▶ 株式会社Ｍｉｚｋａｎ Ｈｏｌｄｉｎｇｓの特許一覧 ▶ 株式会社Ｍｉｚｋａｎの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024076291
(43)【公開日】2024-06-05
(54)【発明の名称】脂溶性成分の分析方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/06 20060101AFI20240529BHJP
【ＦＩ】
G01N33/06
【審査請求】有
【請求項の数】43
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022187808
(22)【出願日】2022-11-24
(71)【出願人】
【識別番号】514057743
【氏名又は名称】株式会社Ｍｉｚｋａｎ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ
(71)【出願人】
【識別番号】317006214
【氏名又は名称】株式会社Ｍｉｚｋａｎ
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】町川 司
(57)【要約】
【課題】脂溶性成分を含有する組成物から、操作的に簡便な手段により当該脂溶性成分を正確に分析する方法を提供する。
【解決手段】次の（ｉ）～（ｉＶ）段階を含む、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成
分の分析方法。
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階、
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
【選択図】なし
【解決手段】次の（ｉ）～（ｉＶ）段階を含む、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成
分の分析方法。
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階、
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
次の（ｉ）～（ｉＶ）段階を含む、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の分析方法。
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール／水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール／水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
【請求項2】
（ｉ）段階において、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項3】
（ｉ）段階において、サンプルＡにおける被測定対象脂溶性成分のうち、４０ｗ／ｗ％以上が細胞又は組織に含有される、請求項２記載の方法。
【請求項4】
（ｉ）段階において、被測定対象脂溶性成分を含む細胞若しくは組織として酢酸菌体を含有する、請求項２又は３記載の方法。
【請求項5】
（ｉ）段階において、サンプルＡが可溶性糖類を含有する、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する可溶性糖類の含有量が、０．１～３０ｗ／ｖ％である、請求項５記載の方法。
【請求項7】
（ｉ）段階において、サンプルＡが、被測定対象脂溶性成分としてセラミドを含有する、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
【請求項8】
（ｉ）段階において、サンプルＡが、酢酸菌生成物を含有する、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
【請求項9】
（ｉ）段階において、サンプルＡが酢酸を含有する、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
【請求項10】
（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する酢酸含有量が０．０２～１５ｗ／ｖ％である、請求項９記載の方法
【請求項11】
（ｉ）段階において、親水性溶媒の２０℃における密度が１．００３ｇ／ｍｌ以上である、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項12】
（ｉ）段階において、親水性溶媒のｐＨが４．５以下である、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項13】
（ｉ）段階において、サンプルＡの総タンパク質含有量が１５ｗ／ｖ％以下である、請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項14】
（ｉ）段階において、サンプルＡの波長６６０ｎｍにおける濁度が１．１００以上である、請求項１～１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項15】
（ｉ）段階において、サンプルＡが飲食品である、請求項１～１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項16】
（ｉｉ）段階において、媒体ａがｔ－ブチルメチルエーテルを含有する、請求項１～１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項17】
（ｉｉ）段階において、媒体ａがメタノールを含有する、請求項１～１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項18】
（ｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉ‘）段階を含む、請求項１～１７のいずれか１項記載の方法。
（ｉｉ‘）サンプルＢを１０～１４４０分間混合する段階
（ｉｉ‘）サンプルＢを１０～１４４０分間混合する段階
【請求項19】
（ｉｉｉ）段階において、下層サンプルＣ２に沈殿が存在する、請求項１～１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項20】
（ｉｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉｉ‘）段階を含む、請求項１～１９のいずれか１項記載の方法。
（ｉｉｉ‘）上層サンプルＣ１をさらに濃縮する段階
（ｉｉｉ‘）上層サンプルＣ１をさらに濃縮する段階
【請求項21】
（ｉＶ）段階が、サンプルＣ１を高速液体クロマトグラフィーに付す段階である、請求項１～２０記載の方法。
【請求項22】
前記段階（ｉＶ）において、高速液体クロマトグラフィーの移動相に少なくとも３種の有機溶媒を使用する、請求項１～２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項23】
次の（ｉ）～（ｉＶ）段階を含む、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の経時的な含有量変化を分析する方法
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール／水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール／水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脂溶性成分の分析方法に関する。
【背景技術】
【0002】
種々の成分を含有する組成物中に含まれる被測定対象の脂溶性成分を分析する技術は、当該組成物を利用する産業において重要である。
【0003】
従来、組成物から、有機溶媒を用いて特定の成分を回収する方法が知られている。例えば、親水性成分を含有する組成物から成分を高回収する手法として、特許文献１では、水可溶性有機物及び無機酸を含む被処理水に、水酸化物、酸化物、炭酸塩あるいは炭酸水素塩のうち少なくとも１種類以上を添加して前記被処理水を中和する工程の後に、水に対する溶解度が３０ｗ／ｖ％以上且つ回収する水可溶性有機物に対する溶解度が１ｗ／ｖ％以下である塩のうち少なくとも１種類以上を添加して、水可溶性有機物と水を分離する工程とを備える水可溶性有機物を高濃度、且つ高回収率で分離・回収する方法が記載されている。
また、組成物から脂溶性成分を抽出して測定するには、通常、クロロホルムなどのような脂溶性成分を溶解して水と相分離しうる有機溶媒を添加して、クロロホルム相に脂溶性成分を抽出して分離し、測定する方法が行われている。
また、組成物から脂溶性成分を抽出して測定するには、通常、クロロホルムなどのような脂溶性成分を溶解して水と相分離しうる有機溶媒を添加して、クロロホルム相に脂溶性成分を抽出して分離し、測定する方法が行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２００６－１７５３３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかし、特許文献１記載の方法は、脂溶性成分の分析に汎用的に利用できる方法ではなかった。また、クロロホルムを使用する方法では、水相とクロロホルム相が良好に分離せず、また、高速液体クロマトグラフィーのピークが安定しないため、定量分析等の分析精度が悪いという問題があった。
従って、本発明の課題は、脂溶性成分を含有する組成物から、特定の密度比の親水性溶媒と疎水性溶媒とで処理することで、当該脂溶性成分を正確に分析する方法を提供することにある。
従って、本発明の課題は、脂溶性成分を含有する組成物から、特定の密度比の親水性溶媒と疎水性溶媒とで処理することで、当該脂溶性成分を正確に分析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは鋭意検討を重ねたところ、所定量の親水性溶媒と、被測定対象脂溶性成分とを含有する組成物を準備又は調整し、被測定対象脂溶性成分の抽出溶媒として、特定の水への溶解度と特定の密度とを具備する有機溶媒を使用し、親水性溶媒と有機溶媒の密度比を調整することにより、相分離が極めて良好となり、被測定対象脂溶性成分を効率よく分析できることを知見した。
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
【0007】
［項１］次の（ｉ）～（ｉＶ）段階を含む、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の分析
方法。
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
［項２］（ｉ）段階において、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有する、項１記載の方法。
［項３］（ｉ）段階において、サンプルＡにおける被測定対象脂溶性成分のうち、４０ｗ／ｗ％以上が細胞又は組織に含有される、項２記載の方法。
［項４］（ｉ）段階において、被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織として酢酸菌体を含有する、項２又は３記載の方法。
［項５］（ｉ）段階において、サンプルＡが可溶性糖類を含有する、項１～４のいずれか１項記載の方法。
［項６］（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する可溶性糖類の含有量が、０．１～３０ｗ／ｖ％である、項５記載の方法。
［項７］（ｉ）段階において、サンプルＡが、被測定対象脂溶性成分としてセラミドを含有する、項１～６のいずれか１項記載の方法。
［項８］（ｉ）段階において、サンプルＡが、酢酸菌生成物を含有する、項１～７のいずれか１項記載の方法。
［項９］（ｉ）段階において、サンプルＡが酢酸を含有する、項１～８のいずれか１項記載の方法。
［項１０］（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する酢酸含有量が０．０２～１５ｗ／ｖ％である、項９記載の方法
［項１１］（ｉ）段階において、親水性溶媒の２０℃における密度が１．００３ｇ／ｍｌ以上である、項１～１０のいずれか１項記載の方法。
［項１２］（ｉ）段階において、親水性溶媒のｐＨが４．５以下である、項１～１１のいずれか１項記載の方法。
［項１３］（ｉ）段階において、サンプルＡの総タンパク質含有量が１５ｗ／ｖ％以下である、項１～１２のいずれか１項記載の方法。
［項１４］（ｉ）段階において、サンプルＡの波長６６０ｎｍにおける濁度が１．１００以上である、項１～１３のいずれか１項記載の方法。
［項１５］（ｉ）段階において、サンプルＡが飲食品である、項１～１４のいずれか１項記載の方法。
［項１６］（ｉｉ）段階において、媒体ａがｔ－ブチルメチルエーテルを含有する、項１～１５のいずれか１項記載の方法。
［項１７］（ｉｉ）段階において、媒体ａがメタノールを含有する、項１～１６のいずれか１項記載の方法。
［項１８］（ｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉ‘）段階を含む、項１～１７のいずれか１項記載の方法。
（ｉｉ‘）サンプルＢを１０～１４４０分間混合する段階
［項１９］（ｉｉｉ）段階において、下層サンプルＣ２に沈殿が存在する、項１～１８のいずれか１項記載の方法。
［項２０］（ｉｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉｉ‘）段階を含む、項１～１９のいずれか１項記載の方法。
（ｉｉｉ‘）上層サンプルＣ１をさらに濃縮する段階
［項２１］（ｉＶ）段階が、サンプルＣ１を高速液体クロマトグラフィーに付す段階である、項１～２０記載の方法。
［項２２］前記段階（ｉＶ）において、高速液体クロマトグラフィーの移動相に少なくと
も３種の有機溶媒を使用する、項１～２１のいずれか１項記載の方法。
［項２３］
次の（ｉ）～（ｉＶ）段階を含む、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の経時的な含有
量変化を分析する方法
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール／水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
方法。
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
［項２］（ｉ）段階において、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有する、項１記載の方法。
［項３］（ｉ）段階において、サンプルＡにおける被測定対象脂溶性成分のうち、４０ｗ／ｗ％以上が細胞又は組織に含有される、項２記載の方法。
［項４］（ｉ）段階において、被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織として酢酸菌体を含有する、項２又は３記載の方法。
［項５］（ｉ）段階において、サンプルＡが可溶性糖類を含有する、項１～４のいずれか１項記載の方法。
［項６］（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する可溶性糖類の含有量が、０．１～３０ｗ／ｖ％である、項５記載の方法。
［項７］（ｉ）段階において、サンプルＡが、被測定対象脂溶性成分としてセラミドを含有する、項１～６のいずれか１項記載の方法。
［項８］（ｉ）段階において、サンプルＡが、酢酸菌生成物を含有する、項１～７のいずれか１項記載の方法。
［項９］（ｉ）段階において、サンプルＡが酢酸を含有する、項１～８のいずれか１項記載の方法。
［項１０］（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する酢酸含有量が０．０２～１５ｗ／ｖ％である、項９記載の方法
［項１１］（ｉ）段階において、親水性溶媒の２０℃における密度が１．００３ｇ／ｍｌ以上である、項１～１０のいずれか１項記載の方法。
［項１２］（ｉ）段階において、親水性溶媒のｐＨが４．５以下である、項１～１１のいずれか１項記載の方法。
［項１３］（ｉ）段階において、サンプルＡの総タンパク質含有量が１５ｗ／ｖ％以下である、項１～１２のいずれか１項記載の方法。
［項１４］（ｉ）段階において、サンプルＡの波長６６０ｎｍにおける濁度が１．１００以上である、項１～１３のいずれか１項記載の方法。
［項１５］（ｉ）段階において、サンプルＡが飲食品である、項１～１４のいずれか１項記載の方法。
［項１６］（ｉｉ）段階において、媒体ａがｔ－ブチルメチルエーテルを含有する、項１～１５のいずれか１項記載の方法。
［項１７］（ｉｉ）段階において、媒体ａがメタノールを含有する、項１～１６のいずれか１項記載の方法。
［項１８］（ｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉ‘）段階を含む、項１～１７のいずれか１項記載の方法。
（ｉｉ‘）サンプルＢを１０～１４４０分間混合する段階
［項１９］（ｉｉｉ）段階において、下層サンプルＣ２に沈殿が存在する、項１～１８のいずれか１項記載の方法。
［項２０］（ｉｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉｉ‘）段階を含む、項１～１９のいずれか１項記載の方法。
（ｉｉｉ‘）上層サンプルＣ１をさらに濃縮する段階
［項２１］（ｉＶ）段階が、サンプルＣ１を高速液体クロマトグラフィーに付す段階である、項１～２０記載の方法。
［項２２］前記段階（ｉＶ）において、高速液体クロマトグラフィーの移動相に少なくと
も３種の有機溶媒を使用する、項１～２１のいずれか１項記載の方法。
［項２３］
次の（ｉ）～（ｉＶ）段階を含む、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の経時的な含有
量変化を分析する方法
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール／水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
【0008】
［項２４］次の（ｉ）～（ｉｉｉ）段階を含む、被測定対象脂溶性成分を含む分析検体の製造方法。
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
［項２５］（ｉ）段階において、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有する、項２４記載の方法。
［項２６］（ｉ）段階において、サンプルＡにおける被測定対象脂溶性成分のうち、４０ｗ／ｗ％以上が細胞又は組織に含有される、項２５記載の方法。
［項２７］（ｉ）段階において、被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織として酢酸菌体を含有する、項２５又は２６記載の方法。
［項２８］（ｉ）段階において、サンプルＡが可溶性糖類を含有する、項２４～２７記載の方法。
［項２９］（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する可溶性糖類の含有量が、０．１～３０ｗ／ｖ％である、項２８記載の方法。
［項３０］（ｉ）段階において、サンプルＡが、被測定対象脂溶性成分としてセラミドを含有する、項２４～２９のいずれか１項記載の方法。
［項３１］（ｉ）段階において、サンプルＡが、酢酸菌生成物を含有する、項２４～３０のいずれか１項記載の方法。
［項３２］（ｉ）段階において、サンプルＡが酢酸を含有する、項２４～３１のいずれか１項記載の方法。
［項３３］（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する酢酸含有量が０．０２～１５ｗ／ｖ％である、項３２記載の方法
［項３４］（ｉ）段階において、親水性溶媒の２０℃における密度が１．００３ｇ／ｍｌ以上である、項２４～３３のいずれか１項記載の方法。
［項３５］（ｉ）段階において、親水性溶媒のｐＨが４．５以下である、項２４～３４のいずれか１項記載の方法。
［項３６］（ｉ）段階において、サンプルＡの総タンパク質含有量が１５ｗ／ｖ％以下である、項２４～３５のいずれか１項記載の方法。
［項３７］（ｉ）段階において、サンプルＡの波長６６０ｎｍにおける濁度が１．１００以上である、項２４～３６のいずれか１項いずれか１項記載の方法。
［項３８］（ｉ）段階において、サンプルＡが飲食品である、項２４～３７のいずれか１項記載の方法。
［項３９］（ｉｉ）段階において、媒体ａがｔ－ブチルメチルエーテルを含有する、項２４～３８のいずれか１項記載の方法。
［項４０］（ｉｉ）段階において、媒体ａがメタノールを含有する、項２４～３９のいずれか１項記載の方法。
［項４１］（ｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉ‘）段階を含む、項２４～４０のいずれか１項記載の方法。
（ｉｉ‘）サンプルＢを１０～１４４０分間混合する段階
［項４２］（ｉｉｉ）段階において、下層サンプルＣ２に沈殿が存在する、項２４～４１のいずれか１項記載の方法。
［項４３］（ｉｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉｉ‘）段階を含む、項２４～４２のいずれか１項記載の方法。
（ｉｉｉ‘）上層サンプルＣ１をさらに濃縮する段階
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
［項２５］（ｉ）段階において、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有する、項２４記載の方法。
［項２６］（ｉ）段階において、サンプルＡにおける被測定対象脂溶性成分のうち、４０ｗ／ｗ％以上が細胞又は組織に含有される、項２５記載の方法。
［項２７］（ｉ）段階において、被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織として酢酸菌体を含有する、項２５又は２６記載の方法。
［項２８］（ｉ）段階において、サンプルＡが可溶性糖類を含有する、項２４～２７記載の方法。
［項２９］（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する可溶性糖類の含有量が、０．１～３０ｗ／ｖ％である、項２８記載の方法。
［項３０］（ｉ）段階において、サンプルＡが、被測定対象脂溶性成分としてセラミドを含有する、項２４～２９のいずれか１項記載の方法。
［項３１］（ｉ）段階において、サンプルＡが、酢酸菌生成物を含有する、項２４～３０のいずれか１項記載の方法。
［項３２］（ｉ）段階において、サンプルＡが酢酸を含有する、項２４～３１のいずれか１項記載の方法。
［項３３］（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する酢酸含有量が０．０２～１５ｗ／ｖ％である、項３２記載の方法
［項３４］（ｉ）段階において、親水性溶媒の２０℃における密度が１．００３ｇ／ｍｌ以上である、項２４～３３のいずれか１項記載の方法。
［項３５］（ｉ）段階において、親水性溶媒のｐＨが４．５以下である、項２４～３４のいずれか１項記載の方法。
［項３６］（ｉ）段階において、サンプルＡの総タンパク質含有量が１５ｗ／ｖ％以下である、項２４～３５のいずれか１項記載の方法。
［項３７］（ｉ）段階において、サンプルＡの波長６６０ｎｍにおける濁度が１．１００以上である、項２４～３６のいずれか１項いずれか１項記載の方法。
［項３８］（ｉ）段階において、サンプルＡが飲食品である、項２４～３７のいずれか１項記載の方法。
