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特開2024-88736アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を含む植物活力剤ならびにその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024088736
(43)【公開日】2024-07-02
(54)【発明の名称】アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を含む植物活力剤ならびにその使用
(51)【国際特許分類】
A01N 37/44 20060101AFI20240625BHJP
A01N 43/16 20060101ALI20240625BHJP
A01N 63/10 20200101ALI20240625BHJP
A01P 21/00 20060101ALI20240625BHJP
C05F 11/10 20060101ALI20240625BHJP
A01G 7/00 20060101ALI20240625BHJP
A01G 7/06 20060101ALI20240625BHJP
【ＦＩ】
A01N37/44
A01N43/16 A
A01N63/10
A01P21/00
C05F11/10
A01G7/00 604Z
A01G7/06 A
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024061800
(22)【出願日】2024-04-05
(62)【分割の表示】P 2021528238の分割
【原出願日】2020-06-15
(31)【優先権主張番号】P 2019112210
(32)【優先日】2019-06-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000004455
【氏名又は名称】株式会社レゾナック
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100146466
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 正俊
(74)【代理人】
【識別番号】100202418
【弁理士】
【氏名又は名称】河原 肇
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】藤田 一郎
(72)【発明者】
【氏名】齋藤 信
(72)【発明者】
【氏名】内田 博
(72)【発明者】
【氏名】木元 久
(57)【要約】 （修正有）
【課題】植物の生理学的プロセスを制御・強化し、農作物の活力、収量、品質及び収穫後の保存性を改善する。
【解決手段】アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を含むことを特徴とする植物活力剤を植物に適用する。
【選択図】なし
【解決手段】アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を含むことを特徴とする植物活力剤を植物に適用する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を含むことを特徴とする植物活力剤。
【請求項2】
前記オリゴ糖が、キチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の植物活力剤。
【請求項3】
前記オリゴ糖として、キチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖の３種すべてを含む、請求項１又は２に記載の植物活力剤。
【請求項4】
前記アミノ酸が、グリシン、グルタミン酸、及びヒスチジンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～３のいずれか一項に記載の植物活力剤。
【請求項5】
前記アミノ酸がグリシンである、請求項１～４のいずれか一項に記載の植物活力剤。
【請求項6】
前記植物活力剤中の前記オリゴ糖の合計含有量が、０．０５～１０質量％である、請求項１～５のいずれか一項に記載の植物活力剤。
【請求項7】
前記植物活力剤中の前記アミノ酸又はその塩の合計含有量が２．５～３０質量％である、請求項１～６のいずれか一項に記載の植物活力剤。
【請求項8】
展着剤をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の植物活力剤。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の植物活力剤を植物に適用することを含む、植物栽培方法。
【請求項10】
前記植物活力剤を、前記オリゴ糖の合計含有量が０．１～５００質量ｐｐｍとなる濃度で植物に適用することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記植物活力剤の植物への適用が葉面散布により行われる、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～８のいずれか一項に記載の植物活力剤を適用しない場合と比較して、増大したエリシター活性を有する植物又はその一部の生産方法であって、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法により植物を栽培することを含む、方法。
【請求項13】
前記エリシター活性が、植物中のグルカナーゼ産生量を測定することにより決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
請求項１～８のいずれか一項に記載の植物活力剤を含有する肥料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を含む植物活力剤、及び該植物活力剤を用いた植物の栽培・生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
植物は、日照時間、気温及び降雨量等の非生物的ストレス、並びに病害虫等の生物的ストレスによって収穫量が減少する。特に農業作物の収穫量を増加させるために、これまで、各種の肥料及び農薬が使用されてきた。肥料は、植物の生長に必要とされる栄養源であるがストレスを緩和する機能は有さない。農薬は、植物に寄生する病害虫を直接駆除し、生物的ストレスを排除するが、農薬を使用する場合には、安全性は十分確認されているとはいえ、過剰摂取による人体や環境への影響が懸念されるし、特に化学合成法によって製造される農薬等の薬剤は、いったん散布すると土壌中等に長期間残存する懸念もあり、出来れば他の方法により生物ストレスに対して耐性をつけることが望まれていた。このことから、近年これらに加えて、人体にも環境にも安全な物質としてバイオスティミュラントの利用が注目されている。
