特開 2024-68398 乳房塗布用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024068398

(43)【公開日】2024-05-20

(54)【発明の名称】乳房塗布用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/05 20060101AFI20240513BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240513BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240513BHJP

   A61K 31/353 20060101ALI20240513BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20240513BHJP

【ＦＩ】

A61K31/05

A61P31/04 171

A61P43/00 105

A61K31/353

C12N5/071

【審査請求】未請求

【請求項の数】3

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022178821

(22)【出願日】2022-11-08

(71)【出願人】

【識別番号】504136568

【氏名又は名称】国立大学法人広島大学

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(72)【発明者】

【氏名】津上 優作

(72)【発明者】

【氏名】磯部 直樹

【テーマコード（参考）】

4B065

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BB06

4B065CA44

4B065CA50

4B065CA60

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA08

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB35

4C086ZC41

4C086ZC61

4C206AA01

4C206AA02

4C206CA19

4C206CA20

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZB35

4C206ZC41

4C206ZC61

(57)【要約】

【課題】ポリフェノールを経皮吸収し、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制する作用を得るための乳房塗布用組成物を提供する。
【解決手段】本発明に係る乳房塗布用組成物は、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを有効成分として含み、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制するための乳房塗布用組成物である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを有効成分として含む、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制するための乳房塗布用組成物。

【請求項2】

乳腺上皮細胞におけるタイトジャンクションの機能を増強又は抑制するための、請求項１に記載の乳房塗布用組成物。

【請求項3】

前記分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールは、レスベラトロール、エクオール及びジンゲロールからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の乳房塗布用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳房塗布用組成物に関し、特にタイトジャンクションの機能を増強又は抑制するための乳房塗布用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ポリフェノールは、様々な細胞において抗酸化作用や抗炎症性作用を示すことが一般に知られている。このため、ポリフェノールは健康食品などに広く利用されており、生活習慣病の予防などに役立っている。

【0003】

さらに近年の研究により、例えば非特許文献１において、乳腺上皮細胞にポリフェノールを添加する実験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、ポリフェノールが細胞間隙に形成されるタイトジャンクションの機能を増強又は抑制したことが報告されている。詳細は後述するが、タイトジャンクションとは隣り合う細胞同士を密着させる接着構造を指す。このタイトジャンクションの機能を増強又は抑制することによって細胞間の間隙を狭める又は広げることができ、細胞内外における物質及び体細胞の自由な通過を促進又は抑制できることが知られている。

【0004】

一方、非特許文献２において、ポリフェノールを経口摂取すると、肝臓や腸管などで代謝されるか又はグルクロン酸や硫酸との抱合体が形成され、標的器官においてポリフェノールの生理活性が低減することが報告されている。また非特許文献３では、経皮吸収する成分の分子量限界は５００ダルトン（Ｄａ）であることが報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Y. Tsugami, H. Wakasa, M. Kawahara, T. Nishimura, K. Kobayashi (2022). Isoflavones and their metabolites influence the milk production ability of bovine mammary epithelial cells in a type-specific manner. Anim Sci J. 93, e13720.

【非特許文献2】T. Walle, F. Hsieh, M. H. DeLegge, J. E. Oatis, Jr., and U. K. Walle (2004). High absorption but very low bioavailability of oral resveratrol in humans, Drug Metab Dspos 32, 1377-1382.

【非特許文献3】J. D. Bos and M. M. H. M. Meinardi (2000). The 500 Dalton rule for the skin penetration of chemical compounds and drugs, Exp Dermatol, 9, 165-169.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上述の通り、非特許文献１では、ポリフェノールがｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてタイトジャンクションの機能を増強又は抑制する作用を有することが知られている。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏでは、非特許文献２に記載の通り、例えばポリフェノールを経口摂取したとすると、生体内において代謝されるか又は抱合体が形成されることにより、ポリフェノールの生理活性が低減してしまうことから、乳腺においてタイトジャンクションの機能を増強又は抑制する作用は期待できない。

【0007】

本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、乳腺においてポリフェノールの作用を失うことなく、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制する作用を得るための乳房塗布用組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを有効成分とし、乳房塗布用組成物とすることで、乳腺に対する該ポリフェノールの作用を失うことなく、乳腺上皮細胞においてタイトジャンクションの機能を増強又は抑制できることを見出して本発明を完成した。

【0009】

具体的に、本発明に係る乳房塗布用組成物は、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを有効成分として含み、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制するための組成物であることを特徴とする。

