特開 2024-65647 グロムス細胞様細胞およびその作製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024065647

(43)【公開日】2024-05-15

(54)【発明の名称】グロムス細胞様細胞およびその作製方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/079 20100101AFI20240508BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240508BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20240508BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240508BHJP

【ＦＩ】

C12N5/079 ZNA

C12N5/10

C12Q1/06

C12N15/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022174625

(22)【出願日】2022-10-31

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(72)【発明者】

【氏名】木田 泰之

(72)【発明者】

【氏名】赤木 祐香

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ63

4B063QR90

4B063QS25

4B063QS32

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BD25

4B065CA24

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】 頸動脈小体の低酸素応答を再現し得るグロムス細胞様細胞を提供する。
【解決手段】 （ａ）多能性幹細胞の自律神経前駆細胞への分化を誘導するステップ、および（ｂ）前記ステップ（ａ）により得られた自律神経前駆細胞を、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＥＧＦシグナル経路活性化剤およびＩＧＦ－１シグナル経路活性化剤の存在下で培養するステップを含む、グロムス細胞様細胞を作製する方法。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）多能性幹細胞の自律神経前駆細胞への分化を誘導するステップ、および
（ｂ）前記ステップ（ａ）により得られた自律神経前駆細胞を、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＥＧＦシグナル経路活性化剤およびＩＧＦ－１シグナル経路活性化剤の存在下で培養するステップ
を含む、グロムス細胞様細胞を作製する方法。

【請求項2】

（ｃ）前記ステップ（ａ）の前に、前記多能性幹細胞に内皮ＰＡＳドメイン含有タンパク質１をコードする外因性核酸を導入するステップ
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＦＧＦシグナル経路活性化剤がｂＦＧＦである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＥＧＦシグナル経路活性化剤がＥＧＦである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記ＩＧＦ－１シグナル経路活性化剤がＩＧＦ－１である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

請求項１～６のいずれか１項に記載の方法により得られたグロムス細胞様細胞。

【請求項8】

内皮ＰＡＳドメイン含有タンパク質１をコードする外因性核酸を含んでなり、チロシン水酸化酵素、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー３および嗅覚受容体５１Ｅ２を発現する、グロムス細胞様細胞。

【請求項9】

低酸素状態においてＡＴＰまたはドーパミンもしくはその代謝物の産生量が増加する、請求項７または８に記載のグロムス細胞様細胞。

【請求項10】

（１）請求項７～９のいずれか１項に記載のグロムス細胞様細胞に候補化合物を接触させるステップ、および
（２）前記グロムス細胞様細胞から放出されたＡＴＰを測定するステップ
を含む、グロムス細胞の活性を調節する化合物のスクリーニング方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グロムス細胞様細胞およびその作製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

頸動脈小体（ＣＢ）は、頚動脈の分岐部に位置する末梢性化学受容器である。ＣＢは、神経様のグロムス細胞（Ｉ型細胞とも呼ばれる）とグリア様の支持細胞（ＩＩ型細胞とも呼ばれる）とから構成され、グロムス細胞が化学受容器の機能を有する。グロムス細胞は、低酸素状態、高二酸化炭素血状態またはアシドーシスを感知すると、ＡＴＰやドーパミンなどの神経伝達物質を放出し、舌咽神経を介して延髄を刺激し、その結果、呼吸数および心拍数の増加が誘発される。そのため、グロムス細胞の感度や神経伝達物質の放出活性を調節する化合物は、呼吸不全の治療薬の候補となり得る。さらに、近年では、グロムス細胞はインスリンやグルコースを感知し、エネルギー恒常性の維持に関与していることが明らかにされており、糖尿病の新たな治療標的としても注目されている。

【0003】

従来、ＣＢの研究には、ヒト以外の動物モデルが使用されてきた。しかし、多数の治療薬候補を試験するためには相当数の動物が必要であり、多大な時間的・経済的コストがかかることが問題となる。さらに、近年では、動物福祉・愛護などの倫理上の観点からも、動物を用いない代替試験系が強く望まれている。また、動物種差を考慮し、ヒトに近い試験系が求められており、ヒトグロムス細胞を用いたインビトロＣＢモデルの開発が望まれている。

【0004】

一方、ＣＢの支持細胞はグロムス細胞の前駆細胞であり、インビトロにおいて支持細胞からグロムス細胞を作製できることが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。しかし、グロムス細胞を作製するためには支持細胞を動物から採取する必要があるため、特にヒトグロムス細胞の大量培養には困難が存在する。ヒト多能性幹細胞からグロムス細胞または支持細胞を作製する方法は、今までに報告されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】国際公開第２００９／０１６２６２

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｐａｒｄａｌ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００７；１３１（２）：３６４－３７７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、インビトロにおいてＣＢの低酸素応答を再現し得るグロムス細胞様細胞、およびその容易かつ効率的な調製方法を提供することを目的としてなされたものである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、これまでヒト多能性幹細胞から自律神経細胞またはその前駆細胞を効率的に誘導する技術を開発している（例えば、国際公開第２０１６／１９４５２２）。本発明者らは、上記方法に特定の培養条件を追加することにより、多能性幹細胞から低酸素応答を示すグロムス細胞様細胞を作出することに成功した。

【0009】

すなわち、本発明は、一実施形態によれば、（ａ）多能性幹細胞の自律神経前駆細胞への分化を誘導するステップ、および（ｂ）前記ステップ（ａ）により得られた自律神経前駆細胞を、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＥＧＦシグナル経路活性化剤およびＩＧＦ－１シグナル経路活性化剤の存在下で培養するステップを含む、グロムス細胞様細胞を作製する方法を提供するものである。

【0010】

前記方法は、（ｃ）前記ステップ（ａ）の前に、前記多能性幹細胞に内皮ＰＡＳドメイン含有タンパク質１（ＥＰＡＳ１）をコードする外因性核酸を導入するステップをさらに含むことが好ましい。