【0003】
「バイオスティミュラント」は、「生物刺激剤」や「植物活力剤」等とも称され、任意の物質群・微生物を含有し、植物体やその根系に施用された場合に、自然な状態の作物体内でも起こっている一連のプロセスを刺激することによって、養分吸収を向上させたり、施肥効率を高めたり、ストレス耐性を付与し、品質を向上させることができるものであって、病害虫に対して直接の作用は示さず、それゆえいかなる殺虫・殺菌剤にも分類されないものをいう。すなわち、自然界に存在する成分（微生物を含む）であって、植物ホルモンや栄養分ではないが、ごく少量でも植物の活力を刺激し、生育を促進する物質を指す。バイオスティミュラントを植物に施用することにより、植物の養分吸収と養分利用率を高め、生育が促進され、農作物の収量と品質が良くなるとされている。農業用バイオスティミュラントには、作物の生理学的プロセスを制御・強化するために、植物又は土壌に施用される化合物、物質及び他の製品の多様な製剤が含まれる。バイオスティミュラントは、作物の活力、収量、品質及び収穫後の保存性を改善するために、栄養素とは異なる経路を通じて植物生理に作用する。
このように、バイオスティミュラントにより、従来の農薬や肥料による問題を生じることなく、植物が本来有する能力を刺激して、その成長を促進することができる。
このように、バイオスティミュラントにより、従来の農薬や肥料による問題を生じることなく、植物が本来有する能力を刺激して、その成長を促進することができる。
【0004】
このようなバイオスティミュラントに関連するものとして、これまでに、キチンオリゴ糖と抗菌活性を有するキトサン等とを組み合わせた植物活力剤（特許文献１）、食酢にオリゴ糖類及び植物抽出成分を配合した植物活力剤（特許文献２）、セルロースを含む植物成長促進剤（特許文献３）、ヘキソフラノース誘導体を含む植物生長調節剤（特許文献４）、低分子化したキチンやキトサンを用いて植物の耐病性を高める方法（特許文献５）、キチン及び／又はキトサン等を含む肥料（特許文献６）、ならびにグルタミン酸とプロリンとを構成アミノ酸として含む植物成長促進剤（特許文献７）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開平９－１４３０１３号公報
【特許文献2】特開２００１－６４１１２号公報
【特許文献3】特開２００２－１１４６１０号公報
【特許文献4】特開２０１３－１５１４３８号公報
【特許文献5】特開２０１５－４８４３６号公報
【特許文献6】特開２０１７－９５３５２号公報
【特許文献7】特開２０１９－００６７７４号公報
【特許文献8】国際公開第２０１７／１０４６８７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明が解決しようとする課題は、植物の生理学的プロセスを制御・強化し、農作物の活力、収量、品質及び収穫後の保存性を改善することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、アミノ酸又はその塩とオリゴ糖の組み合わせが、植物の成長を促進させかつ植物のエリシター活性を増大させるという驚くべき知見を見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
本発明は、以下の通りである。
［１］ アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を含むことを特徴とする植物活力剤。
［２］ 前記オリゴ糖が、キチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖からなる群より選択される少なくとも１種である、１に記載の植物活力剤。
［３］ 前記オリゴ糖として、キチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖の３種すべてを含む、１又は２に記載の植物活力剤。
［４］ 前記アミノ酸が、グリシン、グルタミン酸、及びヒスチジンからなる群から選択される少なくとも１種である、１～３のいずれかに記載の植物活力剤。
［５］ 前記アミノ酸がグリシンである、１～４のいずれかに記載の植物活力剤。
［６］ 前記植物活力剤中の前記オリゴ糖の合計含有量が、０．０５～１０質量％である、１～５のいずれかに記載の植物活力剤。
［７］ 前記植物活力剤中の前記アミノ酸又はその塩の合計含有量が２．５～３０質量％である、１～６のいずれかに記載の植物活力剤。
［８］ 展着剤をさらに含む、１～７のいずれかに記載の植物活力剤。
［９］ １～８のいずれかに記載の植物活力剤を植物に適用することを含む、植物栽培方法。
［１０］ 前記植物活力剤を、前記オリゴ糖の合計含有量が０．１～５００質量ｐｐｍとなる濃度で植物に適用することを含む、９に記載の方法。
［１１］ 前記植物活力剤の植物への適用が葉面散布により行われる、９又は１０に記載の方法。
［１２］ １～８のいずれかに記載の植物活力剤を適用しない場合と比較して、増大したエリシター活性を有する植物又はその一部の生産方法であって、９～１１のいずれかに記載の方法により植物を栽培することを含む、方法。
［１３］ 前記エリシター活性が、植物中のグルカナーゼ産生量を測定することにより決定される、１２に記載の方法。
［１４］ １～８のいずれかに記載の植物活力剤を含有する肥料組成物。
［１］ アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を含むことを特徴とする植物活力剤。
［２］ 前記オリゴ糖が、キチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖からなる群より選択される少なくとも１種である、１に記載の植物活力剤。
［３］ 前記オリゴ糖として、キチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖の３種すべてを含む、１又は２に記載の植物活力剤。
［４］ 前記アミノ酸が、グリシン、グルタミン酸、及びヒスチジンからなる群から選択される少なくとも１種である、１～３のいずれかに記載の植物活力剤。
［５］ 前記アミノ酸がグリシンである、１～４のいずれかに記載の植物活力剤。
［６］ 前記植物活力剤中の前記オリゴ糖の合計含有量が、０．０５～１０質量％である、１～５のいずれかに記載の植物活力剤。
［７］ 前記植物活力剤中の前記アミノ酸又はその塩の合計含有量が２．５～３０質量％である、１～６のいずれかに記載の植物活力剤。
［８］ 展着剤をさらに含む、１～７のいずれかに記載の植物活力剤。
［９］ １～８のいずれかに記載の植物活力剤を植物に適用することを含む、植物栽培方法。
［１０］ 前記植物活力剤を、前記オリゴ糖の合計含有量が０．１～５００質量ｐｐｍとなる濃度で植物に適用することを含む、９に記載の方法。
