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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024062917
(43)【公開日】2024-05-10
(54)【発明の名称】ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に対する新規な抗体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240501BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240501BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240501BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240501BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240501BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240501BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
A61P35/02
A61K47/64
A61K47/68
A61K39/395 N
A61K39/395 T
C12N15/13
【審査請求】未請求
【請求項の数】11
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023034860
(22)【出願日】2023-03-07
(31)【優先権主張番号】P 2022170772
(32)【優先日】2022-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】504173471
【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】前仲 勝実
(72)【発明者】
【氏名】前田 直良
(72)【発明者】
【氏名】露木 貴浩
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076AA22
4C076AA24
4C076AA30
4C076AA31
4C076AA36
4C076AA38
4C076AA45
4C076AA53
4C076AA67
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB21
4C076BB25
4C076CC27
4C076EE59
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA76
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】ＡＴＬを含む血液がんの新規な治療剤を開発すること。
【解決手段】ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合する抗体であって、ａ）それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および／またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域の３つのＣＤＲを含む、またはｂ）それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域の３つのＣＤＲ、およびそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域の３つのＣＤＲを含む抗体、またはその抗原結合断片等が提供される。
【選択図】なし
【解決手段】ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合する抗体であって、ａ）それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および／またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域の３つのＣＤＲを含む、またはｂ）それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域の３つのＣＤＲ、およびそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域の３つのＣＤＲを含む抗体、またはその抗原結合断片等が提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合する抗体であって、
ａ）それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および／またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域の３つのＣＤＲを含む、または
ｂ）それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域の３つのＣＤＲ、およびそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域の３つのＣＤＲを含む
抗体、またはその抗原結合断片。
ａ）それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および／またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域の３つのＣＤＲを含む、または
ｂ）それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域の３つのＣＤＲ、およびそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域の３つのＣＤＲを含む
抗体、またはその抗原結合断片。
【請求項2】
ａ’）配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、または
ｂ’）配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、
請求項１記載の抗体またはその抗原結合断片。
ｂ’）配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、
請求項１記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項3】
ＨＬＡ－ＤＲ β鎖への結合について請求項１記載の抗体またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項4】
ＨＬＡ－ＤＲ β鎖への結合について請求項２記載の抗体またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその抗原結合断片。
【請求項5】
ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合する抗体であって、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むエピトープまたは配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項6】
抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項7】
抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項２記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか１項記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、血液がんの治療のための医薬組成物。
【請求項9】
抗体薬物コンジュゲートの形態である、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項10】
血液がんが、白血病、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫からなる群から選ばれる、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項11】
非ホジキンリンパ腫が成人Ｔ細胞白血病またはバーキットリンパ腫である、請求項１０記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）－ＤＲ β鎖に対する新規な抗体、当該抗体を含む医薬組成物、および当該抗体の利用法、特に血液がんの治療、とりわけ成人Ｔ細胞白血病(Adult T-cell leukemia、ＡＴＬ）の治療における当該抗体の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＡＴＬは、日本の九州地方をはじめ、世界の一部の地域にのみ発症者が多く見られる特有の血液がんであり、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）がＴ細胞に感染することによって引き起こされることが分かっている。ＨＴＬＶ―１はレトロウイルスに分類され、感染後ウイルス遺伝子が染色体内に挿入されるため、感染者は生涯ウイルス保有者となる。潜伏期間が長く、数十年を経て約１～３％の感染者がＡＴＬを発症する。発症平均年齢は６６歳（２００７年時点）である。しかしながら、一度発症すると平均５０％生存期間は１３か月であり、一時的に奏効するが、再燃、再発がきわめて早く起こる予後不良の疾患である。病型は、末梢血リンパ球数、予後不良因子、転移の有無等により、急性型、リンパ腫型、慢性型、くすぶり型の４つに分類され、初診時に既に他の組織や器官への転移が認められる場合も多い。
【0003】
ＡＴＬの化学療法としては、多剤併用化学療法、例えば、ＶＣＡＰ療法（ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニゾロン）、ＡＭＰ療法（ドキソルビシン、ラニムスチン、プレドニゾロン）およびＶＥＣＰ療法（ビンデシン、エトポシド、パラプラチン、プレドニゾロン）を組み合わせたＬＳＧ１５療法などがある。また、発症年齢やＡＴＬ病型により、造血幹細胞移植を選択する場合がある。また、ＡＴＬの治療を目的として、ＡＴＬ細胞の細胞表面分子を標的とした抗体が開発されており、例えば、抗ＣＣＲ４抗体Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ、抗ＣＤ２抗体Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ、抗ＣＤ２５抗体Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ、抗ＣＤ３０抗体との薬物複合体Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ、抗ＣＤ５２抗体Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ、抗ＣＤ７１抗体ＪＳＴ－ＴＦＲ０９およびＡ２４、抗ＣＤ１２２抗体Ｈｕ－Ｍｉｋβ１などが論文報告されている。さらに、ＡＴＬ細胞の細胞死を誘導するのに有効なＨＬＡ－ＤＲ β鎖に対する抗体フラグメント（ダイアボディ）および抗体が報告されているが、抗原エピトープ等の詳細な報告はない（非特許文献１および２）。現在ＡＴＬの治療に使用されているのは抗ＣＣＲ４抗体Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂのみであり、それ以外にＡＴＬに対する有効な治療法、および治療薬は無く、完治できない。したがって、今もなお、ＡＴＬの新規な治療剤の開発が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】The Journal of Biochemistry, Volume 145, Issue 6, June 2009, Pages 799-810
【非特許文献2】PLoS ONE 2016, 11, e0150496
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、ＡＴＬを含む血液がんの新規な治療剤を開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＡＴＬを含む血液がんの治療に有効な新規な抗体を見出した。該抗体は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩのＨＬＡ－ＤＲのβ鎖に特異的に結合する抗体であり、ＡＴＬ細胞の増殖を抑制し、ＡＴＬ細胞移植マウスにおける腫瘍の成長を抑制することが分かった。該抗体は、今までに報告されている抗ＨＬＡ－ＤＲ β鎖抗体とは異なる配列を含む新規な抗体であり、さらに、本発明者らは該抗体のエピトープも同定した。かくして、本発明が完成された。
【0007】
したがって、本発明は以下の態様を提供する。
［１］ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合する抗体であって、
ａ）それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および／またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域の３つのＣＤＲを含む、または
ｂ）それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域の３つのＣＤＲ、およびそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域の３つのＣＤＲを含む
抗体、またはその抗原結合断片。
［２］ａ’）配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、または
ｂ’）配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、
［１］記載の抗体またはその抗原結合断片。
［３］ＨＬＡ－ＤＲ β鎖への結合について［１］記載の抗体またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその抗原結合断片。
［４］ＨＬＡ－ＤＲ β鎖への結合について［２］記載の抗体またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその抗原結合断片。
［５］ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合する抗体であって、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むエピトープまたは配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
［６］抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、［１］記載の抗体またはその抗原結合断片。
［７］抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、［２］記載の抗体またはその抗原結合断片。