［項３９］（ｉｉ）段階において、媒体ａがｔ－ブチルメチルエーテルを含有する、項２４～３８のいずれか１項記載の方法。
［項４０］（ｉｉ）段階において、媒体ａがメタノールを含有する、項２４～３９のいずれか１項記載の方法。
［項４１］（ｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉ‘）段階を含む、項２４～４０のいずれか１項記載の方法。
（ｉｉ‘）サンプルＢを１０～１４４０分間混合する段階
［項４２］（ｉｉｉ）段階において、下層サンプルＣ２に沈殿が存在する、項２４～４１のいずれか１項記載の方法。
［項４３］（ｉｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉｉ‘）段階を含む、項２４～４２のいずれか１項記載の方法。
（ｉｉｉ‘）上層サンプルＣ１をさらに濃縮する段階
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、脂溶性成分を含有する組成物から、操作的に簡便な手段により当該脂溶性成分を正確に分析する方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】比較サンプルの高速液体クロマトグラフィー移動相のグラジェントの経時変化を示す。
【図2】試験例サンプルの高速液体クロマトグラフィー移動相のグラジェントの経時変化を示す。
【図3】高速液体クロマトグラフィーにおけるピーク評価が良好な例を示す。
【図4】高速液体クロマトグラフィーにおけるピーク評価が良好でない例を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本明細書において、数値範囲の規定について複数の上限値及び／又は複数の下限値を示す場合、特に明示されない場合であっても少なくとも上限規定の最大値と下限規定の最小値とを組み合わせた数値範囲の規定が直接的に記載されているものとし、さらに当該上限値のうち任意の上限値と当該下限値のうち任意の下限値とを組み合わせて得られる全ての数値範囲が本発明の一実施形態に含まれるものとする。また、本明細書において、「～」で結ばれた数値範囲は、「～」の前後の数値を下限値及び上限値として含む数値範囲を意味する。複数の下限値と複数の上限値が別個に示されている場合、任意の下限値と上限値を選択し、「～」で結ぶことができるものとする。
【0012】
本発明において、「ｗ／ｗ％」と記載される場合、「湿潤質量換算」の割合を表す。「湿潤質量換算」とは、試料の水分を含む湿潤質量を分母、試料中の対象成分の含有質量を分子として算出される、試料中の対象成分の含有比率を表す。また、本発明において、「ｗ／ｖ％」と記載される場合、試料の容量（１００ｍｌ）における、試料中の対象成分の含有質量（ｇ）を示す。
【0013】
本発明の一態様は、次の（ｉ）～（ｉＶ）段階を含む、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の分析方法である。
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
【0014】
＜段階（ｉ）＞
段階（ｉ）は、被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階である。
以下、段階（ｉ）を詳細に説明する。
段階（ｉ）は、被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階である。
以下、段階（ｉ）を詳細に説明する。
【0015】
＜組成物＞
組成物とは、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の成分が組み合わさってなる物が挙げられる。従って、例えば後述するサンプルＡ、サンプルＢ等も、組成物に該当する。
組成物とは、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の成分が組み合わさってなる物が挙げられる。従って、例えば後述するサンプルＡ、サンプルＢ等も、組成物に該当する。
【0016】
＜サンプルＡ＞
サンプルＡとは、脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有する組成物である。本発明のサンプルＡは人工的に調整してもよいし、自然界に存在する組成物であってもよい。
サンプルＡとは、脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有する組成物である。本発明のサンプルＡは人工的に調整してもよいし、自然界に存在する組成物であってもよい。
【0017】
＜脂溶性成分＞
脂溶性成分とは、疎水基を有しており、油脂に溶ける性質を有する成分を指す。脂溶性成分は、疎水基と親水基を共に有する両親媒性のものであってもよいが、水より油脂への溶解度が高いものであることが、本発明においては有用である。また、被測定対象脂溶性成分とは、文字通り、サンプルＡに含有される脂溶性成分であって、測定の対象とされる脂溶性成分である。本発明の脂溶性成分としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などに含まれる脂溶性成分が挙げられ、具体的には、脂肪アシル（Ｆａｔｔｙ ａｃｙｌｓ）、グリセロ脂質（Ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄｓ）、スフィンゴ脂質（Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ）、ステロール脂質（Ｓｔｅｒｏｌ ｌｉｐｉｄｓ）、プレノール脂質（Ｐｒｅｎｏｌ ｌｉｐｉｄｓ）、糖脂質（Ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド（Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ）、等が挙げられ、より具体的には脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）、中性脂肪（ｎｅｕｔｒａｌ ｆａｔ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）、ステロール類（ｓｔｅｒｏｌｓ）、スフィンゴシン、ジグリセリド、エステル交換油等が挙げられ、特に制限されない。本発明の脂溶性成分のさらに具体的な例としては、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、テルペン、脂溶性ビタミン、スフィンゴ脂質等が挙げられ、さらにより具体的には、カロテノイド、ステロイド、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、ＤＰＡ（ドコサペンタエン酸）、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、αーリノレン酸、リノール酸、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リモネン、α－テルピネン、β－テルピネン、γ－テルピネン、δ－テルピネン、ｐ－シメン、ムロロール、カダレン、テトラヒドロキシバクテリオホパン（Ｃ３５－ペンタサイクリックテルペンアルコール）、ホパン－２２－オール、ホプ－２２（２９）－エン、オルニチルタウリン脂質３－（パルミトイル）－ヒドロキシパルミトイル－オルニチル－タウリン、オルニチン脂質３－（パルミトイル）－ヒドロキシパルミトイル－オルニチン、リゾオルニチン脂質３－ヒドロキシパルミトイル－オルニチン、シス－バクセン酸、レシチン、セラミド等が挙げられる。なお、これらの成分は、例えばごま油、オリーブ油、アボガド油、アブラナ油、エゴマ油、ツバキ油、米油、ピーナッツ油、パーム油、ココナッツ油、トウモロコシ油、ナタネ油、卵黄油、大豆油、レモン精油、豚脂、鶏油、牛脂、魚油（肝油、ニシン油、イワシ油、サバ油、サケ油等）、バター、高オレイン酸菜種油、パームステアリン、パームオレイン、パーム核油、パーム分別油（ＰＭＦ）、綿実油、ひまわり油、高オレイン酸ひまわり油、サフラワー油、亜麻仁油、グレープシードオイル、アーモンドオイル、サラダ油、キャノーラ油、乳脂、ギー、カカオバター、アサイー油、アマランス油、リンゴの種子油、カラシ油、ナツメグバター、オクラ種子油、パパイヤ種子油、杏仁油、ペクイ油、紫蘇油、プルーン仁油、キノア油、ラムティル油、米ぬか油、アザミ油、トマト種子油、小麦胚芽油等の天然由来の油脂に含有されるものであってもよく、これらから精製されたものであってもよく、化学的に合成されたものであってもよい。
脂溶性成分とは、疎水基を有しており、油脂に溶ける性質を有する成分を指す。脂溶性成分は、疎水基と親水基を共に有する両親媒性のものであってもよいが、水より油脂への溶解度が高いものであることが、本発明においては有用である。また、被測定対象脂溶性成分とは、文字通り、サンプルＡに含有される脂溶性成分であって、測定の対象とされる脂溶性成分である。本発明の脂溶性成分としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などに含まれる脂溶性成分が挙げられ、具体的には、脂肪アシル（Ｆａｔｔｙ ａｃｙｌｓ）、グリセロ脂質（Ｇｌｙｃｅｒｏｌｉｐｉｄｓ）、スフィンゴ脂質（Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ）、ステロール脂質（Ｓｔｅｒｏｌ ｌｉｐｉｄｓ）、プレノール脂質（Ｐｒｅｎｏｌ ｌｉｐｉｄｓ）、糖脂質（Ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、ポリケチド（Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅｓ）、等が挙げられ、より具体的には脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）、中性脂肪（ｎｅｕｔｒａｌ ｆａｔ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、糖脂質（ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ）、ステロール類（ｓｔｅｒｏｌｓ）、スフィンゴシン、ジグリセリド、エステル交換油等が挙げられ、特に制限されない。本発明の脂溶性成分のさらに具体的な例としては、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、テルペン、脂溶性ビタミン、スフィンゴ脂質等が挙げられ、さらにより具体的には、カロテノイド、ステロイド、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸）、ＤＰＡ（ドコサペンタエン酸）、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）、αーリノレン酸、リノール酸、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リモネン、α－テルピネン、β－テルピネン、γ－テルピネン、δ－テルピネン、ｐ－シメン、ムロロール、カダレン、テトラヒドロキシバクテリオホパン（Ｃ３５－ペンタサイクリックテルペンアルコール）、ホパン－２２－オール、ホプ－２２（２９）－エン、オルニチルタウリン脂質３－（パルミトイル）－ヒドロキシパルミトイル－オルニチル－タウリン、オルニチン脂質３－（パルミトイル）－ヒドロキシパルミトイル－オルニチン、リゾオルニチン脂質３－ヒドロキシパルミトイル－オルニチン、シス－バクセン酸、レシチン、セラミド等が挙げられる。なお、これらの成分は、例えばごま油、オリーブ油、アボガド油、アブラナ油、エゴマ油、ツバキ油、米油、ピーナッツ油、パーム油、ココナッツ油、トウモロコシ油、ナタネ油、卵黄油、大豆油、レモン精油、豚脂、鶏油、牛脂、魚油（肝油、ニシン油、イワシ油、サバ油、サケ油等）、バター、高オレイン酸菜種油、パームステアリン、パームオレイン、パーム核油、パーム分別油（ＰＭＦ）、綿実油、ひまわり油、高オレイン酸ひまわり油、サフラワー油、亜麻仁油、グレープシードオイル、アーモンドオイル、サラダ油、キャノーラ油、乳脂、ギー、カカオバター、アサイー油、アマランス油、リンゴの種子油、カラシ油、ナツメグバター、オクラ種子油、パパイヤ種子油、杏仁油、ペクイ油、紫蘇油、プルーン仁油、キノア油、ラムティル油、米ぬか油、アザミ油、トマト種子油、小麦胚芽油等の天然由来の油脂に含有されるものであってもよく、これらから精製されたものであってもよく、化学的に合成されたものであってもよい。
【0018】
本発明は脂溶性成分の分析方法に係るものであるから、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の含有量は所定量であることが好ましい。本発明のサンプルＡにおける被測定対象脂溶性成分含有量は、好ましくは０．００００００１～２０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．００００００５～１５．０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．０００００１～６．０ｗ／ｖ％、さらにより好ましくは０．００００１～５．０ｗ／ｖ％、とりわけ好ましくは０．００００５～３．０ｗ／ｖ％、特に好ましくは０．０００１～０．５ｗ／ｖ％、０．０００２～０．００５ｗ／ｖ％、０．０００２～０．００２ｗ／ｖ％であってもよい。また、その上限は、特に限定されるものではないが、例えば１９．０ｗ／ｖ％以下、１８．０ｗ／ｖ％以下、１６．０ｗ／ｖ％以下、１５．０ｗ／ｖ％以下、１４．０ｗ／ｖ％以下、１３．０ｗ／ｖ％以下、１１．０ｗ／ｖ％以下、９．０ｗ／ｖ％以下、７．０ｗ／ｖ％以下、５．０ｗ／ｖ％以下、４．５ｗ／ｖ％以下、４．０ｗ／ｖ％以下、３．５ｗ／ｖ％以下、３．０ｗ／ｖ％以下、２．５ｗ／ｖ％以下、２．０ｗ／ｖ％以下、１．５ｗ／ｖ％以下、１．０ｗ／ｖ％以下、０．７ｗ／ｖ％以下、０．５ｗ／ｖ％以下、０．３ｗ／ｖ％以下であることができる。また、その下限値は、特に限定されるものではないが、例えば、０．００００００１ｗ／ｖ％以上、０．００００００５ｗ／ｖ％以上、０．０００００１ｗ／ｖ％以上、０．０００００５ｗ／ｖ％以上、０．００００１ｗ／ｖ％以上、０．００００５ｗ／ｖ％以上、０．０００１ｗ／ｖ％以上、０．０００２ｗ／ｖ％以上、０．０００３ｗ／ｖ％以上、０．０００４ｗ／ｖ％以上、０．０００４５ｗ／ｖ％以上、０．０００５ｗ／ｖ％以上であることができる。
【0019】
本発明は、従来技術では親水性溶媒と有機溶媒の分離に阻害的に働き、本発明の課題が大きくなる観点から、被測定対象脂溶性成分として、サンプルＡにスフィンゴ脂質を含有することが好ましく、より好ましくはセラミド、さらに好ましくはヒト型セラミド、さらにより好ましくは、酢酸菌セラミドを含有する。その原理は不明であるが、グルコシル基を有さない酢酸菌セラミド等のヒト型セラミドは、従来技術が特に適用しづらかったため、本発明が有用である。
【0020】
＜セラミド＞
セラミドは、長鎖塩基であるスフィンゴシンのアミノ基に脂肪酸がアミド結合したものの総称を指し、具体的には天然セラミド又は合成セラミドが挙げられる。天然セラミドはさらに、その構造の違いにより植物型セラミドとヒト型セラミド（グルコシル基を有さない）に分けられる。天然セラミドの具体例としては、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、Ｎ－アシルスフィンガニン等が挙げられる。また、合成セラミドの具体例としては、（Ｎ－ヘキサデシロキシヒドロキシプロピル)－Ｎ－ヒドロキシヘキサデカナミド、（Ｎ－ヘキサデシロキシヒドロキシプロピル）－Ｎ－ヒドロキシデカナミド等が挙げられる。酢酸菌セラミドとは、酢酸菌によって産生される天然セラミドであり、ヒト型セラミドの一種である。酢酸菌セラミドは、ヒト型セラミドのスフィンゴイド塩基部分のスフィンゴシンの前駆体であるスフィンガニンと脂肪酸がアミド結合した構造を有している。酢酸菌セラミドの例としては、例えばＮ－アシルスフィンガニン（より具体的には、Ｎ－２’－ヒドロキシパルミトイル－スフィンガニン、Ｎ－パルミトイル－スフィンガニン、Ｏ－１－グルクロニル－Ｎ－２’－ヒドロキシパルミトイル－スフィンガニン、Ｎ－シス－バクセノイル－スフィンガニン、Ｏ－１－グルクロニル－Ｎ－パルミトイル－スフィンガニン等）等が挙げられる。
セラミドは、長鎖塩基であるスフィンゴシンのアミノ基に脂肪酸がアミド結合したものの総称を指し、具体的には天然セラミド又は合成セラミドが挙げられる。天然セラミドはさらに、その構造の違いにより植物型セラミドとヒト型セラミド（グルコシル基を有さない）に分けられる。天然セラミドの具体例としては、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、Ｎ－アシルスフィンガニン等が挙げられる。また、合成セラミドの具体例としては、（Ｎ－ヘキサデシロキシヒドロキシプロピル)－Ｎ－ヒドロキシヘキサデカナミド、（Ｎ－ヘキサデシロキシヒドロキシプロピル）－Ｎ－ヒドロキシデカナミド等が挙げられる。酢酸菌セラミドとは、酢酸菌によって産生される天然セラミドであり、ヒト型セラミドの一種である。酢酸菌セラミドは、ヒト型セラミドのスフィンゴイド塩基部分のスフィンゴシンの前駆体であるスフィンガニンと脂肪酸がアミド結合した構造を有している。酢酸菌セラミドの例としては、例えばＮ－アシルスフィンガニン（より具体的には、Ｎ－２’－ヒドロキシパルミトイル－スフィンガニン、Ｎ－パルミトイル－スフィンガニン、Ｏ－１－グルクロニル－Ｎ－２’－ヒドロキシパルミトイル－スフィンガニン、Ｎ－シス－バクセノイル－スフィンガニン、Ｏ－１－グルクロニル－Ｎ－パルミトイル－スフィンガニン等）等が挙げられる。
【0021】
本発明のサンプルＡが被測定対象脂溶性成分としてスフィンゴ脂質を含有し、より好ましくはセラミド、さらに好ましくは、酢酸菌セラミドを含有する態様である場合、サンプルＡの被測定対象脂溶性成分のうち、好ましくは４０ｗ／ｗ％以上、より好ましくは５０ｗ／ｗ％以上、さらに好ましくは６０ｗ／ｗ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは９０ｗ／ｗ％以上、９５ｗ／ｗ％以上、または全量がスフィンゴ脂質、より好ましくはセラミド、さらに好ましくは、酢酸菌セラミドであってもよい。また、本発明のサンプルＡが被測定対象脂溶性成分としてスフィンゴ脂質を含有し、より好ましくはセラミド、さらに好ましくは、酢酸菌セラミドを含有する態様である場合、その含有量は、上記被測定対象脂溶性成分の含有量の範囲及び上下限に関する規定を充足することが好ましい。
【0022】
＜被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織＞
本発明のサンプルＡは、被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有することが好ましい。この態様においては、従来技術では、前記細胞又は組織が、有機溶媒と親水性溶媒との分離に際して、乳化剤のように作用してしまい、有機溶媒と親水性溶媒との分離が十分に行えなかったため、本発明が有用である。
本発明のサンプルＡは、被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有することが好ましい。この態様においては、従来技術では、前記細胞又は組織が、有機溶媒と親水性溶媒との分離に際して、乳化剤のように作用してしまい、有機溶媒と親水性溶媒との分離が十分に行えなかったため、本発明が有用である。
【0023】
「細胞」とは、通常用いられている意味のものとして特に限定されず、その由来は動物細胞、植物細胞、細菌、真核生物、古細菌のいずれであってもよく、生死も限定されない。これらの例としては、例えば、動物細胞、植物細胞、大腸菌、酢酸菌、酵母、納豆菌、乳酸菌等が挙げられる。また、「組織」とは、前記細胞の集合体、前記細胞の一部、またはその混合物を指す。
【0024】
本発明のサンプルＡにおける被測定対象脂溶性成分は、従来技術が適用しづらく、課題の重要性が大きい観点から、前記細胞又は組織中に所定量含有されることが、特に好ましい。その原理は不明であるが、この態様においては、従来技術では、前記細胞又は組織が、有機溶媒と親水性溶媒との分離に際して、乳化剤のように作用する上、細胞または組織内に被測定対象脂溶性成分が残存してしまうところ、本発明では、親水性溶媒と有機溶媒の密度比を調整することで、重力や浸透圧等によって親水性溶媒と有機溶媒とを分離しやすくし、被測定対象脂溶性成分の有機溶媒への抽出を促進している可能性がある。つまり、本発明の好ましい態様として、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有する態様、より好ましくは、サンプルＡが被測定脂溶性成分を含む細菌、真菌類、古細菌の細胞又は組織を含有する態様、さらに好ましくは、サンプルＡが酢酸菌体を含有する態様、特に好ましくは、サンプルＡが酢酸菌セラミドを含む酢酸菌体を含有する態様が挙げられる。また、サンプルＡに含有される被測定対象脂溶性成分のうち、好ましくは４０ｗ／ｗ％以上、より好ましくは５０ｗ／ｗ％以上、さらに好ましくは６０ｗ／ｗ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは８５ｗ／ｗ％以上、８８ｗ／ｗ％以上、９０ｗ／ｗ％以上、９１ｗ／ｗ％以上、９２ｗ／ｗ％以上、９３ｗ／ｗ％以上、９４ｗ／ｗ％以上、９５ｗ／ｗ％以上、９６ｗ／ｗ％以上、９８ｗ／ｗ％以上、９９ｗ／ｗ％以上、または全量が前記した細胞又は組織に由来してもよい。また、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有する態様、より好ましくは、サンプルＡが被測定脂溶性成分を含む細菌、真菌類、古細菌の細胞又は組織を含有する態様、さらに好ましくは、サンプルＡが酢酸菌体を含有する態様、特に好ましくは、サンプルＡが酢酸菌セラミドを含む酢酸菌体を含有する態様である場合、サンプルＡにおける被測定対象脂溶性成分の含有量は、前記被測定対象脂溶性成分含有量の範囲および上下限に関する規定を充足してもよい。
【0025】
本発明のサンプルＡにおける、被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織の含有量は、従来技術が適用しづらく、本発明の解決すべき課題が大きくなる観点から、その含有量は所定量であることが好ましい。当該含有量は、サンプルＡの容量に対する質量（乾燥質量）として、例えば１０～３００ｍｇ／１００ｍｌ、好ましくは１５～２８０ｍｇ／１００ｍｌ、より好ましくは２０～２６０ｍｇ／１００ｍｌ、さらに好ましくは２２～２４０ｍｇ／１００ｍｌ、さらにより好ましくは２５～２２０ｍｇ／１００ｍｌ、とりわけ好ましくは２８～２１０ｍｇ／１００ｍｌ、特に好ましくは３０～２００ｍｇ／１００ｍｌであっても良い。また、上限値は特に制限されるものではないが、例えば２９０ｍｇ／１００ｍｌ以下、２７０ｍｇ／１００ｍｌ以下、２５０ｍｇ／１００ｍｌ以下、２３０ｍｇ／１００ｍｌ以下、２１０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１９０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１７０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１５０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１３０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１１０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１００ｍｇ／１００ｍｌ以下、９０ｍｇ／１００ｍｌ以下、８０ｍｇ／１００ｍｌ以下、７０ｍｇ／１００ｍｌ以下であっても良い。また、下限値は特に制限されるものではないが、例えば０．１ｍｇ／１００ｍｌ以上、１．０ｍｇ／１００ｍｌ以上、３．０ｍｇ／１００ｍｌ以上、４．０ｍｇ／１００ｍｌ以上、５．０ｍｇ／１００ｍｌ以上、１０ｍｇ／１００ｍｌ以上、１５ｍｇ／１００ｍｌ以上、１８ｍｇ／１００ｍｌ以上、２１ｍｇ／１００ｍｌ以上、２５ｍｇ／１００ｍｌ以上、３２ｍｇ／１００ｍｌ以上、４０ｍｇ／１００ｍｌ以上、５０ｍｇ／１００ｍｌ以上であっても良い。なお、サンプルＡ中の細胞又は組織の含有量（乾燥質量）は、例えば、被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含まない組成物に被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を添加することでサンプルＡを調製する態様においては、そのサンプルＡを遠心分離（３０００Ｇで１０分間）して得られた沈殿における乾燥重量から、灰分を除いた質量として換算することができる。
