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特開2024-89265Ｎ－アセチルラクトサミンの製造方法およびＮ－アセチルラクトサミン含有組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024089265
(43)【公開日】2024-07-03
(54)【発明の名称】Ｎ－アセチルラクトサミンの製造方法およびＮ－アセチルラクトサミン含有組成物
(51)【国際特許分類】
C12P 19/26 20060101AFI20240626BHJP
C12N 9/38 20060101ALN20240626BHJP
【ＦＩ】
C12P19/26
C12N9/38
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022204528
(22)【出願日】2022-12-21
(71)【出願人】
【識別番号】711002926
【氏名又は名称】雪印メグミルク株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000774
【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】樋口 淳一
(72)【発明者】
【氏名】山口 敏幸
(72)【発明者】
【氏名】野々山 典子
(72)【発明者】
【氏名】福留 博文
(72)【発明者】
【氏名】酒井 史彦
【テーマコード（参考）】
4B050
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B050CC07
4B050DD02
4B050KK06
4B050KK07
4B050KK11
4B050LL02
4B050LL05
4B064AE01
4B064CA21
4B064CB24
4B064CD07
4B064CD09
4B064DA10
(57)【要約】 （修正有）
【課題】安価でかつ安全なGal供与体である乳糖と、Gal受容体であるＮ－アセチルグルコサミンを含む溶液にβ-ガラクトシダーゼを接触させてＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を製造する方法において、従来の方法よりも、副生成物の生成を抑え、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ－アセチルラクトサミンの割合が高いＮ－アセチルラクトサミン含有組成物の製造方法を提供すること。
【解決手段】乳糖及びＮ－アセチルグルコサミンを含む溶液とBifidobacterium属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを接触させる工程を含み、前記溶液中のβ－ガラクトシダーゼを接触させる前の乳糖の濃度がＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下であることを特徴とするＮ－アセチルラクトサミン含有組成物の製造方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】乳糖及びＮ－アセチルグルコサミンを含む溶液とBifidobacterium属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを接触させる工程を含み、前記溶液中のβ－ガラクトシダーゼを接触させる前の乳糖の濃度がＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下であることを特徴とするＮ－アセチルラクトサミン含有組成物の製造方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳糖及びＮ－アセチルグルコサミンを含む溶液とビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを接触させる工程を含み、
β－ガラクトシダーゼを接触させる前の前記溶液中の乳糖の濃度がＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下であることを特徴とするＮ－アセチルラクトサミン含有組成物の製造方法。
β－ガラクトシダーゼを接触させる前の前記溶液中の乳糖の濃度がＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下であることを特徴とするＮ－アセチルラクトサミン含有組成物の製造方法。
【請求項2】
前記工程が、酵素としてビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼのみを接触させる工程である請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼが、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ-ガラクトシダーゼである請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項4】
請求項１又は２に記載の製造方法により製造したＮ－アセチルラクトサミン含有組成物であって、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ－アセチルラクトサミンの割合が５２重量％以上であることを特徴とする前記組成物。
【請求項5】