【0011】

前記ＦＧＦシグナル経路活性化剤はｂＦＧＦであることが好ましい。

【0012】

前記ＥＧＦシグナル経路活性化剤はＥＧＦであることが好ましい

【0013】

前記ＩＧＦ－１シグナル経路活性化剤はＩＧＦ－１であることが好ましい。

【0014】

前記多能性幹細胞はヒト由来であることが好ましい。

【0015】

また、本発明は、一実施形態によれば、上記方法により作製された、グロムス細胞様細胞を提供するものである。

【0016】

また、本発明は、一実施形態によれば、ＥＰＡＳ１をコードする外因性核酸を含んでなり、チロシン水酸化酵素、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー３および嗅覚受容体５１Ｅ２を発現するグロムス細胞様細胞を提供するものである。

【0017】

上記グロムス細胞様細胞は、低酸素状態においてＡＴＰまたはドーパミンもしくはその代謝物の産生量が増加するものであることが好ましい。

【0018】

また、本発明は、一実施形態によれば、（１）上記グロムス細胞様細胞に候補化合物を接触させるステップ、および（２）前記グロムス細胞様細胞から放出されたＡＴＰを測定するステップを含む、グロムス細胞の活性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0019】

本発明に係る方法によれば、グロムス細胞様細胞を、高効率かつ容易に作製することができる。また、本発明に係るグロムス細胞様細胞は低酸素応答性に優れており、インビトロＣＢモデルの開発、ＣＢの活性を調節する化合物の探索、ＣＢが関連する疾患の治療薬の開発のために有用である。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、グロムス細胞様細胞の作製スケジュールを示す概略図である。

【図2】図２は、誘導０日目の胚様体（ＥＢ）、誘導１３日目の細胞（自律神経前駆細胞）および誘導１６日目の細胞（グロムス細胞様細胞）の顕微鏡像（明視野）を示す図である。

【図3】図３は、誘導－３日目のｉＰＳ細胞（図中「ｈｉＰＳＣ」と表記）、誘導１３日目の細胞（「Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ」と表記）および誘導１６日目の細胞（「Ｇｌｏｍｕｓ ｃｅｌｌｓ」と表記）についてのＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果を示すヒートマップである。

【図4】図４は、誘導０日目のＥＢ、誘導１３日目の細胞（自律神経前駆細胞）および誘導１８日目の細胞（グロムス細胞様細胞）におけるＯＲ５１Ｅ２遺伝子の発現量を示すグラフである。

【図5】図５は、低酸素刺激に応じたグロムス細胞様細胞のＡＴＰ産生を示すグラフである。

【図6】図６は、低酸素刺激に応じたグロムス細胞様細胞のエピネフリン産生を示すグラフである。

【図7】図７は、低酸素刺激に応じたグロムス細胞様細胞のドーパミン（ＤＡ）産生を示すグラフである。

【図8】図８は、低酸素刺激に応じたグロムス細胞様細胞の３，４－ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）産生を示すグラフである。

【図9】図９は、低酸素刺激に応じたグロムス細胞様細胞におけるＴＨ遺伝子の発現量を示すグラフである。

【図10】図１０は、低酸素刺激に応じたグロムス細胞様細胞におけるＫＣＮＫ３遺伝子の発現量を示すグラフである。

【図11】図１１は、低酸素刺激に応じたグロムス細胞様細胞のＡＴＰ産生に対するテトラエチルアンモニウムクロリド（ＴＥＡ）の促進効果を示すグラフである。

【図12】図１２は、低酸素刺激に応じたグロムス細胞様細胞のＡＴＰ産生に対するニフェジピン（Ｎｉｆ．）の抑制効果を示すグラフである。

【図13】図１３は、低酸素刺激に応じたグロムス細胞様細胞のＡＴＰ産生に対するリドカイン（Ｌｉｄ．）の抑制効果を示すグラフである。

【図14】図１４は、外因性ＥＰＡＳ１遺伝子を導入したｉＰＳ細胞におけるＥＰＡＳ１遺伝子の発現量を示すグラフである。

【図15】図１５は、外因性ＥＰＡＳ１遺伝子を導入したｉＰＳ細胞から調製された誘導１７日目の細胞におけるＥＰＡＳ１遺伝子の発現量を示すグラフである。

【図16】図１６は、ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞（未分化、誘導－３日目、図中「ｈｉＰＳＣ」と表記）、ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞から誘導された自律神経前駆細胞（誘導１３日目、「Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ」と表記）およびＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞（誘導１７日目、「Ｇｌｏｍｕｓ ｃｅｌｌｓ」と表記）におけるＴＨ遺伝子の発現量を示すグラフである。

【図17】図１７は、ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞（未分化、誘導－３日目）、ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞から誘導された自律神経前駆細胞（誘導１３日目）およびＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞（誘導１７日目）におけるＫＣＮＫ３遺伝子の発現量を示すグラフである。

【図18】図１８は、ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞（未分化、誘導－３日目）、ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞から誘導された自律神経前駆細胞（誘導１３日目）およびＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞（誘導１７日目）におけるＯＲ５１Ｅ２遺伝子の発現量を示すグラフである。

【図19】図１９は、通常酸素状態または低酸素状態におけるＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞のＡＴＰ産生を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

【0022】

本発明は、第一の実施形態によれば、（ａ）多能性幹細胞の自律神経前駆細胞への分化を誘導するステップ、および（ｂ）前記ステップ（ａ）により得られた自律神経前駆細胞を、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＥＧＦシグナル経路活性化剤およびＩＧＦ－１シグナル経路活性化剤の存在下で培養するステップを含む、グロムス細胞様細胞を作製する方法である。

【0023】

本実施形態の方法では、多能性幹細胞から自律神経前駆細胞を誘導する。「多能性幹細胞」には、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、多能性生殖幹（ｍＧＳ）細胞、Ｍｕｓｅ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法では、いずれの多能性幹細胞を用いてもよいが、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を用いることが好ましく、ｉＰＳ細胞を用いることがより好ましい。

