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特開2024-83314カンキツの品種の識別方法、識別キット、および、核酸検出デバイス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024083314
(43)【公開日】2024-06-20
(54)【発明の名称】カンキツの品種の識別方法、識別キット、および、核酸検出デバイス
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20240613BHJP
C12Q 1/6895 20180101ALI20240613BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240613BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240613BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6895 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023208031
(22)【出願日】2023-12-08
(31)【優先権主張番号】P 2022196625
(32)【優先日】2022-12-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）農林水産省、令和４年度「みどりの食料システム戦略実現技術開発・実証事業のうち農林水産研究の推進（委託プロジェクト研究）（品種識別技術の開発）」委託事業、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(71)【出願人】
【識別番号】592134583
【氏名又は名称】愛媛県
(71)【出願人】
【識別番号】504147243
【氏名又は名称】国立大学法人 岡山大学
(71)【出願人】
【識別番号】503335179
【氏名又は名称】株式会社ファスマック
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】島田 武彦
(72)【発明者】
【氏名】岡本 充智
(72)【発明者】
【氏名】重松 幸典
(72)【発明者】
【氏名】奥貞 丈博
(72)【発明者】
【氏名】木下 佳
(72)【発明者】
【氏名】門田 有希
(72)【発明者】
【氏名】高崎 一人
(72)【発明者】
【氏名】竹内 朋幸
(72)【発明者】
【氏名】遠藤 朋子
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA23
4B063QA13
4B063QA18
4B063QQ09
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】簡易にカンキツの品種を識別できる技術を実現する
【解決手段】カンキツの品種の識別方法は、下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）ＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）ＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）ＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを用いて、カンキツ被検体の品種を特定する特定工程を含む、識別方法。
【選択図】なし
【解決手段】カンキツの品種の識別方法は、下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）ＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）ＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）ＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）ＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを用いて、カンキツ被検体の品種を特定する特定工程を含む、識別方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
カンキツの品種の識別方法であって、
下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを用いて、カンキツ被検体の品種を特定する特定工程を含む、識別方法。
下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを用いて、カンキツ被検体の品種を特定する特定工程を含む、識別方法。
【請求項2】
前記品種は、みはや、あすき、愛媛果試第２８号、甘平、媛小春、および／または、愛媛果試第４８号である、請求項１に記載の識別方法。
【請求項3】
前記特定工程において、前記カンキツ被検体について、下記（１）～（７）からなる群：
（１）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍおよび前記Ｔｃｓ１－Ｐ８６を用いた、みはやの特定；
（２）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ２５および前記ＩＮＤ２３５－ｓを用いた、あすきの特定；
（３）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ６８を用いた、愛媛果試第２８号の特定；
（４）前記Ｃｐ０４１９－ｓ、ＩＮＤ２６５－ｌおよび前記ＩＮＤ４４－ｌを用いた、甘平の特定；
（５）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ８０を用いた、媛小春の特定；
（６）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅおよび前記Ｔｃｓ１－ＣＬ２６を用いた、愛媛果試第４８号の特定；および
（７）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ１０および前記Ｔｃｓ２－ＣＬ３０を用いた、甘平の特定；
より選択される少なくとも１つの品種の特定を行う、請求項１に記載の識別方法。
（１）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍおよび前記Ｔｃｓ１－Ｐ８６を用いた、みはやの特定；
（２）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ２５および前記ＩＮＤ２３５－ｓを用いた、あすきの特定；
（３）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ６８を用いた、愛媛果試第２８号の特定；
（４）前記Ｃｐ０４１９－ｓ、ＩＮＤ２６５－ｌおよび前記ＩＮＤ４４－ｌを用いた、甘平の特定；
（５）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ８０を用いた、媛小春の特定；
（６）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅおよび前記Ｔｃｓ１－ＣＬ２６を用いた、愛媛果試第４８号の特定；および
（７）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ１０および前記Ｔｃｓ２－ＣＬ３０を用いた、甘平の特定；
より選択される少なくとも１つの品種の特定を行う、請求項１に記載の識別方法。
【請求項4】
前記特定工程において、品種の特定に用いる前記ＩｎＤｅｌマーカーを含む領域を増幅するプライマーを用いて、前記カンキツ被検体のＤＮＡにおける前記領域を増幅する、請求項１に記載の識別方法。
【請求項5】
前記特定工程において、前記プライマーにはタグ鎖が付加されており、当該タグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブが固定された固相において、前記プライマーを用いて増幅された増幅産物を拡散させ、前記プローブにハイブリダイズする増幅産物を検出する、請求項４に記載の識別方法。
【請求項6】
カンキツの品種の識別キットであって、
下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
の少なくとも１つを含む領域を増幅するためのプライマーを備えた、識別キット。
下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
の少なくとも１つを含む領域を増幅するためのプライマーを備えた、識別キット。
【請求項7】
前記プライマーとして、
（ａ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｂ’）前記Ｔｃｓ１－Ｐ８６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｃ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ２５を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｄ’）前記ＩＮＤ２３５－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｅ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ６８を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｆ’）前記Ｃｐ０４１９－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｇ’）前記ＩＮＤ２６５－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｈ’）前記ＩＮＤ４４－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｉ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ８０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｊ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｋ’）前記Ｔｃｓ１－ＣＬ２６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｌ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ１０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；および
（ｍ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ３０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号４０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号４１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーセットを含む、請求項６に記載の識別キット。
（ａ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｂ’）前記Ｔｃｓ１－Ｐ８６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｃ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ２５を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｄ’）前記ＩＮＤ２３５－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｅ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ６８を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｆ’）前記Ｃｐ０４１９－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｇ’）前記ＩＮＤ２６５－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｈ’）前記ＩＮＤ４４－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｉ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ８０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｊ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｋ’）前記Ｔｃｓ１－ＣＬ２６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｌ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ１０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；および
（ｍ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ３０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号４０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号４１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーセットを含む、請求項６に記載の識別キット。
【請求項8】
前記少なくとも１つのプライマーセットに含まれるプライマーの一方には、タグ鎖が付加されており、
前記タグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブが固定された固相を有する核酸検出デバイスをさらに備えた、請求項７に記載の識別キット。
前記タグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブが固定された固相を有する核酸検出デバイスをさらに備えた、請求項７に記載の識別キット。
