特開 2024-70247 神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニング方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024070247

(43)【公開日】2024-05-22

(54)【発明の名称】神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニング方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/50 20060101AFI20240515BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20240515BHJP

【ＦＩ】

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023189554

(22)【出願日】2023-11-06

(31)【優先権主張番号】P 2022180234

(32)【優先日】2022-11-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(72)【発明者】

【氏名】落石 知世

(72)【発明者】

【氏名】新木 和孝

(72)【発明者】

【氏名】戸井 基道

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045DA36

2G045FB03

(57)【要約】

【課題】 Ａβオリゴマーと神経毒性の発現メカニズムに基づく新規な認知症治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】 （１）候補化合物の存在下または非存在下でアミロイドβオリゴマーとダイナミンとを接触させるステップと、（２）前記アミロイドβオリゴマーと前記ダイナミンとの結合を評価するステップとを含む、神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニング方法。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）候補化合物の存在下または非存在下でアミロイドβオリゴマーとダイナミンとを接触させるステップと、
（２）前記アミロイドβオリゴマーと前記ダイナミンとの結合を評価するステップと
を含む、神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニング方法。

【請求項2】

（３）候補化合物の存在下または非存在下でアミロイドβモノマーと前記ダイナミンとを接触させるステップと、
（４）前記アミロイドβモノマーと前記ダイナミンとの結合を評価するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記アミロイドβオリゴマーが２～１５量体である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ダイナミンがダイナミン１またはダイナミン２である、請求項に１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

アミロイドβオリゴマーまたはアミロイドβをコードする核酸と、ダイナミンまたはダイナミンをコードする核酸とを含んでなる、神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニングのためのキット。

【請求項7】

前記アミロイドβオリゴマーが２～１５量体である、請求項６に記載のキット。

【請求項8】

前記ダイナミンがダイナミン１またはダイナミン２である、請求項６または７に記載のキット。

【請求項9】

前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項６～８のいずれか１項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニングのための方法およびキットに関する。

【背景技術】

【0002】

現在、高齢人口の増加に伴い、認知症患者の数が増えつつあり、その治療方法の確立が急務とされている。認知症の多くは、アルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性疾患である。ＡＤの病理学的特徴としては、（１）脳の萎縮、（２）斑状のアミロイド蓄積物（老人斑）の形成、（３）神経細胞内における繊維状の塊（神経原線維変化：ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ（ＮＦＴ））の形成の３つが知られている。老人斑の形成はアミロイドβ（Ａβ）の凝集・蓄積によって引き起こされることが知られており、Ａβの凝集がアルツハイマー病の発症の発端であると考えられている（アミロイドカスケード仮説）。

【0003】

従来、脳に蓄積した不溶性のＡβ線維が神経毒性を発揮すると考えられてきた。しかし最近では、より神経毒性の強いＡβ凝集体として、可溶性のＡβオリゴマーが注目されつつある（Ａβオリゴマー仮説）。これまでに本発明者らは、Ａβオリゴマーの細胞内動態を可視化するためのＡβ－ＧＦＰ融合タンパク質およびそれを発現するモデル動物を開発している（特許文献１、非特許文献１および２）。しかし、Ａβオリゴマーがどのようなメカニズムにより神経毒性の発現に関与しているのかについては、依然明らかにされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特許第６４０７５０７号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２２７１２（２０１６）

【非特許文献2】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１７３６８（２０１９）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、Ａβオリゴマーの神経毒性を抑制する、新規な認知症治療薬の候補物質を探索するためのスクリーニング方法を提供することを目的としてなされたものである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、鋭意研究の結果、Ａβオリゴマーがダイナミンに直接結合することを明らかにし、Ａβオリゴマーとダイナミンとの結合を阻害することにより神経毒性を抑制できる可能性を見出した。

