ホーム > 特許ランキング > 雪印メグミルク株式会社
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024079724
(43)【公開日】2024-06-11
(54)【発明の名称】抗菌ペプチド産生促進用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/16 20060101AFI20240604BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240604BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240604BHJP
A23L 33/195 20160101ALI20240604BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240604BHJP
C07K 14/335 20060101ALI20240604BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240604BHJP
A61K 35/747 20150101ALN20240604BHJP
C12R 1/225 20060101ALN20240604BHJP
【ＦＩ】
A61K38/16
A61P31/04
A61P43/00 105
A23L33/195
C12N1/20 E
C07K14/335
A61P31/00
A61K35/747
C12R1:225
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024040721
(22)【出願日】2024-03-15
(62)【分割の表示】P 2020557815の分割
【原出願日】2019-11-28
(31)【優先権主張番号】P 2018223461
(32)【優先日】2018-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】711002926
【氏名又は名称】雪印メグミルク株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小畠 英史
(72)【発明者】
【氏名】冠木 敏秀
(57)【要約】 （修正有）
【課題】本発明の課題は、上皮細胞からの抗菌ペプチド産生を上昇させ、感染予防効果を有する新規な素材を提供することである。
【解決手段】本発明は、ラクトバチルス属の乳酸菌を有効成分とする抗菌ペプチド産生促進用組成物を提供する。また、ラクトバチルス属の菌体由来成分を有効成分とする抗菌ペプチド産生促進用組成物を提供する。さらには、前記菌体由来成分がＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物からなる群から選択される１つ以上である抗菌ペプチド産生促進用組成物を提供する。
【選択図】図３
【解決手段】本発明は、ラクトバチルス属の乳酸菌を有効成分とする抗菌ペプチド産生促進用組成物を提供する。また、ラクトバチルス属の菌体由来成分を有効成分とする抗菌ペプチド産生促進用組成物を提供する。さらには、前記菌体由来成分がＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物からなる群から選択される１つ以上である抗菌ペプチド産生促進用組成物を提供する。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラクトバチルス属（ただし、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・アシドフィルス及びラクトバチルス・ファーメンタムを除く）の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び前記Ｓ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物からなる群から選択される１つ以上を有効成分として含む抗菌ペプチド産生促進用組成物。
【請求項2】
前記ラクトバチルス属の乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アミロボラス又はラクトバチルス・ブフネリである請求項１に記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物。
【請求項3】
抗菌ペプチドがβ‐ディフェンシンである請求項１又は２に記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物。
【請求項4】
上皮細胞における抗菌ペプチドの産生促進である請求項１～３のいずれか１つに記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物。
【請求項5】
請求項１から請求項４のいずれか１つに記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物を含む抗菌ペプチド産生促進用飲食品。
【請求項6】
感染予防用である請求項５に記載の抗菌ペプチド産生促進用飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗菌ペプチド産生促進用組成物に関する。特に、ラクトバチルス属乳酸菌を含む抗菌ペプチド産生促進用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
抗菌ペプチドは生体が有する防御システムの一つであり、細菌、真菌、ウイルスなどに対して広い抗菌活性を有する。抗菌ペプチドの発現を誘導することにより、感染に対する予防、治療効果が期待できることから、これまでにいくつかの抗菌ペプチド産生を上昇させるための解決手段が開示されている。
特許文献１は、非病原性細菌を用いて皮膚細胞におけるβディフェンシン産生を刺激することを課題とし、その解決手段として加熱処理したラクトバチルス・プランタルムの細胞を含む抽出物、およびその活性画分を含む組成物を開示している。
特許文献２は、安全で副作用のない抗菌ペプチドの誘導剤を提供することを課題とし、その解決手段として乳酸菌を有効成分として含む抗菌ペプチド誘導剤を開示している。
特許文献３は、抗菌ペプチドの分泌を誘発させる物質を提供し、細菌またはウイルスに起因する疾患に対する治療剤を提供することを課題とし、その解決手段として分岐鎖アミノ酸を有効成分として含有する抗菌ペプチド分泌誘発剤を開示している。
しかしながら、本願の提供する解決手段はいずれの文献にも開示も示唆もされていない。
特許文献１は、非病原性細菌を用いて皮膚細胞におけるβディフェンシン産生を刺激することを課題とし、その解決手段として加熱処理したラクトバチルス・プランタルムの細胞を含む抽出物、およびその活性画分を含む組成物を開示している。
特許文献２は、安全で副作用のない抗菌ペプチドの誘導剤を提供することを課題とし、その解決手段として乳酸菌を有効成分として含む抗菌ペプチド誘導剤を開示している。
特許文献３は、抗菌ペプチドの分泌を誘発させる物質を提供し、細菌またはウイルスに起因する疾患に対する治療剤を提供することを課題とし、その解決手段として分岐鎖アミノ酸を有効成分として含有する抗菌ペプチド分泌誘発剤を開示している。
しかしながら、本願の提供する解決手段はいずれの文献にも開示も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特許第５２２４８０７号公報
【特許文献2】ＷＯ２０１５／０８７９１９パンフレット
