特開 2024-80912 Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質及び糖ペプチドの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024080912

(43)【公開日】2024-06-17

(54)【発明の名称】Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質及び糖ペプチドの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20240610BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20240610BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240610BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240610BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240610BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240610BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240610BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240610BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240610BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54 ZNA

C12N9/10

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 C

C07K14/47

【審査請求】未請求

【請求項の数】13

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022194268

(22)【出願日】2022-12-05

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構「次世代治療・診断実現のための創薬基盤技術開発事業（糖鎖利用による革新的操業技術開発）」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(71)【出願人】

【識別番号】512088316

【氏名又は名称】株式会社糖鎖工学研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140888

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 欣乃

(72)【発明者】

【氏名】千葉 靖典

(72)【発明者】

【氏名】吉村 弥生

(72)【発明者】

【氏名】齋藤 扶美恵

(72)【発明者】

【氏名】西内 祐二

(72)【発明者】

【氏名】野口 真人

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050DD02

4B050LL05

4B050LL10

4B064AF22

4B064AG01

4B064CA02

4B064CA19

4B064CA21

4B064CC24

4B064DA20

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA19

4B065CA24

4B065CA29

4B065CA60

4H045AA10

4H045AA20

4H045BA10

4H045BA53

4H045CA40

4H045EA60

4H045FA74

(57)【要約】      （修正有）

【課題】本発明は、Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドのうちの複数種類と高い反応性を示し、複数種類のＮ－アセチルへキソサミンを受容体基質に転移する酵素活性を有するタンパク質を提供することを目的とする。
【解決手段】特定のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質。

【請求項2】

前記Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性が、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性、及びＮ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性である、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項3】

ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン及びＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミンを供与体基質とすることができる、請求項１に記載のタンパク質。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、核酸。

【請求項5】

請求項４に記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項6】

請求項４に記載の核酸又は請求項５に記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる、形質転換体。

【請求項7】

前記宿主細胞がブレビバチルス属細菌である、請求項６に記載の形質転換体。

【請求項8】

Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドと、受容体基質となるペプチドと、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質とを反応させる工程を含む、糖ペプチドの製造方法。

【請求項9】

前記ペプチドが、セリン残基又はスレオニン残基を含むペプチドである、請求項８に記載の製造方法。

【請求項10】

前記ペプチドが、ＭＵＣ２ペプチド又はＥＡ２ペプチドである、請求項８に記載の製造方法。

【請求項11】

Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドと、受容体基質となるペプチドと、請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質とを反応させる工程を含む、受容体基質となるペプチドにＮ－アセチルへキソサミンを転移させる方法。

【請求項12】

前記ペプチドが、セリン残基又はスレオニン残基を含むペプチドである、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記ペプチドが、ＭＵＣ２ペプチド又はＥＡ２ペプチドである、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質及び糖ペプチドの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

糖鎖は、単糖がグリコシド結合で結合した鎖状の構造を有するものであり、タンパク質又は脂質に結合して細胞の表面又は細胞の中に多く存在している。生体系において、糖鎖はエネルギー源であるだけでなく、細胞間のコミュニケーションと識別に関連するプロセスで重要な役割を果たしていることも知られている。そのため、ヘルスケア及び医療分野における糖鎖利用への関心が高まっている。そのような糖鎖利用に関する技術の一つには、糖ヌクレオチド及び糖転移酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）を利用して糖ペプチドを産生する技術がある。

【0003】

糖転移酵素は、供与体基質である糖ヌクレオチドから、受容体基質に糖を転移する反応を触媒する。糖転移酵素について、例えば非特許文献１には、ヒトＯ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＯＧＴ）がＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）から受容体基質となるペプチドへのＧｌｃＮＡｃの転移を触媒することが記載されている。一方、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を基質とした場合、ＯＧＴの反応性は極めて低く、ＧａｌＮＡｃを受容体基質に転移する酵素活性はないことが記載されている。

【0004】

また、非特許文献２には、アイソザイムであるヒトＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ－Ｔ１、－Ｔ２、－Ｔ３は、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃを供与体基質とした場合は、ＧａｌＮＡｃを受容体基質へと転移する酵素反応が進行することが記載されている。一方、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃを供与体基質とした場合、ヒトＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ－Ｔ１、－Ｔ２、－Ｔ３の酵素反応は進行しないことが記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ma X et al., “Substrate specificityprovides insights into the sugar donor recognition mechanism of O-GlcNActransferase (OGT).”, PLoS One. 2013 May 21;8(5):e63452.