［１１］ 前記植物活力剤の植物への適用が葉面散布により行われる、９又は１０に記載の方法。
［１２］ １～８のいずれかに記載の植物活力剤を適用しない場合と比較して、増大したエリシター活性を有する植物又はその一部の生産方法であって、９～１１のいずれかに記載の方法により植物を栽培することを含む、方法。
［１３］ 前記エリシター活性が、植物中のグルカナーゼ産生量を測定することにより決定される、１２に記載の方法。
［１４］ １～８のいずれかに記載の植物活力剤を含有する肥料組成物。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、従来の農薬や肥料による人体や環境への影響といった問題を生じることなく、植物の生理学的プロセスを制御・強化し、農作物の活力、収量、品質及び収穫後の保存性を改善することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の第一の態様において、アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を含むことを特徴とする植物活力剤が提供される。
本発明に係る「植物活力剤」は、植物の生育に関わる温度、光、水、及び塩等の非生物的ストレスの緩和作用を有するものだけでなく、病害虫等の生物的ストレスの緩和作用を有するものも含む。
本発明に係る「植物活力剤」は、植物の生育に関わる温度、光、水、及び塩等の非生物的ストレスの緩和作用を有するものだけでなく、病害虫等の生物的ストレスの緩和作用を有するものも含む。
【0011】
本発明において用いられるオリゴ糖は、好適にはキチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖からなる群より選択される少なくとも１種である。本発明に係る植物活力剤は、より好適には、オリゴ糖として、キチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖からなる群より選択される２種以上を含み、さらに好適には、キチンオリゴ糖、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖の３種すべてを含む。
本発明において、キチンオリゴ糖は、植物以外の生物由来物質、例えば真菌、昆虫、甲殻類由来の成分のエリシター（すなわち「外生エリシター」）として用いられ、そして、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖は、植物由来物質のエリシター（すなわち「内生エリシター」）として用いられる。
本発明において、キチンオリゴ糖は、植物以外の生物由来物質、例えば真菌、昆虫、甲殻類由来の成分のエリシター（すなわち「外生エリシター」）として用いられ、そして、セロオリゴ糖及びキシロオリゴ糖は、植物由来物質のエリシター（すなわち「内生エリシター」）として用いられる。
【0012】
エリシターは、高等植物の組織又は培養細胞に生体防御反応を誘導する物質の総称であり、植物の免疫機構において病害抵抗性を誘導する。植物は、葉面等に存在する受容体でエリシターを感知し、病原抵抗反応を発動する。これにより、各種の病原菌に対して、各種化合物が分泌される生体防御作用（免疫）が起こる。エリシターが植物に作用すると、ファイトアレキシンや感染特異的タンパク質の合成・蓄積、活性酸素生成、活性窒素生成、過敏感反応性細胞死、遺伝子発現変化などの防御反応が誘導され、これらの反応により植物は病原菌から身を守り耐病性を高めるものと考えられている。
ファイトアレキシンは、エリシターの作用によって植物体内で合成、蓄積される抗菌性化合物であり、植物種ごとに生産される抗菌性化合物は異なる。代表的なファイトアレキシンとして、フラボノイド、テルペノイド、脂肪酸誘導体などが挙げられる。活性酸素は病原微生物を殺す作用を有し、さらに、活性酸素及び活性窒素は単独で又は協調して様々な防御反応を発動するシグナルとして機能する。このようなエリシター効果による病害抵抗性は、幅広い病害に対して抵抗性を増強させることなどから農業利用に期待されている。
ファイトアレキシンは、エリシターの作用によって植物体内で合成、蓄積される抗菌性化合物であり、植物種ごとに生産される抗菌性化合物は異なる。代表的なファイトアレキシンとして、フラボノイド、テルペノイド、脂肪酸誘導体などが挙げられる。活性酸素は病原微生物を殺す作用を有し、さらに、活性酸素及び活性窒素は単独で又は協調して様々な防御反応を発動するシグナルとして機能する。このようなエリシター効果による病害抵抗性は、幅広い病害に対して抵抗性を増強させることなどから農業利用に期待されている。
【0013】
キチンオリゴ糖は、一部脱アセチル化したキトサンオリゴ糖を含み、Ｎ－アセチルグルコサミンが数個連なったオリゴ糖類であり、一般的には、甲殻類等由来のキチンを加水分解等することにより得られる。オリゴ－Ｎ－アセチルグルコサミンとも称される。
すなわち、キチンオリゴ糖はカニ、エビ等の甲殻類の殻等から常法によって調製されるキチンを、化学的又は酵素的に部分加水分解することにより得られる。キチンオリゴ糖としては、Ｎ－アセチルキトビオース、Ｎ－アセチルキトトリオース、Ｎ－アセチルキトテトラオース、Ｎ－アセチルキトペンタオース、Ｎ－アセチルキトヘキサオース、Ｎ－アセチルキトヘプタオース、Ｎ－アセチルキトオクタオース等から選ばれ一種又は複数の混合物が好ましく用いられる。これらの中では特にＮ－アセチルキトペンタオース、Ｎ－アセチルキトヘキサオース、Ｎ－アセチルキトヘプタオースがエリシター効果が高い。
すなわち、キチンオリゴ糖はカニ、エビ等の甲殻類の殻等から常法によって調製されるキチンを、化学的又は酵素的に部分加水分解することにより得られる。キチンオリゴ糖としては、Ｎ－アセチルキトビオース、Ｎ－アセチルキトトリオース、Ｎ－アセチルキトテトラオース、Ｎ－アセチルキトペンタオース、Ｎ－アセチルキトヘキサオース、Ｎ－アセチルキトヘプタオース、Ｎ－アセチルキトオクタオース等から選ばれ一種又は複数の混合物が好ましく用いられる。これらの中では特にＮ－アセチルキトペンタオース、Ｎ－アセチルキトヘキサオース、Ｎ－アセチルキトヘプタオースがエリシター効果が高い。
【0014】
本発明において用いられるキチンオリゴ糖は、下記の化学構造を有するものが特に好ましい。
なお式中のアセチル基（ＣＯＣＨ3）が一部脱落して、ＮＨ2になっているものも含まれる。このような脱アセチル化の割合は、キチンオリゴ糖全体の３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１５％以下であることがさらに好ましい。
【化1】
【0015】