【0010】

本発明に係る乳房塗布用組成物によると、乳房に塗布することで分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを経皮吸収することができ、経口投与の場合のような代謝等がなされることなく、乳腺上皮細胞におけるタイトジャンクションの機能を増強又は抑制することができる。このタイトジャンクションの機能の増強又は抑制は、細胞内外における物質及び体細胞の自由な通過を促進又は抑制できる。具体的には、タイトジャンクションの機能を増強すると、細胞間の間隙を狭めて物質及び体細胞の自由な通過を抑制し、一方で、タイトジャンクションの機能を抑制すると、細胞間の間隙を広げて物質及び体細胞の自由な通過を促進する。本発明に係る乳房塗布用組成物では、乳腺上皮細胞におけるタイトジャンクションの機能を所望の方向に増強又は抑制することができる。従って、本発明に係る乳房塗布用組成物は、タイトジャンクションの機能を所望の方向に増強又は抑制をすることを通して、細胞間の間隙を任意に調節することができる。

【0011】

本発明に係る乳房塗布用組成物において、乳腺上皮細胞におけるタイトジャンクションの機能を増強又は抑制することができる。

【0012】

本発明に係る乳房塗布用組成物において、前記分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールは、レスベラトロール、エクオール及びジンゲロールからなる群から選択することができる。

【0013】

本発明に係る乳房塗布用組成物によると、レスベラトロール及びエクオールは、タイトジャンクションの機能を増強し、一方で、ジンゲロールは、タイトジャンクションの機能を抑制することができる。このように、所望の方向にタイトジャンクションの機能を増強又は抑制することができるため、細胞間の間隙を任意に調節することができる。

【発明の効果】

【0014】

本発明に係る乳房塗布用組成物によると、乳房に塗布することで分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを経皮吸収することができ、経口投与の場合のような代謝等がなされることなく、乳腺上皮細胞におけるタイトジャンクションの機能を増強又は抑制することができる。このタイトジャンクションの機能の増強又は抑制は、細胞内外における物質及び体細胞の自由な通過を促進又は抑制できる。具体的には、タイトジャンクションの機能を増強すると、細胞間の間隙を狭めて物質及び体細胞の自由な通過を抑制し、一方で、タイトジャンクションの機能を抑制すると、細胞間の間隙を広げて物質及び体細胞の自由な通過を促進する。本発明に係る乳房塗布用組成物では、乳腺上皮細胞におけるタイトジャンクションの機能を所望の方向に増強又は抑制することができる。従って、本発明に係る乳房塗布用組成物は、タイトジャンクションの機能を所望の方向に増強又は抑制をすることを通して、細胞間の間隙を任意に調節することができる。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明を実施するための形態を説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。

【0016】

≪タイトジャンクションの機能を増強又は抑制するための乳房塗布用組成物≫
本発明の一実施形態は、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを有効成分として含み、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制するための乳房塗布用組成物である。

【0017】

本明細書においてポリフェノールとは、同一分子内に２個以上のフェノール性水酸基をもつ化合物の総称を意味する。本実施形態において、乳房塗布用組成物の有効成分として含まれるポリフェノールは、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールであれば特に制限されず、その種類は任意である。例えば、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールとして、レスベラトロール（分子量２２８Ｄａ）、エクオール（分子量２４２Ｄａ）及びジンゲロール（分子量２９４Ｄａ）などが挙げられる。ポリフェノールの分子量が５００Ｄａを超過すると、分子のサイズが大きくて経皮吸収されず、タイトジャンクションの機能の増強又は抑制を行うことが難しい。また、乳房塗布用組成物の有効成分として含まれるポリフェノールは、上述したような分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを組み合わせたものでもよい。

【0018】

本明細書において「タイトジャンクションの機能を増強する」とは、細胞の頂端部における細胞間結合を強くし、細胞間の間隙を狭めることを意味する。また、「タイトジャンクションの機能を抑制する」とは、細胞の頂端部における細胞間結合を弱くし、細胞間の間隙を広げることを意味する。

【0019】

本実施形態において、乳房塗布用組成物中の分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの濃度は、特に制限されず、任意である。例えば、乳房塗布用組成物中の分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの濃度は、０．５μＭ以上、好ましくは１００μＭ以上、さらに好ましくは２００μＭ以上とすることができる。ポリフェノールの濃度が０．５μＭ未満であると、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制することが難しい。

【0020】

本実施形態において、乳房塗布用組成物は、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制できる限りにおいて、添加物を含みうる。添加物の種類及び含有量は特に制限されず、例えば賦形剤、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ｐＨ安定剤、ビヒクル及び防腐剤などが挙げられ、任意の量で含むことができる。