【非特許文献2】Wandall HH et al., “Substratespecificities of three members of the human UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:Polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase family, GalNAc-T1, -T2, and-T3.”, J Biol Chem. 1997 Sep 19;272 (38):23503-14.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

上述のとおり、これまでのところ、特定のＮ－アセチルへキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）が結合した糖ヌクレオチドのみを供与体基質とし、当該供与体基質における特定のＮ－アセチルへキソサミンのみを受容体基質に転移する酵素活性があるタンパク質は知られている。しかしながら、特定のＮ－アセチルへキソサミンのみならず、その他のＮ－アセチルへキソサミンをも受容体基質に転移する酵素活性を有するタンパク質は知られていない。

【0007】

そこで本発明は、Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドのうちの複数種類と高い反応性を示し、複数種類のＮ－アセチルへキソサミンを受容体基質に転移する酵素活性を有するタンパク質を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、鋭意研究の結果、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ及びＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃのどちらを基質とした場合でも高い反応性を示し、ＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃを受容体基質に転移する酵素活性を有することを見出し、本発明の完成に至った。

【0009】

すなわち、本発明は、例えば以下の発明に関する。
［１］
配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質。
［２］
上記Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性が、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性、及びＮ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性である、［１］に記載のタンパク質。
［３］
ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン及びＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミンを供与体基質とすることができる、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
［４］
［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質をコードする、核酸。
［５］
［４］に記載の核酸を含む、ベクター。
［６］
［４］に記載の核酸又は［５］に記載のベクターで宿主細胞を形質転換して得られる、形質転換体。
［７］
上記宿主細胞がブレビバチルス属細菌である、［６］に記載の形質転換体。
［８］
Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドと、受容体基質となるペプチドと、［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質とを反応させる工程を含む、糖ペプチドの製造方法。
［９］
上記ペプチドが、セリン残基又はスレオニン残基を含むペプチドである、［８］に記載の製造方法。
［１０］
上記ペプチドが、ＭＵＣ２ペプチド又はＥＡ２ペプチドである、［８］又は［９］に記載の製造方法。
［１１］
Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドと、受容体基質となるペプチドと、［１］～［３］のいずれかに記載のタンパク質とを反応させる工程を含む、受容体基質となるペプチドにＮ－アセチルへキソサミンを転移させる方法。
［１２］
上記ペプチドが、セリン残基又はスレオニン残基を含むペプチドである、［１１］に記載の方法。
［１３］
上記ペプチドが、ＭＵＣ２ペプチド又はＥＡ２ペプチドである、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］
受容体基質となるペプチドにＮ－アセチルへキソサミンを転移させるための、配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質の使用。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドのうちの複数種類と高い反応性を示し、複数種類のＮ－アセチルへキソサミンを受容体基質に転移する酵素活性を有するタンパク質を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】実施例にて得たブレビバチルス属細菌の形質転換体において、目的タンパク質の発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析で確認した結果を示す図である。

【図2】実施例にて得た大腸菌の形質転換体において、目的タンパク質の発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析で確認した結果を示す図である。

【図3】実施例にて得た形質転換体の培養上清について、ＧａｌＮＡｃを受容体基質に転移する酵素活性を調べた結果を示す図である。

【図4】実施例にて得た形質転換体から目的タンパク質を精製する過程で得られたサンプルについてＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析した結果を示す図である。

【図5】実施例にて得た目的タンパク質の最適温度の検討結果を示す図である。

【図6】実施例にて得た目的タンパク質の最適ｐＨの検討結果を示す図である。

【図7】実施例にて得た目的タンパク質の金属イオン要求性の検討結果を示す図である。

【図8】実施例にて得た目的タンパク質の供与体基質に対する活性の解析結果を示す図である。

【図9】実施例にて得た目的タンパク質の受容体基質であるＭＵＣ２ペプチドに対する活性の解析結果（Ａ）及びＥＡ２ペプチドに対する活性を解析した結果（Ｂ）を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。

【0013】

＜タンパク質＞
本実施形態に係るタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有する、タンパク質である。

【0014】

Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性とは、Ｎ－アセチルへキソサミン（ＨｅｘＮＡｃ）が結合した複数種類の糖ヌクレオチドを供与体基質とし、供与体基質におけるＨｅｘＮＡｃを、受容体基質に転移する反応を触媒する酵素活性である。

【0015】

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ブレビバチルス・ブレビス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）由来の仮想タンパク質であり（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＢＡＨ４２７１４）、ヒトＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ等とアミノ酸配列の相同性を有することから、ＧｌｙｃｏｓｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ＧＴ） Ｆａｍｉｌｙ ２７に分類され、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が結合した糖ヌクレオチドを供与体基質として利用し、ＧａｌＮＡｃを受容体基質に転移すると考えられていた。しかしながら、本発明者らは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が、ＧａｌＮＡｃだけではなく、その他のＨｅｘＮＡｃも受容体基質に転移するＮ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有することを明らかにした。

【0016】

したがって、本実施形態に係るタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。

【0017】

本実施形態に係るタンパク質は、複数種類のＨｅｘＮＡｃを受容体基質に転移する酵素活性を有していれば特に限定されず、例えば、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性、Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性、Ｎ－アセチルマンノサミニルトランスフェラーゼ活性等が挙げられ、好ましくは、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性及びＮ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性である。ここで、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性とは、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合した複数種類の糖ヌクレオチドを供与体基質とし、供与体基質におけるＧｌｃＮＡｃを、受容体基質に転移する反応を触媒する酵素活性を意味する。Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性とは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が結合した複数種類の糖ヌクレオチドを供与体基質とし、供与体基質におけるＧａｌＮＡｃを、受容体基質に転移する反応を触媒する酵素活性を意味する。Ｎ－アセチルマンノサミニルトランスフェラーゼ活性とは、Ｎ－アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）が結合した複数種類の糖ヌクレオチドを供与体基質とし、供与体基質におけるＭａｎＮＡｃを、受容体基質に転移する反応を触媒する酵素活性を意味する。