セロオリゴ糖は、複数のグルコースがβ－グリコシド結合により重合した少糖類であり、保湿性、べたつき抑制、清味付与、でんぷん老化低減、タンパク変性抑制などの機能性が近年見出され、医薬、化粧品、食品、飼料分野への利用が期待されている。特に、グルコースの重合度が３以上のセロオリゴ糖は、上記の機能性の増大、新たな機能性賦与という点でより大きな期待が寄せられている。現在工業的に利用されているセロオリゴ糖は、酵素反応によって製造されているが、主成分はグルコースと二量体のセロビオースであり、三量体のセロトリオース以上のオリゴマーはほとんど含有していない。しかしながら、近年、出願人らにより、炭素触媒を用いた植物性バイオマスの加水分解反応において、昇温速度、冷却速度、反応温度、反応時間を制御して水熱反応をさせることによりグルコースの重合度が３～６のオリゴマーを含有するセロオリゴ糖の製造方法が報告されている（特許文献８）。
セロオリゴ糖をセルロースの加水分解反応により得る場合、セルロース原料としてはアビセル（Ｍｅｒｃｋ社製）などの結晶性微粉セルロースや、コットンリンターパルプを使用することが好ましい。
セロオリゴ糖をセルロースの加水分解反応により得る場合、セルロース原料としてはアビセル（Ｍｅｒｃｋ社製）などの結晶性微粉セルロースや、コットンリンターパルプを使用することが好ましい。
【0016】
本発明において用いられるセロオリゴ糖は、下記の化学構造を有するものが特に好ましい。
【化2】
【0017】
キシロオリゴ糖は、キシロース数個がβ－グリコシド結合により重合した少糖類であり、一般的には、ヘミセルロースの主成分であるキシランの加水分解によって得られ、主に食品用途として販売されている。
【0018】
本発明において用いられるキシロオリゴ糖は、下記の化学構造を有するものが特に好ましい。
【化3】
【0019】
植物活力剤が、オリゴ糖としてキチンオリゴ糖及びキシロオリゴ糖の２種のみを含む場合、キチンオリゴ糖とキシロオリゴ糖の含有量の質量比は、キチンオリゴ糖：キシロオリゴ糖＝１：１～１：５であることが好ましく、キチンオリゴ糖：キシロオリゴ糖＝１：１．５～１：４であることがより好ましい。
植物活力剤が、オリゴ糖としてキチンオリゴ糖及びセロオリゴ糖の２種のみを含む場合、キチンオリゴ糖とセロオリゴ糖の含有量の質量比は、キチンオリゴ糖：セロオリゴ糖＝１：１～１：５であることが好ましく、キチンオリゴ糖：セロオリゴ糖＝１：１．５～１：４であることがより好ましい。
植物活力剤が、オリゴ糖としてキチンオリゴ糖及びセロオリゴ糖の２種のみを含む場合、キチンオリゴ糖とセロオリゴ糖の含有量の質量比は、キチンオリゴ糖：セロオリゴ糖＝１：１～１：５であることが好ましく、キチンオリゴ糖：セロオリゴ糖＝１：１．５～１：４であることがより好ましい。
【0020】
植物活力剤が、オリゴ糖としてキチンオリゴ糖、セロオリゴ糖、及びキシロオリゴ糖の３種を含む場合、キチンオリゴ糖とセロオリゴ糖とキシロオリゴ糖の合計含有量に対する各オリゴ糖の割合は、キチンオリゴ糖１０～５０質量％かつセロオリゴ糖１０～５０質量％かつキシロオリゴ糖１０～６０質量％であることが好ましい。各オリゴ糖の割合は、キチンオリゴ糖２０～４０質量％かつセロオリゴ糖２０～４０質量％かつキシロオリゴ糖２０～５５質量％であることがより好ましい。
【0021】
本発明において用いられるアミノ酸は、好適にはグリシン、グルタミン酸、及びヒスチジンからなる群から選択される少なくとも１種であり、より好適にはグリシンである。
本発明において用いられるアミノ酸の塩は、特に限定されないが、たとえばアミノ酸のナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。アミノ酸の塩の具体例として、グルタミン酸ナトリウム等を挙げることができる。
本発明において用いられるアミノ酸の塩は、特に限定されないが、たとえばアミノ酸のナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。アミノ酸の塩の具体例として、グルタミン酸ナトリウム等を挙げることができる。
【0022】
本発明に係る植物活力剤は粉状、顆粒状、液状等のいずれの形態で製品化してもよいが、一般には散布しやすい液状とすることが好ましい。本発明に係る植物活力剤は、アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を水等の溶媒に高濃度で溶解させた原液として供給することができる。一実施態様では、植物活力剤原液中の前記オリゴ糖の合計含有量は、好適には０．０５～１０質量％であり、より好適には０．１～８質量％であり、さらに好適には０．５～６質量％である。別の実施態様では、植物活力剤原液中の前記オリゴ糖の合計含有量は、好適には１～１５質量％であり、より好適には３～１２質量％であり、さらに好適には５～１０質量％である。
【0023】
一実施態様では、本発明に係る植物活力剤原液中の前記アミノ酸又はその塩の合計含有量は、好適には２．５～３０質量％であり、より好適には５～２０質量％であり、さらに好適には９～１６質量％である。別の実施態様では、前記アミノ酸又はその塩の合計含有量は、好適には１０～７０質量％であり、より好適には１５～６０質量％であり、さらに好適には２０～５０質量％である。
【0024】
本発明に係る植物活力剤は、活性成分であるアミノ酸又はその塩とオリゴ糖以外の他の成分、例えば、防腐剤、展着剤、沈殿防止剤、増粘剤、賦形剤をさらに含んでもよい。防腐剤としてはソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸エステル、安息香、デヒドロ酢酸ナトリウム、ヒノキチオール、フェノキシエタノール、ポリアミノプロピルビグアナイド、ポリリジン等が挙げられる。展着剤は界面活性剤を主成分とする粘稠な液体であり、植物活力剤の展着剤として使用できる限り特に制限されないが、例えば、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヘキシタン脂肪酸エステル等が挙げられる。沈殿防止剤としては、ポリりん酸又はポリりん酸の塩類、又はポリカルボン酸型高分子界面活性剤等が挙げられる。増粘剤としてはカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリアクリルアミド、でん粉などの水溶性高分子、又は廃糖蜜、アルコール醗酵濃縮廃液、アミノ酸醗酵濃縮廃液等が挙げられる。賦形剤としては、乳糖やでんぷん等が挙げられる。
【0025】
本発明の第二の態様において、本発明に係る植物活力剤を植物に適用することを含む、植物栽培方法が提供される。
【0026】
本発明に係る植物活力剤が適用される対象植物は特に制限されないが、典型的には、農作物であり、キク科、ナス科、アブラナ科、イネ科、マメ科、バラ科、ウリ科、ヒルガオ科、アカザ科、ユリ科、セリ科、アオイ科、ショウガ科、ハス科などの植物が挙げられる。