【0024】

本実施形態における多能性幹細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよく、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。

【0025】

多能性幹細胞の調製方法は十分に確立されており（例えば、ｉＰＳ細胞については、Ｃｅｌｌ，２００７；１３１（５）：８６１－８７２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００７．１１．０１９）、当分野において公知の方法にしたがって、任意の組織または細胞から多能性幹細胞を調製することができる。あるいは、すでに樹立されたｉＰＳ細胞株やＥＳ細胞株を、例えば、京都大学ｉＰＳ細胞研究財団（ＣｉＲＡ＿Ｆ）、理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などから入手してもよい。

【0026】

本実施形態における「自律神経前駆細胞」とは、神経堤細胞またはそれよりも自律神経系細胞への分化が進んだ細胞であり、交感神経細胞および副交感神経細胞への分化能を有するものをいう。本実施形態における自律神経前駆細胞は、例えばＳＯＸ１０（神経堤細胞マーカー遺伝子）およびＰＨＯＸ２Ｂ（自律神経細胞マーカー遺伝子）の発現に基づいて定義され得る。

【0027】

多能性幹細胞を自律神経前駆細胞へと誘導する方法はすでに十分に確立されており（例えば、国際公開第２０２０／０４０２８６、国際公開第２０１６／１９４５２２）、当分野において公知の方法にしたがって自律神経前駆細胞を調製することができる。具体的には、例えば、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ－１２培地、ヒト幹細胞（ｈＥＳ）培地、Ｎ２培地またはそれらの混合物などを基本培地として、ドルソモルフィンのようなＢＭＰシグナル経路阻害剤、ＳＢ４３１５４２のようなＴＧＦシグナル経路阻害剤、ＣＨＩＲ９９０２１のようなＷｎｔシグナル経路活性化剤、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のようなＦＧＦシグナル経路活性化剤などを適宜添加した条件下で多能性幹細胞を培養することにより、自律神経前駆細胞を調製することができる。この際、多能性幹細胞は、上記分化誘導前に、Ｙ－２７６３２のようなＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で２～３日培養されることが好ましい。

【0028】

自律神経前駆細胞は、グロムス細胞様細胞への分化を誘導するまで、ＥＧＦや塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などを添加した培地を用いて、分化能を維持したまま安定的に継代培養することができる（Ｆｕｋｕｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，９（１２）：ｅ１１２２９１，２０１４）。

【0029】

次いで、自律神経前駆細胞を、ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＥＧＦシグナル経路活性化剤およびＩＧＦ－１シグナル経路活性化剤の存在下で培養する。これにより、自律神経前駆細胞をグロムス細胞様細胞へと誘導することができる。

【0030】

本実施形態における「ＦＧＦシグナル経路活性化剤」は、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）受容体およびその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよく、例えば、ＦＧＦ１ファミリーである酸性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ１、ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２、ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２の組替え体ＦＧＦ－Ｇ３（商標）、線維芽細胞成長因子キメラ（ＦＧＦＣ）などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態におけるＦＧＦシグナル経路活性化剤は、好ましくはｂＦＧＦであってよく、培地におけるｂＦＧＦの濃度は、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬとすることができる。

【0031】

本実施形態における「ＥＧＦシグナル経路活性化剤」は、ＥＧＦ（上皮成長因子）受容体およびその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよく、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ－β、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子 （ＨＢ－ＥＧＦ）、ベタセルリン（ＢＴＣ）、エピジェン（ＥＰＧ）、エピレグリン（ＥＰＲ）などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態におけるＥＧＦシグナル経路活性化剤は、好ましくはＥＧＦであってよく、培地におけるＥＧＦの濃度は、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬとすることができる。

【0032】

本実施形態における「ＩＧＦ－１シグナル経路活性化剤」は、ＩＧＦ－１（インスリン様成長因子１）受容体およびその下流のシグナル経路を活性化する任意の公知の化合物であってよく、例えば、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、インスリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態におけるＩＧＦ－１シグナル経路活性化剤は、好ましくはＩＧＦ－１であってよく、培地におけるＩＧＦ－１の濃度は、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬとすることができる。

【0033】

ここで用いられる培地は、例えば、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ Ｆ－１２培地を基本培地として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン・ストレプトマイシン、非必須アミノ酸溶液、Ｎ２サプリメント、Ｂ－２７サプリメントなどを適宜添加したものであってよい。ＦＢＳに代えて、任意の同等の代替品を用いることもでき、そのような代替品には、ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：１０８２８０２８）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（商標）血清代替品（ＳＳＲ）（富士フイルム和光純薬：１９１－１８３７５）、ＸＦ２１２ ＸｅｒｕｍＦｒｅｅ（ＴＮＣ ＢＩＯ ＢＶ：ＸＦ２１２－０１００－１ｓ）などが挙げられるが、これらに限定されない。ＦＢＳまたはその代替品は、好ましくは１０～２０％の濃度で添加されてよい。自律神経前駆細胞は、例えば１×１０^６～１×１０^８細胞／ｍＬの濃度範囲で播種されてよい。ＦＧＦシグナル経路活性化剤、ＥＧＦシグナル経路活性化剤およびＩＧＦ－１シグナル経路活性化剤の存在下での培養期間は、例えば３～５０日間であってよく、好ましくは３～７日間であってよい。培養条件は、例えば哺乳動物由来の自律神経前駆細胞であれば、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養することが好ましい。

【0034】

本実施形態の方法では、好ましくは、グロムス細胞の発生および／または機能に関連する因子（以下、「グロムス細胞関連因子」と記載する）をコードする外因性核酸を導入する。これにより、機能がより向上したグロムス細胞様細胞を作製し得る。グロムス細胞関連因子には、例えば、内皮ＰＡＳドメイン含有タンパク質１（ＥＰＡＳ１、別名ＨＩＦ－２α）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ペアードホメオボックスタンパク質２Ｂ（ＰＨＯＸ２Ｂ）、ＳＲＹ－ＢＯＸ転写因子４（ＳＯＸ４）、ＳＲＹ－ＢＯＸ転写因子１１（ＳＯＸ１１）、低酸素誘導因子１Ａ（ＨＩＦ１Ａ）などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法では、ＥＰＡＳ１をコードする外因性核酸を導入することが特に好ましい。