【0018】

本実施形態に係るタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有するものでもある。

【0019】

アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮを使用して塩基配列を解析する場合には、パラメータは、例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸを使用してアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐ ｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。

【0020】

本実施形態に係るタンパク質は、Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有していれば、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～１５、１～１０、１～５、１～３のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。置換、挿入、又は付加されるアミノ酸配列は、天然型であってもよく、非天然型であってもよい。

【0021】

天然型アミノ酸としては、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システイン等が挙げられる。

【0022】

以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン

【0023】

本実施形態に係るタンパク質は、精製又は検出に利用されるタグ又は標識マーカーが結合されていてもよい。タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ＰＡタグ等の公知のタグが用いられ得る。標識マーカーとしては、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ＦＩＴＣ等の蛍光色素などが用いられ得る。本実施形態に係るタンパク質は、上記タグ又は標識マーカーを切り離して用いてもよく、上記タグ又は標識マーカーを切り離さずに用いてもよい。

【0024】

供与体基質としては、ＨｅｘＮＡｃが結合した糖ヌクレオチドであれば特に限定されず、例えば、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、ＧＤＰ－ＭａｎＮＡｃ、ｄＴＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ｄＴＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、ｄＴＤＰ－ＭａｎＮＡｃ等が挙げられる。また、供与体基質は、天然に存在する糖ヌクレオチドであってもよく、人工的に合成した非天然の糖ヌクレオチドであってもよい。

【0025】

本実施形態に係るタンパク質は、上記の供与体基質のうちの少なくとも２種類以上を供与体基質とすることができ、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ及びＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃを基質とすることができることが好ましい。

【0026】

受容体基質としては、上記の供与体基質におけるＮ－アセチルへキソサミンを受容できる基質であれば特に限定されず、例えば、ペプチド等が挙げられる。ここで、本明細書において、「ペプチド」とは、２以上のアミノ酸残基がペプチド結合（アミド結合）によって連結されたものを含むものを意味し、ポリペプチド、タンパク質であってもよく、これらには糖ペプチド又は糖タンパク質も含まれる。アミノ酸残基としては、天然型アミノ酸であっても、非天然型アミノ酸であってもよい。ペプチドとしての長さは特に限定されないが、２～１０００程度のアミノ酸残基を含んでもよい。

【0027】

受容体基質がペプチドである場合、ペプチドの種類は特に限定されないが、好ましくはセリン残基及び／又はスレオニン残基を含むペプチドであり、より好ましくはムチン型糖ペプチドであり、さらに好ましくはＭＵＣ２ペプチド（配列番号５）又はＥＡ２ペプチド（配列番号６）である。

【0028】

受容体基質が、セリン残基及び／又はスレオニン残基を含むペプチドである場合、全アミノ酸残基数に対するセリン残基数及び／又はスレオニン残基数の割合は、特に限定されないが、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上であってもよい。

【0029】

本実施形態に係るタンパク質がＮ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有していることは、例えば、後述する実施例に記載の方法によって確認することができる。より具体的には、複数種類のＮ－アセチルへキソサミンが結合した供与体基質と、受容体基質と、本実施形態のタンパク質とを反応させ、ＨＰＬＣを用いる等してＮ－アセチルへキソサミンが結合した受容体基質を検出することで、Ｎ－アセチルへキソサミニルトランスフェラーゼ活性を有することが確認できる。

【0030】

＜核酸＞
本実施形態に係る核酸は、上記本実施形態に係るタンパク質をコードする核酸であり、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。上記本実施形態に係るタンパク質をコードする核酸の具体例としては、例えば、配列番号２で表される塩基配列を含むものであってもよく、配列番号２で表される塩基配列からなるものであってもよく、また、配列番号２で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むものであってもよく、配列番号２で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるものであってもよい。

【0031】

本実施形態に係る核酸は、本実施形態に係るタンパク質をコードする核酸であれば特に限定されず、例えば、形質転換する宿主細胞の種類に応じてコドンを最適化したものであってもよい。

【0032】

本実施形態に係る核酸が、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号２で表される塩基配列を含むＤＮＡ）である場合、例えば、ブレビバチルス・ブレビス由来のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを実施することによって作製してもよい。本実施形態に係る核酸が、配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡである場合には、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ）を鋳型にしてエラープローンＰＣＲを実施することで得ることができる。または、部位特異的変異導入により塩基配列に変異を導入することによっても得ることができる。また、本実施形態に係る核酸は、人工合成によって作製してもよい。

【0033】

上記のように得たＤＮＡは、そのまま、又は適当な制限酵素等で切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換えベクターを宿主細胞に導入して増幅した後、通常用いられる塩基配列解析方法等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。

【0034】

核酸の塩基配列を決定する際に用いることができるベクターとしては、公知のクローニングベクター又は発現ベクターを挙げることができ、より具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＥＴ系ベクター等を挙げることができる。