【特許文献3】特開２００３－９５９３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の課題は、上皮細胞からの抗菌ペプチド産生を上昇させ、感染予防効果を有する新規な素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0005】
上記課題を解決するため、本発明には以下の構成が含まれる。
〔１〕ラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び前記Ｓ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物からなる群から選択される１つ以上を有効成分として含むことを特徴とする抗菌ペプチド産生促進用組成物。
〔２〕ラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び前記Ｓ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物を含むラクトバチルス・ヘルベティカス菌体又はその培養物を有効成分として含む抗菌ペプチド産生促進用組成物。
〔３〕前記ラクトバチルス属の乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボラス又はラクトバチルス・ブフネリである〔１〕又は[２]に記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物。
〔４〕抗菌ペプチドがβ‐ディフェンシンである〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物。
〔５〕抗菌ペプチド産生促進が、上皮細胞における抗菌ペプチドの産生促進である〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物。
〔６〕〔１〕から〔５〕のいずれか１つに記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物を含む抗菌ペプチド産生促進用飲食品。
〔７〕〔１〕から〔５〕のいずれか１つに記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物を含む感染予防用飲食品。
〔１〕ラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び前記Ｓ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物からなる群から選択される１つ以上を有効成分として含むことを特徴とする抗菌ペプチド産生促進用組成物。
〔２〕ラクトバチルス属の菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び前記Ｓ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物を含むラクトバチルス・ヘルベティカス菌体又はその培養物を有効成分として含む抗菌ペプチド産生促進用組成物。
〔３〕前記ラクトバチルス属の乳酸菌がラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボラス又はラクトバチルス・ブフネリである〔１〕又は[２]に記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物。
〔４〕抗菌ペプチドがβ‐ディフェンシンである〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物。
〔５〕抗菌ペプチド産生促進が、上皮細胞における抗菌ペプチドの産生促進である〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物。
〔６〕〔１〕から〔５〕のいずれか１つに記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物を含む抗菌ペプチド産生促進用飲食品。
〔７〕〔１〕から〔５〕のいずれか１つに記載の抗菌ペプチド産生促進用組成物を含む感染予防用飲食品。
【発明の効果】
【0006】
ラクトバチルス属乳酸菌に由来するＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、以下ＳＬＰということがある）およびその分解物、もしくはＳＬＰを含むラクトバチルス属乳酸菌菌体およびその培養物などの抗菌ペプチド産生を誘導する素材を体内に摂取することにより、種々の感染に対する防御能の向上が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】精製したＳＬＰをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた結果を示す写真である。
【図2】ＳＬＰ、加熱したＳＬＰ、ＳＬＰ分解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた結果を示す写真である。
【図3】Ｃａｃｏ－２細胞にラクトバチルス・ヘルベティカス乳酸菌菌体又は当該乳酸菌のＳＬＰを添加した場合のｈＢＤ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図4】Ｃａｃｏ－２細胞にラクトバチルス・ヘルベティカスのＳＬＰ、加熱したＳＬＰ、ＳＬＰ分解物を添加した場合のｈＢＤ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図5】Ｃａｃｏ－２細胞にラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１、ラクトバチルス・アシドフィルスＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１１２６、ラクトバチルス・ブフネリＪＣＭ１１１５から調製したＳＬＰを添加した場合のｈＢＤ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【図6】ＨＳＣ－４細胞にラクトバチルス・ヘルベティカス乳酸菌菌体又は当該乳酸菌のＳＬＰを添加した場合のｈＢＤ２遺伝子の発現量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明は、新規な抗菌ペプチド産生促進用組成物を提供するものである。
本発明の抗菌ペプチド産生促進用組成物について以下に詳細に説明する。
（抗菌ペプチド産生促進用組成物）
Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、単にＳＬＰということがある）は種々の細菌の細胞壁外層で認められ、規則的な結晶構造を呈することを特徴とするタンパク質である。ＳＬＰは細胞壁成分に非共有的に結合していることから、塩化リチウムなどのカオトロピック試薬によって菌体から抽出される。また、抽出されたＳＬＰはカオトロピック試薬を除くことで規則的な結晶構造を再形成する。この特徴を利用し、菌体からの精製が可能となる。
乳酸菌の中ではラクトバチルス属においてＳ－ｌａｙｅｒを発現していることが見出されており、向井らの報告（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，１９（１）：２１－２９，２００８）ではラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループ乳酸菌をはじめとする１３菌種でＳＬＰの発現が確認もしくは推定されている。これらの乳酸菌が発現しているＳＬＰには、等電点が９～１０の塩基性タンパク質であること、Ｎ末端領域に２３～３０アミノ酸残基からなるシグナルペプチド配列を持つことといった共通点がある。本発明の抗菌ペプチド産生促進用組成物に用いるＳＬＰは、ラクトバチルス属に由来し、当該作用を有するものであればどのようなものでも用いることができるが、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボラス又はラクトバチルス・ブフネリが好ましい。ラクトバチルス・ヘルベティカスのうちではＳＢＴ２１７１（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４４５）が最も好ましい。