【0026】
本発明のサンプルＡは、従来技術が適用しづらく、課題の重要性が大きい観点から、特に好ましくは酢酸菌体（酢酸菌体とは、酢酸菌細胞、酢酸菌細胞の集合体、酢酸菌細胞の一部、またはその混合物を指し、前記した細胞または組織の一態様である）を含有する。その原理は不明であるが、酢酸菌は高い耐酸性、耐アルコール性等を有するといった性質があるので、その膜構造に、脂溶性成分と親水性溶媒との分離を阻害する何らかの特徴がある可能性があり、親水性溶媒と有機溶媒との密度比を調整することでこれを解消できる可能性がある。本発明のサンプルＡが酢酸菌体を含有する場合、サンプルＡに含有される細胞または組織のうち、好ましくは４０ｗ／ｗ％以上、より好ましくは５０ｗ／ｗ％以上、さらに好ましくは６０ｗ／ｗ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは９０ｗ／ｗ％以上、９５ｗ／ｗ％以上、または全量が酢酸菌体であってもよい。また、その含有量は、上記細胞または組織の含有量の範囲及び上下限に関する規定を充足してもよい。
【0027】
ここで、本発明において「乾燥質量」とは、特に断りがない限り、「水分含量」から算出される水分含有量を組成物全体の質量から除いた残分の質量を表す。 水分含量は、日本食品標準成分表２０１５年版（七訂）に準じ、減圧加熱乾燥法で９０℃に加温することで乾燥基準含水率として測定することができる。具体的には、あらかじめ恒量になったはかり容器（Ｗ０）に適量の試料を採取して秤量し（Ｗ１）、常圧において、所定の温度（より詳しくは９０℃）に調節した減圧電気定温乾燥器中に、はかり容器の蓋をとるか、口を開けた状態で入れ、扉を閉じ、真空ポンプを作動させて、所定の減圧度において一定時間乾燥し、真空ポンプを止め、乾燥空気を送って常圧に戻し、はかり容器を取り出し、蓋をしてデシケーター中で放冷、秤量する（Ｗ２）ことを繰り返し、次の計算式で水分含量（質量％）を求める。
【0028】
［数１］
水分（質量％）＝（Ｗ１－Ｗ２）／（Ｗ２－Ｗ０）×１００
水分（質量％）＝（Ｗ１－Ｗ２）／（Ｗ２－Ｗ０）×１００
【0029】
また、「灰分」とは組成物中に含まれる不揮発性の無機物を指し、日本食品標準成分表２０１５年版（七訂）分析マニュアルにおける無機質の分析方法に採用される乾式灰化法によって、試料中の含有量を分析できる。
【0030】
＜酢酸菌＞
本発明のサンプルＡに含まれる酢酸菌は、酢酸菌科（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）に属する細菌であって、酢酸を生産可能な細菌である限り、特に制限されない。酢酸菌としては、例えばアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、コマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、アサイア属（Ａｓａｉａ）に属する細菌、アシドモナス属（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）に属する細菌、アシディフィラム属に属する細菌（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ）、アシディスファエラ属に属する細菌（Ａｃｉｄｉｓｐｈａｅｒａ）、アシドセラ属に属する細菌（Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ）、アシドモナス属に属する細菌（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）、アサイア属に属する細菌（Ａｓａｉａ）、ベルナピア属に属する細菌（Ｂｅｌｎａｐｉａ）、クラウロコッカス属に属する細菌（Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コザキア属に属する細菌（Ｋｏｚａｋｉａ）、リーヒバクター属に属する細菌（Ｌｅａｈｉｂａｃｔｅｒ）、ムリコッカス属に属する細菌（Ｍｕｒｉｃｏｃｃｕｓ）、ネオアサイア属に属する細菌（Ｎｅｏａｓａｉａ）、オレオモナス属に属する細菌（Ｏｌｅｏｍｏｎａｓ）、パラクラウロコッカス属に属する細菌（Ｐａｒａｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロドピラ属に属する細菌（Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ）、ロゼオコッカス属に属する細菌（Ｒｏｓｅｏｃｏｃｃｕｓ）、ルブリテピダ属に属する細菌（Ｒｕｂｒｉｔｅｐｉｄａ）、サッカリバクター属に属する細菌（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ）、ステラ属に属する細菌（Ｓｔｅｌｌａ）、スワミナサニア属に属する細菌（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ）、テイココッカス属に属する細菌（Ｔｅｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ザヴァルジニア属に属する細菌（Ｚａｖａｒｚｉｎｉａ）等が挙げられる。
本発明のサンプルＡに含まれる酢酸菌は、酢酸菌科（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）に属する細菌であって、酢酸を生産可能な細菌である限り、特に制限されない。酢酸菌としては、例えばアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、コマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、アサイア属（Ａｓａｉａ）に属する細菌、アシドモナス属（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）に属する細菌、アシディフィラム属に属する細菌（Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ）、アシディスファエラ属に属する細菌（Ａｃｉｄｉｓｐｈａｅｒａ）、アシドセラ属に属する細菌（Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ）、アシドモナス属に属する細菌（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）、アサイア属に属する細菌（Ａｓａｉａ）、ベルナピア属に属する細菌（Ｂｅｌｎａｐｉａ）、クラウロコッカス属に属する細菌（Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、コザキア属に属する細菌（Ｋｏｚａｋｉａ）、リーヒバクター属に属する細菌（Ｌｅａｈｉｂａｃｔｅｒ）、ムリコッカス属に属する細菌（Ｍｕｒｉｃｏｃｃｕｓ）、ネオアサイア属に属する細菌（Ｎｅｏａｓａｉａ）、オレオモナス属に属する細菌（Ｏｌｅｏｍｏｎａｓ）、パラクラウロコッカス属に属する細菌（Ｐａｒａｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロドピラ属に属する細菌（Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ）、ロゼオコッカス属に属する細菌（Ｒｏｓｅｏｃｏｃｃｕｓ）、ルブリテピダ属に属する細菌（Ｒｕｂｒｉｔｅｐｉｄａ）、サッカリバクター属に属する細菌（Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ）、ステラ属に属する細菌（Ｓｔｅｌｌａ）、スワミナサニア属に属する細菌（Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ）、テイココッカス属に属する細菌（Ｔｅｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ザヴァルジニア属に属する細菌（Ｚａｖａｒｚｉｎｉａ）等が挙げられる。
【0031】
アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の酢酸菌としては、アセトバクター・ポリオキソゲネス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｏｘｏｇｅｎｅｓ）、アセトバクター・トロピカリス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、アセトバクター・インドネシエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｄｏｎｅｓｉｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・シジギイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｙｚｙｇｉｉ）、アセトバクター・シビノンゲンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｂｉｎｏｎｇｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・オリエンタリス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、アセトバクター・パスツリアヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、アセトバクター・オルレアネンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｏｒｌｅａｎｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・ロバニエンシス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ）、アセトバクター・アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ）、アセトバクター・ポモラム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｏｒｕｍ）、アセトバクター・マローラム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｌｏｒｕｍ）などが例示される。
【0032】
グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）の酢酸菌としては、グルコノバクター・フラトウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）、グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）などが例示される。
【0033】
グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の酢酸菌としては、グルコンアセトバクター・スウィングシ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｗｉｎｇｓｉｉ）、グルコンアセトバクター・キシリヌス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、グルコンアセトバクター・インタメデイウス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、グルコンアセトバクター・サッカリ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｉ）、グルコンアセトバクター・マルタセティ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｌｔａｃｅｔｉ）、グルコンアセトバクター・コンブチャ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｍｂｕｃｈａｅ）、及びグルコンアセトバクター・リックウェフェシエンス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）などが例示される。
【0034】
コマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）の酢酸菌としては、コマガタエイバクター・ハンゼニイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、コマガタエイバクター・ザイリナス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ）、コマガタエイバクター・ユーロペウスヨーロッパエウス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）、コマガタエイバクター・オボエディエンス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｏｂｏｅｄｉｅｎｓ）などが例示される。
【0035】
アサイア属（Ａｓａｉａ）の酢酸菌としては、アサイア・ボゴレンシス（Ａｓａｉａ ｂｏｇｏｒｅｎｓｉｓ）、アサイア・シアメンシス（Ａｓａｉａ ｓｉａｍｅｎｓｉｓ）などが例示される。
【0036】
アシドモナス属（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）の酢酸菌としては、アシドモナス・メタノリカス（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）などが例示される。
【0037】
酢酸菌としては、好ましくは、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、アサイア属（Ａｓａｉａ）に属する細菌、アシドモナス属（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）に属する細菌等が挙げられる。菌体臭、風味及び／又は食感調整作用等の観点から、酢酸菌として、より好ましくはアセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）に属する細菌、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、コマガタエイバクター属（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ）に属する細菌等が挙げられ、さらに好ましくは、アセトバクター・マローラム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｌｏｒｕｍ）、コマガタエイバクター・キシリヌス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ ＮＢＲＣ １５２３７ ）、コマガタエイバクター・ユーロペウス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｉｂａｃｔｅｒ ｅｕｒｏｐａｅｕｓ ＮＢＲＣ ３２６１）が挙げられ、特に好ましくはアセトバクター・マローラム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｌｏｒｕｍ）挙げられる。
【0038】
アセトバクター・マローラム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｌｏｒｕｍ）として、好適には、アセトバクター・マローラムＮＣＩ１６８３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｌｏｒｕｍ ＮＣＩ１６８３）株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０５９５）が挙げられる。アセトバクター・マローラムＮＣＩ１６８３（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｌｏｒｕｍ ＮＣＩ１６８３）株（ＦＥＲＭ ＢＰ－１０５９５）は、ロシアの発酵食品であるスメタナから分離された酢酸菌であり、ユビキノンタイプはＱ９であって、１６ＳｒＲＮＡの配列が完全に一致することなどから、アセトバクター・マローラム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｌｏｒｕｍ）（例えば、「インターナショナル ジャーナル・オブ・システマチック・アンド・エボリューショナリー・マイクロバイオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、５２巻、ｐ．１５５１－１５５８、２００２年参照）と同定された株であり、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００６年４月７日付けで受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０５９５として寄託された。
【0039】
＜酢酸菌生成物＞
酢酸菌生成物とは、酢酸菌によって生成される成分全般を指す。本発明の酢酸菌生成物としては、例えば、酢酸、セルロース、多糖類、酢酸菌型セラミド、イソアミルアルコール、イソブタノール、ブタノール、プロパノール、ｎ－アミルアルコール、イソ吉草酸、イソ酪酸、酪酸、プロピオン酸、吉草酸等が挙げられる。
酢酸菌生成物とは、酢酸菌によって生成される成分全般を指す。本発明の酢酸菌生成物としては、例えば、酢酸、セルロース、多糖類、酢酸菌型セラミド、イソアミルアルコール、イソブタノール、ブタノール、プロパノール、ｎ－アミルアルコール、イソ吉草酸、イソ酪酸、酪酸、プロピオン酸、吉草酸等が挙げられる。
【0040】
＜親水性溶媒＞
「親水性溶媒」とは、サンプルＡの液部を構成する溶媒であり、実質的水溶液であるのが好ましい。水以外に含まれる成分としては、水溶性タンパク質、水溶性アミノ酸、水溶性食物繊維（ペクチン、グルコマンナン等）、可溶性糖類、水溶性ビタミン、水溶性アルコール、ポリフェノール、ミネラル、ミネラル塩、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
「親水性溶媒」とは、サンプルＡの液部を構成する溶媒であり、実質的水溶液であるのが好ましい。水以外に含まれる成分としては、水溶性タンパク質、水溶性アミノ酸、水溶性食物繊維（ペクチン、グルコマンナン等）、可溶性糖類、水溶性ビタミン、水溶性アルコール、ポリフェノール、ミネラル、ミネラル塩、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【0041】
なお、親水性溶媒中の水分含有量は、通常５０ｗ／ｗ％以上、好ましくは５５ｗ／ｗ％以上、より好ましくは６０ｗ／ｗ％以上、さらに好ましくは６５ｗ／ｗ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは９０ｗ／ｗ％以上であっても良い。また、その上限値は、特に限定されるものではないが、例えば９９．９９ｗ／ｗ％以下、９９．９ｗ／ｗ％以下、９９．０ｗ／ｗ％以下、９８．０ｗ／ｗ％以下、９７．０ｗ／ｗ％以下、９６．０ｗ／ｗ％以下、９５．０ｗ／ｗ％以下、９４．０ｗ／ｗ％以下、９３．０ｗ／ｗ％以下、９２．０ｗ／ｗ％以下、９１．０ｗ／ｗ％以下、９０ｗ／ｗ％以下であっても良い。また、その下限値は、例えば、５１ｗ／ｗ％以上、５４ｗ／ｗ％以上、５９ｗ／ｗ％以上、６５ｗ／ｗ％以上、７０ｗ／ｗ％以上、７３ｗ／ｗ％以上、７５ｗ／ｗ％以上、７８ｗ／ｗ％以上、８０ｗ／ｗ％以上、８３ｗ／ｗ％以上、８５ｗ／ｗ％以上、８８ｗ／ｗ％以上であっても良い。
【0042】
サンプルＡにおける親水性溶媒含有量は、本発明の課題の重要性が大きくなる観点から所定値以上であることが好ましい。サンプルＡにおける親水性溶媒含有量は、通常５０ｗ／ｖ％以上、好ましくは５５ｗ／ｖ％以上、より好ましくは６０ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは６５ｗ／ｖ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｖ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｖ％以上、特に好ましくは９０ｗ／ｖ％以上であっても良い。また、その上限値は、特に限定されるものではないが、例えば９９．９９ｗ／ｖ％以下、９９．９ｗ／ｖ％以下、９９．０ｗ／ｖ％以下、９８．０ｗ／ｖ％以下、９７．０ｗ／ｖ％以下、９６．０ｗ／ｖ％以下、９５．０ｗ／ｖ％以下、９４．０ｗ／ｖ％以下、９３．０ｗ／ｖ％以下、９２．０ｗ／ｖ％以下、９１．０ｗ／ｖ％以下、９０ｗ／ｖ％以下であっても良い。また、その下限値は、例えば、５１ｗ／ｖ％以上、５４ｗ／ｖ％以上、５９ｗ／ｖ％以上、６５ｗ／ｖ％以上、７０ｗ／ｖ％以上、７３ｗ／ｖ％以上、７５ｗ／ｖ％以上、７８ｗ／ｖ％以上、８０ｗ／ｖ％以上、８３ｗ／ｖ％以上、８５ｗ／ｖ％以上、８８ｗ／ｖ％以上であっても良い。また、本発明のサンプルＡにおける親水性溶媒の含有量は、好ましくは５０～９９．９９９ｗ／ｖ％、より好ましくは６０～９９．９９９ｗ／ｖ％、さらに好ましくは７０～９９．９９９ｗ／ｖ％、特に好ましくは８０～９９．９９９ｗ／ｖ％、８３～９９．９９９ｗ／ｖ％、８５～９９．９９９ｗ／ｖ％、８８～９９．９９９ｗ／ｖ％、９０～９９．９９９ｗ／ｖ％であっても良い。上記の範囲に親水性溶媒の含有量を調整することで、被測定対象脂溶性成分以外の成分を、後述する下層サンプルＣ２に、効率的に分離でき、結果的に被測定対象脂溶性成分の分析精度が向上する。
【0043】
＜可溶性糖類＞
本発明のサンプルＡは、親水性溶媒に「可溶性糖類」を含有することが好ましい。本発明のサンプルＡが可溶性糖類を含有することで、後述する親水性溶媒の密度を所定範囲とするのが容易になる。また、特に本発明のサンプルＡが前記細胞又は組織を含有する態様である場合、従来技術では、可溶性糖類と前記細胞又は組織の存在が、有機溶媒相と水相との分離に阻害的に働く。その原理は不明であるが、一般的に可溶性糖類は保水性が高いところ、前記細胞又は組織に可溶性糖類の分子が吸着することで、水相と有機溶媒相との分離を阻害しているものと推察される。本発明は、親水性溶媒と、有機溶媒を含有する媒体ａの密度を調整することで、これらの課題を解決できるものであるから、特にサンプルＡが前記細胞又は組織を含有し、かつ可溶性糖類を含有する場合、従来技術の課題を解決しつつ、発明の効果を高めることができる。よって、本発明の好ましい態様の一例として、例えば、サンプルＡが、被測定対象脂溶性成分を含有する細胞又は組織を含有し、かつ可溶性糖類を含有する態様、サンプルＡが被測定脂溶性成分を含む細菌、真菌類、古細菌の細胞又は組織を含有し、かつ可溶性糖類を含有する態様、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含有する酢酸菌体を含有し、かつ可溶性糖類を含有する態様、さらにサンプルＡが被測定対象脂溶性成分としてセラミドを含有する酢酸菌体を含有し、かつ可溶性糖類を含有する態様が挙げられる。