【0035】

＜ベクター＞
本実施形態に係るベクターは、上記本実施形態に係る核酸を含む。上記本実施形態に係る核酸を組み込むベクターは、上記本実施形態に係る核酸のコードするタンパク質（上記本実施形態に係るタンパク質）を宿主細胞内で発現させることができるものであれば、特に限定されない。

【0036】

本実施形態に係るベクターは、該ベクターを導入する宿主細胞によって適宜選択すればよいが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等であってよい。また、自律複製型ベクターであってもよく、ゲノム組込み型ベクターであってもよい。

【0037】

本実施形態に係るベクターは、本実施形態に係る核酸の塩基配列以外にも制限酵素部位、挿入された遺伝子の発現のための制御配列（プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合領域等）、抗生物質耐性遺伝子、形質転換体の選別のための配列、シグナル配列（例えば、大腸菌において目的タンパク質をペリプラズムへ移行させるための配列であるｐｅｌＢシグナル配列等）等、種々の配列を含むことができる。

【0038】

上記本実施形態に係る核酸を組み込むベクターの具体例としては、例えば、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＥＴ３０ａ、ｐＣＤＦ－１ｂ、ｐＲＳＦ－１ｂ（いずれもメルクミリポア社製）、ｐＭＡＬ－ｃ５ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ－６Ｐ－１、ｐＴｒｃ９９Ａ（いずれもＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＮＩ、ｐＮＣＭＯ２、ｐＮＹ３２６、ｐＢＩＣ３（いずれもタカラバイオ社製）、ｐＡＵＲ１２３（タカラバイオ社製）、ｐＫＬＡＣ２（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＩ１０１（タカラバイオ社製）、ｐＢＡｐｏ－ＥＦ１ａ（タカラバイオ社製）、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣＺα（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）ｐＨＥＫ２９３ Ｕｌｔｒａ（タカラバイオ社製）等が挙げられる。

【0039】

＜形質転換体＞
本実施形態に係る形質転換体は、上記本実施形態に係る核酸又はベクターで宿主細胞を形質転換することで得られる。

【0040】

宿主細胞としては、本実施形態に係るタンパク質を発現できるものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌、ブレビバチルス属細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞等が挙げられ、好ましくはブレビバチルス属細菌である。これらの宿主細胞で本実施形態に係るタンパク質を発現させるために、本実施形態に係る核酸をそのまま、又は本実施形態に係るベクターを用いて、宿主細胞を形質転換することが好ましい。

【0041】

宿主細胞としての用いることができるブレビバチルス属細菌の具体例としては、特に限定されないが、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・セントロポラス、ブレビバチルス・チョウシネンシス、ブレビバチルス・フォルモサス、ブレビバチルス・インボカツス、ブレビバチルス・ラチロスポラス、ブレビバチルス・リムノフィルス、ブレビバチルス・パラブレビス、ブレビバチルス・レウスゼリ、ブレビバチルス・サーモルバー等が挙げられる。好ましくは、ブレビバチルス・チョウシネンシスであり、より好ましくはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１である。

【0042】

宿主細胞の形質転換は、本実施形態に係る核酸又はベクターを宿主細胞に導入することにより行われる。そのような方法としては、宿主細胞及びベクターによって適宜選択すればよく、遺伝子工学において用いられる通常の方法に従って行うことができる。

【0043】

＜糖ペプチドの製造方法＞
本実施形態に係る糖ペプチドの製造方法は、Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドと、受容体基質となるペプチドと、上記本実施形態に係るタンパク質とを反応させる工程（以下、「反応工程」ともいう。）を含む。Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチド及び受容体基質となるペプチドについては、上述のとおりである。

【0044】

本実施形態に係る糖ペプチドの製造方法において、反応工程に用いる上記本実施形態に係るタンパク質としては、精製したタンパク質を用いてもよく、又は、本実施形態に係る形質転換体が培養上清に本実施形態に係るタンパク質を分泌する場合、その培養上清を用いてもよい。

【0045】

反応工程は、Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドと、受容体基質となるペプチドと、上記本実施形態に係るタンパク質とを混合し、インキュベートする工程であってよく、混合の順番は任意であり、また、本実施形態に係るタンパク質の混合量は、所望の目的糖ペプチドの産生量を達成できる量であればよく、当業者が適宜に設計できる。

【0046】

本実施形態に係る糖ペプチドの製造方法は、複数種類のＮ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドと反応させる場合、受容体基質となるペプチドと本実施形態に係るタンパク質を、同時に複数種類のＮ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドと反応させてもよく、１種類ずつＮ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドと反応させてもよい。

【0047】

反応工程における反応温度は、本実施形態に係るタンパク質の酵素反応を進行させることができる温度であれば特に限定されず、例えば、３０℃以上、３５℃以上、４０℃以上、４５℃以上であってもよい。また、反応工程における反応温度は、６０℃以下、５５℃以下、５０度以下であってもよい。反応工程における反応温度は、３５℃～５５℃であってよく、好ましくは４０℃～５０℃であり、より好ましくは４２℃～４８℃であり、さらに好ましくは４３℃～４７℃である。

