特開 2024-94292 上気道細胞を含むシート状細胞構造体、ならびにその製造方法及び利用法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024094292

(43)【公開日】2024-07-09

(54)【発明の名称】上気道細胞を含むシート状細胞構造体、ならびにその製造方法及び利用法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20240702BHJP

   C12N 1/04 20060101ALI20240702BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240702BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240702BHJP

   A01K 67/027 20240101ALI20240702BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240702BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240702BHJP

   C12N 5/079 20100101ALN20240702BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240702BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12N1/04

C12Q1/02

C12M1/34 A

A01K67/027

C12N5/10

C07K14/47

C12N5/079

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【請求項の数】40

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023218094

(22)【出願日】2023-12-25

(31)【優先権主張番号】P 2022210411

(32)【優先日】2022-12-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

２．ＴＷＥＥＮ

３．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】000002093

【氏名又は名称】住友化学株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504132272

【氏名又は名称】国立大学法人京都大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】中野 徳重

(72)【発明者】

【氏名】大森 孝一

(72)【発明者】

【氏名】大西 弘恵

(72)【発明者】

【氏名】北田 有史

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA07

4B029BB11

4B063QA05

4B063QQ08

4B063QR77

4B063QS40

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BD09

4B065BD12

4B065BD39

4B065CA46

4H045AA20

4H045AA30

4H045CA40

4H045EA50

(57)【要約】

【課題】多能性幹細胞から効率よく上気道細胞を含むシート状細胞構造物を構成する細胞を製造する方法を提供すること。
【解決手段】上気道細胞を含むシート状細胞構造体の製造方法であって、（１）嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第一細胞集団を分散し、単一細胞を得る工程（１）、（２）前記工程（１）で得られた前記単一細胞を精製し、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第二細胞集団を得る工程（２）であって、前記第二細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合が、前記第一細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合より高い、工程（２）、並びに、（３）前記工程（２）で得られた前記第二細胞集団を培養器材上に播種し、前記第二細胞集団を培養し、前記シート状細胞構造体を得る工程（３）、を含む、製造方法。が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

上気道細胞を含むシート状細胞構造体の製造方法であって、
（１）嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第一細胞集団を分散し、単一細胞を得る工程（１）、
（２）前記工程（１）で得られた前記単一細胞を精製し、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第二細胞集団を得る工程（２）であって、前記第二細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合が、前記第一細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合より高い、工程（２）、並びに、
（３）前記工程（２）で得られた前記第二細胞集団を培養器材上に播種し、前記第二細胞集団を培養し、前記シート状細胞構造体を得る工程（３）、
を含む、製造方法。

【請求項2】

前記工程（１）における前記第一細胞集団の少なくとも２０％が外胚葉由来の細胞であって、
前記外胚葉由来の細胞が、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｏｔｘ２、サイトケラチン、及びＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つの嗅プラコード細胞マーカー又は嗅上皮幹細胞マーカーを発現する細胞を含有する、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記工程（１）における前記第一細胞集団は、中枢神経系の細胞を更に含み、
前記中枢神経系の細胞が、
１）Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｄｌｘ５、ＦｏｘＧ１、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＡＰ２、ＲＡＸ、及びＶＳＸ２からなる群より選ばれる少なくとも一つの中枢神経系マーカーを発現し、かつ
２）サイトケラチンを発現しない細胞である、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【請求項4】

前記工程（１）における前記第一細胞集団が、１）前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む非神経上皮組織部、及び、２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、かつ、
前記神経組織部の表面における少なくとも一部が、前記非神経上皮組織部で被覆されている三次元の立体的な組織、又は細胞塊であり、
前記神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【請求項5】

前記工程（１）における前記第一細胞集団が、１）前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む非神経上皮組織部、及び、２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、かつ、
前記非神経上皮組織部と前記神経組織部が、前記培養器材の同一の表面上に接着していて、
前記神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【請求項6】

前記工程（１）における前記第一細胞集団が多能性幹細胞由来である、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【請求項7】

前記工程（１）における前記第一細胞集団は、
（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（ａ）、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（ａ）で培養した細胞を培養する工程（ｂ）、並びに、
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（ｂ）で培養した細胞を培養し、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む前記第一細胞集団を製造する工程（ｃ）、
を含む方法によって製造される、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【請求項8】

前記工程（ａ）の前に、前記多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、
１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、
２）未分化維持因子と、
を含む培地で培養する工程（ｉ）を実施することを更に含む、請求項７に記載の製造方法。

【請求項9】

前記工程（２）は、目的細胞の細胞表面マーカーに対する特異的親和性を有する試薬を用いて、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を回収することで、前記第一細胞集団を精製して前記第二細胞集団を得ることを含み、
前記目的細胞の細胞表面マーカーは、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌｄｎ４、Ｃｌｄｎ６、Ｃｌｄｎ７、ＬＡＭ１Ｂ、ＦＲＥＭ２、ＴＡＣＳＴＤ２、ＩＧＳＦ１、Ｆ１１Ｒ、ＦＲＡＳ１、ＳＯＲＬ１からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【請求項10】

前記工程（２）は、目的外細胞の細胞表面マーカーに対する特異的親和性を有する試薬を用いて、前記目的外細胞を除去することで、前記第一細胞集団を精製して前記第二細胞集団を得ることを更に含み、
前記目的外細胞の細胞表面マーカーは、ＡＴＰ１Ｂ２、ＣＤ８２、ＣＤＨ６、ＣＤＯＮ、ＣＥＬＳＲ２、ＣＬＵ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＰ、ＣＲＢ２、ＤＣＴ、ＤＫＫ３、ＥＦＮＢ１、ＦＢＬＮ２、ＦＢＮ２、ＦＮ１、ＧＰＭ６Ｂ、ＩＳＬＲ２、ＬＲＰ２、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＭＭＲＮ１、ＰＲＥＬＰ、ＰＲＳＳ３５、Ｓ１ＰＲ３、ＳＤＫ２、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＯＲＣＳ１、ＴＦＰＩ、ＴＨＳＤ７Ａ、ＴＨＹ１、ＴＭＥＭ１３２Ｂ、及びＴＳＰＡＮ１８からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、請求項９に記載の製造方法。

【請求項11】

前記工程（２）は、蛍光活性化セルソーティング法（ＦＡＣＳ）又は磁気ビーズによる細胞選別法（ＭＡＣＳ）によって、前記第一細胞集団を精製して前記第二細胞集団を得る、請求項９に記載の製造方法。

【請求項12】

前記工程（２）は、前記第二細胞集団を凍結保存することを更に含み、
前記工程（３）は、凍結保存した前記第二細胞集団を解凍することを更に含む、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【請求項13】

前記工程（３）は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記第二細胞集団を培養する、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【請求項14】

前記ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、ソニック・ヘッジホッグタンパク質、ＳＡＧ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、２０（Ｓ）－ｈｙｄｒｏｘｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ及びＧＳＡ－１０からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の製造方法。

【請求項15】

前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質が、Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤であって、
前記Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤は、Ｋ０２２８８、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ＬＤＮ－２１４１１７、ＭＬ３４７、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １、ＶＵ５３５０、ＯＤ５２、Ｅ６２０１、Ｓａｒａｃａｔｉｎｉｂ、ＢＹＬ７１９及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の製造方法。

【請求項16】

前記工程（３）は、ＲＯＣＫ阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記第二細胞集団を培養する、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【請求項17】

前記ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質がＡｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤であって、
前記Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ２１５７２９９、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、ＥＷ－７１９７、Ａ８３－０１、Ａ７７－０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＢＩＢＦ－０７７５、ＴＰ０４２７７３６、ＴＧＦＢＲ１－ＩＮ－１、ＳＭ－１６、ＴＥＷ－７１９７、ＬＹ３２００８８２、ＬＹ２１０９７６１、Ｒ２６８７１２、ＩＮ１１３０、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ、ＡＺ１２７９９７３４、ＫＲＣＡ ０００８、ＧＳＫ １８３８７０５、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、ＡＳＰ ３０２６、ＴＡＥ６８４、ＡＺＤ３４６３及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１６に記載の製造方法。

【請求項18】

前記工程（３）は、前記培養器材に設けられている物質透過性を有する膜上で前記第二細胞集団を培養する、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。

【請求項19】

前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、１）非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性、２）Ｗｎｔファミリータンパク質の細胞外分泌の阻害活性、３）Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅに対する阻害活性、４）ＲＯＲに対する阻害活性からなる群より選ばれる少なくとも１つの活性を有する、請求項７に記載の製造方法。

【請求項20】

前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、１）非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性を有し、前記阻害活性がＰｏｒｃｕｐｉｎｅによる標的タンパク質のアシル化又はパルミトイル化に対する阻害活性であり、
前記阻害活性を有する物質は、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＩＷＰ－１２、ＩＷＰ－Ｏ１、ＬＧＫ－９７４、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ＥＴＣ－１３１、ＥＴＣ－１５９、ＧＮＦ－１３３１、ＧＮＦ－６２３１、Ｐｏｒｃｎ－ＩＮ－１、ＲＸＣ００４、ＣＧＸ１３２１、ＡＺＤ５０５５及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の製造方法。

【請求項21】

前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、ＸＡＶ－９３９、ＫＹ０２１１１、ＫＹ０３－Ｉ及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の製造方法。

【請求項22】

前記工程（ａ）から前記工程（ｃ）のいずれか一つ以上の工程を、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質、ＲＯＣＫ阻害物質及びＪＮＫシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で実施する、請求項７に記載の製造方法。

【請求項23】

工程（ｃ）をＴＡＫ１阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で実施する、請求項７に記載の製造方法。

【請求項24】

請求項１又は請求項２に記載の製造方法により製造される、上気道細胞を含むシート状細胞構造体。

【請求項25】

上気道細胞を含むシート状細胞構造体であって、
前記上気道細胞は、
１）ｐ６３、サイトケラチン５、及びｐ７５からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の基底細胞マーカーを発現する基底細胞又はその前駆細胞、
２）Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ２、Ｄｌｘ５、サイトケラチン、及びＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の嗅上皮幹細胞マーカーを発現する嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞、並びに、
３）βＩＩＩチューブリン、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｂｆ３、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＬｈｘ２からなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の嗅神経細胞マーカーを発現する嗅神経細胞又はその前駆細胞、
を含む、シート状細胞構造体。

【請求項26】

上気道細胞を含むシート状細胞構造体であって、
前記上気道細胞は、
１）ＦｏｘＪ１、ＦｏｘＮ４、ｐ７３、ＭＹＢ、アセチル化チューブリン及びβ４－Ｔｕｂｕｌｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の線毛上皮細胞マーカーを発現する線毛細胞、並びに、
２）ムチン１、ムチン２、ムチン３、ムチン４、ムチン５ＡＣ、ムチン５Ｂ、ＦｏｘＡ１、ＦｏｘＡ２、Ｎｋｘ２．１／ＴＴＦ－１及びＳＰＤＥＦからなる群より選ばれる少なくとも１つの分泌細胞マーカーを発現する分泌細胞、
を含む、シート状細胞構造体。

【請求項27】

前記シート状細胞構造体は、
Ｅｚｒｉｎ、及びＰＫＣζからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現する、頂端面を含み、
前記上気道細胞は、前記頂端面と培養器材との間に、上皮構造を形成していて、
前記上気道細胞は、上皮細胞極性を有し、
前記シート状細胞構造体を構成する細胞の少なくとも７０％が、前記上皮構造中に局在していて、
前記上皮構造は、前記培養器材に接している基底細胞を含む、請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体。

【請求項28】

前記シート状細胞構造体は、ＡＣＥ２、Ｔｍｐｒｓｓ２、ＮＲＰ１、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＬ、ＢＳＧ、ＨＳＰＡ５、ＤＰＰ４、ＦＵＲＩＮ、ＡＮＰＥＰ、Ｔｍｐｒｓｓ１１Ｄ、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴ３ＧＡＬ４、ＣＥＡＣＡＭ１、シアル酸α２，６Ｇａｌ及びシアル酸α２，３Ｇａｌからなる群より選ばれる少なくとも１つのウイルス受容体又はウイルス感染関連因子を発現する上気道細胞を含有する、請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体。

【請求項29】

前記上気道細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子、及び、ウイルス受容体又はウイルス感染関連因子をコードする遺伝子からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子が欠損又は変異している、請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体。

【請求項30】

１）請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体、及び
２）前記上気道細胞以外の細胞、細胞集団のいずれか一つ以上、
を搭載するマイクロ流体チップ又は生体模倣システム。

【請求項31】

請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を用いた、疾患治療用化合物のスクリーニング方法。

【請求項32】

請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を含む、疾患治療用化合物のスクリーニングキット。

【請求項33】

上気道の疾患モデルとしての、請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材の利用方法。

【請求項34】

請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を用いた、対象物質の薬効又は毒性の評価方法。

【請求項35】

請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を含む、対象物質の薬効又は毒性の評価キット。

【請求項36】

請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を用いた、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法。

【請求項37】

請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を含有する、移植用組成物。

【請求項38】

請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材の、ウイルス又は微生物の分離培養における使用。

【請求項39】

請求項２５又は請求項２６に記載のシート状細胞構造体が移植された、担上気道組織モデル動物又は担ヒト組織モデル動物。

【請求項40】

試料に含まれる嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の精製方法であって、
前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の細胞表面マーカーに対する特異的親和性を有する試薬を用いて、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を前記試料から回収することを含み、
前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の細胞表面マーカーは、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌｄｎ４、Ｃｌｄｎ６、Ｃｌｄｎ７、ＬＡＭ１Ｂ、ＦＲＥＭ２、ＴＡＣＳＴＤ２、ＩＧＳＦ１、Ｆ１１Ｒ、ＦＲＡＳ１、ＳＯＲＬ１からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、精製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、上気道細胞を含むシート状細胞構造物、ならびにその製造方法及び利用法に関する。上気道組織には、嗅上皮組織及び鼻腔上皮組織を含む。

【背景技術】

【0002】

非特許文献１において、マウスｉＰＳ細胞から形成させた胚様体を、マウスから採取した嗅上皮又は嗅球の初代培養細胞と共培養することにより、一部の嗅神経細胞マーカーを発現する神経細胞が分化誘導されることが報告されている。非特許文献２において、ヒト多能性幹細胞から嗅覚プラコード細胞及び嗅神経細胞を製造したことが報告されている。非特許文献３において、ヒト鼻腔より採取した検体を培養して細胞塊を形成させ、その後鼻腔上皮のシートを得る方法が報告されている。非特許文献４において、ヒト鼻腔より採取した検体を浮遊培養して細胞塊を形成させる方法が報告されている。特許文献１において、マウスＥＳ細胞をフィーダー細胞上で培養し、分化誘導因子を添加することで、分化した細胞が嗅神経細胞のマーカーを発現することを報告している。特許文献２において、ヒト多能性幹細胞よりプレプラコードを含む細胞塊を製造したことを報告している。また、本願の発明者は、特許文献３および４において、ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞より立体的な鼻腔上皮組織及び嗅上皮組織を製造可能であることを報告している。しかし、ヒト多能性幹細胞を出発材料とし、移植用の再生医療製品及び化合物の評価、感染症あるいは遺伝病等の疾患モデルの作製、オーガンオンチップ等のデバイスへの搭載に適したシート状の上気道組織を工業的に製造する方法は全く知られていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】ＷＯ／２００９／０９８１４９

【特許文献2】ＵＳ／２０１５／０１２５９５３

【特許文献3】ＷＯ／２０２０／０３９７３２

【特許文献4】ＷＯ／２０２２／０２６２３８

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈｏｌ． ２０１７；１０（７）：８０７２－８０８１

【非特許文献2】ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ Ｖｏｌｕｍｅ ３１， Ｎｕｍｂｅｒｓ １７－１８， ２０２２

【非特許文献3】Ｍｂｉｏ， ２０２２， １３．１： ｅ０３５１１－２１．

【非特許文献4】Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２０２１， Ｖｏｌ． １１， Ｉｓｓｕｅ ２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、特許文献１と２、及び非特許文献の１から４には、多能性幹細胞から上気道細胞を含むシート状細胞構造物を効率よく製造することは記載されていない。本発明の目的は、多能性幹細胞から効率よく上気道細胞を含むシート状細胞構造物を構成する細胞を製造する方法、及び上記シート状細胞構造物を製造する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねたところ、多能性幹細胞が上気道組織へ分化する培養途上の細胞集団を解析することにより、上気道組織を構成する細胞の分離・精製に用いる特異的な表面抗原を複数同定した。さらに、同定した表面抗原を用いて、上気道組織への分化・培養途上の細胞集団から上気道組織を構成する細胞を効果的に分離・精製できるタイミングを見出した。さらに、シート状細胞構造体形成に適した培養器材、及び多能性幹細胞由来の上気道細胞の上皮形成に適した条件を同定することで、上気道組織のシート状細胞構造体を形成させる製造法を確立し、本発明を完成させた。