【0008】

すなわち、本発明は、一実施形態によれば、（１）候補化合物の存在下または非存在下でアミロイドβオリゴマーとダイナミンとを接触させるステップと、（２）前記アミロイドβオリゴマーと前記ダイナミンとの結合を評価するステップとを含む、神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供するものである。

【0009】

前記方法は、（３）候補化合物の存在下または非存在下でアミロイドβモノマーと前記ダイナミンとを接触させるステップと、（４）前記アミロイドβモノマーと前記ダイナミンとの結合を評価するステップとをさらに含むことが好ましい。

【0010】

また、本発明は、一実施形態によれば、アミロイドβオリゴマーまたはアミロイドβをコードする核酸と、ダイナミンまたはダイナミンをコードする核酸とを含んでなる、神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニングのためのキットを提供するものである。

【0011】

前記アミロイドβオリゴマーは２～１５量体であることが好ましい。

【0012】

前記ダイナミンはダイナミン１またはダイナミン２であることが好ましい。

【0013】

前記神経変性疾患はアルツハイマー病であることが好ましい。

【発明の効果】

【0014】

本発明に係る方法によれば、Ａβオリゴマーとダイナミンとの結合を阻害してＡβオリゴマーの神経毒性を抑制するという、新規な作用機序に基づく認知症治療薬の開発が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】図１は、Ａβ－ＧＦＰモノマーまたはオリゴマーおよびダイナミン１を共発現する細胞ならびにＡβ－ＧＦＰモノマーまたはオリゴマーおよびダイナミン２を共発現する細胞から調製されたサンプルについての、Ａβ－ＧＦＰモノマーまたはオリゴマーおよびダイナミン１またはダイナミン２の共免疫沈降の結果を示す図である。

【図2】図２は、ＭｉＴＭＡＢの存在下または非存在下でＡβ－ＧＦＰオリゴマーおよびダイナミン１を共発現する細胞から調製されたサンプルについての、Ａβ－ＧＦＰオリゴマーおよびダイナミン１の共免疫沈降の結果を示す図である。

【図3】図３は、ＭｉＴＭＡＢの存在下または非存在下でＡβ－ＧＦＰオリゴマーおよびダイナミン１を共発現する細胞から調製されたサンプルについての、Ａβ－ＧＦＰオリゴマーの免疫沈降の結果を示す図である。

【図4】図４は、ｐＡｃｔ－Ａβ_１－４２－ＧＦＰを導入したＨｅＬａ細胞におけるＡβ－ＧＦＰオリゴマーの発現を確認した蛍光顕微鏡像（左）および同視野におけるＦＭ４－６４色素染色像（右）である。矢印：Ａβ－ＧＦＰオリゴマー発現細胞、上段：ＦＭ４－６４色素を負荷してから３分後の細胞、下段：ＦＭ４－６４色素を負荷してから２０分後の細胞。

【図5】図５は、Ａβ－ＧＦＰオリゴマーを導入した（ＴＦ）または導入していない（ｎｏｎ ＴＦ）細胞の、ＦＭ４－６４色素を負荷してから５分後、１０分後、１５分後および２０分後における蛍光強度（相対値）を示すグラフである。

【図6】図６は、ＭｉＴＭＡＢ存在下で、Ａβ－ＧＦＰオリゴマーを導入した（ＴＦ）または導入していない（ｎｏｎ ＴＦ）細胞の、ＦＭ４－６４色素を負荷してから５分後、１０分後、１５分後および２０分後における蛍光強度（相対値）を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。

【0017】

本発明は、第一の実施形態によれば、（１）候補化合物の存在下または非存在下でアミロイドβオリゴマーとダイナミンとを接触させるステップと、（２）前記アミロイドβオリゴマーと前記ダイナミンとの結合を評価するステップとを含む、神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニング方法である。

【0018】

「神経変性疾患」とは、中枢神経系の神経細胞が徐々に変性して細胞死に至る進行性疾患の総称である。本実施形態における神経変性疾患には、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側策硬化症、ハンチントン舞踏病、プリオン病などが挙げられるが、これらには限定されない。本実施形態における神経変性疾患は、好ましくはアルツハイマー病である。