【0035】

グロムス細胞関連因子をコードする外因性核酸は、任意の時点で細胞に導入されてよい。例えば、グロムス細胞関連因子をコードする外因性核酸は、分化誘導前の多能性幹細胞に導入されてもよいし、分化誘導によって得られた自律神経前駆細胞に導入されてもよいし、グロムス細胞へと分化しつつある自律神経前駆細胞に導入されてもよい。本実施形態の方法では、グロムス細胞関連因子をコードする外因性核酸は、分化誘導前の多能性幹細胞に導入されることが好ましい。

【0036】

本実施形態におけるグロムス細胞関連因子をコードする外因性核酸は、任意の脊椎動物由来のものであってよく、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。グロムス細胞関連因子をコードする遺伝子はすでにクローニングされており、それらの核酸配列情報は、所定のデータベースから入手することができる。例えば、ヒトＥＰＡＳ１遺伝子であればＮＭ＿００１４３０．５、ヒトＢＤＮＦ遺伝子であればＮＭ＿００１１４３８０５．１、ヒトＰＨＯＸ２Ｂ遺伝子であればＮＭ＿００３９２４．４、ヒトＳＯＸ４遺伝子であればＮＭ＿００３１０７．３、ヒトＳＯＸ１１遺伝子であればＮＭ＿００３１０８．４、ヒトＨＩＦ１Ａ遺伝子であればＮＭ＿００１２４３０８．２（いずれもＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ）が利用可能である。

【0037】

本実施形態におけるグロムス細胞関連因子には、同等の活性を有するそれらのバリアントやホモログなども含まれてよい。言い換えれば、本実施形態におけるグロムス細胞関連因子には、その生理活性が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて算出することができる。また、本実施形態におけるグロムス細胞関連因子には、その生理活性が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。ここで、「１～数個」とは、例えば１～３０個であってよく、好ましくは１～１０個であってよく、特に好ましくは１～５個であってよい。

【0038】

グロムス細胞関連因子をコードする外因性核酸は、当分野において周知の方法により細胞に導入することができ、例えば、それらの核酸を発現ベクターにクローニングして、細胞に導入すればよい。発現ベクターには、例えば、以下に限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、ｐＣＭＶなどのプラスミドベクターなどを用いることができる。

【0039】

本実施形態の方法において、発現ベクターは、その種類に応じて当分野において周知の方法により細胞に導入され得る。非ウイルスベクターであれば、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどにより導入することができる。ウイルスベクターであれば、適切な力価または多重感染度（ＭＯＩ）において細胞に感染させることにより導入することができる。

【0040】

本実施形態の方法によれば、グロムス細胞様細胞を作製することが可能である。

【0041】

本発明は、第二の実施形態によれば、上記方法により作製されたグロムス細胞様細胞である。

【0042】

ここで、「グロムス細胞様細胞」とは、グロムス細胞に発現するマーカー遺伝子であるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー３（ＫＣＮＫ３）および嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）を発現し、グロムス細胞の低酸素応答を模倣することができる細胞をいう。したがって、本実施形態のグロムス細胞様細胞は、上記マーカーに加え、ＥＰＡＳ１を発現していることが好ましい。本実施形態のグロムス細胞様細胞は、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼＬ１（ＵＣＨＬ１）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－２）、マキシＫチャネル（Ｍａｘｉ－Ｋ）、クラスＩＩＩβチューブリン（ＴＵＢＢ３）、低酸素誘導因子１Ａ（ＨＩＦ１Ａ）、および／またはドーパミン受容体（ＤＲＤ２）をさらに発現していることがより好ましい。

【0043】

すなわち、本発明は、第三の実施形態によれば、内皮ＰＡＳドメイン含有タンパク質１（ＥＰＡＳ１）をコードする外因性核酸を含んでなり、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー３（ＫＣＮＫ３）および嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）を発現する、グロムス細胞様細胞である。本実施形態における「外因性核酸」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。

【0044】

本実施形態のグロムス細胞様細胞は、ＥＰＡＳ１を過剰発現していることが好ましい。「ＥＰＡＳ１を過剰発現している」とは、ＥＰＡＳ１をコードする外因性核酸を導入せずに調製したグロムス細胞様細胞におけるＥＰＡＳ１の発現量を超えて、ＥＰＡＳ１を発現している状態をいう。

【0045】

マーカーおよびＥＰＡＳ１の発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどの公知の手法により解析することができる。

【0046】

本実施形態におけるグロムス細胞様細胞は、マーカーおよびＥＰＡＳ１の発現に加えて、低酸素応答性に基づいて定義されてもよく、例えば、低酸素状態におけるＡＴＰまたはドーパミンもしくはその代謝物の産生量の増加に基づいて定義され得る。ドーパミンの代謝物には、例えば、チロシン、Ｌ－ＤＯＰＡ、３，４－ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、エピネフリン、ノルエピネフリンなどを挙げることができるが、これらに限定されない。ＡＴＰまたはドーパミンもしくはその代謝物は、当分野において周知の方法により測定されてよく、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）やＥＬＩＳＡなどにより測定され得る。

【0047】

ここで、「低酸素状態」とは、細胞への酸素供給が生理学的レベルを下回っている状態を意味する。実験的には、例えば１０％、５％、３％、２％またはそれ以下の酸素濃度の雰囲気下で細胞を培養することにより、低酸素状態を誘導することができる。一方、「通常酸素状態」とは、細胞への酸素供給が生理学的レベルにある状態をいい、実験的には、大気中の酸素濃度（約２１％）の雰囲気下での培養を意味する。