［８］［１］～［７］のいずれか１項記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、血液がんの治療のための医薬組成物。
［９］抗体薬物コンジュゲートの形態である、［８］記載の医薬組成物。
［１０］血液がんが、白血病、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫からなる群から選ばれる、［８］記載の医薬組成物。
［１１］非ホジキンリンパ腫が成人Ｔ細胞白血病またはバーキットリンパ腫である、［１０］記載の医薬組成物。
［１］ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合する抗体であって、
ａ）それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、および／またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域の３つのＣＤＲを含む、または
ｂ）それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域の３つのＣＤＲ、およびそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域の３つのＣＤＲを含む
抗体、またはその抗原結合断片。
［２］ａ’）配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および／または配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、または
ｂ’）配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、
［１］記載の抗体またはその抗原結合断片。
［３］ＨＬＡ－ＤＲ β鎖への結合について［１］記載の抗体またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその抗原結合断片。
［４］ＨＬＡ－ＤＲ β鎖への結合について［２］記載の抗体またはその抗原結合断片と競合する抗体またはその抗原結合断片。
［５］ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合する抗体であって、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含むエピトープまたは配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含むエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片。
［６］抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、［１］記載の抗体またはその抗原結合断片。
［７］抗体がヒト化抗体またはキメラ抗体である、［２］記載の抗体またはその抗原結合断片。
［８］［１］～［７］のいずれか１項記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、血液がんの治療のための医薬組成物。
［９］抗体薬物コンジュゲートの形態である、［８］記載の医薬組成物。
［１０］血液がんが、白血病、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫からなる群から選ばれる、［８］記載の医薬組成物。
［１１］非ホジキンリンパ腫が成人Ｔ細胞白血病またはバーキットリンパ腫である、［１０］記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、ＡＴＬを含む血液がんの治療に有効な新規な抗ＨＬＡ－ＤＲ β鎖抗体、および当該抗体を含む血液がんの治療に有効な医薬組成物が提供される。さらに、前記抗体または医薬組成物を投与することを特徴とする、ＡＴＬを含む血液がんの治療方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明では、ＨＴＬＶ－１感染によりがん化したＴ細胞（本明細書において、「ＡＴＬ細胞」ともいう）をラットに接種して、ＡＴＬ細胞表面分子に対する抗体を取得し、そのうち、ＡＴＬ細胞に対して結合性を示すクローンを選択し、２種のモノクローナル抗体を得、その配列を決定した。本願明細書において、これらの抗体をｃ１９抗体およびｃ３３抗体と称する。
【0011】
ｃ１９抗体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変（ＶＨ）領域および配列番号８で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、該ＶＨ領域は、それぞれ配列番号１、配列番号２、および配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（すなわち、ＶＨ ＣＤＲ１－３）を含み、該ＶＬ領域は、それぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲ（すなわち、ＶＬ ＣＤＲ１－３）を含む。
【0012】
ｃ３３抗体は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、該ＶＨ領域は、それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１－３を含み、該ＶＬ領域は、それぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１－３を含む。
【0013】
ｃ１９抗体およびｃ３３抗体は、ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen；ＨＬＡ）クラスＩＩの一つ、ＨＬＡ－ＤＲのβ鎖に特異的に結合する抗体である。ＨＬＡ－ＤＲは、約３４ｋＤａのα鎖および約２８ｋＤａのβ鎖で構成されるヘテロ二量体である。主に単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞等を含む抗原提示細胞の細胞表面に発現しているが、活性化されたＴ細胞やＮＫ細胞等の細胞表面にも発現する抗原である。また、がん化した血液細胞でも発現が見られ、ＡＴＬの良く知られたマーカーの一つである。
【0014】
ｃ１９抗体およびｃ３３抗体は、その抗原結合特異性を保持する範囲内において１以上のアミノ酸変異を含む変異体であってもよい。本明細書において、「アミノ酸変異」には、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加が含まれる。アミノ酸置換は、保存的置換または非保存的置換のいずれであってもよく、好ましくは保存的置換である。アミノ酸の保存的置換とは、アミノ酸の化学的性質に基づいて同じ群に分類されるアミノ酸への置換をいい、当業者によく知られている。例えば、一の非極性（疎水性）アミノ酸から別の非極性（疎水性）アミノ酸への置換（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、メチオニン間の置換）、一の極性中性アミノ酸から別の極性中性アミノ酸への置換（例えば、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン間の置換）、一の酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸間の置換）、一の塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン間の置換）などが挙げられる。アミノ酸置換には、非天然アミノ酸への置換も包含される。
【0015】
本明細書において、「抗原結合特異性を保持する」とは、変異体抗体が、抗原に特異的に結合する能力を保持することをいい、好ましくは、そのオリジナル抗体の抗原結合特異性と同等またはそれ以上の抗原結合特異性を有すること、例えば、オリジナル抗体の抗原結合特異性の約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の抗原結合特異性を有することをいう。抗原結合特異性は、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット法等などの当該分野で既知の結合アッセイにより確認することができる。
【0016】
ｃ１９抗体、ｃ３３抗体またはその変異体は、好ましくは、血液がんに対する抗がん活性を有する。本明細書において、「抗がん活性」とは、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいて、がん細胞の増殖を抑制する活性をいう。すなわち、ｃ１９抗体、ｃ３３抗体またはその変異体は、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合して、好ましくは、がん化細胞の増殖を抑制する。本願明細書において「抑制」とは、がん化細胞の増殖を阻害してがん化細胞数の増加を抑えること、および／または、がん化細胞の死を誘導してがん化細胞数を減少させることを意味する。本明細書において、「がん化細胞」は、がん化した血液細胞であり、例えば、がん化した未熟または成熟リンパ球等が挙げられ、好ましくはがん化した成熟Ｔ細胞、がん化した成熟Ｂ細胞、さらに好ましくはＡＴＬ細胞、バーキットリンパ腫細胞である。ｃ１９抗体およびその変異体は、特に顕著な抗がん活性を有する。
【0017】
したがって、ｃ１９抗体およびｃ３３抗体の変異体は、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合する能力を保持する範囲において１以上のアミノ酸変異を有しており、好ましくは、抗がん活性を有する範囲において１以上のアミノ酸変異を有していてもよい。ｃ１９抗体およびｃ３３抗体の変異体は、好ましくは、そのオリジナル抗体の同等またはそれ以上の抗がん活性を有していてもよい。本明細書において、「同等またはそれ以上の抗がん活性」とは、例えば、オリジナル抗体の抗がん活性の約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の抗がん活性をいう。
【0018】
本発明の一の態様において、ｃ１９抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１－３、あるいはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１－３を含む。好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１－３、あるいはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ１－３を含む。
【0019】
さらに好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１－３、およびそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１－３を含む。またさらに好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１－３、およびそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ１－３を含む。
【0020】
本発明の別の態様において、ｃ３３抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１－３、およびそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１－３を含む。好ましくは、ｃ３３抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１－３、およびそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ１－３を含む。
【0021】
本発明の一の態様において、ｃ１９抗体またはその変異体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、あるいは配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ、あるいは配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬを含む。
【0022】
さらに好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。またさらに好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ、および配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬを含む。
【0023】
本発明の別の態様において、ｃ３３抗体またはその変異体は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬを含む。好ましくはｃ３３抗体またはその変異体は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬを含む。
【0024】
本明細書において、「配列同一性」は、常法により２つの配列を最適にアラインメントして決定すればよい。例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの当該分野で既知の配列アライメントアルゴリズムを用いて決定することができる。
【0025】
さらに、本発明の一の態様において、ｃ１９抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１－３、またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１－３を含み、かつ、上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸変異を含む。好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１－３、またはそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ１－３を含み、かつ、上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸変異を含む。さらに好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１－３、およびそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１－３を含み、かつ、上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸変異を含む。またさらに好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号１～３で示されるアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１－３、およびそれぞれ配列番号４～６で示されるアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ１－３を含み、かつ、上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸変異を含む。