【0019】

本実施形態において、「治療」とは、神経変性疾患に罹患した対象において、その疾患の病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、その疾患を完全に治癒することのみならず、その疾患の諸症状を緩和することをも含む。また、「予防」とは、神経変性疾患に罹患するおそれのある対象において、その罹患を未然に防ぐことを意味する。ここで、「対象」は、任意の哺乳動物であってよいが、好ましくはヒトである。対象は、乳幼児、若年、青年、成人および老人対象を含めた任意の年齢であり得る。

【0020】

本実施形態のスクリーニング方法では、候補化合物の存在下または非存在下でアミロイドβオリゴマーとダイナミンとを接触させる。

【0021】

「アミロイドβオリゴマー」は、２個以上のアミロイドβ（Ａβ）モノマーの重合体である。本実施形態におけるＡβオリゴマーは、好ましくは２～１５量体であり、特に好ましくは２～４量体である。なお、本実施形態におけるＡβオリゴマーには、Ａβオリゴマーが凝集して形成された不溶性Ａβ線維は含まれない。

【0022】

「アミロイドβモノマー」（または、単に「アミロイドβ（Ａβ）」とも記載する）は、アミロイド前駆体タンパク質断片（ＡＰＰ）がβセクレターゼおよびγセクレターゼによって切断されることにより生成されるペプチドである。Ａβには、セクレターゼの切断位置により、アミノ酸数の異なるＡβ_１－４０、Ａβ_１－４２、Ａβ_１－４３などがある。本実施形態におけるＡβは、好ましくはＡβ_１－４２である。

【0023】

本実施形態におけるＡβは、任意の哺乳動物の任意のＡＰＰアイソフォームに由来するものであってよいが、好ましくはヒト由来である。ＡＰＰのアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトＡＰＰアイソフォームであれば、ＮＰ＿００１１２９６０１．１、ＮＰ＿００１１２９６０２．１、ＮＰ＿９５８８１７．１、ＮＰ＿００１１９１２３１．１、ＮＰ＿９５８８１６．１、ＮＰ＿００１１９１２３０．１、ＮＰ＿０００４７５．１、ＮＰ＿００１１２９４８８．１、ＮＰ＿００１１２９６０３．１（いずれもＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ）などが利用可能である。また、ＡＰＰをコードする核酸配列情報も公知であり、例えば、上記ヒトＡＰＰアイソフォームをコードする核酸配列であれば、ＮＭ＿００１１３６１２９．３、ＮＭ＿００１１３６１３０．３、ＮＭ＿２０１４１４．３、ＮＭ＿００１２０４３０２．２、ＮＭ＿２０１４１３．３、ＮＭ＿００１２０４３０１．２、ＮＭ＿０００４８４．４、ＮＭ＿００１１３６０１６．３、ＮＭ＿００１１３６１３１．３（いずれもＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ）などが利用可能である。

【0024】

本実施形態におけるＡβには、その機能が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて算出することができる。また、本実施形態におけるＡβには、その機能が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。「１～数個」とは、例えば１～３０個、好ましくは１～１０個、特に好ましくは１～５個であってよい。

【0025】

したがって、本実施形態におけるＡβは、家族性アルツハイマー病において見出される公知の変異を含むものであってもよい。すなわち、本実施形態におけるＡβは、野生型に限定されず、例えば、オランダ型変異体（Ｅ２２Ｑ）、北極型変異体（Ｅ２２Ｇ）、イタリア型変異体（Ｅ２２Ｋ）、フランドル型変異体（Ａ２１Ｇ）、アイオワ型変異体（Ｄ２３Ｎ）などであってもよい。

【0026】

本実施形態におけるＡβには、Ｎ末端および／またはＣ末端に、直接またはリンカーを介して、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＦＬＡＧなどのタグや、ＧＦＰなどのマーカータンパク質が付加されていてもよい。好ましくは、本実施形態の方法では、Ａβ－ＧＦＰ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２２７１２（２０１６））を用いることができる。