本発明のサンプルＡは、親水性溶媒に「可溶性糖類」を含有することが好ましい。本発明のサンプルＡが可溶性糖類を含有することで、後述する親水性溶媒の密度を所定範囲とするのが容易になる。また、特に本発明のサンプルＡが前記細胞又は組織を含有する態様である場合、従来技術では、可溶性糖類と前記細胞又は組織の存在が、有機溶媒相と水相との分離に阻害的に働く。その原理は不明であるが、一般的に可溶性糖類は保水性が高いところ、前記細胞又は組織に可溶性糖類の分子が吸着することで、水相と有機溶媒相との分離を阻害しているものと推察される。本発明は、親水性溶媒と、有機溶媒を含有する媒体ａの密度を調整することで、これらの課題を解決できるものであるから、特にサンプルＡが前記細胞又は組織を含有し、かつ可溶性糖類を含有する場合、従来技術の課題を解決しつつ、発明の効果を高めることができる。よって、本発明の好ましい態様の一例として、例えば、サンプルＡが、被測定対象脂溶性成分を含有する細胞又は組織を含有し、かつ可溶性糖類を含有する態様、サンプルＡが被測定脂溶性成分を含む細菌、真菌類、古細菌の細胞又は組織を含有し、かつ可溶性糖類を含有する態様、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含有する酢酸菌体を含有し、かつ可溶性糖類を含有する態様、さらにサンプルＡが被測定対象脂溶性成分としてセラミドを含有する酢酸菌体を含有し、かつ可溶性糖類を含有する態様が挙げられる。
【0044】
本発明において「可溶性糖類」とは、水に可溶な糖類をいい、単糖類及び少糖類（単糖が２～１０個結合した糖類）の総称をいう。従って、それよりもはるかに多くの糖が結合したでんぷんは含まれない。
【0045】
本発明のサンプルＡにおける可溶性糖類含量は、前記従来技術が適用しづらく、解決すべき課題の重要性が大きくなり、かつ本発明の効果が大きくなる観点から、所定の含有量であることが好ましい。当該含有量は、親水性溶媒中の濃度として、例えば０．０１～２５ｗ／ｖ％の範囲とすることができ、好ましくは０．０２～２４ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０５～２３ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．０８～２２ｗ／ｖ％、さらにより好ましくは０．１～２１．５ｗ／ｖ％、とりわけ好ましくは０．１５～２０．５ｗ／ｖ％、特に好ましくは０．２０～１６．０ｗ／ｖ％であっても良い。また、その上限は、好ましくは２５ｗ／ｖ％以下であるが、２０ｗ／ｖ％以下、１８ｗ／ｖ％以下、１７ｗ／ｖ％以下、又は１５ｗ／ｖ％以下、又は１４ｗ／ｖ％以下、又は１３ｗ／ｖ％以下、又は１２ｗ／ｖ％以下、又は１１ｗ／ｖ％以下、又は１０ｗ／ｖ％以下、又は９ｗ／ｖ％以下、又は８ｗ／ｖ％以下、又は７ｗ／ｖ％以下、又は６ｗ／ｖ％以下とすることができる。一方、その下限は限定されないが、０．０１ｗ／ｖ％以上、０．０５ｗ／ｖ％以上、０．１ｗ／ｖ％以上、０．２ｗ／ｖ％以上、０．３ｗ／ｖ％以上、０．５ｗ／ｖ％以上、０．８ｗ／ｖ％以上、１．０ｗ／ｖ％以上、１．５ｗ／ｖ％以上、２．０ｗ／ｖ％以上であっても良い。
【0046】
本発明のサンプルＡ中の可溶性糖類含量は、日本食品標準成分表２０１５年版（七訂）における「利用可能炭水化物（ぶどう糖、果糖、ガラクトース、ショ糖、麦芽糖、乳糖及びトレハロース）」の測定方法に準じて高速液体クロマトグラフィー法を用いて測定し、各測定値を濃度既知の単糖類又は少糖類（２～１０糖）標準品との含量と比較して得られた数値を合計することで求める。
【0047】
前記の通り、本発明のサンプルＡは脂溶性成分を含有する細胞又は組織を含有し、かつ可溶性糖類を含有することが好ましいが、この態様においては、前記と同様の理由により、従来技術が適用しづらく、解決すべき課題の重要性が大きくなり、かつ本発明の効果が大きくなる観点から、その含有量比が所定範囲内であることが好ましい。具体的には、サンプルＡ中の細胞又は組織の含有量（ｍｇ／１００ｍｌ）の値を、サンプルＡの親水性溶媒１００ｍｌに対する可溶性糖類の含有量（ｇ）の値で除した値（これを、値Ｄという）が所定範囲内であることがより好ましい。本発明のサンプルＡにおける値Ｄの範囲は、好ましくは１～１０００、より好ましくは２～７００、さらに好ましくは３～５００、さらにより好ましくは４～４００、とりわけ好ましくは６～３００、特に好ましくは８～２５０である。すなわち、本発明の好ましい態様の一例として、例えば、サンプルＡが、脂溶性成分を含有する細胞又は組織を含有し、かつ可溶性糖類を含有し、かつ値Ｄが上記範囲を充足する態様、さらに、サンプルＡが被測定脂溶性成分を含む細菌、真菌類、古細菌の細胞又は組織を含有し、かつ可溶性糖類を含有し、かつ値Ｄが上記範囲を充足する態様、サンプルＡが酢酸菌体を含有し、かつ可溶性糖類を含有し、かつ値Ｄが上記範囲を充足する態様、さらにはサンプルＡがセラミドを含有する酢酸菌体を含有し、かつ可溶性糖類を含有し、かつ値Ｄが上記範囲を充足する態様が挙げられる。
【0048】
＜親水性溶媒の密度＞
本発明は、サンプルＡ中の親水性溶媒と、後述する媒体ａの密度を所定範囲にする段階を含むことから、親水性溶媒の密度を所定範囲とすることが好ましい。その原理は不明であるが、親水性溶媒の密度が所定範囲にあることが、有機溶媒と親水性溶媒との相分離を容易にし、かつ、被測定対象脂溶性成分の、サンプルＡから有機溶媒への移行を容易にしていると考えられる。当該密度は、例えば、２０℃において、好ましくは１．００３～１．２５０ｇ／ｍｌ、より好ましくは１．００３５～１．２３０ｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１．００４～１．２００ｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１．００５～１．１８０ｇ／ｍｌ、とりわけ好ましくは１．００５～１．１５５ｇ／ｍｌ、特に好ましくは１．００５～１．１４５ｇ／ｍｌであっても良い。また、上限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において１．２３０ｇ／ｍｌ以下、１．２００ｇ／ｍｌ以下、１．１９０ｇ／ｍｌ以下、１．１６０ｇ／ｍｌ以下、１．１５０ｇ／ｍｌ以下、１．１４０ｇ／ｍｌ以下、１．１３０ｇ／ｍｌ以下、１，１１０ｇ／ｍｌ以下、１．１００ｇ／ｍｌ以下、１．０９０ｇ／ｍｌ以下、１．０７０ｇ／ｍｌ以下、１．０６０ｇ／ｍｌ以下、１．０４０ｇ／ｍｌ以下、１．０３０ｇ／ｍｌ以下、１．０１０ｇ／ｍｌ以下であっても良い。また、下限値は特に限定されないが、例えば１．００１ｇ／ｍｌ以上、１．００１５ｇ／ｍｌ以上、１．００２ｇ／ｍｌ以上、１．００２５ｇ／ｍｌ以上、１．００３ｇ／ｍｌ以上、１．００３５ｇ／ｍｌ以上、１．００４ｇ／ｍｌ以上、１．００４５ｇ／ｍｌ以上、１．００５ｇ／ｍｌ以上、１．００５５ｇ／ｍｌ以上、１．００６ｇ／ｍｌ以上、１．００６５ｇ／ｍｌ以上、１．００７ｇ／ｍｌ以上、１．００７５ｇ／ｍｌ以上、１．００８ｇ／ｍｌ以上、１．００８５ｇ／ｍｌ以上、１．００９ｇ／ｍｌ以上、１．００９５ｇ／ｍｌ以上、１．０１０ｇ／ｍｌ以上、１．０１５０ｇ／ｍｌ以上、１．０２０ｇ／ｍｌ以上、１．０２５ｇ／ｍｌ以上、１．０３０ｇ／ｍｌ以上、１．０３５ｇ／ｍｌ以上、１．０４０ｇ／ｍｌ以上、１．０４５ｇ／ｍｌ以上、１．０５０ｇ／ｍｌ以上、１．０５５ｇ／ｍｌ以上、１．０６０ｇ／ｍｌ以上、１．０７０ｇ／ｍｌ以上であっても良い。
本発明は、サンプルＡ中の親水性溶媒と、後述する媒体ａの密度を所定範囲にする段階を含むことから、親水性溶媒の密度を所定範囲とすることが好ましい。その原理は不明であるが、親水性溶媒の密度が所定範囲にあることが、有機溶媒と親水性溶媒との相分離を容易にし、かつ、被測定対象脂溶性成分の、サンプルＡから有機溶媒への移行を容易にしていると考えられる。当該密度は、例えば、２０℃において、好ましくは１．００３～１．２５０ｇ／ｍｌ、より好ましくは１．００３５～１．２３０ｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１．００４～１．２００ｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１．００５～１．１８０ｇ／ｍｌ、とりわけ好ましくは１．００５～１．１５５ｇ／ｍｌ、特に好ましくは１．００５～１．１４５ｇ／ｍｌであっても良い。また、上限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において１．２３０ｇ／ｍｌ以下、１．２００ｇ／ｍｌ以下、１．１９０ｇ／ｍｌ以下、１．１６０ｇ／ｍｌ以下、１．１５０ｇ／ｍｌ以下、１．１４０ｇ／ｍｌ以下、１．１３０ｇ／ｍｌ以下、１，１１０ｇ／ｍｌ以下、１．１００ｇ／ｍｌ以下、１．０９０ｇ／ｍｌ以下、１．０７０ｇ／ｍｌ以下、１．０６０ｇ／ｍｌ以下、１．０４０ｇ／ｍｌ以下、１．０３０ｇ／ｍｌ以下、１．０１０ｇ／ｍｌ以下であっても良い。また、下限値は特に限定されないが、例えば１．００１ｇ／ｍｌ以上、１．００１５ｇ／ｍｌ以上、１．００２ｇ／ｍｌ以上、１．００２５ｇ／ｍｌ以上、１．００３ｇ／ｍｌ以上、１．００３５ｇ／ｍｌ以上、１．００４ｇ／ｍｌ以上、１．００４５ｇ／ｍｌ以上、１．００５ｇ／ｍｌ以上、１．００５５ｇ／ｍｌ以上、１．００６ｇ／ｍｌ以上、１．００６５ｇ／ｍｌ以上、１．００７ｇ／ｍｌ以上、１．００７５ｇ／ｍｌ以上、１．００８ｇ／ｍｌ以上、１．００８５ｇ／ｍｌ以上、１．００９ｇ／ｍｌ以上、１．００９５ｇ／ｍｌ以上、１．０１０ｇ／ｍｌ以上、１．０１５０ｇ／ｍｌ以上、１．０２０ｇ／ｍｌ以上、１．０２５ｇ／ｍｌ以上、１．０３０ｇ／ｍｌ以上、１．０３５ｇ／ｍｌ以上、１．０４０ｇ／ｍｌ以上、１．０４５ｇ／ｍｌ以上、１．０５０ｇ／ｍｌ以上、１．０５５ｇ／ｍｌ以上、１．０６０ｇ／ｍｌ以上、１．０７０ｇ／ｍｌ以上であっても良い。
【0049】
＜段階（ｉｉ）＞
段階（ｉｉ）は、次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階である。
以下、段階（ｉｉ）を詳細に説明する。
段階（ｉｉ）は、次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階である。
以下、段階（ｉｉ）を詳細に説明する。
【0050】
＜サンプルＢ＞
「サンプルＢ」とは、サンプルＡに、媒体ａを添加して得られる組成物である。段階（ｉｉ）では、次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすようにサンプルＢを得る。
・要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
・要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なく とも１種の有機溶媒を含有する
・要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性 溶媒の密度）が０．６０００～０．８５０００である
「サンプルＢ」とは、サンプルＡに、媒体ａを添加して得られる組成物である。段階（ｉｉ）では、次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすようにサンプルＢを得る。
・要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
・要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なく とも１種の有機溶媒を含有する
・要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性 溶媒の密度）が０．６０００～０．８５０００である
【0051】
＜媒体ａ＞
「媒体ａ」とは、有機溶媒、又は少なくとも１種の有機溶媒を含有する液体組成物を指 す。サンプルＡに対する媒体ａの添加量は、所定量であることができ、例えばサンプル Aの容量１ｍｌあたり０．１～１００ｍｌ、０．５～７０ｍｌ、１．０～５０ｍｌ、１ ．５～３０ｍｌ、２．０～１０ｍｌであってもよい。また、その上限値は特に限定され ないが、例えば、サンプルＡの容量１ｍｌあたり１００ｍｌ以下、９０ｍｌ以下、８０ ｍｌ以下、７０ｍｌ以下、６０ｍｌ以下、５０ｍｌ以下、４０ｍｌ以下、３０ｍｌ以下 、２０ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、５ｍｌ以下であってもよい。また、その下限値は特に 限定されないが、例えば、サンプルＡの容量１ｍｌあたり０．１ｍｌ以上、０．３ｍｌ 以上、０．７ｍｌ以上、、１．０ｍｌ以上、１．５ｍｌ以上、２．０ｍｌ以上であって もよい。
「媒体ａ」とは、有機溶媒、又は少なくとも１種の有機溶媒を含有する液体組成物を指 す。サンプルＡに対する媒体ａの添加量は、所定量であることができ、例えばサンプル Aの容量１ｍｌあたり０．１～１００ｍｌ、０．５～７０ｍｌ、１．０～５０ｍｌ、１ ．５～３０ｍｌ、２．０～１０ｍｌであってもよい。また、その上限値は特に限定され ないが、例えば、サンプルＡの容量１ｍｌあたり１００ｍｌ以下、９０ｍｌ以下、８０ ｍｌ以下、７０ｍｌ以下、６０ｍｌ以下、５０ｍｌ以下、４０ｍｌ以下、３０ｍｌ以下 、２０ｍｌ以下、１０ｍｌ以下、５ｍｌ以下であってもよい。また、その下限値は特に 限定されないが、例えば、サンプルＡの容量１ｍｌあたり０．１ｍｌ以上、０．３ｍｌ 以上、０．７ｍｌ以上、、１．０ｍｌ以上、１．５ｍｌ以上、２．０ｍｌ以上であって もよい。
【0052】
＜有機溶媒＞
「有機溶媒」とは、有機化合物であって他の物質を溶解する物質の総称を指す。本発明の媒体ａに含有される有機溶媒は、前記要件Ｘ及びＹを満たす限りにおいて特に制限されず、例えばアルコール、脂肪族カルボン酸エステル、ケトン、エーテル等が挙げられる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられ、脂肪族カルボン酸エステルとしては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸等の分枝又は直鎖の飽和脂肪酸のほか、各種の不飽和脂肪酸のアルコールエステル、例えば上記アルコールのエステル等が挙げられる。ケトンとしては、アセトン、エチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、ブチルメチルケトン、イソブチルケトン等が例示される。エーテルとしては、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジエチルエーテル、ジフェニルエーテル、エチレンオキシド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、フラン、１，４－ジオキサン、アニソール、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、クラウンエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル等が挙げられる。また、前記以外にも、例えばジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。本発明の媒体ａは、好ましくは２種以上の有機溶媒を含有する。また、本発明の媒体ａは好ましくはｔ－ブチルメチルエーテルを含有する。さらに、本発明の媒体ａは、とりわけ好ましくはｔ－ブチルメチルエーテル及び１種以上の有機溶媒を含有し、特に好ましくは、本発明の媒体ａは少なくともｔ－ブチルメチルエーテル及びメタノールを含有する。
「有機溶媒」とは、有機化合物であって他の物質を溶解する物質の総称を指す。本発明の媒体ａに含有される有機溶媒は、前記要件Ｘ及びＹを満たす限りにおいて特に制限されず、例えばアルコール、脂肪族カルボン酸エステル、ケトン、エーテル等が挙げられる。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられ、脂肪族カルボン酸エステルとしては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸等の分枝又は直鎖の飽和脂肪酸のほか、各種の不飽和脂肪酸のアルコールエステル、例えば上記アルコールのエステル等が挙げられる。ケトンとしては、アセトン、エチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、ブチルメチルケトン、イソブチルケトン等が例示される。エーテルとしては、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジエチルエーテル、ジフェニルエーテル、エチレンオキシド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、フラン、１，４－ジオキサン、アニソール、ベンゾフラン、ジベンゾフラン、クラウンエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル等が挙げられる。また、前記以外にも、例えばジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等が挙げられる。本発明の媒体ａは、好ましくは２種以上の有機溶媒を含有する。また、本発明の媒体ａは好ましくはｔ－ブチルメチルエーテルを含有する。さらに、本発明の媒体ａは、とりわけ好ましくはｔ－ブチルメチルエーテル及び１種以上の有機溶媒を含有し、特に好ましくは、本発明の媒体ａは少なくともｔ－ブチルメチルエーテル及びメタノールを含有する。
【0053】
＜ｔ－ブチルメチルエーテル＞
本発明の媒体ａは、ｔ－ブチルメチルエーテルを含有することが好ましい。ｔ－ブチルメチルエーテル（メチル-t-ブチルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、ＭＴＢＥ、ｔＢＭＥとも称される）は、「ＣＡＳ：１６３４－０４－４」で表される有機溶媒である。本発明の媒体ａにおけるｔ－ブチルメチルエーテルの含有割合（ｔ－ブチルメチルエーテルの容量／媒体ａの容量）は、好ましくは０．１００～０．９７０、より好ましくは０．２００～０．９３０、さらに好ましくは０．３００～０．９００、さらにより好ましくは０．４００～０．８７０、とりわけ好ましくは０．４５０～０．８５０、特に好ましくは０．５００～０．８００である。また、その上限値は、特に限定されないが、例えば、０．９８０以下、０．９６０以下、０．９４０以下、０．９２０以下、０．９００以下、０．８８０以下、０．８６０以下、０．８４０以下、０．８２０以下、０．８００以下、０．７８０以下、０．７６０以下、０．７４０以下、０．７２０以下、０．７００以下、０．６８０以下、０．６６０以下、０．６４０以下、０．６２０以下、０．６００以下である。また、下限値は、特に限定されないが、例えば０．１００以上、０．１４０以上、０．１８０以上、０．２２０以上、０．２６０以上、０．２８０以上、０．３２０以上、０．３６０以上、０．４００以上、０．４４０以上、０．４８０以上、０．５２０以上である。
本発明の媒体ａは、ｔ－ブチルメチルエーテルを含有することが好ましい。ｔ－ブチルメチルエーテル（メチル-t-ブチルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、ＭＴＢＥ、ｔＢＭＥとも称される）は、「ＣＡＳ：１６３４－０４－４」で表される有機溶媒である。本発明の媒体ａにおけるｔ－ブチルメチルエーテルの含有割合（ｔ－ブチルメチルエーテルの容量／媒体ａの容量）は、好ましくは０．１００～０．９７０、より好ましくは０．２００～０．９３０、さらに好ましくは０．３００～０．９００、さらにより好ましくは０．４００～０．８７０、とりわけ好ましくは０．４５０～０．８５０、特に好ましくは０．５００～０．８００である。また、その上限値は、特に限定されないが、例えば、０．９８０以下、０．９６０以下、０．９４０以下、０．９２０以下、０．９００以下、０．８８０以下、０．８６０以下、０．８４０以下、０．８２０以下、０．８００以下、０．７８０以下、０．７６０以下、０．７４０以下、０．７２０以下、０．７００以下、０．６８０以下、０．６６０以下、０．６４０以下、０．６２０以下、０．６００以下である。また、下限値は、特に限定されないが、例えば０．１００以上、０．１４０以上、０．１８０以上、０．２２０以上、０．２６０以上、０．２８０以上、０．３２０以上、０．３６０以上、０．４００以上、０．４４０以上、０．４８０以上、０．５２０以上である。
【0054】
＜メタノール＞
本発明の媒体aは、メタノール（ＣＡＳ：６７－５６－１）を含有することが好ましい。本発明の媒体aにおけるメタノールの含有割合（メタノールの容量／媒体aの容量）は、好ましくは０．０６０～０．９００、より好ましくは０．０９０～０．８００、さらに好ましくは０．１２０～０．７００、さらにより好ましくは０．１５０～０．６００、とりわけ好ましくは０．１８０～０．５００、特に好ましくは０．２１０～０．４００である。また、そのまた、上限値は、特に限定されないが、例えば、０．９５０以下、０．０８５０以下、０．７５０以下、０．６５０以下、０．５５０以下、０．４５０以下、０．３５０以下、０．３００以下、０．２８０以下である。また、下限値は、特に限定されないが、例えば０．０５０以上、０．０８００以上、０．１１０以上、０．１２０以上、０．１４０以上、０．１６０以上、０．１８０以上、０．２００以上、０．２２０以上、０．２４０以上である。
本発明の媒体aは、メタノール（ＣＡＳ：６７－５６－１）を含有することが好ましい。本発明の媒体aにおけるメタノールの含有割合（メタノールの容量／媒体aの容量）は、好ましくは０．０６０～０．９００、より好ましくは０．０９０～０．８００、さらに好ましくは０．１２０～０．７００、さらにより好ましくは０．１５０～０．６００、とりわけ好ましくは０．１８０～０．５００、特に好ましくは０．２１０～０．４００である。また、そのまた、上限値は、特に限定されないが、例えば、０．９５０以下、０．０８５０以下、０．７５０以下、０．６５０以下、０．５５０以下、０．４５０以下、０．３５０以下、０．３００以下、０．２８０以下である。また、下限値は、特に限定されないが、例えば０．０５０以上、０．０８００以上、０．１１０以上、０．１２０以上、０．１４０以上、０．１６０以上、０．１８０以上、０．２００以上、０．２２０以上、０．２４０以上である。
【0055】