【0048】

第二および第三の実施形態のグロムス細胞様細胞は、インビトロにおいてグロムス細胞の低酸素応答を再現することができるものであり、インビトロＣＢモデルを作製するために有用である。

【0049】

本発明は、第四の実施形態によれば、（１）上記グロムス細胞様細胞に候補化合物を接触させるステップ、および（２）前記グロムス細胞様細胞から放出されたＡＴＰを測定するステップを含む、グロムス細胞の活性を調節する化合物のスクリーニング方法である。

【0050】

本実施形態における「候補化合物」は、低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質などであってよく、それらの混合物（例えば、細胞または組織からの抽出物、細胞または組織の培養上清など）であってもよい。また、これらの候補化合物は、新規のものであってもよいし、公知のものであってもよい。本実施形態の方法では、市販の化合物ライブラリーを用いてもよく、例えば、標準化合物ライブラリー（ＲＩＫＥＮ ＮＰＤｅｐｏ）、大阪大学オリジナル化合物ライブラリー（大阪大学）、ＩｎｈｉｂｉｔｏｒＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（Ｍｅｒｃｋ）およびＳＣＲＥＥＮ－ＷＥＬＬ（商標）Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＥＮＺＯ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＩＮＣ．）などを好ましい化合物ライブラリーとして挙げることができる。

【0051】

候補化合物とグロムス細胞様細胞とを接触させるためには、候補化合物を添加した培地中で一定期間グロムス細胞様細胞を培養すればよい。添加される候補化合物の濃度は、候補化合物の種類により異なるが、例えば、低分子化合物であれば、１ｐＭ～１００ｍＭの範囲で適宜選択することができる。培養期間は、例えば、１秒～７２時間であってよい。

【0052】

次いで、グロムス細胞様細胞から放出されたＡＴＰを測定する。ＡＴＰは、当分野において周知の方法により測定されてよく、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）やＥＬＩＳＡなどにより測定され得る。また、ＡＴＰ測定用のキットが市販されており、本実施形態の方法では、そのような市販品を使用することもできる。例えば、ＡＴＰ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）などが好ましい市販品として挙げられる。

【0053】

候補化合物の添加によりＡＴＰ産生が変化したかどうかを判定するためには、候補化合物を添加しない培養を並行して解析して比較してもよいし、過去に実施した候補化合物を添加しない培養についての解析結果と比較してもよい。本実施形態の方法において、候補化合物を添加した培地中のグロムス細胞様細胞からのＡＴＰ放出が、候補化合物を添加しない培地中のグロムス細胞様細胞と比較して有意に増加または減少した場合には、当該候補化合物は、グロムス細胞の活性を調節する化合物として有望であると評価することができる。グロムス細胞の活性を促進する化合物は、例えば、呼吸不全、低血圧症、低血糖症、感染症による機能不全などの治療のために有用であり得る。グロムス細胞の活性を抑制する化合物は、例えば、糖尿病、高血圧、高山病、感染症による過活動、過呼吸、頸動脈小体腫瘍（別名：傍神経節腫、グロムス腫瘍）などの治療のために有用であり得る。

【実施例0054】

以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

【0055】

＜１．ｉＰＳ細胞からグロムス細胞様細胞への分化誘導＞
（１－１）試薬
本実施例において使用した試薬情報（試薬名、製品番号、製造元、略称など）は下記の通りである。
・ｍＴｅＳＲ１－ｃＧＭＰ （ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ＳＴ－８５８５０Ｇ） （以下、「ｍＴｅＳＲ１」と表記）
・ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ （富士フイルム和光純薬： ０４８－２９７８５）
・ＤＭＥＭ （ｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ） （富士フイルム和光純薬： ０４３－３００８５）
・Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： ３１９８５０６２）
・ステムセルバンカー （ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（商標）ＧＭＰ ｇｒａｄｅ）（ＺＮＱ： ＣＢ０４５）
・Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （Ｂｉｏｗｅｓｔ， Ｎｕａｉｌｌｅ， Ｆｒａｎｃｅ） （以下、「ＦＢＳ」と表記）
・Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： １０８２８－０２８） （以下、「ＫＳＲ」と表記）
・Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ａｐｏ） （富士フイルム和光純薬： １４１－０９０４１） ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （以下、「Ｎ２」と表記）
・ＭＥＭ ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （富士フイルム和光純薬： １３９－１５６５１） （以下、「ＮＥＡＡ」と表記）
・Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： １７５０４０４４） （以下、「Ｂ２７」と表記）
・Ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （富士フイルム和光純薬： １９５－１５７９１）
・Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （富士フイルム和光純薬： １６８－２３１９１） （以下、「Ｐ／Ｓ」と表記）
・エタノール（９９．５） （富士フイルム和光純薬： ０５７－００４５６）
・Ｙ－２７６３２ （富士フイルム和光純薬： ０３６－２４０２３）
・Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（富士フイルム和光純薬： ０６７－０２１９１） （以下、「ＦＳＫ」と表記）
・Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ： Ｐ５４９９－５ＭＧ） （以下、「ＤＭ」と表記）
・ＳＢ４３１５４２ ｈｙｄｒａｔｅ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ： Ｓ４３１７－５ＭＧ） （以下、「ＳＢ」と表記）
・ＣＨＩＲ９９０２１ （Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ： １３１２２） （以下、「ＣＨＩＲ」と表記）
・ＩＷＲ－１ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ： Ｉ０１６１－５ＭＧ）
・ＳＡＮＴ１ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ： Ｓ４５７２－５ＭＧ）
・骨形成因子４（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、ヒト、組換え体 （富士フイルム和光純薬： ０２２－１７０７１） （以下、「ＢＭＰ４」と表記）
・線維芽細胞成長因子（塩基性）（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ）、ヒト、組換え体 （富士フイルム和光純薬： ０６４－０４５４１） （以下、「ｂＦＧＦ」と表記）
・Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ） （富士フイルム和光純薬： ０５９－０７８７３）
・インスリン様増殖因子－Ｉ （ＩＧＦ－１） （富士フイルム和光純薬： ０９６－０５７４１）
・ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ （ニッピ： ８９２０１２）
・Ｌｉｐｉｄｕｒｅ （日油株式会社： ＣＭ５２０６）
・Ａｃｃｕｔａｓｅ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： Ａ１１１０５－０１）
・ＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： １２６０４－０１３）
・Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ： １０９７７－０１５） （以下、「ＤＷ」と表記）
・Ｄ－ＰＢＳ（－） （富士フイルム和光純薬： ０４５－２９７９５） （以下、「ＰＢＳ」と表記）
・Ｔｒｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｐｏｗｄｅｒ， ｐＨ７．４ （タカラバイオ： Ｔ９１５３）
・塩酸 （富士フイルム和光純薬： ０８０－０１０６６）
・Ａｌｂｕｍｉｎ， ｆｒｏｍ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （富士フイルム和光純薬： ０１７－２３２９４） （以下、「ＢＳＡ」と表記）
・ジメチルスルホキシド （富士フイルム和光純薬： ０４６－２１９８１） （以下、「ＤＭＳＯ」と表記）