【0007】

本発明は、以下に例示する上気道細胞を含むシート状細胞構造物の製造方法、上気道細胞を含むシート状細胞構造物、該細胞構造物の再生医療用製品としての使用方法、該細胞構造物の疾患モデルとしての使用方法、該細胞構造物の遺伝子治療評価システムとしての使用方法、該細胞構造物を含む器材、チップ、システム、デバイス等に関する。
［１］ 上気道細胞を含むシート状細胞構造体の製造方法であって、
（１）嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第一細胞集団を分散し、単一細胞を得る工程（１）、
（２）前記工程（１）で得られた前記単一細胞を精製し、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第二細胞集団を得る工程（２）であって、前記第二細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合が、前記第一細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合より高い、工程（２）、並びに、
（３）前記工程（２）で得られた前記第二細胞集団を培養器材上に播種し、前記第二細胞集団を培養し、前記シート状細胞構造体を得る工程（３）、
を含む、製造方法。
［２］ 前記工程（１）における前記第一細胞集団の少なくとも２０％が外胚葉由来の細胞であって、
前記外胚葉由来の細胞が、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｏｔｘ２、サイトケラチン、及びＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つの嗅プラコード細胞マーカー又は嗅上皮幹細胞マーカーを発現する細胞を含有する、［１］に記載の製造方法。
［３］ 前記工程（１）における前記第一細胞集団は、中枢神経系の細胞を更に含み、
前記中枢神経系の細胞が、
１）Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｄｌｘ５、ＦｏｘＧ１、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＡＰ２、ＲＡＸ、及びＶＳＸ２からなる群より選ばれる少なくとも一つの中枢神経系マーカーを発現し、かつ
２）サイトケラチンを発現しない細胞である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］ 前記工程（１）における前記第一細胞集団が、１）前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む非神経上皮組織部、及び、２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、かつ、
前記神経組織部の表面における少なくとも一部が、前記非神経上皮組織部で被覆されている三次元の立体的な組織、又は細胞塊であり、
前記神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、［１］から［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］ 前記工程（１）における前記第一細胞集団が、１）前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む非神経上皮組織部、及び、２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、かつ、
前記非神経上皮組織部と前記神経組織部が、前記培養器材の同一の表面上に接着していて、
前記神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含む、［１］から［３］のいずれかに記載の製造方法。
［６］ 前記工程（１）における前記第一細胞集団が多能性幹細胞由来である、［１］から［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］ 前記工程（１）における前記第一細胞集団は、
（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（ａ）、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（ａ）で培養した細胞を培養する工程（ｂ）、並びに、
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（ｂ）で培養した細胞を培養し、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む前記第一細胞集団を製造する工程（ｃ）、
を含む方法によって製造される、［１］から［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］ 前記工程（ａ）の前に、前記多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、
１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つと、
２）未分化維持因子と、
を含む培地で培養する工程（ｉ）を実施することを更に含む、［７］に記載の製造方法。
［９］ 前記工程（２）は、目的細胞の細胞表面マーカーに対する特異的親和性を有する試薬を用いて、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を回収することで、前記第一細胞集団を精製して前記第二細胞集団を得ることを含み、
前記目的細胞の細胞表面マーカーは、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌｄｎ４、Ｃｌｄｎ６、Ｃｌｄｎ７、ＬＡＭ１Ｂ、ＦＲＥＭ２、ＴＡＣＳＴＤ２、ＩＧＳＦ１、Ｆ１１Ｒ、ＦＲＡＳ１、ＳＯＲＬ１からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、［１］から［８］のいずれか一項に記載の製造方法。
［１０］ 前記工程（２）は、目的外細胞の細胞表面マーカーに対する特異的親和性を有する試薬を用いて、前記目的外細胞を除去することで、前記第一細胞集団を精製して前記第二細胞集団を得ることを更に含み、
前記目的外細胞の細胞表面マーカーは、ＡＴＰ１Ｂ２、ＣＤ８２、ＣＤＨ６、ＣＤＯＮ、ＣＥＬＳＲ２、ＣＬＵ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＰ、ＣＲＢ２、ＤＣＴ、ＤＫＫ３、ＥＦＮＢ１、ＦＢＬＮ２、ＦＢＮ２、ＦＮ１、ＧＰＭ６Ｂ、ＩＳＬＲ２、ＬＲＰ２、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＭＭＲＮ１、ＰＲＥＬＰ、ＰＲＳＳ３５、Ｓ１ＰＲ３、ＳＤＫ２、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＯＲＣＳ１、ＴＦＰＩ、ＴＨＳＤ７Ａ、ＴＨＹ１、ＴＭＥＭ１３２Ｂ、及びＴＳＰＡＮ１８からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、［９］に記載の製造方法。
［１１］ 前記工程（２）は、蛍光活性化セルソーティング法（ＦＡＣＳ）又は磁気ビーズによる細胞選別法（ＭＡＣＳ）によって、前記第一細胞集団を精製して前記第二細胞集団を得る、［９］または［１０］に記載の製造方法。
［１２］ 前記工程（２）は、前記第二細胞集団を凍結保存することを更に含み、
前記工程（３）は、凍結保存した前記第二細胞集団を解凍することを更に含む、［１］から［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］ 前記工程（３）は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記第二細胞集団を培養する、［１］から［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］ 前記ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、ソニック・ヘッジホッグタンパク質、ＳＡＧ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、２０（Ｓ）－ｈｙｄｒｏｘｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ及びＧＳＡ－１０からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１３］に記載の製造方法。
［１５］ 前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質が、Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤であって、
前記Ｉ型ＢＭＰ受容体阻害剤は、Ｋ０２２８８、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ＬＤＮ－２１４１１７、ＭＬ３４７、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １、ＶＵ５３５０、ＯＤ５２、Ｅ６２０１、Ｓａｒａｃａｔｉｎｉｂ、ＢＹＬ７１９及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１３］又は［１４］に記載の製造方法。
［１６］ 前記工程（３）は、ＲＯＣＫ阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記第二細胞集団を培養する、［１］から［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］ 前記ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質がＡｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤であって、
前記Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ２１５７２９９、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、ＥＷ－７１９７、Ａ８３－０１、Ａ７７－０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＢＩＢＦ－０７７５、ＴＰ０４２７７３６、ＴＧＦＢＲ１－ＩＮ－１、ＳＭ－１６、ＴＥＷ－７１９７、ＬＹ３２００８８２、ＬＹ２１０９７６１、Ｒ２６８７１２、ＩＮ１１３０、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ、ＡＺ１２７９９７３４、ＫＲＣＡ ０００８、ＧＳＫ １８３８７０５、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、ＡＳＰ ３０２６、ＴＡＥ６８４、ＡＺＤ３４６３及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１６］に記載の製造方法。
［１８］ 前記工程（３）は、前記培養器材に設けられている物質透過性を有する膜上で前記第二細胞集団を培養する、［１］から［１７］のいずれかに記載の製造方法。
［１９］ 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、１）非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性、２）Ｗｎｔファミリータンパク質の細胞外分泌の阻害活性、３）Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅに対する阻害活性、４）ＲＯＲに対する阻害活性からなる群より選ばれる少なくとも１つの活性を有する、［７］又は［８］に記載の製造方法。
［２０］ 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、１）非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性を有し、前記阻害活性がＰｏｒｃｕｐｉｎｅによる標的タンパク質のアシル化又はパルミトイル化に対する阻害活性であり、
前記阻害活性を有する物質は、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＩＷＰ－１２、ＩＷＰ－Ｏ１、ＬＧＫ－９７４、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ＥＴＣ－１３１、ＥＴＣ－１５９、ＧＮＦ－１３３１、ＧＮＦ－６２３１、Ｐｏｒｃｎ－ＩＮ－１、ＲＸＣ００４、ＣＧＸ１３２１、ＡＺＤ５０５５及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１９］に記載の製造方法。
［２１］ 前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、ＸＡＶ－９３９、ＫＹ０２１１１、ＫＹ０３－Ｉ及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む、［１９］に記載の製造方法。
［２２］ 前記工程（ａ）から前記工程（ｃ）のいずれか一つ以上の工程を、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質、ＲＯＣＫ阻害物質及びＪＮＫシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で実施する、［７］又は［８］に記載の製造方法。
［２３］ 工程（ｃ）をＴＡＫ１阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で実施する、［７］又は［８］に記載の製造方法。
［２４］ ［１］から［２３］のいずれかに記載の製造方法により製造される、上気道細胞を含むシート状細胞構造体。
［２５］ 上気道細胞を含むシート状細胞構造体であって、
前記上気道細胞は、
１）ｐ６３、サイトケラチン５、及びｐ７５からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の基底細胞マーカーを発現する基底細胞又はその前駆細胞、
２）Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ２、Ｄｌｘ５、サイトケラチン、及びＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の嗅上皮幹細胞マーカーを発現する嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞、並びに、
３）βＩＩＩチューブリン、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｂｆ３、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＬｈｘ２からなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の嗅神経細胞マーカーを発現する嗅神経細胞又はその前駆細胞、
を含む、シート状細胞構造体。
［２６］ 上気道細胞を含むシート状細胞構造体であって、
前記上気道細胞は、
１）ＦｏｘＪ１、ＦｏｘＮ４、ｐ７３、ＭＹＢ、アセチル化チューブリン及びβ４－Ｔｕｂｕｌｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の線毛上皮細胞マーカーを発現する線毛細胞、並びに、
２）ムチン１、ムチン２、ムチン３、ムチン４、ムチン５ＡＣ、ムチン５Ｂ、ＦｏｘＡ１、ＦｏｘＡ２、Ｎｋｘ２．１／ＴＴＦ－１及びＳＰＤＥＦからなる群より選ばれる少なくとも１つの分泌細胞マーカーを発現する分泌細胞、
を含む、シート状細胞構造体。
［２７］ 前記シート状細胞構造体は、
Ｅｚｒｉｎ、及びＰＫＣζからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現する、頂端面を含み、
前記上気道細胞は、前記頂端面と培養器材との間に、上皮構造を形成していて、
前記上気道細胞は、上皮細胞極性を有し、
前記シート状細胞構造体を構成する細胞の少なくとも７０％が、前記上皮構造中に局在していて、
前記上皮構造は、前記培養器材に接している基底細胞を含む、［２５］又は［２６］に記載のシート状細胞構造体。
［２８］ 前記シート状細胞構造体は、ＡＣＥ２、Ｔｍｐｒｓｓ２、ＮＲＰ１、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＬ、ＢＳＧ、ＨＳＰＡ５、ＤＰＰ４、ＦＵＲＩＮ、ＡＮＰＥＰ、Ｔｍｐｒｓｓ１１Ｄ、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴ３ＧＡＬ４、ＣＥＡＣＡＭ１、シアル酸α２，６Ｇａｌ及びシアル酸α２，３Ｇａｌからなる群より選ばれる少なくとも１つのウイルス受容体又はウイルス感染関連因子を発現する上気道細胞を含有する、［２４］から［２７］のいずれかに記載のシート状細胞構造体。
［２９］ 前記上気道細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子、及び、ウイルス受容体又はウイルス感染関連因子をコードする遺伝子からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子が欠損又は変異している、［２４］から［２８］のいずれかに記載のシート状細胞構造体。
［３０］ １）［２４］から［２９］のいずれかに記載のシート状細胞構造体、及び
２）前記上気道細胞以外の細胞、細胞集団のいずれか一つ以上、
を搭載するマイクロ流体チップ又は生体模倣システム。
［３１］ ［２４］から［２９］のいずれかに記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を用いた、疾患治療用化合物のスクリーニング方法。
［３２］ ［２４］から［２９］のいずれかに記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を含む、疾患治療用化合物のスクリーニングキット。
［３３］ 上気道の疾患モデルとしての、［２４］から［２９］のいずれかに記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材の利用方法。
［３４］ ［２４］から［２９］のいずれかに記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を用いた、対象物質の薬効又は毒性の評価方法。
［３５］ ［２４］から［２９］のいずれかに記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を含む、対象物質の薬効又は毒性の評価キット。
［３６］ ［２４］から［２９］のいずれかに記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を用いた、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法。
［３７］ ［２４］から［２９］のいずれかに記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材を含有する、移植用組成物。
［３８］ ［２４］から［２９］のいずれかに記載のシート状細胞構造体を含有する機器、チップ、システム、又は器材の、ウイルス又は微生物の分離培養における使用。
［３９］ ［２４］から［２９］のいずれかに記載のシート状細胞構造体が移植された、担上気道組織モデル動物又は担ヒト組織モデル動物。
［４０］ 試料に含まれる嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の精製方法であって、
前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の細胞表面マーカーに対する特異的親和性を有する試薬を用いて、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を前記試料から回収することを含み、
前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の細胞表面マーカーは、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌｄｎ４、Ｃｌｄｎ６、Ｃｌｄｎ７、ＬＡＭ１Ｂ、ＦＲＥＭ２、ＴＡＣＳＴＤ２、ＩＧＳＦ１、Ｆ１１Ｒ、ＦＲＡＳ１、ＳＯＲＬ１からなる群より選ばれる少なくとも一つを含む、精製方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、多能性幹細胞から効率よく上気道細胞を含むシート状細胞構造物を製造することが可能になる。また、本発明によれば、上気道細胞を含むシート状細胞構造物を用いた再生医療用の移植用組成物、疾患モデル、疾患の治療薬のスクリーニング方法、スクリーニングキット、化合物の薬効又は毒性の評価方法及び評価キット等を提供することができる。また、別の態様として、本発明によって製造した上気道細胞を含むシート状細胞構造物を、インフルエンザウイルス、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）及び季節性コロナウイルスを含む感染症の研究、ウイルスの分離培養その他に供することもできる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、本実施形態に係る上気道細胞を含むシート状細胞構造物を示す模式図である。

【図2】図２は、本実施形態に係る上気道細胞を含むシート状細胞構造物を示す模式図である。

【図3A】図３Ａは、本実施形態に係る上気道細胞を含むシート状細胞構造物を示す模式図（上面図、断面図）である。

【図3B】図３Ｂは、本実施形態に係る上気道細胞を含むシート状細胞構造物を示す模式図（上面図、断面図）である。

【図4】図４は、実験１において、ヒトｉＰＳ細胞から嗅上皮幹細胞を含む細胞集団を作製する際の工程を模式的に示した図（上段）、及び培養開始２３日目の嗅上皮幹細胞を含む細胞集団の倒立顕微鏡の明視野及び蛍光観察像（下段）である。

【図5】図５は、実験１の嗅上皮幹細胞を含む細胞集団を各マーカーで免疫染色した後の染色図である。

【図6】図６は、ヒトｉＰＳ細胞から嗅上皮幹細胞を含む細胞集団を作製する際の工程を模式的に示した図である（上段）。下段は、実験２において、培養開始２０日後の細胞集団の倒立顕微鏡の明視野観察像である。

【図7】図７は、実験２の嗅上皮オルガノイドにおけるシングルセル解析結果の二次元プロット図である。

【図8】図８は、実験２の嗅上皮オルガノイドにおけるシングルセル解析結果の二次元プロット図である。ＤＬＸ５、Ｐａｘ６、Ｓｐ８、ＥｐＣＡＭの各遺伝子の１細胞ごとの発現量解析の結果を示している。

【図9】図９は、実験２の嗅上皮オルガノイドにおけるシングルセル解析結果の二次元プロット図である。ＳＩＸ１、ＯＴＸ２、ＳＯＸ２、Ｋｉ６７の各遺伝子の１細胞ごとの発現量解析の結果を示している。

【図10】図１０は、実験２の嗅上皮オルガノイドにおけるシングルセル解析結果の二次元プロット図である。Ｅｂｆ２、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｌｈｘ２、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎの各遺伝子の１細胞ごとの発現量解析の結果を示している。

【図11】図１１は、実験２の嗅上皮オルガノイドにおけるシングルセル解析結果の二次元プロット図である。ＳＯＸ１、Ｖｓｘ２の各遺伝子の１細胞ごとの発現量解析の結果を示している。

【図12】図１２は、嗅上皮幹細胞を含む細胞集団における細胞表面マーカー遺伝子の発現倍率を示す表である。

【図13】図１３は、実験３の嗅上皮オルガノイドにおけるシングルセル解析結果の二次元プロット図である。ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＣＬＤＮ４の各遺伝子の１細胞ごとの発現量解析の結果を示している。