本発明の媒体ａは、ｔ－ブチルメチルエーテル及びメタノールの両方を含有することが好ましい。その含有比（ｔ－ブチルメチルエーテルの容量／メタノールの容量）は特に限定されないが、好ましくは０．３００～０．９５０、より好ましくは０．３５０～０．９３０、さらに好ましくは０．４００～０．９００、さらにより好ましくは０．４５０～０．８７０、とりわけ好ましくは０．５００～０．８５０、特に好ましくは０．５５０～０．８３０である。また、その上限値は、特に限定されないが、例えば、０．９５０以下、０．９２０以下、０．８９０以下、０．８６０以下、０．８３０以下、０．８００以下、０．７７０以下、０．７６０以下、０．７５５以下、０．７５０以下、０．７３０以下、０．７００以下、０．６８０以下、０．６６０以下、０．６４０以下、０．６２０以下、０．６００以下である。また、下限値は、特に限定されないが、例えば０．１２０以上、０．１６０以上、０．２００以上、０．２５０以上、０．３００以上、０．３５０以上、０．４００以上、０．４４０以上、０．４８０以上、０．５２０以上である。さらに、媒体ａにおけるｔ－ブチルメチルエーテル及びメタノールの合計含有量の割合（ｔ－ブチルメチルエーテルとメタノールの合計容量／媒体aの容量）は、その下限は、例えば０．３５以上、０．４０以上、０．４５以上、０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、０．６５以上、０．７０以上、０．７５以上、０．８０以上、０．８５以上、０．９０以上、０．９５以上、１であっても良い。また、その上限は、例えば１以下、０．９９以下、０．９５以下、０．９０以下、０．８５以下、０．８０以下であっても良い。また、ｔ－ブチルメチルエーテル及びメタノールを、媒体ａのオクタノール/水分配係数が所定範囲となるように含有することが好ましく、具体的には０．５０以上４．０以下であっても良い。より具体的にその下限は、０．５０以上、又は０．６０以上、又は０．７０以上、又は０．８０以上、又は０．９０以上であってもよく、その上限は特に制限されないが、通常４．０以下、又は３．９以下、又は３．６、又は３．５以下、又は３．０以下、又は２．５以下、又は２．０以下、又は１．９以下、又は１．８以下、又は１．７以下、又は１．６以下、又は１．５以下、又は１．４以下、又は１．３以下、又は１．２以下、又は１．１５以下、又は１．１０以下であってもよい。
【0056】
＜要件Ｘ＞
本発明の媒体ａは、２０℃における密度が、通常０．９９８ｇ／ｍｌ未満である。前記密度は、２０℃において、好ましくは０．７００～０．９９５ｇ／ｍｌ、より好ましくは０．７２０～０．９００ｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．７３０～０．８９０ｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは０．７３５～０．８８０ｇ／ｍｌ、とりわけ好ましくは０．７３６～０．８５０ｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．７３９～０．７８５ｇ／ｍｌであっても良い。また、上限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において０．９９５ｇ／ｍｌ以下、０．９９２ｇ／ｍｌ以下、０．９９０ｇ／ｍｌ以下、０．９８５ｇ／ｍｌ以下、０．９８０ｇ／ｍｌ以下、０．９７５ｇ／ｍｌ以下、０．９７０ｇ／ｍｌ以下、０．９６５ｇ／ｍｌ以下、０．９６３ｇ／ｍｌ以下、０．９６０ｇ／ｍｌ以下、０．９５５ｇ／ｍｌ以下、０．９５０ｇ／ｍｌ以下、０．９４５ｇ／ｍｌ以下、０．９４０ｇ／ｍｌ以下、０．９３５ｇ／ｍｌ以下、０．９３０ｇ／ｍｌ以下、０．９２５ｇ／ｍｌ以下、０．９２０ｇ／ｍｌ以下、０．９１５ｇ／ｍｌ以下、０．９１０ｇ／ｍｌ以下、０．９０５ｇ／ｍｌ以下、０．９００ｇ／ｍｌ以下、０．８９５ｇ／ｍｌ以下、０．８９０ｇ／ｍｌ以下、０．８８５ｇ／ｍｌ以下、０．８８０ｇ／ｍｌ以下、０．８７５ｇ／ｍｌ以下、０．８７０ｇ／ｍｌ以下、０．８６５ｇ／ｍｌ以下、０．８６０ｇ／ｍｌ以下、０．８５５ｇ／ｍｌ以下、０．８５０ｇ／ｍｌ以下、０．８４５ｇ／ｍｌ以下、０．８４０ｇ／ｍｌ以下、０．８３５ｇ／ｍｌ以下、０．８３０ｇ／ｍｌ以下、０．８２５ｇ／ｍｌ以下、０．８２０ｇ／ｍｌ以下、０．８１７ｇ／ｍｌ以下、０．８１４ｇ／ｍｌ以下、０．８１１ｇ／ｍｌ以下、０．８０９ｇ／ｍｌ以下、０．８０６ｇ／ｍｌ以下、０．８０３ｇ／ｍｌ以下、０．８００ｇ／ｍｌ以下、０．７９７ｇ／ｍｌ以下、０．７９４ｇ／ｍｌ以下、０．７９１ｇ／ｍｌ以下、０．７８８ｇ／ｍｌ以下、０．７８５ｇ／ｍｌ以下、０．７８２ｇ／ｍｌ以下、０．７７９ｇ／ｍｌ以下、０．７７６ｇ／ｍｌ以下、０．７７３ｇ／ｍｌ以下、０．７７０ｇ／ｍｌ以下、０．７６７ｇ／ｍｌ以下、０．７６４ｇ／ｍｌ以下、０．７６１ｇ／ｍｌ以下、０．７５８ｇ／ｍｌ以下、０．７５５ｇ／ｍｌ以下であってもよい。また、下限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において０．６６０ｇ／ｍｌ以上、０．６６３ｇ／ｍｌ以上、０．６６５ｇ／ｍｌ以上、０．６６８ｇ／ｍｌ以上、０．６７０ｇ／ｍｌ以上、０．６７３ｇ／ｍｌ以上、０．６７５ｇ／ｍｌ以上、０．６７７ｇ／ｍｌ以上、０．６８０ｇ／ｍｌ以上、０．６８３ｇ／ｍｌ以上、０．６８５ｇ／ｍｌ以上、０．６８７ｇ／ｍｌ以上、０．６９０ｇ／ｍｌ以上、０．６９３ｇ／ｍｌ以上、０．６９６ｇ／ｍｌ以上、０．７００ｇ／ｍｌ以上、０．７０３ｇ／ｍｌ以上、０．７０５ｇ／ｍｌ以上、０．７０７ｇ／ｍｌ以上、０．７１０ｇ／ｍｌ以上、０．７１２ｇ／ｍｌ以上、０．７１５ｇ／ｍｌ以上、０．７１８ｇ／ｍｌ以上、０．７２０ｇ／ｍｌ以上、０．７２３ｇ／ｍｌ以上、０．７２５ｇ／ｍｌ以上、０．７２７ｇ／ｍｌ以上、０．７３０ｇ／ｍｌ以上、０．７３３ｇ／ｍｌ以上、０．７３５ｇ／ｍｌ以上、０．７３８ｇ／ｍｌ以上、０．７４０ｇ／ｍｌ以上、０．７４１ｇ／ｍｌ以上、０．７４２ｇ／ｍｌ以上、０．７４３ｇ／ｍｌ以上、０．７４４ｇ／ｍｌ以上、０．７４５ｇ／ｍｌ以上、０．７４６ｇ／ｍｌ以上、０．７５０ｇ／ｍｌ以上、０．７５１ｇ／ｍｌ以上であってもよい。
本発明の媒体ａは、２０℃における密度が、通常０．９９８ｇ／ｍｌ未満である。前記密度は、２０℃において、好ましくは０．７００～０．９９５ｇ／ｍｌ、より好ましくは０．７２０～０．９００ｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．７３０～０．８９０ｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは０．７３５～０．８８０ｇ／ｍｌ、とりわけ好ましくは０．７３６～０．８５０ｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．７３９～０．７８５ｇ／ｍｌであっても良い。また、上限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において０．９９５ｇ／ｍｌ以下、０．９９２ｇ／ｍｌ以下、０．９９０ｇ／ｍｌ以下、０．９８５ｇ／ｍｌ以下、０．９８０ｇ／ｍｌ以下、０．９７５ｇ／ｍｌ以下、０．９７０ｇ／ｍｌ以下、０．９６５ｇ／ｍｌ以下、０．９６３ｇ／ｍｌ以下、０．９６０ｇ／ｍｌ以下、０．９５５ｇ／ｍｌ以下、０．９５０ｇ／ｍｌ以下、０．９４５ｇ／ｍｌ以下、０．９４０ｇ／ｍｌ以下、０．９３５ｇ／ｍｌ以下、０．９３０ｇ／ｍｌ以下、０．９２５ｇ／ｍｌ以下、０．９２０ｇ／ｍｌ以下、０．９１５ｇ／ｍｌ以下、０．９１０ｇ／ｍｌ以下、０．９０５ｇ／ｍｌ以下、０．９００ｇ／ｍｌ以下、０．８９５ｇ／ｍｌ以下、０．８９０ｇ／ｍｌ以下、０．８８５ｇ／ｍｌ以下、０．８８０ｇ／ｍｌ以下、０．８７５ｇ／ｍｌ以下、０．８７０ｇ／ｍｌ以下、０．８６５ｇ／ｍｌ以下、０．８６０ｇ／ｍｌ以下、０．８５５ｇ／ｍｌ以下、０．８５０ｇ／ｍｌ以下、０．８４５ｇ／ｍｌ以下、０．８４０ｇ／ｍｌ以下、０．８３５ｇ／ｍｌ以下、０．８３０ｇ／ｍｌ以下、０．８２５ｇ／ｍｌ以下、０．８２０ｇ／ｍｌ以下、０．８１７ｇ／ｍｌ以下、０．８１４ｇ／ｍｌ以下、０．８１１ｇ／ｍｌ以下、０．８０９ｇ／ｍｌ以下、０．８０６ｇ／ｍｌ以下、０．８０３ｇ／ｍｌ以下、０．８００ｇ／ｍｌ以下、０．７９７ｇ／ｍｌ以下、０．７９４ｇ／ｍｌ以下、０．７９１ｇ／ｍｌ以下、０．７８８ｇ／ｍｌ以下、０．７８５ｇ／ｍｌ以下、０．７８２ｇ／ｍｌ以下、０．７７９ｇ／ｍｌ以下、０．７７６ｇ／ｍｌ以下、０．７７３ｇ／ｍｌ以下、０．７７０ｇ／ｍｌ以下、０．７６７ｇ／ｍｌ以下、０．７６４ｇ／ｍｌ以下、０．７６１ｇ／ｍｌ以下、０．７５８ｇ／ｍｌ以下、０．７５５ｇ／ｍｌ以下であってもよい。また、下限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において０．６６０ｇ／ｍｌ以上、０．６６３ｇ／ｍｌ以上、０．６６５ｇ／ｍｌ以上、０．６６８ｇ／ｍｌ以上、０．６７０ｇ／ｍｌ以上、０．６７３ｇ／ｍｌ以上、０．６７５ｇ／ｍｌ以上、０．６７７ｇ／ｍｌ以上、０．６８０ｇ／ｍｌ以上、０．６８３ｇ／ｍｌ以上、０．６８５ｇ／ｍｌ以上、０．６８７ｇ／ｍｌ以上、０．６９０ｇ／ｍｌ以上、０．６９３ｇ／ｍｌ以上、０．６９６ｇ／ｍｌ以上、０．７００ｇ／ｍｌ以上、０．７０３ｇ／ｍｌ以上、０．７０５ｇ／ｍｌ以上、０．７０７ｇ／ｍｌ以上、０．７１０ｇ／ｍｌ以上、０．７１２ｇ／ｍｌ以上、０．７１５ｇ／ｍｌ以上、０．７１８ｇ／ｍｌ以上、０．７２０ｇ／ｍｌ以上、０．７２３ｇ／ｍｌ以上、０．７２５ｇ／ｍｌ以上、０．７２７ｇ／ｍｌ以上、０．７３０ｇ／ｍｌ以上、０．７３３ｇ／ｍｌ以上、０．７３５ｇ／ｍｌ以上、０．７３８ｇ／ｍｌ以上、０．７４０ｇ／ｍｌ以上、０．７４１ｇ／ｍｌ以上、０．７４２ｇ／ｍｌ以上、０．７４３ｇ／ｍｌ以上、０．７４４ｇ／ｍｌ以上、０．７４５ｇ／ｍｌ以上、０．７４６ｇ／ｍｌ以上、０．７５０ｇ／ｍｌ以上、０．７５１ｇ／ｍｌ以上であってもよい。
【0057】
＜要件（Ｙ）＞
本発明の媒体ａは、一定の疎水性を有する有機溶媒を含有し、具体的には、本発明の媒体ａは相対的に段階（ｉ）で用いる親水性溶媒に対して疎水性を有する媒体であればよい。具体的には本発明の媒体ａが、オクタノール/水分配係数が所定値以上である少なくとも１種の有機溶媒を含有する。前記オクタノール/水分配係数はＯＥＣＤテストガイドライン１０７（Ａｄｏｐｔｅｄ：１９９５年７月２７日に改版したもの）に規定されるフラスコ振とう法によって測定することができる。媒体ａに含有される少なくとも１種の有機溶媒の、オクタノール/水分配係数は、所定範囲にあることが好ましく、具体的には０．５０以上４．０以下であっても良い。より具体的にその下限は、０．５０以上、又は０．６０以上、又は０．７０以上、又は０．８０以上、又は０．９０以上であってもよい。また、その上限は特に制限されないが、通常４．０以下、又は３．９以下、又は３．６、又は３．５以下、又は３．０以下、又は２．５以下、又は２．０以下、又は１．９以下、又は１．８以下、又は１．７以下、又は１．６以下、又は１．５以下、又は１．４以下、又は１．３以下、又は１．２以下、又は１．１５以下、又は１．１０以下であってもよい。また、媒体ａが上記オクタノール/水分配係数に関する規定を充足しても良い。
また、媒体ａにおいて、上記オクタノール/水分配係数を有する有機溶媒が所定割合以上含有されることが好ましい。具体的にはその下限は１０ｗ／ｖ％以上、又は２０ｗ／ｖ％以上、又は３０ｗ／ｖ％以上、又は４０ｗ／ｖ％以上、又は５０ｗ／ｖ％以上、又は６０ｗ／ｖ％以上、又は７０ｗ／ｖ％以上、又は８０ｗ／ｖ％以上、又は９０ｗ／ｖ％以上、又は１００ｗ／ｖ％であってもよい。
さらに、媒体ａが上記オクタノール/水分配係数に関する規定を充足するように有機溶媒を所定割合含有しても良い。
また、本発明の媒体ａが、２０℃における水への溶解度が０．０００２～１０ｗ／ｖ％である少なくとも１種の有機溶媒を含有するものであっても良い。前記溶解度はＪＩＳＫ８００１：２０１７試薬試験方法通則に記載されている方法によって算出できる。すなわち、一定量の溶質を，試料が固体の場合は粉末とした後、水中に入れ、２０℃±５℃で５分ごとに強く３０秒間振り混ぜるとき、３０分以内に溶けるために必要な水の体積（ｍｌ）を求めることで測定できる。媒体ａに含有される少なくとも１種の有機溶媒の、２０℃における水への溶解度は、所定範囲にあることが好ましく、その範囲は、好ましくは０．０００５～９．０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．００５～８．０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．０１～７．０ｗ／ｖ％、さらにより好ましくは０．１～６．０ｗ／ｖ％、とりわけ好ましくは０．５～５．５ｗ／ｖ％、特に好ましくは１．０～５．０ｗ／ｖ％であっても良い。また、上限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において１０．０ｗ／ｖ％以下、９．０ｗ／ｖ％以下、８．０ｗ／ｖ％以下、７．５ｗ／ｖ％以下、７．０ｗ／ｖ％以下、６．５ｗ／ｖ％以下、６．０ｗ／ｖ％以下、５．５ｗ／ｖ％以下、５．３ｗ／ｖ％以下、５．０ｗ／ｖ％以下、４．５ｗ／ｖ％以下であっても良い。また、下限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において０．００２ｗ／ｖ％以上、０．００４ｗ／ｖ％以上、０．００８ｗ／ｖ％以上、０．０１２ｗ／ｖ％以上、０．０１５ｗ／ｖ％以上、０．０２０ｗ／ｖ％以上、０．０８０ｗ／ｖ％以上、０．１００ｗ／ｖ％以上、０．２００ｗ／ｖ％以上、０．４００ｗ／ｖ％以上、１．０ｗ／ｖ％以上、１．３ｗ／ｖ％以上、１．５ｗ／ｖ％以上であっても良い。
また、媒体ａにおける上記溶解度を有する有機溶媒が１０ｗ／ｖ％以上、又は２０ｗ／ｖ％以上、又は３０ｗ／ｖ％以上、又は４０ｗ／ｖ％以上、又は５０ｗ／ｖ％以上、又は６０ｗ／ｖ％以上、又は７０ｗ／ｖ％以上、又は８０ｗ／ｖ％以上、又は９０ｗ／ｖ％以上、又は１００ｗ／ｖ％であってもよい。
さらに、媒体ａが上記２０℃における水への溶解度に関する規定を充足するように有機溶媒を含有しても良い。
本発明の媒体ａは、一定の疎水性を有する有機溶媒を含有し、具体的には、本発明の媒体ａは相対的に段階（ｉ）で用いる親水性溶媒に対して疎水性を有する媒体であればよい。具体的には本発明の媒体ａが、オクタノール/水分配係数が所定値以上である少なくとも１種の有機溶媒を含有する。前記オクタノール/水分配係数はＯＥＣＤテストガイドライン１０７（Ａｄｏｐｔｅｄ：１９９５年７月２７日に改版したもの）に規定されるフラスコ振とう法によって測定することができる。媒体ａに含有される少なくとも１種の有機溶媒の、オクタノール/水分配係数は、所定範囲にあることが好ましく、具体的には０．５０以上４．０以下であっても良い。より具体的にその下限は、０．５０以上、又は０．６０以上、又は０．７０以上、又は０．８０以上、又は０．９０以上であってもよい。また、その上限は特に制限されないが、通常４．０以下、又は３．９以下、又は３．６、又は３．５以下、又は３．０以下、又は２．５以下、又は２．０以下、又は１．９以下、又は１．８以下、又は１．７以下、又は１．６以下、又は１．５以下、又は１．４以下、又は１．３以下、又は１．２以下、又は１．１５以下、又は１．１０以下であってもよい。また、媒体ａが上記オクタノール/水分配係数に関する規定を充足しても良い。
また、媒体ａにおいて、上記オクタノール/水分配係数を有する有機溶媒が所定割合以上含有されることが好ましい。具体的にはその下限は１０ｗ／ｖ％以上、又は２０ｗ／ｖ％以上、又は３０ｗ／ｖ％以上、又は４０ｗ／ｖ％以上、又は５０ｗ／ｖ％以上、又は６０ｗ／ｖ％以上、又は７０ｗ／ｖ％以上、又は８０ｗ／ｖ％以上、又は９０ｗ／ｖ％以上、又は１００ｗ／ｖ％であってもよい。
さらに、媒体ａが上記オクタノール/水分配係数に関する規定を充足するように有機溶媒を所定割合含有しても良い。
また、本発明の媒体ａが、２０℃における水への溶解度が０．０００２～１０ｗ／ｖ％である少なくとも１種の有機溶媒を含有するものであっても良い。前記溶解度はＪＩＳＫ８００１：２０１７試薬試験方法通則に記載されている方法によって算出できる。すなわち、一定量の溶質を，試料が固体の場合は粉末とした後、水中に入れ、２０℃±５℃で５分ごとに強く３０秒間振り混ぜるとき、３０分以内に溶けるために必要な水の体積（ｍｌ）を求めることで測定できる。媒体ａに含有される少なくとも１種の有機溶媒の、２０℃における水への溶解度は、所定範囲にあることが好ましく、その範囲は、好ましくは０．０００５～９．０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．００５～８．０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．０１～７．０ｗ／ｖ％、さらにより好ましくは０．１～６．０ｗ／ｖ％、とりわけ好ましくは０．５～５．５ｗ／ｖ％、特に好ましくは１．０～５．０ｗ／ｖ％であっても良い。また、上限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において１０．０ｗ／ｖ％以下、９．０ｗ／ｖ％以下、８．０ｗ／ｖ％以下、７．５ｗ／ｖ％以下、７．０ｗ／ｖ％以下、６．５ｗ／ｖ％以下、６．０ｗ／ｖ％以下、５．５ｗ／ｖ％以下、５．３ｗ／ｖ％以下、５．０ｗ／ｖ％以下、４．５ｗ／ｖ％以下であっても良い。また、下限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において０．００２ｗ／ｖ％以上、０．００４ｗ／ｖ％以上、０．００８ｗ／ｖ％以上、０．０１２ｗ／ｖ％以上、０．０１５ｗ／ｖ％以上、０．０２０ｗ／ｖ％以上、０．０８０ｗ／ｖ％以上、０．１００ｗ／ｖ％以上、０．２００ｗ／ｖ％以上、０．４００ｗ／ｖ％以上、１．０ｗ／ｖ％以上、１．３ｗ／ｖ％以上、１．５ｗ／ｖ％以上であっても良い。
また、媒体ａにおける上記溶解度を有する有機溶媒が１０ｗ／ｖ％以上、又は２０ｗ／ｖ％以上、又は３０ｗ／ｖ％以上、又は４０ｗ／ｖ％以上、又は５０ｗ／ｖ％以上、又は６０ｗ／ｖ％以上、又は７０ｗ／ｖ％以上、又は８０ｗ／ｖ％以上、又は９０ｗ／ｖ％以上、又は１００ｗ／ｖ％であってもよい。
さらに、媒体ａが上記２０℃における水への溶解度に関する規定を充足するように有機溶媒を含有しても良い。
【0058】
＜要件Ｚ＞
本発明の分析方法は、２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が所定範囲であることが好ましい。その原理は不明であるが、当該密度比が所定範囲にあることで、有機溶媒と親水性溶媒との相分離を容易にし、かつ、被測定対象脂溶性成分の、サンプルAから有機溶媒への移行が容易になると考えられる。２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）は、通常０．６０００～０．８５００、好ましくは０．６０２０～０．８０００、より好ましくは０．６０４０～０．７９００、さらに好ましくは０．６０６０～０．７８００、さらにより好ましくは０．６１００～０．７７００、とりわけ好ましくは０．６１５０～０．７６００、特に好ましくは０．６２００～０．７５５０、０．６３００～０．７５３０、０．６３５０～０．７５００、０．６４００～０．７４９０である。また、上限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において０．７９５０以下、０．７８５０以下、０．７７５０以下、０．７６５０以下、０．７６００以下、０．７５５０以下、０．７５３０以下、０．７５１０以下、０．７４８０以下、０．７４５０以下、０．７４３０以下、０．７４２０以下、０．７４１０以下、０．７４００以下、０．７３８０以下、０．７３６０以下、０．７３２０以下、０．７３００以下、０．７２１０以下、０．７１１０以下、０．７０００以下である。また、下限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において０．６０００以上、０．６０１０以上、０．６０３０以上、０．６０４０以上、０．６０５０以上、０．６０８０以上、０．６１２０以上、０．６１４０以上、０．６１６０以上、０．６２１０以上、０．６２５０以上、０．６３５０以上、０．６４２０以上、０．６５００以上、０．６６００以上、０．６７００以上、０．６７５０以上、０．６８００以上、０．６９００以上、０．６９５０以上、０．７０００以上である。
本発明の分析方法は、２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が所定範囲であることが好ましい。その原理は不明であるが、当該密度比が所定範囲にあることで、有機溶媒と親水性溶媒との相分離を容易にし、かつ、被測定対象脂溶性成分の、サンプルAから有機溶媒への移行が容易になると考えられる。２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）は、通常０．６０００～０．８５００、好ましくは０．６０２０～０．８０００、より好ましくは０．６０４０～０．７９００、さらに好ましくは０．６０６０～０．７８００、さらにより好ましくは０．６１００～０．７７００、とりわけ好ましくは０．６１５０～０．７６００、特に好ましくは０．６２００～０．７５５０、０．６３００～０．７５３０、０．６３５０～０．７５００、０．６４００～０．７４９０である。また、上限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において０．７９５０以下、０．７８５０以下、０．７７５０以下、０．７６５０以下、０．７６００以下、０．７５５０以下、０．７５３０以下、０．７５１０以下、０．７４８０以下、０．７４５０以下、０．７４３０以下、０．７４２０以下、０．７４１０以下、０．７４００以下、０．７３８０以下、０．７３６０以下、０．７３２０以下、０．７３００以下、０．７２１０以下、０．７１１０以下、０．７０００以下である。また、下限値は特に限定されないが、例えば、２０℃において０．６０００以上、０．６０１０以上、０．６０３０以上、０．６０４０以上、０．６０５０以上、０．６０８０以上、０．６１２０以上、０．６１４０以上、０．６１６０以上、０．６２１０以上、０．６２５０以上、０．６３５０以上、０．６４２０以上、０．６５００以上、０．６６００以上、０．６７００以上、０．６７５０以上、０．６８００以上、０．６９００以上、０．６９５０以上、０．７０００以上である。
【0059】
＜サンプルＢの混合；段階（ｉｉ‘）＞
本発明の分析方法では、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得ることで、被測定対象脂溶性成分を、有機溶媒に抽出することができる。従って、サンプルＢを得る段階では、サンプルＢに有機溶媒を効率的に抽出させるために、サンプルＢを所定の時間混合する工程（段階（ｉｉ‘））があってもよい。前記混合方法としては、例えば振蕩培養機を用いた混合等が挙げられる。前記混合時間は、特に制限されるものではないが、好ましくは１０～１４４０分間、より好ましくは１２～１０８０分間、さらに好ましくは１５～５４０分間、さらにより好ましくは２０～４８０分間、とりわけ好ましくは２５～２４０分間、特に好ましくは３０～９０分である。また、混合時間の上限は特に限定されないが、例えば１２００分間以下、１１００分間以下、１０００分間以下、９００分間以下、８００分間以下、７００分間以下、６００分間以下、５００分間以下、３００分間以下、２００分間以下、１８０分間以下、１５０分間以下、１２０分間以下、８０分間で以下ある。また、混合時間の下限は特に限定されないが、例えば、１０分間以上、１２分間以上、１３分間以上、１６分間以上、１８分間以上、２０分間以上、２４分間以上、２７分間以上、３３分間以上、４０分間以上、４５分間以上、４８分間以上である。
本発明の分析方法では、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得ることで、被測定対象脂溶性成分を、有機溶媒に抽出することができる。従って、サンプルＢを得る段階では、サンプルＢに有機溶媒を効率的に抽出させるために、サンプルＢを所定の時間混合する工程（段階（ｉｉ‘））があってもよい。前記混合方法としては、例えば振蕩培養機を用いた混合等が挙げられる。前記混合時間は、特に制限されるものではないが、好ましくは１０～１４４０分間、より好ましくは１２～１０８０分間、さらに好ましくは１５～５４０分間、さらにより好ましくは２０～４８０分間、とりわけ好ましくは２５～２４０分間、特に好ましくは３０～９０分である。また、混合時間の上限は特に限定されないが、例えば１２００分間以下、１１００分間以下、１０００分間以下、９００分間以下、８００分間以下、７００分間以下、６００分間以下、５００分間以下、３００分間以下、２００分間以下、１８０分間以下、１５０分間以下、１２０分間以下、８０分間で以下ある。また、混合時間の下限は特に限定されないが、例えば、１０分間以上、１２分間以上、１３分間以上、１６分間以上、１８分間以上、２０分間以上、２４分間以上、２７分間以上、３３分間以上、４０分間以上、４５分間以上、４８分間以上である。