【0021】

本実施形態において、乳房塗布用組成物は、溶媒を含むものであってよい。溶媒は、例えば水、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などを用いることができ、特に制限されない。

【0022】

本実施形態に係る乳房塗布用組成物によると、乳房に塗布することで分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを経皮吸収することができ、クローディンの量を増加又は低減することにより、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制することができる。具体的には、クローディンの量を増加してタイトジャンクションの機能を増強すると、細胞の頂端部における細胞間の間隙を狭めて物質及び体細胞の自由な通過を抑制し、一方で、クローディンの量を低減してタイトジャンクションの機能を抑制すると、細胞の頂端部における細胞間の間隙を広げて物質及び体細胞の自由な通過を促進する。このため、乳房塗布用組成物は、タイトジャンクションの機能を増強することによって、乳腺中への菌やウイルスの侵入を防ぐことができ、一方で、タイトジャンクションの機能を抑制することによって、乳腺中に他の薬剤を浸透させるなどして利用することができる。なお、クローディンは、クローディンファミリーであれば特に制限されず、例えばクローディン－３及びクローディン－４などが挙げられる。

【0023】

本実施形態において、乳房塗布用組成物は、公知の方法により種々の形態に製剤化されうる。例えば、乳房塗布用組成物は、好適な剤形とすることができ、剤形の種類は特に制限されず、任意である。例えば、軟膏、クリーム剤、外用液剤又は貼付剤とすることができる。また、これらの剤形にするために用いる添加物は、公知のものを使用することができ、特に制限されない。

【0024】

本実施形態において、乳房塗布用組成物の１日当たりの塗布量及び１日当たりの塗布回数は特に制限されず、任意である。また、乳房塗布用組成物全体中の分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの濃度に応じて、対象の一乳房への１日当たりの塗布量及び１日当たりの塗布回数を適宜変更することができる。例えば、対象の一乳房に対して、乳房塗布用組成物中の分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの濃度が１００μＭ以上である乳房塗布用組成物を、１回／日で０．１～１０ｍＬ、好ましくは０．５～１０ｍＬ、さらに好ましくは１～１０ｍＬ塗布するものであってよく、乳房塗布用組成物中の分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの濃度が２００μＭ以上である乳房塗布用組成物を、１回／日で０．１～１０ｍＬ、好ましくは０．５～１０ｍＬ、さらに好ましくは１～１０ｍＬ塗布するものであってもよい。１日当たりの塗布量は０．１～１０ｍＬに限定されず、適宜変更することができる。また、１日当たりの塗布回数は、１回／日に限定されず、例えば２回／日、３回／日、４回／日、５回／日、６回／日、７回／日、８回／日、９回／日、１０回／日などとすることができる。

【0025】

本実施形態において、乳房塗布用組成物は、数日から数週間にわたって継続的に塗布することが好ましい。例えば、対象の一乳房に対して、１日当たり０．１～１０ｍＬ、好ましくは０．５～１０ｍＬ、さらに好ましくは１～１０ｍＬを２日間、好ましくは３日間、より好ましくは５日間、さらに好ましくは７日間にわたって、継続的に塗布することができる。

【0026】

本実施形態において、乳房塗布用組成物は、他の乳房用薬剤と組み合わせて用いるものであってもよい。乳房塗布用組成物によってタイトジャンクションの機能を抑制することにより、細胞間の間隙を広げて物質の自由な通過を促進し、乳腺中に他の乳房用薬剤を浸透させることができるため、好適である。この場合、乳房塗布用組成物の有効成分である５００Ｄａ以下のポリフェノールは、ジンゲロールを使用することが好ましい。

【0027】

本実施形態において、乳房塗布用組成物が適用される対象は、乳房を有する対象であれば特に制限されず、任意である。例えば、対象は哺乳類動物などである。哺乳類動物も特に制限されないが、例えばヒト、ウシ及びヤギなどである。

【0028】

本実施形態に係る乳房塗布用組成物の製造方法は、特に制限されず、任意である。例えば、本実施形態に係る乳房塗布用組成物の有効成分である、市販されている分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを購入し、適宜精製を行ったうえで添加物と混合させて製造することができる。なお添加物は必須ではないため、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールのみを用いて製造するものであってもよい。また、市販されている分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールのかわりに、化学合成した分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを用いるものであってもよい。分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの化学合成方法は特に制限されず、当業者において既知の合成方法であれば適宜使用することができる。