【0056】

（１－２）ストック溶液
・ＦＳＫ： ＤＭＳＯを用いて１０ｍＭに調製
・ＤＭ： ＤＭＳＯを用いて１ｍＭに調製
・ＳＢ： ＤＭＳＯを用いて１０ｍＭに調製
・ＣＨＩＲ： ＤＭＳＯを用いて３ｍＭに調製
・ＩＷＲ－１： ＤＭＳＯを用いて１０ｍＭに調製
・ＳＡＮＴ１： ＤＭＳＯを用いて２５０μＭに調製
・ＢＭＰ４： ０．１％ＢＳＡを添加した４ｍＭ塩酸溶液を用いて１００μｇ／ｍＬに調製
・ｂＦＧＦ： １ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で５００μｇ／ｍＬに調製後、ＤＭＥＭを用いて１０μｇ／ｍＬに調製
・ＥＧＦおよびＩＧＦ－１： ＰＢＳを用いて２０μｇ／ｍＬに調製
・アスコルビン酸： ＰＢＳを用いて５０ｍｇ／ｍＬに調製
・Ｙ－２７６３２： Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを用いて１０ｍＭに調製
・Ｌｉｐｉｄｕｒｅ： エタノール（９９．５）を用いて０．５％に調製

【0057】

（１－３）培地
・ヒト幹細胞培地（ｈＥＳＭ）： ２０％のＫＳＲ、１％のＮＥＡＡ、１％のＭｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、および１％のＰ／Ｓが添加されたＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２
・Ｎ２培地： １％のＮ２、１％のＮＥＡＡ、および１％のＰ／Ｓが添加されたＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２
・グロムス細胞分化培地（ＧＤＭ）： １５％のＦＢＳ、１％のＮ２、２％のＢ２７、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－１および１％のＰ／Ｓが添加されたＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２

【0058】

（１－４）ｉＰＳ細胞からグロムス細胞様細胞への分化誘導
・胚様体の形成（－３日目）：
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）は、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣより入手した。６ウェルプレートをＬｉｐｉｄｕｒｅによりコートし、ＰＢＳで洗浄した。ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）を、１０μＭのＹ－２７６３２が添加されたｍＴｅＳＲ１を用いて１×１０^６細胞／ウェルの濃度で播種し、オービタルシェイカー（ワケンビーテック：ＷＢ－１０１ＳＲＣ）上で培養した（９５ｒｐｍ）。播種後２４時間および４８時間に、１０μＭのＹ－２７６３２が添加されたｍＴｅＳＲ１を２ｍＬ／ウェルにて添加した。胚様体（ＥＢ）が形成されるまで３日間培養した。
・分化ステップ１（０日目）：
培地を、２μＭのＤＭ、１０μＭのＳＢ、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたｈＥＳＭに交換し（４ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で２日間培養した。
・分化ステップ２（２日目）：
培地を、３μＭのＣＨＩＲ、２０μＭのＳＢ、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたｈＥＳＭに交換し（６ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で３日間培養した。
・分化ステップ３（５日目）：
培地を、３μＭのＣＨＩＲ、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたｈＥＳＭ：Ｎ２（３：１）混合培地に交換し（４ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で２日間培養した。
・分化ステップ４（７日目）：
培地を、１０μＭのＩＷＲ－１、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたｈＥＳＭ：Ｎ２（１：１）混合培地に交換し（３ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で２日間培養した。
・分化ステップ５（９日目）：
培地を、１０μＭのＩＷＲ－１、２５０ｎＭのＳＡＮＴ１、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたｈＥＳＭ：Ｎ２（１：３）混合培地に交換し（３ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で３日間培養し、フレッシュな同培地に交換し、さらに２４時間培養した。
・分化ステップ６（１３日目）：
培地をＧＤＭに交換し（３ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で３～４日間培養した。

【0059】

グロムス細胞様細胞の作製スケジュールの概略を図１に示す。誘導０日目の胚様体（ＥＢ）、誘導１３日目の細胞（自律神経前駆細胞）および誘導１６日目の細胞（グロムス細胞様細胞）の顕微鏡像（明視野）を図２に示す。

【0060】

＜２．グロムス細胞様細胞における遺伝子発現＞
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡを用いて、ｉＰＳ細胞（未分化、誘導－３日目）、自律神経前駆細胞（誘導１３日目）およびグロムス細胞様細胞（誘導１６日目）から全ＲＮＡを抽出した。ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＲＮＡ－ｓｅｑ用のライブラリーを調製した。ＮｏｖａＳｅｑ ６０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列を決定した。ＳＴＡＲ（２．７．１ａ）およびＲＳＥＭ（１．３．１）を用いてマッピングおよび定量を行った。ｈｇ３８を参照ゲノムとして用い、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＧＲＣｈ３８を遺伝子アノテーションとして用いた。統計解析ソフトＲ（バージョン３．５．１）のｅｄｇｅＲパッケージ（バージョン３．２４．３）により、差次的に発現する遺伝子を解析した。