【0048】

反応工程におけるｐＨは、本実施形態に係るタンパク質の酵素反応を進行させることができるｐＨであれば特に限定されず、例えば、５．０以上、５．５以上、６．０以上、６．５以上、７．０以上であってもよい。また、反応工程におけるｐＨは、９．０以下、８．５以下、８．０以下、７．５以下であってもよい。反応工程におけるｐＨは、５．０～９．０であってもよく、好ましくは６．０～８．５であり、より好ましくは６．５～８．０であり、さらに好ましくは７．０～７．５である。

【0049】

反応工程における反応系には、上記糖ヌクレオチド、ペプチド、及び本実施形態のタンパク質以外にも、緩衝液、水、ｐＨ調整剤、界面活性剤、金属イオン、プロテアーゼ阻害剤等を適宜添加してもよい。

【0050】

金属イオンとしては、特に限定されないが、一価金属イオン、二価金属イオン、三価金属イオンであってもよく、好ましくは二価金属イオンである。

【0051】

二価金属イオンとしては、例えば、ベリリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン（Ｆｅ^２＋又はＦｅ^３＋）、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン、亜鉛イオン等が挙げられる。好ましくは、マンガンイオン、コバルトイオン、ニッケルイオンである。

【0052】

反応工程の反応系において本実施形態に係るタンパク質の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０００１質量％以上、０．００１質量％以上、０．０１質量％以上、０．１質量％以上であってもよい。また、反応系における本実施形態に係るタンパク質の濃度は、１０質量％以下、１質量％以下、０．１質量％以下であってもよい。

【0053】

本実施形態に係る糖ペプチドの製造方法は、更に上記反応工程における反応系から糖ペプチドを分離する工程（以下、「分離工程」ともいう。）を含んでいてもよい。分離工程は、例えば、分取ＨＰＬＣ等によって行ってもよい。

【0054】

＜受容体基質となるペプチドにＮ－アセチルへキソサミンを転移させる方法＞
本実施形態に係る受容体基質となるペプチドにＮ－アセチルへキソサミンを転移させる方法（以下、「転移方法」ともいう。）は、Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチドと、受容体基質となるペプチドと、上記本実施形態に係るタンパク質とを反応させる工程（以下、「反応工程」ともいう。）を含む。Ｎ－アセチルへキソサミンが結合した糖ヌクレオチド及び受容体基質となるペプチドについては、上述のとおりである。

【0055】

本実施形態に係る転移方法は、上記本実施形態に係る糖ペプチドの製造方法の各態様を特に限定なく適用することができる。

【0056】

本実施形態に係る転移方法は、受容体基質となるペプチドにＮ－アセチルへキソサミンが転移したか否かを確認する工程（以下、「確認工程」ともいう。）を含んでいてもよい。確認工程は、特に限定されないが、例えばＨＰＬＣ、質量分析等により実施することができる。

【実施例0057】

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0058】

（１．発現コンストラクトの作製及び菌株の取得）
配列番号２で表される塩基配列を基に、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質のＮ末端側に順に１０×Ｈｉｓタグ及びＰＡタグが付加されたタンパク質（以下、「ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔ」ともいう；配列番号３）をコードするＤＮＡ（配列番号４）を人工合成した。

【0059】

その後、ブレビバチルス属細菌にてＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔを精製するにあたり、ヒゲタ醤油株式会社に、配列番号４で表される塩基配列が挿入された発現コンストラクトの作製とブレビバチルス属細菌によるＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔ発現の受託解析（ＢｒｅｖｉＭＡＸ Ｓｔａｎｄａｒｄ）を依頼した。

【0060】

その結果、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ）ＨＰＤ３１を配列番号４で表される塩基配列が挿入されたｐＢＩＣ３ｓベクターを導入して形質転換した株（以下、「ＢＢ－１株」ともいう。）を得た。

【0061】

なお、受託解析にて、ＢＢ－１株を３ｍＬのブレビバチルス属細菌用培地に植菌し、２５℃、３日間培養して１５，０００×ｇ、５分の遠心分離によって得た培養上清について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウエスタンブロット解析が実施され、ＢＢ－１株による目的タンパク質（ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔ）の発現が確認された。ウエスタンブロット解析は、抗５×Ｈｉｓタグ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を一次抗体として、パーオキシダーゼ融合抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として使用し、常法に従って実施した。その結果を図１に示す。図１において、矢尻で示すように、想定される分子量（３６．１ｋＤａ）相当の位置にバンドが確認されため、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの発現が確認された。