【0060】
＜段階（ｉｉｉ）＞
段階（ｉｉｉ）は、サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階である。
以下、段階（ｉｉｉ）を詳細に説明する。
段階（ｉｉｉ）は、
段階（ｉｉｉ）は、サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階である。
以下、段階（ｉｉｉ）を詳細に説明する。
段階（ｉｉｉ）は、
【0061】
＜上層サンプルＣ１＞
「上層サンプルＣ１」とは、サンプルＢを相分離させた組成物の上層を指す。本発明の分析方法は、前記要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすものであるため、上層サンプルＣ１に被測定対象脂溶性成分が抽出される。従って、上層サンプルＣ１を回収することで、被測定対象脂溶性成分の分析検体とすることができる。
「上層サンプルＣ１」とは、サンプルＢを相分離させた組成物の上層を指す。本発明の分析方法は、前記要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすものであるため、上層サンプルＣ１に被測定対象脂溶性成分が抽出される。従って、上層サンプルＣ１を回収することで、被測定対象脂溶性成分の分析検体とすることができる。
【0062】
サンプルＢを相分離させる方法は特に制限されず、例えば卓上遠心機で遠心する方法等が挙げられる。前記遠心は、例えば２０℃で３～３０分間、５～１５分間、７～１２分間、３０００ｒｐｍで行うことができる。
【0063】
＜段階（ｉｉｉ‘）＞
前記上層サンプルＣ１は、そのまま分析検体としてもよいが、さらに濃縮してもよく（段階（ｉｉｉ‘））、当該濃縮産物を分析検体としてもよい。または当該濃縮産物を水や前記有機溶媒、またはそれらの混合物で希釈することで分析検体としてもよい。なお、前記水と有機溶媒の混合物としては、例えば、水、クロロホルム、メタノールを含有する混合物が挙げられる。前記濃縮を行うことで、例えば、被測定対象脂溶性成分が微量である場合等においても、分析精度を上げることができる。なお、前記濃縮方法は、特に制限されるものではないが、例えば、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する方法等が挙げられ、この態様においては、濃縮物が固形状となってもよい。
前記上層サンプルＣ１は、そのまま分析検体としてもよいが、さらに濃縮してもよく（段階（ｉｉｉ‘））、当該濃縮産物を分析検体としてもよい。または当該濃縮産物を水や前記有機溶媒、またはそれらの混合物で希釈することで分析検体としてもよい。なお、前記水と有機溶媒の混合物としては、例えば、水、クロロホルム、メタノールを含有する混合物が挙げられる。前記濃縮を行うことで、例えば、被測定対象脂溶性成分が微量である場合等においても、分析精度を上げることができる。なお、前記濃縮方法は、特に制限されるものではないが、例えば、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去する方法等が挙げられ、この態様においては、濃縮物が固形状となってもよい。
【0064】
なお、本発明のサンプルＡが、特に被測定対象脂溶性成分を含有する細胞若しくは組織、及び／又は可溶性糖類を含む態様である場合、前記従来技術で前記被測定対象脂溶性成分を抽出し、濃縮を行うと、前記細胞若しくは組織、又は可溶性糖類が有機溶媒に残存し、濃縮物がべたついてしまい、分析に適さなくなる。従って、前記濃縮が容易に行える点からも、本発明は有用である。
【0065】
＜下層サンプルＣ２＞
「下層サンプルＣ２」とは、サンプルＢを相分離させた組成物の下層を指す。本発明の分析方法は、前記要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすものであるため、下層サンプルＣ２には親水性溶媒の層が形成される。サンプルＡ中に細胞や組織が含有される場合、この下層サンプルＣ２には、細胞または組織の沈殿が存在することがある。前記従来技術では、この沈殿が水相と有機溶媒相の界面に存在する場合があるが、本発明方法では、通常この沈殿の過半数が下層サンプルＣ２に存在し、さらに好ましくは６０ｗ／ｗ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは９０ｗ／ｗ％以上、９５ｗ／ｗ％以上、または全量が下層サンプルＣ２に存在する。
「下層サンプルＣ２」とは、サンプルＢを相分離させた組成物の下層を指す。本発明の分析方法は、前記要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすものであるため、下層サンプルＣ２には親水性溶媒の層が形成される。サンプルＡ中に細胞や組織が含有される場合、この下層サンプルＣ２には、細胞または組織の沈殿が存在することがある。前記従来技術では、この沈殿が水相と有機溶媒相の界面に存在する場合があるが、本発明方法では、通常この沈殿の過半数が下層サンプルＣ２に存在し、さらに好ましくは６０ｗ／ｗ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは９０ｗ／ｗ％以上、９５ｗ／ｗ％以上、または全量が下層サンプルＣ２に存在する。
【0066】
本発明において、被測定対象脂溶性成分の種類によっては、前記下層サンプルＣ２に、被測定対象脂溶性成分が残存することもあり得る。従って、下層サンプルＣ２を回収したものに媒体ａを添加して、再度脂溶性成分を抽出してもよい。
【0067】
＜段階（ｉＶ）＞
段階（ｉＶ）は、サンプルＣ１中の脂溶性成分含有量を測定する段階である。
以下、段階（ｉＶ）を詳細に説明する。
段階（ｉＶ）は、サンプルＣ１中の脂溶性成分含有量を測定する段階である。
以下、段階（ｉＶ）を詳細に説明する。
【0068】
＜脂溶性成分の測定＞
サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量測定方法は、特に制限されるものではなく、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）や、ガスクロマトグラフィーを適用できるが、好ましくは高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）が挙げられる。
サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量測定方法は、特に制限されるものではなく、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）や、ガスクロマトグラフィーを適用できるが、好ましくは高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）が挙げられる。
【0069】
＜高速液体クロマトグラフィー＞
本発明の段階（ｉＶ）は、サンプルＣ１を高速液体クロマトグラフィーに付す段階を有
することが好ましい。本発明の分析方法では、高速液体クロマトグラフィーにおいて、ドリフト、うねりやノイズが抑制され、目的成分ピーク前後で略水平とすることができる。従って、濃度既知の目的成分のピークと、分析検体における目的成分のピークの面積比の比較が容易になり、測定誤差が小さくなる。高速液体クロマトグラフィーに供する条件は特に制限されるものではないが、本発明は汎用的に使用できるものであるから、様々な脂溶性成分が上層サンプルＣ１に抽出され得る。従って、高速液体クロマトグラフィーにおける移動相は、複数の有機溶媒を使用することが好ましい。これによって、高速液体クロマトグラフィーにおける各種脂溶性成分のピークを分離させることが容易になる。当該条件としては、例えば、少なくとも２種または３種の有機溶媒を使用して移動相の極性を調整する方法が挙げられる。その一例として、例えば移動相において、極性の小さい溶媒と、極性が大きい溶媒とを、その流量を調整することが好ましく、経時的に移動相の極性を上げる工程を有することが、特に好ましい。前記少なくとも２種または３種の有機溶媒は任意に選択できるが、例えば、メタノール、アセトニトリル、クロロホルム、ヘキサン、テトラヒドロフラン、イソプロパノール、イソオクタン、Nーヘプタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、酢酸エチル、トルエン、ベンゼン、ジクロロメタン、エタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ｔ－ブチルメチルエーテル等から選択でき、一例として、メタノール、及びｔ－ブチルメチルエーテルを採用できる。この態様においては、移動相におけるメタノールの含有割合に対するｔ－ブチルメチルエーテルの含有割合が３倍以上１０倍以下となるように調整する工程を有し、その後、メタノールの含有割合に対するｔ－ブチルメチルエーテルの含有割合が０．２５倍以上０．５５倍以下となるように経時的に移動相のメタノールの含有割合に対するｔ－ブチルメチルエーテルの含有割合を下げる工程を有してもよい。さらに、移動相に使用する少なくとも３種の有機溶媒として、メタノール、ｔ－ブチルメチルエーテル、およびヘキサン（ＣＡＳ番号１１０－５４－３）を採用してもよい。この態様においては、前記した移動相におけるメタノールの含有割合に対するｔ－ブチルメチルエーテルの含有割合が３倍以上１０倍以下となるように調整する工程において、メタノールとｔ－ブチルメチルエーテルの合計含有割合に対するヘキサンの含有割合が７倍以上であるように調整する工程を有してもよく、その後、移動相におけるメタノールとｔ－ブチルメチルエーテルの合計含有割合に対するヘキサンの含有割合が０．１倍以下となるように調整する工程を有しても良い。なお、各種有機溶媒の極性の大きさは、同一温度における比誘電率（溶媒の誘電率と真空の誘電率の比）を比べることで判断でき、比誘電率の値が大きい溶媒の方が、より極性が大きいと判断できる。
本発明の段階（ｉＶ）は、サンプルＣ１を高速液体クロマトグラフィーに付す段階を有
することが好ましい。本発明の分析方法では、高速液体クロマトグラフィーにおいて、ドリフト、うねりやノイズが抑制され、目的成分ピーク前後で略水平とすることができる。従って、濃度既知の目的成分のピークと、分析検体における目的成分のピークの面積比の比較が容易になり、測定誤差が小さくなる。高速液体クロマトグラフィーに供する条件は特に制限されるものではないが、本発明は汎用的に使用できるものであるから、様々な脂溶性成分が上層サンプルＣ１に抽出され得る。従って、高速液体クロマトグラフィーにおける移動相は、複数の有機溶媒を使用することが好ましい。これによって、高速液体クロマトグラフィーにおける各種脂溶性成分のピークを分離させることが容易になる。当該条件としては、例えば、少なくとも２種または３種の有機溶媒を使用して移動相の極性を調整する方法が挙げられる。その一例として、例えば移動相において、極性の小さい溶媒と、極性が大きい溶媒とを、その流量を調整することが好ましく、経時的に移動相の極性を上げる工程を有することが、特に好ましい。前記少なくとも２種または３種の有機溶媒は任意に選択できるが、例えば、メタノール、アセトニトリル、クロロホルム、ヘキサン、テトラヒドロフラン、イソプロパノール、イソオクタン、Nーヘプタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、酢酸エチル、トルエン、ベンゼン、ジクロロメタン、エタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ｔ－ブチルメチルエーテル等から選択でき、一例として、メタノール、及びｔ－ブチルメチルエーテルを採用できる。この態様においては、移動相におけるメタノールの含有割合に対するｔ－ブチルメチルエーテルの含有割合が３倍以上１０倍以下となるように調整する工程を有し、その後、メタノールの含有割合に対するｔ－ブチルメチルエーテルの含有割合が０．２５倍以上０．５５倍以下となるように経時的に移動相のメタノールの含有割合に対するｔ－ブチルメチルエーテルの含有割合を下げる工程を有してもよい。さらに、移動相に使用する少なくとも３種の有機溶媒として、メタノール、ｔ－ブチルメチルエーテル、およびヘキサン（ＣＡＳ番号１１０－５４－３）を採用してもよい。この態様においては、前記した移動相におけるメタノールの含有割合に対するｔ－ブチルメチルエーテルの含有割合が３倍以上１０倍以下となるように調整する工程において、メタノールとｔ－ブチルメチルエーテルの合計含有割合に対するヘキサンの含有割合が７倍以上であるように調整する工程を有してもよく、その後、移動相におけるメタノールとｔ－ブチルメチルエーテルの合計含有割合に対するヘキサンの含有割合が０．１倍以下となるように調整する工程を有しても良い。なお、各種有機溶媒の極性の大きさは、同一温度における比誘電率（溶媒の誘電率と真空の誘電率の比）を比べることで判断でき、比誘電率の値が大きい溶媒の方が、より極性が大きいと判断できる。
【0070】
＜濁度＞
本発明のサンプルＡは、濁度が所定範囲にあることが好ましい。濁度は、攪拌したサンプルを、分光光度計を用いて波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定した数値で特定できる。具体的には、本発明のサンプルＡの濁度は、好ましくは、１．１００～３．６００、より好ましくは１．１００～３．４００、さらに好ましくは１．１００～３．２００、さらにより好ましくは１．１００～３．０００、とりわけ好ましくは１．１００～２．８００、特に好ましくは１．１００～２．７００である。また、その上限値は、特に限定されないが、例えば３．８００以下、３．７００以下、３．６００以下、３．４００以下、３．２００以下、３．０００以下、２．８００以下、２．７００以下、２．５００以下、２．４００以下、２．２００以下、２．０００以下であってもよい。また、その下限値は特に限定されないが、例えば、１．０１０以上、１．０３０以上、１．０６０以上、１．０９０以上、１．１１０以上、１．１３０以上、１．１５０以上、１．２００以上、１．３００以上であってもよい。
本発明のサンプルＡは、濁度が所定範囲にあることが好ましい。濁度は、攪拌したサンプルを、分光光度計を用いて波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定した数値で特定できる。具体的には、本発明のサンプルＡの濁度は、好ましくは、１．１００～３．６００、より好ましくは１．１００～３．４００、さらに好ましくは１．１００～３．２００、さらにより好ましくは１．１００～３．０００、とりわけ好ましくは１．１００～２．８００、特に好ましくは１．１００～２．７００である。また、その上限値は、特に限定されないが、例えば３．８００以下、３．７００以下、３．６００以下、３．４００以下、３．２００以下、３．０００以下、２．８００以下、２．７００以下、２．５００以下、２．４００以下、２．２００以下、２．０００以下であってもよい。また、その下限値は特に限定されないが、例えば、１．０１０以上、１．０３０以上、１．０６０以上、１．０９０以上、１．１１０以上、１．１３０以上、１．１５０以上、１．２００以上、１．３００以上であってもよい。
【0071】
＜タンパク質＞
本発明のサンプルＡの好ましい態様は前記の通りであるが、本発明のサンプルＡは、サンプルＢの相分離を効率的に行う観点から、総タンパク質含有量が所定の範囲であることが好ましい。本発明のサンプルＡの総タンパク質含有量は、好ましくは０～１５ｗ／ｖ％、より好ましくは０～１２ｗ／ｖ％、より好ましくは０～１０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０～７．０ｗ／ｖ％、さらにより好ましくは０～４．０ｗ／ｖ％、とりわけ好ましくは０～２．０ｗ／ｖ％、特に好ましくは０～０．８ｗ／ｖ％である。また、下限値は、特に制限されるものではないが、例えば、０．０００１ｗ／ｖ％以上、０．０１ｗ／ｖ％以上、０．０２ｗ／ｖ％以上、０．０３ｗ／ｖ％以上、０．０４ｗ／ｖ％以上、０．０５ｗ／ｖ％以上、０．０６ｗ／ｖ％以上、０．０７ｗ／ｖ％以上、０．０８ｗ／ｖ％以上、０．０９ｗ／ｖ％以上、０．１０ｗ／ｖ％以上である。また、上限値は、例えば、１５ｗ／ｖ％以下、１３ｗ／ｖ％以下、１１ｗ／ｖ％以下、９．０ｗ／ｖ％以下、８．５ｗ／ｖ％以下、８．０ｗ／ｖ％以下、７．５ｗ／ｖ％以下、７．０ｗ／ｖ％以下、６．５ｗ／ｖ％以下、６．０ｗ／ｖ％以下、５．５ｗ／ｖ％以下、５．０ｗ／ｖ％以下、４．５ｗ／ｖ％以下、４．０ｗ／ｖ％以下、３．５ｗ／ｖ％以下、３．０ｗ／ｖ％以下、２．５ｗ／ｖ％以下、２．０ｗ／ｖ％以下、１．５ｗ／ｖ％以下、１．０ｗ／ｖ％以下、０．７ｗ／ｖ以下、０．６ｗ／ｖ％以下、０．４ｗ／ｖ％以下、０．３ｗ／ｖ％以下である。サンプルＡのタンパク質含有量は、例えばケルダール法によって測定できる。
本発明のサンプルＡの好ましい態様は前記の通りであるが、本発明のサンプルＡは、サンプルＢの相分離を効率的に行う観点から、総タンパク質含有量が所定の範囲であることが好ましい。本発明のサンプルＡの総タンパク質含有量は、好ましくは０～１５ｗ／ｖ％、より好ましくは０～１２ｗ／ｖ％、より好ましくは０～１０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０～７．０ｗ／ｖ％、さらにより好ましくは０～４．０ｗ／ｖ％、とりわけ好ましくは０～２．０ｗ／ｖ％、特に好ましくは０～０．８ｗ／ｖ％である。また、下限値は、特に制限されるものではないが、例えば、０．０００１ｗ／ｖ％以上、０．０１ｗ／ｖ％以上、０．０２ｗ／ｖ％以上、０．０３ｗ／ｖ％以上、０．０４ｗ／ｖ％以上、０．０５ｗ／ｖ％以上、０．０６ｗ／ｖ％以上、０．０７ｗ／ｖ％以上、０．０８ｗ／ｖ％以上、０．０９ｗ／ｖ％以上、０．１０ｗ／ｖ％以上である。また、上限値は、例えば、１５ｗ／ｖ％以下、１３ｗ／ｖ％以下、１１ｗ／ｖ％以下、９．０ｗ／ｖ％以下、８．５ｗ／ｖ％以下、８．０ｗ／ｖ％以下、７．５ｗ／ｖ％以下、７．０ｗ／ｖ％以下、６．５ｗ／ｖ％以下、６．０ｗ／ｖ％以下、５．５ｗ／ｖ％以下、５．０ｗ／ｖ％以下、４．５ｗ／ｖ％以下、４．０ｗ／ｖ％以下、３．５ｗ／ｖ％以下、３．０ｗ／ｖ％以下、２．５ｗ／ｖ％以下、２．０ｗ／ｖ％以下、１．５ｗ／ｖ％以下、１．０ｗ／ｖ％以下、０．７ｗ／ｖ以下、０．６ｗ／ｖ％以下、０．４ｗ／ｖ％以下、０．３ｗ／ｖ％以下である。サンプルＡのタンパク質含有量は、例えばケルダール法によって測定できる。
【0072】
＜ｐＨ＞
本発明のサンプルＡの好ましい態様は前記の通りであるが、本発明のサンプルＡは、殺菌効果を付与して脂溶性成分の抽出を安全に行う観点、上層サンプルＢの総分離を阻害するタンパク質等の物質を変性させられる観点から、親水性溶媒のｐＨが所定の範囲内であることが好ましい。ｐＨの調整は、例えば、サンプルＡに有機酸や有機酸塩（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カリウム、乳酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸及び酢酸等）を含有させることで行える。本発明の親水性溶媒のｐＨは、好ましくは７以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは４．５以下、さらにより好ましくは４．４以下、とりわけ好ましくは４以下、特に好ましくは３．９以下、３．８以下、３．６以下、３．３以下である。また、ｐＨの下限は特に制限されないが、好ましくは１．３以上、１．５以上、１．７以上、１．９以上、２．１以上である。本発明の親水性溶媒のｐＨの好ましい範囲は、１．２～７、１．５～５、１．７～４．５、１．９～３．６、２．１～３．５である。ｐＨの調整方法は、特に制限されないが、例えば、サンプルＡに各種有機酸や、緩衝作用を有するナトリウム塩を含有させることで実施できる。有機酸の種類は特に制限されるものではないが、殺菌効果が高いという観点から、酢酸を含有することが好ましい。
本発明のサンプルＡの好ましい態様は前記の通りであるが、本発明のサンプルＡは、殺菌効果を付与して脂溶性成分の抽出を安全に行う観点、上層サンプルＢの総分離を阻害するタンパク質等の物質を変性させられる観点から、親水性溶媒のｐＨが所定の範囲内であることが好ましい。ｐＨの調整は、例えば、サンプルＡに有機酸や有機酸塩（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、グルコン酸カリウム、乳酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸及び酢酸等）を含有させることで行える。本発明の親水性溶媒のｐＨは、好ましくは７以下、より好ましくは５以下、さらに好ましくは４．５以下、さらにより好ましくは４．４以下、とりわけ好ましくは４以下、特に好ましくは３．９以下、３．８以下、３．６以下、３．３以下である。また、ｐＨの下限は特に制限されないが、好ましくは１．３以上、１．５以上、１．７以上、１．９以上、２．１以上である。本発明の親水性溶媒のｐＨの好ましい範囲は、１．２～７、１．５～５、１．７～４．５、１．９～３．６、２．１～３．５である。ｐＨの調整方法は、特に制限されないが、例えば、サンプルＡに各種有機酸や、緩衝作用を有するナトリウム塩を含有させることで実施できる。有機酸の種類は特に制限されるものではないが、殺菌効果が高いという観点から、酢酸を含有することが好ましい。
【0073】
＜酢酸＞
酢酸とは、酢酸分子（ＣＨ3ＣＯＯＨ）と酢酸イオン（ＣＨ3ＣＯＯ-）をいい、酢酸の含有量とは、これらを合計した濃度を指し、高速液体クロマトグラフィー法によって測定できる。本発明の食酢における酢酸の由来は、特に限定されず、例えば、市販の酢酸であることもできるし、食酢によって含有されるものであってもよいし、酢酸菌に由来するものであってもよい。但し、サンプルＡに含有される酢酸の過半数が食酢及び／または酢酸菌由来であることが好ましい。本発明のサンプルＡにおける酢酸含有量は、親水性溶媒中の濃度として、好ましくは０．０２～１５ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０２～１０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．０２～８．０ｗ／ｖ％、よりさらに好ましくは０．０２～７．０ｗ／ｖ％、とりわけ好ましくは０．０２～５ｗ／ｖ％、特に好ましくは０．０２～４．０ｗ／ｖ％である。酢酸の含有量の下限値は特に限定されず、例えば０．０１ｗ／ｖ％以上、０．０２ｗ／ｖ％以上、０．１ｗ／ｖ％以上、０．２ｗ／ｖ％以上、０．７ｗ／ｖ％以上、１．０ｗ／ｖ％以上、１．５ｗ／ｖ％以上、２．０ｗ／ｖ％以上、２．５ｗ／ｖ％以上、又は４ｗ／ｖ％以上であることができ、上限値は、例えば２１ｗ／ｖ％以下、１９ｗ／ｖ％以下、１７ｗ／ｖ％以下、１５ｗ／ｖ％以下、１３ｗ／ｖ％以下、１１ｗ／ｖ％以下、９ｗ／ｖ％以下、８ｗ／ｖ％以下、７ｗ／ｖ％以下、又は６ｗ／ｖ％以下、５．０ｗ／ｖ％以下、４．５ｗ／ｖ％以下、４．０ｗ／ｖ％以下、３．０ｗ／ｖ％以下、１．０ｗ／ｖ％以下であることができる。
酢酸とは、酢酸分子（ＣＨ3ＣＯＯＨ）と酢酸イオン（ＣＨ3ＣＯＯ-）をいい、酢酸の含有量とは、これらを合計した濃度を指し、高速液体クロマトグラフィー法によって測定できる。本発明の食酢における酢酸の由来は、特に限定されず、例えば、市販の酢酸であることもできるし、食酢によって含有されるものであってもよいし、酢酸菌に由来するものであってもよい。但し、サンプルＡに含有される酢酸の過半数が食酢及び／または酢酸菌由来であることが好ましい。本発明のサンプルＡにおける酢酸含有量は、親水性溶媒中の濃度として、好ましくは０．０２～１５ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０２～１０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．０２～８．０ｗ／ｖ％、よりさらに好ましくは０．０２～７．０ｗ／ｖ％、とりわけ好ましくは０．０２～５ｗ／ｖ％、特に好ましくは０．０２～４．０ｗ／ｖ％である。酢酸の含有量の下限値は特に限定されず、例えば０．０１ｗ／ｖ％以上、０．０２ｗ／ｖ％以上、０．１ｗ／ｖ％以上、０．２ｗ／ｖ％以上、０．７ｗ／ｖ％以上、１．０ｗ／ｖ％以上、１．５ｗ／ｖ％以上、２．０ｗ／ｖ％以上、２．５ｗ／ｖ％以上、又は４ｗ／ｖ％以上であることができ、上限値は、例えば２１ｗ／ｖ％以下、１９ｗ／ｖ％以下、１７ｗ／ｖ％以下、１５ｗ／ｖ％以下、１３ｗ／ｖ％以下、１１ｗ／ｖ％以下、９ｗ／ｖ％以下、８ｗ／ｖ％以下、７ｗ／ｖ％以下、又は６ｗ／ｖ％以下、５．０ｗ／ｖ％以下、４．５ｗ／ｖ％以下、４．０ｗ／ｖ％以下、３．０ｗ／ｖ％以下、１．０ｗ／ｖ％以下であることができる。