【請求項9】
コントロールマーカーを含む領域を増幅するためのプライマーと、当該プライマーに付加されるタグ鎖とをさらに備えた、請求項８に記載の識別キット。
【請求項10】
下記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを含む領域の増幅産物に付加されたタグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブと、
前記プローブが固定された固相と
を備えた、カンキツの品種を識別するための核酸検出デバイス。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを含む領域の増幅産物に付加されたタグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブと、
前記プローブが固定された固相と
を備えた、カンキツの品種を識別するための核酸検出デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、カンキツの品種を識別するための、識別方法、識別キット、および、核酸検出デバイスに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、果樹類の優良品種が国外に流出し、無断で栽培される事例が顕在化している。今後更に、これらの生産物および加工品が違法流通することによる権利侵害の発生が懸念されることから、権利侵害が想定される国において育成者の権利を保護するための品種登録を進めると共に、権利侵害を立証するためのＤＮＡ品種識別技術の開発が進められている。
【0003】
育成者権の侵害を監視するためには、税関等の水際において輸入を阻止することが重要である。このため、既存の品種識別技術に加えて、税関等の検査現場において簡易かつ迅速に品種識別が可能な技術の開発が求められている。
【0004】
植物品種の識別方法として、増幅断片制限断片長多型（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence；ＣＡＰＳ）のようなＤＮＡ多型を利用したＤＮＡ多型分析が知られている（非特許文献１）。非特許文献１には、国内に流通するカンキツの品種を、カンキツの種苗等の被検体から抽出したＤＮＡを用いてＣＡＰＳ分析することが記載されている。
【0005】
また、ＣＡＰＳのようにＤＮＡ多型分析に用いられる他のＤＮＡ多型として、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ）が知られている（非特許文献２）。非特許文献２には、果実や加工品を対象としたＳＮＰマーカーによる品種識別技術が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Fujii, H. et al., DNA Polymorphism 27: 71-79, 2019
【非特許文献2】Endo, T. et al., Breed Sci 70: 363-372, 2020
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、非特許文献１のようなＣＡＰＳ分析法は、多型検出のために比較的長いＰＣＲ増幅断片を利用するため、分析に適した夾雑物の少ないＤＮＡを得ることが容易ではない果実などの検体では、分析結果が不安定になり得る可能性がある。また、非特許文献２のようなＳＮＰ分析法は、必要となるＰＣＲ増幅断片が短いため、分析精度は向上するが、分析に定量ＰＣＲ分析機器が必要であることや、ＳＮＰマーカーにおいて利用するプローブ等の試薬が高価であることから、ランニングコストに課題がある。したがって、より簡易に目的の品種を識別できる技術の開発が求められている。
【0008】
本発明の一態様は、上述した問題点を解決するためのものであり、その目的は、カンキツ被検体が対象とするカンキツ品種であるか否かを迅速かつ簡易に識別できる技術を実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記課題を解決するために、本発明の一態様に係るカンキツの品種の識別方法は、
下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを用いて、カンキツ被検体の品種を特定する特定工程を含む。
下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを用いて、カンキツ被検体の品種を特定する特定工程を含む。
【0010】
また、本発明の一態様に係るカンキツの品種の識別キットは、
下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
の少なくとも１つを含む領域を増幅するためのプライマーを備えている。
下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
の少なくとも１つを含む領域を増幅するためのプライマーを備えている。
【0011】
また、本発明の一態様に係るカンキツの品種を識別するための核酸検出デバイスは、
下記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを含む領域の増幅産物に付加されたタグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブと、前記プローブが固定された固相とを備えている。
下記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを含む領域の増幅産物に付加されたタグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブと、前記プローブが固定された固相とを備えている。
【発明の効果】
【0012】
本発明の一態様によれば、カンキツ被検体が対象とするカンキツ品種であるか否かを迅速かつ簡易に識別できる技術を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】実施例における、品種特異的なＤＮＡ多型のＰＣＲによる検証結果を示す図である。
【図2】実施例における、我国のカンキツ有望品種のためのＣ－ＰＡＳ検出キットによる検出パターンを示す図である。
【図3】実施例における、我国のカンキツ有望品種のためのＣ－ＰＡＳ検出キットによる検出パターンを示す図である。
【図4】実施例における、我国のカンキツ有望品種についての品種特異的ＤＮＡマーカーのＰＣＲ断片の電気泳動パターンを示す図である。
【図5】実施例における、我国のカンキツ有望品種についての品種特異的ＤＮＡマーカーのＰＣＲ断片の電気泳動パターンを示す図である。
【図6】実施例における、カンキツ品種のＣ－ＰＡＳ検出キットを用いた、代表的な結果を示す。
【図7】実施例における、甘平についての品種特異的ＤＮＡマーカーのＰＣＲ断片の電気泳動パターンを示す図である。
【図8】実施例における、甘平のためのＣ－ＰＡＳ検出キットによる検出パターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の一態様について、詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）、Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
【0015】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、核酸は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）、または、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。本明細書において使用される場合、塩基の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記を使用する。また、本明細書において、「３’末端」とは、遺伝子配列の下流における端部領域または位置を意味し、「５’末端」とは、遺伝子配列の上流における端部領域または位置を意味している。
【0016】
〔カンキツの品種〕
本明細書において、カンキツの品種は、ミカン科ミカン亜科のミカン属（Citrus）、キンカン属（Fortunella）、およびカラタチ属（Poncirus）等に属する植物体の集合であり、その特性の相違により他の植物体の集合と区別可能な植物体の集合を意味している。また、カンキツの品種は、日本の農林水産省に品種登録された品種であってもよいし、品種登録されていない品種であってもよいし、品種として確立される前の育成段階のものを含む。
本明細書において、カンキツの品種は、ミカン科ミカン亜科のミカン属（Citrus）、キンカン属（Fortunella）、およびカラタチ属（Poncirus）等に属する植物体の集合であり、その特性の相違により他の植物体の集合と区別可能な植物体の集合を意味している。また、カンキツの品種は、日本の農林水産省に品種登録された品種であってもよいし、品種登録されていない品種であってもよいし、品種として確立される前の育成段階のものを含む。
【0017】
このようなカンキツの品種は、例えば、ウンシュウミカン（Citrus unshiu Marc.）の品種（あるいは宮川早生、石川温州）、ダンカングレープフルーツ（Citrus paradisi Macf.）、トロビタスイートオレンジ（Citrus sinensis (L.) Osbeck）、リスボンレモン(Citrus limon (L.) Burm. f.)、不知火（あるいはデコポン（登録商標））、イヨカン（Citrus iyo hort. ex Tanaka）の品種、ナツダイダイ（Citrus natsudaidai Hayata）の品種（あるいは川野夏橙）、ハッサク（Citrus hassaku hort. ex Tanaka）の品種、ポンカン（Citrus reticulata Blanco）の品種（あるいは太田ポンカン）、璃の香、みはや、あすみ、あすき、麗紅、津之輝、西南のひかり、津之望、はるひ、清見、せとか、はるみ、はれひめ、甘平、愛媛果試第２８号（あるいは紅まどんな（登録商標））、愛媛果試第４８号（あるいは紅プリンセス（登録商標））、媛小春、ユズ（Citrus junos hort. ex Tanaka）の品種、ブンタン（Citrus grandis Osbeck）の品種（あるいは土佐文旦）、河内晩柑、ヒュウガナツ（Citrus tamurana hort. ex Tanaka）の品種、スダチ（Citrus sudachi hort. ex Tanaka）の品種、ブッシュカン（Citrus limonimedica Lush.）の品種、ユウコウ（Citrus yukou hort. ex Tanaka）の品種、シークヮーサー（Citrus depressa Hayata）の品種（あるいは大宜味クガニー）、カラ（カラマンダリン）、タンカン（Citrus tankan Hayata）の品種（あるいはＴ１３２）、セミノール、カボス（Citrus sphaerocarpa hort. ex Tanaka）の品種、天草、黄金柑、キシュウミカン(Citrus kinokuni hort. ex Tanaka)、スイートスプリング、サンボウカン(Citrus sulcata hort. ex. Ik. Takahashi)、アンコール、たまみ、西之香、サガマンダリン、マーコット、南香、天香、かんきつ中間母本農６号、およびカブス（Citrus aurantium L.）の品種（あるいはダイダイ）である。
【0018】
これらの中でも、宮川早生、ダンカングレープフルーツ、トロビタスイートオレンジ、リスボンレモン、璃の香、不知火、イヨカンの品種、川野夏橙、ハッサクの品種、太田ポンカン、みはや、あすみ、あすき、麗紅、津之輝、西南のひかり、津之望、はるひ、清見、せとか、はるみ、はれひめ、甘平、愛媛果試第２８号、媛小春、および、愛媛果試第４８号の２６の品種は、日本国内の出荷量の約９４％を占める主要な品種である。
【0019】
本明細書において、カンキツの品種の識別とは、品種が不特定の１種または複数種のカンキツ被検体を解析して、カンキツ被検体の品種を他の品種と区別すること、カンキツ被検体の品種が特定の品種に含まれているか否かを判定すること、カンキツ被検体の品種を特定すること、カンキツ被検体の品種を同定すること等を意味する。
【0020】
本明細書において、カンキツ被検体は、ミカン科ミカン亜科のミカン属（Citrus）、キンカン属（Fortunella）、およびカラタチ属（Poncirus）等に属する植物体の生鮮果実（果皮を含む）、種子、苗、花、葉、樹木、根、芽、およびこれらの一部分、ならびに、これらの加工品、特に加工果実が挙げられる。当該植物体の加工果実としては、果汁（ジュース）、果実缶詰、果実瓶詰、乾燥果実、ジャム、砂糖漬け果皮等が挙げられる。なお、加工品および加工果実は、加工過程においてＤＮＡの分解が抑えられ、分析に適したＤＮＡが取得可能なものであることが好ましい。税関等においてカンキツの品種識別に実用的に使用し得るという観点から、カンキツ被検体として、生鮮果実を好適に使用することができる。また、加工業者の検査現場等において原材料を確認するために、カンキツ被検体として、加工品または加工果実を好適に使用することができる。
【0021】
〔カンキツの品種の識別方法〕
本発明の一態様に係るカンキツの品種の識別方法は、挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカーを用いてカンキツの品種を識別する方法である。識別方法は、下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを用いて、カンキツ被検体の品種を特定する特定工程を含む。
本発明の一態様に係るカンキツの品種の識別方法は、挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカーを用いてカンキツの品種を識別する方法である。識別方法は、下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを用いて、カンキツ被検体の品種を特定する特定工程を含む。
【0022】
本発明の一態様に係る識別方法により識別するカンキツの品種は、一例として、みはや、あすき、愛媛果試第２８号、甘平、媛小春、および、愛媛果試第４８号である。識別方法は、一例として、カンキツ被検体が、みはや、あすき、愛媛果試第２８号、甘平、媛小春、および、愛媛果試第４８号の６品種のいずれであるかを特定する。また、識別方法は、一例として、カンキツ被検体が上記６品種以外の品種であることを特定する。
【0023】
（ＩｎＤｅｌマーカー）