請求項３に記載の製造方法により製造したＮ－アセチルラクトサミン含有組成物であって、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ－アセチルラクトサミンの割合が５２重量％以上であることを特徴とする前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＮ－アセチルラクトサミンの製造方法およびＮ－アセチルラクトサミン含有組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｎ－アセチルラクトサミン（以下、単にLacNAcということがある）は、ガラクトース（以下、単にGalということがある）がＮ-アセチルグルコサミン（以下、単にGlcNAcということがある）にβ－１，４結合したオリゴ糖である。LacNAcは、ヒトミルクオリゴ糖や、リポ多糖、各種の糖蛋白質及び糖脂質の糖鎖中に存在する、生化学的に非常に重要なオリゴ糖である。また、腸内細菌の一つであるビフィズス菌の発育因子としても知られており、機能性食品素材としても有用な物質である。
【0003】
LacNAcの製造には、化学合成法や、ウリジン二リン酸ガラクトース（UDP-Gal）とGlcNAcを基質としたGal転移酵素による合成方法が知られている。しかし、化学合成法では、食品には利用できない有害な試薬や溶媒の使用が必須であり、Gal糖転移酵素を用いた合成法では、基質となるUDP-GalとGal転移酵素が非常に高価であるため、これらの合成法は、食品への利用を前提とした工業的生産としては現実的ではない。
【0004】
一方、簡便なLacNAcの合成方法として、β－ガラクトシダーゼの糖転移反応を利用し、乳糖（ラクトースともいう）やp-nitrophenyl-Galactoside（以下、単にPNP-Galということがある）のGal残基をGlcNAcに転移させる方法がある。
特許文献１、特許文献２、特許文献３では、それぞれデイプロコッカス ニューモニエ（Diplococcus pneumoniae）の菌由来、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来、バシラス（Bacillus）属の菌由来のβ－ガラクトシダーゼを用いてLacNAcを調製しているが、食品には使用できない合成基質であるPNP-GalをGal供与体として使用しているため、やはり食品への応用が不可能であった。
以上より、LacNAcを食品に利用するための工業的生産方法としては、Gal供与体として安価、かつ安全な糖である乳糖を用いることが望ましい。
特許文献１、特許文献２、特許文献３では、それぞれデイプロコッカス ニューモニエ（Diplococcus pneumoniae）の菌由来、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来、バシラス（Bacillus）属の菌由来のβ－ガラクトシダーゼを用いてLacNAcを調製しているが、食品には使用できない合成基質であるPNP-GalをGal供与体として使用しているため、やはり食品への応用が不可能であった。
以上より、LacNAcを食品に利用するための工業的生産方法としては、Gal供与体として安価、かつ安全な糖である乳糖を用いることが望ましい。
【0005】
乳糖とGlcNAcの溶液にβ－ガラクトシダーゼを作用させると、目的物質であるLacNAcの他に、単糖（グルコース、ガラクトース、およびGlcNAc）、未反応の乳糖、ならびに副生成物のガラクトオリゴ糖（以下、単にGOSということがある）が生成する。GOSは、乳糖にβ－ガラクトシダーゼを作用させた場合に生成するオリゴ糖の総称であり、様々な種類のオリゴ糖で構成される。
ここで、LacNAc含有組成物を様々な食品へ添加する場合、できるだけLacNAcの含有量が高く、副生成物は少ない方が、その添加量は少量ですみ、また、食品の風味や物性への影響を少なくできるため、好ましい。したがって、一般的に、β-ガラクトシダーゼを作用させて調製したLacNAc含有組成物を食品に利用する場合は、LacNAcを濃縮する工程を経る必要がある。例えば、一般的なLacNAcの濃縮工程では、まず、GOSが生成しにくいβ-ガラクトシダーゼを作用させて残存する乳糖を全て単糖に変換し、その後、限外濾過膜や活性炭クロマトグラフィーなどで単糖とオリゴ糖を分画する。これらの工程によって、LacNAc含有組成物中の単糖と乳糖の大部分が除去され、LacNAcとGOSを含むオリゴ糖画分を調製できる。さらに、当該オリゴ糖画分に含まれるLacNAcを濃縮するためには、より高度なクロマトグラフィー技術によりLacNAcとGOSを分離する必要がある。しかし、工業的規模でそのようなクロマトグラフィー技術を使用することは現実的ではない。このように、LacNAc含有組成物から単糖と乳糖を分離することは容易であるが、GOSを分離することは極めて困難であった。
したがって、乳糖とGlcNAcの溶液にβ-ガラクトシダーゼを作用させた段階で、副生成物であるGOSが少なく、乳糖を除くオリゴ糖に占めるLacNAcの割合が高いLacNAc含有組成物の製造方法が望まれていた。
ここで、LacNAc含有組成物を様々な食品へ添加する場合、できるだけLacNAcの含有量が高く、副生成物は少ない方が、その添加量は少量ですみ、また、食品の風味や物性への影響を少なくできるため、好ましい。したがって、一般的に、β-ガラクトシダーゼを作用させて調製したLacNAc含有組成物を食品に利用する場合は、LacNAcを濃縮する工程を経る必要がある。例えば、一般的なLacNAcの濃縮工程では、まず、GOSが生成しにくいβ-ガラクトシダーゼを作用させて残存する乳糖を全て単糖に変換し、その後、限外濾過膜や活性炭クロマトグラフィーなどで単糖とオリゴ糖を分画する。これらの工程によって、LacNAc含有組成物中の単糖と乳糖の大部分が除去され、LacNAcとGOSを含むオリゴ糖画分を調製できる。さらに、当該オリゴ糖画分に含まれるLacNAcを濃縮するためには、より高度なクロマトグラフィー技術によりLacNAcとGOSを分離する必要がある。しかし、工業的規模でそのようなクロマトグラフィー技術を使用することは現実的ではない。このように、LacNAc含有組成物から単糖と乳糖を分離することは容易であるが、GOSを分離することは極めて困難であった。