【0029】

≪抗菌因子を増加させるための乳房塗布用組成物≫
本発明の一実施形態は、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを有効成分として含み、対象の乳房中の抗菌因子を増加させるための乳房塗布用組成物である。

【0030】

乳汁中には、様々な抗菌因子が含まれていることが知られている。例えば牛乳の場合、抗菌因子としてリゾチームやラクトフェリンなどが含まれている。このような抗菌因子は、乳房内に侵入してきた病原菌に対して攻撃するとともに、病原菌に応じて乳房中の抗菌因子の濃度が適宜増加し、病原菌を完全に死滅させるように作用する。このように、乳房中の抗菌因子は、乳房炎などの感染症から予防する役割を果たしている。このため、乳房中の抗菌因子を増加させることにより、乳房炎などの感染症を予防する効果が期待される。

【0031】

しかし、このような乳房中の抗菌因子を増加させる物質は、これまでのところ発見されておらず、乳房中の抗菌因子を増加させることは難しいという問題があった。このような問題に鑑み、本発明の一実施形態では、対象の乳房中の抗菌因子を増加させるための乳房塗布用組成物を提供するものである。

【0032】

本実施形態において、ポリフェノールの種類は、上述した実施形態と同様であり、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールであれば特に制限されない。例えば、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールとして、レスベラトロール（分子量２２８Ｄａ）、エクオール（分子量２４２Ｄａ）及びジンゲロール（分子量２９４Ｄａ）などが挙げられる。ポリフェノールの分子量が５００Ｄａを超過すると、分子のサイズが大きくて経皮吸収されず、乳房中の抗菌因子を増加させることが難しい。また、乳房塗布用組成物の有効成分として含まれるポリフェノールは、上述したような分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを組み合わせたものでもよい。

【0033】

本実施形態において、乳房塗布用組成物中の分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの濃度は、特に制限されず、任意である。例えば、乳房塗布用組成物中の分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの濃度は、０．５μＭ以上、好ましくは１００μＭ以上、さらに好ましくは２００μＭ以上とすることができる。ポリフェノールの濃度が０．５μＭ未満であると、対象の乳房中の抗菌因子を増加させることが難しい。

【0034】

本実施形態において、乳房塗布用組成物は、乳房中の抗菌因子を増加できる限りにおいて、添加物を含みうる。添加物の種類及び含有量は特に制限されず、例えば賦形剤、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ｐＨ安定剤、ビヒクル及び防腐剤などが挙げられ、任意の量で含むことができる。

【0035】

本実施形態において、乳房塗布用組成物は、溶媒を含むものであってよい。溶媒は、例えば水、エタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などを用いることができ、特に制限されない。

【0036】

本実施形態に係る乳房塗布用組成物によると、乳房に塗布することで分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを経皮吸収することができ、乳房中の抗菌因子を増加させることができる。これにより、乳房内の病原菌に対する抗菌力を向上させ、乳房炎などの感染症を予防することができる。なお抗菌因子は特に制限されず、任意である。例えば、抗菌因子はβ－ディフェンシン－１又はＳ１００Ａ７などである。また、抗菌因子は少なくともβ－ディフェンシン－１及びＳ１００Ａ７を含むことが好ましい。また、乳房の感染症は乳房炎に限定されず、乳房の感染症として知られているものは全て含む。

【0037】

本実施形態において、乳房塗布用組成物は、公知の方法により種々の形態に製剤化されうる。例えば、乳房塗布用組成物は、好適な剤形とすることができ、剤形の種類は特に制限されず、任意である。例えば、軟膏、クリーム剤、外用液剤又は貼付剤とすることができる。また、これらの剤形にするために用いる添加物は、公知のものを使用することができ、特に制限されない。

【0038】

本実施形態において、乳房塗布用組成物の１日当たりの塗布量及び１日当たりの塗布回数は特に制限されず、任意である。また、乳房塗布用組成物全体中の分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの濃度に応じて、対象の一乳房への１日当たりの塗布量及び１日当たりの塗布回数を適宜変更することができる。例えば、対象の一乳房に対して、乳房塗布用組成物中の分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの濃度が１００μＭ以上である乳房塗布用組成物を、１回／日で０．１～１０ｍＬ、好ましくは０．５～１０ｍＬ、さらに好ましくは１～１０ｍＬ塗布するものであってよく、乳房塗布用組成物中の分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの濃度が２００μＭ以上である乳房塗布用組成物を、１回／日で０．１～１０ｍＬ、好ましくは０．５～１０ｍＬ、さらに好ましくは１～１０ｍＬ塗布するものであってもよい。１日当たりの塗布量は０．１～１０ｍＬに限定されず、適宜変更することができる。また、１日当たりの塗布回数は、１回／日に限定されず、例えば２回／日、３回／日、４回／日、５回／日、６回／日、７回／日、８回／日、９回／日、１０回／日などとすることができる。