【0026】
本発明の別の態様において、ｃ３３抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１－３、およびそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１－３を含み、かつ、上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸変異を含む。好ましくは、ｃ３３抗体またはその変異体は、それぞれ配列番号９～１１で示されるアミノ酸配列からなるＶＨ ＣＤＲ１－３、およびそれぞれ配列番号１２～１４で示されるアミノ酸配列からなるＶＬ ＣＤＲ１－３を含み、かつ、上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸変異を含む。
【0027】
本発明の一の態様において、ｃ１９抗体またはその変異体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、あるいは配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含み、かつ上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸範囲を含む。好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＶＨ、あるいは配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるＶＬを含み、かつ上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸範囲を含む。さらに好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含み、かつ、上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸変異を含む。またさらに好ましくは、ｃ１９抗体またはその変異体は、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＶＨ、および配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるＶＬを含み、かつ、上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸変異を含む。
【0028】
本発明の別の態様において、ｃ３３抗体またはその変異体は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むＶＬを含み、かつ、上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸変異を含む。好ましくは、ｃ３３抗体またはその変異体は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるＶＨ、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるＶＬを含み、かつ、上記アミノ酸配列において０～数個のアミノ酸変異を含む。
【0029】
本明細書において、「数個」とは、１～１０個程度をいい、アミノ酸配列長にもよるが、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個であってもよい。
【0030】
本発明では、ｃ１９抗体が、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖上の配列：ＥＥＳＶＲＦ（配列番号１７）（配列番号１９で示されるＨＬＡ－ＤＲ β鎖の全長アミノ酸配列において６４番目～６９番目のアミノ酸）を含むポリペプチド（エピトープ）を特異的に認識して結合することが見出された。したがって、本発明のさらなる態様において、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。例えば、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体は、上記したｃ１９抗体の変異体であってもよい。配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、例えば、配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【0031】
本発明では、ｃ３３抗体が、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖上の配列：ＬＷＱＰＫＲＥＣ（配列番号１８）（配列番号１９で示されるＨＬＡ－ＤＲ β鎖の全長アミノ酸配列において３７番目～４４番目のアミノ酸）を含むポリペプチド（エピトープ）を特異的に認識して結合することが見出された。したがって、本発明のさらなる態様において、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。例えば、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体は、上記したｃ３３抗体の変異体であってもよい。配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、例えば、配列番号１８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
【0032】
本発明のまたさらなる態様において、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖への結合について、上記ｃ１９抗体、ｃ３３抗体またはその変異体と競合する抗体が提供される。本明細書において、「競合する」とは、結合アッセイにおいて、ある抗体（競合抗体）またはその抗原結合断片の存在により、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖またはそのポリペプチド（抗原または抗原ポリペプチド）と、上記ｃ１９抗体、ｃ３３抗体またはその変異体との結合が低減することをいう。競合結合アッセイとしては、当該分野で既知の方法を用いることができ、例えば、ＥＬＩＳＡ法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、フローサイトメトリー、共免疫沈降法、プルダウンアッセイ法、ラベル転移反応法、相互作用マッピング法などを用いてもよい。上記の競合抗体は、上記ｃ１９抗体、ｃ３３抗体またはその変異体と、抗原または抗原ポリペプチドとの結合を、例えば、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、またさらに好ましくは約７０％、またさらに好ましくは約８０％、またさらに好ましくは約９０％低減させる。
【0033】
上記競合抗体はまた、上記のｃ１９抗体のエピトープまたはｃ３３抗体のエピトープ（すなわち、配列番号１７または配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）の全部または一部に結合する抗体であってもよい。さらに、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖またはＨＬＡ－ＤＲ β鎖ポリペプチド上の当該エピトープに近接する領域に結合する抗体もまた、上記競合抗体になり得る。さらに、上記競合抗体はまた、上記のｃ１９抗体またはｃ３３抗体のエピトープへの結合について、上記ｃ１９抗体、ｃ３３抗体またはその変異体と競合する抗体であってもよい。
【0034】
上記ｃ１９抗体、ｃ３３抗体またはその変異体、上記ｃ１９またはｃ３３抗体のエピトープに結合する抗体、および上記競合抗体（以下、まとめて「本発明の抗体」ともいう）は、単離された抗体であり、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。
【0035】
さらに、本発明の抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または多重特異性抗体であってもよい。ヒト化抗体は、一般に、非ヒト動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域とからなる可変領域、およびヒト抗体由来の定常領域からなる抗体をいう。ヒト化抗体は、所望により、ヒト抗体由来のフレームワーク領域の残基が対応する非ヒト動物抗体由来の残基によって置換されていてもよく、また、ヒト抗体およびＣＤＲが由来する非ヒト動物抗体のどちらにも見出されない残基を有していてもよい。キメラ抗体は、一般に、非ヒト動物抗体由来の可変領域と、ヒト抗体由来の定常領域からなる抗体をいう。これらの抗体の作製は、当該分野で既知の方法によって行うことができる。
【0036】
本発明のさらなる態様において、本発明の抗体の抗原結合断片が提供される。本明細書において、「抗体結合断片」とは、抗体の一部分を含むポリペプチドであり、抗原に結合できるものをいう。本発明の抗体の抗原結合断片は、好ましくは、血液がんに対する抗がん活性を有する。
【0037】
本発明の抗体の抗原結合断片としては、例えば、限定するものではないが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、Ｆｖ（可変領域断片）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ナノボディ）、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなどが挙げられる。これらの抗原結合断片の作製は、当該分野で既知の方法によって行うことができる。
【0038】
さらに、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸も、本発明に含まれる。
【0039】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、当該分野で既知の方法によって作製することができる。例えば、抗原（ＨＬＡ－ＤＲ β鎖またはその部分ペプチド）で動物を免疫し、血清からポリクローナル抗体を取得することができる。また、免疫した動物から分離したリンパ球を用いてハイブリドーマを作製することで、モノクローナル抗体を取得することができる。ハイブリドーマ法は、後記する実施例のように、ＡＴＬ細胞で免疫した動物から出発して行うことができる。組換え抗体作製法では、例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込み、宿主細胞（例えば哺乳動物細胞、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、本発明の抗体またはその抗原結合断片を組換え抗体として産生させる。または、ファージディスプレイ法により、抗体遺伝子ライブラリーから抗体を得ることもできる。
【0040】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合して、好ましくは、がん化細胞の増殖を抑制することから、血液がんの予防または治療に有用である。したがって、本発明のさらなる態様において、有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片を対象に投与することを含む、血液がんの予防または治療法が提供される。本発明の抗体またはその抗原結合断片の有効量は、当業者によって適宜決定される。投与経路もまた、当業者によって適宜決定すればよいが、例えば、限定するものではないが、経口、経鼻、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、腫瘍内等が挙げられる。
【0041】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、そのままの形態で投与してもよいが、１以上の薬剤と結合された抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の形態で投与してもよい。特に、ｃ３３抗体またはその変異体またはその抗原結合断片を用いる場合は、ＡＤＣの形態が好ましい。本発明の抗体またはその抗原結合断片と結合させる薬剤としては、治療対象となる血液がんのいずれかの治療薬を用いればよく、例えば、限定するものではないが、モノメチルアウリスタチンＥ（Monomethyl auristatin E；ＭＭＡＥ）、エムタンシン（ＤＭ１）、オゾガマイシン、メルタンシン、エキサテカン等の化学療法剤が挙げられる。
【0042】
本発明のまたさらなる態様において、有効成分として本発明の抗体またはその抗原結合断片を含む血液がんの予防または治療のための医薬組成物が提供される。医薬組成物は、上記したＡＤＣの形態で本発明の抗体またはその抗原結合断片を含んでいてもよい。医薬組成物は、本発明の抗体またはその抗原結合断片の他に、医薬上許容される担体、安定化剤、賦形剤、溶解補助剤、潤沢化剤、基材、結合剤、懸濁剤、コーティング剤、糖衣剤、粘着増強剤、分散剤、崩壊剤、流動化剤等の添加剤を含んでいてもよい。医薬上許容される担体としては、例えば、限定するものではないが、生理食塩水、ショ糖、緩衝液、グリコール、グリセロール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリアミノ酸、植物油等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、シクロデキストリン、セルロース、亜硫酸塩等、賦形剤としては、例えば、乳糖、セルロース、デンプン等、溶解補助剤としては、例えば、非イオン界面活性剤、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等が挙げられる。その他、添加剤として、例えば、限定するものではないが、クエン酸水和物、水酸化ナトリウム、塩酸、ポリソルベート、トレハロース水和物、クエン酸ナトリウム水和物等が挙げられる。上記担体および添加剤は、医薬組成物の投与形態または投与経路によって適宜選択すればよい。医薬組成物は、常法によって製剤化することによって製造することができる。
【0043】
医薬組成物の投与形態としては、例えば、限定するものではないが、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、徐放性錠剤、徐放性カプセル、腸溶剤、注入剤、点鼻剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。医薬組成物の投与経路は、例えば、限定するものではないが、経口、経鼻、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、腫瘍内等が挙げられる。
【0044】
本発明の抗体またはその抗原結合断片または上記医薬組成物の投与対象は、哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、限定するものではないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ等が挙げられ、好ましくはヒトである。
【0045】
本発明の抗体またはその抗原結合断片、または上記医薬組成物の投与量は、投与対象の年齢、体重、性別、健康状態等を考慮して適宜決定することができる。例えば、限定するものではないが、１回量で約１～５ｍｇ／ｋｇ体重の抗体を１～４週間間隔で５～１０回点滴静注してもよい。
【0046】