本発明の一態様に係る識別方法においては、上記（ａ）～（ｍ）の１３個のＩｎＤｅｌマーカーのうちの少なくとも１つを用いた多型分析を行う。ここで、ＩｎＤｅｌは、ＤＮＡの塩基配列中のある特定の領域内に、配列の挿入または欠失の変異が見られるＤＮＡ多型、および、当該変異箇所においてさらに置換または付加の変異が見られるＤＮＡ多型を意味している。識別方法において、ＩｎＤｅｌは、クレメンティン（Citrus clementina v1.0）のゲノム配列を基準とした多型である。基準品種であるクレメンティン（Citrus clementina v1.0）のゲノム配列は、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅのゲノムデータベース（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）に公表されている。
本発明の一態様に係る識別方法においては、上記（ａ）～（ｍ）の１３個のＩｎＤｅｌマーカーのうちの少なくとも１つを用いた多型分析を行う。ここで、ＩｎＤｅｌは、ＤＮＡの塩基配列中のある特定の領域内に、配列の挿入または欠失の変異が見られるＤＮＡ多型、および、当該変異箇所においてさらに置換または付加の変異が見られるＤＮＡ多型を意味している。識別方法において、ＩｎＤｅｌは、クレメンティン（Citrus clementina v1.0）のゲノム配列を基準とした多型である。基準品種であるクレメンティン（Citrus clementina v1.0）のゲノム配列は、Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅのゲノムデータベース（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）に公表されている。
【0024】
「配列番号Ｘ（Ｘ＝１～１３）で表される塩基配列（塩基配列Ｘとする）のＹ番目からＺ番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー」において、塩基配列Ｘは、基準となるカンキツ品種（品種名：クレメンティン（Citrus clementina v1.0））由来の塩基配列である。したがって、塩基配列Ｘは、他のカンキツ品種においては、ＩｎＤｅｌマーカーの部分以外でも塩基配列が異なる部分が含まれ得る。
【0025】
他のカンキツ品種において、塩基配列Ｘに対応する塩基配列を塩基配列Ｘ’としたとき、「配列番号Ｘで表される塩基配列のＹ番目からＺ番目の塩基に相当する」とは、次のとおりである。塩基配列ＸのＹ番目からＺ番目の塩基（塩基配列ＸとＸ’とがＹ番目からＺ番目の塩基以外で同一の場合）や、塩基配列Ｘ’上で当該塩基に対応している塩基を指す。このＩｎＤｅｌマーカーが位置するゲノム上の領域は、多数のカンキツ品種間で保存されているため、ホモロジー検索等の手法によって、このＩｎＤｅｌマーカーを特定することができる。
【0026】
上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーにおいて、配列の挿入または欠失の位置、および、挿入配列または欠失配列は、以下のとおりである：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目と１２８番目との間の欠失；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目と３５４番目との間の欠失；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目までの塩基からなる挿入配列
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基からなる挿入配列；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基からなる挿入配列。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目と１２８番目との間の欠失；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目と３５４番目との間の欠失；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目までの塩基からなる挿入配列；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目までの塩基からなる挿入配列
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基からなる挿入配列；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基からなる挿入配列。
【0027】
上記（ａ）のＩｎＤｅｌマーカーについて、配列番号１に示す塩基配列は、１番目から１７５番目までの塩基からなる挿入配列が存在する挿入型配列を示し、当該挿入配列が存在しない場合には欠失型配列を示す。上記（ｂ）～（ｃ）、（ｅ）、（ｇ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーについても、上記（ａ）のＩｎＤｅｌマーカーと同様に挿入型配列および欠失型配列が示されている。
【0028】
上記（ｄ）のＩｎＤｅｌマーカーについて、配列番号４に示す塩基配列は、１２７番目の塩基と１２８番目の塩基との間に配列が存在しない欠失型配列を示し、１２７番目の塩基と１２８番目の塩基との間に挿入配列が存在する場合には挿入型配列を示す。上記（ｆ）のＩｎＤｅｌマーカーについても、上記（ｄ）のＩｎＤｅｌマーカーと同様に欠失型配列および挿入型配列が示されている。
【0029】
本発明者らは、カンキツ品種におけるレトロトランスポゾン等の挿入や欠損により生じるＩｎＤｅｌ多型について鋭意検討した。その結果、上述したカンキツの６品種を識別可能であり、多型検出のためのＰＣＲプライマーの設計等の各種条件を満たす１３個のＩｎＤｅｌマーカーを見出し、本発明を完成させた。上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーは、カンキツ被検体において、選択された１３個のＩｎＤｅｌ多型のそれぞれの存在を検出するためのＤＮＡマーカーである。
【0030】
識別方法においては、ＩｎＤｅｌマーカーを用いて、識別の対象となるカンキツ被検体のＤＮＡの塩基配列におけるＩｎＤｅｌ多型を検出し、品種ごとに対応付けられたＩｎＤｅｌ多型の情報と比較することで、カンキツ被検体の品種を識別する。識別方法においては、上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーにおける配列の挿入または配列の欠失を検出することにより、カンキツ被検体の品種を特定する。識別方法においては、識別の対象となるカンキツの品種に応じて、上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーの中から、適切な種類および数のＩｎＤｅｌマーカーを任意に選択して組み合わせて、カンキツの品種識別用ＩｎＤｅｌマーカーサブセットを構成する。
【0031】
上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーの中から適切なＩｎＤｅｌマーカーまたはその組み合わせを選択することにより、カンキツ被検体の品種を識別することができる。具体的には、品種が不特定のカンキツ被検体が、上記６品種のいずれであるかを特定することができる。さらには、カンキツ被検体が、上記６品種以外の品種であるか否かについても判定することができる。
【0032】
本発明の一態様に係る識別方法は、上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーから選択される１つ、２つ、または３つのＩｎＤｅｌマーカーを用いて、上記６品種に関してカンキツ被検体を識別する。識別方法は、特定工程において、カンキツ被検体について、下記（１）～（７）からなる群：
（１）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍおよび前記Ｔｃｓ１－Ｐ８６を用いた、みはやの特定；
（２）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ２５および前記ＩＮＤ２３５－ｓを用いた、あすきの特定；
（３）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ６８を用いた、愛媛果試第２８号の特定；
（４）前記Ｃｐ０４１９－ｓ、ＩＮＤ２６５－ｌおよび前記ＩＮＤ４４－ｌを用いた、甘平の特定；
（５）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ８０を用いた、媛小春の特定；
（６）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅおよび前記Ｔｃｓ１－ＣＬ２６を用いた、愛媛果試第４８号の特定；および
（７）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ１０および前記Ｔｃｓ２－ＣＬ３０を用いた、甘平の特定；
より選択される少なくとも１つの品種の特定を行う。
（１）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍおよび前記Ｔｃｓ１－Ｐ８６を用いた、みはやの特定；
（２）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ２５および前記ＩＮＤ２３５－ｓを用いた、あすきの特定；
（３）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ６８を用いた、愛媛果試第２８号の特定；
（４）前記Ｃｐ０４１９－ｓ、ＩＮＤ２６５－ｌおよび前記ＩＮＤ４４－ｌを用いた、甘平の特定；
（５）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ８０を用いた、媛小春の特定；
（６）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅおよび前記Ｔｃｓ１－ＣＬ２６を用いた、愛媛果試第４８号の特定；および
（７）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ１０および前記Ｔｃｓ２－ＣＬ３０を用いた、甘平の特定；
より選択される少なくとも１つの品種の特定を行う。
【0033】
すなわち、特定工程においては、上記（ａ）のＩｎＤｅｌマーカーと上記（ｂ）のＩｎＤｅｌマーカーとを用いて、みはやを特定する。また、特定工程においては、上記（ｃ）のＩｎＤｅｌマーカーと上記（ｄ）のＩｎＤｅｌマーカーとを用いて、あすきを特定する。さらに、特定工程においては、上記（ｅ）のＩｎＤｅｌマーカーを用いて、愛媛果試第２８号を特定する。また、特定工程においては、上記（ｆ）のＩｎＤｅｌマーカー、上記（ｇ）のＩｎＤｅｌマーカー、および上記（ｈ）のＩｎＤｅｌマーカーを用いて、甘平を特定する。さらに、特定工程においては、上記（ｉ）のＩｎＤｅｌマーカーを用いて、媛小春を特定する。また、特定工程においては、上記（ｊ）のＩｎＤｅｌマーカーと上記（ｋ）のＩｎＤｅｌマーカーとを用いて、愛媛果試第４８号を特定する。また、特定工程においては、上記（ｌ）のＩｎＤｅｌマーカーと上記（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーとを用いて、甘平を特定する。
【0034】
一例として、特定工程においては、上記（ａ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列と上記（ｂ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列とを検出した場合に、カンキツ被検体の品種がみはやであると特定する。また、特定工程においては、上記上記（ｃ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列と上記（ｄ）のＩｎＤｅｌマーカーの欠失型配列とを検出した場合に、カンキツ被検体の品種があすきであると特定する。さらに、特定工程においては、上記（ｅ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列を検出した場合に、カンキツ被検体の品種が愛媛果試第２８号であると特定する。また、特定工程においては、上記（ｆ）のＩｎＤｅｌマーカーの欠失型配列、上記（ｇ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列、および上記（ｈ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列を検出した場合に、カンキツ被検体の品種が甘平であると特定する。さらに、特定工程においては、上記（ｉ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列を検出した場合に、カンキツ被検体の品種が媛小春であると特定する。また、特定工程においては、上記（ｊ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列と上記（ｋ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列とを検出した場合に、カンキツ被検体の品種が愛媛果試第４８号であると特定する。また、特定工程においては、上記（ｌ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列と上記（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーの挿入型配列とを検出した場合に、カンキツ被検体の品種が甘平であると特定する。
【0035】
上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーと上記６品種との関係は、後述する表６に示されている。したがって、例えば、上記６品種のうちの特定の２品種のいずれであるかを識別するだけである場合は、上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーのうちから、当該２品種の間で相違する１個のＩｎＤｅｌマーカーを選択し、解析することもできる。
【0036】
（ＩｎＤｅｌ多型分析）
本発明の一態様に係る識別方法の特定工程において、上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーを用いてカンキツ被検体のＩｎＤｅｌ多型分析を行う方法としては、特に限定されず、ＩｎＤｅｌ多型を検出する公知のＩｎＤｅｌ多型分析方法を用いることができる。このような公知のＩｎＤｅｌ多型分析方法には、カンキツ被検体のＰＣＲ増幅断片中のＩｎＤｅｌ多型を検出することによりＩｎＤｅｌ多型分析する方法が含まれる。