【0039】

本実施形態において、乳房塗布用組成物は、数日から数週間にわたって継続的に塗布することが好ましい。例えば、対象の一乳房に対して、１日当たり０．１～１０ｍＬ、好ましくは０．５～１０ｍＬ、さらに好ましくは１～１０ｍＬを２日間、好ましくは３日間、より好ましくは５日間、さらに好ましくは７日間にわたって、継続的に塗布することができる。

【0040】

本実施形態において、乳房塗布用組成物が適用される対象は、乳房を有する対象であれば特に制限されず、任意である。例えば、対象は哺乳類動物などである。哺乳類動物も特に制限されないが、例えばヒト、ウシ及びヤギなどである。

【0041】

本実施形態に係る乳房塗布用組成物の製造方法は、特に制限されず、任意である。例えば、本実施形態に係る乳房塗布用組成物の有効成分である、市販されている分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを購入し、適宜精製を行ったうえで添加物と混合させて製造することができる。なお添加物は必須ではないため、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールのみを用いて製造するものであってもよい。また、市販されている分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールのかわりに、化学合成した分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを用いるものであってもよい。分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールの化学合成方法は特に制限されず、当業者において既知の合成方法であれば適宜使用することができる。

【実施例0042】

以下に、本発明に係る乳房塗布用組成物について詳細に説明するための実施例を示す。

【0043】

実施例１
レスベラトロール（東京化成工業）を購入し、乳房塗布用組成物として用いた。

【0044】

実施例２
エクオール（Toronto Research Chemicals）を購入し、乳房塗布用組成物として用いた。

【0045】

実施例３
ジンゲロール（東京化成工業）を購入し、乳房塗布用組成物として用いた。

【0046】

実施例４
レスベラトロール（東京化成工業）から、乳房塗布用組成物中の濃度が１００μＭとなるように、７０％エタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と０．２％ジメチルスルホキシド（ナカライテスク）からなる溶媒（エタノール７０ｍＬ、脱イオン水２９．８ｍＬ、ジメチルスルホキシド０．２ｍＬ）に加えて、十分に溶解させ、乳房塗布用組成物を作製した。

【0047】

実施例５
エクオール（Toronto Research Chemicals）を用いて、乳房塗布用組成物中の濃度を２００μＭとしたこと以外は、実施例４と同様の方法により、乳房塗布用組成物を作製した。

【0048】

実施例６
ジンゲロール（東京化成工業）を用いたこと以外は、実施例４と同様の方法により、乳房塗布用組成物を作製した。

【0049】

比較例１
０．１％ジメチルスルホキシド（ナカライテスク）を乳房塗布用組成物のコントロールとして用いた。

【0050】

比較例２
イカリイン（東京化成工業）を購入し、乳房塗布用組成物として用いた。

【0051】

比較例３
オレウロペイン（東京化成工業）を購入し、乳房塗布用組成物として用いた。

【0052】

比較例４
イカリイン（東京化成工業）を用いたこと以外は、実施例４と同様の方法により、乳房塗布用組成物を作製した。

【0053】

比較例５
オレウロペイン（東京化成工業）を用いたこと以外は、実施例４と同様の方法により、乳房塗布用組成物を作製した。

【0054】

［タイトジャンクションの機能及び抗菌因子への影響を確認するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験］
上記実施例１～３及び比較例１～３の乳房塗布用組成物を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、タイトジャンクションの機能への影響に対する確認試験を行った。また、抗菌因子に対する影響についても検討した。