【0062】

（２．培養上清におけるＧａｌＮＡｃ転移活性の評価）
＜ＦＩＴＣで標識したＭＵＣ２ペプチド（ＦＩＴＣ－ＭＵＣ２）の作製＞
外部委託により合成された粗ＦＩＴＣ－ＭＵＣ２を、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で以下の条件にて精製した。精製したＦＩＴＣ－ＭＵＣ２を、以下の実験で用いた。ＦＩＴＣ－ＭＵＣ２は、ＭＵＣ２ペプチド（ＰＴＴＴＰＩＴＴＴＴＴＶＴＰＴＰＴＰＴＧＴＱＴＫ；配列番号５）のＣ末端にＦＩＴＣを融合したペプチドである。
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ
バッファーＡ：０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液
バッファーＢ：０．０５％ＴＦＡを含む１００％アセトニトリル（ＡＣＮ）
平衡化：バッファーＡ：バッファーＢ＝８０：２０の溶液
グラジエント：１５分間でバッファーＡ：バッファーＢ＝６５：３５まで直線的にバッファーＢを増加させて溶出を行なった。
流速：１ｍＬ／分
検出：蛍光検出器（Ｅｘ．４９５ｎｍ、Ｅｍ．５２０ｎｍ）

【0063】

＜大腸菌を用いたＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの精製＞
人工合成したＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔ遺伝子（配列番号２）の５’側に、ＮｄｅＩサイト、ペリプラズムへの分泌シグナルであるｐｅｌＢシグナル配列、１０×Ｈｉｓタグ配列、及びＰＡタグ配列をこの順となるように、また、３’側にＮｏｔＩサイトをＰＣＲ法で付与し、ＤＮＡ断片を作製した（配列番号７）。その後、当該ＤＮＡ断片を大腸菌の発現ベクターであるｐＥＴ３０ａのＮｄｅＩとＮｏｔＩの間に挿入した。得られたプラスミド（ｐＦＳ３００）を用いて大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ２（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換し、発現株（ＥＦＳ４）を構築した。次にカナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含む８ｍＬのＬＢ培地（１％Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％塩化ナトリウム）にＥＦＳ４株を植菌し、３７℃で一晩培養した。この培養液を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含む１００ｍＬのＴＢ培地（１．２％Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、２．４％Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．８％グリセロール、１７ｍＭ リン酸二水素カリウム、７２ｍＭ リン酸水素二カリウム）でＯＤ_６００が０．４となるように希釈し、この培地を２４穴プレート２枚に２ｍＬずつ分注した。これを１６℃で８時間培養後、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、マキシマイザー（タイテック社製）にて１，２００ｒｐｍ、１６℃で４０時間培養を行なった。

【0064】

上記培養液を一本のチューブにまとめたのち、１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心した。得られた菌体に１８ｍＬのＰＢＳ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）を添加して超音波破砕したのち、再度遠心し、上清を回収した。この上清に１ｍＬのＮｉ－アガロース（富士フイルム和光純薬社製）を添加し、攪拌後、５ｍＬのオープンカラムに移し、１ｍＬのＰＢＳ溶液で５回洗浄後、５００ｍＭのイミダゾール溶液を含むＰＢＳ溶液１ｍＬを添加し溶出を行なった。これを４回繰り返し、精製酵素画分を取得した。得られた精製酵素画分を１０ｋＤａカットの限外ろ過膜を用いて脱塩を行ない、４ｍＬの精製ＢｂｐｐＧａｌＮＡｃ－Ｔ溶液とした。

【0065】

この精製工程の各画分について、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）電気泳動を行い、蛍光染色と抗ＰＡ抗体によるウエスタンブロッティングを行なった。それぞれの画分で、菌体量ＯＤ_６０００．００８３相当分をＳＤＳ化後、１０％のＰＡＧ２枚について各レーンにアプライし、常法により電気泳動を行った。泳動終了後、１枚のゲルはＯｒｉｏｌｅ 蛍光ゲルステイン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて染色を行った。もう一枚については、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜への転写を行ったのち、一次抗体として抗ＰＡタグ，ラットモノクローナル抗体（富士フイルム和光純薬社製）、二次抗体としてパーオキシダーゼ融合抗ラットイムノグロブリン抗体を二次抗体として使用し、常法に従って実施した。その結果を図２に示す。

【0066】

図２に示すように、精製ＢｂｐｐＧａｌＮＡｃ－Ｔ溶液画分では依然として複数のバンドが確認されるものの、ＢｂｐｐＧａｌＮＡｃ－Ｔは、ウエスタンブロッティングの結果における矢尻で示す部分に確認された。また、精製ＢｂｐｐＧａｌＮＡｃ－Ｔ溶液画分ではＢｂｐｐＧａｌＮＡｃ－Ｔが濃縮されていることが確認された。