具体的には、ハクサイ、キャベツ、ブロッコリー、ハナヤサイ類、コマツナ、ミズナ、ダイコン、カブなどのアブラナ科植物、ジャガイモ、トマト、ナス、ピーマン、トウガラシ、シシトウ、タバコなどのナス科植物、シュンギク、レタス、リーフレタス、ゴボウ、フキなどのキク科植物、スイカ、メロン、カボチャ、キュウリ、ニガウリ、へちま、ひょうたんなどのウリ科植物、ホウレン草、ふだん草、スイスチャード、おかひじき、ビート等などのアカザ科植物、ニンジン、セロリ、パセリ、ミツバなどのセリ科植物、大豆（エダマメ）、小豆、インゲンマメ、ソラマメ、エンドウマメ、シカクマメ、落花生などのマメ科植物、サツマイモ、エンサイなどのヒルガオ科植物、ニラ、ネギ類、タマネギ、ニンニク、アスパラガスなどのユリ科植物、イチゴ、リンゴ、ナシ、ビワなどのバラ科植物、オクラ、綿などのアオイ科植物、ショウガなどのショウガ科植物、ハスなどのハス科植物、とうもろこし、米、大麦、小麦、サトウキビなどのイネ科植物等が挙げられる。
なかでも、キャベツ、コマツナなどのアブラナ科植物、トマト、ナスなどのナス科植物、レタス、リーフレタスなどのキク科植物、イチゴ、リンゴなどのバラ科植物が好ましく、そのなかでもコマツナ、トマトがより好ましい。
具体的には、ハクサイ、キャベツ、ブロッコリー、ハナヤサイ類、コマツナ、ミズナ、ダイコン、カブなどのアブラナ科植物、ジャガイモ、トマト、ナス、ピーマン、トウガラシ、シシトウ、タバコなどのナス科植物、シュンギク、レタス、リーフレタス、ゴボウ、フキなどのキク科植物、スイカ、メロン、カボチャ、キュウリ、ニガウリ、へちま、ひょうたんなどのウリ科植物、ホウレン草、ふだん草、スイスチャード、おかひじき、ビート等などのアカザ科植物、ニンジン、セロリ、パセリ、ミツバなどのセリ科植物、大豆（エダマメ）、小豆、インゲンマメ、ソラマメ、エンドウマメ、シカクマメ、落花生などのマメ科植物、サツマイモ、エンサイなどのヒルガオ科植物、ニラ、ネギ類、タマネギ、ニンニク、アスパラガスなどのユリ科植物、イチゴ、リンゴ、ナシ、ビワなどのバラ科植物、オクラ、綿などのアオイ科植物、ショウガなどのショウガ科植物、ハスなどのハス科植物、とうもろこし、米、大麦、小麦、サトウキビなどのイネ科植物等が挙げられる。
なかでも、キャベツ、コマツナなどのアブラナ科植物、トマト、ナスなどのナス科植物、レタス、リーフレタスなどのキク科植物、イチゴ、リンゴなどのバラ科植物が好ましく、そのなかでもコマツナ、トマトがより好ましい。
【0027】
本発明に係る植物活力剤は、一般には、その原液に水等を加え所望の濃度に希釈（例えば１０００倍に希釈）して使用され、植物活力剤中の前記オリゴ糖の合計含有量が、好適には０．１～５００質量ｐｐｍとなる濃度において植物に適用される。植物活力剤中の前記オリゴ糖の合計含有量は、より好適には０．５～２００質量ｐｐｍ、さらに好適には１～１００質量ｐｐｍとなる濃度において植物に適用される。
【0028】
植物活力剤の植物へ適用は、当業界に慣習的な方法により行うことができ、散布方法も特に限定されず、例えば、植物の葉、茎等に直接散布する方法、植物を栽培する培養基や土壌中に散布する方法、肥料等に配合して培養基や土壌中に散布する方法等のいずれであってもよい。なお、肥料中に配合する場合、肥料としては、窒素、燐酸、カリウムを含有する化学肥料、油カス、魚カス、骨粉、海藻粉末、糖類、ビタミン類などの有機質肥料等、その種類は限定されない。散布方法としては、特に、葉面散布により行われることが、エリシター活性を有効に発現させる上で好ましい。葉面散布は当業界に慣習的な手法、例えば動力噴霧器、肩掛け噴霧器、ブロードキャスター、スプレイヤー、有人又は無人ヘリコプター、煙霧器、ハンドスプレーなどにより行うことができる。
【0029】
植物活力剤を肥料に配合して散布する場合、肥料組成物中の固形分１００質量％に対して、前記オリゴ糖の含有量は１０～５０質量％であることが好ましく、１５～４０質量％であることがより好ましい。肥料組成物中の固形分１００質量％に対して、前記アミノ酸又はその塩の含有量は１０～５０質量％であることが好ましく、１５～４０質量％であることがより好ましい。肥料組成物は、前記オリゴ糖及び前記アミノ酸又はその塩以外に、窒素、燐酸、カリウムから選択される少なくとも１種の栄養素を含有することが好ましく、窒素、リン酸、及びカリウムの３つの栄養素全てを含有することがより好ましい。液状肥料である場合、肥料組成物は水を７０～９９質量％含有することが好ましく、７５～９９質量％含有することがより好ましく、散布前にこの原液を１００倍から１０００倍希釈して用いることが好ましい。
【0030】
このような方法によって植物を栽培することにより、植物活力剤を適用しない場合と比較して、エリシター活性を有する植物又はその一部（例えば、根、茎、葉、花、果実、種子、組織、細胞など）を生産することが可能となり、ひいては、農作物の活力、収量、品質及び収穫後の保存性を改善することができる。
【0031】
上述のとおり、エリシター効果は病害抵抗性の一つの指標として重要であるが、本発明者らは、このたび、エリシター効果の一つのシグナルであるグルカナーゼ産生量により、その酵素活性を測定することでエリシター活性を評価できることを見出した。栽培中植物の葉の一部を採取して、そのグルカナーゼ活性を分析することにより、同一個体の経時的な評価が可能となる。
【0032】
エリシター活性の評価方法における手順の概要を以下に示す：
（ｉ）植物のサンプリング及び前処理を行う；（ｉｉ）ＢＳＡをタンパク質標準として検量線を作成する（色素結合法による波長（６００ｎｍ）の吸光度を利用）；（ｉｉｉ）（ｉ）で調製した検体のタンパク質濃度を測定する；（ｉＶ）（ｉ）で調製した検体のグルカナーゼ活性を測定する。具体的には、グルカナーゼにより可溶性の低分子分解物が遊離すると発色するＢ－ＨＳ試薬にて、その活性を波長５９０ｎｍの吸光度値として評価する；（ｖ）タンパク質単位あたりのグルカナーゼ活性を算出する。
このようなエリシター活性の評価方法の具体的な手順については下記実施例で詳細に説明されている。
（ｉ）植物のサンプリング及び前処理を行う；（ｉｉ）ＢＳＡをタンパク質標準として検量線を作成する（色素結合法による波長（６００ｎｍ）の吸光度を利用）；（ｉｉｉ）（ｉ）で調製した検体のタンパク質濃度を測定する；（ｉＶ）（ｉ）で調製した検体のグルカナーゼ活性を測定する。具体的には、グルカナーゼにより可溶性の低分子分解物が遊離すると発色するＢ－ＨＳ試薬にて、その活性を波長５９０ｎｍの吸光度値として評価する；（ｖ）タンパク質単位あたりのグルカナーゼ活性を算出する。
このようなエリシター活性の評価方法の具体的な手順については下記実施例で詳細に説明されている。
【0033】
以下の実施例により、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例0034】
［１．オリゴ糖の準備］
（１）キチンオリゴ糖