したがって、乳糖とGlcNAcの溶液にβ-ガラクトシダーゼを作用させた段階で、副生成物であるGOSが少なく、乳糖を除くオリゴ糖に占めるLacNAcの割合が高いLacNAc含有組成物の製造方法が望まれていた。
【0006】
特許文献４では、乳糖とGlcNAcを含有する溶液にバシラス サーキュランス（Bacillus circulans）の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを作用させてLacNAcを調製する方法が開示されている。当該方法は、基質である乳糖とGlcNAcの物質量比（乳糖/GlcNAc比）を０．２５～０．５に設定してLacNAcを調製する方法であるが、当該文献には副生成物であるGOSの生成量については開示されていない。しかし、バシラス サーキュランスの菌由来のβ-ガラクトシダーゼはGOSを生成しやすい酵素であるため、GOSが多量に生成しているものと推測できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】特開平6-335395号公報
【特許文献2】特開平10-23898号公報
【特許文献3】特許第6771756号公報
【特許文献4】特許第2819312号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の課題は、安価でかつ食品利用に安全なGal供与体である乳糖と、Gal受容体であるＮ－アセチルグルコサミンを含む溶液にβ-ガラクトシダーゼを接触させてＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を製造する方法において、バシラス サーキュランスの菌由来のβ-ガラクトシダーゼを使用した従来の方法よりも、副生成物であるガラクトオリゴ糖の生成を抑え、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ－アセチルラクトサミンの割合が高いＮ－アセチルラクトサミン含有組成物の製造方法を提供することである。また、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ－アセチルラクトサミンの割合が高く、例えば前記割合が５２重量％以上であるＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、Ｎ－アセチルラクトサミンの製造に用いるβ－ガラクトシダーゼとして、ビフィドバクテリウム属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを使用し、乳糖及びＮ－アセチルグルコサミンを含む酵素反応前の溶液において、乳糖の濃度をＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下とすることで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
乳糖及びＮ－アセチルグルコサミンを含む溶液とビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを接触させる工程を含み、
β－ガラクトシダーゼを接触させる前の前記溶液中の乳糖の濃度がＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下であることを特徴とするＮ－アセチルラクトサミン含有組成物の製造方法。
＜２＞
前記工程が、酵素としてビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼのみを接触させる工程である＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼが、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ-ガラクトシダーゼである＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞
＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法により製造したＮ－アセチルラクトサミン含有組成物であって、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ－アセチルラクトサミンの割合が５２重量％以上であることを特徴とする前記組成物。
＜５＞
＜３＞に記載の製造方法により製造したＮ－アセチルラクトサミン含有組成物であって、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ－アセチルラクトサミンの割合が５２重量％以上であることを特徴とする前記組成物。
すなわち本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
乳糖及びＮ－アセチルグルコサミンを含む溶液とビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを接触させる工程を含み、
β－ガラクトシダーゼを接触させる前の前記溶液中の乳糖の濃度がＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下であることを特徴とするＮ－アセチルラクトサミン含有組成物の製造方法。
＜２＞