【0067】

＜活性の評価＞
以下の手順により、ＢＢ－１株の培養上清によるＧａｌＮＡｃ転移活性を評価した。まず、ＢＢ－１株を上記１．と同様に、ブレビバチルス属細菌用培地で２５℃、３日間培養し、その培養上清を得た。次いで、１Ｍ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＭｎＣｌ_２、１０ｍＭ ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ（供与体基質；ヤマサ醤油社製）、１００ｍＭ ＰＭＳＦ、１００×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社製）、１０μＭ ＦＩＴＣ－ＭＵＣ２ペプチド（受容体基質）、蒸留水、及びＢＢ－１株の培養上清又は大腸菌にて発現させ、精製したＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔ（精製ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔ）が、下記表１に示す組成となるように反応溶液１～６を調製した。続いて、当該反応溶液を３７℃で１８時間振とうしながらインキュベートすることで反応させ、その後それぞれのサンプルに１００μＬの蒸留水を加えたのち、９５℃で１０分間インキュベートすることで反応を終了させた。反応を終了させた溶液を０．２２μｍフィルター（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＧＶ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ ０．２２μｍ；ミリポア社製）に通して濾過した後、溶液の１／３量を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に注入した。ＨＰＬＣでの分析は以下の条件にて行った。その結果を図３に示す。
（ＨＰＬＣの分析条件）
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８－ＡＲＩＩ（ナカライテスク）
カラムオーブン：４０℃
流速：１ｍＬ／分
平衡化：０．０５％ＴＦＡを含む１０％ＡＣＮ水溶液
グラジエント：３０分間で４０％ＡＣＮ＋０．０５％ＴＦＡまで直線的にＡＣＮ水溶液の濃度を増加させて溶出を行った
検出：蛍光検出器（Ｅｘ．４９５ｎｍ、Ｅｍ．５２０ｎｍ）

【0068】

【表1】

【0069】

図３に示すように、反応溶液１を用いた場合と反応溶液２を用いた場合との比較、又は反応溶液３を用いた場合と反応溶液４を用いた場合との比較から、ＢＢ－１株の培養上清を添加した反応溶液１及び反応溶液３を用いた場合でのみ、ＭＵＣ２ペプチドにＧａｌＮＡｃが付加した産物が確認された（図３中Ａのピーク）。このピーク画分を分取したのち、質量分析装置による解析を行なったところ、ＭＵＣ２のペプチドの分子量に加えＮ－アセチルヘキソサミンに相当する分子量の増加が確認された。すなわち、ＢＢ－１株で発現しているＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－ＴがＭＵＣ２ペプチドにＧａｌＮＡｃを転移したことがわかった。

【0070】

（３．ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの精製）
上記１．及び２．のとおり、ＢＢ－１株によるＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの発現、及びＢＢ－１株の培養上清によるＧａｌＮＡｃ転移活性が確認されたため、ＢＢ－１株からＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔを以下の手順で精製した。

【0071】

滅菌したブレビバチルス属細菌用培地を２４穴プレートにそれぞれ２ｍＬずつ分注後、それぞれにＢＢ－１株のコロニーを植菌し、３７℃、１８０ｒｐｍで一晩培養した。これらの培養液全てを回収し、１本のチューブにまとめ、１５０００ｒｐｍ、４℃、５分で遠心して細胞を沈殿させた。この沈殿画分を２００ｍＬのブレビバチルス属細菌用培地に懸濁したのち、９６穴ディープウェルプレート２枚に対し１穴あたり１ｍＬずつ分注した。これをマキシマイザー（タイテック社製）に設置し、２５℃、１３００ｒｐｍで３日間の培養を行った。

【0072】

その後、培養液を遠心して上清を回収し、当該上清にグリセロール（終濃度１０％）、ＣＨＡＰＳ（終濃度０．１％）、ＰＭＳＦ（終濃度１ｍＭ）を添加した。５０ｍＬのチューブに、平衡化済みのｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標） Ｈｉｓタグ精製樹脂（Ｍｅｒｃｋ社製）２．５ｍＬと上記培養上清を含む溶液５０ｍＬを加え、ローテーターを利用して２時間、４℃で混合した。混合溶液を空のカラムに移して樹脂を回収した後、樹脂を２５ｍＬのバッファーＡ（１０％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０））で２回洗浄した。続いて、樹脂に５ｍＬのバッファーＢ（０．５Ｍイミダゾール、１０％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦを含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０））を添加することでＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの溶出を行った。さらに１５分後に再度５ｍＬのバッファーＢでＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの溶出を行った。溶出した画分はアミコンウルトラ（１０，０００ＮＭＷＬ、ミリポア社製）で濃縮したのち、バッファーＡでの洗浄を繰り返して脱塩を行い、精製標品を得た。

【0073】

ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの上記各精製工程において得た画分について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析を行った。ウエスタンブロット解析は、抗５×Ｈｉｓタグ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）を一次抗体として、パーオキシダーゼ融合抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として使用し、常法に従って実施した。その結果を図４に示す。図４に示すように、精製標品において、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔは図４中の矢尻で示す部分に確認できた（図４レーン５）。

【0074】

（４．ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの諸性質）
＜試験例１：ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの最適温度の検討＞
上記３．で得たＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの最適温度を、下記表２で示す組成の反応溶液を調製し、調製した反応溶液を３０℃から６０℃まで５℃刻みで温度を変化させて反応させたこと以外は、上記２．と同様にして解析した。その結果を図５に示す。なお、図５に示す結果は３回の独立した実験の測定値の平均値である。

【0075】

【表2】

【0076】

図５に示すように、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔは４５℃で最も高い活性を示した。この結果から、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの最適温度は４５℃前後であることが明らかになった。