【0055】

（ヤギ乳腺上皮細胞の培養）
乳房塗布用組成物による乳腺上皮細胞への影響を確認するために、乳房塗布用組成物を含む又は含まない培地上でヤギ乳腺上皮細胞の培養を以下のように行った。まず、泌乳期トカラヤギから乳腺を採材し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、メスを用いて細切した。続いて、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３時間振盪した。その後、トリプシン処理と密度勾配遠心を２回行い、ヤギ乳腺上皮細胞塊を単離して使用時まで凍結保存した。使用時において、ヤギ乳腺上皮細胞塊を解凍後、２４ウェルプレート上に播種し、増殖培地（５％ウシ胎児血清、５μｇ／ｍＬ ＩＴＳ－Ｘ、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子、５ｍＭ 酢酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）でコンフルエントになるまで培養した。続いて、分化培地（１％ウシ胎児血清、５μｇ／ｍＬ ＩＴＳ－Ｘ、１ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子、５ｍＭ 酢酸ナトリウム、１μｇ／ｍＬプロラクチン、１μＭデキサメタゾンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）に変更し、２日間培養した。その後、培地中の各ポリフェノール濃度が０．５、１、５、１０、５０μＭとなるように、各実施例１～３の乳房塗布用組成物を分化培地に溶解して得られた溶液をウェルプレート上に添加し、３日間培養した。一方、コントロールとして比較例１の０．１％ＤＭＳＯをウェルプレート上に添加し、また、培地中の各ポリフェノール濃度が１０、１００μＭとなるように、比較例２、３の乳房塗布用組成物を分化培地に溶解して得られた溶液をウェルプレート上に添加し、それぞれ３日間培養した。

【0056】

（培養細胞におけるクローディン量の測定）
培養したヤギ乳腺上皮細胞中のクローディン－３とクローディン－４の量を測定するためにウェスタンブロッティングを以下のように行った。まず、培養が終了した各乳腺上皮細胞層を回収し、タンパク質抽出用バッファーに溶解して得られた細胞溶解液に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、その後に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。ブロッキング溶液として４％スキムミルク／ＰＢＳ－Ｔ溶液を使用した。一次抗体には、抗クローディン－３抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、抗クローディン－４抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および抗α－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ）を使用した。二次抗体は、Ｂｉｏ－Ｒａｄから購入したＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識した抗ウサギあるいは抗マウスＩｇＧ抗体（×２５００－５０００）を使用した。バンドの検出には、発光基質溶液であるＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とＥｚ－Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ（ＡＴＴＯ）を用いた。最後に、内部標準であるα－ｔｕｂｕｌｉｎにより規格化したクローディン－３とクローディン－４の量を、比較例１のクローディン－３とクローディン－４の量で除することにより相対強度比を算出した。結果は後述する表１に示す。

【0057】

（培養細胞における抗菌因子濃度の測定）
培養したヤギ乳腺上皮細胞中の抗菌因子であるβ－ディフェンシン－１とＳ１００Ａ７の量を測定するために、上記細胞溶解液を用いて競合ＥＬＩＳＡを以下のように行った。まず、抗β－ディフェンシン－１抗体と抗Ｓ１００Ａ７抗体は、合成ペプチドをウサギへ免疫して作製した。ペプチドへのＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識は、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２もしくはＫｉｔ－ＳＨ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、発色にはＴＭＢを用いて行った。測定したβ－ディフェンシン－１とＳ１００Ａ７の量を、比較例１のβ－ディフェンシン－１とＳ１００Ａ７の量で除することにより相対強度比を算出した。結果は後述する表１に示す。

【0058】

［タイトジャンクションの機能及び抗菌因子への影響を確認するｉｎ ｖｉｖｏ試験］
上記実施例４～６及び比較例４、５の乳房塗布用組成物を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、タイトジャンクションの機能への影響に対する確認試験を行った。また、抗菌因子に対する影響についても検討した。

【0059】

（乳房への塗布と乳汁の採取）
ヤギ乳腺におけるタイトジャンクションの機能への影響を確認するために、ヤギ乳房に乳房塗布用組成物の塗布を行った。まず、搾乳後の泌乳期トカラヤギの乳房に、各実施例４～６及び比較例４、５の乳房塗布用組成物を１ｍＬ塗布した。具体的には、実施例４、６及び比較例４、５の乳房塗布用組成物は１００μＭで７日間、実施例５の乳房塗布用組成物は２００μＭで５日間、１日１回塗布した。また、実施例４、６の場合、反対側の乳房にコントロールとして０．２％ＤＭＳＯを含む７０％エタノールを１ｍＬ塗布した。実施例５及び比較例４、５の場合、塗布３日前（－ｄａｙ２）から塗布１日前（ｄａｙ０）の期間内に０．２％ＤＭＳＯを含む７０％エタノールを１ｍＬ塗布し、その後に実施例５及び比較例４、５の乳房塗布用組成物を塗布した。そして、規定期間の経過後に、各トカラヤギの乳房から乳汁を採取した。