前記工程が、酵素としてビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼのみを接触させる工程である＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼが、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ-ガラクトシダーゼである＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞
＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法により製造したＮ－アセチルラクトサミン含有組成物であって、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ－アセチルラクトサミンの割合が５２重量％以上であることを特徴とする前記組成物。
＜５＞
＜３＞に記載の製造方法により製造したＮ－アセチルラクトサミン含有組成物であって、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ－アセチルラクトサミンの割合が５２重量％以上であることを特徴とする前記組成物。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、乳糖とＮ－アセチルグルコサミンを含む溶液にβ－ガラクトシダーゼを接触させてＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を製造する方法において、ビフィドバクテリウム属の菌由来のβ－ガラクトシダーゼを使用し、酵素反応前の溶液に含まれる乳糖の濃度をＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下とすることにより、副生成物であるガラクトオリゴ糖の生成量を抑え、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ－アセチルラクトサミンの割合が高い組成物を提供することができる。
したがって、本発明の製造方法によれば、酵素反応後のＮ－アセチルラクトサミン含有組成物から高度なクロマトグラフィー技術によりガラクトオリゴ糖を分離するという煩雑な濃縮工程を経ることなく、単糖と乳糖を分離する工程のみで食品に利用可能な高純度のＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を提供することができる。したがって、食品に利用可能な高純度のＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を工業的規模でも提供することができるというメリットもある。
したがって、本発明の製造方法によれば、酵素反応後のＮ－アセチルラクトサミン含有組成物から高度なクロマトグラフィー技術によりガラクトオリゴ糖を分離するという煩雑な濃縮工程を経ることなく、単糖と乳糖を分離する工程のみで食品に利用可能な高純度のＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を提供することができる。したがって、食品に利用可能な高純度のＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を工業的規模でも提供することができるというメリットもある。
【発明を実施するための形態】
【0011】
（製造方法）
本発明の製造方法は、乳糖及びＮ－アセチルグルコサミンを含む溶液とビフィドバクテリウム属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを接触させる工程を含み、β－ガラクトシダーゼを接触させる前の前記溶液中の乳糖の濃度がＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下であるＮ－アセチルラクトサミン含有組成物の製造方法である。すなわち、基質として乳糖とＮ－アセチルグルコサミンを含有する溶液に、酵素としてガラクトース転移作用を有する酵素であるβ－ガラクトシダーゼを添加して基質に作用させて、Ｎ－アセチルラクトサミンを生成する方法において、ビフィドバクテリウム属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを用いること、及びβ-ガラクトシダーゼを作用させる前（酵素反応前）の前記溶液中の乳糖の濃度をＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下とすることを特徴とする。これらの構成の組み合わせによって、副生成物であるガラクトオリゴ糖の生成量を抑え、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ-アセチルラクトサミン比率の高いＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を製造することができる。
酵素としては、β-ガラクトシダーゼのガラクトース転移作用を阻害しない範囲において、他の酵素を添加することも可能である。例えば、グルコースオキシダーゼなどを添加することで、基質として乳糖とＮ－アセチルグルコサミンを用いるＮ-アセチルラクトサミン酵素合成反応の反応副生成物であるグルコースを除去することも可能である。しかし、風味への影響や低コスト化のためには、酵素としてβ-ガラクトシダーゼのみを用いることが望ましい。本発明の製造方法によれば、酵素としてβ-ガラクトシダーゼのみを用いた場合であっても、乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合を５２重量％以上とすることが可能である。