【0077】

＜試験例２：ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの最適ｐＨの検討＞
上記３．で得たＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの最適ｐＨを、試験例１と同様の組成の反応溶液の他に、０．１Ｍの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０、５．５）、ＭＥＳバッファー（ｐＨ５．５、６．０、６．５）、ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ６．５、７．５）、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５、８．０、８．５、９．０）を用いた反応溶液を調製したこと、及び反応温度を４５℃で反応させたこと以外は試験例１と同様にして解析した。その結果を図６に示す。なお、図６に示す結果は、３回の独立した実験の測定値の平均値である。

【0078】

図６に示すように、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－ＴはＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．０）を用いた反応溶液中で反応させた場合に最も高い活性を示した。この結果から、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの最適ｐＨは７．０付近であることが明らかになった。

【0079】

＜試験例３：ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの金属イオン要求性の検討＞
糖転移酵素の多くが、その活性においてマンガンイオン（Ｍｎ^２＋）を要求することが知られている。そのため、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの金属イオン要求性を以下のとおりに確認した。試験例１の反応溶液における塩化マンガン（Ｍｎ^２＋）の代わりに、塩化コバルト（Ｃｏ^２＋）、塩化ニッケル（Ｎｉ^２＋）、塩化鉄（Ｆｅ^２＋、Ｆｅ^３＋）、塩化マグネシウム（Ｍｇ^２＋）、塩化カルシウム（Ｃａ^２＋）、塩化銅（Ｃｕ^２＋）、塩化亜鉛（Ｚｎ^２＋）、又はＥＤＴＡを添加した反応溶液、及び試験例１の反応溶液において塩化マンガンを添加しない反応溶液を調製した。これらの反応溶液について、反応温度を４５℃で反応させたこと以外は試験例１と同様の方法を実施した。その結果を図７に示す。なお、図７に示す結果は、３回の独立した実験の測定値の平均値である。

【0080】

図７に示すように、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔは二価金属イオンの添加で高い活性を示し、Ｎｉ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｍｎ^２＋の添加で特に高い活性を示すことが明らかとなった。

【0081】

＜試験例４：ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの供与体基質に対する活性の解析＞
ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔはアミノ酸配列の相同性からＣＡＺＹデータベースのＧＴ２７に分類され、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ）を供与体基質として利用すると考えられる。そこで、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの糖ヌクレオチド基質に対する活性を調べた。具体的には、試験例１における反応溶液における供与体基質であるＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃの代わりに、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン（ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ）、ＵＤＰ－ガラクトース（ＵＤＰ－Ｇａｌ）、ＵＤＰ－グルコース（ＵＤＰ－Ｇｌｃ）、ＧＤＰ－マンノース（ＧＤＰ－Ｍａｎ）、又はＧＤＰ－フコース（ＧＤＰ－Ｆｕｃ）を添加した反応溶液、及び試験例１の反応溶液においてＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃを添加しない反応溶液を調製した。これらの反応溶液について、反応温度を４５℃で反応させたこと以外は試験例１と同様の方法を実施した。その結果を図８に示す。なお、図８に示す結果は、３回の独立した実験の測定値の平均値である。

【0082】

図８に示すように、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔは、想定されていたＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃに加え、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃも供与体基質として利用することができ、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃを供与体基質とした場合よりも高い活性を示した。一方、ＨｅｘＮＡｃが結合していない他の糖ヌクレオチドには反応せず活性を示さなかった。この結果から、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔは、複数種類のＨｅｘＮＡｃを受容体基質に転移する酵素活性を有することが明らかになった。

【0083】

＜試験例５：ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔの受容体基質に対する活性の解析＞
上述したとおり、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－ＴはＧＴ２７に属することから、セリン又はスレオニン残基を含むペプチドに糖を転移すると考えられた。そこで、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔについて、様々なセリン又はスレオニン残基を含むペプチド（受容体基質）に対する活性を調べた。試験例１の反応溶液における受容体基質であるＦＩＴＣ－ＭＵＣ２の代わりに、ＦＩＴＣで標識したＥＡ２ペプチド（ＦＩＴＣ－ＥＡ２）を添加した反応溶液を調製した。なお、ＦＩＴＣ－ＥＡ２は、ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ；配列番号６）のＣ末端にＦＩＴＣを融合したペプチドであり、上記２．におけるＦＩＴＣ－ＭＵＣ２と同様にして精製した。これらの反応溶液について、反応温度を４５℃で反応させたこと以外は試験例１と同様の方法を実施した。ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－ＴのＭＵＣ２ペプチドに対する活性を解析した結果を図９（Ａ）に、ＥＡ２ペプチドに対する活性を解析した結果を図９（Ｂ）に示す。

【0084】

図９（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ＭＵＣ２ペプチド及びＥＡ２ペプチドのどちらを受容体基質として用いた場合でも、アスタリスクで示す部分にピーク（ＦＩＴＣ－ＭＵＣ２又はＦＩＴＣ－ＥＡ２にＧａｌＮＡｃが付加した産物）が確認でき、また反応時間にしたがってその量が増加した。この結果から、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔにより、どちらの受容体基質に対してもＧａｌＮＡｃが転移されていることが確認された。

【0085】

以上の試験例４及び５の結果より、ＢｂｐｐＨｅｘＮＡｃ－Ｔは、複数種類のＨｅｘＮＡｃを受容体となる基質に対して転移する酵素活性を有することが明らかになった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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