【0027】

Ａβオリゴマーは、Ａβモノマーを発現する細胞内で形成され得る。したがって、例えば、Ａβモノマーをコードする核酸を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、Ａβオリゴマーを得ることができる。宿主細胞としては、例えば、初代培養神経細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞などの哺乳動物細胞を用いることができる。発現ベクターは、例えば、以下に限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、ｐＣＭＶなどのプラスミドベクターなどを用いることができる。発現ベクターは、その種類に応じて当分野において周知の方法により細胞に導入されてよい。例えば、非ウイルスベクターであれば、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどにより導入することができる。ウイルスベクターであれば、適切な力価または多重感染度（ＭＯＩ）において細胞に感染させることにより導入することができる。

【0028】

「ダイナミン」は、細胞内輸送における膜小胞の形成に重要な役割を担うＧＴＰアーゼであり、哺乳動物においては、ダイナミン１、ダイナミン２およびダイナミン３のサブタイプがある。本実施形態において用いることができるダイナミンは、任意の哺乳動物由来の任意のサブタイプであってよいが、好ましくはヒト由来のダイナミン１またはダイナミン２である。ダイナミンのアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトダイナミン１アイソフォーム１であれば、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００４３９９．２、ヒトダイナミン２アイソフォーム１であれば、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＰ＿００１００５３６０．１が利用可能である。また、ダイナミンをコードする核酸配列情報も公知であり、例えば、ヒトダイナミン１アイソフォーム１をコードする核酸配列であれば、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿００４４０８．４、ヒトダイナミン２アイソフォーム１をコードする核酸配列であれば、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿００１００５３６０．３が利用可能である。

【0029】

本実施形態におけるダイナミンには、その機能が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。また、本実施形態におけるダイナミンには、その機能が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。

【0030】

ダイナミンは、ダイナミンをコードする核酸を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することにより発現させればよい。好ましい宿主細胞、ならびに発現ベクターおよびその導入方法は、Ａβの場合と同様であってよい。また、本実施形態におけるダイナミンには、Ａβと同様に、Ｎ末端および／またはＣ末端に、直接またはリンカーを介して、タグまたはマーカータンパク質が付加されていてもよい。

【0031】

本実施形態の方法では、単離精製されたＡβオリゴマーおよびダイナミンを用いることもできる。その場合には、好ましくは、宿主細胞としてＢＬ２１やＲｏｓｅｔｔａなどの大腸菌を用いてよく、発現ベクターとしてｐＴ７やｐＥＴなどのプラスミドベクターを用いてよい。Ａβオリゴマーは、当分野において周知の方法により精製されてよく、例えば、アフィニティークロマトグラフィーにより精製されてよい。

【0032】

候補化合物の存在下または非存在下でＡβオリゴマーとダイナミンとを接触させるためには、Ａβオリゴマーとダイナミンとを共発現させた宿主細胞を、候補化合物を添加したまたは添加していない培地中で一定期間インキュベートすればよい。あるいは、候補化合物を添加したまたは添加していない反応溶液に、単離されたＡβオリゴマーおよびダイナミンを添加し、一定時間インキュベートすればよい。反応溶液には、例えば、脳組織の抽出液またはその組成に準じて調製された緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ緩衝ａＣＳＦ）などを用いればよい。

【0033】

本実施形態における「候補化合物」は、低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質などであってよく、それらの混合物（例えば、細胞または組織からの抽出物、細胞または組織の培養上清など）であってもよい。また、これらの候補化合物は、新規のものであってもよいし、公知のものであってもよい。培地または反応溶液に添加される候補化合物の終濃度は、候補化合物の種類により異なるが、例えば、低分子化合物であれば、１ｎＭ～１ｍＭの範囲で適宜選択することができる。インキュベーション時間は、例えば、６０分～４８時間であってよい。