本発明の製造方法は、乳糖及びＮ－アセチルグルコサミンを含む溶液とビフィドバクテリウム属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを接触させる工程を含み、β－ガラクトシダーゼを接触させる前の前記溶液中の乳糖の濃度がＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下であるＮ－アセチルラクトサミン含有組成物の製造方法である。すなわち、基質として乳糖とＮ－アセチルグルコサミンを含有する溶液に、酵素としてガラクトース転移作用を有する酵素であるβ－ガラクトシダーゼを添加して基質に作用させて、Ｎ－アセチルラクトサミンを生成する方法において、ビフィドバクテリウム属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを用いること、及びβ-ガラクトシダーゼを作用させる前（酵素反応前）の前記溶液中の乳糖の濃度をＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下とすることを特徴とする。これらの構成の組み合わせによって、副生成物であるガラクトオリゴ糖の生成量を抑え、乳糖を除くオリゴ糖に占めるＮ-アセチルラクトサミン比率の高いＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を製造することができる。
酵素としては、β-ガラクトシダーゼのガラクトース転移作用を阻害しない範囲において、他の酵素を添加することも可能である。例えば、グルコースオキシダーゼなどを添加することで、基質として乳糖とＮ－アセチルグルコサミンを用いるＮ-アセチルラクトサミン酵素合成反応の反応副生成物であるグルコースを除去することも可能である。しかし、風味への影響や低コスト化のためには、酵素としてβ-ガラクトシダーゼのみを用いることが望ましい。本発明の製造方法によれば、酵素としてβ-ガラクトシダーゼのみを用いた場合であっても、乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合を５２重量％以上とすることが可能である。
【0012】
（β－ガラクトシダーゼ）
本発明におけるβ－ガラクトシダーゼは、乳糖からガラクトース残基をＮ－アセチルグルコサミンに転移する反応を触媒する作用を有するビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来の酵素であり、そのような作用を示す酵素であれば種や菌株は特に限定されない。ビフィドバクテリウム属の菌由来の酵素としては、精製酵素、部分生成酵素、該酵素の作用を有する静止菌体、乾燥菌体、菌体破砕物なども使用することができる。Ｎ－アセチルラクトサミンは、Ｄ－ガラクトースとＮ－アセチルグルコサミンがβ－１，４－グリコシド結合している二糖であるため、β－１，４－グリコシド結合に対する特異性の高いβ－ガラクトシダーゼが好ましく、特に、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ－ガラクトシダーゼの精製酵素もしくは部分精製酵素又は該酵素を含有する物質（静止菌体、乾燥菌体、菌体破砕物等）が好ましい。
本発明におけるβ－ガラクトシダーゼは、乳糖からガラクトース残基をＮ－アセチルグルコサミンに転移する反応を触媒する作用を有するビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌由来の酵素であり、そのような作用を示す酵素であれば種や菌株は特に限定されない。ビフィドバクテリウム属の菌由来の酵素としては、精製酵素、部分生成酵素、該酵素の作用を有する静止菌体、乾燥菌体、菌体破砕物なども使用することができる。Ｎ－アセチルラクトサミンは、Ｄ－ガラクトースとＮ－アセチルグルコサミンがβ－１，４－グリコシド結合している二糖であるため、β－１，４－グリコシド結合に対する特異性の高いβ－ガラクトシダーゼが好ましく、特に、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ－ガラクトシダーゼの精製酵素もしくは部分精製酵素又は該酵素を含有する物質（静止菌体、乾燥菌体、菌体破砕物等）が好ましい。
【0013】
本発明のビフィドバクテリウム属の菌由来のβ－ガラクトシダーゼの濃度は、上記酵素反応が好適に進行するように当業者が適宜設定することができるが、例えば終濃度で０．０１Ｕ／ｍｌ～１００Ｕ／ｍｌが好ましく０．１Ｕ／ｍｌ～１０Ｕ／ｍｌとすることがより好ましい。尚、β－ガラクトシダーゼ１Ｕの酵素活性は、乳糖溶液（ｐＨ６．５）に、該酵素を添加し、５０℃で１０分間反応を行った場合、１分間に１μモルのグルコースを遊離させる酵素量と定義する。
【0014】
本発明の製造方法における上記酵素反応は、乳糖及びＮ－アセチルグルコサミンを含有する溶液（例えば、水溶液、緩衝液溶液）中で、これらの基質にビフィドバクテリウム属の菌由来のβ－ガラクトシダーゼを作用させてＮ－アセチルラクトサミンを生成させる反応である。本酵素反応が進行する限り、反応条件等は限定されないが、用いるβ－ガラクトシダーゼの至適ｐＨ及び至適温度において、緩衝液中で行うことが好ましい。例えば、ｐＨ４～９、５～７０℃の条件下、該ｐＨに保持できる緩衝液中で酵素反応を行うことが好ましい。
【0015】
上記酵素反応に基質として用いられる乳糖とＮ－アセチルグルコサミンは、通常は乳糖とＮ－アセチルグルコサミンを含有する水溶液あるいは緩衝液溶液として用いられ、各基質の含有量、含有比等は上記酵素反応に不都合でない限り特に限定されない。乳糖は、好ましくは０．０５～１．５Ｍ程度、より好ましくは１Ｍ程度で用いる。Ｎ－アセチルグルコサミンは０．０５～１．５Ｍ程度、より好ましくは０．５Ｍ程度の濃度で用いる。酵素反応開始前の溶液における乳糖の濃度は、Ｎ－アセチルグルコサミンの濃度に対して、物質量比で５．２倍以下であればよく、下限としては、０．１倍以上が好ましく、０．２倍以上がさらに好ましい。また好ましい範囲としては、０．１～５．２倍であり、さらに好ましくは０．２～５．２倍であり、さらにいっそう好ましくは０．２～２倍であり、もっとも好ましくは１．１～２倍である。当該物質量比（乳糖／Ｎ－アセチルグルコサミンの物質量比）は、酵素反応開始前の溶液中の乳糖の濃度（Ｍ）を同じく酵素反応開始前の溶液中のＮ－アセチルグルコサミンの濃度（Ｍ）で除して求めることができる。前記物質量比が５．２倍以下であれば、Ｎ－アセチルラクトサミン含有組成物において、乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合を５２重量％以上とすることが可能であるからである。