【0061】

結果を図３に示す。グロムス細胞様細胞において、グロムス細胞マーカーであるＴＨをはじめ、低酸素応答や免疫応答に関連する遺伝子や、マウスまたはラットのグロムス細胞において発現が確認されている神経成長因子および受容体遺伝子の発現が増加していることが確認された。

【0062】

次いで、通常酸素状態のｉＰＳ細胞、自律神経前駆細胞およびグロムス細胞様細胞におけるＯＲ５１Ｅ２の発現をｑＰＣＲにより解析した。ｑＰＣＲは、以下の（３－３）と同様の手順により行った。

【0063】

結果を図４に示す。図中、「ｈｉＰＳＣ」はｉＰＳ細胞（未分化、誘導－３日目）を、「Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ」は自律神経前駆細胞（誘導１３日目）を、「Ｇｌｏｍｕｓ ｃｅｌｌｓ」はグロムス細胞様細胞（誘導１６日目）を示す。分化に伴い、ＯＲ５１Ｅ２の発現が増加したことが確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。

【0064】

＜３．グロムス細胞様細胞の低酸素応答＞
（３－１）ＡＴＰの産生
誘導１６～１９日目のグロムス細胞様細胞を用いた。ＫＲＢ（クレブスリンガー緩衝液：１２０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３，２．５ｍＭ ＣａＣｌ_２，１．１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．１％ウシ血清アルブミン，２．８ｍＭグルコース，ｐＨ７．２）でグロムス細胞様細胞を２回洗浄後、ＫＲＢを加え、低酸素ＣＯ_２インキュベータ（２％Ｏ_２）中で１０～３０分間インキュベートした。上清を回収し、ＡＴＰ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ａ２２０６６）を用いてＡＴＰを測定した。細胞をＲＩＰＡバッファー（富士フイルム和光純薬：１８２－０２４５１）で溶解し、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：２３２２５）により総タンパク質量を測定した。ＡＴＰの測定結果を総タンパク質量により補正した。

【0065】

結果を図５に示す。低酸素刺激に応じてグロムス細胞様細胞からのＡＴＰ産生量が増加したことが確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。

【0066】

（３－２）カテコールアミンの産生
誘導１６～１９日目のグロムス細胞様細胞を用いた。低酸素刺激は、上記（３－１）と同様の手順により行った。ＫＲＢを除去し、ＨＰＬＣの移動相として用いる緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５．０）により細胞を懸濁し、超音波処理（１０秒間を３セット）により細胞を破砕した。１２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清をタンパク質コンセントレーターに供し、溶液中のタンパク質を除去した。得られた溶液をＨＰＬＣに供し、エピネフリン、ドーパミン（ＤＡ）および３，４－ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）を測定した。

【0067】

エピネフリンの測定結果を図６に、ＤＡの測定結果を図７に、ＤＯＰＡＣの測定結果を図８に示す。エピネフリン、ＤＡおよびＤＯＰＡＣの産生量が低酸素刺激に応じて増加したことが確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。

【0068】

（３－３）遺伝子発現
グロムス細胞様細胞における遺伝子発現をｑＰＣＲにより解析した。低酸素刺激は、上記（３－１）と同様の手順により行った。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ（タカラバイオ、Ｕ０９５５Ｂ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡、ＦＳＱ－３０１）を用いてｃＤＮＡを調製した。ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標）ＳＹＢＲ（商標）ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡、ＱＰＳ－２０１）を用いてｑＰＣＲを行った。内部コントロールとしてハウスキーピング遺伝子３６Ｂ４を用いた。反応および解析は３重に行った。

【0069】

表１．ｑＰＣＲに使用したプライマーセット

【表1】

【0070】

ＴＨの発現量を図９に、ＫＣＮＫ３の発現量を図１０に示す。ＴＨおよびＫＣＮＫ３のいずれも低酸素刺激により発現量が増加したことが確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。

【0071】

（３－４）イオンチャネル阻害による低酸素応答の変化
Ｋ^＋チャネル阻害剤であるテトラエチルアンモニウムクロリド（富士フイルム和光純薬：２０６－０４５０１）（終濃度：５ｍＭ）、Ｃａ^２＋チャネル阻害剤であるニフェジピン（富士フイルム和光純薬：１４１－０５７８３）（終濃度：５μＭ）、またはＮａ^＋チャネル阻害剤であるリドカイン（富士フイルム和光純薬：１２０－０２６９１）（終濃度：１μＭ）を含有するＫＲＢを用いて、上記（３－１）の手順により細胞を低酸素刺激し、ＡＴＰ産生量を解析した。対照として、イオンチャネル阻害剤を含まないＫＲＢを用いて、同様にＡＴＰ産生量を解析した。

【0072】

結果を図１１～１３に示す（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。Ｋ^＋チャネルを阻害することにより、低酸素刺激に応じたＡＴＰ産生が増加した（図１１）。ＡＴＰａｓｅであるアピラーゼ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：Ａ６１３２－２００ＵＮ）（終濃度：２Ｕ／ｍＬ）を添加した場合にはＡＴＰは検出されなかった（図１１）。一方、Ｃａ^２＋チャネルまたはＮａ^＋チャネルを阻害することにより、低酸素刺激に応じたＡＴＰ産生が減少した（図１２、１３）。Ｃａ^２＋を含まないＫＲＢを用いた場合にも低酸素刺激に応じたＡＴＰ産生が減少した（図１２）。これらの結果から、上記（１－４）の手順により作製されたグロムス細胞様細胞が、グロムス細胞と同様の分子メカニズムにより低酸素応答を示していることが確認された。

【0073】

＜４．ＥＰＡＳ１を強制発現させたｉＰＳ細胞の作製＞
ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ社に依頼して、ＥＰＡＳ１遺伝子（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿００１４３０．５）を含むプラスミドを合成した（ｐＬＶ－ｈＥＰＡＳ１、ベクターＩＤ：ＶＢ１１２０２－１４９７ｆｃｙ）。