【図14】図１４は、実験３の嗅上皮オルガノイドにおけるシングルセル解析結果の二次元プロット図である。ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ７、ＬＡＭＢ１、ＦＲＥＭ２の各遺伝子の１細胞ごとの発現量解析の結果を示している。

【図15】図１５は、実験３の嗅上皮オルガノイドにおけるシングルセル解析結果の二次元プロット図である。ＴＡＣＳＴＤ２、ＩＧＳＦ１、Ｆ１１Ｒ、ＦＲＡＳ１の各遺伝子の１細胞ごとの発現量解析の結果を示している。

【図16】図１６は、実験３の嗅上皮オルガノイドにおけるシングルセル解析結果の二次元プロット図である。ＳＯＲＬ１遺伝子の１細胞ごとの発現量解析の結果を示している。

【図17】図１７は、実験４において第一細胞集団の嗅上皮オルガノイドから嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を精製する際の工程を模式的に示した図（上段）、及び精製後の細胞集団をＦＡＣＳにより解析した結果（下段）である。

【図18】図１８は、実験５においてマイクロウェルプレートを用いて製造した第一細胞集団の嗅上皮オルガノイドから嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を精製する際の工程を模式的に示した図（上段）、及び精製後の細胞集団をＦＡＣＳにより解析した結果（下段）である。

【図19】図１９は、実験６において、工程１、２、３を経て上気道細胞を含むシート状細胞構造体を製造する過程を模式的に表した図（上段）、及び工程３において各条件の培地で第二細胞集団を培養した際の倒立顕微鏡による明視野観察像（下段）である。

【図20】図２０は、実験６において、嗅上皮幹細胞、基底細胞、嗅神経前駆細胞、未成熟嗅神経細胞を各マーカーで免疫染色した後の染色図である。

【図21】図２１は、実験６において、嗅上皮幹細胞、基底細胞、嗅神経前駆細胞、未成熟嗅神経細胞を各マーカーで免疫染色した後の染色図である。

【図22】図２２は、実験７において、嗅上皮幹細胞、基底細胞、嗅神経前駆細胞、未成熟嗅神経細胞を各マーカーで免疫染色した後の染色図である。

【図23】図２３は、実験８において、工程１、２、３を経て上気道細胞を含むシート状細胞構造体を製造する過程を模式的に表した図（上段）、及び工程３において第二細胞集団を培養した際の倒立顕微鏡による明視野観察像（下段）である。

【図24】図２４は、実験８において、嗅上皮幹細胞、基底細胞、分泌細胞、線毛細胞を各マーカーで免疫染色した後の染色図である。

【図25】図２５は、実験９における、上気道細胞を含むシート状細胞構造体の走査型電子顕微鏡による観察像である。

【図26】図２６は、実験１０において、多能性幹細胞から嗅上皮様組織を含む非神経上皮組織を含む細胞塊を作製する際の工程を模式的に示した図（上段）、及び培養開始２３日目の嗅上皮幹細胞を含む細胞集団の倒立顕微鏡の明視野及び蛍光観察像（下段）である。

【図27】図２７は、実験１０の嗅上皮幹細胞を含む細胞集団を各マーカーで免疫染色した後の染色図である。

【図28】図２８は、実験１１において、ヒトｉＰＳ細胞から上気道細胞シートを作成し、コラーゲンスポンジとの細胞シート・足場複合体を製造し、動物移植試験を実施する際の工程を模式的に示した図である（上段）。下段は、実験１１において、移植試験実施後１週間目のラット鼻腔組織を固定して調製した試料の偏斜照明明視野観察像および蛍光管撮像である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明を実施するための形態（以下「本実施形態」と記す。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。本明細書において「Ａ～Ｚ」という形式の表記は、範囲の上限下限（すなわちＡ以上Ｚ以下）を意味し、Ａにおいて単位の記載がなく、Ｚにおいてのみ単位が記載されている場合、Ａの単位とＺの単位とは同じである。本明細書において「～を含む」との表現は、「～からなる」、「～のみからなる」の概念を含む表現である。

【0011】

１．定義
本明細書において、用語の定義は下記のとおりである。
「幹細胞」とは、分化能及び増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等が含まれる。「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する全ての細胞に分化し得る能力（分化多能性：ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞をいう。全ての細胞とは、外胚葉、中胚葉及び内胚葉の三胚葉由来の細胞である。「複能性幹細胞」とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。「単能性幹細胞」とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。

【0012】

多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等を挙げることができる。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ）、及び生殖細胞（例えば精巣）から作製されるＧＳ細胞も多能性幹細胞に包含される。なお、ヒト胚性幹細胞は、受精１４日以内のヒト胚から樹立されたものである。

【0013】

胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ＥＳ細胞は、内部細胞集団をフィーダー細胞上又はｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を含む培地中で培養することにより製造することができる。ＥＳ細胞の製造方法は、例えば国際公開第９６／２２３６２号、国際公開第０２／１０１０５７号、米国特許第５８４３７８０号明細書、米国特許第６２００８０６号明細書、米国特許第６２８０７１８号明細書等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、市販品を購入することもできる。例えばヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、ＥＢ５細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、Ｄ３株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より、入手可能である。ＥＳ細胞の１つである核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）は、細胞核を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。

【0014】

ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をマウス幹細胞因子（ｍＳＣＦ）、ＬＩＦ及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む培地中で培養することにより製造することができる（Ｃｅｌｌ，７０：８４１－８４７，１９９２）。

【0015】

「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を公知の方法等により初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することにより、多能性を誘導した細胞である。人工多能性幹細胞としては、具体的には線維芽細胞、末梢血単核球等に分化した体細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。２００６年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４）ｐｐ．６６３－６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５）ｐｐ．８６１－８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８）ｐｐ．１９１７－１９２０；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１）ｐｐ．１０１－１０６）。人工多能性幹細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１－６５４）。

【0016】

人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば末梢血単核球、Ｔ細胞等）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。

【0017】

人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子（例えばＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＭｙｃの４因子）の発現により初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。遺伝子を発現させるための手段としては、例えばウイルスベクター（例えばレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えばプラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、ＲＮＡベクターを用いた遺伝子導入法（例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法等が挙げられる。

【0018】

また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７－Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞、１３８３Ｄ２細胞、１３８３Ｄ６細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、ｈｉＰＳ β－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ細胞株が、メルク社より購入可能である。

【0019】

多能性幹細胞は、遺伝子改変されていてもよい。遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などが挙げられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲッティング、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製、羊土社（１９９５）等に記載の方法を用いて行うことができる。

【0020】

具体的には、例えば改変する標的遺伝子（例えば細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子等）のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。

【0021】

標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）等に記載された公知の方法が挙げられる。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ｋｉｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）などを用いることができる。

【0022】

標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）、バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲッティング、ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製、羊土社（１９９５）等に記載の方法に従って行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択又はポリＡ選択などの方法を用いることができる。選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等が挙げられる。

【0023】

多能性幹細胞として、ゲノム編集を行った多能性幹細胞を用いることもできる。「ゲノム編集」とは、ヌクレアーゼを用いた部位特異的なゲノムＤＮＡ鎖の切断、又は塩基の化学的変換等の原理により標的遺伝子もしくはゲノム領域を意図的に改変する技術である。部位特異的ヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ３、９、１３等が挙げられる。ゲノム編集技術を用いることにより、特定の遺伝子を欠失したノックアウト細胞株、特定の遺伝子座に人工的に別の配列を挿入したノックイン細胞株等を作製することができる。

【0024】

多能性幹細胞として、疾患特異的多能性幹細胞を用いてもよい。「疾患特異的多能性幹細胞」とは、疾患の発症に関与する遺伝子の変異又は遺伝的背景を有する多能性幹細胞を表す。疾患特異的多能性幹細胞は、対象となる疾患を発症している患者や近親者から前述の方法等により人工多能性幹細胞を樹立する方法、又は既に樹立済の多能性幹細胞のゲノムをジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲといったゲノム編集技術等により改変する方法等により作製することができる。

【0025】

多能性幹細胞として、他家移植の際に生じる免疫拒絶反応を抑制する機能を有する、低免疫原性の多能性幹細胞を用いてもよい。「低免疫原性の多能性幹細胞」は、ヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ：ＨＬＡ）のホモドナーから樹立した多能性幹細胞であってもよいし、免疫に関わる遺伝子を一つ以上、例えばＨＬＡ遺伝子群、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＲＦＸＡＰ遺伝子、ＲＦＸＡＮＫ遺伝子等をゲノム編集技術等により欠失、機能改変させた多能性幹細胞、あるいはＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１遺伝子、ＨＬＡ－Ｇ遺伝子等を発現するような多能性幹細胞であってもよい。ユニバーサルドナー細胞も低免疫原性の多能性幹細胞に含有される。上記のような多能性幹細胞は、例えば国際公開第１９９５／０１７９１１号公報、国際公開第９８／４２８３８号公報、国際公開第２０１６／１８３０４１号公報、国際公開第２０１２／１４５３８４号公報、国際公開第２０１３／１５８２９２号公報等に記載の方法によって製造可能である。

【0026】

「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、ウサギ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。ウサギ目には、ウサギ等が含包される。「霊長類」とは、霊長目に属する哺乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザル、ロリス、ツバイ等の原猿亜目、及びサル、類人猿、ヒト等の真猿亜目が含まれる。

【0027】

本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例えばマウス、ラット）又は霊長類（例えばヒト、サル）の多能性幹細胞であり、最も好ましくはヒトの多能性幹細胞である。

【0028】

「細胞接着（Ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）」には、細胞と細胞との接着（細胞－細胞接着）及び細胞と細胞外マトリクス（基質）との接着（細胞－基質接着）が含まれる。インビトロの人工培養環境下で生じる、細胞の培養器材等への接着も細胞接着に含有される。細胞－細胞接着において形成される結合は細胞－細胞結合（ｃｅｌｌ－ｃｅｌｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）であり、細胞－基質接着において形成される結合は細胞－基質結合（ｃｅｌｌ－ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）である。細胞接着の種類として、例えば固定結合（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、連絡結合（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｎｇ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、閉鎖結合（ｏｃｃｌｕｄｉｎｇ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が挙げられる。

【0029】

細胞－細胞結合として、「密着結合（ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」、「接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）」が挙げられる。密着結合は比較的強い細胞－細胞結合であり、上皮細胞で生じ得る。細胞間に密着結合が存在しているかどうかは、例えば密着結合の構成成分に対する抗体（抗クローディン抗体、抗ＺＯ－１抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。

【0030】

「浮遊培養」とは、細胞が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養することをいう。すなわち浮遊培養は、細胞を培養器材及び培養器材上のフィーダー細胞等（以下、「培養器材等」と記す。）に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養（接着培養）とは区別される。より詳細には、浮遊培養とは、細胞と培養器材等との間に、強固な細胞－基質結合を作らせない条件での培養をいう。培養している細胞が浮遊培養状態であるか接着培養であるかの判別は、例えば顕微鏡観察時の培養器材の揺動等によって当業者であれば容易に可能である。

【0031】

「接着培養」とは、細胞が培養器材等に接着して存在する状態を維持しつつ培養することをいう。ここで、細胞が培養器材等に接着するとは、例えば細胞と培養器材等との間に細胞接着の一種である強固な細胞－基質結合ができることをいう。

【0032】

浮遊培養中の細胞凝集体においては、細胞と細胞とが面接着する。浮遊培養中の細胞凝集体では、細胞と培養器材等との間に、強固な細胞－基質結合は形成されておらず、細胞－基質結合はほとんど形成されないか、形成されていてもその寄与が小さい。浮遊培養中の細胞凝集体の内部には、内在の細胞－基質結合が存在してもよい。「細胞と細胞とが面接着（ｐｌａｎｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）する」とは、細胞と細胞とが面で接着することをいう。より詳細には、「細胞と細胞とが面接着する」とは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば１％以上、好ましくは３％以上、より好ましくは５％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばＤｉＩ）による染色、細胞接着因子（例えばＥ－ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ等）の免疫染色等により観察できる。

【0033】

接着培養を行う際に用いられる培養器材は、接着培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器材としては、例えばフラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック及びオーガンオンチップ等の生体機能チップ、培養器材等が挙げられる。細胞接着性の培養器材としては、細胞との接着性を向上させる、あるいは細胞の性状を本発明にとって好ましい状態へ誘導または維持する目的で、培養器材の表面が人工的に処理されているもの等を使用できる。人工的な処理とは、例えば細胞外マトリクス、高分子等によるコーティング処理、及びガスプラズマ処理、正電荷処理等の表面加工が挙げられる。細胞が接着される細胞外マトリクスとしては、例えば基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等が挙げられる。高分子としては、ポリリジン、ポリオルニチン等が挙げられる。培養器材の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。

【0034】

「ラミニン」とは、α、β、γ鎖からなるヘテロ三量体分子であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリクスタンパク質である。具体的には、ラミニンは、５種のα鎖、４種のβ鎖及び３種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約１５種類のアイソフォームを有する。α鎖（α１～α５）、β鎖（β１～β４）及びγ鎖（γ１～γ４）のそれぞれの数字を組み合わせて、ラミニンの名称が定められている。例えばα５鎖、β１鎖、γ１鎖の組合せによるラミニンをラミニン５１１という。

【0035】

浮遊培養を行う際に用いられる培養器材は、浮遊培養することが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器材としては、例えばフラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ及びローラーボトルが挙げられる。これらの培養器材は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器材としては、培養器材の表面に、細胞との接着性を向上させる目的で行われる上述の人工的な処理がされていないもの等を使用できる。細胞非接着性の培養器材として、細胞との接着性を低下させる目的で培養器材の表面が人工的に処理されたものを使用することもできる。培養器材の培養面は、平底、Ｕ底又はＶ底でもよいし、凹凸があってもよい。細胞との接着性を低下させる処理としては、例えば２‐ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＭＰＣ）ポリマー、Ｐｏｌｙ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（Ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）等のコーティングによる超親水性処理、タンパク低吸着処理等が挙げられる。

【0036】

「振盪培養」とは、培養器材を揺動させることにより培養液を攪拌し、培養液中への酸素供給、細胞の周囲との物質交換等を促進する培養法である。攪拌培養、流路培養等を行うこともできる。

【0037】

浮遊培養を行う際に生じる剪断力等の物理的ストレスから細胞凝集体を保護し、また細胞が分泌する増殖因子及びサイトカイン類の局所濃度を高め、組織の発達を促進する目的から、細胞凝集体をゲルに包埋、又は物質透過性のあるカプセルに封入したのちに浮遊培養を実施することもできる（Ｎａｔｕｒｅ，２０１３，５０１．７４６７：３７３）。上記封入した細胞凝集体を振盪培養してもよい。包埋に用いるゲル又はカプセルは、生体由来又は合成高分子製のいずれであってもよい。このような目的に用いるゲル又はカプセルとしては、例えばマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、Ｃｕｌｔｒｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｒｉｘ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（３Ｄ Ｍａｔｒｉｘ社製）、ＶｉｔｒｏＧｅｌ ３Ｄ（ＴｈｅＷｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、コラーゲンゲル（新田ゼラチン社製）、アルギン酸ゲル（ＰＧリサーチ社製）、Ｃｅｌｌ－ｉｎ－ａ－Ｂｏｘ（Ａｕｓｔｒｉａｎｏｖａ社製）、Ｍａｔｒｉｍｉｘ（ニッピ社製）等が挙げられる。

【0038】

「培養器材」とは、細胞培養を実施する際に細胞又は組織の足場となる材料を表す。培養器材には通常細胞を接着させて用いる。培養器材の材料としては例えばアルミナ、セラミックス、ガラス、シリカ、ジルコニア、チタン、リン酸カルシウム等の無機材料、ゼラチン、コラーゲン等のタンパク質、アルギン酸、セルロース等の多糖類、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリカプロラクトン、シリコーンゴム等の合成高分子材料等が用いられる。培養器材の形状としては、例えば膜状、ビーズ状、繊維状、中空糸状、メッシュ状、スポンジ状等の物が用いられる。培養器材として市販の物を用いることもできる。このような目的に用いる培養器材としては、例えばトランズウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、ａｄ－ＭＥＤ Ｖｉｔｒｉｇｅｌ ２（関東化学製）、３Ｄ Ｉｎｓｅｒｔ（Ｂｉｏｔｅｋ社製）、ツェレッツ（ハイレックスコーポレーション社製）、ＮａｎｏＥＣＭ（ナノファイバー ソルーションズ社製）、ＳｐｏｎｇｅＣｏｌ コラーゲンスポンジ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ社製）、ＣＥＲＡＨＩＶＥ（クアーズテック社製）、Ｃｅｌｌｂｅｄ（日本バイリーン社製）等が挙げられる。