【0060】

（乳中体細胞数及び乳中抗菌因子濃度の測定）
乳中体細胞数、乳中β－ディフェンシン－１濃度及び乳中Ｓ１００Ａ７濃度を確認するために、以下の測定を行った。まず、採取した乳汁を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ ＦＬ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる乳中体細胞数（ＳＣＣ）の測定に供した。測定した乳中体細胞数をコントロールの乳中体細胞数で除することにより相対強度比を算出した。また、採取した乳汁を、上述した競合ＥＬＩＳＡによる抗菌因子濃度の測定に供した。測定した乳中β－ディフェンシン－１濃度と乳中Ｓ１００Ａ７濃度を、コントロールのβ－ディフェンシン－１濃度と乳中Ｓ１００Ａ７濃度で除することにより相対強度比を算出した。結果は後述する表２に示す。

【0061】

以下、上述した試験の結果について説明する。表１は、実施例１～３及び比較例１～３の乳房塗布用組成物を含む培地上で３日間ヤギ乳腺上皮細胞を培養したときの、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるタイトジャンクションの機能及び抗菌因子への影響に対する結果をまとめた表である。なお、表１中、ＮＤは測定しなかったこと（Ｎｏｔ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）を意味する。

【0062】

【表1】

【0063】

表１を参照しつつ、タイトジャンクションの機能への影響について説明する。まず、表１の実施例１の欄に示すように、培地中のレスベラトロールの濃度が０．５μＭ以上の場合に、タイトジャンクションの構成タンパク質であるクローディン－３の量が増加することが確認された。また、表１の実施例２の欄に示すように、培地中のエクオールの濃度が０．５μＭ以上の場合に、クローディン－３の量が増加することが確認された。クローディン－３の量の増加はタイトジャンクションの機能の増強を示すため、これらの結果から、実施例１のレスベラトロールと実施例２のエクオールはタイトジャンクションの機能を増強する作用を有することが確認された。一方、表１の実施例３の欄に示すように、培地中のジンゲロールの濃度が０．５μＭ以上の場合に、クローディン－３とクローディン－４の両方の量が低下することが確認された。なお、クローディン－４もタイトジャンクションの構成タンパク質である。クローディン－３とクローディン－４の量の減少はタイトジャンクションの機能の抑制を示すため、実施例３のジンゲロールはタイトジャンクションの機能を抑制する作用を有することが確認された。また、比較例２の欄に示すように、培地中のイカリインの濃度が１０μＭ以上の場合において、クローディン－３の量に変化は見られなかったものの、クローディン－４の量は減少することが確認された。従って、比較例２のイカリインはタイトジャンクションの機能を抑制する作用を有することが確認された。また、表１の比較例３の欄に示すように、培地中のオレウロペインの濃度が１０μＭ以上の場合において、クローディン－４の量に変化は見られなかったものの、クローディン－３の量は減少することが確認された。従って、比較例３のオレウロペインもタイトジャンクションの機能を抑制する作用を有することが確認された。

【0064】

続いて、表１を参照しつつ、抗菌因子への影響について説明する。まず、表１の実施例１の欄に示すように、培地中にレスベラトロールが０．５μＭ以上の濃度で存在する場合において、抗菌因子であるβ－ディフェンシン－１とＳ１００Ａ７の量が増加することが確認された。このため、実施例１のレスベラトロールは、抗菌因子を増加する作用を有することが確認された。なお、乳房塗布用組成物の塗布による抗菌因子の増加は、タイトジャンクションの機能への影響とは全く別の現象であるものと推察される。また、表１の実施例２の欄に示すように、培地中にエクオールが０．５μＭ以上の濃度で存在する場合においても、β－ディフェンシンの量が増加することが確認された。このため、エクオールも抗菌因子を増加する作用を有することが確認された。また、表１の実施例３の欄に示すように、培地中にジンゲロールが５０μＭの濃度で存在する場合において、β－ディフェンシン－１の量が１．３５倍に増加することが確認された。このため、実施例３のジンゲロールも抗菌因子を増加する作用を有することが確認された。

【0065】

表１の結果から、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを含む実施例１～３及び分子量５００Ｄａ超過のポリフェノールを含む比較例２、３に係る乳房塗布用組成物を培地に添加することで、両者においてヤギ乳腺上皮細胞におけるタイトジャンクションの機能を増強又は抑制した他、抗菌因子を増加することが確認された。

【0066】

続いて、表２は、実施例４～６及び比較例４、５の乳房塗布用組成物を用いた、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるタイトジャンクションの機能及び抗菌因子への影響に対する結果をまとめた表である。なお、表２中、ＮＤは測定しなかったこと（Ｎｏｔ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）を意味する。