また、ＳＬＰは菌体から精製されたものである必要はなく、ＳＬＰを含む菌体自体や培養物としても用いることができるが、精製したＳＬＰがより好ましい。菌体自体は、生菌体でも死菌体でもよい。
抗菌ペプチドとしては、ディフェンシンファミリー（α－ディフェンシン、β－ディフェンシンなど）、カセリシジン（ＬＬ－３７）、ダームシジン、ＬＥＡＰ－１（ヘプシジン）、ＬＥＡＰ－２、ラクトフェリン、Ｒｅｇペプチドなどが挙げられ、このうちでもディフェンシンファミリーが好ましく、β－ディフェンシンがさらに好ましい。
本発明の抗菌ペプチド産生促進用組成物について以下に詳細に説明する。
（抗菌ペプチド産生促進用組成物）
Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、単にＳＬＰということがある）は種々の細菌の細胞壁外層で認められ、規則的な結晶構造を呈することを特徴とするタンパク質である。ＳＬＰは細胞壁成分に非共有的に結合していることから、塩化リチウムなどのカオトロピック試薬によって菌体から抽出される。また、抽出されたＳＬＰはカオトロピック試薬を除くことで規則的な結晶構造を再形成する。この特徴を利用し、菌体からの精製が可能となる。
乳酸菌の中ではラクトバチルス属においてＳ－ｌａｙｅｒを発現していることが見出されており、向井らの報告（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ，１９（１）：２１－２９，２００８）ではラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）グループ乳酸菌をはじめとする１３菌種でＳＬＰの発現が確認もしくは推定されている。これらの乳酸菌が発現しているＳＬＰには、等電点が９～１０の塩基性タンパク質であること、Ｎ末端領域に２３～３０アミノ酸残基からなるシグナルペプチド配列を持つことといった共通点がある。本発明の抗菌ペプチド産生促進用組成物に用いるＳＬＰは、ラクトバチルス属に由来し、当該作用を有するものであればどのようなものでも用いることができるが、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・アミロボラス又はラクトバチルス・ブフネリが好ましい。ラクトバチルス・ヘルベティカスのうちではＳＢＴ２１７１（ＦＥＲＭ ＢＰ－５４４５）が最も好ましい。
また、ＳＬＰは菌体から精製されたものである必要はなく、ＳＬＰを含む菌体自体や培養物としても用いることができるが、精製したＳＬＰがより好ましい。菌体自体は、生菌体でも死菌体でもよい。
抗菌ペプチドとしては、ディフェンシンファミリー（α－ディフェンシン、β－ディフェンシンなど）、カセリシジン（ＬＬ－３７）、ダームシジン、ＬＥＡＰ－１（ヘプシジン）、ＬＥＡＰ－２、ラクトフェリン、Ｒｅｇペプチドなどが挙げられ、このうちでもディフェンシンファミリーが好ましく、β－ディフェンシンがさらに好ましい。
【0009】
（抗菌ペプチド産生促進用組成物の製造方法）
ＳＬＰは以下の方法に従って乳酸菌菌体より精製する。対象とするラクトバチルス属乳酸菌をＭＲＳ液体培地などの液体培地、もしくは脱脂乳で十分に培養した後に菌体を回収し、必要に応じて洗浄を行う。菌体は、寒天培地などに生育させたコロニーから回収してもよい。得られた菌体をそのまま、もしくは凍結乾燥した後に、塩化リチウム、尿素、塩酸グアニジンなどのカオトロピック試薬溶液で懸濁、攪拌して菌体表層のＳＬＰを可溶化する。可溶化したＳＬＰを含む溶液から固形物を除いた後、透析などによってカオトロピック試薬を除き、ＳＬＰを析出させる。析出したＳＬＰを回収後、必要に応じて洗浄を行い、精製ＳＬＰとする。本発明の抗菌ペプチド産生促進用組成物に用いるＳＬＰは加熱しても抗菌ペプチド促進作用が維持されることから加熱されたものであってもよい。
ＳＬＰは以下の方法に従って乳酸菌菌体より精製する。対象とするラクトバチルス属乳酸菌をＭＲＳ液体培地などの液体培地、もしくは脱脂乳で十分に培養した後に菌体を回収し、必要に応じて洗浄を行う。菌体は、寒天培地などに生育させたコロニーから回収してもよい。得られた菌体をそのまま、もしくは凍結乾燥した後に、塩化リチウム、尿素、塩酸グアニジンなどのカオトロピック試薬溶液で懸濁、攪拌して菌体表層のＳＬＰを可溶化する。可溶化したＳＬＰを含む溶液から固形物を除いた後、透析などによってカオトロピック試薬を除き、ＳＬＰを析出させる。析出したＳＬＰを回収後、必要に応じて洗浄を行い、精製ＳＬＰとする。本発明の抗菌ペプチド産生促進用組成物に用いるＳＬＰは加熱しても抗菌ペプチド促進作用が維持されることから加熱されたものであってもよい。
【0010】
（ＳＬＰ分解物）
ＳＬＰ分解物は以下の方法に従って調製する。ＳＬＰの懸濁液に対して種々のプロテアーゼを適当な濃度で添加し、適宜反応させる。プロテアーゼの種類およびプロテアーゼ分解の程度は限定されるものではない。一例としてプロティナーゼＫで分解処理する条件としては、３７℃で２時間～２４時間が望ましく、３時間～２０時間がより好ましい。
ＳＬＰ分解物は以下の方法に従って調製する。ＳＬＰの懸濁液に対して種々のプロテアーゼを適当な濃度で添加し、適宜反応させる。プロテアーゼの種類およびプロテアーゼ分解の程度は限定されるものではない。一例としてプロティナーゼＫで分解処理する条件としては、３７℃で２時間～２４時間が望ましく、３時間～２０時間がより好ましい。
【0011】
（摂取量）
ＳＬＰによる抗菌ペプチド産生促進作用は分解物の状態でも発揮されることから、経口的に摂取した後に胃酸による分解を受けても作用への影響は小さいものと考えられる。このことから、ＳＬＰを食品に添加して経口的に摂取することが望ましい。摂取量については特に制限しないが、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の場合、概算でＳＬＰ１ｍｇ／日を継続的に摂取することで抗菌ペプチドの誘導が期待できると考えられる。
ＳＬＰによる抗菌ペプチド産生促進作用は分解物の状態でも発揮されることから、経口的に摂取した後に胃酸による分解を受けても作用への影響は小さいものと考えられる。このことから、ＳＬＰを食品に添加して経口的に摂取することが望ましい。摂取量については特に制限しないが、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の場合、概算でＳＬＰ１ｍｇ／日を継続的に摂取することで抗菌ペプチドの誘導が期待できると考えられる。
【0012】
（食品、医薬品、飼料への配合）
精製したＳＬＰは加熱処理によって抗菌ペプチド産生促進作用を失わないことから、常法に従って食品、医薬品、飼料に配合することが可能である。
本発明の抗菌ペプチド産生促進用組成物を含む飲食品は、抗菌ペプチド産生促進用飲食品としての利用価値があり、本飲食品を摂取することにより、上皮細胞からの抗菌ペプチド産生を促進し、様々な感染からの予防ができ、また感染した場合でも軽症に抑えられ、また早い回復が期待できる。動物用飼料に含まれる場合は、これを摂取した動物に同様の効果が期待できる。
また、本発明の抗菌ペプチド産生促進用組成物を含む医薬は、抗菌ペプチドの産生が促進されることにより治療または予防できる疾患に使うことができる。例えば、病原菌による各種の感染症などが挙げられる。