本発明の一態様に係る識別方法の特定工程において、上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーを用いてカンキツ被検体のＩｎＤｅｌ多型分析を行う方法としては、特に限定されず、ＩｎＤｅｌ多型を検出する公知のＩｎＤｅｌ多型分析方法を用いることができる。このような公知のＩｎＤｅｌ多型分析方法には、カンキツ被検体のＰＣＲ増幅断片中のＩｎＤｅｌ多型を検出することによりＩｎＤｅｌ多型分析する方法が含まれる。
【0037】
すなわち、特定工程においては、一例として、品種の特定に用いるＩｎＤｅｌマーカーを含む領域を増幅するプライマーを用いて、カンキツ被検体のＤＮＡにおける前記領域を増幅する。カンキツ被検体のＤＮＡの前記領域の増幅は、カンキツ被検体から抽出したＤＮＡを鋳型にして、ＩｎＤｅｌマーカーを含む領域を増幅するプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行う。そして、得られた増幅断片におけるＩｎＤｅｌ多型（遺伝子型）を決定し、決定されたＩｎＤｅｌ多型と品種との関係を示す表６に示すようなデータに基づいて、カンキツ被検体の品種を特定する。
【0038】
また、特定工程においては、一例として、ＰＣＲが適切に行われているか否かを決定するためのコントロールマーカーを用いてもよい。これにより、ＰＣＲ増幅断片の存在または不在に基づいてカンキツの品種を識別する識別方法において、識別精度を向上させることができる。このようなコントロールマーカーは、一例として、葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子、ｍａｔＫ遺伝子、ｐｓｂＡ遺伝子等である。すなわち、特定工程においては、ＩｎＤｅｌマーカーを含む領域を増幅するプライマーと共に、コントロールマーカーを含む領域を増幅するプライマーを用いて、ＰＣＲを実行してもよい。
【0039】
ここで、カンキツ被検体からＤＮＡを抽出する方法としては、特に限定されず、公知のＤＮＡ抽出方法を用いることができる。また、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて、ＤＮＡを抽出してもよい。被検体の種類および夾雑物の量等に応じて、ＤＮＡ抽出工程の前に、適宜に前処理を行ってもよい。例えば、被検体が固体である場合は、ＤＮＡ抽出工程の前に、被検体を、液化窒素等により予め粉末化しておいてもよい。また、被検体が液体である場合は、被検体を遠心分離することにより固形分を沈殿させて、回収されるペレットを、ＤＮＡ抽出工程に用いてもよい。さらに、被検体が生鮮果実または加工果実等である場合は、ＤＮＡ抽出工程の前に、洗浄バッファによる洗浄を行い、被検体に含まれる糖類およびフェノール類等をある程度除去してもよい。また、被検体から抽出されたＤＮＡは、ＰＣＲ反応において鋳型として用いるために、必要に応じて洗浄または精製してもよい。
【0040】
ＰＣＲにより、上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーのいずれかを含む領域を増幅するためのプライマーは、標的のＩｎＤｅｌマーカーを含む領域のＤＮＡ断片を増幅することができるものである限り、特に限定されない。カンキツ被検体が生鮮果実および加工果実等である場合には、抽出されるＤＮＡサンプル中の夾雑物が多いため、増幅断片の長さが短くなるようにプライマーセットを設計することが好ましい。例えば、プライマー増幅断片の長さが、５００塩基対（ｂｐ）以下となるようにプライマーセットを設計することが好ましく、４５０ｂｐ以下となるようにプライマーセットを設計することがより好ましく、４００ｂｐ以下、３００ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、または、１５０ｂｐ以下となるようにプライマーセットを設計してもよい。
【0041】
上記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーのいずれかを含む領域を増幅するためのプライマーセットは、フォワードプライマーである第１のプライマーと、リバースプライマーである第２のプライマーとが含まれる。これらのプライマーの長さは、例えば、１５ｂｐ以上、１６ｂｐ以上、１７ｂｐ以上、１８ｂｐ以上、または２０ｂｐ以上であってもよく、５０ｂｐ以下、４０ｂｐ以下、または３０ｂｐ以下であってもよい。
【0042】
ＩｎＤｅｌマーカーを含む領域を増幅するためのプライマーセットは、下記（ａ’）～（ｍ’）：
（ａ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｂ’）前記Ｔｃｓ１－Ｐ８６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｃ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ２５を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｄ’）前記ＩＮＤ２３５－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｅ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ６８を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｆ’）前記Ｃｐ０４１９－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｇ’）前記ＩＮＤ２６５－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｈ’）前記ＩＮＤ４４－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｉ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ８０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｊ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｋ’）前記Ｔｃｓ１－ＣＬ２６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｌ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ１０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；および
（ｍ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ３０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号４０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号４１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
からなる群より選択されてもよい。
（ａ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｂ’）前記Ｔｃｓ１－Ｐ８６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｃ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ２５を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｄ’）前記ＩＮＤ２３５－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｅ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ６８を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｆ’）前記Ｃｐ０４１９－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｇ’）前記ＩＮＤ２６５－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｈ’）前記ＩＮＤ４４－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｉ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ８０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｊ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｋ’）前記Ｔｃｓ１－ＣＬ２６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｌ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ１０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；および
（ｍ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ３０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号４０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号４１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
からなる群より選択されてもよい。
【0043】
なお、例えば、上記（ａ’）のプライマーセットにおいて、第１のプライマーには、配列番号１２の塩基配列を全て含み、より長いプライマー、ならびに、配列番号１２の塩基配列の少なくとも一部（例えば１５ｂｐ）を含み、その前または後に他の塩基配列を含むプライマーも含まれる。
【0044】
上記（ａ’）および（ｂ’）のプライマーセットを用いることで、みはや、および、みはやと同じ遺伝子型を示すみはやの後代品種においては、配列番号１および２に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、上記（ａ）および（ｂ）のＩｎＤｅｌマーカーに相当する塩基配列を検出することができる。
【0045】
上記（ｃ’）および（ｄ’）のプライマーセットを用いることで、あすき、および、あすきと同じ遺伝子型を示すあすきの後代品種においては、配列番号３および４に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、上記（ｃ）および（ｄ）のＩｎＤｅｌマーカーに相当する塩基配列を検出することができる。
【0046】
上記（ｅ’）のプライマーセットを用いることで、愛媛果試第２８号、および、愛媛果試第２８号と同じ遺伝子型を示す愛媛果試第２８号の後代品種においては、配列番号５に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、上記（ｅ）のＩｎＤｅｌマーカーに相当する塩基配列を検出することができる。
【0047】
上記（ｆ’）、（ｇ’）、および（ｈ’）のプライマーセットを用いることで、甘平、および、甘平と同じ遺伝子型を示す甘平の後代品種においては、配列番号６～８に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、上記（ｆ）、（ｇ）、および（ｈ）のＩｎＤｅｌマーカーに相当する塩基配列を検出することができる。
【0048】
上記（ｉ’）のプライマーセットを用いることで、媛小春、および、媛小春と同じ遺伝子型を示す媛小春の後代品種においては、配列番号９に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、上記（ｉ）のＩｎＤｅｌマーカーに相当する塩基配列を検出することができる。
【0049】
上記（ｊ’）および（ｋ’）のプライマーセットを用いることで、愛媛果試第４８号、および、愛媛果試第４８号と同じ遺伝子型を示す愛媛果試第４８号の後代品種においては、配列番号１０および１１に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、上記（ｊ）および（ｋ）のＩｎＤｅｌマーカーに相当する塩基配列を検出することができる。
【0050】
上記（ｌ’）および（ｍ’）のプライマーセットを用いることで、甘平、および、甘平と同じ遺伝子型を示す甘平の後代品種においては、配列番号３６および３７に示す塩基配列からなるＰＣＲ増幅産物が得られ、上記（ｌ）および（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカーに相当する塩基配列を検出することができる。
【0051】
また、例えば、（ａ’）のプライマーセットは、配列番号１２に示す塩基配列またはその均等な塩基配列からなる第１のプライマーと、配列番号１３に示す塩基配列またはその均等な塩基配列からなる第２のプライマーとの組み合わせであってもよい。なお、本願明細書において、「均等な塩基配列」とは、品種間における塩基配列のバリエーションに対応する塩基配列であってよい。所定の塩基配列に均等な塩基配列とは、所定の塩基配列に対して、同一性が８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％以上である塩基配列や、数個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１、２または３個）の塩基の修飾（置換、欠失、挿入または付加）を含む塩基配列であってよい。このような均等な塩基配列は、当該技術分野における当業者にとって明らかであり、カンキツの品種の遺伝子情報を登録しているデータベースを参照することにより、または、カンキツの品種において染色体番号および塩基のゲノム上の位置により特定されるＩｎＤｅｌ多型の近傍領域の塩基配列を解読することにより、決定することができる。
【0052】
ＩｎＤｅｌ多型分析におけるＰＣＲは、単独のプライマーセットを含む反応系でＤＮＡ断片を増幅するシングルプレックスＰＣＲ、または、複数のプライマーセットを含む反応系で遺伝子増幅するマルチプレックスＰＣＲ、のいずれであってもよい。マルチプレックスＰＣＲの場合は、異なる波長を有する蛍光物質（例えば、ＮＥＤ、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＰＥＴ）により標識したプライマーセットを混合してもよい。