【0039】

細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＢａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、Ｅａｇｌｅ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ）、Ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｆ－１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＩＭＤＭ／Ｆ１２、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地等が挙げられる。

【0040】

多能性幹細胞の培養には、上記基礎培地をベースとした多能性幹細胞培養用の培地、好ましく公知の胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞用の培地、フィーダーフリー下で多能性幹細胞を培養するための培地（フィーダーフリー培地）等を用いることができる。フィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地が挙げられる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、添加剤として、Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（６４ｍｇ／ｌ）、ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ（１４μｇ／１）、ｉｎｓｕｌｉｎ（１９．４ｍｇ／ｌ）、ＮａＨＣＯ_３（５４３ｍｇ／ｌ）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（１０．７ｍｇ／ｌ）、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質（ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍＬ）又はＮｏｄａｌ（１００ｎｇ／ｍＬ））を含む（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８，４２４－４２９（２０１１））。市販のフィーダーフリー培地としては、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ｈＥＳＦ９、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素社製）、ＲｅｐｒｏＭｅｄ ｉＰＳＣ Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ＸＦ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ Ｖ９（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＤＥＦ－ＣＳ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社製）、Ｓｔｅｍ－Ｐａｒｔｎｅｒ ＳＦ（極東製薬社製）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（メルク社製）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ ｈＰＳＣ ＭｅｄｉｕｍΔ（富士フイルム和光純薬社製）等が挙げられる。

【0041】

無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えばアルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール又はこれらの均等物等を適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。市販の血清代替物としては、例えばＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（以下、「ＫＳＲ」と記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等が挙げられる。

【0042】

浮遊培養及び接着培養で用いる無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。

【0043】

調製の煩雑さを回避するために、無血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を適量（例えば約０．５％から約３０％、好ましくは約１％から約２０％）添加した無血清培地（例えばＦ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１×ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ、５％ＫＳＲ及び４５０μＭ １－モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。あるいは、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地ないしＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地にＮ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＨＥＰＥＳを添加した無血清培地を用いてもよい。また、ＫＳＲ同等品として特表２００１－５０８３０２に開示された培地が挙げられる。

【0044】

「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、１－モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。血清は通常、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、ウサギの胎児、新生仔、成体等より採取される。血清培地として最も汎用されるのはウシ胎児に由来する血清を用いた培地であるが、これに限定されない。

【0045】

本発明における培養は、好ましくはゼノフリー条件で行われる。「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。本発明における培養は、さらに好ましくはアニマルフリー条件で行われる。「アニマルフリー」とは、動物由来の成分が排除された条件を意味する。

【0046】

本発明に用いる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ；ＣＤＭ）である。

【0047】

「基底膜（Ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ）構造」とは、細胞外マトリクスより構成される薄い膜状の構造を意味する。生体においては、基底膜は上皮細胞の基底側（ｂａｓａｌ）に形成される。基底膜の成分としては、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（パールカン）、エンタクチン／ニドゲン、サイトカイン、成長因子等が挙げられる。生体由来の組織中並びに本発明の製造方法等で作製された細胞集団中に基底膜が存在しているかどうかは、例えばＰＡＭ染色等の組織染色、並びに基底膜の構成成分に対する抗体（抗ラミニン抗体、抗ＩＶ型コラーゲン抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。

【0048】

「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播種して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現等を制御する機能を有する基底膜構成成分を含むものをいう。本発明において、細胞の接着培養を行う際には、基底膜標品存在下で培養することができる。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層等との間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリクス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて支持体から除去することで作製することができる。基底膜標品としては、基底膜調製物として市販されている商品、例えばマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｃｕｌｔｒｅｘ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）基底膜成分として公知の細胞外マトリクス分子（例えばラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等）を含むものが挙げられる。

【0049】

細胞又は組織の培養には、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫等の組織又は細胞から抽出、可溶化されたマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）等の基底膜標品を用いることができる。同様に細胞培養に用いる基底膜成分として、ヒト可溶化羊膜（生物資源応用研究所社製）、ＨＥＫ２９３細胞に産生させたヒト組み換えラミニン（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社製）、ヒト組み換えラミニン断片（ニッピ社製）、ヒト組み換えビトロネクチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等も用いることができる。異なる生物種由来の成分混入を回避する観点、及び感染症のリスクを回避する観点から、基底膜標品は、好ましくは成分の明らかな組み換えタンパク質を用いる。

【0050】

本明細書において、「物質Ｘを含む培地」及び「物質Ｘの存在下」とは、それぞれ外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地もしくは外来性の物質Ｘを含む培地、及び外来性の物質Ｘの存在下を意味する。外来性の物質Ｘは、例えば培地中に存在する細胞又は組織が当該物質Ｘを内在的（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）に発現、分泌又は産生する内在的な物質Ｘと区別される。培地中の物質Ｘは、物質Ｘの分解又は培地の蒸発による微量な濃度の変化が起こっていてもよい。

【0051】

本明細書において、物質Ｘの濃度がＹである培地中での培養開始時とは、好ましくは培地中の物質Ｘの濃度がＹで均一となった時点を指すが、培養容器が十分に小さい（例えば９６ウェルプレートや、培養液が２００μＬ以下での培養）場合、濃度がＹとなるように後述する培地添加操作、半量培地交換操作又は全量培地交換操作を行った時点を濃度Ｙでの培養開始時と解釈する。また、培地中の物質Ｘの濃度がＹであるとは、一定の培養期間を通じたＸの平均の濃度がＹである場合、物質ＸをＹの濃度で含む期間が培養期間の５０％以上である場合、物質ＸをＹの濃度で含む期間が各工程において想定される培養期間のうち最も短い期間以上である場合等を含む。

【0052】

本明細書において、「物質Ｘの非存在下」とは、外来性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘが添加されていない培地もしくは外来性の物質Ｘを含まない培地、又は外来性の物質Ｘの存在しない状態を意味する。

【0053】

本明細書において、「ヒトタンパク質Ｘ」とは、タンパク質Ｘが、ヒト生体内で天然に発現するタンパク質Ｘのアミノ酸配列を有することを意味する。ヒトタンパク質Ｘは、好ましくは、ヒト生体内で天然に発現するタンパク質Ｘと同等のリン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、Ｓ－ニトロシル化、メチル化、Ｎ－アセチル化、脂質化等の翻訳後修飾を受けている。

【0054】

「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、「単離されたタンパク質Ｘ」には、培養対象の細胞や組織から産生され細胞や組織及び培地中に含まれている内在性のタンパク質Ｘは包含されない。「単離されたタンパク質Ｘ」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Ｘの重量の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。

【0055】

本明細書において、「誘導体」とは、特定の化合物に対して、当該化合物の分子内の一部が、他の官能基または他の原子と置換されることにより生じる化合物群を意図する。本明細書において、タンパク質の「改変体」とは、もとのタンパク質の特性を維持できる範囲でアミノ酸残基の欠失、付加、置換等の変異がされているタンパク質をいう。変異のアミノ酸の数としては、特に制限されないが、１～４、１～３、１～２、又は１個が挙げられる。タンパク質の「改変体」は、もとのタンパク質と少なくとも９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。改変体において変異したアミノ酸は、非天然型であってもよい。「タンパク質の融合体」又は「融合タンパク質」とは、あるタンパク質に同一又は他のタンパク質の全部、あるいは一部の機能に必要なアミノ酸配列を付加したタンパク質をいう。融合タンパク質は遺伝子工学等の手法により人工的に創製されたもの、染色体の転座などにより自然に生成したもののいずれであってもよい。融合タンパク質として例えば、精製及び検出を効率よく実施する為にグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼを付加したＧＳＴタグ融合タンパク質、タンパク質の局在等を明らかにするために蛍光タンパク質を付加したＧＦＰ等蛍光タンパク質融合タンパク質、タンパク質の安定性の向上等を目指してＩｇＧのＦｃドメインを付加したＦｃ融合タンパク質等が挙げられる。

【0056】

本明細書において、「Ａ時間（Ａ日）以降」とはＡ時間（Ａ日）を含み、Ａ時間（Ａ日）から後のことをいう。「Ｂ時間（Ｂ日）以内」とは、Ｂ時間（Ｂ日）を含み、Ｂ時間（Ｂ日）から前のことをいう。

【0057】

「フィーダー細胞」とは、細胞を培養するときに共存させる当該細胞以外の細胞を指す。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞としては、例えばマウス線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト線維芽細胞、ＳＮＬ細胞等が挙げられる。フィーダー細胞は、増殖抑制処理されていることが好ましい。増殖抑制処理としては、増殖抑制剤（例えばマイトマイシンＣ）処理、γ線照射等が挙げられる。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞は、液性因子（好ましくは未分化維持因子）の分泌、細胞接着用の足場（細胞外基質）の作製により、多能性幹細胞の未分化維持に貢献する。

【0058】

本明細書において、フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞非存在下にて培養することである。フィーダー細胞非存在下とは、例えばフィーダー細胞を添加していない条件、又はフィーダー細胞を実質的に含まない（例えば全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が３％以下）の条件が挙げられる。

【0059】

「細胞凝集体」又は「細胞塊」（ｃｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）とは、細胞が集合して形成された塊であって、細胞同士が接着している塊をいう。胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）、スフェア（Ｓｐｈｅｒｅ）、スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、オルガノイド（Ｏｒｇａｎｏｉｄ）も細胞凝集体に包含される。細胞凝集体は、好ましくは細胞同士が面接着している。一部の態様において、細胞凝集体の一部分あるいは全部において、細胞同士が細胞接着し、例えば接着結合（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を形成している。一部の態様において、細胞凝集体は細胞外基質を含んでいてもよい。一部の態様において、二つ以上の細胞凝集体同士をさらに人工的に接着又は凝集させることもできる。細胞集団同士をさらに接着又は凝集させた塊、及びアセンブロイド（ａｓｓｅｍｂｌｏｉｄ）も細胞凝集体に含まれる。細胞凝集体の形態は球状に限らず、例えば双球状、数珠状、球の集合体状、紐状・分枝状（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ， １１：２１４２１ （２０２１）、特願２０２１－０７８１５４に記載の形状）、シート状等の形態であってもよい。

【0060】

「均一な細胞凝集体」とは、複数の細胞凝集体を培養する際に各細胞凝集体の大きさが一定であることを意味する。細胞凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な細胞凝集体とは、最大径の長さの分散が小さいことを意味する。より具体的には、複数の細胞凝集体のうち７５％以上の細胞凝集体において、その最大径が複数の細胞凝集体の最大径平均値の±１００％以内、好ましくは最大径平均値の±５０％以内、より好ましくは最大径平均値の±２０％以内であることを意味する。

【0061】

「細胞集団」とは、２以上の細胞から構成される細胞群をいう。細胞集団は、一種の細胞から構成されていてもよいし、複数種の細胞から構成されていてもよい。細胞集団を構成する細胞は、培地中に浮遊していてもよいし、培養器材等に接着していてもよい。また、細胞集団を構成する細胞は、単一細胞であってもよいし、細胞集団の少なくとも一部において、細胞同士が細胞接着し、細胞集団を形成していてもよい。ここで「単一細胞」とは、例えば細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなった細胞をいう。一部の態様において、単一細胞に分散されるとは、細胞―細胞間結合（例えば接着結合）がほとんどなくなった状態が挙げられる。細胞集団は、細胞凝集体、細胞塊、後述する組織を含んでよい。

【0062】

「組織」とは、形態又は性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。本実施形態の一側面において、上記組織は、細胞凝集体、細胞塊の一種と把握することもできる。

【0063】

「外胚葉」とは生物の初期発生の過程において卵の受精後に形成される３つの胚葉のうち、最も外側に存在する胚葉を表す。外胚葉は発生の進行に従い神経外胚葉と表層外胚葉に分かれ、さらに神経外胚葉は神経管と神経堤に分かれる。これら外胚葉から身体の各種器官が形成され、外胚葉から形成された器官は外胚葉に由来すると称される。例えば神経管からは脳及び脊髄等の中枢神経系の器官又は組織が形成される。例えば神経堤からは一部の中枢神経系細胞、顔面の骨及び軟骨、感覚神経細胞、自律神経細胞、色素細胞、間葉系細胞等が形成される。表層外胚葉からは嗅上皮を含む上気道組織、表皮、内耳、下垂体前葉等が形成される。プラコード及びプラコード由来組織は表層外胚葉に由来する。多能性幹細胞は、外胚葉に分化する過程で、例えばＰａｘ３、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ１といった外胚葉マーカーとして知られている遺伝子を発現する。

【0064】

「内胚葉」とは生物の初期発生の過程において卵の受精後に形成される３つの胚葉のうち、最も内側に存在する胚葉を表す。内胚葉からは例えば消化器、尿路、咽頭、気管、気管支、肺が形成される。多能性幹細胞は、内胚葉に分化する過程で、例えばＳＯＸ１７、ＨＮＦ－３β／ＦｏｘＡ２、Ｋｌｆ５、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＰＤＸ－１といった内胚葉マーカーとして知られている遺伝子を発現する。

【0065】

「中胚葉」とは外胚葉と内胚葉の間に形成される胚葉を表す。中胚葉からは例えば循環器、骨格、筋肉といった器官又は組織が形成される。多能性幹細胞は、中胚葉に分化する過程で、例えばＴ／Ｂｒａｃｈｕｒｙ、ＳＭＡ、ＡＢＣＡ４、Ｎｋｘ２．５、ＰＤＧＦＲαといった中胚葉マーカーとして知られている遺伝子を発現する。

【0066】

「神経組織」とは、発生期又は成体期の大脳、中脳、小脳、脊髄、網膜、感覚神経、末梢神経等の神経系細胞によって構成される組織を意味する。本明細書において、「神経上皮組織」とは、神経組織が層構造をもつ上皮構造を形成したものを意味する。神経組織中の神経上皮組織は、光学顕微鏡を用いた明視野観察等により存在量を評価することができる。

【0067】

「中枢神経系」とは、神経組織が集積し、情報処理の中心をなす領域を表す。脊椎動物では、脳と脊髄が中枢神経系に含まれる。中枢神経系は外胚葉に由来する。

【0068】

「神経系細胞（Ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ）」とは、外胚葉由来組織のうち表皮系細胞以外の細胞を表す。すなわち、神経系細胞には、神経系前駆細胞、ニューロン（神経細胞）、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞、グリア前駆細胞等の細胞を含む。神経系細胞には、後述する網膜組織を構成する細胞（網膜細胞）、網膜前駆細胞、網膜層特異的神経細胞、神経網膜細胞、網膜色素上皮細胞も包含される。神経系細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ、βＩＩＩチューブリン（Ｔｕｊ１）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ等をマーカーとして用いることによって、同定することができる。

【0069】

ニューロンは、神経回路を形成し情報伝達に貢献する機能的な細胞である。ニューロンは、ＴｕＪ１、Ｄｃｘ、ＨｕＣ／Ｄ等の幼若神経細胞マーカー、及び／又は、Ｍａｐ２、ＮｅｕＮ等の成熟神経細胞マーカーの発現を指標に同定することができる。

【0070】

グリア細胞としては、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミュラーグリア等が挙げられる。アストロサイトのマーカーとしてはＧＦＡＰが挙げられる。オリゴデンドロサイトのマーカーとしてはＯ４が挙げられる。ミュラーグリアのマーカーとしてはＣＲＡＬＢＰ等が挙げられる。

【0071】

神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞への分化能（多分化能）と、多分化能を維持した増殖能（自己複製能ということもある）を有する細胞である。神経幹細胞のマーカーとしてはＮｅｓｔｉｎ、Ｓｏｘ２、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｈｅｓファミリー、ＣＤ１３３等が挙げられる。しかしながら、これらのマーカーは前駆細胞全般のマーカーであり神経幹細胞特異的なマーカーとは考えられていない。神経幹細胞の数は、ニューロスフェアアッセイ、クローナルアッセイ等により評価することができる。

【0072】

ニューロン前駆細胞とは、増殖能をもち、神経細胞を産生し、グリア細胞を産生しない細胞である。ニューロン前駆細胞のマーカーとしては、Ｔｂｒ２、Ｔα１等が挙げられる。幼若神経細胞マーカー（ＴｕＪ１、Ｄｃｘ、ＨｕＣ／Ｄ）陽性かつ増殖マーカー（Ｋｉ６７、ｐＨ３、ＭＣＭ）陽性の細胞を、ニューロン前駆細胞として同定することもできる。グリア前駆細胞とは、増殖能もち、グリア細胞を産生し、神経細胞を産生しない細胞である。

