他の多くの魚種においても性決定の遺伝子スイッチの報告が増えている（Ｈａｔｔｏｒｉ， Ｒ．Ｓ．， Ｃａｓｔａｎｅｄａ－Ｃｏｒｔｅｓ， Ｄ．Ｃ．， Ａｒｉａｓ Ｐａｄｉｌｌａ， Ｌ．Ｆ．， Ｓｔｒｏｂｌ－Ｍａｚｚｕｌｌａ， Ｐ．Ｈ．， Ｆｅｒｎａｎｄｉｎｏ， Ｊ．Ｉ．， ２０２０． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｘｉｓ ａｓ ａ ｋｅｙ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｘ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｆｉｓｈ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ７７， ４２２３-４２３６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ０００１８－０２０－０３５３２－９）。本研究では、性連鎖マイクロサテライトマーカー情報とゲノムデータベース解析を組み合わせ、１８１の予測遺伝子リストから生殖腺分化に関連する遺伝子を選定した。予測された遺伝子の詳細な比較配列解析の結果、性連鎖遺伝子座に雄特異的なａｍｈ遺伝子（ａｍｈｙと命名）が同定された。ａｍｈｙのコード領域は、１つの同義語ＳＮＰを除いてａｍｈｘと同一であったが、推定されるａｍｈｙのプロモーターは、１ｋｂ断片内の３つの欠失により女性特異的ａｍｈｘのプロモーターと異なっていた。これらの欠失は、ＸＹにおけるａｍｈｙの早期発現（組織学的性分化の開始前に起こる）に関連していると思われる。これらの特徴から、ａｍｈｙはヒラメの性決定機構の有力な候補であると考えられる。
近年、魚類のゲノム解読プロジェクトが増加し、他の多くの魚種においても性決定の遺伝子スイッチの報告が増えている（Ｈａｔｔｏｒｉ， Ｒ．Ｓ．， Ｃａｓｔａｎｅｄａ－Ｃｏｒｔｅｓ， Ｄ．Ｃ．， Ａｒｉａｓ Ｐａｄｉｌｌａ， Ｌ．Ｆ．， Ｓｔｒｏｂｌ－Ｍａｚｚｕｌｌａ， Ｐ．Ｈ．， Ｆｅｒｎａｎｄｉｎｏ， Ｊ．Ｉ．， ２０２０． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｘｉｓ ａｓ ａ ｋｅｙ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｘ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｆｉｓｈ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ７７， ４２２３-４２３６． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ０００１８－０２０－０３５３２－９）。本研究では、性連鎖マイクロサテライトマーカー情報とゲノムデータベース解析を組み合わせ、１８１の予測遺伝子リストから生殖腺分化に関連する遺伝子を選定した。予測された遺伝子の詳細な比較配列解析の結果、性連鎖遺伝子座に雄特異的なａｍｈ遺伝子（ａｍｈｙと命名）が同定された。ａｍｈｙのコード領域は、１つの同義語ＳＮＰを除いてａｍｈｘと同一であったが、推定されるａｍｈｙのプロモーターは、１ｋｂ断片内の３つの欠失により女性特異的ａｍｈｘのプロモーターと異なっていた。これらの欠失は、ＸＹにおけるａｍｈｙの早期発現（組織学的性分化の開始前に起こる）に関連していると思われる。これらの特徴から、ａｍｈｙはヒラメの性決定機構の有力な候補であると考えられる。
【0106】
ａｍｈｙプロモーターと推定される最も長い欠失は、開始コドンに近い領域（位置－１４ｂｐ）に対応し、他の２つの欠失はさらに上流領域に位置している。これらの欠失のどれがａｍｈｙの早期発現に関与しているかは、プロモーターおよび／または機能解析によってさらに検討する必要がある。しかしながら、ａｍｈｙとａｍｈｘのコード領域はほぼ同一であるため、これらの遺伝子の発現プロファイルが異なるのは、その制御領域の修飾が原因であると考えるのが妥当であると思われる。これまでに報告されている性決定遺伝子の中には、コードする塩基配列やアミノ酸配列が異なるものがあり、ＴａｋｉｆｕｇｕｒｕｂｒｉｐｅｓａｍｈｒＩＩ（Ｋａｍｉｙａ，Ｔ．，Ｋａｉ，Ｗ．，Ｔａｓｕｍｉ，Ｓ．，Ｏｋａ，Ａ．，Ｍａｔｓｕｎａｇａ，Ｔ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｎ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｍ．，Ｓｕｅｔａｋｅ，Ｈ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｓ．，Ｈｏｓｏｙａ，Ｓ．，Ｔｏｈａｒｉ，Ｓ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，Ｍｉｙａｄａｉ，Ｔ．，Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ，Ｂ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｋ．，２０１２．Ａｔｒａｎｓ－ｓｐｅｃｉｅｓｍｉｓｓｅｎｓｅＳＮＰｉｎＡｍｈｒ２ｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｅｘｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｔｉｇｅｒＰｕｆｆｅｒｆｉｓｈ，Ｔａｋｉｆｕｇｕｒｕｂｒｉｐｅｓ（Ｆｕｇｕ）．