【0053】
ＰＣＲの反応条件は、用いるＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ装置の種類、増幅断片の長さ等に応じて適宜に設定され得る。サイクル条件としては、変性工程、アニーリング工程および伸長工程の３工程を１サイクルとする３ステップＰＣＲ法、および、変性工程とアニーリングおよび伸長工程との２工程を１サイクルとする２ステップＰＣＲ法を適用することができる。２ステップＰＣＲ法を用いることにより、ＰＣＲにかかる時間を短縮することができる。２ステップＰＣＲ法のサイクル条件の一例としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの活性化を９０～１００℃で５～１５分間（例えば、９５℃で１０分間）行った後に、変性工程（９０～１００℃で１０～２０秒間、例えば、９５℃で１５秒間）とアニーリングおよび伸長工程（５５～６５℃で４５秒間～２分間、例えば、６０℃で１分間）とを１サイクルとして、合計３０～５０サイクル、好適には、４０サイクル行う。鋳型となるＤＮＡの量および品質に応じて、ＩｎＤｅｌマーカーを安定的に検出するために、サイクル数を適宜調整してもよい。例えば、加工果実等から抽出されるＤＮＡは、葉等から抽出されるＤＮＡよりも、量および品質が低下するため、サイクル数を４５～５０サイクル程度に増加させてもよい。
【0054】
マルチプレックスＰＣＲの場合、複数のターゲットの増幅を１つのＰＣＲ反応系において良好に実行できるように、反応条件を調整する。マルチプレックスＰＣＲの反応条件は、一例として、９８℃で１０秒間の変性、５６℃で５秒間のアニーリング、および、６８℃で２秒間の伸長を１サイクルとして、合計３２サイクル行い、６８℃で３０秒間の最終伸長を１サイクル行う条件である。
【0055】
ＩｎＤｅｌ多型分析におけるＰＣＲとして、ＰＣＲによる増幅およびＩｎＤｅｌ多型の特定を行うＴａｑＭａｎ（登録商標）－ＰＣＲ法のようなリアルタイムＰＣＲを用いてもよい。また、ＰＣＲにより増幅した増幅断片においてＩｎＤｅｌ多型を特定する方法として、ＤＮＡシーケンス解析、アガロースゲル電気泳動を利用する方法等の公知の方法を用いてもよい。
【0056】
本発明の一態様に係る識別方法の特定工程において、ＩｎＤｅｌマーカーを含む領域を増幅するプライマーにはタグ鎖が付加されており、当該タグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブが固定された固相において、プライマーを用いて増幅された増幅産物を拡散させ、プローブにハイブリダイズする増幅産物を検出する。
【0057】
すなわち、特定工程においては、ＩｎＤｅｌマーカーを含む領域の増幅産物を、核酸クロマトグラフィーにより検出し、カンキツの品種を識別し得る。このような核酸クロマトグラフィーは、液体を拡散または移動可能な多孔質状の固相担体を含む、核酸検出デバイスを用いて行うことができる。核酸クロマトグラフィーにおいては、キャピラリー現象により、固相担体内において増幅産物を含む展開液を移動させる。固相担体には、プライマーに付加されたタグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブが固定されている。そして、固相担体内において移動する展開液中に含まれる増幅産物のタグ鎖が固相上のプローブとハイブリダイズすることにより、増幅産物が固相担体に捕捉される。これにより、標的となるＩｎＤｅｌマーカーを含む領域の増幅産物を検出する。
【0058】
核酸クロマトグラフィーを利用した増幅産物の検出は、BioMed Research International 2014（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4251647/）、Journal of Biotechnology 2014（https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165614002946?via%3Dihub）、特開２０１３－５９３１９、特開２０１６－１４４４５７、または、特開２０１４－１８１５０の記載を参照することにより、実行することができる。
【0059】
タグ鎖は、固相上のプローブに特異的にハイブリダイズ可能なタグ配列を有している。タグ配列は、プローブのタグ鎖検出用の配列の塩基長に一致する塩基長を有しており、好ましくは、２０～５０塩基長であり、より好ましくは、２０～２５塩基長である。タグ配列は、ＩｎＤｅｌマーカーを含む領域を増幅させるためのプライマーセットに含まれるプライマーの一方に付加される。タグ配列は、一例として、プライマーの５’末端に付加される。
【0060】
プローブは、固相担体に固定化された状態で用いられ、タグ配列に対応する検出配列を有している。固相担体には、検出対象のＩｎＤｅｌマーカーの数に対応する数のプローブが固定化されている。また、固相担体には、コントロールマーカーを検出するためのプローブが固定化され得る。
【0061】
固相担体は多孔質体であり、一例として、セルロース、ナイロン、ＰＶＤＦ等である。固相担体の形状は、一例として、平板状であり、プローブが一定の配列で固定されたアレイであり、複数のプローブが固定されている。固相担体は、一例として、長尺状であり、その長手方向に沿う一方の端部を展開液に接触させることで、プローブにハイブリダイズするタグ鎖を含む増幅産物を検出する。
【0062】
固相担体上のプローブにハイブリダイズした増幅産物の検出は、従来公知の方法により行うことが可能であり、一例として、このような増幅産物を染色して可視化することにより行う。標的となる増幅産物がプローブに捕捉された場合に、染色されたバンドが視認されるように構成することで、迅速に増幅産物を検出することができる。
【0063】
特定工程において、核酸クロマトグラフィーによる増幅産物の検出に用いられる核酸検出デバイスは、ＩｎＤｅｌマーカーを含む領域の増幅産物に付加されたタグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブと、プローブが固定された固相とを備えている。このような核酸検出デバイスとして、Tohoku Bio-Array社製のＤＮＡクロマト用メンブランスティックのような、商業的に入手可能なデバイスを用いてもよい。
【0064】
このように、本発明の一態様に係る識別方法においては、ＩｎＤｅｌマーカーを用いることにより、カンキツの品種を簡易に識別することができる。識別方法においては、１３種のＩｎＤｅｌマーカーを用いて、６つのカンキツ品種を簡易に識別することができる。マルチプレックス解析が可能であり、作業効率が高い。識別方法は、カンキツ被検体として、種苗だけでなく、生鮮果実および加工果実を用いても精度よくカンキツの品種を識別することが可能である。したがって、当該識別方法は、税関および加工業者の検査現場等の導入に適しており、実用的な技術として、育成者権の保護および食品安全性の確保に貢献することができる。
【0065】
（その他）
別の実施形態において、本発明の一態様に係る識別方法は、指定の品種のカンキツの植物体またはその加工品において、他の品種の混在の可能性の評価に利用することができる。例えば、指定の品種のカンキツの植物体またはその加工品について、指定の品種に特有のＩｎＤｅｌ多型以外のＩｎＤｅｌ多型が検出される場合（例えば、他の品種に特有のＩｎＤｅｌ多型が検出される場合）、他の品種の混在の可能性、および／または、指定の品種が、他の品種により代用されている可能性があると評価することができる。また、指定の品種に特有のＩｎＤｅｌ多型以外のＩｎＤｅｌ多型が検出されない場合、他の品種の混在の可能性、および／または、指定の品種が他の品種により代用されている可能性がないか、または、低いと評価することができる。
別の実施形態において、本発明の一態様に係る識別方法は、指定の品種のカンキツの植物体またはその加工品において、他の品種の混在の可能性の評価に利用することができる。例えば、指定の品種のカンキツの植物体またはその加工品について、指定の品種に特有のＩｎＤｅｌ多型以外のＩｎＤｅｌ多型が検出される場合（例えば、他の品種に特有のＩｎＤｅｌ多型が検出される場合）、他の品種の混在の可能性、および／または、指定の品種が、他の品種により代用されている可能性があると評価することができる。また、指定の品種に特有のＩｎＤｅｌ多型以外のＩｎＤｅｌ多型が検出されない場合、他の品種の混在の可能性、および／または、指定の品種が他の品種により代用されている可能性がないか、または、低いと評価することができる。
【0066】
〔識別キット〕
本発明の一態様に係るカンキツの品種の識別キットは、カンキツの品種を識別するための識別キットであって、下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
の少なくとも１つを含む領域を増幅するためのプライマーを備えている。
本発明の一態様に係るカンキツの品種の識別キットは、カンキツの品種を識別するための識別キットであって、下記（ａ）～（ｍ）の挿入欠失（ＩｎＤｅｌ）マーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）；
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
の少なくとも１つを含む領域を増幅するためのプライマーを備えている。
【0067】
また、識別キットにおいては、プライマーとして、
（ａ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｂ’）前記Ｔｃｓ１－Ｐ８６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｃ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ２５を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｄ’）前記ＩＮＤ２３５－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｅ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ６８を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｆ’）前記Ｃｐ０４１９－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｇ’）前記ＩＮＤ２６５－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｈ’）前記ＩＮＤ４４－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｉ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ８０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｊ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｋ’）前記Ｔｃｓ１－ＣＬ２６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｌ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ１０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；および
（ｍ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ３０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号４０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号４１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーセットを含み得る。
（ａ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｂ’）前記Ｔｃｓ１－Ｐ８６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｃ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ２５を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｄ’）前記ＩＮＤ２３５－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号１８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号１９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｅ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ６８を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｆ’）前記Ｃｐ０４１９－ｓを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｇ’）前記ＩＮＤ２６５－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２４に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２５に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｈ’）前記ＩＮＤ４４－ｌを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２６に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２７に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｉ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ８０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号２８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号２９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｊ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅを含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｋ’）前記Ｔｃｓ１－ＣＬ２６を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３２に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３３に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