【0034】

次いで、Ａβオリゴマーとダイナミンとの結合を評価する。Ａβオリゴマーとダイナミンとの結合は、タンパク質間相互作用を解析するための任意の手法により評価することができる。好ましい手法としては、例えば、共免疫沈降、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、二分子蛍光補完（ＢｉＦＣ）、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0035】

候補化合物の添加によりＡβオリゴマーとダイナミンとの結合が変化したかどうかを判定するためには、候補化合物を添加しない培養または反応を並行して解析して比較してもよいし、過去に実施した候補化合物を添加しない培養または反応についての解析結果と比較してもよい。本実施形態の方法において、候補化合物の存在下でのＡβオリゴマーとダイナミンとの結合が、候補化合物の非存在下でのＡβオリゴマーとダイナミンとの結合と比較して有意に減少した場合には、当該候補化合物は、神経変性疾患の治療薬または予防薬として有望であると判断することができる。一方、候補化合物の存在下でのＡβオリゴマーとダイナミンとの結合が、候補化合物の非存在下でのＡβオリゴマーとダイナミンとの結合と比較して同等または有意に増加した場合には、当該候補化合物は、神経変性疾患の治療薬または予防薬として有望ではないと判断することができる。

【0036】

本実施形態のスクリーニング方法は、（３）候補化合物の存在下または非存在下でアミロイドβモノマーと前記ダイナミンとを接触させるステップと、（４）前記アミロイドβモノマーと前記ダイナミンとの結合を評価するステップとをさらに含んでもよい。なお、（１）～（４）の番号は、各ステップの実施の順番を限定するものではなく、例えば、ステップ（３）および（４）を実施した後に（１）および（２）ステップを実施してもよい。

【0037】

Ａβモノマーとダイナミンとの結合の評価は、オリゴマーを形成しない変異を含むＡβを用いる以外は、上で記載したＡβオリゴマーとダイナミンとの結合の評価と同様に実施すればよい。オリゴマーを形成しない変異Ａβとしては、例えば、Ａβ（Ｆ１９Ｓ／Ｌ３４Ｐ）を用いることができる（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２２７１２（２０１６））。

【0038】

Ａβオリゴマーとは異なり、Ａβモノマーは細胞毒性ではなく、むしろ神経保護作用を有することが知られる。したがって、実施形態の方法において、候補化合物の存在下でのＡβモノマーとダイナミンとの結合が、候補化合物の非存在下でのＡβモノマーとダイナミンとの結合と比較して有意に減少した場合は、当該候補化合物は、神経変性疾患の治療薬または予防薬として有望ではないと判断することができる。

【0039】

本発明は、第二の実施形態によれば、アミロイドβオリゴマーまたはアミロイドβをコードする核酸と、ダイナミンまたはダイナミンをコードする核酸とを含んでなる、神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニングのためのキットである。本実施形態における「アミロイドβオリゴマー」、「アミロイドβをコードする核酸」、「ダイナミン」、「ダイナミンをコードする核酸」、「神経変性疾患」、「治療」および「予防」は、第一の実施形態で定義したものと同様である。

【0040】

本実施形態のキットは、上記の構成に加え、緩衝液、培地、プレート、説明書などをさらに含んでもよい。

【実施例0041】

以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。

【0042】

＜１．Ａβオリゴマーに結合するタンパク質の探索＞
ヒトＡβ_１－４２－ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＡβ－ＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１７３６８（２０１９））およびＧＦＰを発現するＧＦＰトランスジェニックマウス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｎｅｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ２３（６），ｐｐ．２１７０－２１８１（２００３））の脳組織から調製された試料について、抗ＧＦＰ抗体（株式会社医学生物学研究所（ＭＢＬ））を結合させたＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＧＦＰ－Ｔｒａｐ（商標）磁気アガロースビーズ（ＣｈｒｏｍｏＴｅｋ）を用いて共免疫沈降を行った。回収されたビーズから溶出されたタンパク質を消化して得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により解析した。その結果、ダイナミン１およびダイナミン２がＡβオリゴマーに結合することが示唆された。