【0074】
＜食酢＞
食酢とは、酢酸を有効成分とする酸味のある調味料を指す。食酢の種類としては、特に限定されないが、酢酸や氷（ひょう）酢酸を水で薄め、酢の風味に調味した合成酢や、日本農林規格に定められた醸造酢、穀物酢、果実酢、米酢、米黒酢、りんご酢、ぶどう酢、又はエタノールを原料とした酢酸発酵によって製造される酒精酢、中国酢、シェリー酢等が挙げられる。尚、前記果実酢に用いることができる果実としては、例えば後述する果実が挙げられる。本発明のサンプルＡが食酢を含有する場合、サンプルＡに含有される酢酸のうち、好ましくは５０ｗ／ｗ％以上、より好ましくは６０ｗ／ｗ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは８５ｗ／ｗ％以上、９０ｗ／ｗ％以上、９５ｗ／ｗ％以上、又は全量が食酢に由来してもよい。また、食酢含有量全体に対する醸造酢の割合（質量％）は、好ましくは５０ｗ／ｗ％以上、より好ましくは６０ｗ／ｗ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは９０ｗ／ｗ％以上、９５ｗ／ｗ％以上、１００ｗ／ｗ％（全量）であってもよい。
食酢とは、酢酸を有効成分とする酸味のある調味料を指す。食酢の種類としては、特に限定されないが、酢酸や氷（ひょう）酢酸を水で薄め、酢の風味に調味した合成酢や、日本農林規格に定められた醸造酢、穀物酢、果実酢、米酢、米黒酢、りんご酢、ぶどう酢、又はエタノールを原料とした酢酸発酵によって製造される酒精酢、中国酢、シェリー酢等が挙げられる。尚、前記果実酢に用いることができる果実としては、例えば後述する果実が挙げられる。本発明のサンプルＡが食酢を含有する場合、サンプルＡに含有される酢酸のうち、好ましくは５０ｗ／ｗ％以上、より好ましくは６０ｗ／ｗ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは８５ｗ／ｗ％以上、９０ｗ／ｗ％以上、９５ｗ／ｗ％以上、又は全量が食酢に由来してもよい。また、食酢含有量全体に対する醸造酢の割合（質量％）は、好ましくは５０ｗ／ｗ％以上、より好ましくは６０ｗ／ｗ％以上、さらにより好ましくは７０ｗ／ｗ％以上、とりわけ好ましくは８０ｗ／ｗ％以上、特に好ましくは９０ｗ／ｗ％以上、９５ｗ／ｗ％以上、１００ｗ／ｗ％（全量）であってもよい。
【0075】
＜ナトリウム＞
「ナトリウム」とは、ナトリウムイオンをいい、日本食品標準成分表２０１５年版（七訂）の「ナトリウム」に準じ、原子吸光法を用いて測定したものである。本発明のサンプルＡにおけるナトリウムの含有量は、特に制限されるものではないが、例えば、親水性溶媒中の濃度として、０．０１ｗ／ｖ％以上１５ｗ／ｖ％以下の範囲であればよい。具体的には、その下限は通常０．０１ｗ／ｖ％以上であるが、０．０３ｗ／ｖ％以上、又は０．０５ｗ／ｖ％以上、又は０．０７ｗ／ｖ％以上、又は０．１ｗ／ｖ％以上、又は０．３ｗ／ｖ％以上、又は０．５ｗ／ｖ％以上、又は０．６ｗ／ｖ％以上、又は０．７ｗ／ｖ％以上、又は０．８ｗ／ｖ％以上、又は１．０ｗ／ｖ％以上である。一方、その上限は、例えば１０ｗ／ｖ％以下、又は８．５ｗ／ｖ％以下、又は８．０ｗ／ｖ％以下、又は７．５ｗ／ｖ％以下、又は７．０ｗ／ｖ％以下、又は６．５ｗ／ｖ％以下、又は６．０ｗ／ｖ％以下、又は５．５ｗ／ｖ％以下、又は５．０ｗ／ｖ％以下、又は３．０ｗ／ｖ％以下、又は２．０ｗ／ｖ％以下、又は１．０ｗ／ｖ％以下、０．５ｗ／ｖ％以下、０．３ｗ／ｖ％以下とすることができる。本発明の分析方法は前記要件（Ｚ）を満たすため、ナトリウム含有量の調整によって親水性溶媒の密度調整を行ってもよいが、水への溶解度が高く、かつ安全性にも優れる観点から、可溶性糖類で行う方がより簡便である。
「ナトリウム」とは、ナトリウムイオンをいい、日本食品標準成分表２０１５年版（七訂）の「ナトリウム」に準じ、原子吸光法を用いて測定したものである。本発明のサンプルＡにおけるナトリウムの含有量は、特に制限されるものではないが、例えば、親水性溶媒中の濃度として、０．０１ｗ／ｖ％以上１５ｗ／ｖ％以下の範囲であればよい。具体的には、その下限は通常０．０１ｗ／ｖ％以上であるが、０．０３ｗ／ｖ％以上、又は０．０５ｗ／ｖ％以上、又は０．０７ｗ／ｖ％以上、又は０．１ｗ／ｖ％以上、又は０．３ｗ／ｖ％以上、又は０．５ｗ／ｖ％以上、又は０．６ｗ／ｖ％以上、又は０．７ｗ／ｖ％以上、又は０．８ｗ／ｖ％以上、又は１．０ｗ／ｖ％以上である。一方、その上限は、例えば１０ｗ／ｖ％以下、又は８．５ｗ／ｖ％以下、又は８．０ｗ／ｖ％以下、又は７．５ｗ／ｖ％以下、又は７．０ｗ／ｖ％以下、又は６．５ｗ／ｖ％以下、又は６．０ｗ／ｖ％以下、又は５．５ｗ／ｖ％以下、又は５．０ｗ／ｖ％以下、又は３．０ｗ／ｖ％以下、又は２．０ｗ／ｖ％以下、又は１．０ｗ／ｖ％以下、０．５ｗ／ｖ％以下、０．３ｗ／ｖ％以下とすることができる。本発明の分析方法は前記要件（Ｚ）を満たすため、ナトリウム含有量の調整によって親水性溶媒の密度調整を行ってもよいが、水への溶解度が高く、かつ安全性にも優れる観点から、可溶性糖類で行う方がより簡便である。
【0076】
なお、本発明は脂溶性成分の分析方法に関するものであるから、サンプルＡ中の総脂質含有量は、所定範囲内であることが好ましい。当該脂質含有量は、日本食品標準成分表２０１５年版（七訂）に準じ、ジエチルエーテルによるソックスレー抽出法で測定する。本発明のサンプルＡの脂質含有量は、本発明の技術的意義が大きくなる観点から、サンプルＡ中の濃度として、好ましくは４５ｗ／ｖ％以下、より好ましくは３５ｗ／ｖ％以下、さらに好ましくは２５ｗ／ｖ％以下、さらにより好ましくは１５ｗ／ｖ％以下、とりわけ好ましくは１０ｗ／ｖ％以下、特に好ましくは７ｗ／ｖ％以下である。また、その上限は、４５ｗ／ｖ％以下、又は４０ｗ／ｖ％以下、又は３０ｗ／ｖ％以下が好ましく、一方、その下限は、限定はされないが、０．００１ｗ／ｖ％以上、又は０．００２ｗ／ｖ％以上、又は０．００３ｗ／ｖ％以上、又は０．００５ｗ／ｖ％以上とすることができる。
【0077】
本発明は汎用的に使用できる分析方法であるが、前記従来技術が適用しづらく、解決すべき課題の重要性が大きくなる観点から、サンプルＡが飲食品であることが、特に好ましい。
【0078】
＜飲食品＞
「飲食品」とは、通常用いられている意味のものとして特に限定されず、そのまま喫食に供される飲食品、そのまま喫食に供される飲食品の調製用組成物等（飲料調製用の濃縮物、調味料等）が挙げられる。飲食品は、水を５０ｗ／ｖ％以上含むものであることが好ましい。また、飲食品をそのまま前述のサンプルＡとして用いてもよく、前記したサンプルＡにおける水分含有量を充足することが好ましい。さらに、本明細書にて開示するサンプルＡにおける各種成分の含有量の範囲を充足してもよい。
また、本発明の飲食品は、好ましくは飲料、飲料調製用の濃縮物、又は調味料であってもよい。
「飲食品」とは、通常用いられている意味のものとして特に限定されず、そのまま喫食に供される飲食品、そのまま喫食に供される飲食品の調製用組成物等（飲料調製用の濃縮物、調味料等）が挙げられる。飲食品は、水を５０ｗ／ｖ％以上含むものであることが好ましい。また、飲食品をそのまま前述のサンプルＡとして用いてもよく、前記したサンプルＡにおける水分含有量を充足することが好ましい。さらに、本明細書にて開示するサンプルＡにおける各種成分の含有量の範囲を充足してもよい。
また、本発明の飲食品は、好ましくは飲料、飲料調製用の濃縮物、又は調味料であってもよい。
【0079】
そのまま喫食に供される飲食品としては、特に制限されないが、例えば飲料、菓子類、汁物（スープ）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは飲料が挙げられる。
【0080】
飲料としては、例えば果汁含有飲料（例えば柑橘類（みかん、オレンジ、レモン、ライム、グレープフルーツ、柚子、カボス、スダチ、ベルガモット、ピンクグレープフルーツ、八朔、カラマンシー、シークワーサー等）、熱帯果実（パイナップル、バナナ、グアバ、マンゴー、アセロラ、パパイヤ、パッションフルーツ等）、ライチ、イチゴ、リンゴ、モモ、ブドウ（白ブドウ、赤ブドウ等）、カシス、ラズベリー、ざくろ、ウメ、梨、杏、スモモ、キウイフルーツ、メロン、ブルーベリー、アサイー等のフルーツジュース、エード、ニアウォーター、美容系飲料、スムージー等）、乳製品含有飲料（例えば乳等の乳及びその加工品である脱脂粉乳や全脂粉乳、濃縮乳、ヨーグルト、生クリーム、練乳、バター、脱脂乳、クリームパウダー、加糖粉乳、調製粉乳、ホエイパウダー、バターミルクパウダー等の乳成分を含む飲料）、野菜飲料（例えばトマト、ニンジン、かぼちゃ等のジュース、スムージー、青汁等）、清涼飲料水（例えばスポーツドリンク、レモネード等のエード、果実風味ドリンク）、炭酸飲料、ゼリー飲料、穀物飲料（例えば米、豆乳、アーモンドを主原料とする穀物飲料類等）、茶系飲料（例えば紅茶、ウーロン茶、緑茶、黒茶、抹茶、ジャスミン茶、ローズヒップ茶、カモミール茶、ほうじ茶の他、ブレンド茶（はと麦、大麦、玄米、大豆、とうもろこし等の穀物、柿の葉、びわの葉、クマ笹、アマチャヅル、アシタバ、ドクダミ等の葉、昆布、ベニバナ、しいたけ、レイシ等））、コーヒー飲料、粉末飲料（例えばココア、青汁等）、酒（例えばビール、発泡酒等のビールテイスト飲料、果実酒、日本酒等の醸造酒、焼酎、ウイスキー、ブランデー、スピリッツ等の蒸留酒、蒸留酒に糖類等の副原料を混合するリキュール等の混成酒、さらにこれら酒類に果汁や香料、乳化香料（油溶性香料を水に安定的に分散するように乳化した香料製剤）、炭酸ガス等を加えたカクテル、フィズ、チューハイ等）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは果汁含有飲料が挙げられる。
【0081】
本発明の果汁含有飲料の果汁含有率（ストレート果汁換算）は特に制限されないが、湿潤質量換算で、例えば、０．０５ｗ／ｖ％以上１００ｗ／ｖ％以下の範囲とすることができる。具体的には、その下限は、通常０．０５ｗ／ｖ％以上であるが、０．１ｗ／ｖ％以上、又は０．１５ｗ／ｖ％以上、又は０．２ｗ／ｖ％以上が好ましく、一方、その上限は、１００ｗ／ｖ％以下、又は９０ｗ／ｖ％以下とすることができる。
【0082】
本発明において「果汁」とは、果実の搾汁液又は抽出等によって得られる果実の液部をいい、果実を裏ごし又はすりおろし処理したピューレ、おろしを使用する場合は、その内の液部をいう。本発明の液状調味料に使用する果汁としては、例えば、柑橘（例えば、レモン、バレンシアオレンジ、ネーブルオレンジ、グレープフルーツ、ライム、シークワーサー、ダイダイ、ユズ、カボス、スダチ、シトロン、ブッシュカン、ナツミカン、ハッサク、ヒュウガナツ、スウィーティー、デコポン、イヨカン、タンカン、セミノール、ブンタン、マンダリンオレンジ、ウンシュウミカン、ポンカン、紀州ミカン、キンカン、ユコウ、ザボン、バンペイユ等）、リンゴ、パイナップル、桃、ぶどう、いちご、梨、バナナ、キウイ、カシス、アセロラ、ブルーベリー、ラズベリー、柿、アプリコット、グアバ、プラム、マンゴー、パパイヤ、ライチ等に由来する果汁が挙げられる。これらの果汁は、１種又は２種以上を用いることができる。また、上記果汁は、凍結、濃縮、還元等の加工を行ったものも用いることもできる。
【0083】
また、上記果汁は、クエン酸含量が湿潤質量換算で、０．１ｗ／ｖ％以上、又は０．２５ｗ／ｖ％以上、又は０．５ｗ／ｖ％以上、又は０．７５ｗ／ｖ％以上、又は１．０ｗ／ｖ％以上、又は１．５ｗ／ｖ％以上であることが好ましく、果汁のＪＡＳ規格（果実飲料の日本農林規格 平成２５年１２月２４日農林水産省告示第３１１８号）においてクエン酸規格として規格されている果汁が好ましく、なかでもレモン果汁、ライム果汁、カボス果汁が好ましい。また上記果汁は、糖度が１．０ｗ／ｖ％以上、又は１．５ｗ／ｖ％以上、又は２．０ｗ／ｖ％以上、又は２．５ｗ／ｖ％以上であることが好ましく、果汁のＪＡＳ規格（果実飲料の日本農林規格 平成２５年１２月２４日農林水産省告示第３１１８号）において糖度規格として規格されている果汁が好ましく、なかでも柑橘果汁（糖度規格がない果汁を除く）又はリンゴ果汁が好ましい。
【0084】
本発明において、「果汁含有率（ストレート果汁換算）」とは、果実を搾汁して得られるストレート果汁を１００％としたときのｗ／ｖ％濃度をいい、飲食品に配合される果汁の含有率（ｗ／ｖ％）に、果汁の濃縮倍率を乗じて算出することができる。例えば、濃縮倍率が５倍であるリンゴ果汁を飲食品に１０ｗ／ｖ％で配合した場合には、果汁含有率（ストレート換算）は５０ｗ／ｖ％となる。また、各果汁の濃縮倍率は、例えば、ＪＡＳ規格（果実飲料の日本農林規格 平成２５年１２月２４日農林水産省告示第３１１８号）に示される各種果実のストレート果汁の糖用屈折計示度の基準又は酸度基準の最低値に基づいて、換算することができる。
【0085】
菓子類とは、甘味や塩味などの味覚を強調し、あるいは食感などの触覚を工夫し、各種の匂いで嗅覚などの食味感覚の嗜好品として製造、調理された食品である。より具体的には、例えば、ゼリー、プディング、チョコレート、バー（スナックバー）、冷菓（アイスクリーム、シャーベット等）等が挙げられ、これらの中でも、好ましくはゼリー、冷菓（アイスクリーム、シャーベット等）が挙げられ、その中でも特に好ましくはゼリーが挙げられる。
【0086】
汁物（スープ）は、肉類、魚介類、卵、乳、野菜、果物、ハーブ、海藻等の具材を適当な方法で調理して得られた、水を多く含む食品である。汁物として、具体的には、例えばミネストローネ、サンラータン、白湯スープ、チゲスープ等が挙げられる。
【0087】
喫食に供される飲食品の調製用組成物としては、特に制限されないが、例えば飲料の調製用組成物、デザートソース・クリーム、調味料、レトルト食品等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは飲料の調製用組成物、デザートソース・クリーム、調味料等が挙げられ、より好ましくは飲料の調製用組成物が挙げられる。
【0088】
飲料の調製用組成物としては、例えば飲料の濃縮タイプが挙げられる。これは、適当な飲料（例えば、水、又は上記で例示された飲料）で希釈してから、飲用に供される。推奨される希釈倍率は、例えば１．１～５０倍、好ましくは２～２０倍、より好ましくは３～１２倍、さらに好ましくは４～８倍である。
【0089】
デザートソース・クリームとは、飲料や、菓子類（ゼリー、ケーキ、アイスクリーム等）にかけたり、載せたり、混ぜたりして、風味、テクスチャー、色をデザートに加える液体状、粉末状、又は半固体状のソースやクリームであり、具体的には、例えばキャラメルソース、カスタードソース、チョコレートソースや、ラズベリーソース、ストロベリーソース、ブルーベリーソース、アップルソース、ザクロソースなどのフルーツソース等が挙げられる。
【0090】
調味料としては、特に制限されないが、例えばタレ（ゴマだれ等のゴマ含有調味料、焼肉だれ等）、ドレッシング（ノンオイルドレッシング、分離ドレッシング、乳化ドレッシング等）、調味酢（例えば汎用性調味酢、酢の物用調味酢、すし飯用調味酢、酢漬け（例えばピクルス等）用調味液、甘酢等）、米飯用調味料、ぽん酢調味料、だし含有調味料（例えばめんつゆ、鍋つゆ等）、納豆用調味料、漬物用調味料、肉用調味料、食酢、ウスターソース、ケチャップ、オイスターソース、サルサ、サンバルソース、チリソース、辛味スパイス含有調味料、チャツネ、マスタード、マヨネーズ等が挙げられる。また、本発明の調味料としては、アミノ酸や核酸を含有するものであってもよい。
【0091】
＜アミノ酸＞
本発明において、「アミノ酸」とは、アミノ酸とその塩をいい、アミノ酸の種類は特に限定されない。本発明の飲食品に含まれるアミノ酸は、原料となる食材に含まれるものでもよく、当該食材とは別に外部から添加されるものでもよい。また、外部からアミノ酸を添加する場合、精製抽出された高純度の製剤を添加してもよく、アミノ酸を含む何らかの素材（例えば果汁）、または素材加工品（例えば抽出物、濃縮果汁）の形態で添加してもよい。但し、当該飲食品に含有されるアミノ酸の過半（より好ましくは全部）が何らかの食材由来であることが好ましい。アミノ酸を含むものとしては、例えばアミノ酸系調味料が挙げられ、アミノ酸系調味料の例としては、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム、ＤＬ－アラニン、グリシン、Ｌ－又はＤＬ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－又はＤＬ－メチオニン、Ｌ－リシン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ－アルギニン等が挙げられる。これらのアミノ酸は、１種のみを単独で使用してもよく、２種以上を任意の組み合わせや任意の比率で含有してもよい。
本発明において、「アミノ酸」とは、アミノ酸とその塩をいい、アミノ酸の種類は特に限定されない。本発明の飲食品に含まれるアミノ酸は、原料となる食材に含まれるものでもよく、当該食材とは別に外部から添加されるものでもよい。また、外部からアミノ酸を添加する場合、精製抽出された高純度の製剤を添加してもよく、アミノ酸を含む何らかの素材（例えば果汁）、または素材加工品（例えば抽出物、濃縮果汁）の形態で添加してもよい。但し、当該飲食品に含有されるアミノ酸の過半（より好ましくは全部）が何らかの食材由来であることが好ましい。アミノ酸を含むものとしては、例えばアミノ酸系調味料が挙げられ、アミノ酸系調味料の例としては、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム、ＤＬ－アラニン、グリシン、Ｌ－又はＤＬ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－又はＤＬ－メチオニン、Ｌ－リシン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ－アルギニン等が挙げられる。これらのアミノ酸は、１種のみを単独で使用してもよく、２種以上を任意の組み合わせや任意の比率で含有してもよい。
【0092】
本発明のサンプルＡの総アミノ酸含有量は、特に制限されるものではないが、例えば、０．３～１５００ｍｇ／１００ｍｌ、好ましくは０．５～１２００ｍｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．８～１０００ｍｇ／１００ｍｌ、さらにより好ましくは１．０～８００ｍｇ／１００ｍｌ、とりわけ好ましくは２．０～５００ｍｇ／１００ｍｌ、特に好ましくは３．０～２５０ｍｇ／１００ｍｌである。また、上限値は、例えば、１６００ｍｇ／１００ｍｌ以下、１４００ｍｇ／１００ｍｌ以下、１１００ｍｇ／１００ｍｌ以下、９００ｍｇ／１００ｍｌ以下、７５０ｍｇ／１００ｍｌ以下、６５０ｍｇ／１００ｍｌ以下、６００ｍｇ／１００ｍｌ以下、５５０ｍｇ／１００ｍｌ以下、４５０ｍｇ／１００ｍｌ以下、４００ｍｇ／１００ｍｌ以下、３５０ｍｇ／１００ｍｌ以下、３００ｍｇ／１００ｍｌ以下、２４０ｍｇ／１００ｍｌ以下、２００ｍｇ／１００ｍｌ以下、１８０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１６０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１４０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１２０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１１０ｍｇ／１００ｍｌ以下、１００ｍｇ／１００ｍｌ以下、９０ｍｇ／１００ｍｌ以下、８０ｍｇ／１００ｍｌ以下、７０ｍｇ／１００ｍｌ以下、６０ｍｇ／１００ｍｌ以下、５０ｍｇ／１００ｍｌ以下、４０ｍｇ／１００ｍｌ以下、３０ｍｇ／１００ｍｌ以下である。また、下限値は、例えば０．０１ｍｇ／１００ｍｌ以上、０．０２ｍｇ／１００ｍｌ以上、０．０５ｍｇ／１００ｍｌ以上、０．１ｍｇ／１００ｍｌ以上、０．２ｍｇ／１００ｍｌ以上、０．４ｍｇ／１００ｍｌ以上、０．６ｍｇ／１００ｍｌ以上、０．８ｍｇ／１００ｍｌ以上、１．１ｍｇ／１００ｍｌ以上、１．５ｍｇ／１００ｍｌ以上、２．０ｍｇ／１００ｍｌ以上、２．４ｍｇ／１００ｍｌ以上、３．５ｍｇ／１００ｍｌ以上、４．０ｍｇ／１００ｍｌ以上、４．５ｍｇ／１００ｍｌ以上、５．５ｍｇ／１００ｍｌ以上、６．５ｍｇ／１００ｍｌ以上、７．５ｍｇ／１００ｍｌ以上、８．５ｍｇ／１００ｍｌ以上、１０ｍｇ／１００ｍｌ以上である。アミノ酸分析は、高速液体クロマトグラフィー法によって行える。
【0093】
＜核酸＞
本発明において、「核酸」とは、核酸とその塩をいう。本発明の飲食品に含まれる核酸は、原料となる食材に含まれるものでもよく、当該食材とは別に外部から添加されるものでもよい。本発明の飲食品の製造時に外部から核酸を添加する場合、精製抽出された高純度の製剤を添加してもよく、核酸を含む何らかの素材加工品（例えば抽出物）の形態で添加してもよい。但し、当飲食品に含有される核酸の過半（より好ましくは全部）が何らかの食材由来であることが好ましい。核酸を含むものとしては、例えばアミノ酸系調味料があげられ、核酸系調味料の例としては、例えば、５’－イノシン酸二ナトリウム、５’－グアニル酸二ナトリウム、５’－ウリジル酸二ナトリウム、５’－シチジル酸二ナトリウム、５’－リボヌクレオチドカルシウム、５’－リボヌクレオチド二ナトリウム等が挙げられる。これらの核酸は、１種のみを単独で含有してもよく、２種以上を任意の組み合わせや任意の比率で含有してもよい。
本発明において、「核酸」とは、核酸とその塩をいう。本発明の飲食品に含まれる核酸は、原料となる食材に含まれるものでもよく、当該食材とは別に外部から添加されるものでもよい。本発明の飲食品の製造時に外部から核酸を添加する場合、精製抽出された高純度の製剤を添加してもよく、核酸を含む何らかの素材加工品（例えば抽出物）の形態で添加してもよい。但し、当飲食品に含有される核酸の過半（より好ましくは全部）が何らかの食材由来であることが好ましい。核酸を含むものとしては、例えばアミノ酸系調味料があげられ、核酸系調味料の例としては、例えば、５’－イノシン酸二ナトリウム、５’－グアニル酸二ナトリウム、５’－ウリジル酸二ナトリウム、５’－シチジル酸二ナトリウム、５’－リボヌクレオチドカルシウム、５’－リボヌクレオチド二ナトリウム等が挙げられる。これらの核酸は、１種のみを単独で含有してもよく、２種以上を任意の組み合わせや任意の比率で含有してもよい。
【0094】
レトルト食品としては、レトルトパウチ又は缶内に調理済み又は半調理済みの食品が詰められてなるものである限り、特に制限されない。詰められる食品としては、例えば、上記した食品そのもの、又は簡単な調理（例えば、食材を加えて加熱調理するなど）により上記した食品を得ることができるもの等が挙げられる。
【0095】
本発明はまた、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の経時的な含有量変化を分析する方法に関する。
【0096】
前記の通り、本発明はサンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の含有量を精度よく分析できる方法であるから、サンプルＡを所定期間保管した場合における、被測定対象脂溶性成分の含有量変化を分析できる。前記期間は、特に制限されるものではないが、例えば１０年間以内、５年間以内、４年間以内、３年間以内、２年間以内、１年６月間以内、１年間以内であってもよい。