キチン（富士フイルム和光純薬株式会社製、精製キチン）１０ｇを、リン酸１．２ｇを含む水３０ｍＬに分散後に、減圧乾燥した粉末を、直径５ｍｍのアルミナボール１００ｇと共に容量２５０ｍＬのアルミナポットに入れて、遊星ボールミル（フリッチュ社製、ＰＵＬＶＥＲＩＳＥＴＴＥ６）にセットして５００ｒｐｍで連続６時間処理して反応物を取得した。なお、温度については室温で開始し、剪断発熱による温度上昇は成り行きに任せた。
続いて反応物を、水に懸濁し水酸化カルシウムで中和したスラリー液を、５Ｂろ紙を用いてヌッチェろ過器により濾過を行い、回収したろ液を、凍結乾燥してキチンオリゴ糖粉末を取得した。
（１）キチンオリゴ糖
キチン（富士フイルム和光純薬株式会社製、精製キチン）１０ｇを、リン酸１．２ｇを含む水３０ｍＬに分散後に、減圧乾燥した粉末を、直径５ｍｍのアルミナボール１００ｇと共に容量２５０ｍＬのアルミナポットに入れて、遊星ボールミル（フリッチュ社製、ＰＵＬＶＥＲＩＳＥＴＴＥ６）にセットして５００ｒｐｍで連続６時間処理して反応物を取得した。なお、温度については室温で開始し、剪断発熱による温度上昇は成り行きに任せた。
続いて反応物を、水に懸濁し水酸化カルシウムで中和したスラリー液を、５Ｂろ紙を用いてヌッチェろ過器により濾過を行い、回収したろ液を、凍結乾燥してキチンオリゴ糖粉末を取得した。
【0035】
（２）セロオリゴ糖
以下の実施例１、２および比較例１、４では「製造方法１」により製造したセロオリゴ糖を用い、実施例６、８、１０では「製造方法２」により製造したセロオリゴ糖を用いた。
（製造方法１：結晶性微粉セルロースからの取得）
アビセル（Ｍｅｒｃｋ社製結晶性微粉セルロース）１０ｇと、活性炭ＢＡ５０（味の素ファインテクノ（株）製）１．５ｇを、直径１．５ｃｍのアルミナ球２０００ｇと共に容量３６００ｍＬのセラミックポットミルの中に入れて、卓上ポットミル回転台（日陶科学（株）製，卓上ポットミル型式ＡＮＺ－５１Ｓ）にセットし、６０ｒｐｍで４８時間処理して反応原料を取得した。なお、温度については室温で開始し、剪断発熱による温度上昇は成り行きに任せた。
続いて、反応原料０．３７４ｇと水４０ｍＬを、高圧反応器（内容積１００ｍＬ，オーエムラボテック（株）製オートクレーブ，ハステロイＣ２２製）に入れた後、６００ｒｐｍで撹拌しながら反応温度まで１０～３０℃／分（平均昇温速度１１．３℃／分）で２３０℃まで加熱後、直ちに加熱を止め、反応器を１０～３０℃／分（平均降温速度１６．７℃／分）で風冷にて冷却して反応液を作製した。
続いて反応液を、遠心分離装置により回収した上清液を、凍結乾燥してセロオリゴ糖粉末を取得した。
以下の実施例１、２および比較例１、４では「製造方法１」により製造したセロオリゴ糖を用い、実施例６、８、１０では「製造方法２」により製造したセロオリゴ糖を用いた。
（製造方法１：結晶性微粉セルロースからの取得）
アビセル（Ｍｅｒｃｋ社製結晶性微粉セルロース）１０ｇと、活性炭ＢＡ５０（味の素ファインテクノ（株）製）１．５ｇを、直径１．５ｃｍのアルミナ球２０００ｇと共に容量３６００ｍＬのセラミックポットミルの中に入れて、卓上ポットミル回転台（日陶科学（株）製，卓上ポットミル型式ＡＮＺ－５１Ｓ）にセットし、６０ｒｐｍで４８時間処理して反応原料を取得した。なお、温度については室温で開始し、剪断発熱による温度上昇は成り行きに任せた。
続いて、反応原料０．３７４ｇと水４０ｍＬを、高圧反応器（内容積１００ｍＬ，オーエムラボテック（株）製オートクレーブ，ハステロイＣ２２製）に入れた後、６００ｒｐｍで撹拌しながら反応温度まで１０～３０℃／分（平均昇温速度１１．３℃／分）で２３０℃まで加熱後、直ちに加熱を止め、反応器を１０～３０℃／分（平均降温速度１６．７℃／分）で風冷にて冷却して反応液を作製した。
続いて反応液を、遠心分離装置により回収した上清液を、凍結乾燥してセロオリゴ糖粉末を取得した。
【0036】
（製造方法２：コットンリンターパルプからの取得）
コットンリンターパルプ（東工コーセン株式会社、セルロース含有率９７％）２７１ｇ（含水率１．８％、乾燥質量２６６ｇ）を、フードブレンダー（型番：ＨＢＦ５００Ｓ、ハミルトンビーチ社製）を用いて８５質量％リン酸（富士フイルム和光純薬株式会社製特級試薬）３８ｇと混合して、反応原料３０９ｇ（含水率３．４％、リン酸含有率１０．４％）を取得した。
続いて、反応原料３０９ｇを振動ミル（装置名：ＭＢ－１型、中央化工機株式会社製、ポットサイズ５L）にφ３／４インチカーボンスチールボール１３ｋｇと一緒に投入して全振幅８ｍｍ、振動数１６．２Ｈｚ、ジャケット流通水温度７５℃の条件で、２４時間、乾式粉砕による加水分解反応を行った後、反応粉体を回収した。
この反応粉体１０ｇとイオン交換水９０ｇを２００Ｌビーカーに入れて、マグネチックスターラーを用い２５℃で１時間攪拌を行い、セルロース加水分解物の抽出液を得た。
続いて、抽出物に、４０質量％水酸化カルシウム水溶液１．３ｇを加え、マグネチックスターラーを用い２５℃で１時間攪拌を行って調製した中和液から、遠心分離装置により上清液を回収した後、凍結乾燥してセロオリゴ糖粉末を取得した。
コットンリンターパルプ（東工コーセン株式会社、セルロース含有率９７％）２７１ｇ（含水率１．８％、乾燥質量２６６ｇ）を、フードブレンダー（型番：ＨＢＦ５００Ｓ、ハミルトンビーチ社製）を用いて８５質量％リン酸（富士フイルム和光純薬株式会社製特級試薬）３８ｇと混合して、反応原料３０９ｇ（含水率３．４％、リン酸含有率１０．４％）を取得した。
続いて、反応原料３０９ｇを振動ミル（装置名：ＭＢ－１型、中央化工機株式会社製、ポットサイズ５L）にφ３／４インチカーボンスチールボール１３ｋｇと一緒に投入して全振幅８ｍｍ、振動数１６．２Ｈｚ、ジャケット流通水温度７５℃の条件で、２４時間、乾式粉砕による加水分解反応を行った後、反応粉体を回収した。
この反応粉体１０ｇとイオン交換水９０ｇを２００Ｌビーカーに入れて、マグネチックスターラーを用い２５℃で１時間攪拌を行い、セルロース加水分解物の抽出液を得た。
続いて、抽出物に、４０質量％水酸化カルシウム水溶液１．３ｇを加え、マグネチックスターラーを用い２５℃で１時間攪拌を行って調製した中和液から、遠心分離装置により上清液を回収した後、凍結乾燥してセロオリゴ糖粉末を取得した。
【0037】
（３）キシロオリゴ糖
以下の実施例１、２および比較例１、４では下記「市販品」のキシロオリゴ糖を用い、実施例６～９、１１では「製造方法」により製造したキシロオリゴ糖を用いた。
以下の実施例１、２および比較例１、４では下記「市販品」のキシロオリゴ糖を用い、実施例６～９、１１では「製造方法」により製造したキシロオリゴ糖を用いた。
【0038】
（製造方法：コーンコブ粉末からの取得）
アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＴＮ株（ＦＥＲＭ Ｐ－１８５０８）を、液体培地（アビセル５０ｇ／Ｌ、ＫＨ2Ｏ4 ２４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、酒石酸カリウム１／２Ｈ2Ｏ ４．７ｇ／Ｌ、尿素４ｇ／Ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ）１００ｍＬを入れた５００ｍＬフラスコで３０℃、６日間振とう培養して得た培養液の遠心分離上清５０ｍＬに、コーンコブ粉末５ｇを懸濁し、５０℃、７２Ｈｒで撹拌反応して得た反応液の遠心分離上清を、凍結乾燥してキシロオリゴ糖原末を取得した。