また、前記酵素反応開始前の乳糖／Ｎ－アセチルグルコサミンの物質量比が５．２倍より低ければ低い程、Ｎ－アセチルラクトサミン含有組成物における、乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合を高くすることが可能である。一方で、乳糖／Ｎ－アセチルグルコサミンの物質量比が低すぎる場合には、生成されるＮ－アセチルラクトサミンの量自体は少なくなる。すなわち、酵素反応開始前の乳糖／Ｎ－アセチルグルコサミンの物質量比が低ければ乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合を高くすることが可能であるが、乳糖／Ｎ－アセチルグルコサミンの物質量比が低すぎるとＮ－アセチルラクトサミンの生成量は減少するため、基質の乳糖やＮ－アセチルグルコサミンが残ってしまい、無駄になる。
したがって、乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合が５２重量％以上、かつ、一定以上のＮ－アセチルラクトサミン物質量を実現するためには、酵素反応開始前の乳糖の濃度が酵素反応前のＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量換算で５．２倍以下に調整する必要があり、好ましくは０．１～５．２倍であり、さらに好ましくは０．２～５．２倍であり、さらにいっそう好ましくは０．２～２倍であり、もっとも好ましくは１．１～２倍である。
また、前記酵素反応開始前の乳糖／Ｎ－アセチルグルコサミンの物質量比が５．２倍より低ければ低い程、Ｎ－アセチルラクトサミン含有組成物における、乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合を高くすることが可能である。一方で、乳糖／Ｎ－アセチルグルコサミンの物質量比が低すぎる場合には、生成されるＮ－アセチルラクトサミンの量自体は少なくなる。すなわち、酵素反応開始前の乳糖／Ｎ－アセチルグルコサミンの物質量比が低ければ乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合を高くすることが可能であるが、乳糖／Ｎ－アセチルグルコサミンの物質量比が低すぎるとＮ－アセチルラクトサミンの生成量は減少するため、基質の乳糖やＮ－アセチルグルコサミンが残ってしまい、無駄になる。
したがって、乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合が５２重量％以上、かつ、一定以上のＮ－アセチルラクトサミン物質量を実現するためには、酵素反応開始前の乳糖の濃度が酵素反応前のＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量換算で５．２倍以下に調整する必要があり、好ましくは０．１～５．２倍であり、さらに好ましくは０．２～５．２倍であり、さらにいっそう好ましくは０．２～２倍であり、もっとも好ましくは１．１～２倍である。
【0016】
（Ｎ－アセチルラクトサミン含有組成物）
本発明のＮ－アセチルラクトサミン含有組成物は、酵素反応後の乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合が５２重量％以上である組成物であって、乳糖とＮ－アセチルグルコサミンを含有する溶液中の乳糖の濃度をＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下とした溶液に、ビフィドバクテリウム属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを作用させることにより製造することができる。乳糖とＮ－アセチルグルコサミンに酵素としてビフィドバクテリウム属の菌由来のβ－ガラクトシダーゼのみを作用させた場合、他の余分な生成物が生じないため風味に与える影響が少ないというメリットが期待できる。
本発明のＮ－アセチルラクトサミン含有組成物において乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合（実施例ではLacNAc比率として表示）は、５３重量％以上がさらに好ましく、５４重量％以上がさらにいっそう好ましく、６０重量％以上がもっとも好ましい。当該比率は、酵素反応終了後の溶液中のＮ－アセチルラクトサミン濃度（w/w％）を、乳糖を除くオリゴ糖濃度（w/w％）で除した値に１００をかけることにより求めることができる。
本発明のＮ－アセチルラクトサミン含有組成物は、酵素反応後の乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合が５２重量％以上である組成物であって、乳糖とＮ－アセチルグルコサミンを含有する溶液中の乳糖の濃度をＮ－アセチルグルコサミンの濃度に対して物質量比で５．２倍以下とした溶液に、ビフィドバクテリウム属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを作用させることにより製造することができる。乳糖とＮ－アセチルグルコサミンに酵素としてビフィドバクテリウム属の菌由来のβ－ガラクトシダーゼのみを作用させた場合、他の余分な生成物が生じないため風味に与える影響が少ないというメリットが期待できる。