（ｌ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ１０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号３８に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号３９に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；および
（ｍ’）前記Ｔｃｓ２－ＣＬ３０を含む領域を増幅するためのプライマーセットであって、配列番号４０に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第１プライマーと、配列番号４１に示される塩基配列における１５以上の連続する塩基を含む第２プライマーとからなるプライマーセット；
からなる群より選択される少なくとも１つのプライマーセットを含み得る。
【0068】
また、識別キットにおいて、プライマーセットに含まれるプライマーの一方には、タグ鎖が付加されており、タグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブが固定された固相を有する核酸検出デバイスをさらに備え得る。
【0069】
さらに、識別キットは、コントロールマーカーを含む領域を増幅するためのプライマーと、当該プライマーに付加されるタグ鎖とをさらに備え得る。
【0070】
すなわち、本発明の一態様に係る識別キットは、本発明に係るカンキツの品種の識別方法において用いられる識別キットの一態様である。したがって、本発明に係るカンキツの品種の識別キットの詳細は、上述した本発明の一形態に係るカンキツの品種の識別方法の説明に準じる。
【0071】
〔核酸検出デバイス〕
本発明の一態様に係る核酸検出デバイスは、カンキツの品種を識別するための核酸検出デバイスであって、下記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを含む領域の増幅産物に付加されたタグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブと、プローブが固定された固相とを備えている。
本発明の一態様に係る核酸検出デバイスは、カンキツの品種を識別するための核酸検出デバイスであって、下記（ａ）～（ｍ）のＩｎＤｅｌマーカー：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列の１番目から１７５番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｍ）；
（ｂ）配列番号２に示す塩基配列の１番目から１３２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－Ｐ８６）；
（ｃ）配列番号３に示す塩基配列の１番目から２１３番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）；
（ｄ）配列番号４に示す塩基配列の１２７番目から１２８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２３５－ｓ）；
（ｅ）配列番号５に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ６８）；
（ｆ）配列番号６に示す塩基配列の３５３番目から３５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｃｐ０４１９－ｓ）；
（ｇ）配列番号７に示す塩基配列の１番目から１５４番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ２６５－ｌ）；
（ｈ）配列番号８に示す塩基配列の１番目から１８番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（ＩＮＤ４４－ｌ）；
（ｉ）配列番号９に示す塩基配列の１番目から２１２番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）；
（ｊ）配列番号１０に示す塩基配列の１番目から１５６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５＿Ｅ）；
（ｋ）配列番号１１に示す塩基配列の１番目から１１６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ１－ＣＬ２６）
（ｌ）配列番号３６に示す塩基配列の１番目から１７１番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ１０）；および
（ｍ）配列番号３７に示す塩基配列の１番目から１６６番目の塩基に相当するＩｎＤｅｌマーカー（Ｔｃｓ２－ＣＬ３０）；
からなる群より選択される少なくとも１つのＩｎＤｅｌマーカーを含む領域の増幅産物に付加されたタグ鎖にハイブリダイズ可能なプローブと、プローブが固定された固相とを備えている。
【0072】
すなわち、本発明の一態様に係る核酸検出デバイスは、本発明に係るカンキツの品種の識別方法において用いられる核酸検出デバイスの一態様である。したがって、本発明に係るカンキツの品種を識別するための核酸検出デバイスの詳細は、上述した本発明の一形態に係るカンキツの品種の識別方法の説明に準じる。
【0073】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例0074】
本発明の一実施例について以下に説明する。
【0075】
〔１．材料および方法〕
（１－１．植物材料およびＤＮＡ抽出）
農業・食品産業技術総合研究機構 果樹茶業研究部門（ＮＩＦＴＳ）および愛媛県農林水産研究所果樹研究センター みかん研究所に保存された２６のカンキツ品種（表１）を実験に用いた。
（１－１．植物材料およびＤＮＡ抽出）
農業・食品産業技術総合研究機構 果樹茶業研究部門（ＮＩＦＴＳ）および愛媛県農林水産研究所果樹研究センター みかん研究所に保存された２６のカンキツ品種（表１）を実験に用いた。
【0076】
【表1】
【0077】
分類は田中システムに従った(Tanaka et al. 1969)。表１におけるサンプルのアクセッション番号（JP No.）および登録番号は、農業・食品産業技術総合研究機構（ＮＡＲＯ）遺伝資源センターにおけるＧｅｎｅｂａｎｋ（http://www.gene.affrc.go.jp/databases-plant_search.php）、および、農林水産省（ＭＡＦＦ）における品種登録ホームページ（http://www.hinshu2.maff.go.jp）に基づく。ゲノムＤＮＡは、完全に展開した葉および果皮組織から、DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen社製)を用いて単離した。
【0078】
（１－２．公開されたマーカーにおける品種特異的ＩｎＤｅｌ多型のスクリーニング）
過去の研究において公開された１８５のＩｎＤｅｌマーカー(Fang et al. 2018, Kawahara et al. 2020）について、表１に示す２６のカンキツ品種のゲノムＤＮＡを用いて、標的品種に特異的なＩｎＤｅｌ多型断片のスクリーニングに供した。２６の品種間において標的品種を同定するための、単一のＩｎＤｅｌ多型断片またはＩｎＤｅｌ多型断片の最小の組み合わせを選抜した。
過去の研究において公開された１８５のＩｎＤｅｌマーカー(Fang et al. 2018, Kawahara et al. 2020）について、表１に示す２６のカンキツ品種のゲノムＤＮＡを用いて、標的品種に特異的なＩｎＤｅｌ多型断片のスクリーニングに供した。２６の品種間において標的品種を同定するための、単一のＩｎＤｅｌ多型断片またはＩｎＤｅｌ多型断片の最小の組み合わせを選抜した。
【0079】
ＰＣＲ混合液を、ゲノムＤＮＡ ５ｎｇ、フォワードおよびリバースプライマー ５ｐｍｏｌ、および、ＫＯＤ Ｏｎｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡社製） ５μＬを含む、終量１０μＬに調整した。ＰＣＲのサイクル条件は、以下のとおりとした：９８℃で１０秒間の変性、５６℃で５秒間のアニーリング、および、６８℃で２秒間の伸長を３２サイクル、ならびに、６８℃で３０秒間の最終伸長を１サイクル。全ての反応をＰｒｏＦＬＥＸ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Thermo Fisher Scientific社製）において行った。ＰＣＲ産物を２．０％アガロースゲル(Agarose standard 01; Rikaken社製)において電気泳動し、臭化エチジウムを用いて可視化した。
【0080】
（１－３．レトロトランスポゾン挿入部位のための配列ライブラリーの構築）
レトロトランスポゾン挿入部位を包括的に決定するために、挿入部位に隣接する領域をＰＣＲにより増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍにおいて増幅産物のシークエンシングを行った。既報に記載された方法（Monden et al. 2014, 2015）に従って配列ライブラリーを構築した。本実験においては、３つのレトロトランスポゾンファミリー（ＣＩＲＥ１、Ｔｃｓ１およびＴｃｓ２）をシークエンシングの標的とし、各レトロトランスポゾンファミリーについて配列ライブラリーを準備した。まず、ＮＥＢＮｅｘｔ ｄｓＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（New England Biolabs社製）を用いてゲノムＤＮＡを断片化し、叉状アダプタをＤＮＡ断片に連結させた。叉状アダプタを、２つの異なるオリゴ鎖をアニーリングすることにより調製した（Ｆｏｒｋｅｄ＿Ｔｙｐｅ１およびＦｏｒｋｅｄ＿Ｃｏｍ）（表２）。
レトロトランスポゾン挿入部位を包括的に決定するために、挿入部位に隣接する領域をＰＣＲにより増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ｐｌａｔｆｏｒｍにおいて増幅産物のシークエンシングを行った。既報に記載された方法（Monden et al. 2014, 2015）に従って配列ライブラリーを構築した。本実験においては、３つのレトロトランスポゾンファミリー（ＣＩＲＥ１、Ｔｃｓ１およびＴｃｓ２）をシークエンシングの標的とし、各レトロトランスポゾンファミリーについて配列ライブラリーを準備した。まず、ＮＥＢＮｅｘｔ ｄｓＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（New England Biolabs社製）を用いてゲノムＤＮＡを断片化し、叉状アダプタをＤＮＡ断片に連結させた。叉状アダプタを、２つの異なるオリゴ鎖をアニーリングすることにより調製した（Ｆｏｒｋｅｄ＿Ｔｙｐｅ１およびＦｏｒｋｅｄ＿Ｃｏｍ）（表２）。
【0081】
【表2】
【0082】
一次ＰＣＲ増幅を、レトロトランスポゾン特異的プライマー（ＣＩＲＥ１－ＰＰＴまたはＴｃｓ－ＰＢＳ）とアダプタ特異的プライマー（ＡＰ２－Ｔｙｐｅ１）との組み合わせ、および、テンプレートとしてのアダプタ連結ＤＮＡを用いて行った（表３）。
【0083】
【表3】
【0084】
一次ＰＣＲ増幅において、Ｔｃｓ１およびＴｃｓ２ファミリーの配列ライブラリーを調製するために、表３に示す共通プライマー（Ｔｃｓ－ＰＢＳ）を用いた。ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ増幅を、テンプレートとしての一次ＰＣＲ産物と、尾部ＰＣＲプライマー（Ｐ５およびＰ７プライマー）とを用いて行った。尾部ＰＣＲプライマーは、フローセルのシークエンシングにおけるハイブリダイズのためのＰ５またはＰ７配列（Illumina社製）、プライマー結合部位のシークエンシングのためのＲｄ１ＳＰまたはＲｄ２ＳＰ配列（Illumina社製）、ならびに、マルチプレックスシークエンシングのためのいくつかのバーコード配列を含む。レトロトランスポゾン特異的プライマー（例えば、Ｄ５０１～Ｄ５０８）は、Ｐ５配列、バーコード配列、Ｒｄ１ＳＰ配列、および、レトロトランスポゾン端部配列を含む。一方、アダプタ特異的プライマー（例えば、Ｄ７０１～Ｄ７１３）は、Ｐ７配列、バーコード配列、Ｒｄ２ＳＰ配列、および、アダプタ配列を含む。各サンプルに用いたプライマーの組み合わせを、表４に示す。
【0085】
【表4】
【0086】
ＰＣＲ産物をアガロースゲルにおいてサイズ選択し（５００～１０００ｂｐ）、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（QIAGEN社製）を用いて精製した。精製した産物を、Ｑｕｂｉｔ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて定量化し、Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Agilent社製）を用いてサイズ選択領域を確認した。各系から生成したバーコード産物の等量をプールすることにより、ＨｉＳｅｑ配列ライブラリーを調製した。レトロトランスポゾン挿入部位を分析するためのＨｉＳｅｑリード（HiSeq reads）を、ＤＤＢＪアクセッション番号、ＤＲＡ０１４４９０（ＣＩＲＥ１）、ＤＲＡ０１４４９１（Ｔｃｓ１）およびＤＲＡ０１４４９２（Ｔｃｓ２）下に蓄積した。
【0087】
（１－４．レトロトランスポゾン挿入多型のデータ解析）
得られたペアエンドリード（paired-end reads）（１５０ｂｐ）を、発明者らの過去の研究（Monden et al. 2014, 2015; Sasai et al. 2019; Hirata et al. 2020）に記載された方法にしたがって解析した。得られたリードを、Ｍａｓｅｒａ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（the Cell Innovation Program of the National Institute of Genetics）（https://cell-innovation.nig.ac.jp/index_en.html）を用いて解析した。アダプタのトリミングとクオリティフィルタリング（ＱＶ≧３０）とを、それぞれ、Ｃｕｔａｄａｐｔ（Martin, 2011）およびＦＬＥＸＢＡＲ（Dodt et al. 2012）を用いて行った。