ＰＬｏＳＧｅｎｅｔ．８，ｅ１００２７９８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００２７９８）やＳｅｒｉｏｌａｑｕｉｎｑｕｅｒａｄｉａｔａｈｓｄ１７ｂ１（Ｋｏｙａｍａ，Ｔ．，Ｎａｋａｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ，Ｋ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｒ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｋ．，Ｋｕｒｕｍａ，Ｙ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｎ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｍ．，Ｏｋａｄａ，Ｙ．，Ｉｅｄａ，Ｒ．，Ｕｃｈｉｎｏ，Ｔ．，Ｔａｓｕｍｉ，Ｓ．，Ｈｏｓｏｙａ，Ｓ．，Ｕｎｏ，Ｓ．，Ｋｏｙａｍａ，Ｊ．，Ｔｏｙｏｄａ，Ａ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｔ．，２０１９．ＡＳＮＰｉｎａＳｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｉｃＥｎｚｙｍｅＩｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＰｈｅｎｏｔｙｐｉｃＳｅｘｉｎＳｅｒｉｏｌａＦｉｓｈｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２９，１９０１－１９０９．ｅ８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｕｂ．２０１９．０４．０６９）ではこれらの違いが遺伝子型の性決定と関連していることが分かっている。Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓのａｍｈｙの発現パターンは、プロモーター領域の９ｂｐの欠失のみで異なるメダカＯｒｙｚｉａｓｌｕｚｏｎｅｎｓｉｓｓｏｘ３Ｙ（Ｔａｋｅｈａｎａ，Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｍ．，Ｍｙｏｓｈｏ，Ｔ．，Ｓｕｓｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｋ．，Ｓｈｉｎ－Ｉ，Ｔ．，Ｋｏｈａｒａ，Ｙ．，Ｋｕｒｏｋｉ，Ｙ．，Ｔｏｙｏｄａ，Ａ．，Ｆｕｊｉｙａｍａ，Ａ．，Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｓａｋａｉｚｕｍｉ，Ｍ．，Ｎａｒｕｓｅ，Ｋ．，２０１４．Ｃｏ－ｏｐｔｉｏｎｏｆＳｏｘ３ａｓｔｈｅｍａｌｅ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｆａｃｔｏｒｏｎｔｈｅｙｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｉｎｔｈｅｆｉｓｈＯｒｙｚｉａｓｄａｎｃｅｎａ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５，１-１０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ５１５７）の性決定遺伝子と類似している。
【0107】
これまで多くの性決定遺伝子が報告されているが、ａｍｈが性決定遺伝子の地位を占める可能性が高いと思われ、本研究でもそのことが裏付けられた。性連鎖の他に、他の種のａｍｈｙに共通するもう一つの特徴は、組織学的性分化が始まる前に前セルトリ細胞で高発現し、プロモーター領域の変化と関連していると思われることである。Ｐ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓでは、２０日齢からａｍｈｙの発現が検出され、２５日齢にピークを示した。２０日以前の発現を評価したわけではないが、２５日というのは比較的早く、ＸＸにおけるｃｙｐ１９ａ１ａの発現が６５日で増加し始めたのに比べてかなり早い時期であると考えることができる。ａｍｈと結合するとされる受容体ａｍｈｒＩＩの発現も孵化後２０日目で検出され（低レベルであるが）、その後徐々に増加した。興味深いことに、ａｍｈｘの発現はＸＹ遺伝子型よりもＸＸ遺伝子型において高かった。これはＸＸ個体がａｍｈｘを２コピー、ＸＹ個体が１コピー持っているためと考えられる。
【0108】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を用いてａｍｈ（推定ａｍｈｙ）遺伝子のＴＧＦ－βドメインをコードする領域を破壊することにより、ＸＹ遺伝子型の卵巣の発生（すなわち雄－雌の性転換）が確認され、この遺伝子がＰ．ｏｌｉｖａｃｅｕｓ遺伝子型の雄における精巣形成に必要であることが示され、その下流機能がＴＧＦ－βドメインにより媒介されている可能性が示唆された。
【0109】
本結果は、ａｍｈｙがヒラメの性決定遺伝子の有力な候補であることを支持するものである。このような遺伝子型性決定マーカーが利用できるようになれば、遺伝的性決定と環境的性決定の相互作用を養殖や生態学的な観点から理解するのに役立つと思われる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】