（市販品）
物産フードサイエンス株式会社製、キシロオリゴ糖９５Ｐを用いた。
［２．アミノ酸の準備］
（１）グリシン：昭和電工株式会社製
（２）リジン：富士フィルム和光純薬株式会社製
（３）グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）：富士フィルム和光純薬株式会社製
（４）ヒスチジン：富士フィルム和光純薬株式会社製
（５）アラニン：富士フィルム和光純薬株式会社製
（６）アルギニン：富士フィルム和光純薬株式会社製
アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＴＮ株（ＦＥＲＭ Ｐ－１８５０８）を、液体培地（アビセル５０ｇ／Ｌ、ＫＨ2Ｏ4 ２４ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、酒石酸カリウム１／２Ｈ2Ｏ ４．７ｇ／Ｌ、尿素４ｇ／Ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／Ｌ）１００ｍＬを入れた５００ｍＬフラスコで３０℃、６日間振とう培養して得た培養液の遠心分離上清５０ｍＬに、コーンコブ粉末５ｇを懸濁し、５０℃、７２Ｈｒで撹拌反応して得た反応液の遠心分離上清を、凍結乾燥してキシロオリゴ糖原末を取得した。
（市販品）
物産フードサイエンス株式会社製、キシロオリゴ糖９５Ｐを用いた。
［２．アミノ酸の準備］
（１）グリシン：昭和電工株式会社製
（２）リジン：富士フィルム和光純薬株式会社製
（３）グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）：富士フィルム和光純薬株式会社製
（４）ヒスチジン：富士フィルム和光純薬株式会社製
（５）アラニン：富士フィルム和光純薬株式会社製
（６）アルギニン：富士フィルム和光純薬株式会社製
【0039】
［３．フリルレタスの根乾燥重量の測定］
（１）植物活力剤の調製
［１．オリゴ糖の準備］で用意した各オリゴ糖、及び［２．アミノ酸の準備］で用意し各アミノ酸を、下記表中の比較例１－２及び実施例１、６－７における植物活力剤濃度（質量ｐｐｍ）の１０００倍になるよう、それぞれの組成比率でスターラー撹拌して水に溶解後、０．４５μｍフィルターで除菌したものを植物活力剤原液とした。
（１）植物活力剤の調製
［１．オリゴ糖の準備］で用意した各オリゴ糖、及び［２．アミノ酸の準備］で用意し各アミノ酸を、下記表中の比較例１－２及び実施例１、６－７における植物活力剤濃度（質量ｐｐｍ）の１０００倍になるよう、それぞれの組成比率でスターラー撹拌して水に溶解後、０．４５μｍフィルターで除菌したものを植物活力剤原液とした。
【0040】
（２）栽培試験
試験区には、水耕栽培の実施用に準備した養液１５０Ｌに各条件の植物活力剤原液１５０ｇを添加して分散させて（１０００倍希釈して）温度２０～２２℃で１２０株ずつの栽培を開始した。栽培は合計６０日間実施し、植物活力剤原液１５０ｇの追添加を開始後１週間ごとに合計５回行い、フリルレタスの根乾燥重量を測定した。
根乾燥重量の測定は、根の部分をカットして、カットした根を恒温乾燥機により５０℃で１２時間、乾燥させてから重量を測定することにより行った。
なお、表１中の根乾燥重量は、植物活力剤を添加しなかった無添加区における根乾燥重量を１００％としたときの割合（％）を表す。
試験区には、水耕栽培の実施用に準備した養液１５０Ｌに各条件の植物活力剤原液１５０ｇを添加して分散させて（１０００倍希釈して）温度２０～２２℃で１２０株ずつの栽培を開始した。栽培は合計６０日間実施し、植物活力剤原液１５０ｇの追添加を開始後１週間ごとに合計５回行い、フリルレタスの根乾燥重量を測定した。
根乾燥重量の測定は、根の部分をカットして、カットした根を恒温乾燥機により５０℃で１２時間、乾燥させてから重量を測定することにより行った。
なお、表１中の根乾燥重量は、植物活力剤を添加しなかった無添加区における根乾燥重量を１００％としたときの割合（％）を表す。
【0041】
【表1】
【0042】
［４．コマツナのエリシター活性の評価］
（１）植物活力剤の調製
［１．オリゴ糖の準備］で用意した各オリゴ糖、及び［２．アミノ酸の準備］で用意し各アミノ酸を下記表中の比較例４－１０及び実施例２、８－９における植物活力剤濃度（質量ｐｐｍ）の１０００倍になるよう、それぞれの組成比率でスターラー撹拌して水に溶解後、０．４５μｍフィルターで除菌したものを植物活力剤原液とした。この原液を水で１０００倍に希釈して、以下の栽培試験に使用した。
（１）植物活力剤の調製
［１．オリゴ糖の準備］で用意した各オリゴ糖、及び［２．アミノ酸の準備］で用意し各アミノ酸を下記表中の比較例４－１０及び実施例２、８－９における植物活力剤濃度（質量ｐｐｍ）の１０００倍になるよう、それぞれの組成比率でスターラー撹拌して水に溶解後、０．４５μｍフィルターで除菌したものを植物活力剤原液とした。この原液を水で１０００倍に希釈して、以下の栽培試験に使用した。
【0043】
（２）ＭＳ培地の調製
コマツナの育成にはムラシゲスクーグ（ＭＳ）寒天培地を使用した。調製した植物活力剤を各比較例及び実施例に示される終濃度となるようにＭＳ培地に添加し、その後、１２１℃２０分でオートクレーブを行った。
コマツナの育成にはムラシゲスクーグ（ＭＳ）寒天培地を使用した。調製した植物活力剤を各比較例及び実施例に示される終濃度となるようにＭＳ培地に添加し、その後、１２１℃２０分でオートクレーブを行った。
【0044】
（３）播種及び生育方法
クリーンベンチ上にて、高圧蒸気滅菌したＭＳ培地をプラントボックスに移し、よく冷ました後、コマツナ（わかみ、サカタのタネ）の種を１０粒ずつ播種した。その後、明所にて２２℃２４時間、長日条件下で６日間生育させた。
クリーンベンチ上にて、高圧蒸気滅菌したＭＳ培地をプラントボックスに移し、よく冷ました後、コマツナ（わかみ、サカタのタネ）の種を１０粒ずつ播種した。その後、明所にて２２℃２４時間、長日条件下で６日間生育させた。
【0045】
（４）タンパク質抽出
以下の組成のタンパク質抽出用緩衝液を調製した。
以下の組成のタンパク質抽出用緩衝液を調製した。
【0046】
【表2】
【0047】
バイオマッシャー（株式会社ニッピ）付属の１．５ｍｌチューブに上記で作製したタンパク質抽出用緩衝液３００μｌを添加し、その中にハサミで４×４ｍｍ程度にカットしてサンプリングした葉（植物体）を入れた。この操作を各サンプルにつき、５回行った。次いで、手で撹拌棒を回転させ、概ね目に見える固形分が無くなる程度まで植物体を破砕した。１５，０００×ｇ、１０分、４℃の条件下で遠心分離し、水層を新しい１．５ｍｌチューブに回収し、抽出液を調製した。