本発明の抗体またはその抗原結合断片は、がん化細胞の細胞表面分子であるＨＬＡ－ＤＲ β鎖に結合する活性を有するため、血液がんの検出ツールまたは標的化剤として用いることもできる。例えば、血液がんの診断や血液がんの治療において、腫瘍部位の検出または標的化に用いることができる。血液がんの検出ツールとして用いる場合、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、検出を容易にするために標識されていてもよい。かかる標識としては、例えば、限定するものではないが、放射性物質、蛍光色素、化学発光物質、酵素等を用いることができる。
【0047】
血液がんとしては、例えば、白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫等が挙げられ、好ましくは、非ホジキンリンパ腫である成人Ｔ細胞白血病やバーキットリンパ腫が挙げられる。
【実施例0048】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0049】
実施例１：モノクローナル抗体の作製
（１）ラットの免疫
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ（新潟大学藤井雅寛教授より贈与）をアジュバント（Difco Laboratories）とともにＷｉｓｔａｒラット（メス、７週齢）（日本ＳＬＣ）の皮下に免疫し、３週間後腸骨リンパ節を採取し、リンパ球を分離した。なお、本明細書において、ＡＴＬ細胞株とは、ＡＴＬ患者より樹立されたＴ細胞株をいう。
（１）ラットの免疫
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ（新潟大学藤井雅寛教授より贈与）をアジュバント（Difco Laboratories）とともにＷｉｓｔａｒラット（メス、７週齢）（日本ＳＬＣ）の皮下に免疫し、３週間後腸骨リンパ節を採取し、リンパ球を分離した。なお、本明細書において、ＡＴＬ細胞株とは、ＡＴＬ患者より樹立されたＴ細胞株をいう。
【0050】
（２）モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの樹立
分離したリンパ球とマウスミエローマ細胞Ｘ６３／Ａｇ８－６５３（北海道大学薬学部にて保管）を混合し、ＰＥＧ１５００（Roche）の存在下で融合させ、ＧＩＴ培地（コージンバイオ）、５％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Roche）、ＨＡＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Thermo Fisher Scientific）、ＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Thermo Fisher Scientific）、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（BioWest）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（WAKO）を用いて３７℃、５％ＣＯ２下、９６穴プレートで培養した。さらに４８穴プレートへスケールアップし、２４穴プレート培養時からＨＡＴ ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔをＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Thermo Fisher Scientific）に切り替えて培養を継続した。さらに１２穴プレート、６穴プレートへとスケールアップし、最終的にＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを加えず培養し、ハイブリドーマを樹立した。
分離したリンパ球とマウスミエローマ細胞Ｘ６３／Ａｇ８－６５３（北海道大学薬学部にて保管）を混合し、ＰＥＧ１５００（Roche）の存在下で融合させ、ＧＩＴ培地（コージンバイオ）、５％ＢＭ Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（Roche）、ＨＡＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Thermo Fisher Scientific）、ＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Thermo Fisher Scientific）、１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（BioWest）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（WAKO）を用いて３７℃、５％ＣＯ２下、９６穴プレートで培養した。さらに４８穴プレートへスケールアップし、２４穴プレート培養時からＨＡＴ ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔをＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Thermo Fisher Scientific）に切り替えて培養を継続した。さらに１２穴プレート、６穴プレートへとスケールアップし、最終的にＨＴ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを加えず培養し、ハイブリドーマを樹立した。
【0051】
（３）陽性クローン細胞のスクリーニング
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩおよび急性Ｔ細胞性白血病株ＭＯＬＴ－４（新潟大学藤井雅寛教授より贈与）にハイブリドーマ培養上清を添加し、ＴＬ－ＯｍＩにのみ細胞凝集（アグリゲーション）を誘導するクローンを選択することによりスクリーニングを行った。
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩおよび急性Ｔ細胞性白血病株ＭＯＬＴ－４（新潟大学藤井雅寛教授より贈与）にハイブリドーマ培養上清を添加し、ＴＬ－ＯｍＩにのみ細胞凝集（アグリゲーション）を誘導するクローンを選択することによりスクリーニングを行った。
【0052】
（４）モノクローナル抗体の精製
樹立したハイブリドーマを、ハイブリドーマ用無血清培地（WAKO）で培養し、培養上清５００ｍＬを回収後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Cytiva）、さらにＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーによりモノクローナル抗体ｃ１９およびｃ３３を精製した。精製にはＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（GE）を使用した。
樹立したハイブリドーマを、ハイブリドーマ用無血清培地（WAKO）で培養し、培養上清５００ｍＬを回収後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Cytiva）、さらにＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーによりモノクローナル抗体ｃ１９およびｃ３３を精製した。精製にはＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（GE）を使用した。
【0053】
（５）免疫グロブリンサブタイプの同定
Ｒａｐｉｄ Ｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Antagen）を用いて、免疫グロブリンサブタイプを同定した。ＰＢＳ（－）で０．５～２μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体液を１００μＬ使用した。各モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖はそれぞれ、ｃ１９はＩｇＧ２ｂ、ｋａｐｐａ、ｃ３３はＩｇＧ２ａ、ｋａｐｐａであった。
Ｒａｐｉｄ Ｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ（Antagen）を用いて、免疫グロブリンサブタイプを同定した。ＰＢＳ（－）で０．５～２μｇ／ｍＬに希釈したモノクローナル抗体液を１００μＬ使用した。各モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖はそれぞれ、ｃ１９はＩｇＧ２ｂ、ｋａｐｐａ、ｃ３３はＩｇＧ２ａ、ｋａｐｐａであった。
【0054】
（６）モノクローナル抗体の配列決定
モノクローナル抗体ｃ１９およびｃ３３を産生するハイブリドーマからＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ＢｃａＢＥＳＴＴＭ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（TAKARA）を用いてｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ法により抗体の可変領域を含む重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の遺伝子を増幅し、塩基配列を確認した。ＰＣＲは、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（TAKARA）、ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（TAKARA）、Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（TAKARA）、表１に示されるラットＩｇＧ ＶＨに特異的なプライマーセット（配列番号２０～４３に示される２４種のＦｏｒｗａｒｄプライマー、および配列番号４４～４７に示される４種のＲｅｖｅｒｓｅプライマー）、または表２に示されるラットＩｇＧ ＶＬに特異的なプライマーセット（配列番号４８～７３に示される２６種のＦｏｒｗａｒｄプライマー、および配列番号７４～７８に示される５種のＲｅｖｅｒｓｅプライマー）を用いて、ｃ１９重鎖、軽鎖は、（１）９５℃ ２分、（２）９５℃ ３０秒、（３）５９．９℃ １分、（４）６８℃ １分、（２）－（４）を３５回繰り返し、（５）６８℃ ４分、ｃ３３重鎖、軽鎖は、（１）９５℃ ２分、（２）９５℃ ３０秒、（３）５５℃ １分、（４）６８℃ １分、（２）－（４）を３５回繰り返し、（５）６８℃ ４分の条件で行った。増幅した遺伝子配列、および該遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列は下記する通りである。増幅した遺伝子は、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（TAKARA）を用いて、クローニング用Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０プラスミド（TAKARA）にクローニングした。大腸菌株ＤＨ５αをｐＭＤ２０プラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン入りＬＢ寒天（Sigma）プレートでコロニー形成後、ピックアップして１００μｇ／ｍＬアンピシリン入りＬＢ液体培地で培養後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いて抽出した。
モノクローナル抗体ｃ１９およびｃ３３を産生するハイブリドーマからＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ＢｃａＢＥＳＴＴＭ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（TAKARA）を用いてｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ法により抗体の可変領域を含む重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の遺伝子を増幅し、塩基配列を確認した。ＰＣＲは、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（TAKARA）、ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（TAKARA）、Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（TAKARA）、表１に示されるラットＩｇＧ ＶＨに特異的なプライマーセット（配列番号２０～４３に示される２４種のＦｏｒｗａｒｄプライマー、および配列番号４４～４７に示される４種のＲｅｖｅｒｓｅプライマー）、または表２に示されるラットＩｇＧ ＶＬに特異的なプライマーセット（配列番号４８～７３に示される２６種のＦｏｒｗａｒｄプライマー、および配列番号７４～７８に示される５種のＲｅｖｅｒｓｅプライマー）を用いて、ｃ１９重鎖、軽鎖は、（１）９５℃ ２分、（２）９５℃ ３０秒、（３）５９．９℃ １分、（４）６８℃ １分、（２）－（４）を３５回繰り返し、（５）６８℃ ４分、ｃ３３重鎖、軽鎖は、（１）９５℃ ２分、（２）９５℃ ３０秒、（３）５５℃ １分、（４）６８℃ １分、（２）－（４）を３５回繰り返し、（５）６８℃ ４分の条件で行った。増幅した遺伝子配列、および該遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列は下記する通りである。増幅した遺伝子は、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（TAKARA）を用いて、クローニング用Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ２０プラスミド（TAKARA）にクローニングした。大腸菌株ＤＨ５αをｐＭＤ２０プラスミドで形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン入りＬＢ寒天（Sigma）プレートでコロニー形成後、ピックアップして１００μｇ／ｍＬアンピシリン入りＬＢ液体培地で培養後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いて抽出した。
【0055】
さらに、各モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ領域）におけるフレームワーク領域（ＨＦＲ１－３）および相補性決定領域（ＣＤＲ１－３）、軽鎖可変領域（ＶＬ領域）におけるフレームワーク領域（ＬＦＲ１－３）および相補性決定領域（ＣＤＲ１－３）をＣｈｏｔｈｉａのナンバリングスキームにしたがって決定した（図１）。
【0056】
【表1】
【0057】
【表2】
【0058】
c19重鎖可変領域の遺伝子配列（配列番号７９）