【0067】

【表2】

【0068】

表２を参照しつつ、タイトジャンクションの機能への影響について説明する。まず、表２の実施例４、５の欄に示すように、分子量２２８Ｄａのレスベラトロールを含む実施例４の乳房塗布用組成物の乳房への塗布後１～７日目（ｄａｙ１～ｄａｙ７）において、また、分子量２４２Ｄａのエクオールを含む実施例５の乳房塗布用組成物の乳房への塗布後１～５日目（ｄａｙ１～ｄａｙ５）において、乳中体細胞数が低下することが確認された。表１の結果にて上述したように、レスベラトロールとエクオールは、タイトジャンクションの構成タンパク質であるクローディン－３の量を増加し、タイトジャンクションの機能を増強することが既に確認されている。従って、これらの結果から、実施例４、５に係る乳房塗布用組成物の乳房への塗布により、乳腺上皮細胞のタイトジャンクションの機能が増強され、細胞間の間隙が狭くなり、細胞間隙を通過して乳腺内腔側へ移行する体細胞数が減少したものと推察される。また、表２の実施例６の欄に示すように、分子量２９４Ｄａのジンゲロールを含む実施例６の乳房塗布用組成物の乳房への塗布後１～７日目（ｄａｙ１～ｄａｙ７）において、乳中体細胞数の量が増加することが確認された。表１の結果にて上述したように、ジンゲロールは、タイトジャンクションの構成タンパク質であるクローディン－３とクローディン－４の量を減少させ、タイトジャンクションの機能を抑制することが既に確認されている。従って、これらの結果から、実施例６に係る乳房塗布用組成物の乳房への塗布により、乳腺上皮細胞のタイトジャンクションの機能が抑制され、細胞間の間隙が広くなり、細胞間隙を通過して乳腺内腔側へ移行する体細胞数が増加したものと推察される。このように、乳房塗布用組成物が分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを含む場合は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても乳腺上皮細胞のタイトジャンクションの機能を増強又は抑制できることが確認された。しかし、表２の比較例４、５の欄に示すように、分子量６７６Ｄａのイカリインを含む比較例４及び分子量５４０Ｄａのオレウロペインを含む比較例５の乳房塗布用組成物の乳房への塗布後１～７日目（ｄａｙ１～ｄａｙ７）においては、両者とも乳中体細胞数に変化が見られないことが確認された。表１の結果にて上述したように、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、イカリインとオレウロペインは、タイトジャンクションの機能を抑制する作用を有することが確認されていたにもかかわらず、乳房塗布用組成物を乳房に塗布したｉｎ ｖｉｖｏにおいてタイトジャンクションの機能を抑制できないことが確認された。この理由としては、分子量５００Ｄａ超過のポリフェノールが含まれている場合、分子サイズの大きさのために経皮吸収されなかったものと考えられる。以上の結果から、分子量５００Ｄａ超過のポリフェノールを有効成分として含む乳房塗布用組成物を用いる場合は、タイトジャンクションの機能の増強又は抑制を行うことが難しいことが示された。

【0069】

続いて、表２を参照しつつ、乳中抗菌因子への影響について説明する。まず、表２の実施例４の欄に示すように、実施例４に係る乳房塗布用組成物の乳房への塗布後１～７日目（ｄａｙ１～ｄａｙ７）において、乳中β－ディフェンシン－１濃度と乳中Ｓ１００Ａ７濃度がともに増加することが確認された。また、表２の実施例５、６の欄に示すように、実施例５に係る乳房塗布用組成物では乳房への塗布後２～５日目（ｄａｙ２～ｄａｙ５）において乳中β－ディフェンシン－１濃度の増加が確認され、実施例６に係る乳房塗布用組成物では乳房への塗布後１～７日目（ｄａｙ１～ｄａｙ７）において乳中β－ディフェンシン－１濃度の増加が確認された。これらの結果から、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを含む乳房塗布用組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、該ポリフェノールが乳房中に経皮吸収され、乳房中の抗菌因子を増加させる作用を有することが分かった。

【0070】

表２の結果から、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、分子量５００Ｄａ以下のポリフェノールを含む乳房塗布用組成物を乳房に塗布することで、該ポリフェノールを経皮吸収することができ、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制した他、抗菌因子を増加させることが確認された。

【0071】

以上の結果から、タイトジャンクションの機能を増強又は抑制するための乳房塗布用生物として有用であり、また、抗菌因子を増加させるための乳房塗布用組成物としても有用であることが示された。