【0073】

神経系前駆細胞（Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）は、神経幹細胞、ニューロン前駆細胞及びグリア前駆細胞を含む前駆細胞の集合体である。神経系前駆細胞は、増殖能とニューロン及びグリア産生能とをもつ。神経系前駆細胞は、Ｎｅｓｔｉｎ、ＧＬＡＳＴ、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｍｕｓａｓｈｉ、Ｐａｘ６等をマーカーとして同定することができる。神経系細胞のマーカー陽性かつ増殖マーカー（Ｋｉ６７、ｐＨ３、ＭＣＭ）陽性の細胞を、神経系前駆細胞として同定することもできる。

【0074】

「非神経上皮組織」とは、上皮構造を有する組織のうち神経上皮組織以外の組織を表す。上皮組織は、外胚葉、中胚葉、内胚葉、栄養外胚葉のいずれの胚葉からも形成される。上皮組織には上皮、中皮、内皮が含まれる。非神経上皮組織に含まれる組織の例としては、表皮、角膜上皮、鼻腔上皮、嗅上皮、口腔上皮、気管上皮、気管支上皮、気道上皮、腎上皮、腎皮質上皮、胎盤上皮等が挙げられる。上皮組織は通常種々の細胞間結合によりつながれており、単層又は重層化した層構造を有する組織を形成する。これらの上皮組織の有無の確認、存在量の定量は、光学顕微鏡による観察又は、上皮細胞マーカーに対する抗体（抗Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により可能である。

【0075】

本発明において、「上皮細胞極性（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｏｌａｒｉｔｙ）」とは上皮細胞内に空間的に形成されている構成成分および細胞機能の分布の偏りを表す。例えば、角膜上皮細胞は眼球の最も外層に局在し、頂端側（ａｐｉｃａｌ）では涙液を保持するための膜結合型ムチン（ＭＵＣ－１、４、１６）等の頂端側特異的なタンパク質を発現している。また、角膜上皮細胞は基底側（ｂａｓａｌ）では基底膜に接着するためのα６インテグリン、β１インテグリン等の基底側特異的なタンパク質を発現している。

【0076】

生体由来の組織中及び本実施形態の製造方法等で作製された細胞集団中において、上皮細胞及び上皮組織に、上皮細胞極性が存在しているかどうかは、Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ、頂端側マーカー（抗ＭＵＣ－１抗体、抗ＰＫＣ－ｚｅｔａ抗体等）並びに基底側マーカー（抗α６インテグリン抗体、抗β１インテグリン抗体等）を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。

【0077】

本発明において、「経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ：Ｔｒａｎｓ－ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」とは、上皮細胞が形成するタイトジャンクションによって頂端面側と基底膜側との間でイオンの透過が制限されることによって生じる電気抵抗である。経上皮電気抵抗の値は、上皮組織のバリア性能、物質透過性等を反映している。経上皮電気抵抗の値は、例えばｃｅｌｌＺｓｃｏｐｅ（セルシード社製）、ＥＶＯＭ、ＥＶＯＭ２（ＷＰＩ社製）、ミリセル（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ） ＥＲＳ－２ 抵抗値測定システム（メルク社製）、及び経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定装置（鶴賀電機社製）等の機器と、機器に付属の電極とを用いて計測することができる。経上皮電気抵抗の値は例として、単位面積抵抗：Ω・ｃｍ^２で表される。

【0078】

「プラコード（ｐｌａｃｏｄｅ）」とは、主に脊椎動物の発生過程において表皮外胚葉の一部が肥厚して形成される器官の原基を表す。プラコードに由来する組織としては、水晶体、嗅上皮、内耳、三叉神経、下垂体等が挙げられる。プラコードのマーカー及びその前駆組織であるプレプラコード・前プラコード領域（ｐｒｅｐｌａｃｏｄｅ ｒｅｇｉｏｎ）のマーカーとしては、Ｓｉｘ１、Ｓｉｘ４、Ｄｌｘ２、Ｄｌｘ５、Ｅｙａ２等が挙げられる。

【0079】

「嗅上皮プラコード・嗅プラコード（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｐｌａｃｏｄｅ）」とは、胚発生の過程で表皮外胚葉の領域に形成される肥厚した構造であって、嗅上皮前駆細胞マーカーを発現し、将来の嗅上皮となる器官の原基を表す。公知の嗅上皮プラコード・嗅プラコードで発現する遺伝子及び嗅上皮前駆細胞マーカーとしては、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２、ＦｏｘＧ１（別名Ｂｆ１）、ＦｏｘＤ４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｐｏｕ２ｆ１、Ｓｐ８、Ｃｈｄ７、Ａｌｄｈ１ａ１、Ａｌｄｈ１ａ３、Ｇａｔａ３、Ｄｍｒｔ４、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１８、ＰＤＧＦＲβ等が挙げられる。

【0080】

「呼吸器」とは、体外から酸素を取り入れ、体外へと二酸化炭素を排出する外呼吸に関与する器官、臓器を表す。呼吸器に含まれる器官、臓器の例として、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、胸郭等が挙げられる。呼吸器は解剖学的に上気道と下気道に分けられる。鼻孔、鼻腔、鼻咽腔、咽頭、喉頭は上気道に分類される。気管、気管支、細気管支、肺は下気道に分類される。鼻腔上皮及び嗅上皮は上気道組織の一つである。

【0081】

「鼻腔」とは、上気道組織の一つであり、顔の中心にある外鼻に空いている孔（鼻孔）より奥に存在する空間を表す。鼻腔は鼻孔より始まり、咽頭上部へと繋がっている。鼻腔は主として嗅部と呼ばれる嗅上皮が存在し、大気中のにおい物質を感知する部分、呼吸部と呼ばれる鼻腔上皮に覆われた部分、及び角化扁平重層上皮で覆われた皮膚と同様の性質を有している部分から構成される。

【0082】

「鼻腔上皮」とは鼻腔中にある上皮組織であり、主として後述する嗅上皮以外の領域を表す。鼻腔上皮の機能としては取り込んだ空気を温め、また表面に分泌された粘液と細胞表面の線毛の働きにより異物を除去する働きがある。鼻腔上皮は主として外胚葉性の非神経上皮に由来し、分泌細胞、線毛細胞、クラブ細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞等の細胞から構成されている。

【0083】

「口腔上皮」とは、口腔を形成する上皮組織及びその細胞を表す。口腔上皮としては、例えば口腔粘膜上皮、唾液腺上皮、歯原性上皮が挙げられる。口腔粘膜上皮は通常、重層扁平上皮からなる粘膜組織であり、結合組織と接した基底膜上に基底細胞、メルケル細胞、メラニン産生細胞等を含み、その上層に有刺細胞、顆粒細胞、角質層が形成される。口腔粘膜上皮は、例えばサイトケラチン７、８、１３、１４、１９陽性の組織として検出され得る。

【0084】

「分泌細胞」とは呼吸器系の組織において粘液又は漿液の分泌を行う細胞を表す。杯細胞及び腺細胞は分泌細胞に属する。分泌細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、例えばムチン１、ムチン２、ムチン３、ムチン４、ムチン５ＡＣ、ムチン５Ｂ、ＦｏｘＡ１、ＦｏｘＡ２、ＦＯＸＡ３、Ｎｋｘ２．１／ＴＴＦ－１、ＳＰＤＥＦ等が挙げられる。また、本発明者らがＷＯ／２０２２／０２６２３８にて見出した分泌細胞にて発現する遺伝子、転写産物及びマーカーとして、ＣＥＡＣＡＭ５、ＬＹ６Ｄ、ＡＤＨ１Ｃ、ＭＳＭＢ、ＰＳＣＡ、ＴＳＰＡＮ１、ＢＰＩＦＢ１、ＦＡＭ３Ｄ、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＡＤＨ７、ＣＲＹＭ、ＣＰ、ＧＳＴＡ１、ＳＴＥＡＰ４、ＡＬＤＨ３Ａ１、ＦＭＯ３、ＣＸＣＬ８が挙げられる。

【0085】

「線毛細胞」（「線毛上皮細胞」ともいう。）とは、上皮組織を形成する細胞であって、細胞の表面に線毛を有する細胞を表す。線毛細胞は、呼吸器系、脳室、卵管等の上皮組織に存在し、線毛の運動により液体、液性因子、体内に侵入した異物、卵子等を特定の方向へ移送する働きがあることが知られている。線毛細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＦｏｘＪ１、ＦｏｘＮ４、ｐ７３、アセチル化チューブリン、β４チューブリン、ＤＮＡＩ１、ＤＮＡＨ５、ＳＮＴＮ等が挙げられる。組織又は細胞をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色等を実施した後に顕微鏡で観察し、細胞表面の線毛構造を観察することにより、線毛細胞及びその前駆細胞の存在を確認することができる。例えばＪ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．，２１１（２００３），ｐｐ．１０３－１１１に記載の方法により、線毛運動周波数：ｃｉｌｉａｒｙ ｂｅａｔｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ（ＣＢＦ）の程度を計測することにより、線毛細胞の存在を観測することもできる。

【0086】

「線毛運動」とは、細胞表面にある線毛の動きであり、ヒトを含む哺乳動物の場合、呼吸器系では細菌やウイルスなどの病原体の排除、卵管では卵子の輸送等の機能を有する。線毛運動は通常、有効打と回復打からなる波動運動である。細胞が線毛運動を実施しているかは、例えば高倍率のレンズを用い、顕微鏡により動画を撮影することで検出できる。

【0087】

「クラブ細胞」（「クララ細胞」ともいう。）とは、上皮組織を形成する細胞であって、粘液又は漿液成分の分泌、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０による化合物代謝、サイトカインの分泌、免疫機能の制御等の機能を有する細胞を表す。クラブ細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＣＹＰ２ｆ１、ＣＹＰ２ｆ２、ｕｒｏｐｌａｋｉｎ３ａ、Ｃｌｄｎ１０、Ａｏｘ３、Ｐｏｎ１、Ｃｃｋａｒ等が挙げられる。また、サイトケラチン４、サイトケラチン１３を発現し、バリア機能や免疫応答に関与していると考えられる「Ｈｉｌｌｏｃｋ（ヒロック）細胞」も、クラブ細胞のサブ集団として含まれる。

【0088】

「基底細胞」は、上皮の基底層に存在する細胞を表す。基底細胞は分裂能を有し、組織幹細胞として生体組織の長期的な維持や傷害の際の修復に寄与する。鼻腔上皮の基底細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、サイトケラチン５、サイトケラチン１４、サイトケラチン１５、ｐ６３、ΔＮｐ６３、ｐ７５等が挙げられる。

【0089】

塩類細胞（「イオノサイト：ｉｏｎｏｃｙｔｅ」ともいう。）は、ＣＦＴＲを発現し、粘膜粘液の粘稠性を制御する機能を有する細胞を示す。塩類細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＣＦＴＲ、Ｆｏｘｉ１、液胞型プロトンＡＴＰａｓｅ（ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ、Ｖ－ＡＴＰａｓｅ）、Ａｓｃｌ３、Ｔｆｃｐ２ｌ１、ＤＭＲＴ２等が挙げられる。

【0090】

神経内分泌細胞は、ホルモン及びペプチドを分泌し、生体の発生や恒常性を制御する機能を有する細胞を示す。神経内分泌細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ａｓｃｌ１、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ Ａ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｉｓｉｎ、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、ＣＡＬＣＡ等が挙げられる。

【0091】

孤立化学感覚上皮細胞は、化学物質の感知と生体防御反応の制御等の機能を有する細胞を示す。タフト（Ｔｕｆｔ）細胞、刷毛細胞、微絨毛細胞も同種の細胞を表す。孤立化学感覚上皮細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＣｈＡＴ／Ｔｒｐｍ５、Ｐｏｕ２ｆ３／Ｓｋｎ－１ａ、苦味受容体Ｔａｓ２ｒ、Ｇｎａｔ３、Ｐｌｃｂ２、ＧＮＧ１３等が挙げられる。

【0092】

「嗅上皮」とは鼻腔中にある上皮組織であり、生体が匂いの情報を感知する嗅覚器官を表す。嗅上皮は上気道組織に分類される。嗅上皮はプラコードに由来する組織の一つであり、嗅覚受容体を発現し、空気中の揮発性分子を感知する嗅神経細胞、嗅神経細胞を支える支持細胞、嗅上皮の幹細胞及び前駆細胞である基底細胞、及び粘液を分泌するボーマン腺細胞等の細胞から構成されている。嗅上皮は形態的に表層、中間層、基底層に分類され、表層には支持細胞、中間層には嗅神経細胞、基底層には基底細胞が存在する。ボーマン腺は嗅上皮内に分枝管状の胞状腺を形成し、点在している。

【0093】

「嗅上皮の前駆組織」とは嗅上皮プラコードを含む。嗅上皮及び嗅上皮プラコードで発現する遺伝子及びマーカーとしては、上述のプラコード領域及び前プラコード領域のマーカーに加え、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２、ＦｏｘＧ１（別名Ｂｆ１）、Ｓｏｘ２、Ｐｏｕ２ｆ１、Ｓｐ８、Ｃｈｄ７、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１８、ＰＤＧＦＲβ等が挙げられる。また、本発明者らがＷＯ／２０２２／０２６２３８にて見出した嗅上皮の前駆組織にて発現する遺伝子、転写産物及びマーカーとして、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｃ、ＺＮＦ３６７、Ａ２Ｍ、ＭＧＰ、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＨ、ＮＵＳＡＰ１、ＨＩＳＴ１ＨＩＣ、ＭＣＡＭ、ＲＧＳ５、ＥＳＣＯ２、Ｃ１１ｏｒｆ８８、ＺＭＹＤ１０、ＭＥＬＫ、ＨＪＵＲＰ、ＴＯＰ２Ａ、ＣＥＰ１５２、ＣＡＶ１、ＨＭＧＢ２、ＣＥＮＰＷ、ＯＲ２Ｂ１１、ＳＬＣ１７Ａ６、ＧＡＤＬ１、ＳＣＮ４Ｂ、ＳＭＩＭ３５、ＡＣ２４５５９５．１、ＬＩＮＣ００６４２、ＧＮＧ１３、ＪＡＫＭＩＰ１、ＬＩＮＧＯ２、ＡＮＯ２、Ｃ７ｏｒｆ５７、ＮＸＰＨ３、ＳＴＯＭ、ＫＲＴ７４、ＮＸＮＬ２、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＧＡＢＢＲ２、ＴＭＰＲＳＳ６、ＨＹＤＩＮが挙げられる。

【0094】

「嗅覚系組織」とは、胎児期又は成体の嗅覚系組織、例えば嗅上皮を構成する細胞（例えば嗅神経細胞、支持細胞、基底細胞、ボーマン腺細胞、嗅神経鞘細胞及びこれらの前駆細胞等）、嗅球を構成する細胞、嗅皮質を構成する細胞等が、一種類又は少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した組織を意味する。それぞれの細胞の存在は、公知の方法、例えば細胞特異的遺伝子の発現の有無、又は発現の程度等により確認できる。