得られたペアエンドリード（paired-end reads）（１５０ｂｐ）を、発明者らの過去の研究（Monden et al. 2014, 2015; Sasai et al. 2019; Hirata et al. 2020）に記載された方法にしたがって解析した。得られたリードを、Ｍａｓｅｒａ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（the Cell Innovation Program of the National Institute of Genetics）（https://cell-innovation.nig.ac.jp/index_en.html）を用いて解析した。アダプタのトリミングとクオリティフィルタリング（ＱＶ≧３０）とを、それぞれ、Ｃｕｔａｄａｐｔ（Martin, 2011）およびＦＬＥＸＢＡＲ（Dodt et al. 2012）を用いて行った。
【0088】
選抜したリードを、ほとんどの配列をカバーする特定の長さ（５０ｂｐ）にトリミングした。１０以上の同一の配列を含むリードを、ＦＡＳＴＡ ｆｏｒｍａｔにおいて単一の配列に削減した後、以下に示すパラメータに設定したＢＬＡＴ ｓｅｌｆ－ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Kent 2002）を用いて分類した:“－ｔｉｌｅＳｉｚｅ”＝８、“－ｍｉｎＭａｔｃｈ”＝１、“－ｍｉｎＳｃｏｒｅ”＝１０、“－ｒｅｐＭａｔｃｈ”＝－１、および、“－ｏｎｅＯｆｆ”＝２。
【0089】
このクラスター分析により、特定のレトロトランスポゾン挿入部位が互いに一致した、いくつかのクラスターを生成した。次に、適切な閾値を設定し、レトロトランスポゾンの存在または非存在を評価した。例えば、与えられたクラスターにおいて、特定のレトロトランスポゾンの挿入部位を有するリードの数が、その種の全リード数に対して０．１％より少ない場合、レトロトランスポゾンはその部位に存在しないと判断した。これにより、全ての品種におけるレトロトランスポゾンの存在（１）に対する非存在（０）に関する遺伝子型情報が得られた。最後に、種特異的および種間の挿入部位多型を、遺伝子型情報に基づいてスクリーニングした。
【0090】
〔５．品種特異的ＤＮＡマーカーの開発およびＰＣＲ検証〕
ＩｎＤｅｌ多型断片をＴ－ベクター(pMD19；Takara社製)中において複製し、サンガー法によるシークエンシングの対象とした。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Qiagen社製）を用いてプラスミドを調製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems社製）を用いて、製造者による取扱説明書にしたがって、シークエンシングを実行した。得られた配列をミカンゲノムデータベース（https://mikan.dna.affrc.go.jp/）に対してブラスト検索し、挿入または欠損したＩｎＤｅｌ多型断片のアレル配列を収集した。
ＩｎＤｅｌ多型断片をＴ－ベクター(pMD19；Takara社製)中において複製し、サンガー法によるシークエンシングの対象とした。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Qiagen社製）を用いてプラスミドを調製し、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems社製）を用いて、製造者による取扱説明書にしたがって、シークエンシングを実行した。得られた配列をミカンゲノムデータベース（https://mikan.dna.affrc.go.jp/）に対してブラスト検索し、挿入または欠損したＩｎＤｅｌ多型断片のアレル配列を収集した。
【0091】
配列アライメントに続いて、挿入または欠損の連結部位を各ＩｎＤｅｌ多型断片について決定し、多型断片特異的プライマーセットを、この連結部位の周囲およびアレル配列間の非同一配列を用いて設計した。レトロトランスポゾンＤＮＡ多型について、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを、レトロトランスポゾンの５’－ＬＴＲあるいは３’－ＬＴＲ領域、または、種特異的レトロトランスポゾン挿入部位のいずれかの配列に基づいて設計した。ＰＣＲポジティブＤＮＡマーカーを、カンキツ葉緑体ゲノムｒｂｃＬ遺伝子のコーディング領域を用いて設計した。ｒｂｃＬ遺伝子のプライマー配列を配列番号３４および３５に示す。これらの開発したＤＮＡマーカーのプライマー配列を表５に示す。開発した種特異的ＤＮＡマーカーを、上述した条件にしたがったＰＣＲおよび２．０％アガロースゲル電気泳動を用いて確認した。
【0092】
【表5】
【0093】
（１－５．マルチプレックスＰＣＲおよびＣ－ＰＡＳ法を用いたＤＮＡマーカーの検出）
Ｃ－ＰＡＳ法を用いてＰＣＲ産物を検出するために、一本鎖タグおよびスペーサ配列を、各ＤＮＡマーカーのフォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれかの５’端に加えた。各標的品種特異的なＤＮＡマーカーを、マルチプレックスＰＣＲを用いて、ＰＣＲポジティブＤＮＡマーカーと共に増幅した。プライマー濃度比およびマルチプレックスＰＣＲ条件を、ＤＮＡマーカーを均一に増幅させるように調整した。キット（FASMAC社製）に含まれ、予めミックスされたプライマーを用いて、製造者の取扱説明書に従ってＰＣＲを行った。単一鎖タグハイブリダイゼーションのためのタグ－スペーサ配列を有するＰＣＲ産物を、染料および展開液（Tohoku Bio-Array社製）と混合した。その後、ＤＮＡクロマト用メンブランスティック（Ｃ－ＰＡＳ４;Tohoku Bio-Array社製）を展開液に１０分間浸漬した。
Ｃ－ＰＡＳ法を用いてＰＣＲ産物を検出するために、一本鎖タグおよびスペーサ配列を、各ＤＮＡマーカーのフォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれかの５’端に加えた。各標的品種特異的なＤＮＡマーカーを、マルチプレックスＰＣＲを用いて、ＰＣＲポジティブＤＮＡマーカーと共に増幅した。プライマー濃度比およびマルチプレックスＰＣＲ条件を、ＤＮＡマーカーを均一に増幅させるように調整した。キット（FASMAC社製）に含まれ、予めミックスされたプライマーを用いて、製造者の取扱説明書に従ってＰＣＲを行った。単一鎖タグハイブリダイゼーションのためのタグ－スペーサ配列を有するＰＣＲ産物を、染料および展開液（Tohoku Bio-Array社製）と混合した。その後、ＤＮＡクロマト用メンブランスティック（Ｃ－ＰＡＳ４;Tohoku Bio-Array社製）を展開液に１０分間浸漬した。
【0094】
〔２．結果〕
（２－１．日本のカンキツ有望品種８種のための品種特異的ＤＮＡマーカーのスクリーニング）
過去の文献(Fang et al. 2018, Kawahara et al. 2020）における１８５のＩｎＤｅｌマーカーのうち、標的品種に特異的なＩｎＤｅｌ多型断片を、日本市場における２６のカンキツ品種（表１）を用いてスクリーニングした。２６のカンキツ品種は、国内の流通量の９４％以上を占める。多くのＩｎＤＥｌマーカーにおいて、２～４個の複数のＰＣＲ断片の増幅がみられた。日本の育種集団は少数の祖先品種から繰り返し交雑により受け継いだゲノムを部分的に共有しているので、従来の日本の育種においては、親品種が種子親または花粉親として用いられない限り、標的品種に特異的な単一のＩｎＤｅｌ多型断片が検出されることはまれであることが予測される。単一のＩｎＤｅｌ多型断片を、璃の香において取得した。璃の香は、レモンと日向夏との交配から生成された品種である。ＩＮＤ１４１マーカーは、２６品種中の３品種のＩｎＤｅｌ断片を生成し、璃の香のみが６００ｂｐ断片（ＩＮＤ１４１－１）を有していた。残りの７の標的品種においては、単一のＩｎＤｅｌ多型断片は存在しなかった。
（２－１．日本のカンキツ有望品種８種のための品種特異的ＤＮＡマーカーのスクリーニング）
過去の文献(Fang et al. 2018, Kawahara et al. 2020）における１８５のＩｎＤｅｌマーカーのうち、標的品種に特異的なＩｎＤｅｌ多型断片を、日本市場における２６のカンキツ品種（表１）を用いてスクリーニングした。２６のカンキツ品種は、国内の流通量の９４％以上を占める。多くのＩｎＤＥｌマーカーにおいて、２～４個の複数のＰＣＲ断片の増幅がみられた。日本の育種集団は少数の祖先品種から繰り返し交雑により受け継いだゲノムを部分的に共有しているので、従来の日本の育種においては、親品種が種子親または花粉親として用いられない限り、標的品種に特異的な単一のＩｎＤｅｌ多型断片が検出されることはまれであることが予測される。単一のＩｎＤｅｌ多型断片を、璃の香において取得した。璃の香は、レモンと日向夏との交配から生成された品種である。ＩＮＤ１４１マーカーは、２６品種中の３品種のＩｎＤｅｌ断片を生成し、璃の香のみが６００ｂｐ断片（ＩＮＤ１４１－１）を有していた。残りの７の標的品種においては、単一のＩｎＤｅｌ多型断片は存在しなかった。
【0095】
（２－２．トランスポゾンライブラリのＮＧＳ、および、カンキツ有望品種８種におけるレトロトランスポゾンの挿入により起こる品種特異的配列多型のスクリーニング）
公開されたＩｎＤｅｌマーカーのスクリーニングにおいて、標的品種を同定するための単一のＩｎＤｅｌ多型断片を見出すことは困難であるため、ＬＴＲレトロトランスポゾンファミリーＣＩＲＥ１、Ｔｃｓ１、およびＴｃｓ２を、ハイスループットシークエンシングプラットフォームを用いた挿入部位の包括的な解析のために選択した。
公開されたＩｎＤｅｌマーカーのスクリーニングにおいて、標的品種を同定するための単一のＩｎＤｅｌ多型断片を見出すことは困難であるため、ＬＴＲレトロトランスポゾンファミリーＣＩＲＥ１、Ｔｃｓ１、およびＴｃｓ２を、ハイスループットシークエンシングプラットフォームを用いた挿入部位の包括的な解析のために選択した。
【0096】
ＣＩＲＥ１ファミリーにおいては、１５０ｂｐの１２２，６６８，７３２リードが得られた（最小＝２，５９７，９００、平均＝４，７１８，０２８、および、最大＝６，１１０，３９５リード/ライン）。前処理の後、５７，４２０，０９４のリードが残った。これらのリードを、ＢＬＡＴ ｓｅｌｆ－ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Kent 2002）を用いたクラスター分析に用いて、２６品種における独立した９３の挿入部位を生成した。これらの挿入部位間において、以下の１０の挿入部位が推定品種特異的挿入部位と考えられた：はるひに特異的な４つの挿入部位（ＣＩＲＥ１－ＣＬ３０、ＣＩＲＥ１－ＣＬ２８、ＣＩＲＥ１－ＣＬ２１、および、ＣＩＲＥ１－ＣＬ５５）；川野夏橙に特異的な２つの挿入部位（ＣＩＲＥ１－ＣＬ１５およびＣＩＲＥ１－Ｐ５１）；璃の香に特異的な２つの挿入部位（ＣＩＲＥ１－Ｐ６０およびＣＩＲＥ１－Ｐ７５）；麗紅に特異的な１つの挿入部位（ＣＩＲＥ１－ＣＬ４８）；およびダンカングレープフルーツに特異的な１つの挿入部位（ＣＩＲＥ１－Ｐ５８）。
【0097】
Ｔｃｓ１ライブラリーにおいては、１５０ｂｐの７５，６４６，１４３（最小＝１，５２９，４４０、平均＝２，９０９，４６７、および、最大＝５，００３，３８７リード／ライン）のリードが得られた。前処理の後、３７，２５９，５０３のリードが残った。これらのリードを、ＢＬＡＴ ｓｅｌｆ－ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ（Kent 2002）を用いたクラスター分析に用い、２６の品種におけるＴｃｓ１の２７６の独立した挿入部位を生成した。このうち、以下に示す２４の挿入部位が品種特異的であると考えられた：レモンに特異的な８の挿入部位（Ｔｃｓ１－Ｐ１０４、Ｔｃｓ１－ＣＬ３２、Ｔｃｓ１－Ｐ１１０、Ｔｃｓ１－Ｐ１１２、Ｔｃｓ１－ＣＬ４６、Ｔｃｓ１－ＣＬ６４、Ｔｃｓ１－Ｐ１４８、およびＴｃｓ１－Ｐ１５１）；はるひに特異的な３の挿入部位（Ｔｃｓ１－ＣＬ５７、Ｔｃｓ１－ＣＬ６８、Ｔｃｓ１－ＣＬ９３）；川野夏橙に特異的な２の挿入部位（Ｔｃｓ１－ＣＬ８５およびＴｃｓ１－Ｐ９５）；璃の香に特異的な２の挿入部位（Ｔｃｓ１－ＣＬ８７およびＴｃｓ１－ＣＬ６９）；愛媛果試第２８号に特異的な２の挿入部位（Ｔｃｓ１－ＣＬ１１３およびＴｃｓ１－Ｐ９９）；グレープフルーツに特異的な１の挿入部位（Ｔｃｓ１－ＣＬ９０）；不知火に特異的な１の挿入部位（Ｔｃｓ１－Ｐ１０７）； イヨカンに特異的な１の挿入部位（Ｔｃｓ１－ＣＬ８３）；ハッサクに特異的な１の挿入部位（Ｔｃｓ１－ＣＬ１１９）；ポンカンに特異的な１の挿入部位（Ｔｃｓ１－Ｐ１１８）；麗紅に特異的な１の挿入部位（Ｔｃｓ１－ＣＬ５９）；ならびに、媛小春に特異的な１の挿入部位（Ｔｃｓ１－ＣＬ５８）。
【0098】
Ｔｃｓ２ライブラリーにおいては、１５０ｂｐの１３４，８５８，０６０（最小＝３，６７１，６７４、平均＝５，１８６，８４８、最大＝６，７９７，９９４リード／ライン）のリードが得られた。前処理の後、３３，２５１，５７８のリードが残った。これらのリードを用いたクラスター分析により、２６の品種におけるＴｃｓ２の１７４の独立した挿入部位を生成した。このうち、以下に示す１９の挿入部位が品種特異的であると考えられた：レモンに特異的な４の挿入部位（Ｔｃｓ２－ＣＬ７４、Ｔｃｓ２－ＣＬ８８、Ｔｃｓ２－ＣＬ８１、およびＴｃｓ２－ＣＬ９９）；グレープフルーツに特異的な３の挿入部位（Ｔｃｓ２－ＣＬ５２、Ｔｃｓ２－ＣＬ７０、およびＴｃｓ２－ＣＬ７７）；璃の香に特異的な３の挿入部位（Ｔｃｓ２－ＣＬ７９、Ｔｃｓ２－ＣＬ８５、およびＴｃｓ２－Ｐ９７）；はるひに特異的な３の挿入部位（Ｔｃｓ２－ＣＬ１８、Ｔｃｓ２－ＣＬ４１、およびＴｃｓ２－Ｐ１００）；川野夏橙に特異的な２の挿入部位（Ｔｃｓ２－ＣＬ８２およびＴｃｓ２－ＣＬ１０５）；愛媛果試第２８号に特異的な２の挿入部位（Ｔｃｓ２－ＣＬ７３およびＴｃｓ２－ＣＬ６８）；麗紅に特異的な１の挿入部位（Ｔｃｓ２－ＣＬ８３）；ならびに媛小春に特異的な１の挿入部位（Ｔｃｓ２－ＣＬ８０）。全体として、３つのＬＴＲレトロトランスポゾンファミリーは、２６のカンキツ品種のレトロトランスポゾンの挿入により引き起こされる高配列多型を表し、品種特異的配列多型の数を、３つのファミリー中に検出した。
【0099】