【0043】

＜２．Ａβモノマーまたはオリゴマーとダイナミンとの結合＞
（２－１）Ａβオリゴマーとダイナミンとの結合
次に、Ａβオリゴマーとダイナミン１またはダイナミン２との結合を生化学的に解析した。ヒトダイナミン１をコードする核酸配列（ＮＭ＿００４４０８．４）およびＦＬＡＧタグをコードする核酸配列を含む、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトダイナミン１（以下、「ダイナミン１－ＦＬＡＧ」と記載する）を発現するプラスミドｐＣＭＶ－ＤＮＭ１－ＦＬＡＧ、ならびにヒトダイナミン２をコードする核酸配列（ＮＭ＿００１００５３６０．３）およびＦＬＡＧタグをコードする核酸配列を含む、Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトダイナミン２（以下、「ダイナミン２－ＦＬＡＧ」と記載する）を発現するプラスミドｐＣＭＶ－ＤＮＭ２－ＦＬＡＧを調製した。ヒトＡβ_１－４２－ＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラスミドには、ｐＡｃｔ－Ａβ_１－４２－ＧＦＰ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２２７１２（２０１６））を用いた。ｐＣＭＶ－ＤＮＭ１－ＦＬＡＧおよびｐＡｃｔ－Ａβ_１－４２－ＧＦＰ、または、ｐＣＭＶ－ＤＮＭ２－ＦＬＡＧおよびｐＡｃｔ－Ａβ_１－４２－ＧＦＰを、ポリエチレンイミンベースのトランスフェクションによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、ＤＭＥＭ中で２４時間培養した。その後、細胞を回収し、溶解バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４），０．５ｍＭのＥＤＴＡ，１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００，１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）カクテル，１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ））を加え、１０分ごとにピペッティングしながら４℃で３０分間インキュベートした。遠心分離（４℃、１７０００×ｇ、１０分間）により上清を回収し、細胞内タンパク質溶液を得た。

【0044】

細胞内タンパク質溶液にＧＦＰ－Ｔｒａｐ（商標）磁気アガロースビーズを加え、４℃で１時間転倒混和しながらインキュベートした。磁気ビーズ分離ラックでビーズを回収し、洗浄後、２×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、タンパク質溶出液を得た。タンパク質溶出液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、電気泳動後、ＰＶＤＦ膜にタンパク質を転写した。Ａβオリゴマーと共免疫沈降したダイナミン１またはダイナミン２は、一次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体（富士フイルム和光純薬）（１：２０００希釈）、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（１：２０００希釈）を用いて検出した。

【0045】

（２－２）Ａβモノマーとダイナミンとの結合
ｐＡｃｔ－Ａβ_１－４２－ＧＦＰに代えて、ヒトＡβ_１－４２（Ｆ１９Ｓ／Ｌ３４Ｐ）－ＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラスミド（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：２２７１２（２０１６））を用いた以外は、上記（２－１）と同様の手順により共免疫沈降およびウェスタンブロッティングを行い、Ａβモノマーとダイナミン１またはダイナミン２との結合を評価した。