【0095】

「嗅神経細胞」（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ：ＯＲＮ）とは、鼻腔粘膜の嗅上皮中間層にある嗅覚を受容する神経細胞のことを表す。嗅神経細胞は表面の線毛にある嗅覚受容体で空気中の揮発性分子をとらえる。嗅神経細胞は、双極性の感覚細胞である。嗅神経細胞において、末梢側で発現している嗅覚受容体でとらえられた嗅覚情報は、中枢側の嗅糸と呼ばれる神経軸索に伝搬される。嗅糸は数十本ずつ集まって一つの束を形成し、嗅神経はこれらの束すべてを指す。嗅糸は頭蓋骨の篩骨篩板にある篩骨孔を通って脳の嗅球に達し、そこで僧帽細胞等にシナプス結合して、脳内の嗅覚中枢へ嗅覚情報を伝達する。嗅神経細胞及びその前駆細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、環状ヌクレオチド感受性チャンネルα２サブユニット（ＣＮＧＡ２）、環状ヌクレオチド感受性チャンネルα４サブユニット（ＣＮＧＡ４）、環状ヌクレオチド感受性チャンネルβ１ｂサブユニット、嗅覚特異性Ｇタンパク質（Ｇｏｌｆ）アデニル酸シクラーゼ、Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ Ｍａｒｋｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＯＭＰ）、ＮＣＡＭ、ＯＣＡＭ（ＮＣＡＭ－２）、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｂｆ３、ＮｅｕｒｏＤ、ＰＧＰ９．５、Ｎｅｕｒｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｎｏｌａｓｅ（ＮＳＥ）、Ｇｒｏｗｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４３（ＧＡＰ－４３／Ｂ５０）、ビメンチン、Ｌｈｘ２、Ｉｄ３、β－Ｔｕｂｕｌｉｎ ＩＩＩ（Ｔｕｊ）、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、ＴｒｋＢ、Ｃｔｉｐ２、Ｕｎｃｘ及び各種の嗅覚受容体（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＯＲ）等が挙げられる。また、本発明者らがＷＯ／２０２２／０２６２３８にて見出した嗅神経細胞にて発現する遺伝子、転写産物及びマーカーとして、ＮＨＬＨ１、ＧＮＧ８、ＬＨＸ９、ＯＬＩＧ２、ＴＳＨＺ１、ＳＰＯＣＫ２、ＰＣＤＨ８、ＩＮＳＭ１、ＣＡＲＴＰＴ、ＴＵＢＡ１Ａ、ＤＯＣ２Ｂ、ＭＤＭ１、ＯＬＩＧ１、ＫＣＮＭＡ１、ＡＲＨＧＤＩＧ、ＴＲＩＢ３、ＥＬＡＶＬ４、ＬＩＮＣ０２３８４、ＦＮＤＣ５が挙げられる。

【0096】

「支持細胞」（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｃｅｌｌ／ｓｕｓｔｅｎｔａｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ）とは、嗅上皮の最も頂端面側に存在する多列円柱上皮様の細胞を表す。支持細胞は嗅神経細胞等の他の細胞の機能の発揮、生存や上皮構造の維持等に関わる。嗅上皮の微絨毛細胞（ｍｉｃｒｏｖｉｌｌａｒ ｃｅｌｌ）は支持細胞のサブタイプである。支持細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｃａｒｂｏｎｙｌ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ２（Ｃｂｒ２）、Ｓ－１００、Ｅｚｒｉｎ、Ｒｅｅｐ６、Ｓｏｘ２、Ｔｙｒｏ３、ＣＹＰ２Ａ６、ＳＵＳ－１、ＳＵＳ－４、ＥＰＡＳ１等が挙げられる。また、本発明者らがＷＯ／２０２２／０２６２３８にて見出した支持細胞にて発現する遺伝子、転写産物及びマーカーとして、ＳＥＣ１４Ｌ３、ＧＰＸ６、ＬＩＮＣ０２１５９、ＵＣＮ３、ＡＴＰ１３Ａ５、ＫＬＫＢ１、ＴＭＥＭ２１１、ＦＧＦ２０、ＣＹＰ２Ａ１３、ＳＣＡＲＡ５、ＳＬＣ１４Ａ１、ＥＲＭＮ、ＭＥＴＴＬ７Ａ、ＮＯＳ２、Ｂ３ＧＮＴ７、ＳＬＣ５Ａ８、ＰＰＰ１Ｒ１６Ｂ、ＣＥＳ１、ＤＵＯＸＡ１、ＳＬＣＯ１Ａ２が挙げられる。

【0097】

嗅上皮における「基底細胞」（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ）とは、嗅上皮の基底層に存在する細胞を表す。基底細胞は形態的に球状基底細胞（ｇｌｏｂｏｓｅ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ：ＧＢＣ）と水平基底細胞（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ：ＨＢＣ）に分けられる。これら二種の細胞のうち、球状基底細胞は恒常的に細胞分裂を生じ、新しい嗅神経細胞を供給する活動中の前駆細胞、幹細胞である。一方で、水平基底細胞は通常では細胞分裂の細胞周期が停止した状態にあり、嗅上皮の大規模な損傷等が生じた際に活性化される休眠状態の幹細胞である。水平基底細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ｐ６３、サイトケラチン５、サイトケラチン１４、ＩＣＡＭ－１等が挙げられる。球状基底細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ＧＡＰ４３、ＧＢＣ－１、Ｌｇｒ５、Ａｓｃｌ１、ＬＳＤ１、ＳＥＣ８、ｃ－Ｋｉｔ／ＣＤ１１７、Ｓｏｘ２、Ｈｅｓ１、Ｉｄ、Ｂｍｉ１等が挙げられる。また、本発明者らがＷＯ／２０２２／０２６２３８にて見出した嗅上皮の基底細胞にて発現する遺伝子、転写産物及びマーカーとして、Ｓ１００Ａ２、ＮＰＰＣ、ＡＤＩＲＦ、ＰＯＳＴＮ、ＡＴＦ３、ＭＹＣ、ＫＲＴ１７、ＦＯＳＢ、ＭＥＧ３、ＣＸＣＬ１４、ＳＵＬＴ１Ｅ１、ＣＤ４４、ＦＨＬ２、ＦＸＹＤ３、ＴＲＩＭ２９、ＣＬＤＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＩＧＦ１が挙げられる。

【0098】

「ボーマン腺細胞」（Ｂｏｗｍａｎ’ｓ ｇｌａｎｄ ｃｅｌｌ）とは、ボーマン腺（嗅腺）を構成する細胞を表す。ボーマン腺は嗅上皮に存在する分岐した細い管上の組織であり、嗅上皮を保護する粘液の分泌等の機能を有する。ボーマン腺細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、Ｓｏｘ９、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ａｑｕａｐｏｒｉｎ５、Ａｓｃｌ３、サイトケラチン１８等が挙げられる。

【0099】

「嗅神経鞘細胞」（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｅｎｓｈｅａｔｉｎｇ ｇｌｉａ：ＯＥＧ）とは、嗅上皮及び嗅球に存在するグリア細胞の一種を表す。嗅神経鞘細胞はＢＤＮＦ、ＮＧＦ等の神経栄養因子を放出し、嗅神経の恒常的な再生に関わる細胞である。嗅神経鞘細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、ｐ７５ＮＴＲ、Ｓ１００β、Ｓｏｘ１０、ＧＦＡＰ、ＢＬＢＰ、Ａｑｕａｐｏｒｉｎ１、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ α７等が挙げられる。

【0100】

「嗅上皮周縁部」（ｌａｔｅｒａｌ ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）とは、嗅上皮の周縁の領域であり、嗅上皮以外の非神経上皮と連続している領域を表す。本発明における「嗅上皮内側部」（ｍｅｄｉａｌ ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）とは、嗅上皮周縁部に囲われた嗅上皮の中心領域を表す。嗅上皮周縁部と嗅上皮内側部では構成している細胞の割合が異なることが知られている（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１０，１３７：２４７１－２４８１）。嗅上皮周縁部で発現が高い遺伝子としてＰｂｘ１／２／３、Ｍｅｉｓ１、βＩＶＴｕｂｕｌｉｎが挙げられる。嗅上皮内側部で発現が高い遺伝子としてＴｕｊ１、Ａｓｃｌ１、Ｓｏｘ２が挙げられる。

【0101】

「性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞」とは、主として中枢神経系の視床下部に存在し、生殖系の器官の制御に関与する性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ：ＧｎＲＨ）を分泌する神経細胞である。性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞は、胎生期に嗅上皮で発生したのちに、中枢神経系へと移動する。性腺刺激ホルモン放出ホルモン陽性神経細胞で発現する遺伝子及びマーカーとしては、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ：ＧｎＲＨ）、Ｐｏｕ２ｆ１、Ｄｌｘ５、Ｍｅｉｓ１、Ｐｂｘ１、Ｐｋｎｏｘ１、Ｚｅｂ１等が挙げられる。

【0102】

「嗅窩：Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ Ｐｉｔ」とは、発生中の胚において、嗅上皮プラコードが胚の内側に陥入し形成される嗅覚系組織の基となる組織である。嗅窩は主として将来の嗅上皮を構成する組織、細胞、及び嗅上皮と連続して形成される鼻腔上皮の組織、細胞より構成される。

【0103】

「骨組織」とは、骨を構成する細胞と、リン酸カルシウム、Ｉ型コラーゲン等から構成される骨基質を表す。骨を構成する細胞には、骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞等が含まれる。

【0104】

本発明において「間葉系細胞」とは、主に中胚葉並びに神経堤に由来し、結合組織を形成する非上皮性の細胞である。これらの細胞のうちの一部は、間葉系幹細胞と呼ばれる複能性を有した体性幹細胞である。本発明の製造方法における第一細胞集団及び第二細胞集団、並びに、本発明の製造方法で製造されるシート状細胞構造体中に間葉系細胞が含まれるかどうかは、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｃａｄｈｅｒｉｎ－１１、Ｌａｍｉｎｉｎ、ＣＤ４４といった間葉系細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。間葉系幹細胞が含まれるかどうかは、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１６６、ＶＣＡＭ－１、ＳＴＲＯ－１、ｃ－Ｋｉｔ、Ｓｃａ－１、Ｎｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ、ＣＤＣＰ１、ＢＭＰＲ２、ＢＭＰＲ１Ａ及びＢＰＭＲ１Ｂといった間葉系幹細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫組織化学等の手法により検出することができる。

【0105】

本発明において、「ニッチ」、又は「幹細胞ニッチ」とは幹細胞の増殖、分化、性質の維持等に関わる微小環境をいう。生体におけるニッチの例としては、造血幹細胞ニッチ、毛包幹細胞ニッチ、腸管上皮幹細胞ニッチ、筋幹細胞ニッチ、下垂体ニッチ、基底細胞ニッチなどが挙げられる。これらのニッチにおいては、それぞれの組織特有の幹細胞とニッチを提供する支持細胞とが存在する。また、支持細胞が提供するサイトカイン、ケモカイン、細胞外マトリックス、細胞接着因子、細胞間シグナル伝達因子等により幹細胞が維持されている。

【0106】

「受容体タンパク質」とは、細胞膜、細胞質又は核内にあるタンパク質であり、ホルモン、サイトカイン、細胞増殖因子、化合物等の物質と結合し、各種の細胞の反応を惹起するタンパク質を表す。

【0107】

「嗅覚受容体」とは、嗅神経細胞及びその他の細胞で発現し、化合物等の感知に関わる受容体タンパク質を表す。

【0108】

「病原体」とは、宿主となる生物に病気を起こす性質を有するものをいう。ウイルス、真正細菌、菌類、原生動物、寄生虫、異常プリオンタンパク質等のタンパク質、核酸等が病原体として扱われる。

【0109】

「ウイルス受容体」とは、ウイルスが細胞、組織に感染する際に結合する宿主側の因子である。ウイルス受容体は通常、タンパク質又は糖鎖である。例えば、アンジオテンシン変換酵素２（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ２：ＡＣＥ２）はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス受容体であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳｐｉｋｅタンパク質と結合することが報告されている。シアル酸α２，６Ｇａｌは、ヒト季節性インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２等）の受容体であることが報告されている。シアル酸α２，３Ｇａｌは、トリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１など）の受容体であることが報告されている。その他のウイルス受容体は、例えばＮａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ４．１（２００３）：５７－６８等に記載されている。

【0110】

「ウイルス感染関連因子」とは、ウイルスが細胞及び組織に感染する際に影響する宿主側の因子を表す。例えば、ＴＭＰＲＳＳ２はタンパク質分解酵素の一種であり、細胞への感染の際にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質を開裂し、活性型へと変換することが報告されている。

【0111】

「パターン認識受容体（ＰＲＲｓ）」とは、病原体などの異物を認識する機能をもつ受容体を表す。パターン認識受容体としてはレクチン、補体、膜受容体、細胞質タンパク質等が挙げられる。パターン認識受容体は病原体特有の分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ；ＰＡＭＰｓ）を認識し、機能を発揮する。病原体特有の分子パターンとしては、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、糖鎖、タンパク質等が挙げられ、パターン認識受容体は各々固有の標的と結合する。

【0112】

「サイトカイン」とは、生体が細胞間情報伝達に用いる一群のタンパク質を表す。サイトカインには例えばケモカイン、増殖因子、造血因子、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子等が含まれる。

【0113】

「免疫」とは、病原体及びウイルスなどの非自己物質、がん細胞等の自己由来であっても異常を有し有害な細胞、及び異物等を認識し、排除する又は無害化するための生体が有するシステムである。「免疫応答」とは、免疫が機能する際に免疫系の組織及び細胞が示す生理的反応である。

【0114】

「ウイルスの分離」とは、ウイルスの存在が予想される検体中に存在する特定のウイルスを増殖、同定することである。検体としては例えば、ヒトを含む動物、及び植物その他生物の組織、排泄物、及び分泌物等、並びに、環境中の試料が挙げられる。ウイルスの分離には、対象となるウイルスの種類、特性に応じ、培養細胞、動物等が用いられる。

【0115】

［２．上気道細胞を含むシート状細胞構造物の製造方法］
本発明は、上気道細胞を含むシート状細胞構造物の製造方法を提供する。
本発明の一態様は、
上気道細胞を含むシート状細胞構造体の製造方法であって、
（１）嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第一細胞集団を分散し、単一細胞を得る工程（１）、
（２）前記工程（１）で得られた前記単一細胞を精製し、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第二細胞集団を得る工程（２）であって、前記第二細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合が、前記第一細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合より高い、工程（２）、並びに、
（３）前記工程（２）で得られた前記第二細胞集団を培養器材上に播種し、前記第二細胞集団を培養し、前記シート状細胞構造体を得る工程（３）、
を含む。

【0116】

工程（１）における前記第一細胞集団は、
（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（ａ）、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（ａ）で培養した細胞を培養する工程（ｂ）、並びに、
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（ｂ）で培養した細胞を培養し、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む前記第一細胞集団を製造する工程（ｃ）、
を含む方法によって製造されることが好ましい。

【0117】

すなわち、上気道細胞を含むシート状細胞構造物の製造方法の好ましい他の一態様は、
上気道細胞を含むシート状細胞構造体の製造方法であって、
（ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する工程（ａ）、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、前記工程（ａ）で培養した細胞を培養する工程（ｂ）、並びに、
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記工程（ｂ）で培養した細胞を培養し、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第一細胞集団を製造する工程（ｃ）、
（１）前記第一細胞集団を分散し、単一細胞を得る工程（１）、
（２）前記工程（１）で得られた前記単一細胞を精製し、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第二細胞集団を得る工程（２）であって、前記第二細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合が、前記第一細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合より高い、工程（２）、並びに、
（３）前記工程（２）で得られた前記第二細胞集団を培養器材上に播種し、前記第二細胞集団を培養し、前記シート状細胞構造体を得る工程（３）、
を含む。以下、第一細胞集団を製造する方法（工程（ｉ）、工程（ａ）～工程（ｃ））について説明した後に、前記第一細胞集団からシート状細胞構造物を製造する方法（工程（１）～工程（３））について説明する。

【0118】

＜２－１．第一細胞集団を製造する方法＞
＜工程（ｉ）＞
工程（ａ）～工程（ｃ）を説明するに先立って、多能性幹細胞の未分化維持培養である工程（ｉ）について、説明する。
本実施形態に係る製造方法において、
後述する工程（ａ）の前に、多能性幹細胞をフィーダー細胞非存在下で、
を含む培地で培養する工程（ｉ）を含んでもよい。

【0119】

多能性幹細胞をＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質、ソニック・ヘッジホッグシグナル（Ｓｈｈ）伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で培養してから、工程（ｉ）を開始することにより、多能性幹細胞の状態が変わり、分化しやすく、細胞死が生じにくく、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む細胞集団（第一細胞集団）の製造効率が向上する。

【0120】

多能性幹細胞より製造された嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む細胞集団は、国際公開第２０２０／０３９７３２号及び国際公開第２０２２／０２６２３８号の実施例に記載の方法によっても製造することができる。

【0121】

本実施形態において、多能性幹細胞は、好ましくは胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、所定の機関より入手でき、市販品を購入することもできる。例えばヒト人工多能性幹細胞株２０１Ｂ７株は、京都大学より入手できる。ＨＣ－６ ＃１０株、１２３１Ａ３株及び１３８３Ｄ２株は国立研究開発法人理化学研究所より入手できる。ｈｉＰＳ β－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ株はメルク社から入手できる。

【0122】

ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路（すなわちＴＧＦβスーパーファミリーシグナル伝達経路）とは、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎ、又はＢＭＰ等をリガンドとし、細胞内でＳｍａｄファミリーの物質により伝達されるシグナル伝達経路である。

【0123】

ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路、すなわちＳｍａｄファミリーの物質により伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路阻害物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質が好ましい。