精製したＳＬＰは加熱処理によって抗菌ペプチド産生促進作用を失わないことから、常法に従って食品、医薬品、飼料に配合することが可能である。
本発明の抗菌ペプチド産生促進用組成物を含む飲食品は、抗菌ペプチド産生促進用飲食品としての利用価値があり、本飲食品を摂取することにより、上皮細胞からの抗菌ペプチド産生を促進し、様々な感染からの予防ができ、また感染した場合でも軽症に抑えられ、また早い回復が期待できる。動物用飼料に含まれる場合は、これを摂取した動物に同様の効果が期待できる。
また、本発明の抗菌ペプチド産生促進用組成物を含む医薬は、抗菌ペプチドの産生が促進されることにより治療または予防できる疾患に使うことができる。例えば、病原菌による各種の感染症などが挙げられる。
【0013】
（評価方法）
抗菌ペプチド産生促進作用とは、対象における抗菌ペプチドの産生が促進される作用をいい、抗菌ペプチドを発現するための遺伝子の発現が誘導されることにより抗菌ペプチドが発現されることをいう。したがって、本明細書中、抗菌ペプチド産生促進作用と抗菌ペプチド誘導作用とは同義で用いられる。
本発明のＳＬＰによる抗菌ペプチド誘導作用は以下に示す方法で評価する。培養細胞に対してＳＬＰもしくはその分解物を添加し、所定の時間作用させた後に抗菌ペプチド遺伝子の発現量を測定する。評価には種々の細胞を用いることができるが、特に生体外との接触が想定される上皮細胞が好ましい。また、測定される抗菌ペプチドは限定されるものではないが、ディフェンシンファミリーが好ましく、上皮細胞から分泌されるβ‐ディフェンシンが特に好ましい。
抗菌ペプチド産生促進作用とは、対象における抗菌ペプチドの産生が促進される作用をいい、抗菌ペプチドを発現するための遺伝子の発現が誘導されることにより抗菌ペプチドが発現されることをいう。したがって、本明細書中、抗菌ペプチド産生促進作用と抗菌ペプチド誘導作用とは同義で用いられる。
本発明のＳＬＰによる抗菌ペプチド誘導作用は以下に示す方法で評価する。培養細胞に対してＳＬＰもしくはその分解物を添加し、所定の時間作用させた後に抗菌ペプチド遺伝子の発現量を測定する。評価には種々の細胞を用いることができるが、特に生体外との接触が想定される上皮細胞が好ましい。また、測定される抗菌ペプチドは限定されるものではないが、ディフェンシンファミリーが好ましく、上皮細胞から分泌されるβ‐ディフェンシンが特に好ましい。
【実施例0014】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0015】
本試験に用いたラクトバチルス属の菌体、ＳＬＰ、ＳＬＰ分解物の調製例を以下に示す。
（ラクトバチルス属乳酸菌菌体の調製例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１をＭＲＳ液体培地１００ｍＬで３７℃、１６時間培養後、遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、１０分間）にて菌体を回収し、生理食塩水で２回、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で１回洗浄し、さらに凍結乾燥を実施した（凍結乾燥菌体）。
以下の試験では、凍結乾燥菌体を用いた。
（ラクトバチルス属乳酸菌菌体の調製例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１をＭＲＳ液体培地１００ｍＬで３７℃、１６時間培養後、遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、１０分間）にて菌体を回収し、生理食塩水で２回、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で１回洗浄し、さらに凍結乾燥を実施した（凍結乾燥菌体）。
以下の試験では、凍結乾燥菌体を用いた。
【0016】
（ＳＬＰの調製例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１をＭＲＳ液体培地１００ｍＬで３７℃、１６時間培養後、遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、１０分間）にて菌体を回収し、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で１回洗浄した。得られた菌体はｃＯｍｐｌｅｔｅTM Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した１Ｍ ＬｉＣｌ溶液１０ｍＬで懸濁し、室温で３０分間攪拌した。攪拌後の懸濁液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、上清を回収した。沈殿はｃＯｍｐｌｅｔｅTMＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した５Ｍ ＬｉＣｌ
溶液１０ｍＬで再懸濁し、室温で再度３０分間攪拌した。攪拌後の懸濁液は遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、上清を回収した。回収した上清をまとめ、０．２μｍフィルターを通した後にＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ １０Ｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）で滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に対して透析することでＳＬＰを析出させた。透析後の溶液を遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、析出したＳＬＰを回収した。回収したＳＬＰは滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１ｍＬで洗浄後、１Ｍ ＬｉＣｌ溶液５００μＬに懸濁し、適宜攪拌しながら氷上で１５分間保持した。遠心分離によってＬｉＣｌ溶液を除き、再度滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１ｍＬで洗浄、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁して凍結乾燥したものを精製ＳＬＰとした。
精製後のＳＬＰは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法によって目的サイズの４３ｋＤａ付近にバンドが認められることを確認した（図１）。また、得られたＳＬＰは３ｍｇであった。
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１をＭＲＳ液体培地１００ｍＬで３７℃、１６時間培養後、遠心分離（８，０００×ｇ、４℃、１０分間）にて菌体を回収し、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水で１回洗浄した。得られた菌体はｃＯｍｐｌｅｔｅTM Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した１Ｍ ＬｉＣｌ溶液１０ｍＬで懸濁し、室温で３０分間攪拌した。攪拌後の懸濁液を遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、上清を回収した。沈殿はｃＯｍｐｌｅｔｅTMＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を添加した５Ｍ ＬｉＣｌ