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAATCTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCAGTTTCAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTCCTAGTGGTGGTAGTACTTACTATCCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAGATGATGCAAAAAGCACCCAATACCTGCAAATGGACAGTCTGAGGCCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCTTCAGTAGCTTCAGTGGTGACTTACTACTGGTACTTTGACTTCTGGGGCCCAGGAACCATGGTCACCGTGTCCTCA
c19軽鎖可変領域の遺伝子配列（配列番号８０）
GACGTCCAGTTGACCCAGTCTCCTTCATTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTATCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAGACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGTGAAGCTCCCAAACTCCTGATGTATAATACAAACAGTTTGTATCCAGGAATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACTGATTTCACACTTACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCCACATATTTCTGCCTTCAGCATAACAGTGGGTGGGCGTTCGGTGGAGGCTCCAGGCAGGAACTGAAACGTAAT
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAATCTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCAGTTTCAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTCCTAGTGGTGGTAGTACTTACTATCCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAGATGATGCAAAAAGCACCCAATACCTGCAAATGGACAGTCTGAGGCCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCTTCAGTAGCTTCAGTGGTGACTTACTACTGGTACTTTGACTTCTGGGGCCCAGGAACCATGGTCACCGTGTCCTCA
c19軽鎖可変領域の遺伝子配列（配列番号８０）
GACGTCCAGTTGACCCAGTCTCCTTCATTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTATCAACTGCAAAGCAAGTCAGAATATTAACAAGTACTTAGACTGGTATCAGCAAAAGCTTGGTGAAGCTCCCAAACTCCTGATGTATAATACAAACAGTTTGTATCCAGGAATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACTGATTTCACACTTACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCCACATATTTCTGCCTTCAGCATAACAGTGGGTGGGCGTTCGGTGGAGGCTCCAGGCAGGAACTGAAACGTAAT
【0059】
c33重鎖可変領域の遺伝子配列（配列番号８１）
GAGGTGCAGCTAAAAGAGTCAGGACCTGGTCTGGTGCAGCCCTCACAGACCCTGTCTCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTAACCAGCTATCATGTAAGCTGGGTTCGCCAGCCTCCTGGAAAGAGTCTGGTGTGGGTGGGAACAATATGGGCTGGTGGAGGTACAAGTTATAATTCGGCTGTACAATCCCGACTGAGCATCAGCCGGGACACCTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAGTGAACAGTCTGCAACCTGAAGACACAGGCACTTACTACTGTGCCAGACTTTATATAGGTACAATTGGGGTATTTGATCACTGGGGCCAAGGAGCCATGGTCACCGTCTCCTCA
c33軽鎖可変領域の遺伝子配列（配列番号８２）
GACGTTGTGCTGACTCAGTCTCCAACCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGAGACAGTCAGTCTCTCCTGCAGGGCTAGCCATAGTATTGGCACAAATCTACACTGGTATCAGCAAAAAACAAATGAGTCTCCAAGGGTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGCCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTCAACATCAACAATGTGGAGTTTGATGATGTCTCAAGTTATTTTTGTCTACAGACTCAAAGCTGGCCCCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAACTGGAGATCAAACGGGCT
GAGGTGCAGCTAAAAGAGTCAGGACCTGGTCTGGTGCAGCCCTCACAGACCCTGTCTCTCACCTGCACTGTCTCTGGGTTCTCACTAACCAGCTATCATGTAAGCTGGGTTCGCCAGCCTCCTGGAAAGAGTCTGGTGTGGGTGGGAACAATATGGGCTGGTGGAGGTACAAGTTATAATTCGGCTGTACAATCCCGACTGAGCATCAGCCGGGACACCTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAGTGAACAGTCTGCAACCTGAAGACACAGGCACTTACTACTGTGCCAGACTTTATATAGGTACAATTGGGGTATTTGATCACTGGGGCCAAGGAGCCATGGTCACCGTCTCCTCA
c33軽鎖可変領域の遺伝子配列（配列番号８２）
GACGTTGTGCTGACTCAGTCTCCAACCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGAGACAGTCAGTCTCTCCTGCAGGGCTAGCCATAGTATTGGCACAAATCTACACTGGTATCAGCAAAAAACAAATGAGTCTCCAAGGGTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGCCAGTGGATCAGGGACAGATTTTACTCTCAACATCAACAATGTGGAGTTTGATGATGTCTCAAGTTATTTTTGTCTACAGACTCAAAGCTGGCCCCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAACTGGAGATCAAACGGGCT
【0060】
c19重鎖可変領域 (122アミノ酸)（配列番号７）
EVQLVESGGGLVQPGRSLNLSCAASGFSFSNYYMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGGSTYYPDSVKGRFTISRDDAKSTQYLQMDSLRPEDTATYYCASVASVVTYYWYFDFWGPGTMVTVSS
c19重鎖可変領域CDR1（配列番号１）
GFSFSNY
c19重鎖可変領域CDR2（配列番号２）
SPSGGS
c19重鎖可変領域CDR3（配列番号３）
VASVVTYYWYFDF
c19軽鎖可変領域 (108アミノ酸)（配列番号８）
DVQLTQSPSFLSASVGDRVTINCKASQNINKYLDWYQQKLGEAPKLLMYNTNSLYPGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCLQHNSGWAFGGGSRQELKRN
c19軽鎖可変領域CDR1（配列番号４）
KASQNINKYLD
c19軽鎖可変領域CDR2（配列番号５）
NTNSLYP
c19軽鎖可変領域CDR3（配列番号６）
LQHNSGWA
EVQLVESGGGLVQPGRSLNLSCAASGFSFSNYYMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGGSTYYPDSVKGRFTISRDDAKSTQYLQMDSLRPEDTATYYCASVASVVTYYWYFDFWGPGTMVTVSS
c19重鎖可変領域CDR1（配列番号１）
GFSFSNY
c19重鎖可変領域CDR2（配列番号２）
SPSGGS
c19重鎖可変領域CDR3（配列番号３）
VASVVTYYWYFDF
c19軽鎖可変領域 (108アミノ酸)（配列番号８）
DVQLTQSPSFLSASVGDRVTINCKASQNINKYLDWYQQKLGEAPKLLMYNTNSLYPGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCLQHNSGWAFGGGSRQELKRN
c19軽鎖可変領域CDR1（配列番号４）
KASQNINKYLD
c19軽鎖可変領域CDR2（配列番号５）
NTNSLYP
c19軽鎖可変領域CDR3（配列番号６）
LQHNSGWA
【0061】
c33重鎖可変領域 (119アミノ酸)（配列番号１５）
EVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYHVSWVRQPPGKSLVWVGTIWAGGGTSYNSAVQSRLSISRDTSKSQVFLKVNSLQPEDTGTYYCARLYIGTIGVFDHWGQGAMVTVSS
c33重鎖可変領域CDR1（配列番号９）
GFSLTSY
c33重鎖可変領域CDR2（配列番号１０）
WAGGG
c33重鎖可変領域CDR3（配列番号１１）
LYIGTIGVFDH
c33軽鎖可変領域 (109アミノ酸)（配列番号１６）
DVVLTQSPTTLSVTPGETVSLSCRASHSIGTNLHWYQQKTNESPRVLIKYASQSISGIPSRFSASGSGTDFTLNINNVEFDDVSSYFCLQTQSWPLTFGSGTKLEIKRA
c33軽鎖可変領域CDR1（配列番号１２）
RASHSIGTNLH
c33軽鎖可変領域CDR2（配列番号１３）
YASQSIS
c33軽鎖可変領域CDR3（配列番号１４）
LQTQSWPLT
EVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYHVSWVRQPPGKSLVWVGTIWAGGGTSYNSAVQSRLSISRDTSKSQVFLKVNSLQPEDTGTYYCARLYIGTIGVFDHWGQGAMVTVSS
c33重鎖可変領域CDR1（配列番号９）
GFSLTSY
c33重鎖可変領域CDR2（配列番号１０）
WAGGG
c33重鎖可変領域CDR3（配列番号１１）
LYIGTIGVFDH
c33軽鎖可変領域 (109アミノ酸)（配列番号１６）
DVVLTQSPTTLSVTPGETVSLSCRASHSIGTNLHWYQQKTNESPRVLIKYASQSISGIPSRFSASGSGTDFTLNINNVEFDDVSSYFCLQTQSWPLTFGSGTKLEIKRA
c33軽鎖可変領域CDR1（配列番号１２）
RASHSIGTNLH
c33軽鎖可変領域CDR2（配列番号１３）
YASQSIS
c33軽鎖可変領域CDR3（配列番号１４）
LQTQSWPLT
【0062】
実施例２：モノクローナル抗体の結合分子の決定
（１）モノクローナル抗体ｃ３３の結合分子の同定
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩの細胞溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Roche））と、ｃ３３抗体、またはアイソタイプコントロールＩｇＧ２ｂを１時間混合後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ＰＬＵＳ－Ａｇａｒｏｓｅ（Santa Cruz Biotechnology）を加えてさらに１時間撹拌し、免疫沈降を行った。沈降物を１Ｘドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミド（ＳＤＳ）ローディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、１％ＳＤＳ、および０．０５％ブロモフェノールブルー、１％β－メルカプトエタノール）で溶解し、９５℃で５分加熱後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＣＢＢ（WAKO）で染色後、ｃ３３抗体による免疫沈降に特異的なバンドを切り出し、Ｓｅｑｕａ－ｂｒｅｎｅ １０μｇ／ｕ溶液に短時間浸漬・乾燥後、サンプルの２／３程度を２片に切断し、Ｎ末端解析に用いた。装置用カラムは、Ｗａｋｏｓｉｌ ＰＴＨ－ＧＲ（Ｓ－ＰＳＱ）（WAKO）、シーケンサ装置はＰＰＳＱ－５３Ａ（Shimadzu）を用いた。その結果、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ β鎖を同定した。
（１）モノクローナル抗体ｃ３３の結合分子の同定
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩの細胞溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Roche））と、ｃ３３抗体、またはアイソタイプコントロールＩｇＧ２ｂを１時間混合後、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ ＰＬＵＳ－Ａｇａｒｏｓｅ（Santa Cruz Biotechnology）を加えてさらに１時間撹拌し、免疫沈降を行った。沈降物を１Ｘドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミド（ＳＤＳ）ローディングバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、１％ＳＤＳ、および０．０５％ブロモフェノールブルー、１％β－メルカプトエタノール）で溶解し、９５℃で５分加熱後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＣＢＢ（WAKO）で染色後、ｃ３３抗体による免疫沈降に特異的なバンドを切り出し、Ｓｅｑｕａ－ｂｒｅｎｅ １０μｇ／ｕ溶液に短時間浸漬・乾燥後、サンプルの２／３程度を２片に切断し、Ｎ末端解析に用いた。装置用カラムは、Ｗａｋｏｓｉｌ ＰＴＨ－ＧＲ（Ｓ－ＰＳＱ）（WAKO）、シーケンサ装置はＰＰＳＱ－５３Ａ（Shimadzu）を用いた。その結果、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ β鎖を同定した。
【0063】
（２）ＨＬＡ－ＤＲ β鎖の遺伝子クローニング