本発明のＮ－アセチルラクトサミン含有組成物において乳糖を除くオリゴ糖に対するＮ－アセチルラクトサミンの割合（実施例ではLacNAc比率として表示）は、５３重量％以上がさらに好ましく、５４重量％以上がさらにいっそう好ましく、６０重量％以上がもっとも好ましい。当該比率は、酵素反応終了後の溶液中のＮ－アセチルラクトサミン濃度（w/w％）を、乳糖を除くオリゴ糖濃度（w/w％）で除した値に１００をかけることにより求めることができる。
【実施例0017】
[実施例１]
表１に示す８水準の濃度で乳糖とGlcNAcを溶解した１ｍＬの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）に、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ－ガラクトシダーゼ（ノボザイムズジャパン株式会社：Saphera Fiber L）、またはバシラス サーキュランス（Bacillus circulans）の菌由来のβ－ガラクトシダーゼ（天野エンザイム株式会社：ビオラクタFN5）を５Ｕ／ｍＬの濃度で添加し、５０℃で反応させてLacNAcを調製した。経時的にサンプリングし、反応液を５分間煮沸することで反応を停止させ、反応液中の乳糖とLacNAcの濃度を下記測定条件によりＨＰＬＣで定量した。また、下記のオリゴ糖の測定条件によりＨＰＬＣで重合度２以上のオリゴ糖を乳糖換算で定量し、下記のGlcNAc含有オリゴ糖の測定条件によりＨＰＬＣで重合度２以上のGlcNAc含有オリゴ糖をLacNAc換算で定量した。さらに、乳糖を除くオリゴ糖の濃度、GOSの濃度、乳糖を除くオリゴ糖に占めるLacNAcの重量比率（LacNAc比率）、乳糖を除くオリゴ糖に占めるGOSの重量比率（GOS比率）を、それぞれ下式１、２、３、４により算出した。各水準の経時的に採取したサンプルの中でLacNAc比率の最大値と、その時のLacNAc、GOS、乳糖を除くオリゴ糖の濃度、およびGOS比率を表２に示す。
表１に示す８水準の濃度で乳糖とGlcNAcを溶解した１ｍＬの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ６．０）に、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ－ガラクトシダーゼ（ノボザイムズジャパン株式会社：Saphera Fiber L）、またはバシラス サーキュランス（Bacillus circulans）の菌由来のβ－ガラクトシダーゼ（天野エンザイム株式会社：ビオラクタFN5）を５Ｕ／ｍＬの濃度で添加し、５０℃で反応させてLacNAcを調製した。経時的にサンプリングし、反応液を５分間煮沸することで反応を停止させ、反応液中の乳糖とLacNAcの濃度を下記測定条件によりＨＰＬＣで定量した。また、下記のオリゴ糖の測定条件によりＨＰＬＣで重合度２以上のオリゴ糖を乳糖換算で定量し、下記のGlcNAc含有オリゴ糖の測定条件によりＨＰＬＣで重合度２以上のGlcNAc含有オリゴ糖をLacNAc換算で定量した。さらに、乳糖を除くオリゴ糖の濃度、GOSの濃度、乳糖を除くオリゴ糖に占めるLacNAcの重量比率（LacNAc比率）、乳糖を除くオリゴ糖に占めるGOSの重量比率（GOS比率）を、それぞれ下式１、２、３、４により算出した。各水準の経時的に採取したサンプルの中でLacNAc比率の最大値と、その時のLacNAc、GOS、乳糖を除くオリゴ糖の濃度、およびGOS比率を表２に示す。
【0018】
（式１）
乳糖を除くオリゴ糖（w/w%）＝オリゴ糖測定値（w/w%）－乳糖測定値（w/w%）
乳糖を除くオリゴ糖（w/w%）＝オリゴ糖測定値（w/w%）－乳糖測定値（w/w%）
【0019】
（式２）
GOS（w/w%）＝式１で算出した乳糖を除くオリゴ糖（w/w%）－GlcNAc含有オリゴ糖測定値（w/w%）
GOS（w/w%）＝式１で算出した乳糖を除くオリゴ糖（w/w%）－GlcNAc含有オリゴ糖測定値（w/w%）
【0020】
（式３）
LacNAc比率（w/w%）
＝（LacNAc測定値（w/w%）／式１で算出した乳糖を除くオリゴ糖（w/w%））×１００
LacNAc比率（w/w%）
＝（LacNAc測定値（w/w%）／式１で算出した乳糖を除くオリゴ糖（w/w%））×１００
【0021】
（式４）
GOS比率（w/w%）
＝（式２で算出したGOS（w/w%）／式１で算出した乳糖を除くオリゴ糖（w/w%））×１００
GOS比率（w/w%）
＝（式２で算出したGOS（w/w%）／式１で算出した乳糖を除くオリゴ糖（w/w%））×１００
【0022】
(式５)
乳糖/GlcNAc物質量比
＝（基質の乳糖濃度（w/w%）／342.3）÷（基質のGlcNAc濃度（w/w%）／221.2）
注）342.3：乳糖分子量、221.2：GlcNAc分子量
乳糖/GlcNAc物質量比
＝（基質の乳糖濃度（w/w%）／342.3）÷（基質のGlcNAc濃度（w/w%）／221.2）
注）342.3：乳糖分子量、221.2：GlcNAc分子量
【0023】
＜乳糖、LacNAc測定条件＞
カラム：CarboPac PA1（Thermo Fisher Scientific社製）
移動相：100 mM NaOH
流 速：1 mL/min
温 度：25℃
検出器：電気化学検出器
試 料：10 uL
カラム：CarboPac PA1（Thermo Fisher Scientific社製）
移動相：100 mM NaOH
流 速：1 mL/min
温 度：25℃
検出器：電気化学検出器
試 料：10 uL
【0024】
＜オリゴ糖の測定条件＞
カラム：Sugar KS-802（昭和電工製）
移動相：水
流 速：0.5 mL/min
温 度：60℃
検出器：示唆屈折率検出器