溶液１０ｍＬで再懸濁し、室温で再度３０分間攪拌した。攪拌後の懸濁液は遠心分離（１０，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、上清を回収した。回収した上清をまとめ、０．２μｍフィルターを通した後にＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ １０Ｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）で滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に対して透析することでＳＬＰを析出させた。透析後の溶液を遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃、２０分間）し、析出したＳＬＰを回収した。回収したＳＬＰは滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１ｍＬで洗浄後、１Ｍ ＬｉＣｌ溶液５００μＬに懸濁し、適宜攪拌しながら氷上で１５分間保持した。遠心分離によってＬｉＣｌ溶液を除き、再度滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１ｍＬで洗浄、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水に再懸濁して凍結乾燥したものを精製ＳＬＰとした。
精製後のＳＬＰは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法によって目的サイズの４３ｋＤａ付近にバンドが認められることを確認した（図１）。また、得られたＳＬＰは３ｍｇであった。
【0017】
（ＳＬＰ分解物の調製例）
５ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで懸濁したＳＬＰに、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ｆｒｏｍ Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ，Ｐ６５５６：Ｓｉｇｍａ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で一晩反応させた。反応後のＳＬＰを９６℃で１０分間加熱してｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを不活化し、ＳＬＰ分解物とした。比較のため、ＰＢＳで懸濁したＳＬＰ、ＰＢＳで懸濁して９６℃で１０分間加熱したＳＬＰ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで分解したＳＬＰについてＳＤＳ－ＰＡＧＥ法でバンドの確認を行った（図２）。加熱したＳＬＰはＳＬＰと同様の４３ｋＤａ付近のほかに３７ｋＤａ付近、５ｋＤａ付近にもバンドが見られた。また、ＳＬＰ分解物は５ｋＤａ以上の明確なバンドは見られなかった。
５ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで懸濁したＳＬＰに、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ｆｒｏｍ Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ ａｌｂｕｍ，Ｐ６５５６：Ｓｉｇｍａ）（１０ｍｇ／ｍＬ）を終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で一晩反応させた。反応後のＳＬＰを９６℃で１０分間加熱してｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを不活化し、ＳＬＰ分解物とした。比較のため、ＰＢＳで懸濁したＳＬＰ、ＰＢＳで懸濁して９６℃で１０分間加熱したＳＬＰ、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで分解したＳＬＰについてＳＤＳ－ＰＡＧＥ法でバンドの確認を行った（図２）。加熱したＳＬＰはＳＬＰと同様の４３ｋＤａ付近のほかに３７ｋＤａ付近、５ｋＤａ付近にもバンドが見られた。また、ＳＬＰ分解物は５ｋＤａ以上の明確なバンドは見られなかった。
【0018】
〔試験例１〕抗菌ペプチド誘導活性の評価（１）菌体との比較
１．試験方法
継代培養したＣａｃｏ－２細胞（ヒト腸管上皮細胞）を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう１２ｗｅｌｌプレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩培養した。培養には、ＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ５７９６：Ｓｉｇｍａ）にＦＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１０％）（Ｌｏｔ．１１Ｄ２６４：Ｓｉｇｍａ）、ＮＥＡＡ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１×）（Ｍ７１４５：Ｓｉｇｍａ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１００Ｕ－１００μｇ／ｍＬ）（１５１４０－１２２：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して使用した。培養後、細胞が７０～８０％コンフルエントに達していることを確認するとともに、培地を除きＦＢＳおよび抗生物質を添加していない培地（ＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ＋１×ＮＥＡＡ）に交換、３７℃でさらに２４時間培養した。培養後の１２ｗｅｌｌプレートから培地を除き、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体もしくはラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰを１０もしくは５０μｇ／ｍＬ含む培地を添加、６時間培養した。培養後の１２ｗｅｌｌプレートから培地を除き、ＰＢＳで洗浄した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞からトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で濃度を測定した。
抽出したトータルＲＮＡ溶液から、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓ ｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ(登録商標）Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ）を使用した。得られた逆転写反応液をｔｅｍｐｌａｔｅ ｃＤＮＡとしてリアルタイムＰＣＲに供した。