【0124】

ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としては、ＴＧＦβに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＴＧＦβに直接作用する物質（例えばタンパク質、抗体、アプタマー等）、ＴＧＦβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＴＧＦβ受容体とＴＧＦβの結合を阻害する物質、ＴＧＦβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えばＴＧＦβ受容体の阻害剤、Ｓｍａｄの阻害剤等）を挙げることができる。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、Ｌｅｆｔｙが挙げられる。

【0125】

ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができる。具体的には、ＳＢ４３１５４２（「ＳＢ４３１」と略記する場合がある。）（４－［４－（３，４－Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－５－（２－ｐｙｒｉｄｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＳＢ５０５１２４（２－［４－（１，３－Ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－２－（１，１－ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］－６－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ＳＢ５２５３３４（６－［２－（１，１－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－５－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ）、ＬＹ２１５７２９９（４－［５，６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－２－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２－ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－６－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＬＹ２１０９７６１（４－［５，６－ｄｉｈｙｄｒｏ－２－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２－ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－７－［２－（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＧＷ７８８３８８（４－｛４－［３－（Ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］－ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ｝－Ｎ－（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｐｙｒａｎ－４－ｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＬＹ３６４９４７（４－［３－（２－Ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＳＤ－２０８（２－（５－Ｃｈｌｏｒｏ－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｔｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ ａｍｉｎｅ）、ＥＷ－７１９７（Ｎ－（２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４－［１，２，４］ｔｒｉａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎ－６－ｙｌ－１Ｈ－Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－２－ｍｅｔｈａｎａｍｉｎｅ）、Ａ８３－０１（３－（６－Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－４－（４－ｑｕｉｎｏｌｙｌ）－１－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏｃａｒｂａｍｏｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｅ）、ＲｅｐＳｏｘ（２－［５－（６－Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］－１，５－ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎｅ）、ＳＭ１６（４－［４－（１，３－Ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌ）－５－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ］ｂｉｃｙｃｌｏ［２．２．２］ｏｃｔａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｒ２６８７１２（４－［２－Ｆｌｕｏｒｏ－５－［３－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｅ－１－ｅｔｈａｎｏｌ）、ＩＮ１１３０（３－［［５－（６－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４－（６－ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（４－［５，６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－２－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［１，２－ｂ］ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－６－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＡＺ１２７９９７３４（４－（｛４－［（２，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｏｘｙ］ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ｝ａｍｉｎｏ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、Ａ７７－０１（４－［３－（６－Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＫＲＣＡ ０００８（１，１－［（５－Ｃｈｌｏｒｏ－２，４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉｙｌ）ｂｉｓ［ｉｍｉｎｏ（３－ｍｅｔｈｏｘｙ－４，１－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）－４，１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｄｉｙｌ］］ｂｉｓｅｔｈａｎｏｎｅ）、ＧＳＫ １８３８７０５（２－［［２－［［１－［（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｏｙｌ］－５－（ｍｅｔｈｙｌｏｘｙ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－６－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－６－ｆｌｕｏｒｏ－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ（３－［（１Ｒ）－１－（２，６－Ｄｉｃｈｌｏｒｏ－３－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］－５－［１－（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］－２－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ（５－Ｃｈｌｏｒｏ－Ｎ２－［２－ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌ－４－（４－ｐｉｐｅｒｉｄｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ４－（２－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－２，４－ｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＳＰ ３０２６（Ｎ２－［２－Ｍｅｔｈｏｘｙ－４－［４－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ４－［２－［（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＴＡＥ６８４（５－Ｃｈｌｏｒｏ－Ｎ２－［２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－［４－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ４－［２－［（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＺＤ３４６３（Ｎ－［４－（４－Ａｍｉｎｏ－１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）－２－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－５－ｃｈｌｏｒｏ－４－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－２－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎａｍｉｎｅ）、ＴＰ０４２７７３６（６－［４－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］－１，３－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）、ＴＧＦＢＲ１－ＩＮ－１（５－（１，３－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－６－ｙｌ）－Ｎ－（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１－（６－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＴＥＷ－７１９７（２－ｆｌｕｏｒｏ－Ｎ－［［５－（６－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－４－（［１，２，４］ｔｒｉａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎ－６－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ａｎｉｌｉｎｅ）、ＬＹ３２００８８２（２－［４－［［４－［１－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－３－（ｏｘａｎ－４－ｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］ｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎ－２－ｏｌ）、ＢＩＢＦ－０７７５（（３Ｚ）－Ｎ－Ｅｔｈｙｌ－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－３－［ｐｈｅｎｙｌ［［４－（１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ］－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ等のＡｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤、ＳＩＳ３（１－（３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－６，７－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－２（１Ｈ）－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）－３－（１－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｈｅｎｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）－２－ｐｒｏｐｅｎ－１－ｏｎｅ）等のＳＭＡＤ３阻害剤、ＩＴＤ－１（４－［１，１’－Ｂｉｐｈｅｎｙｌ］－４－ｙｌ－１，４，５，６，７，８－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－２，７，７－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－５－ｏｘｏ－３－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）等の受容体分解促進剤及びこれら化合物の誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は組み合わせて用いてもよい。ＳＢ４３１５４２は、ＴＧＦβ受容体（ＡＬＫ５）及びＡｃｔｉｖｉｎ受容体（ＡＬＫ４／７）の阻害剤（すなわちＴＧＦβＲ阻害剤）として公知の化合物である。ＳＩＳ３は、ＴＧＦβ受容体の制御下にある細胞内シグナル伝達因子であるＳＭＡＤ３のリン酸化を阻害するＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質である。ＩＴＤ－１は、ＴＧＦ－β ｔｙｐｅ ＩＩ ｒｅｃｅｐｔｏｒのプロテアソーム分解促進剤である。上記の化合物等がＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としての活性を有することは当業者にとって公知である（例えばＥｘｐｅｒｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ ｄｒｕｇｓ， ２０１０， １９．１： ７７－９１．等に記載されている）。

【0126】

ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＡｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤を含む。Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤は、好ましくはＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ２１５７２９９、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、ＥＷ－７１９７、Ａ８３－０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＳＭ１６、Ｒ２６８７１２、ＩＮ１１３０、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ、ＡＺ１２７９９７３４、Ａ７７－０１、ＫＲＣＡ ０００８、ＧＳＫ １８３８７０５、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、ＡＳＰ ３０２６、ＴＡＥ６８４、ＡＺＤ３４６３、ＴＰ０４２７７３６からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＳＢ４３１５４２、ＲｅｐＳｏｘ又はＡ８３－０１を含む。

【0127】

培地中のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で用いる物質に応じて適宜設定することが可能である。工程（ａ）におけるＴＧＦβ伝達経路阻害物質としてＳＢ４３１５４２を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約１００μＭ、より好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭ、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭ、特に好ましくは約１μＭ～約１０μＭの濃度で使用される。また、ＳＢ４３１５４２以外のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＳＢ４３１５４２と同等のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。なお、ＳＢ４３１５４２等のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害活性は、当業者に周知の方法、例えばＳｍａｄのリン酸化をウエスタンブロッティング法で検出することで決定できる（Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２００４） ３，７３７－４５．等）。

【0128】

Ｓｈｈ伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＨｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属するタンパク質（例えばＳｈｈ、Ｉｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Ｓｍｏアゴニスト、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（９－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－Ｎ－［４－（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－２－（１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌｏｘｙ）－９Ｈ－ｐｕｒｉｎ－６－ａｍｉｎｅ）、ＧＳＡ－１０（Ｐｒｏｐｙｌ ４－（１－ｈｅｘｙｌ－４－ｈｙｄｒｏｘｙ－２－ｏｘｏ－１，２－ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）、Ｈｈ－Ａｇ１．５、２０（Ｓ）－Ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ Ａｇｏｎｉｓｔ：Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ）－Ｎ’－（３－ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ）－１，４－ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ）、２０（Ｓ）－ｈｙｄｒｏｘｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）－１７－［（２Ｒ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－６－ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔａｎ－２－ｙｌ］－１０，１３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，３，４，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７－ｄｏｄｅｃａｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ａ］ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎ－３－ｏｌ）等が挙げられる。これらの物質は単独で又は組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がＳｈｈ伝達経路作用物質としての活性を有することは当業者にとって公知である（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ， ２０１０， ６．１： ４４－５４．に記載されている。）。

【0129】

Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＳＡＧ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、ＧＳＡ－１０からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＳＡＧを含む。培地中のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で用いる物質に応じて適宜設定することが可能である。ＳＡＧは、工程（ｉ）においては通常約１ｎＭ～約２０００ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約１０００ｎＭ、より好ましくは約１０ｎＭ～約７００ｎＭ、さらに好ましくは約５０ｎＭ～約７００ｎＭ、特に好ましくは約１００ｎＭ～約６００ｎＭ、最も好ましくは約１００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度で使用される。また、ＳＡＧ以外のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＳＡＧと同等のＳｈｈシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。Ｓｈｈ伝達促進活性は、当業者に周知の方法、例えばＧｌｉ１遺伝子の発現に着目したレポータージーンアッセイにて決定することができる（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００７）２６，５１６３－５１６８等）。

【0130】

本発明において、ＦＧＦシグナル伝達経路とは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーに属するシグナリング分子により惹起される生理的反応を伝達するシグナル伝達経路を表す。ＦＧＦシグナル伝達経路は、ＦＧＦファミリー分子がＦＧＦ受容体へ結合し、その下流の細胞内シグナル伝達経路を活性化させるＦＧＦ受容体依存的な経路、及びＦＧＦファミリー分子がＦＧＦ受容体と結合せずに生理的反応を惹起するＦＧＦ受容体非依存的な経路のいずれも含む。

【0131】

ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としてはＦＧＦにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、ＦＧＦと直接結合してトラップする物質、ＦＧＦ受容体のキナーゼ活性を阻害する物質、ＦＧＦ受容体の分解を誘導する物質、ＦＧＦによって活性化される細胞内シグナル伝達を阻害する物質、ＦＧＦ刺激によって誘導される遺伝子発現を抑制する物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては、例えば抗ＦＧＦ抗体、ＧＰ３６９（抗ＦＧＦＲ２抗体）、ＳＵ５４０２（３－［４－Ｍｅｔｈｙｌ－２－［（２－ｏｘｏ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌ－３－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＢＧＪ３９８（３－（２，６－Ｄｉｃｈｌｏｒｏ－３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１－［６－［［４－（４－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］－１－ｍｅｔｈｙｌｕｒｅａ）、ＰＤ１７３０７４（１－（Ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ）－３－（２－（（４－（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｂｕｔｙｌ）ａｍｉｎｏ）－６－（３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－７－ｙｌ）ｕｒｅａ）、ＡＺＤ４５４７（ｒｅｌ－Ｎ－［５－［２－（３，５－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－４－［（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ（Ｎ－（３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－Ｎ－［３－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－６－ｙｌ］ｅｔｈａｎｅ－１，２－ｄｉａｍｉｎｅ）、ＢＹＬ７１９（（２Ｓ）－Ｎ１－［４－Ｍｅｔｈｙｌ－５－［２－（２，２，２－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ－１，１－ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－４－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－１，２－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＧＳＫ２６３６７７１（２－Ｍｅｔｈｙｌ－１－［［２－Ｍｅｔｈｙｌ－３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏＭｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］Ｍｅｔｈｙｌ］－６－（４－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｂｅｎｚｉＭｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、Ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（２－Ｍｅｔｈｙｌ－２－［４－［２－（５－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌ－３－ｙｌ）－５，６－ｄｉｈｙｄｒｏｉＭｉｄａｚｏ［１，２－ｄ］［１，４］ｂｅｎｚｏｘａｚｅｐｉｎ－９－ｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌ－１－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎａＭｉｄｅ）、Ｃａｐｉｖａｓｅｒｔｉｂ（４－Ａｍｉｎｏ－Ｎ－［（１Ｓ）－１－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］－１－（７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｓａｐａｎｉｓｅｒｔｉｂ（２－（（（１Ｒ，４Ｒ）－４－（（（（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）（ｐｈｅｎｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ（Ｎ－［３－［５－（２－Ａｍｉｎｏ－４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）－２－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ）－４－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ］－２，６－ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ（５－［（４－Ｂｒｏｍｏ－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－ｆｌｕｏｒｏ－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）－１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（Ｎ－［３－［３－Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－５－［（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－６，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，４，７－ｔｒｉｏｘｏｐｙｒｉｄｏ［４，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－１（２Ｈ）－ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＤＧＹ－０９－１９２及びこれらの誘導体等が挙げられる。

【0132】

工程（ｉ）において用いられるＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくは線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１から４のいずれかに対する阻害活性を有する物質であり、さらに好ましくは線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）に対する阻害活性を有する物質である。より好ましくは線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）の受容体チロシンキナーゼ阻害物質である。線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）の受容体チロシンキナーゼ阻害活性は、例えばＯｎｃｏｔａｒｇｅｔ． ２０１４； ５：４５４３－４５５３に記載のセルフリーキャリパーモビリティーシフトアッセイ及びＡＴＰ競合阻害アッセイ等の手法により測定可能である。線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）に対する阻害活性を有する物質としては、好ましくはＰＤ１７３０７４、Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ、Ｓｕｌｆａｔｉｎｉｂ、ＯＮ１２３３００、ＳＵ５４０２、Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ、Ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ、ＰＤ－１６６８６６、Ｂｒｉｖａｎｉｂ、Ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＰＤ１７３０７４を含む。ＰＤ１７３０７４は、工程（ｉ）においては通常約１ｎＭ～約２０００ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約１０００ｎＭ、より好ましくは約１０ｎＭ～約７００ｎＭ、さらに好ましくは約２０ｎＭ～約７００ｎＭ、特に好ましくは約３０ｎＭ～約５００ｎＭ、最も好ましくは約５０ｎＭ～約３００ｎＭの濃度で使用される。また、ＰＤ１７３０７４以外のＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＰＤ１７３０７４と同等のＦＧＦシグナル伝達経路阻害活性又は線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）の受容体チロシンキナーゼ阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害活性は、当業者に周知の方法、線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）の受容体チロシンキナーゼ阻害活性は、例えばＯｎｃｏｔａｒｇｅｔ． ２０１４； ５：４５４３－４５５３．に記載のセルフリーキャリパーモビリティーシフトアッセイ及びＡＴＰ競合阻害アッセイ等の手法により測定可能である。

【0133】

工程（ｉ）において用いられる培地は、未分化維持培養を可能にするため、未分化維持因子を含む。未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定されない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、プライムド多能性幹細胞（ｐｒｉｍｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）（例えばヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞）の場合、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質、ｉｎｓｕｌｉｎ等を挙げることができる。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えばｂＦＧＦ、ＦＧＦ４やＦＧＦ８）が挙げられる。また、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。ＴＧＦβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２が挙げられる。Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＮｏｄａｌ、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＡｃｔｉｖｉｎＢが挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。ヒト多能性幹細胞（例えばヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞）を培養する場合、工程（ｉ）の培地においてＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない場合は、好ましくは未分化維持因子として、ｂＦＧＦを含む。あるいは、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まず、ｂＦＧＦを含む培地で一定期間培養し、その後ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含み、ｂＦＧＦを含まない培地に変更してもよい。

【0134】

未分化維持因子は、通常哺乳動物の未分化維持因子である。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。未分化維持因子は、哺乳動物の種間で交差反応性を有し得るので、培養対象の多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な限り、いずれの哺乳動物の未分化維持因子を用いてもよい。未分化維持因子は、好ましくは培養する細胞と同一種の哺乳動物の未分化維持因子である。例えばヒト多能性幹細胞の培養には、ヒト未分化維持因子（例えばｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、ＦＧＦ８、ＥＧＦ、ＢＭＰ、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＡｃｔｉｖｉｎＢ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２等）が用いられる。未分化維持因子は、好ましくは単離されている。オルガノイドを含む立体組織への効率の良い分化能を維持する多能性幹細胞の培養条件、及び添加する未分化維持因子の態様として、例えばＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｖｏｌ． １７ １－１９ Ｏｃｔｏｂｅｒ １１， ２０２２に記載のＢＭＰ４、ＴＧＦβ１、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦβ３を同時に添加する組み合わせもまた好ましい。

【0135】

未分化維持因子は、培養対象である多能性幹細胞の未分化維持能を有する限り、いずれの宿主によって生産されたもの又は人工合成されたものを用いることができる。本発明に用いる未分化維持因子は、生体内で生じるものと同様の修飾を受けたものが好ましく、培養対象である多能性幹細胞と同種の細胞において異種成分を含まない条件下で産生されたものがさらに好ましい。