【0074】

０．１ｗ／ｖ％ゼラチンでコートされた６ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１．５×１０^６／ウェル）を播種した。培地には、１０％ＦＢＳおよび１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含有するＤＭＥＭを用いた。ｐＬＶ－ｈＥＰＡＳ１プラスミド（４μｇ）、パッケージプラスミドｐｓＰＡＸ２（ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２６０）（２μｇ）およびエンベローププラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）（ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２５９）（２μｇ）を、５００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎｃ．）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２ウェル）にトランスフェクションした。２０～２４時間後に培地全量を１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭに交換し、さらに２４時間後および４８時間後にフレッシュな培地に全量交換し、培養上清を回収した。培養上清をＰＶＤＦシリンジフィルター（０．４５μｍ）で濾過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（クロンテック）を添加し、遠心分離することにより、ウイルスのペレットを得た。ペレットをその後使用する培地に懸濁し、ウイルス懸濁液を－８０℃で保管した。

【0075】

ｉＭａｔｒｉｘによりコートされた６ウェルプレートに、ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）を、１０μＭのＹ－２７６３２が添加されたｍＴｅＳＲ１を用いて６×１０^４細胞／ウェルの濃度で播種した（０日目）。翌日、培地をフレッシュなｍＴｅＳＲ１に交換し（２ｍＬ／ウェル）、２００μＬ／ウェルのウイルス懸濁液を添加した（１日目）。その後、毎日培地をフレッシュなｍＴｅＳＲ１に交換し、ウイルスの添加から４日後に０．３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加したｍＴｅＳＲ１に交換した（５日目）。ウイルスの添加から１０日以上、０．３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加したｍＴｅＳＲ１中で細胞を培養することにより、ピューロマイシン選択を行った。選択されたｉＰＳ細胞（通常酸素状態）におけるＥＰＡＳ１の発現をｑＰＣＲにより解析した。また、上記（１－４）の手順により、選択されたｉＰＳ細胞をグロムス細胞様細胞へと誘導し、誘導１７日目の細胞（通常酸素状態）におけるＥＰＡＳ１の発現をｑＰＣＲにより解析した。ｑＰＣＲは、上記（３－３）と同様の手順により行った。

【0076】

結果を図１４および１５に示す。図中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は野生型ｉＰＳ細胞を示す。ＥＰＡＳ１を導入されたｉＰＳ細胞は、ＥＰＡＳ１を強く発現していることが確認された（図１４、＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。この結果に基づき、以下、ＥＰＡＳ１を導入されたｉＰＳ細胞を「ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞」と記載する。ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞から誘導されたグロムス細胞様細胞も、ＥＰＡＳ１を強く発現していた（図１５、＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。この結果に基づき、以下、ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞から誘導されたグロムス細胞様細胞を「ＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞」と記載する。

【0077】

＜５．ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞から調製されたグロムス細胞様細胞における遺伝子発現＞
ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞（未分化、誘導－３日目）、ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞から誘導された自律神経前駆細胞（誘導１３日目）およびＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞（誘導１７日目）における、グロムス細胞マーカー遺伝子ＴＨならびにグロムス細胞関連因子ＫＣＮＫ３およびＯＲ５１Ｅ２の発現をｑＰＣＲにより解析した。ｑＰＣＲは、上記（３－３）と同様の手順により行った。

【0078】

結果を図１６～１８に示す。図中、「ｈｉＰＳＣ」はＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞を、「Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ」はＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞から誘導された自律神経前駆細胞（誘導１３日目）を、「Ｇｌｏｍｕｓ ｃｅｌｌｓ」はＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞（誘導１７日目）を示す。分化に伴い、ＴＨ、ＫＣＮＫ３およびＯＲ５１Ｅ２の発現が増加したことが確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。

【0079】

＜６．ＥＰＡＳ１発現ｉＰＳ細胞から調製されたグロムス細胞様細胞の低酸素応答＞
（６－１）ＡＴＰの産生
上記（３－１）の手順により、低酸素刺激に応じたＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞（誘導１７日目）のＡＴＰ産生を解析した。通常酸素状態（２０％Ｏ_２）におけるＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞（誘導１７日目）を対照とした。

【0080】

結果を図１９に示す（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。ＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞は低酸素刺激に応じて高いＡＴＰ産生能を示し、その産生量は、ＥＰＡＳ１を導入されていないｉＰＳ細胞から調製されたグロムス細胞様細胞（図４）と比較して１０倍以上であった。以上の結果から、ＥＰＡＳ１過剰発現グロムス細胞様細胞は低酸素状態に高感度であり、高い低酸素応答性を有することが確認された。

【0081】

＜７．グロムス細胞の活性を調節する化合物のスクリーニング＞
以下の表２に示す８７個の市販化合物に対し、グロムス細胞の活性調節能についてのスクリーニングを実施した。上記１の手順により調製された誘導１６～１９日目のグロムス細胞様細胞スフェアをＫＲＢで２回洗浄し、化合物を含有するＫＲＢとともに４～５スフェア／ウェル（９６ウェルプレート）で添加し、上記（３－１）の手順によりＡＴＰ産生量を解析した。対照として、ＤＭＳＯ（化合物の溶媒として使用）を含有するＫＲＢを用いた。

【0082】

表２．スクリーニングされた化合物

【表2A】

【表2B】

【表2C】

【0083】

その結果、対照と比較して、ＡＴＰ産生を１．５倍以上に増加させた化合物が１９個、０．５倍以下に減少させた化合物が１９個見出された（データは省略）。また、ＡＴＰ産生を減少させた化合物にはニフェジピンが含まれていた。ニフェジピンはラットのグロムス細胞の低酸素応答を抑制することがすでに報告されている（Ｂｕｔｔｉｇｉｅｇ Ｊ．ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ ＣＡ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４；３２２（１）：８２－７）。したがって、上記の結果から、本スクリーニング方法がグロムス細胞の活性を調節する化合物を正確に選別できるものであることが裏付けられた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

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