リアルタイムＰＣＲにはＴａｑＭａｎ(登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃４４４４５５６）およびＴａｑＭａｎＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ｈＢＤ２：Ｈｓ００１７５４７４＿ｍ１、ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。反応には３８４ウェルプレート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃４３０９８４９）を用い、ＶｉｉＡTM７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ポジティブコントロール（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＬＰＳを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、各水準の遺伝子発現はΔΔＣｔ法によってポジティブコントロールに対する相対発現量として評価した。試験はｎ＝３で実施し、増幅が認められなかったサンプルを含む水準は非検出（ｎ．ｄ．：ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ）とした。
１．試験方法
継代培養したＣａｃｏ－２細胞（ヒト腸管上皮細胞）を２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう１２ｗｅｌｌプレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩培養した。培養には、ＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ５７９６：Ｓｉｇｍａ）にＦＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１０％）（Ｌｏｔ．１１Ｄ２６４：Ｓｉｇｍａ）、ＮＥＡＡ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１×）（Ｍ７１４５：Ｓｉｇｍａ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１００Ｕ－１００μｇ／ｍＬ）（１５１４０－１２２：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して使用した。培養後、細胞が７０～８０％コンフルエントに達していることを確認するとともに、培地を除きＦＢＳおよび抗生物質を添加していない培地（ＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ＋１×ＮＥＡＡ）に交換、３７℃でさらに２４時間培養した。培養後の１２ｗｅｌｌプレートから培地を除き、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体もしくはラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰを１０もしくは５０μｇ／ｍＬ含む培地を添加、６時間培養した。培養後の１２ｗｅｌｌプレートから培地を除き、ＰＢＳで洗浄した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて細胞からトータルＲＮＡを抽出した。抽出したトータルＲＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で濃度を測定した。
抽出したトータルＲＮＡ溶液から、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓ ｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）を用いてｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ(登録商標）Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ）を使用した。得られた逆転写反応液をｔｅｍｐｌａｔｅ ｃＤＮＡとしてリアルタイムＰＣＲに供した。
リアルタイムＰＣＲにはＴａｑＭａｎ(登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃４４４４５５６）およびＴａｑＭａｎＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ（ｈＢＤ２：Ｈｓ００１７５４７４＿ｍ１、ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ０３９２９０９７＿ｇ１）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。反応には３８４ウェルプレート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃４３０９８４９）を用い、ＶｉｉＡTM７（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。ポジティブコントロール（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）としてＬＰＳを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、各水準の遺伝子発現はΔΔＣｔ法によってポジティブコントロールに対する相対発現量として評価した。試験はｎ＝３で実施し、増幅が認められなかったサンプルを含む水準は非検出（ｎ．ｄ．：ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ）とした。
【0019】
２．試験結果
評価の結果、ＳＢＴ２１７１菌体およびＳＬＰ共にｈＢＤ２遺伝子の発現上昇が認められた（図３）。ＳＢＴ２１７１菌体では添加濃度１０μｇ／ｍＬでポジティブコントロールの約３倍、添加濃度５０μｇ／ｍＬで約２８倍のｈＢＤ２遺伝子発現が認められた。一方、ＳＬＰでは添加濃度１０μｇ／ｍＬで約１９倍、５０μｇ／ｍＬで約４５倍の遺伝子発現が認められた。この結果より、ＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰは、ＳＢＴ２１７１菌体よりも強い抗菌ペプチド誘導作用を有すると考えられた。図中、ａ、ｂ、ｃ、ｄの記号はそれぞれ異なる記号間で有意な差（Ｐ＜０．０５）があること
を示す（以下、図４～６において同じ）。
評価の結果、ＳＢＴ２１７１菌体およびＳＬＰ共にｈＢＤ２遺伝子の発現上昇が認められた（図３）。ＳＢＴ２１７１菌体では添加濃度１０μｇ／ｍＬでポジティブコントロールの約３倍、添加濃度５０μｇ／ｍＬで約２８倍のｈＢＤ２遺伝子発現が認められた。一方、ＳＬＰでは添加濃度１０μｇ／ｍＬで約１９倍、５０μｇ／ｍＬで約４５倍の遺伝子発現が認められた。この結果より、ＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰは、ＳＢＴ２１７１菌体よりも強い抗菌ペプチド誘導作用を有すると考えられた。図中、ａ、ｂ、ｃ、ｄの記号はそれぞれ異なる記号間で有意な差（Ｐ＜０．０５）があること
を示す（以下、図４～６において同じ）。
【0020】
〔試験例２〕抗菌ペプチド誘導活性の評価（２）ＳＬＰ分解物の評価
１．試験方法
上記「試験例１（１）菌体との比較」と同様にＣａｃｏ－２細胞を播種、培地交換した後、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１のＳＬＰをそのままで、９６℃１０分間加熱したもの、もしくはｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理によって分解したものをそれぞれ５０μｇ／ｍＬの濃度となるよう添加し、６時間培養した。その後、上記の通りトータルＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲによるｈＢＤ２遺伝子発現解析を行った。
１．試験方法