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩからＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ＢｃａＢＥＳＴＴＭ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（TAKARA）を用いてｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ法によりＨＬＡ－ＤＲβ鎖特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：atggtgtgtctgaagctccctg（配列番号８３）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー：tcagctcaggaatcctgttg（配列番号８４））、および２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（TAKARA）、ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（TAKARA）、Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（TAKARA）を用いて全長を増幅した。大腸菌での発現のため、シグナルペプチド以外の細胞外領域をＦｏｒｗａｒｄプライマー：ccccgaattcgggggacacccgaccacgtttc（配列番号８５）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー：caagctcgagcttgctctgtgcagattcag（配列番号８６）を用いて増幅し、塩基配列を確認した。ＰＣＲは、（１）９５℃ ２分、（２）９５℃ ３０秒、（３）５６℃ １分、（４）６８℃ １分、（２）－（４）を３５回繰り返し、（５）６８℃ ４分の条件で行った。増幅したＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域の遺伝子配列（５９４塩基）、そこから推定されるアミノ酸配列（１９８アミノ酸）は下記する通りである。増幅したＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域遺伝子、ならびに大腸菌発現用ｐＥＴ－２６ｂプラスミド（Merck）をＥｃｏＲＩ（TAKARA）、およびＸｈｏＩ（TAKARA）制限酵素切断部位で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いて精製した。ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（TAKARA）を用いて増幅したＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域遺伝子をｐＥＴ－２６ｂプラスミドに挿入し、ヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現できるようにした。１００μｇ／ｍＬアンピシリン入りＬＢ寒天プレートでコロニー形成後、ピックアップして１００μｇ／ｍＬアンピシリン入りＬＢ液体培地で培養後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いて抽出した。
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩからＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いてｍＲＮＡを抽出し、ＢｃａＢＥＳＴＴＭ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（TAKARA）を用いてｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲ法によりＨＬＡ－ＤＲβ鎖特異的なプライマー（Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：atggtgtgtctgaagctccctg（配列番号８３）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー：tcagctcaggaatcctgttg（配列番号８４））、および２．５ｍＭ ｄＮＴＰ（TAKARA）、ＴＡＫＡＲＡ Ｅｘ Ｔａｑ（TAKARA）、Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（TAKARA）を用いて全長を増幅した。大腸菌での発現のため、シグナルペプチド以外の細胞外領域をＦｏｒｗａｒｄプライマー：ccccgaattcgggggacacccgaccacgtttc（配列番号８５）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー：caagctcgagcttgctctgtgcagattcag（配列番号８６）を用いて増幅し、塩基配列を確認した。ＰＣＲは、（１）９５℃ ２分、（２）９５℃ ３０秒、（３）５６℃ １分、（４）６８℃ １分、（２）－（４）を３５回繰り返し、（５）６８℃ ４分の条件で行った。増幅したＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域の遺伝子配列（５９４塩基）、そこから推定されるアミノ酸配列（１９８アミノ酸）は下記する通りである。増幅したＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域遺伝子、ならびに大腸菌発現用ｐＥＴ－２６ｂプラスミド（Merck）をＥｃｏＲＩ（TAKARA）、およびＸｈｏＩ（TAKARA）制限酵素切断部位で消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いて精製した。ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＜Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ＞（TAKARA）を用いて増幅したＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域遺伝子をｐＥＴ－２６ｂプラスミドに挿入し、ヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現できるようにした。１００μｇ／ｍＬアンピシリン入りＬＢ寒天プレートでコロニー形成後、ピックアップして１００μｇ／ｍＬアンピシリン入りＬＢ液体培地で培養後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（QIAGEN）を用いて抽出した。
【0064】
増幅したＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域の遺伝子配列(594塩基)（配列番号８７）
GGGGACACCCGACCACGTTTCCTGTGGCAGCCTAAGAGGGAGTGTCATTTCTTCAATGGGACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTCTATAACCAGGAGGAGTCCGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGACGCTGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACATCCTGGAGCAGGCGCGGGCCGCGGTGGACACCTACTGCAGACACAACTACGGGGTTGGTGAGAGCTTCACAGTGCAGCGGCGAGTCCAACCTAAGGTGACTGTATATCCTTCAAAGACCCAGCCCCTGCAGCACCACAACCTCCTGGTCTGCTCTGTGAGTGGTTTCTATCCAGGCAGCATTGAAGTCAGGTGGTTCCTGAACGGCCAGGAAGAGAAGGCTGGGATGGTGTCCACAGGCCTGATCCAGAATGGAGACTGGACCTTCCAGACCCTGGTGATGCTGGAAACAGTTCCTCGAAGTGGAGAGGTTTACACCTGCCAAGTGGAGCACCCAAGCGTGACAAGCCCCCTCACAGTGGAATGGAGAGCACGGTCTGAATCTGCACAGAGCAAG
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域の推定アミノ酸配列(198アミノ酸)（配列番号８８）
GDTRPRFLWQPKRECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
GGGGACACCCGACCACGTTTCCTGTGGCAGCCTAAGAGGGAGTGTCATTTCTTCAATGGGACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTCTATAACCAGGAGGAGTCCGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTTCCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGACGCTGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACATCCTGGAGCAGGCGCGGGCCGCGGTGGACACCTACTGCAGACACAACTACGGGGTTGGTGAGAGCTTCACAGTGCAGCGGCGAGTCCAACCTAAGGTGACTGTATATCCTTCAAAGACCCAGCCCCTGCAGCACCACAACCTCCTGGTCTGCTCTGTGAGTGGTTTCTATCCAGGCAGCATTGAAGTCAGGTGGTTCCTGAACGGCCAGGAAGAGAAGGCTGGGATGGTGTCCACAGGCCTGATCCAGAATGGAGACTGGACCTTCCAGACCCTGGTGATGCTGGAAACAGTTCCTCGAAGTGGAGAGGTTTACACCTGCCAAGTGGAGCACCCAAGCGTGACAAGCCCCCTCACAGTGGAATGGAGAGCACGGTCTGAATCTGCACAGAGCAAG
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域の推定アミノ酸配列(198アミノ酸)（配列番号８８）
GDTRPRFLWQPKRECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
【0065】
（３）ＨＬＡ－ＤＲβ鎖の組換えタンパク質の発現・精製
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域遺伝子をクローニングしたｐＥＴ－２６ｂプラスミドで、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Merck）を形質転換した。培養後、１ｍＭ ＩＰＴＧにより遺伝子発現を誘導し、封入体画分にタンパク質が発現していることを確認した。封入体を６Ｍグアニジン塩酸塩／１Ｍ ＤＴＴで可溶化後、リフォールディングバッファー（１Ｍ Ｌ－Ａｒｇ、Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ、Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＥＤＴＡ）で巻き戻し、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーによりリフォールディングしたＨＬＡ－ＤＲβ鎖を精製した。精製にはＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（GE）を使用した。なお、ｐＥＴ－２６ｂプラスミドの挿入部位のＣ末端側にはＨｉｓタグ配列があるため、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖はＨｉｓタグとの融合タンパク質として発現させた。
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖細胞外領域遺伝子をクローニングしたｐＥＴ－２６ｂプラスミドで、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Merck）を形質転換した。培養後、１ｍＭ ＩＰＴＧにより遺伝子発現を誘導し、封入体画分にタンパク質が発現していることを確認した。封入体を６Ｍグアニジン塩酸塩／１Ｍ ＤＴＴで可溶化後、リフォールディングバッファー（１Ｍ Ｌ－Ａｒｇ、Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ、Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ ＥＤＴＡ）で巻き戻し、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーによりリフォールディングしたＨＬＡ－ＤＲβ鎖を精製した。精製にはＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（GE）を使用した。なお、ｐＥＴ－２６ｂプラスミドの挿入部位のＣ末端側にはＨｉｓタグ配列があるため、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖はＨｉｓタグとの融合タンパク質として発現させた。
【0066】
（４）ウェスタンブロット
精製したＨＬＡ－ＤＲ β鎖を１０μｇ用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ならびにウェスタンブロットを行った。ｃ１９抗体およびｃ３３抗体１μｇを一次抗体、抗ラットＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（Invitrogen）を二次抗体として用いて約２５ｋＤａのバンドを検出した。また、抗体Ｈｉｓタグ抗体１μｇを一次抗体、抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（Invitrogen）を二次抗体として用いて約２５ｋＤａのバンドを検出した。Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（LI-COR Biosciences）により解析した。その結果、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖はｃ１９抗体およびｃ３３抗体のいずれでも検出された（図２）。したがって、ｃ１９抗体およびｃ３３抗体がＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合することが分かった。
精製したＨＬＡ－ＤＲ β鎖を１０μｇ用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ならびにウェスタンブロットを行った。ｃ１９抗体およびｃ３３抗体１μｇを一次抗体、抗ラットＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（Invitrogen）を二次抗体として用いて約２５ｋＤａのバンドを検出した。また、抗体Ｈｉｓタグ抗体１μｇを一次抗体、抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（Invitrogen）を二次抗体として用いて約２５ｋＤａのバンドを検出した。Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（LI-COR Biosciences）により解析した。その結果、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖はｃ１９抗体およびｃ３３抗体のいずれでも検出された（図２）。したがって、ｃ１９抗体およびｃ３３抗体がＨＬＡ－ＤＲ β鎖に特異的に結合することが分かった。