試 料：10 uL
カラム：Sugar KS-802（昭和電工製）
移動相：水
流 速：0.5 mL/min
温 度：60℃
検出器：示唆屈折率検出器
試 料：10 uL
【0025】
＜GlcNAc含有オリゴ糖の測定条件＞
カラム：Sugar KS-802（昭和電工製）
移動相：水
流 速：0.5 mL/min
温 度：60℃
検出器：紫外吸光度検出器
試 料：10 uL
カラム：Sugar KS-802（昭和電工製）
移動相：水
流 速：0.5 mL/min
温 度：60℃
検出器：紫外吸光度検出器
試 料：10 uL
【0026】
【表1】
【0027】
【表2】
【0028】
表２の結果から、いずれの酵素を使用した場合でも、基質に占めるGlcNAcの割合が高くなるほど、すなわち乳糖/GlcNAc物質量比が低いほど、生成物の乳糖を除くオリゴ糖に占めるGOSの割合（GOS比率）が低くなり、LacNAcの割合（LacNAc比率）が高くなる傾向が認められた。一方、ビフィドバクテリウム属の菌由来のβ－ガラクトシダーゼを使用した場合、いずれの水準でもバシラス属の菌由来のβ－ガラクトシダーゼよりもGOS比率が低く、LacNAc比率が高かった。また、バシラス属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを使用した場合、LacNAc比率は最大でも５１％にとどまったが、ビフィドバクテリウム属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼを使用し、乳糖/GlcNAc物質量比が５．２以下の場合にはLacNAc比率が５２％以上になり、バシラス属の菌由来のβ-ガラクトシダーゼでは調製できないような、高いLacNAc比率のLacNAc含有組成物が得られた。
【0029】
[実施例２]
脱脂粉乳を１７．６％（乳糖濃度で８．４％）、食品用のGlcNAc素材（焼津水産化学工業株式会社：マリンスウィートYM40）をGlcNAc濃度で４．３％となるように調製した溶液（乳糖/GlcNAc物質量比：１．３）に、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ－ガラクトシダーゼ（ノボザイムズジャパン株式会社：Saphera Fiber L）を５．０Ｕ／ｍLの濃度で添加し、７℃で２０時間反応させた。反応液を５分間煮沸して反応を停止させた後、実施例１の条件でＨＰＬＣによりLacNAcと乳糖を除くオリゴ糖の生成量を測定した。その結果、LacNAcの生成量は１．５％、乳糖を除くオリゴ糖の生成量は２．６％であり、得られたLacNAc含有組成物中の乳糖を除くオリゴ糖に占めるLacNAcの割合（LacNAc比率）は５８％であった。
脱脂粉乳を１７．６％（乳糖濃度で８．４％）、食品用のGlcNAc素材（焼津水産化学工業株式会社：マリンスウィートYM40）をGlcNAc濃度で４．３％となるように調製した溶液（乳糖/GlcNAc物質量比：１．３）に、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ－ガラクトシダーゼ（ノボザイムズジャパン株式会社：Saphera Fiber L）を５．０Ｕ／ｍLの濃度で添加し、７℃で２０時間反応させた。反応液を５分間煮沸して反応を停止させた後、実施例１の条件でＨＰＬＣによりLacNAcと乳糖を除くオリゴ糖の生成量を測定した。その結果、LacNAcの生成量は１．５％、乳糖を除くオリゴ糖の生成量は２．６％であり、得られたLacNAc含有組成物中の乳糖を除くオリゴ糖に占めるLacNAcの割合（LacNAc比率）は５８％であった。
【0030】
[実施例３]
脱塩ホエイ粉を３２ｋｇ（乳糖量として２５ｋｇ）、GlcNAc素材（焼津水産化学工業株式会社：マリンスウィートYM40）をGlcNAc量として６．３ｋｇを溶解した、総重量１００ｋｇの水溶液（乳糖/GlcNAc物質量比：２．６）に、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ－ガラクトシダーゼ（ノボザイムズジャパン株式会社：Saphera Fiber L）を５００，０００Ｕ添加し、５０℃で１時間反応させた。反応液を９５℃で１０分間加熱して反応を停止させた後、実施例１と同様にＨＰＬＣによりLacNAcと乳糖を除くオリゴ糖の生成量を測定した。その結果、LacNAcの生成量は３．０ｋｇ、乳糖を除くオリゴ糖の生成量は５．７ｋｇであり、得られたLacNAc含有組成物中の乳糖を除くオリゴ糖に占めるLacNAcの割合（LacNAc比率）は５３％であった。
脱塩ホエイ粉を３２ｋｇ（乳糖量として２５ｋｇ）、GlcNAc素材（焼津水産化学工業株式会社：マリンスウィートYM40）をGlcNAc量として６．３ｋｇを溶解した、総重量１００ｋｇの水溶液（乳糖/GlcNAc物質量比：２．６）に、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）の菌由来のβ－ガラクトシダーゼ（ノボザイムズジャパン株式会社：Saphera Fiber L）を５００，０００Ｕ添加し、５０℃で１時間反応させた。反応液を９５℃で１０分間加熱して反応を停止させた後、実施例１と同様にＨＰＬＣによりLacNAcと乳糖を除くオリゴ糖の生成量を測定した。その結果、LacNAcの生成量は３．０ｋｇ、乳糖を除くオリゴ糖の生成量は５．７ｋｇであり、得られたLacNAc含有組成物中の乳糖を除くオリゴ糖に占めるLacNAcの割合（LacNAc比率）は５３％であった。
【産業上の利用可能性】
【0031】
本発明によれば、乳糖及びＮ－アセチルグルコサミンにビフィドバクテリウム属の菌由来のβ－ガラクトシダーゼを作用させることにより、簡単な精製、濃縮工程で、副生成物であるガラクトオリゴ糖の含有量が少ないＮ－アセチルラクトサミン含有組成物を提供できる。