【0048】
（５）タンパク質濃度の調整
純度既知の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）２ｍｇ／ｍｌを段階希釈（１／２、１／４、１／８、１／１６、１／３２、１／６４希釈）してスタンダードを作製した。作製したスタンダードを用い、６００ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ６００）の平均値をとり、検量線を作成した（ｎ＝３）。クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）液３００μｌを９６ウェルプレートに分注し、上記で調製した抽出液を６μｌ添加した。Ａｂｓ６００を測定した。ブランクはＭｉｌｌｉＱを用いた。抽出液の吸光度を段階希釈したＢＳＡ２ｍｇ／ｍｌによって作成した検量線に当てはめ、タンパク質濃度を求めた。
なお、抽出液のＡｂｓ６００測定値が検量線から外れた場合は、超純水（ＭｉｌｌｉＱ）で適宜希釈して再測定してタンパク質濃度を求めた。
求めた値を用いて抽出液の濃度が一定になるように希釈を行い以下のグルカナーゼ活性測定に用いた。
純度既知の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）２ｍｇ／ｍｌを段階希釈（１／２、１／４、１／８、１／１６、１／３２、１／６４希釈）してスタンダードを作製した。作製したスタンダードを用い、６００ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ６００）の平均値をとり、検量線を作成した（ｎ＝３）。クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）液３００μｌを９６ウェルプレートに分注し、上記で調製した抽出液を６μｌ添加した。Ａｂｓ６００を測定した。ブランクはＭｉｌｌｉＱを用いた。抽出液の吸光度を段階希釈したＢＳＡ２ｍｇ／ｍｌによって作成した検量線に当てはめ、タンパク質濃度を求めた。
なお、抽出液のＡｂｓ６００測定値が検量線から外れた場合は、超純水（ＭｉｌｌｉＱ）で適宜希釈して再測定してタンパク質濃度を求めた。
求めた値を用いて抽出液の濃度が一定になるように希釈を行い以下のグルカナーゼ活性測定に用いた。
【0049】
（６）グルカナーゼ活性の測定
１．５ｍｌチューブに、Ｂ－ＨＳ試薬（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社）１錠をＭｉｌｌｉＱ １０ｍｌに懸濁したＢ－ＨＳ基質溶液１００μｌ、０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）５０μｌ、及び上記で調製した希釈液又は超純水（ブランク）５０μｌを混合し、各比較例及び実施例のサンプルを調製した。１５分毎にサンプルをよく振りつつ、３０℃のウォーターバスで、１時間３０分、酵素反応を行った。反応停止液０．２Ｎ ＮａＯＨを１００μｌ（合計３００μｌ）加えて反応を停止した。１５，０００ｒｐｍ、５分の条件下で遠心分離し、上清２００μｌを９６ウェルプレートに分注し、グルカナーゼ活性を評価するために５９０ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ５９０）を測定し、植物活力剤を適用しない場合（比較例３）と比較した。
１．５ｍｌチューブに、Ｂ－ＨＳ試薬（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社）１錠をＭｉｌｌｉＱ １０ｍｌに懸濁したＢ－ＨＳ基質溶液１００μｌ、０．２Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）５０μｌ、及び上記で調製した希釈液又は超純水（ブランク）５０μｌを混合し、各比較例及び実施例のサンプルを調製した。１５分毎にサンプルをよく振りつつ、３０℃のウォーターバスで、１時間３０分、酵素反応を行った。反応停止液０．２Ｎ ＮａＯＨを１００μｌ（合計３００μｌ）加えて反応を停止した。１５，０００ｒｐｍ、５分の条件下で遠心分離し、上清２００μｌを９６ウェルプレートに分注し、グルカナーゼ活性を評価するために５９０ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓ５９０）を測定し、植物活力剤を適用しない場合（比較例３）と比較した。
【0050】
【表3-1】
【0051】
【表3-2】
【0052】
［５．コマツナの生体重の測定］
（１）植物活力剤の調製
［１．オリゴ糖の準備］で用意した各オリゴ糖、及び［２．アミノ酸の準備］で用意し各アミノ酸を下記表中の比較例１２－１４及び実施例３－５、１０－１１における植物活力剤濃度（質量ｐｐｍ）の１０００倍になるよう、それぞれの組成比率でスターラー撹拌して水に溶解後、０．４５μｍフィルターで除菌したものを植物活力剤原液とした。この原液を水で１０００倍に希釈して、以下の栽培試験に使用した。
（１）植物活力剤の調製
［１．オリゴ糖の準備］で用意した各オリゴ糖、及び［２．アミノ酸の準備］で用意し各アミノ酸を下記表中の比較例１２－１４及び実施例３－５、１０－１１における植物活力剤濃度（質量ｐｐｍ）の１０００倍になるよう、それぞれの組成比率でスターラー撹拌して水に溶解後、０．４５μｍフィルターで除菌したものを植物活力剤原液とした。この原液を水で１０００倍に希釈して、以下の栽培試験に使用した。
【0053】
（２）生体重の測定
作物としてコマツナ（わかみ、サカタのタネ）、培土として有機野菜の土（廣田商店）、肥料として新多木有機入り液肥3号（多木化学株式会社）を準備した。
ろ紙上で作物の芽だしを行った後、培養土と肥料を入れた25穴連結ポット（全体２８０×２８０ｍｍ 一穴５０×５０×５０ｍｍ）へ定植を行った。定植後一週間の間隔でコマツナに各植物活力剤の葉面散布を行いながら培養室で３４日間育成した後、生体重を測定し、植物活力剤を適用しない場合（比較例１１）と比較した。
作物としてコマツナ（わかみ、サカタのタネ）、培土として有機野菜の土（廣田商店）、肥料として新多木有機入り液肥3号（多木化学株式会社）を準備した。
ろ紙上で作物の芽だしを行った後、培養土と肥料を入れた25穴連結ポット（全体２８０×２８０ｍｍ 一穴５０×５０×５０ｍｍ）へ定植を行った。定植後一週間の間隔でコマツナに各植物活力剤の葉面散布を行いながら培養室で３４日間育成した後、生体重を測定し、植物活力剤を適用しない場合（比較例１１）と比較した。
【0054】
【表4】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸又はその塩とオリゴ糖を含むことを特徴とする植物活力剤。