上記「試験例１（１）菌体との比較」と同様にＣａｃｏ－２細胞を播種、培地交換した後、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１のＳＬＰをそのままで、９６℃１０分間加熱したもの、もしくはｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理によって分解したものをそれぞれ５０μｇ／ｍＬの濃度となるよう添加し、６時間培養した。その後、上記の通りトータルＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲによるｈＢＤ２遺伝子発現解析を行った。
【0021】
２．試験結果
評価の結果、何も処理していないＳＬＰだけでなく、加熱処理したＳＬＰおよびｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで分解処理したＳＬＰでもポジティブコントロールと比較して顕著に高いｈＢＤ２遺伝子発現が認められた（図４）。この結果より、精製したＳＬＰは分解物の状態でも抗菌ペプチド誘導作用を有すると考えられた。
評価の結果、何も処理していないＳＬＰだけでなく、加熱処理したＳＬＰおよびｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫで分解処理したＳＬＰでもポジティブコントロールと比較して顕著に高いｈＢＤ２遺伝子発現が認められた（図４）。この結果より、精製したＳＬＰは分解物の状態でも抗菌ペプチド誘導作用を有すると考えられた。
【0022】
〔試験例３〕抗菌ペプチド誘導活性の評価（３）菌株比較
１．試験方法
上記「試験例１（１）菌体との比較」と同様にＣａｃｏ－２細胞を播種、培地交換した後、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１、ラクトバチルス・アシドフィルスＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１１２６、ラクトバチルス・ブフネリＪＣＭ１１１５からそれぞれ精製したＳＬＰを１０μｇ／ｍＬの濃度となるよう添加、６時間培養した。その後、上記の通りトータルＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲによるｈＢＤ２遺伝子発現解析を行った。なお、ＳＬＰ無添加の場合をネガティブコントロール（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）としてポジティブコントロールに対する相対発現量として評価した。
１．試験方法
上記「試験例１（１）菌体との比較」と同様にＣａｃｏ－２細胞を播種、培地交換した後、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１、ラクトバチルス・アシドフィルスＪＣＭ１１３２、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１１２６、ラクトバチルス・ブフネリＪＣＭ１１１５からそれぞれ精製したＳＬＰを１０μｇ／ｍＬの濃度となるよう添加、６時間培養した。その後、上記の通りトータルＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲによるｈＢＤ２遺伝子発現解析を行った。なお、ＳＬＰ無添加の場合をネガティブコントロール（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）としてポジティブコントロールに対する相対発現量として評価した。
【0023】
２．試験結果
評価の結果、いずれの菌株から精製したＳＬＰでもネガティブコントロールと比較して高いｈＢＤ２遺伝子発現が認められ、また、ポジティブコントロールと同等あるいはそれ以上のｈＢＤ２遺伝子発現が認められた（図５）。この結果より、精製したＳＬＰによる抗菌ペプチド誘導作用はラクトバチルス属に広く共通するものと考えられた。
乳酸菌が産生するＳＬＰの分子量は菌種間で大きな開きがあり、さらにその遺伝子構造は同一菌種内においても多様性に富むことが示されていたところ、本発明のＳＬＰによる抗菌ペプチド誘導作用がラクトバチルス属に広く見出されたことは意外なものであった。
評価の結果、いずれの菌株から精製したＳＬＰでもネガティブコントロールと比較して高いｈＢＤ２遺伝子発現が認められ、また、ポジティブコントロールと同等あるいはそれ以上のｈＢＤ２遺伝子発現が認められた（図５）。この結果より、精製したＳＬＰによる抗菌ペプチド誘導作用はラクトバチルス属に広く共通するものと考えられた。
乳酸菌が産生するＳＬＰの分子量は菌種間で大きな開きがあり、さらにその遺伝子構造は同一菌種内においても多様性に富むことが示されていたところ、本発明のＳＬＰによる抗菌ペプチド誘導作用がラクトバチルス属に広く見出されたことは意外なものであった。
【0024】
〔試験例４〕抗菌ペプチド誘導活性の評価（４）口腔上皮細胞での評価
１．試験方法
継代培養したＨＳＣ－４細胞（ヒト舌上皮細胞）を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう２４ｗｅｌｌプレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩培養した。培養には、ＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ５７９６：Ｓｉｇｍａ）にＦＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１０％）（Ｌｏｔ．４２Ｆ４１６０Ｋ：Ｇｉｂｃｏ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１００Ｕ－１００μｇ／ｍＬ）（１５１４０－１２２：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）を添加して使用した。培養後、細胞が７０～８０％コンフルエントに達していることを確認するとともに、培地を除きＦＢＳおよび抗生物質を添加していない培地（ＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）に交換、３７℃でさらに２４時間培養した。培養後の２４ｗｅｌｌプレートから培地を除き、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体もしくはラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰを１０もしくは５０μｇ／ｍＬ含む培地を添加、６時間培養した。その後、上記の通りトータルＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲによるｈＢＤ２遺伝子発現解析を行った。
１．試験方法