【0097】
本発明はまた、被測定対象脂溶性成分を含む分析検体の製造方法に関する。
【0098】
本発明が、被測定対象脂溶性成分を含む分析検体の製造方法である場合、前述の通り、前記上層サンプルＣ１を回収することで、被測定対象脂溶性成分の分析検体を製造できる。また、上層サンプルＣ１をさらに濃縮し、当該濃縮産物を分析検体としてもよい。さらに、当該濃縮産物を水や前記有機溶媒、またはそれらの混合物で希釈することで分析検体としてもよい。なお、前記水と有機溶媒の混合物としては、例えば、水、クロロホルム、メタノールを含有する混合物が挙げられる。従って、本明細書に開示した（ｉ）～（ｉｉｉ）段階、（ｉｉ‘）段階、（ｉｉｉ‘）段階に係る条件を、そのまま本発明の被測定対象脂溶性成分を含む分析検体の製造方法に適用できる。
【実施例0099】
以下、本発明を実施例に則して更に詳細に説明するが、これらの実施例はあくまでも説明のために便宜的に示す例に過ぎず、本発明は如何なる意味でもこれらの実施例に限定されない。
【0100】
＜有機溶媒を含有する媒体の調製＞
表１の組成に従って、ｔ－ブチルメチルエーテル（関東化学；純度９９．８ｗ／ｗ％）、メタノール（関東化学；純度９９．８ｗ／ｗ％）、クロロホルム（関東化学；純度９９．０ｗ／ｗ％）を混合し、対照溶媒と試験溶媒（媒体ａ）を調製した。なお、ｔ－ブチルメチルエーテル、メタノール、クロロホルムは、関東化学製の試薬（ＨＰＬＣ用）を使用した。
表１の組成に従って、ｔ－ブチルメチルエーテル（関東化学；純度９９．８ｗ／ｗ％）、メタノール（関東化学；純度９９．８ｗ／ｗ％）、クロロホルム（関東化学；純度９９．０ｗ／ｗ％）を混合し、対照溶媒と試験溶媒（媒体ａ）を調製した。なお、ｔ－ブチルメチルエーテル、メタノール、クロロホルムは、関東化学製の試薬（ＨＰＬＣ用）を使用した。
【0101】
【表1】
【0102】
＜段階（ｉ）：サンプルＡの調製＞
レモン果汁、りんご果汁、黒酢、りんご酢、酢酸菌体（セラミド含有量０．８ｗ／ｗ％）、上白糖、酢酸、香料、乳化香料を適宜混合し、表２に示すようにサンプルＡを調製した。なお、酢酸菌体中のセラミド含有量は、特開２００７－３０６８８２号公報に記載されている方法と同様にして行い、凍結乾燥した酢酸菌体を、公知のブライ・デイヤー（Ｂｌｉｇｈ－ｄｙｅｒ）法に従い、クロロホルム：メタノール：水＝１：２：０．８の組成の有機溶媒にて全脂質の抽出を行った後、高速液体クロマトグラフィーに供することで行った。
レモン果汁、りんご果汁、黒酢、りんご酢、酢酸菌体（セラミド含有量０．８ｗ／ｗ％）、上白糖、酢酸、香料、乳化香料を適宜混合し、表２に示すようにサンプルＡを調製した。なお、酢酸菌体中のセラミド含有量は、特開２００７－３０６８８２号公報に記載されている方法と同様にして行い、凍結乾燥した酢酸菌体を、公知のブライ・デイヤー（Ｂｌｉｇｈ－ｄｙｅｒ）法に従い、クロロホルム：メタノール：水＝１：２：０．８の組成の有機溶媒にて全脂質の抽出を行った後、高速液体クロマトグラフィーに供することで行った。
【0103】
＜比較例１、比較例２における分析検体の調製＞
比較例１、比較例２では、前記によってサンプルＡを調製した後、対照溶媒を、サンプルＡの容量１ｍｌあたり３．６ｍｌとなるように添加し、ボルテックス（ボルテックスミキサー：Ｐａｓｏｌｉｎａ：ＮＳ－８０）で撹拌した後、２０分間超音波に供した。その後、１０分間、３０００ｒｐｍで遠心した（冷却遠心機２８００；ＫＵＢＯＴＡ）。
比較例１、比較例２では、前記によってサンプルＡを調製した後、対照溶媒を、サンプルＡの容量１ｍｌあたり３．６ｍｌとなるように添加し、ボルテックス（ボルテックスミキサー：Ｐａｓｏｌｉｎａ：ＮＳ－８０）で撹拌した後、２０分間超音波に供した。その後、１０分間、３０００ｒｐｍで遠心した（冷却遠心機２８００；ＫＵＢＯＴＡ）。
【0104】
次に、上澄を０．４５μｍＰＴＦＥフィルターで濾過し、１００ｍｌナスフラスコに採取した。
【0105】
次に、沈殿物に対して、適宜水及び対照溶媒を添加して、前記と同様に遠心、濾過し、最初に上澄を採取したものと同じ１００ｍｌナスフラスコに採取した。
【0106】
次に、ナスフラスコに採取した試料をロータリーエバポレーターに供して溶媒を除去（試料を濃縮）し、得られた残渣に再度対照溶媒を所定量添加し、高速液体クロマトグラフィー用の検体とし、当該検体をバイアルへ封入し、高速液体クロマトグラフィーに供し、ＥＬＳＤにて検出した。なお、検体中のセラミド含有量の定量に際しては、濃度既知のセラミド標品（長良サイエンス社製；Ｃｅｒａｍｉｄｅ ｆｒｏｍ Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｌｏｒｕｍ（Ｃｅｒａｍｉｄｅ ｍｉｘ））を、前記と同様に高速液体クロマトグラフィーに供し、検量線を作成した。
【0107】
＜高速液体クロマトグラフィー＞
高速液体クロマトグラフィーには、次の機器を使用した。
・液体クロマトグラフ装置（島津製作所；ＬＣ－２０ＡＤ）
・オートサンプラー（島津製作所；ＳＩＬ－２０ＡＣ ＨＴ）
・通信モジュール（島津製作所；ＣＢＭ－２０Ａ）
・カラムオーブン（島津製作所；ＣＴＯ－２０ＡＣ）
・ＥＬＳＤ検出器（島津製作所；ＥＬＳＤ－ＬＴII）
・ＨＲＬカラム（島津製作所；Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ ＨＲＣ－ＳＩＬ４．６ｍｍｆｗａｉ＊２５ｃｍ）
・カラム：（島津製作所； ＳＨＩＭ－ＰＡＣＫ ＨＲＣ－ＳＩＬ（２５０ｍｍｋａｋｅｒｕ４．６ｍｍ））
高速液体クロマトグラフィーには、次の機器を使用した。
・液体クロマトグラフ装置（島津製作所；ＬＣ－２０ＡＤ）
・オートサンプラー（島津製作所；ＳＩＬ－２０ＡＣ ＨＴ）
・通信モジュール（島津製作所；ＣＢＭ－２０Ａ）
・カラムオーブン（島津製作所；ＣＴＯ－２０ＡＣ）
・ＥＬＳＤ検出器（島津製作所；ＥＬＳＤ－ＬＴII）
・ＨＲＬカラム（島津製作所；Ｓｈｉｍ－Ｐａｃｋ ＨＲＣ－ＳＩＬ４．６ｍｍｆｗａｉ＊２５ｃｍ）
・カラム：（島津製作所； ＳＨＩＭ－ＰＡＣＫ ＨＲＣ－ＳＩＬ（２５０ｍｍｋａｋｅｒｕ４．６ｍｍ））
【0108】
また、高速液体クロマトグラフィーは次の条件で行った。
移動相：図１に示すようにメタノールとクロロホルムの流量を経時的に調整した
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：４μＬ
オートサンプラー温度：１５℃
検出器ＥＬＳＤ温度：４０℃
ＥＬＳＤ検出感度：Ｇａｉｎ ８
カラム温度：５０℃
移動相：図１に示すようにメタノールとクロロホルムの流量を経時的に調整した
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：４μＬ
オートサンプラー温度：１５℃
検出器ＥＬＳＤ温度：４０℃
ＥＬＳＤ検出感度：Ｇａｉｎ ８
カラム温度：５０℃
【0109】
＜段階（ｉｉ）：試験例におけるサンプルＢの調製＞
試験例では、前記によってサンプルＡを調製した後、試験溶媒を、サンプルＡの容量１ｍｌあたり５．２ｍｌとなるように添加してサンプルＢを得、ボルテックスで攪拌した後、振盪機（マルチシェイカー；ＥＹＥＬＡ；ＭＵＬＴＩ ＳＨＡＫＥＲ ＭＭＳ）で１時間、２０℃で振盪（１２０ｒｐｍ）した（段階（ｉｉ‘））。その後、１０分間静置した。
試験例では、前記によってサンプルＡを調製した後、試験溶媒を、サンプルＡの容量１ｍｌあたり５．２ｍｌとなるように添加してサンプルＢを得、ボルテックスで攪拌した後、振盪機（マルチシェイカー；ＥＹＥＬＡ；ＭＵＬＴＩ ＳＨＡＫＥＲ ＭＭＳ）で１時間、２０℃で振盪（１２０ｒｐｍ）した（段階（ｉｉ‘））。その後、１０分間静置した。
【0110】
＜段階（ｉｉｉ）：試験例における上層サンプルＣ１及び下層サンプルＣ２の調製＞
次に、サンプルＢを卓上遠心機で２０℃、１０分間、３０００ｒｐｍで遠心し、上層サンプルＣ１と下層サンプルＣ２を得た。
次に、サンプルＢを卓上遠心機で２０℃、１０分間、３０００ｒｐｍで遠心し、上層サンプルＣ１と下層サンプルＣ２を得た。
【0111】
次に、上層サンプルＣ１を１００ｍｌナスフラスコに採取した。
【0112】
また、下層サンプルＣ２に対して、適宜水及び試験溶媒を、添加して、再度振蕩、遠心し、その上層を、サンプルＣ１を採取したものと同じナスフラスコに採取した。
【0113】
次に、ナスフラスコに採取した試料を、ロータリーエバポレーターに供して溶媒を除去（試料を濃縮；段階（ｉｉｉ‘））し、得られた残渣に対し、クロロホルム：メタノール：超純水（ＭｉｌｌｉＱウォーター）比が６０：３０：４．５となる溶媒を添加し、分析検体とした。当該検体をバイアルへ封入し、高速液体クロマトグラフィーに供し、ＥＬＳＤにて検出した。なお、検体中のセラミド含有量の定量に際しては、濃度既知のセラミド標品（長良サイエンス社製；Ｃｅｒａｍｉｄｅ ｆｒｏｍ Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｍａｌｏｒｕｍ（Ｃｅｒａｍｉｄｅ ｍｉｘ））を、前記と同様に高速液体クロマトグラフィーに供し、検量線を作成した。
【0114】
＜高速液体クロマトグラフィー＞
高速液体クロマトグラフィーは、次の条件で行った。
・カラム：Ｄｉｏｌ－ＨＩＬＩＣカラム（ＹＭＣ：ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｄｉｏｌ－ＨＩＬＩＣ４．６×２５０ｍｍ、基材：有機シリカハイブリッド、粒子径：１．９μｍ, ３μｍ, ５μｍ、細孔径：１２ｎｍ、使用ｐＨレンジ２～１０）
・移動相：図２に示すようにヘキサン、ｔ－ブチルメチルエーテル、メタノールの流量を経時的に調整した
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：１０μＬ
・オートサンプラー温度：２０℃
・検出器ＥＬＳＤ温度：４０℃
・ＥＬＳＤ検出感度：Ｇａｉｎ６
・カラム温度：３０℃
高速液体クロマトグラフィーは、次の条件で行った。
・カラム：Ｄｉｏｌ－ＨＩＬＩＣカラム（ＹＭＣ：ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｄｉｏｌ－ＨＩＬＩＣ４．６×２５０ｍｍ、基材：有機シリカハイブリッド、粒子径：１．９μｍ, ３μｍ, ５μｍ、細孔径：１２ｎｍ、使用ｐＨレンジ２～１０）
・移動相：図２に示すようにヘキサン、ｔ－ブチルメチルエーテル、メタノールの流量を経時的に調整した
・流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ：１０μＬ
・オートサンプラー温度：２０℃
・検出器ＥＬＳＤ温度：４０℃
・ＥＬＳＤ検出感度：Ｇａｉｎ６
・カラム温度：３０℃
【0115】
＜ピーク評価＞
高速液体クロマトグラフィーのピークを観察し、図３のようにベースラインにおけるドリフト、うねりやノイズが抑制され、目的成分ピーク前後で略水平となっている場合は評価〇、図４のようにそうでない場合は評価×とした。なお、図３は試験例４の、図４は比較例２の結果である。
高速液体クロマトグラフィーのピークを観察し、図３のようにベースラインにおけるドリフト、うねりやノイズが抑制され、目的成分ピーク前後で略水平となっている場合は評価〇、図４のようにそうでない場合は評価×とした。なお、図３は試験例４の、図４は比較例２の結果である。
【0116】
＜誤差評価＞
各分析検体で３回反復試験を行い、分析検体中の酢酸菌体含有量に対するセラミド含有量（ｗ／ｗ％）を算出した。測定結果に基づく算出値（ｎ＝３）が、いずれも０．８ｗ／ｗ％から誤差範囲±１５％未満（酢酸菌体含有量に対するセラミド含有量が０．６８～０．９２ｗ／ｗ％）の範囲にある場合、誤差評価〇とした。その他の場合は、誤差評価×とした。測定値の誤差は、酢酸菌体含有量に対するセラミド含有量を原料状態で測定し、酢酸菌体配合量から組成物中のセラミド含有量を計算した値を理論値として算出した。
各分析検体で３回反復試験を行い、分析検体中の酢酸菌体含有量に対するセラミド含有量（ｗ／ｗ％）を算出した。測定結果に基づく算出値（ｎ＝３）が、いずれも０．８ｗ／ｗ％から誤差範囲±１５％未満（酢酸菌体含有量に対するセラミド含有量が０．６８～０．９２ｗ／ｗ％）の範囲にある場合、誤差評価〇とした。その他の場合は、誤差評価×とした。測定値の誤差は、酢酸菌体含有量に対するセラミド含有量を原料状態で測定し、酢酸菌体配合量から組成物中のセラミド含有量を計算した値を理論値として算出した。
【0117】
＜結果＞
結果を表２に示す。なお、比較例２では、試料をロータリーエバポレーターで濃縮した際に試料が湿け、べたついてしまい、脂溶性成分以外の夾雑物が分析検体に含有されることが推察された。また、試験例１、３、及び４では乳化香料、脱脂粉乳、香料等をサンプルＡに配合したが、優れた結果が得られた。
結果を表２に示す。なお、比較例２では、試料をロータリーエバポレーターで濃縮した際に試料が湿け、べたついてしまい、脂溶性成分以外の夾雑物が分析検体に含有されることが推察された。また、試験例１、３、及び４では乳化香料、脱脂粉乳、香料等をサンプルＡに配合したが、優れた結果が得られた。
【0118】
【表2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2023-12-01
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
次の（ｉ）～（ｉＶ）段階を含む、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の分析方法。
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール／水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール／水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
【請求項2】
（ｉ）段階において、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項3】
（ｉ）段階において、サンプルＡにおける被測定対象脂溶性成分のうち、４０ｗ／ｗ％以上が細胞又は組織に含有される、請求項２記載の方法。
【請求項4】
（ｉ）段階において、被測定対象脂溶性成分を含む細胞若しくは組織として酢酸菌体を含有する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
（ｉ）段階において、サンプルＡが可溶性糖類を含有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項6】
（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する可溶性糖類の含有量が、０．１～３０ｗ／ｖ％である、請求項５記載の方法。
【請求項7】
（ｉ）段階において、サンプルＡが、被測定対象脂溶性成分としてセラミドを含有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項8】
（ｉ）段階において、サンプルＡが、酢酸菌生成物を含有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項9】
（ｉ）段階において、サンプルＡが酢酸を含有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項10】
（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する酢酸含有量が０．０２～１５ｗ／ｖ％である、請求項９記載の方法
【請求項11】
（ｉ）段階において、親水性溶媒の２０℃における密度が１．００３ｇ／ｍｌ以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項12】
（ｉ）段階において、親水性溶媒のｐＨが４．５以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項13】
（ｉ）段階において、サンプルＡの総タンパク質含有量が１５ｗ／ｖ％以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項14】
（ｉ）段階において、サンプルＡの波長６６０ｎｍにおける濁度が１．１００以上である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項15】
（ｉ）段階において、サンプルＡが飲食品である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項16】
（ｉｉ）段階において、媒体ａがｔ－ブチルメチルエーテルを含有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項17】
（ｉｉ）段階において、媒体ａがメタノールを含有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項18】
（ｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉ‘）段階を含む、請求項１又は２に記載の方法。
（ｉｉ‘）サンプルＢを１０～１４４０分間混合する段階
（ｉｉ‘）サンプルＢを１０～１４４０分間混合する段階
【請求項19】
（ｉｉｉ）段階において、下層サンプルＣ２に沈殿が存在する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項20】
（ｉｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉｉ‘）段階を含む、請求項１又は２に記載の方法。
（ｉｉｉ‘）上層サンプルＣ１をさらに濃縮する段階
（ｉｉｉ‘）上層サンプルＣ１をさらに濃縮する段階
【請求項21】
（ｉＶ）段階が、サンプルＣ１を高速液体クロマトグラフィーに付す段階である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項22】
前記段階（ｉＶ）において、高速液体クロマトグラフィーの移動相に少なくとも３種の有機溶媒を使用する、請求項２１記載の方法。
【請求項23】
次の（ｉ）～（ｉＶ）段階を含む、サンプルＡ中の被測定対象脂溶性成分の経時的な含有量変化を分析する方法。
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール／水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール／水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉＶ）サンプルＣ１中の被測定対象脂溶性成分含有量を測定する段階
【請求項24】
次の（ｉ）～（ｉｉｉ）段階を含む、被測定対象脂溶性成分を含む分析検体の製造方法。
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
（ｉ）被測定対象脂溶性成分と、親水性溶媒５０ｗ／ｖ％以上とを含有するサンプルＡを準備又は調整する段階
（ｉｉ）次の要件（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）を満たすように、サンプルＡに媒体ａを添加してサンプルＢを得る段階
要件（Ｘ）：２０℃における媒体ａの密度が０．９９８ｇ／ｍｌ未満である
要件（Ｙ）：媒体ａが、オクタノール/水分配係数が０．５０～４．０である少なくとも１種の有機溶媒を含有する
要件（Ｚ）：２０℃における親水性溶媒と媒体ａとの密度比（媒体ａの密度／親水性溶媒の密度）が０．６０００～０．８５００である
（ｉｉｉ）サンプルＢを相分離し、分析検体である上層サンプルＣ１と、下層サンプルＣ２とを分離する段階
【請求項25】
（ｉ）段階において、サンプルＡが被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織を含有する、請求項２４記載の方法。
【請求項26】
（ｉ）段階において、サンプルＡにおける被測定対象脂溶性成分のうち、４０ｗ／ｗ％以上が細胞又は組織に含有される、請求項２５記載の方法。
【請求項27】
（ｉ）段階において、被測定対象脂溶性成分を含む細胞又は組織として酢酸菌体を含有する、請求項２５又は請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
（ｉ）段階において、サンプルＡが可溶性糖類を含有する、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項29】
（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する可溶性糖類の含有量が、０．１～３０ｗ／ｖ％である、請求項２８記載の方法。
【請求項30】
（ｉ）段階において、サンプルＡが、被測定対象脂溶性成分としてセラミドを含有する、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項31】
（ｉ）段階において、サンプルＡが、酢酸菌生成物を含有する、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項32】
（ｉ）段階において、サンプルＡが酢酸を含有する、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項33】
（ｉ）段階において、サンプルＡの親水性溶媒に対する酢酸含有量が０．０２～１５ｗ／ｖ％である、請求項３２記載の方法。
【請求項34】
（ｉ）段階において、親水性溶媒の２０℃における密度が１．００３ｇ／ｍｌ以上である、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項35】
（ｉ）段階において、親水性溶媒のｐＨが４．５以下である、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項36】
（ｉ）段階において、サンプルＡの総タンパク質含有量が１５ｗ／ｖ％以下である、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項37】
（ｉ）段階において、サンプルＡの波長６６０ｎｍにおける濁度が１．１００以上である、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項38】
（ｉ）段階において、サンプルＡが飲食品である、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項39】
（ｉｉ）段階において、媒体ａがｔ－ブチルメチルエーテルを含有する、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項40】
（ｉｉ）段階において、媒体ａがメタノールを含有する、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項41】
（ｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉ‘）段階を含む、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
（ｉｉ‘）サンプルＢを１０～１４４０分間混合する段階
（ｉｉ‘）サンプルＢを１０～１４４０分間混合する段階
【請求項42】
（ｉｉｉ）段階において、下層サンプルＣ２に沈殿が存在する、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
【請求項43】
（ｉｉｉ）段階の次に、次の（ｉｉｉ‘）段階を含む、請求項２４又は請求項２５に記載の方法。
（ｉｉｉ‘）上層サンプルＣ１をさらに濃縮する段階
（ｉｉｉ‘）上層サンプルＣ１をさらに濃縮する段階