【0067】
（５）フローサイトメーター
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ、ＳＴ１、ＫＯＢ、ＭＴ－１、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）感染細胞株Ｃ５／ＭＪ、ＨＵＴ－１０２、ＳＬＢ－１、ＭＴ－２、ＭＴ－４、バーキットリンパ腫細胞株ＢＪＡＢ、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、急性Ｔ細胞性白血病細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＯＬＴ－４ １ｘ１０６個から、ｃ１９抗体およびｃ３３抗体１μｇを一次抗体、抗ラットＩｇＧ－ＰＥを二次抗体として用いてＨＬＡ－ＤＲβ鎖を検出した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD）により解析した。細胞は、ＲＰＭＩ－１６４０（WAKO）、１０％ＦＢＳ（BioWest）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（WAKO）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。また、コントロールとして、市販の抗ＨＬＡ－ＤＲ α鎖抗体Ｌ２４３を用いて同様の実験を行った。その結果、急性Ｔ細胞性白血病細胞株以外の全ての細胞株においてｃ１９抗体およびｃ３３抗体が結合したことが示され、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖の発現が確認された。また、Ｌ２４３についても、急性Ｔ細胞性白血病細胞株以外の全ての細胞株において結合したことが示され、ＨＬＡ－ＤＲα鎖の発現が確認された。なお、ＨＴＬＶ－１感染細胞株とは、ＡＴＬ患者から樹立されたリンパ球細胞株と、正常リンパ球細胞を共培養した結果、正常リンパ球細胞にウイルスが感染してがん化（トランスフォーム）したものである。
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ、ＳＴ１、ＫＯＢ、ＭＴ－１、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ－１）感染細胞株Ｃ５／ＭＪ、ＨＵＴ－１０２、ＳＬＢ－１、ＭＴ－２、ＭＴ－４、バーキットリンパ腫細胞株ＢＪＡＢ、Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、急性Ｔ細胞性白血病細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＯＬＴ－４ １ｘ１０６個から、ｃ１９抗体およびｃ３３抗体１μｇを一次抗体、抗ラットＩｇＧ－ＰＥを二次抗体として用いてＨＬＡ－ＤＲβ鎖を検出した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD）により解析した。細胞は、ＲＰＭＩ－１６４０（WAKO）、１０％ＦＢＳ（BioWest）、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（WAKO）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。また、コントロールとして、市販の抗ＨＬＡ－ＤＲ α鎖抗体Ｌ２４３を用いて同様の実験を行った。その結果、急性Ｔ細胞性白血病細胞株以外の全ての細胞株においてｃ１９抗体およびｃ３３抗体が結合したことが示され、ＨＬＡ－ＤＲβ鎖の発現が確認された。また、Ｌ２４３についても、急性Ｔ細胞性白血病細胞株以外の全ての細胞株において結合したことが示され、ＨＬＡ－ＤＲα鎖の発現が確認された。なお、ＨＴＬＶ－１感染細胞株とは、ＡＴＬ患者から樹立されたリンパ球細胞株と、正常リンパ球細胞を共培養した結果、正常リンパ球細胞にウイルスが感染してがん化（トランスフォーム）したものである。
【0068】
実施例３：表面プラズモン共鳴解析
ＢｉａｃｏｒｅＴ２００のＣＭ５センサーチップ上のカルボキシメチルデキストランマトリックスを、１：１の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させ、フローセル１と３には１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解したウシ血清アルブミン（１０μＭ）を、フローセル２と４には１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に溶解したＨＬＡ－ＤＲβ鎖（５０μＭ）をアミンカップリング法により固定化した。カップリング反応に使用されなかったＣＭ５センサーチップ上のカルボキシ末端は、１０ｍＭエタノールアミンでブロッキングした。１×ＨＢＳ－Ｐ＋バッファーで希釈したｃ１９モノクローナル抗体（０．３１２５ｎＭ、０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ）、またはｃ３３モノクローナル抗体（５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、８０ｎＭ）をそれぞれアナライトとして、フローセルに３０μｌ／分の流速で流すことにより相互作用測定を行った（アナライトの添加時間は１２０秒、解離時間は６００秒）。センサーチップの再生化は、１０ｍＭ Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒（流速３０μｌ／分）流すことで行った。Ｋｉｎｅｔｉｃｓ解析の結果、ｃ１９モノクローナル抗体とＨＬＡ－ＤＲβ鎖の見かけの解離定数は０．３３ｎＭ、ｃ３３モノクローナル抗体とＨＬＡ－ＤＲβ鎖の見かけの解離定数は４．５０ｎＭであった（図３）。
ＢｉａｃｏｒｅＴ２００のＣＭ５センサーチップ上のカルボキシメチルデキストランマトリックスを、１：１の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩／Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドにより活性化させ、フローセル１と３には１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に溶解したウシ血清アルブミン（１０μＭ）を、フローセル２と４には１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に溶解したＨＬＡ－ＤＲβ鎖（５０μＭ）をアミンカップリング法により固定化した。カップリング反応に使用されなかったＣＭ５センサーチップ上のカルボキシ末端は、１０ｍＭエタノールアミンでブロッキングした。１×ＨＢＳ－Ｐ＋バッファーで希釈したｃ１９モノクローナル抗体（０．３１２５ｎＭ、０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ）、またはｃ３３モノクローナル抗体（５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、８０ｎＭ）をそれぞれアナライトとして、フローセルに３０μｌ／分の流速で流すことにより相互作用測定を行った（アナライトの添加時間は１２０秒、解離時間は６００秒）。センサーチップの再生化は、１０ｍＭ Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒（流速３０μｌ／分）流すことで行った。Ｋｉｎｅｔｉｃｓ解析の結果、ｃ１９モノクローナル抗体とＨＬＡ－ＤＲβ鎖の見かけの解離定数は０．３３ｎＭ、ｃ３３モノクローナル抗体とＨＬＡ－ＤＲβ鎖の見かけの解離定数は４．５０ｎＭであった（図３）。
【0069】
実施例４：エピトープマッピング
実施例２－（２）と同様の条件で、Ｎ末端から順次、７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、２５アミノ酸残基、３４アミノ酸残基、３８アミノ酸残基、４０アミノ酸残基、４８アミノ酸残基、７４アミノ酸残基、および１０７アミノ酸残基を欠損している９つのＮ末端欠損ＨＬＡ－ＤＲβ鎖を増幅し、塩基配列を確認した。Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは、各Ｎ末端欠損ＨＬＡ－ＤＲβ鎖に特異的な配列とし、下記の配列（配列番号８９～９７）を用いた。Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして、配列番号８６（caagctcgagcttgctctgtgcagattcag）の共通配列を用いた。
実施例２－（２）と同様の条件で、Ｎ末端から順次、７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、２５アミノ酸残基、３４アミノ酸残基、３８アミノ酸残基、４０アミノ酸残基、４８アミノ酸残基、７４アミノ酸残基、および１０７アミノ酸残基を欠損している９つのＮ末端欠損ＨＬＡ－ＤＲβ鎖を増幅し、塩基配列を確認した。Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは、各Ｎ末端欠損ＨＬＡ－ＤＲβ鎖に特異的な配列とし、下記の配列（配列番号８９～９７）を用いた。Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーとして、配列番号８６（caagctcgagcttgctctgtgcagattcag）の共通配列を用いた。
【0070】
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(8-198アミノ酸)：cagcgaattcgctgtggcagcctaagagggag（配列番号８９）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(16-198アミノ酸)：atgcgaattcgcatttcttcaatgggacgg（配列番号９０）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(26-198アミノ酸)：gaacgaattcgttcctggacagatacttctataac（配列番号９１）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(35-198アミノ酸)：ctccgaattcggaggagtccgtgcgcttcgac（配列番号９２）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(39-198アミノ酸)：gcgcgaattcgcgcttcgacagcgacgtggg（配列番号９３）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(41-198アミノ酸)：gtccgaattcggacagcgacgtgggggagttc（配列番号９４）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(49-198アミノ酸)：cgccgaattcggcggtgacggagctggggc（配列番号９５）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(75-198アミノ酸)：caccgaattcggtggacacctactgcagac（配列番号９６）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(108-198アミノ酸)：gggcgaattcgcccctgcagcaccacaacc（配列番号９７）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(8-198アミノ酸)：cagcgaattcgctgtggcagcctaagagggag（配列番号８９）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(16-198アミノ酸)：atgcgaattcgcatttcttcaatgggacgg（配列番号９０）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(26-198アミノ酸)：gaacgaattcgttcctggacagatacttctataac（配列番号９１）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(35-198アミノ酸)：ctccgaattcggaggagtccgtgcgcttcgac（配列番号９２）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(39-198アミノ酸)：gcgcgaattcgcgcttcgacagcgacgtggg（配列番号９３）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(41-198アミノ酸)：gtccgaattcggacagcgacgtgggggagttc（配列番号９４）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(49-198アミノ酸)：cgccgaattcggcggtgacggagctggggc（配列番号９５）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(75-198アミノ酸)：caccgaattcggtggacacctactgcagac（配列番号９６）
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(108-198アミノ酸)：gggcgaattcgcccctgcagcaccacaacc（配列番号９７）
【0071】
増幅された遺伝子配列から推定されるアミノ酸配列は以下の通りである。
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(8-198アミノ酸)（配列番号９８）
LWQPKRECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(16-198アミノ酸)（配列番号９９）
HFFNGTERVRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(26-198アミノ酸)（配列番号１００）
FLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(35-198アミノ酸)（配列番号１０１）
EESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(39-198アミノ酸)（配列番号１０２）
RFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(41-198アミノ酸)（配列番号１０３）
DSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(49-198アミノ酸)（配列番号１０４）
AVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(75-198アミノ酸)（配列番号１０５）
VDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(108-198アミノ酸)（配列番号１０６）
PLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(8-198アミノ酸)（配列番号９８）
LWQPKRECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(16-198アミノ酸)（配列番号９９）
HFFNGTERVRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(26-198アミノ酸)（配列番号１００）
FLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(35-198アミノ酸)（配列番号１０１）
EESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(39-198アミノ酸)（配列番号１０２）
RFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(41-198アミノ酸)（配列番号１０３）
DSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(49-198アミノ酸)（配列番号１０４）
AVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(75-198アミノ酸)（配列番号１０５）
VDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
ＨＬＡ－ＤＲβ鎖(108-198アミノ酸)（配列番号１０６）
PLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
【0072】
実施例２－（３）と同様の条件で、各Ｎ末端欠損ＨＬＡ－ＤＲβ鎖組換えタンパク質の発現・精製を行い、実施例２－（３）で得られた全長ＨＬＡ－ＤＲβ鎖組換えタンパク質と共に、実施例２－（４）と同様の条件で、抗Ｈｉｓタグ抗体１μｇを一次抗体、抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（Invitrogen）を二次抗体として用いて全ての組換えタンパク質発現を確認した（図４）。さらに、ｃ１９モノクローナル抗体とｃ３３モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットを行った結果、ｃ１９モノクローナル抗体に対するＨＬＡ－ＤＲβ鎖の結合部位は、Ｎ末端はアミノ酸番号３５付近、Ｃ末端はアミノ酸番号４０付近にあり、またｃ３３モノクローナル抗体に対するＨＬＡ－ＤＲβ鎖の結合部位は、Ｎ末端はアミノ酸番号８付近、Ｃ末端はアミノ酸番号１５付近にあることが分かった（図４）。以下に推定されるそれぞれのモノクローナル抗体の結合部位（エピトープ）のアミノ酸配列を示す。
ｃ１９モノクローナル抗体が結合するアミノ酸配列：ＥＥＳＶＲＦ（配列番号１７）
ｃ３３モノクローナル抗体が結合するアミノ酸配列：ＬＷＱＰＫＲＥＣ（配列番号１８）
ｃ１９モノクローナル抗体が結合するアミノ酸配列：ＥＥＳＶＲＦ（配列番号１７）
ｃ３３モノクローナル抗体が結合するアミノ酸配列：ＬＷＱＰＫＲＥＣ（配列番号１８）
【0073】
なお、上記エピトープ配列は、ＨＬＡ－ＤＲ β鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）においてそれぞれ、アミノ酸番号６４～６９（ｃ１９モノクローナル抗体のエピトープ）およびアミノ酸番号３７～４４（ｃ３３モノクローナル抗体のエピトープ）に相当する。
【0074】
ＨＬＡ－ＤＲ β鎖の全長アミノ酸配列(266アミノ酸)（配列番号１９）
MVCLKLPGGSCMTALTVTLMVLSSPLALSGDTRPRFLWQPKRECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLQPTGFLS
シグナルペプチド：アミノ酸番号１～29の29アミノ酸
細胞外領域：アミノ酸番号30～227の198アミノ酸
細胞膜領域＋細胞内領域：アミノ酸番号228～266の39アミノ酸
MVCLKLPGGSCMTALTVTLMVLSSPLALSGDTRPRFLWQPKRECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSKMLSGVGGFVLGLLFLGAGLFIYFRNQKGHSGLQPTGFLS
シグナルペプチド：アミノ酸番号１～29の29アミノ酸
細胞外領域：アミノ酸番号30～227の198アミノ酸
細胞膜領域＋細胞内領域：アミノ酸番号228～266の39アミノ酸
【0075】
実施例５：細胞増殖抑制試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および細胞凝集試験
（１）細胞増殖抑制試験
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ、ＳＴ１、ＫＯＢ、Ｔ細胞性急性白血病細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ ２ｘ１０４個を９６穴プレートに播種し、ｃ１９抗体およびｃ３３抗体を異なる希釈倍率（ｃ１９抗体濃度０．１２８、１．２８、１２．８、１２８μｇ／ｍｌ、または３．１２５、６．２５、１２．５、２５μｇ／ｍｌ；ｃ３３抗体濃度０．２９８、２．９８、２９．８、２９８μｇ／ｍｌ）で添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。添加７２時間後、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ＷＳＴ－１試薬（Roshe）を添加し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＳｐｉｒｅを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。結果を図５－１および図５－２に示す。抗体無添加の場合の細胞増殖率を１００％とし、各濃度の抗体添加時の相対値（％）を示した。ｃ１９抗体の添加により、ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ、ＳＴ１、ＫＯＢの増殖が濃度依存的に抑制された（図５－１）が、急性Ｔ細胞性白血病細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭに対しては濃度依存的な増殖抑制効果を示さなかった。一方、ｃ３３抗体の添加は、いずれの細胞株に対しても増殖抑制効果を示さなかった（図５－２）。
（１）細胞増殖抑制試験
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ、ＳＴ１、ＫＯＢ、Ｔ細胞性急性白血病細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ ２ｘ１０４個を９６穴プレートに播種し、ｃ１９抗体およびｃ３３抗体を異なる希釈倍率（ｃ１９抗体濃度０．１２８、１．２８、１２．８、１２８μｇ／ｍｌ、または３．１２５、６．２５、１２．５、２５μｇ／ｍｌ；ｃ３３抗体濃度０．２９８、２．９８、２９．８、２９８μｇ／ｍｌ）で添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。添加７２時間後、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ＷＳＴ－１試薬（Roshe）を添加し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＳｐｉｒｅを用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。結果を図５－１および図５－２に示す。抗体無添加の場合の細胞増殖率を１００％とし、各濃度の抗体添加時の相対値（％）を示した。ｃ１９抗体の添加により、ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ、ＳＴ１、ＫＯＢの増殖が濃度依存的に抑制された（図５－１）が、急性Ｔ細胞性白血病細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭに対しては濃度依存的な増殖抑制効果を示さなかった。一方、ｃ３３抗体の添加は、いずれの細胞株に対しても増殖抑制効果を示さなかった（図５－２）。
【0076】
（２）細胞凝集試験
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ、ＳＴ１、ＫＯＢ、ＭＴ－１、急性Ｔ細胞性白血病細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４ ２ｘ１０４個を９６穴プレートに播種し、ｃ１９抗体３．１２５μｇ／ｍＬ（ｌｏｗ ｃｏｎｃ．）または１２．５μｇ／ｍＬ（ｈｉｇｈ ｃｏｎｃ．）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。２４時間後、細胞凝集を確認した。対照として、抗体と同容量のＰＢＳまたはコントロールＩｇＧを添加して同様に試験した。その結果、ＡＴＬ細胞にｃ１９抗体を添加した場合、細胞凝集が観察されたが、急性Ｔ細胞性白血病細胞では細胞凝集は見られなかった（図６）。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞抑制試験の結果と共に考察すると、おそらく細胞表面上のＨＬＡ－ＤＲ β鎖の発現量（または発現数）と細胞凝集の度合いに相関性があり、凝集の度合いが多いほど抗体が抗原により多く結合していると考えられる。
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ、ＳＴ１、ＫＯＢ、ＭＴ－１、急性Ｔ細胞性白血病細胞株ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ－４ ２ｘ１０４個を９６穴プレートに播種し、ｃ１９抗体３．１２５μｇ／ｍＬ（ｌｏｗ ｃｏｎｃ．）または１２．５μｇ／ｍＬ（ｈｉｇｈ ｃｏｎｃ．）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。２４時間後、細胞凝集を確認した。対照として、抗体と同容量のＰＢＳまたはコントロールＩｇＧを添加して同様に試験した。その結果、ＡＴＬ細胞にｃ１９抗体を添加した場合、細胞凝集が観察されたが、急性Ｔ細胞性白血病細胞では細胞凝集は見られなかった（図６）。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞抑制試験の結果と共に考察すると、おそらく細胞表面上のＨＬＡ－ＤＲ β鎖の発現量（または発現数）と細胞凝集の度合いに相関性があり、凝集の度合いが多いほど抗体が抗原により多く結合していると考えられる。
【0077】
実施例６：マウス腫瘍移植モデルにおける腫瘍成長抑制効果（ｉｎ ｖｉｖｏ）
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ １ｘ１０７個をＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス（メス、６週齢）（実験動物中央研究所）の皮下に接種し、腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達した後、精製したｃ１９モノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで４回（ＡＴＬ細胞接種後１０日目、１３日目、１６日目、１９日目）尾静脈接種した。抗体のアイソタイプコントロールとして、ラットＩｇＧ２ｂを同容量で使用した。投与開始後から２週間、経時的に腫瘍径および体重を測定した。その結果、コントロールと比べて、ｃ１９抗体を投与した場合に腫瘍体積の増加が抑えられた（図７）。なお、腫瘍体積は、腫瘍の長径と短径を測定し、長径×短径×短径/２から算出した。コントロール群と比較して、ｃ１９投与群で体重変化に大きな違いは観察されなかった。
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩ １ｘ１０７個をＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＯＧ）マウス（メス、６週齢）（実験動物中央研究所）の皮下に接種し、腫瘍体積が約２００ｍｍ３に達した後、精製したｃ１９モノクローナル抗体を０．５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇで４回（ＡＴＬ細胞接種後１０日目、１３日目、１６日目、１９日目）尾静脈接種した。抗体のアイソタイプコントロールとして、ラットＩｇＧ２ｂを同容量で使用した。投与開始後から２週間、経時的に腫瘍径および体重を測定した。その結果、コントロールと比べて、ｃ１９抗体を投与した場合に腫瘍体積の増加が抑えられた（図７）。なお、腫瘍体積は、腫瘍の長径と短径を測定し、長径×短径×短径/２から算出した。コントロール群と比較して、ｃ１９投与群で体重変化に大きな違いは観察されなかった。
【0078】
実施例７：補体依存性細胞傷害活性
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩをアジュバント（Difco Laboratories）とともにＷｉｓｔａｒラット（メス、７週齢）（日本ＳＬＣ）の皮下に免疫し、３週間後に血液を採取し、血漿成分を分離した。この血漿をＴＬ－ＯｍＩに添加することで細胞死（細胞溶解）が観察されたことから、補体依存性細胞傷害活性が確認された。また、実施例１で得られた精製したｃ１９モノクローナル抗体をＴＬ－ＯｍＩに添加し、非免疫ラット由来の血漿成分を添加することでも細胞死が観察されたことから、ｃ１９モノクローナル抗体の補体依存性細胞傷害活性が確認された。
ＡＴＬ細胞株ＴＬ－ＯｍＩをアジュバント（Difco Laboratories）とともにＷｉｓｔａｒラット（メス、７週齢）（日本ＳＬＣ）の皮下に免疫し、３週間後に血液を採取し、血漿成分を分離した。この血漿をＴＬ－ＯｍＩに添加することで細胞死（細胞溶解）が観察されたことから、補体依存性細胞傷害活性が確認された。また、実施例１で得られた精製したｃ１９モノクローナル抗体をＴＬ－ＯｍＩに添加し、非免疫ラット由来の血漿成分を添加することでも細胞死が観察されたことから、ｃ１９モノクローナル抗体の補体依存性細胞傷害活性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【0079】
本発明の新規な抗ＨＬＡ－ＤＲ β鎖抗体は、ＡＴＬを含む血液がんの治療に用いることができ、がん化細胞、特にＡＴＬ細胞の増殖を抑制することができる。また、本発明の新規な抗ＨＬＡ－ＤＲ β鎖抗体は、ＡＴＬを含む血液がんの検出ツールとして、または抗がん剤等の他の薬剤との抗原薬物複合体（ＡＤＣ）として使用することもできる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【配列表】