さらに、品種特異的挿入多型の候補を、３つのレトロトランスポゾンファミリーのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ＮＧＳ 分析から得た。以下の、品種特異的挿入多型の候補を３つの品種から得た：璃の香における７つの挿入部位；愛媛果試第２８号の４つの挿入部位；および媛小春の２つの挿入部位。Ｔｃｓ１およびＴｃｓ２レトロトランスポゾンライブラリーは、ＣＩＲＥ１ライブラリーと比較して、２６の品種間の試験においては、品種特異的挿入多型が高頻度の傾向にあった。
【0100】
（２－３．残り５品種における複数の多型と組み合わせた品種特異的ＤＮＡマーカーセット）
選択された選択されたマンダリン遺伝資源を繰り返し交配することにより遺伝的背景が類似した残りの５品種においては、単一のＰＣＲ断片を含む品種特異的ＤＮＡ多型を得ることは困難であった。残りの５品種における品種特異的ＤＮＡマーカーセットを得るために、ＩｎＤｅｌ断片およびレトロトランスポゾン挿入部位のＤＮＡ多型データを、ＭｉｎｉｍａｌＭａｒｋｅｒ ｐｒｏｇｒａｍを用いて分析した（Fujii et al. 2013）。２または３つのマーカーが、２６の品種中の標的を同定するために必要であった。
選択された選択されたマンダリン遺伝資源を繰り返し交配することにより遺伝的背景が類似した残りの５品種においては、単一のＰＣＲ断片を含む品種特異的ＤＮＡ多型を得ることは困難であった。残りの５品種における品種特異的ＤＮＡマーカーセットを得るために、ＩｎＤｅｌ断片およびレトロトランスポゾン挿入部位のＤＮＡ多型データを、ＭｉｎｉｍａｌＭａｒｋｅｒ ｐｒｏｇｒａｍを用いて分析した（Fujii et al. 2013）。２または３つのマーカーが、２６の品種中の標的を同定するために必要であった。
【0101】
すなわち、２６の品種中からのあすみの識別に要求される最小セットは、２つのＩｎＤｅｌ多型断片（Ｃｐ０４１９の３７１ｂｐの断片（Ｃｐ０４１９－ｓ）、および、ＩＮＤ２１４の２４６ｂｐの断片（ＩＮＤ２１４－ｓ））であった。特に、あすみは、２６の品種中において、これらの２つのＩｎＤｅｌ多型断片を単独で有しており、これらの２つのＩｎＤｅｌ多型断片の存在または不在により、被検体があすみであるか否かを判定することが可能である。
【0102】
みはやは、２つの多型挿入部位（Ｔｃｓ１－Ｐ８６およびＴｃｓ２－ＣＬ５５）の存在に基づいて同定可能である。あすきは、多型挿入部位（Ｔｃｓ２－ＣＬ２５）およびＩＮＤ２３５の１４４ｂｐのＰＣＲ断片（ＩＮＤ２３５－ｓ）に基づいて同定可能である。愛媛果試第４８号は、２つの多型挿入部位（Ｔｃｓ２－ＣＬ５５およびＴｃｓ１－ＣＬ２６）の存在により同定可能である。甘平は、以下の３つのＤＮＡ多型が２６の品種からの同定に要求された：Ｃｐ０４１９の３７１ｂｐのＰＣＲ断片（Ｃｐ０４１９－ｓ）、ＩＮＤ２６５の２８０ｂｐのＰＣＲ断片ｄ（ＩＮＤ２６５－ｌ）、およびＩＮＤ４４の１５２ｂｐのＰＣＲ断片（ＩＮＤ４４－ｌ）。
【0103】
（２－４．品種特異的ＤＮＡマーカーおよびＰＣＲ検証）
表５に記載された品種特異的ＤＮＡ多型を最終的に選択し、２％アガロースゲル電気泳動およびＣ－ＰＡＳ４を用いた検出に対応するＰＣＲプライマーを設計した。各ＤＮＡマーカーのＰＣＲ断片が、２％アガロースゲル電気泳動において重ならないように調整した。を除くＤＮＡマーカーのクレメンティンゲノム配列（Wu et al. 2014）における位置を、ミカンゲノムデータベースに対するＢＬＡＳＴサーチ解析を通して決定した。
表５に記載された品種特異的ＤＮＡ多型を最終的に選択し、２％アガロースゲル電気泳動およびＣ－ＰＡＳ４を用いた検出に対応するＰＣＲプライマーを設計した。各ＤＮＡマーカーのＰＣＲ断片が、２％アガロースゲル電気泳動において重ならないように調整した。を除くＤＮＡマーカーのクレメンティンゲノム配列（Wu et al. 2014）における位置を、ミカンゲノムデータベースに対するＢＬＡＳＴサーチ解析を通して決定した。
【0104】
ＰＣＲ検証を、実際のＰＣＲにおいて各品種についての品種特異的ＤＮＡマーカーとして機能し得るか否かを確認することで行った。ＰＣＲ検証試験を、２６の品種間において標的ＰＣＲ多型断片のみが増幅され得るか否かを決定することで行った。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルにおいて電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化した（図１）。図１は、品種特異的なＤＮＡ多型のＰＣＲによる検証結果を示す図である。図１中の番号は、表１における植物材料を示している。
【0105】
璃の香、愛媛果試第２８号、および媛小春において、ＩＮＤ１４１－ｌ、Ｔｃｓ２－ＣＬ６８、およびＴｃｓ２－ＣＬ８０のためのプライマーセットを、各品種に特異的な単一のＰＣＲ多型断片を増幅するために確認した。残りの５品種のために、標的の多型断片の特異的な増幅が可能なように設計し、ＰＣＲ産物を予測される品種において検出し、上述したＤＮＡ多型スクリーニングの結果と一致した。２６の品種におけるこれらのＤＮＡマーカーのためのＰＣＲ産物の存在または不在を、表６にまとめた。
【0106】
【表6】
【0107】
（２－５．８つの日本のカンキツ有望品種の品種特異的ＤＮＡマーカーセットのマルチプルＰＣＲおよびＣ－ＰＡＳ検出）
２６のカンキツ品種中の標的を同定するための８つの品種特異的ＤＮＡマーカーセットを、単一のＤＮＡ多型または複数のＤＮＡ多型の組み合わせから作成した。ＤＮＡ診断は、ＰＣＲ多型断片の存在または不在に基づいているので、葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子を、マルチプレックスＰＣＲ実験自体が適切に行われているか否かを決定するためのポジティブＤＮＡマーカーとして用いた。マルチプルＰＣＲ断片の均一な増幅を実現するために、各品種特異的ＤＮＡマーカーセットに対してプライマー濃度比を最適化した。
２６のカンキツ品種中の標的を同定するための８つの品種特異的ＤＮＡマーカーセットを、単一のＤＮＡ多型または複数のＤＮＡ多型の組み合わせから作成した。ＤＮＡ診断は、ＰＣＲ多型断片の存在または不在に基づいているので、葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子を、マルチプレックスＰＣＲ実験自体が適切に行われているか否かを決定するためのポジティブＤＮＡマーカーとして用いた。マルチプルＰＣＲ断片の均一な増幅を実現するために、各品種特異的ＤＮＡマーカーセットに対してプライマー濃度比を最適化した。
【0108】
ＰＣＲ産物をＣ－ＰＡＳ４メンブレンスティックを用いて検出した。ＰＣＲ溶液 １μＬを、１．５ｍＬチューブ中の展開液 ２０μＬに加えた。次いで、Ｃ－ＰＡＳ４メンブレンスティックをこの溶液中に１０分浸漬した。実験では、検出結果を青色のバンドとして可視化した。璃の香、愛媛果試第２８号、および媛小春については、単一の品種特異的ＰＣＲ断片およびポジティブＤＮＡマーカーを、マルチプレックスＰＣＲにおいて同時に増幅した。
【0109】
Ｃ－ＰＡＳ検出において、これらの品種のＣ－ＰＡＳ４メンブレンスティックには、２つのバンドが検出されたが、他の品種については１つのバンドしか検出されなかった（図２および３）。図２および３は、日本の代表的な８つのカンキツ品種のためのＣ－ＰＡＳ検出キットによる検出パターンを示す図である。図２および３中の番号は、表１における植物材料を示している。図２および３中のＮＣは、非テンプレートＤＮＡを示す。矢印は、各Ｃ－ＰＡＳ検出キットにおける標的品種を示している。
【0110】
あすみ、みはや、あすき、および愛媛果試第４８号について、２つの品種特異的ＰＣＲ断片およびポジティブＤＮＡマーカーを、マルチプレックスＰＣＲにおいて同時に増幅し、臭化エチジウム染色により可視化した。これらの品種のＣ－ＰＡＳ４メンブレンスティックには、３つのバンドが検出されたが、他の品種については１つまたは２つのバンドしか検出されなかった。
【0111】
甘平については、３つの品種特異的ＰＣＲ断片およびポジティブＤＮＡマーカーを、マルチプレックスＰＣＲにおいて同時に増幅した。この品種のＣ－ＰＡＳ４メンブレンスティックには、４つのバンドが検出されたが、他の品種については１～３つのバンドしか検出されなかった。全てのマーカーのＤＮＡ多型を表５に示し、２％アガロースゲル電気泳動パターンを図４および５に示す。図４および５は、カンキツ有望品種についての品種特異的ＤＮＡマーカーのＰＣＲ断片の電気泳動パターンを示す図である。図４および５中の番号は、表１における植物材料を示している。
【0112】
（２－６．カンキツ果皮から単離したゲノムＤＮＡを用いた、品種特異的ＤＮＡマーカーのＣ－ＰＡＳ検出）
８つの標的品種について開発したＣ－ＰＡＳ検出キットを、果実組織から単離したＤＮＡサンプルに適用し、果実の検閲に対する適用可能性を確認した。ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen社製）を用いて果皮組織から単離した。ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の検出を、各Ｃ－ＰＡＳ検出キットに提供された取扱説明書にしたがって行った。図６は、あすみ、および、璃の香のＣ－ＰＡＳキットを用いた、代表的な結果を示す。図６において、Ａ）はあすみのためのＣ－ＰＡＳキットを用いた検出パターンを示し、Ｂ）は、璃の香のためのＣ－ＰＡＳキットを用いた検出パターンを示す。璃の香、みはや、あすみ、あすき、および甘平のＤＮＡサンプルを、評価に用いた。図６中、１は璃の香、２はみはや、３はあすみ、４はあすき、５は甘平を示す。
８つの標的品種について開発したＣ－ＰＡＳ検出キットを、果実組織から単離したＤＮＡサンプルに適用し、果実の検閲に対する適用可能性を確認した。ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen社製）を用いて果皮組織から単離した。ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の検出を、各Ｃ－ＰＡＳ検出キットに提供された取扱説明書にしたがって行った。図６は、あすみ、および、璃の香のＣ－ＰＡＳキットを用いた、代表的な結果を示す。図６において、Ａ）はあすみのためのＣ－ＰＡＳキットを用いた検出パターンを示し、Ｂ）は、璃の香のためのＣ－ＰＡＳキットを用いた検出パターンを示す。璃の香、みはや、あすみ、あすき、および甘平のＤＮＡサンプルを、評価に用いた。図６中、１は璃の香、２はみはや、３はあすみ、４はあすき、５は甘平を示す。
【0113】
あすみのＣ－ＰＡＳ検出キットを用いた場合、あすみのみが、ｒｂｃＬ、Ｃｐ０４１９、およびＩＮＤ２１４に対応する３つのバンドを示した。一方、残りの品種は、これらのバンドの全ては示さなかった。璃の香のＣ－ＰＡＳ検出キットを用いた場合、璃の香のみがｒｂｃＬおよびＩＮＤ１４１－１に対応する２つのバンドを示した。一方、残りの品種は、ｒｂｃＬに対応する１つのバンドのみを示した。
【0114】
同様に、残りの標的品種のためのＣ－ＰＡＳ検出キットについて、葉および果実組織から単離したＤＮＡサンプル間において、同様の検出パターンの存在を確認した。それゆえに、これらのＣ－ＰＡＳ検出キットは、果実の品種識別技術として果実の検閲において使用可能である。
【0115】
（３．甘平の特異的ＤＮＡマーカーセットのマルチプルＰＣＲおよびＣ－ＰＡＳ検出）
２６のカンキツ品種中の甘平を同定するための特異的ＤＮＡマーカーセットの他の候補を作成した。葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子を、マルチプレックスＰＣＲ実験自体が適切に行われているか否かを決定するためのポジティブＤＮＡマーカーとして用いた。ＰＣＲ混合液を表７に示す組成とし、蒸留水により終量１０μＬに調整した。
２６のカンキツ品種中の甘平を同定するための特異的ＤＮＡマーカーセットの他の候補を作成した。葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子を、マルチプレックスＰＣＲ実験自体が適切に行われているか否かを決定するためのポジティブＤＮＡマーカーとして用いた。ＰＣＲ混合液を表７に示す組成とし、蒸留水により終量１０μＬに調整した。
【0116】
【表7】
【0117】
Ｔｃｓ２－ＣＬ１０およびＴｃｓ２－ＣＬ３０のプライマー配列を表８に示す。なお、Ｔｃｓ２－ＣＬ１０およびＴｃｓ２－ＣＬ３０のフォワードプライマーは共通である。
【0118】
【表8】
【0119】
ＰＣＲのサイクル条件は、以下のとおりとした：９８℃で１０秒間活性化した後、９８℃で１０秒間の変性、６２℃で５秒間のアニーリング、および、６８℃で１秒間の伸長を３０サイクル、ならびに、６８℃で１０秒間の最終伸長を１サイクル。全ての反応をサーマルサイクラーＶｅｒｉｔｉ２００（Thermo Fisher Scientific社製）において行った。４℃にて保管されたＰＣＲ産物を、２．０％アガロースゲル(Agarose standard 01; Rikaken社製)において電気泳動し、臭化エチジウムを用いて可視化した。マルチプレックスＰＣＲによるＰＣＲ断片の２．０％アガローゲル電気泳動パターンを図７に示す。図７は、甘平についての品種特異的ＤＮＡマーカーのＰＣＲ断片の電気泳動パターンを示す図である。図７中の番号は、表１における植物材料を示している。
【0120】
ＰＣＲ産物をＣ－ＰＡＳ４メンブレンスティックを用いて検出した。ＰＣＲ溶液 １μＬを、１．５ｍＬチューブ中の展開液 ２０μＬに加えた。次いで、Ｃ－ＰＡＳ４メンブレンスティックをこの溶液中に１０分浸漬した。実験では、検出結果を青色のバンドとして可視化した。
【0121】
Ｃ－ＰＡＳ検出において、２３番の甘平のＣ－ＰＡＳ４メンブレンスティックには、３つのバンドが検出されたが、他の品種については２つ又は１つのバンドしか検出されなかった（図８）。図８は、日本の代表的な２６のカンキツ品種のためのＣ－ＰＡＳ検出キットによる検出パターンを示す図である。図８中の番号は、表１における植物材料を示しており、２７番は滅菌水を示している。２６の品種におけるこれらのＤＮＡマーカーのためのＰＣＲ産物の存在または不在を、表９にまとめた。
【0122】
【表9】
【0123】
表９および図８に示すように、新たに見出したＤＮＡマーカーＴｃｓ２－ＣＬ１０およびＴｃｓ２－ＣＬ３０により、甘平を特定可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0124】
本発明の一態様に係るカンキツの品種の識別方法、識別キット、および、核酸検出デバイスは、果実の品種識別技術として、殊に、税関等の検査現場に導入できる実用可能な技術として、育成者権の保護および食品安全性の確保に貢献することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】