【0046】

結果を図１に示す。図中、「ＤＮＭ１」はダイナミン１－ＦＬＡＧ、「ＤＮＭ２」はダイナミン２－ＦＬＡＧ、「Ａβ ｏｌｉｇｏｍｅｒ」はヒトＡβ_１－４２－ＧＦＰオリゴマー、「Ａβ ｍｏｎｏｍｅｒ」はヒトＡβ_１－４２－ＧＦＰモノマー、「ＩＰ」は共免疫沈降サンプル、「ｉｎｐｕｔ」は共免疫沈降前の細胞内タンパク質溶液を示す。ダイナミン１およびダイナミン２はいずれもＡβオリゴマーと結合することが確認された（図１、ＤＮＭ１／Ａβ ｏｌｉｇｏｍｅｒ ＩＰ、ＤＮＭ２／Ａβ ｏｌｉｇｏｍｅｒ ＩＰ）。一方、ダイナミン１はＡβモノマーとも結合したが（図１、ＤＮＭ１／Ａβ ｍｏｎｏｍｅｒ ＩＰ）、ダイナミン２とＡβモノマーとの結合は確認されなかった（図１、ＤＮＭ２／Ａβ ｍｏｎｏｍｅｒ ＩＰ）。Ａβモノマーは細胞毒性ではなく、むしろ神経保護作用を有することを考慮すると、（１）ダイナミン１とＡβオリゴマーとの結合を阻害するが、ダイナミン１とＡβモノマーとの結合を阻害しない物質、または（２）ダイナミン２とＡβオリゴマーとの結合を阻害する物質が、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療薬として有効であり得ることが示唆された。

【0047】

＜３．Ａβオリゴマーとダイナミンとの結合を阻害する物質のスクリーニング＞
既知のダイナミン阻害剤ＭｉＴＭＡＢがダイナミン１とＡβオリゴマーとの結合を阻害するかどうかを、共免疫沈降およびウェスタンブロッティングにより評価した。ＦＬＡＧ－ダイナミン１プラスミドおよびｐＡｃｔ－Ａβ_１－４２－ＧＦＰを細胞に導入すると同時に、培地に終濃度５μＭまたは１０μＭのＭｉＴＭＡＢ（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した以外は、上記（２－１）と同様の手順により共免疫沈降およびウェスタンブロッティングを行った。その後、膜をストリッピングし、一次抗体として抗Ａβ抗体（６Ｅ１０）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）（１：５００希釈）、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（１：２０００希釈）を用い、同様の手順によりウェスタンブロッティングを行った。

【0048】

結果を図２および図３に示す。図中、「ＩＰ」は共免疫沈降サンプル、「ｉｎｐｕｔ」は共免疫沈降前の細胞内タンパク質溶液を示す。レーン１および５は１０μＭのＭｉＴＭＡＢ存在下でＡβ－ＧＦＰとダイナミン１とを共発現させた細胞からのサンプル、レーン２および６は５μＭのＭｉＴＭＡＢ存在下でＡβ－ＧＦＰとダイナミン１とを共発現させた細胞からのサンプル、レーン３および７はＭｉＴＭＡＢ非存在下でＡβ－ＧＦＰとダイナミン１とを共発現させた細胞からのサンプル、レーン４および８はＡβ－ＧＦＰとダイナミン１とを導入していないＭｉＴＭＡＢ非存在下の細胞からのサンプルを示す。

【0049】

ＭｉＴＭＡＢの細胞毒性のため、共免疫沈降前の細胞内タンパク質溶液において、ダイナミン１およびＡβ－ＧＦＰの発現がＭｉＴＭＡＢの濃度依存的に減少したことが確認された（図２および３、レーン５および６）。そこで、免疫沈降されたＡβ－ＧＦＰ（図３）のバンド強度に基づいて共免疫沈降されたダイナミン１（図２）のバンド強度をノーマライズし、Ａβ－ＧＦＰオリゴマーとダイナミン１との結合量の変化を相対的に評価した。その結果、Ａβ－ＧＦＰオリゴマーとダイナミン１との結合量は、ＭｉＴＭＡＢ非存在下と比較して、５μＭのＭｉＴＭＡＢ存在下では約３１％、１０μＭのＭｉＴＭＡＢ存在下では約５％に減少したことが明らかになった。