継代培養したＨＳＣ－４細胞（ヒト舌上皮細胞）を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう２４ｗｅｌｌプレートに播種し、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で一晩培養した。培養には、ＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｄ５７９６：Ｓｉｇｍａ）にＦＢＳ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１０％）（Ｌｏｔ．４２Ｆ４１６０Ｋ：Ｇｉｂｃｏ）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃ．１００Ｕ－１００μｇ／ｍＬ）（１５１４０－１２２：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）を添加して使用した。培養後、細胞が７０～８０％コンフルエントに達していることを確認するとともに、培地を除きＦＢＳおよび抗生物質を添加していない培地（ＤＭＥＭ－ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）に交換、３７℃でさらに２４時間培養した。培養後の２４ｗｅｌｌプレートから培地を除き、ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１菌体もしくはラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰを１０もしくは５０μｇ／ｍＬ含む培地を添加、６時間培養した。その後、上記の通りトータルＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、リアルタイムＰＣＲによるｈＢＤ２遺伝子発現解析を行った。
【0025】
２．試験結果
評価の結果、Ｃａｃｏ－２細胞の場合と同様に菌体、ＳＬＰ共にｈＢＤ２遺伝子発現の上昇が認められた。また、菌体と比較してＳＬＰ添加によって高いｈＢＤ２遺伝子発現が認められた（図６）。この結果はＣａｃｏ－２細胞の場合と同様であり、ＳＬＰは菌体よりも強い抗菌ペプチド誘導作用を有すると考えられた。
評価の結果、Ｃａｃｏ－２細胞の場合と同様に菌体、ＳＬＰ共にｈＢＤ２遺伝子発現の上昇が認められた。また、菌体と比較してＳＬＰ添加によって高いｈＢＤ２遺伝子発現が認められた（図６）。この結果はＣａｃｏ－２細胞の場合と同様であり、ＳＬＰは菌体よりも強い抗菌ペプチド誘導作用を有すると考えられた。
【0026】
（食品への配合例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰ１０ｍｇに、脱脂粉乳３０ｇ、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明の抗菌ペプチド産生促進用スティック状健康食品を製造した。
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰ１０ｍｇに、脱脂粉乳３０ｇ、ビタミンＣとクエン酸の等量混合物４０ｇ、グラニュー糖１００ｇ、コーンスターチと乳糖の等量混合物６０ｇを加えて混合した。混合物をスティック状袋に詰め、本発明の抗菌ペプチド産生促進用スティック状健康食品を製造した。
【0027】
（飼料への配合例）
ラクトバチルス・ヘルベティカス ＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰ２ｇを３９９８ｇの脱イオン水に懸濁し、４０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫ ＩＩ １６０型；特殊機化工業社製）にて、３，６００ｒｐｍで２０分間撹拌混合して２ｇ／４ｋｇのＳＬＰ溶液を得た。このＳＬＰ溶液２ｋｇに大豆粕１ｋｇ、脱脂粉乳１ｋｇ、大豆油０．４ｋｇ、コーン油０．２ｋｇ、パーム油２．３ｋｇ、トウモロコシ澱粉１ｋｇ、小麦粉０．９ｋｇ、ふすま０．２ｋｇ、ビタミン混合物０．５ｋｇ、セルロース０．３ｋｇ、ミネラル混合物０．２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間加熱殺菌して、本発明の抗菌ペプチド産生促進用飼料１０ｋｇを製造した。
ラクトバチルス・ヘルベティカス ＳＢＴ２１７１から精製したＳＬＰ２ｇを３９９８ｇの脱イオン水に懸濁し、４０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫ ＩＩ １６０型；特殊機化工業社製）にて、３，６００ｒｐｍで２０分間撹拌混合して２ｇ／４ｋｇのＳＬＰ溶液を得た。このＳＬＰ溶液２ｋｇに大豆粕１ｋｇ、脱脂粉乳１ｋｇ、大豆油０．４ｋｇ、コーン油０．２ｋｇ、パーム油２．３ｋｇ、トウモロコシ澱粉１ｋｇ、小麦粉０．９ｋｇ、ふすま０．２ｋｇ、ビタミン混合物０．５ｋｇ、セルロース０．３ｋｇ、ミネラル混合物０．２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間加熱殺菌して、本発明の抗菌ペプチド産生促進用飼料１０ｋｇを製造した。
【0028】
（医薬品への配合例）
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の液体培養物を、４℃、７，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、滅菌水による洗浄と遠心分離を３回繰り返して行い、洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を凍結乾燥処理して菌体粉末を得た。この菌体粉末１部に脱脂粉乳４部を混合し、この混合粉末を打錠機により１ｇずつ常法により打錠して、本発明の抗菌ペプチド産生促進用錠剤を調製した。
ラクトバチルス・ヘルベティカスＳＢＴ２１７１の液体培養物を、４℃、７，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、滅菌水による洗浄と遠心分離を３回繰り返して行い、洗浄菌体を得た。この洗浄菌体を凍結乾燥処理して菌体粉末を得た。この菌体粉末１部に脱脂粉乳４部を混合し、この混合粉末を打錠機により１ｇずつ常法により打錠して、本発明の抗菌ペプチド産生促進用錠剤を調製した。
【産業上の利用可能性】
【0029】
ラクトバチルス属乳酸菌に由来するＳＬＰおよびＳＬＰ分解物、もしくはＳＬＰを含むラクトバチルス属乳酸菌菌体およびその培養物などの抗菌ペプチド産生を誘導する素材を体内に摂取することにより、種々の感染に対する防御能の向上が期待できる。
【受託番号】
【0030】
＜寄託生物材料への言及＞
（１）ＳＢＴ２１７１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
１９９６年３月６日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ－５４４５
（１）ＳＢＴ２１７１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２０号室（郵便番号２９２－０８１８）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
１９９６年３月６日
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ－５４４５
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラクトバチルス・ヘルベティカスの菌体由来成分であるＳ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）及び前記Ｓ層タンパク質（Ｓ－ｌａｙｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の分解物からなる群から選択される１つ以上を有効成分として含むβ‐ディフェンシン産生促進用組成物。
【請求項2】
β‐ディフェンシン産生促進が、上皮細胞におけるβ‐ディフェンシン産生促進である請求項１に記載のβ‐ディフェンシン産生促進用組成物。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のβ‐ディフェンシン産生促進用組成物を含むβ‐ディフェンシン産生促進用飲食品。
【請求項4】
感染予防用である請求項３に記載のβ‐ディフェンシン産生促進用飲食品。