【0050】

以上の結果から、ダイナミン１とＡβ－ＧＦＰとの共発現系を用いて、ダイナミン１とＡβオリゴマーとの結合を阻害する物質のスクリーニングが可能であることが示された。

【0051】

＜４．ＭｉＴＭＡＢはダイナミンとＡβオリゴマーとの結合を阻害することによりエンドサイトーシス障害を改善する＞
（４－１）Ａβオリゴマーがエンドサイトーシスに及ぼす影響
ダイナミンはエンドサイトーシスにおける細胞膜からの小胞の切断に関与し、ダイナミンの機能が阻害されるとエンドサイトーシスが阻害されることがすでに知られている。そこで、エンドサイトーシスを可視化できるＦＭ４－６４色素を用いて、Ａβオリゴマーがダイナミンに結合することによりエンドサイトーシスを阻害するかどうかを確認した。

【0052】

Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｐＡｃｔ－Ａβ_１－４２－ＧＦＰをＨｅＬａ細胞にトランスフェクションし、ＤＭＥＭ中で２４時間培養した。その後、細胞を回収し、ガラスボトムディッシュに低密度で播種した。４～６時間後、終濃度１．６μＭのＦＭ４－６４色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に添加し、３分後、５分後、１０分後、１５分後および２０分後に共焦点レーザー顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ）により撮像し、細胞におけるＦＭ４－６４色素の蛍光強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアにより解析した。

【0053】

顕微鏡像を図４に示す。ＦＭ４－６４色素を負荷してから３分後の細胞（図４右上）よりも、２０分後の細胞（図４右下）における蛍光強度が増加しており、ＦＭ４－６４色素がエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれていることが確認されたが、Ａβ－ＧＦＰを発現する細胞（矢印）では、Ａβ－ＧＦＰを発現していない細胞と比較して、色素の取り込みが減少していた。また、５分後、１０分後、１５分後および２０分後の細胞における蛍光強度（ＦＭ４－６４色素を負荷してから３分後の細胞における蛍光強度を１とした場合の相対値）を図５に示す。図中、「ＴＦ」はＡβ－ＧＦＰが導入された細胞、「ｎｏｎ ＴＦ」はＡβ－ＧＦＰが導入されていない細胞を意味する。Ａβ－ＧＦＰを発現する細胞では、Ａβ－ＧＦＰを発現していない細胞と比較して、色素の取り込みが有意に遅くなっていることが明らかになった。これらの結果から、Ａβオリゴマーがダイナミンに結合することにより、エンドサイトーシスが阻害されることが示唆された。

【0054】

（４－２）Ａβオリゴマーによるエンドサイトーシス障害に対するＭｉＴＭＡＢの効果
上記（４－１）と同様の手順により、ｐＡｃｔ－Ａβ_１－４２－ＧＦＰをＨｅＬａ細胞に導入した。ＤＭＥＭ中で２４時間培養した後、ガラスボトムディッシュに低密度で播種すると同時に、ＭｉＴＭＡＢ（終濃度５μＭ）を培地に添加した。その後、上記（４－１）と同様の手順により、細胞におけるＦＭ４－６４色素の蛍光強度（相対値）を算出し、エンドサイトーシス活性を評価した。

【0055】

結果を図６に示す。図中、「ＴＦ」はＡβ－ＧＦＰが導入された細胞、「ｎｏｎ ＴＦ」はＡβ－ＧＦＰが導入されていない細胞を意味する。細胞をＭｉＴＭＡＢで処理した場合には、Ａβ－ＧＦＰを発現する細胞とＡβ－ＧＦＰを発現していない細胞との間で、５分後、１０分後、１５分後および２０分後のいずれの時点でも、ＦＭ４－６４色素の細胞内取り込みに有意差は認められなかった。これらの結果から、ＭｉＴＭＡＢがダイナミンとＡβオリゴマーとの結合を阻害することにより、Ａβオリゴマーによるエンドサイトーシス障害を改善できる可能性が示唆された。

【0056】

以上の結果から、ダイナミンとＡβ－ＧＦＰとの共発現系を用いたスクリーニング系により、Ａβオリゴマーの神経毒性を抑制可能な、認知症治療薬の候補物質の探索が可能であることが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】