【0136】

本発明に係る製造方法の一態様は、単離された未分化維持因子を提供する工程を含む。本発明に係る製造方法の一態様は、工程（ｉ）に用いる培地中へ、単離された未分化維持因子を外来的（又は外因的）に添加する工程を含む。工程（ｉ）に用いる培地に予め未分化維持因子が添加されていてもよい。

【0137】

工程（ｉ）において用いられる培地中の未分化維持因子濃度は、培養する多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であり、当業者であれば適宜設定することができる。例えばフィーダー細胞非存在下で未分化維持因子としてｂＦＧＦを用いる場合、その濃度は、通常約４ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ～約２００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３０ｎｇ／ｍＬ～約１５０ｎｇ／ｍＬである。未分化維持因子としてＢＭＰ４、ＴＧＦβ１、ＡｃｔｉｖｉｎＡ、Ｎｏｄａｌ、ＴＧＦβ３を同時に添加する場合、その濃度は、通常ＢＭＰ４が約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬであり、ＴＧＦβ１が約０．０１ｎｇ／ｍＬ～約５ｎｇ／ｍＬであり、ＡｃｔｉｖｉｎＡが約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬであり、Ｎｏｄａｌが約１０ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬであり、ＴＧＦβ３が約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬである。

【0138】

工程（ｉ）は、フィーダー細胞非存在下で実施する。工程（ｉ）における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養のいずれの条件で行われてもよいが、好ましくは接着培養により行われる。フィーダー細胞非存在下での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場であるマトリクスにより表面をコーティングした培養器材中で、多能性幹細胞を接着培養する。

【0139】

足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８，６１１－６１５（２０１０））、ラミニン断片（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３，１２３６（２０１２））、基底膜標品（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９，９７１－９７４（２００１））、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。マトリクスは、好ましくはラミニン５１１が用いられる（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８，６１１－６１５（２０１０））。

【0140】

ラミニン断片は、多能性幹細胞への接着性を有しており、フィーダーフリー条件での多能性幹細胞の維持培養を可能とするものであれば特に限定されないが、好ましくはＥ８フラグメントである。ラミニンＥ８フラグメントは、ラミニン５１１をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（ＥＭＢＯ Ｊ．，３：１４６３－１４６８，１９８４、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０５：５８９－５９８，１９８７）。ラミニン断片としては、好ましくはラミニン５１１のＥ８フラグメントが用いられる（Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ３，１２３６（２０１２）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ４，３５４９（２０１４））。ラミニンＥ８フラグメントは、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、組換え体であってもよい。遺伝子組換え動物（カイコ等）に産生させたものであってもよい。未同定成分の混入を回避する観点から、好ましくは組換え体のラミニン断片が用いられる。ラミニン５１１のＥ８フラグメントは市販されており、例えばニッピ株式会社等から購入可能である。

【0141】

未同定成分の混入を回避する観点から、本発明において用いられるラミニン又はラミニン断片は、単離されていることが好ましい。工程（ｉ）におけるフィーダー細胞非存在下での多能性幹細胞の培養においては、好ましくは単離されたラミニン５１１又はラミニン５１１のＥ８フラグメントによって、より好ましくはラミニン５１１のＥ８フラグメントによって表面をコーティングした培養器材中で、多能性幹細胞を接着培養する。

【0142】

工程（ｉ）において用いられる培地は、フィーダーフリー条件下で、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能にする培地（フィーダーフリー培地）であれば、特に限定されない。フィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地が挙げられる。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、添加剤として、Ｌ－ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ－２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（６４ｍｇ／ｌ）、ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ（１４μｇ／１）、ｉｎｓｕｌｉｎ（１９．４ｍｇ／ｌ）、ＮａＨＣＯ_３（５４３ｍｇ／ｌ）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（１０．７ｍｇ／ｌ）、ｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及びＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路作用物質（ＴＧＦβ１（２ｎｇ／ｍＬ）又はＮｏｄａｌ（１００ｎｇ／ｍＬ））を含む（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８，４２４－４２９（２０１１））。市販のフィーダーフリー培地としては、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｓ－ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ Ｍｅｄｉｕｍ、ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ｈＥＳＦ９、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素株式会社製）、ＲｅｐｒｏＭｅｄ ｉＰＳＣ Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ ＸＦ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ Ｖ９（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＤＥＦ－ＣＳ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ（タカラバイオ社製）、Ｓｔｅｍ－Ｐａｒｔｎｅｒ ＳＦ（極東製薬社製）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（メルク社製）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ ｈＰＳＣ ＭｅｄｉｕｍΔ（富士フイルム和光純薬社製）、ｃｉＫＩＣ ｉＰＳ ｍｅｄｉｕｍ（関東化学株式会社製）、ＳｔｅｍＭＡＣＳ ｉＰＳ－Ｂｒｅｗ ＸＦ， ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテック社製）、ＥｘＣｅｌｌｅｒａｔｅ ｉＰＳＣ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ， Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ－Ｆｒｅｅ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＳＴＥＭｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｌｉｎｉ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＣＥＬＲＥＮＡ Ｍｅｄｉｕｍ （細胞科学研究所社製）、ｈＰＳＣ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＤＸＦ（プロモセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ ／ ｉＰＳＣ Ｍｅｄｉｕｍ（システムバイオサイエンス社製）等が挙げられる。工程（ｉ）ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することができる。ＳｔｅｍＦｉｔ培地は未分化維持成分としてｂＦＧＦを含有する（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１４）４，３５９４）。

【0143】

工程（ｉ）における多能性幹細胞は、プライム状態（Ｐｒｉｍｅｄ ｓｔａｔｅ）及びナイーブ様状態（Ｎａｉｖｅ－ｌｉｋｅ ｓｔａｔｅ）のいずれであってもよいが、好ましくはプライム状態である。ナイーブ様状態の多能性幹細胞は、プライム状態の多能性幹細胞を例えばＣｅｌｌ， ２０１４， １５８．６： １２５４－１２６９．に記載の方法等、あるいは市販のＲｅｐｒｏＮａｉｖｅ（リプロセル社製）、ＮａiｖｅＣｕｌｔ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＲＳｅＴ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）ＡｌｐｈａＳＴＥＭ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ミネルバ バイオテクノロジー社製）等の培地で処理、培養することにより得ることができる。

【0144】

工程（ｉ）において用いられる培地は、血清培地であっても無血清培地であってもよい。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、工程（ｉ）において用いられる培地は、好ましくは無血清培地である。培地は、血清代替物を含んでいてもよい。

【0145】

工程（ｉ）における多能性幹細胞の培養時間は、続く工程（ａ）において形成され得る細胞凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲で特に限定されないが、通常０．５～１４４時間、好ましくは２～９６時間、より好ましくは６～７２時間、さらに好ましくは１２～６０時間、特に好ましくは１８～５４時間であり、例えば４８時間である。すなわち、工程（ａ）開始の０．５～１４４時間前、好ましくは１８～５４時間前に工程（ｉ）を開始し、工程（ｉ）を完了した後引き続き工程（ａ）が行われる。工程（ｉ）の実施の好ましい一態様として、例えば工程（ａ）開始の５４～４２時間前にＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を添加し、工程（ａ）開始の３０～１８時間前にＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質及びＳｈｈシグナル伝達経路作用物質を添加する。

【0146】

工程（ｉ）の好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、ｂＦＧＦを含有する無血清培地中で、接着培養する。当該接着培養は、好ましくはラミニン５１１、ラミニン５１１のＥ８フラグメント又はビトロネクチンで表面をコーティングした培養器材中で実施される。当該接着培養は、好ましくはフィーダーフリー培地としてＳｔｅｍＦｉｔを用いて実施される。

【0147】

工程（ｉ）の好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、ｂＦＧＦを含有する無血清培地中で、浮遊培養する。当該浮遊培養では、ヒト多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞の凝集体を形成してもよい。

【0148】

工程（ｉ）及び後述する工程において、培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃であってもよく、好ましくは約３７℃である。ＣＯ_２濃度は、例えば約１％から約１０％であってもよく、好ましくは約５％である。

【0149】

本発明に係る製造方法に用いる多能性幹細胞の調製、並びに、工程（ｉ）及び以降の工程において、作業者間の手技の差による影響を排し、作業者に由来する異物等の混入を防止し、製造品質を安定させ、生産量を増大させる観点から、自動培養装置、自動培養ロボット、ラボオートメーション機器を用いることもまた好ましい。本発明の実施に用いることができる上記機器としては、例えば自動培養装置（パナソニック社製、川崎重工業社製、日立製作所社製、ｉＡＣＥ２（ＡＣＣ－２００））、及びＳＬＡＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ： Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ，２０２０，２４７２６３０３２０９７２１０９に記載のロボット（ロボティック・バイオロジー・インスティテュート株式会社製、ＬａｂＤｒｏｉｄ）等が挙げられるが、これらに限定されない。上記機器を用いた本発明の実施にあたり、当業者であれば本発明に記載の製造方法及び工程を、使用する機器向けに調節又は変更することができる。

【0150】

本発明に係る製造方法に用いる多能性幹細胞の調製、並びに、工程（ｉ）及び以降の工程において、製造品質を管理し安定させる観点から、製造物の中間評価を実施することもまた好ましい。上記中間評価は、製造中の細胞塊の一部を消費して実施する抜き取り検査、及び非侵襲的検査のいずれであってもよいが、好ましくは非侵襲的検査である。非侵襲的検査としては、例えば顕微鏡による光学観察、光干渉断層計（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＯＣＴ）による測定、培地交換時に回収した培地中に含まれる代謝物、核酸、分泌タンパク質の定量等の手法が挙げられる。顕微鏡による光学観察の一態様としては、例えば国際公開第２０１７／０９０７４１号に記載の方法等を用いて、細胞塊の表面に形成された上皮構造、上気道組織、鼻腔上皮、嗅上皮等を光学的に観察及び検出し、数値化して評価することが挙げられる。上記光学観察の評価基準は、例えば当業者による目視の判断、又は撮影した画像の機械学習によるモデル構築等の手法により適宜設定することができる。評価基準としては、例えば細胞塊の表面が上皮に覆われている面積の割合、表面の上皮の厚さ、表面の上皮の割合、細胞塊の周囲における死細胞又はデブリの量等が使用され得る。光干渉断層計を用いた評価手法としては、例えばＣｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ Ｅｓｔｉｅｒ（ＳＣＲＥＥＮホールディングス社製）を用いて断層画像、３Ｄイメージ等を取得し、細胞塊の断層面積、体積、真球度、面粗度、内部空洞体積、表面の上皮の厚さ等を定量することにより実施することができる。回収した培地を用いた解析としては、例えばエクソソーム解析、メタボロミクス解析等が実施可能である。

【0151】

＜工程（ａ）＞
工程（ａ）では、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の存在下で多能性幹細胞を培養する。

【0152】

Ｗｎｔシグナル伝達経路とは、Ｗｎｔファミリー・タンパク質をリガンドとし、主としてＦｒｉｚｚｌｅｄを受容体とするシグナル伝達経路である。当該シグナル経路としては、古典的Ｗｎｔ経路（ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｗｎｔ ｐａｔｈｗａｙ）、非古典的Ｗｎｔ経路（ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｗｎｔ ｐａｔｈｗａｙ）等が挙げられる。古典的Ｗｎｔ経路は、β－ｃａｔｅｎｉｎによって伝達される。非古典的Ｗｎｔ経路としては、ｐｌａｎａｒ ｃｅｌｌ ｐｏｌａｒｉｔｙ（ＰＣＰ）経路、Ｗｎｔ／ＪＮＫ経路、Ｗｎｔ／Ｃａｌｃｉｕｍ経路、Ｗｎｔ－ＲＡＰ１経路、Ｗｎｔ－Ｒｏｒ２経路、Ｗｎｔ－ＰＫＡ経路、Ｗｎｔ－ＧＳＫ３ＭＴ経路、Ｗｎｔ－ａＰＫＣ経路、Ｗｎｔ－ＲＹＫ経路、Ｗｎｔ－ｍＴＯＲ経路等が挙げられる。非古典的Ｗｎｔ経路では、Ｗｎｔ以外の他のシグナル伝達経路でも活性化される共通のシグナル伝達因子が存在するが、本発明ではそれらの因子もＷｎｔシグナル伝達経路の構成因子とし、それらの因子に対する阻害物質もＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に含まれる。

【0153】

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｗｎｔファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。当該阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該阻害物質として例えばＷｎｔのプロセシングと細胞外への分泌を阻害する物質、Ｗｎｔに直接作用する物質（例えばタンパク質、抗体、アプタマー等）、Ｗｎｔをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、Ｗｎｔ受容体とＷｎｔの結合を阻害する物質、Ｗｎｔ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。本実施形態において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、１）非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性、２）Ｗｎｔファミリータンパク質の細胞外分泌の阻害活性、３）Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅに対する阻害活性、４）ＲＯＲに対する阻害活性からなる群より選ばれる少なくとも１つの活性を有することが好ましい。

【0154】

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｆｒｉｚｚｌｅｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓＦＲＰ）クラスに属するタンパク質（ｓＦＲＰ１～５、Ｗｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ－１（ＷＩＦ－１）、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）クラスに属するタンパク質（Ｄｋｋ１～４、Ｋｒｅｍｅｎ）、ＡＰＣＤＤ１、ＡＰＣＤＤ１Ｌ、Ｄｒａｘｉｎファミリーに属するタンパク質、ＩＧＦＢＰ－４、Ｎｏｔｕｍ、ＳＯＳＴ／Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎファミリーに属するタンパク質等が挙げられる。

【0155】

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、当業者に周知の化合物を使用することができる。古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の阻害物質として例えばＦｒｉｚｚｌｅｄ阻害剤、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ（Ｄｖｌ）阻害剤、Ｔａｎｋｙｒａｓｅ（ＴＡＮＫ）阻害剤、カゼインキナーゼ１阻害剤、カテニン応答性転写阻害剤、ｐ３００阻害剤、ＣＲＥＢ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＢＰ）阻害剤、ＢＣＬ－９阻害剤、ＴＣＦ分解誘導薬（Ａｍ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１５；５（８）：２３４４－２３６０）等が挙げられる。非古典的Ｗｎｔ経路の阻害物質として、例えばＰｏｒｃｕｐｉｎｅ（ＰＯＲＣＮ）阻害剤、Ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）阻害剤、（ＴＧＦ－β－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＴＡＫ１）阻害剤、Ｎｅｍｏ－Ｌｉｋｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＮＬＫ）阻害剤、ＬＩＭ Ｋｉｎａｓｅ阻害剤、ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）阻害剤、Ｒａｃ阻害剤、ｃ－Ｊｕｎ ＮＨ ２－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）阻害剤、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ（ＰＫＣ）阻害剤、Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ ２（ＭｅｔＡＰ２）阻害剤、Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ阻害剤、ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ（ＮＦＡＴ）阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤等が挙げられる。また、作用機序は報告されていないが、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＫＹ０２１１１（Ｎ－（６－Ｃｈｌｏｒｏ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）、ＫＹ０３－Ｉ（２－（４－（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｕｔａｎａｍｉｄｅ）－６－Ｉｏｄｏｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）が挙げられる。これらの物質は単独で又は組み合わせて用いてもよい。本実施形態の一側面において、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、ＸＡＶ－９３９（３，５，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２－［４－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－４Ｈ－ｔｈｉｏｐｙｒａｎｏ［４，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｏｎｅ）、ＫＹ０２１１１、ＫＹ０３－Ｉ及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。

【0156】

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質であるＰＯＲＣＮ阻害剤は、小胞体に局在するアシル基転移酵素であるＰｏｒｃｕｐｉｎｅの活性を阻害する物質である。Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅはｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｙｌ－ＣｏＡを基質とし、Ｗｎｔファミリー・タンパク質間で保存されたモチーフ内セリン残基にパルミトレイン酸を付加する反応を触媒する酵素である。ＰＯＲＣＮ阻害剤は例えばＮａｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ６０７， ｐａｇｅｓ８１６－８２２ （２０２２）に記載の通り、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅの３３２番目のセリン残基と結合し、酵素活性を阻害する物質である。

【0157】

被験物質のＰＯＲＣＮ阻害剤としての活性は、例えばＪ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１５， ５８， １５， ５８８９－５８９９に記載のＷｎｔ３Ａを常時発現するＨＥＫ２９３－ＳＴＦ細胞を用いるルシフェラーゼレポーター系と、Ｗｎｔ３Ａを発現しないＨＥＫ２９３－ＳＴＦ／Ｗｎｔ細胞にＷｎｔを含有する馴化培地を用いるルシフェラーゼレポーター系を組み合わせた２重スクリーニング系により評価できる。被験物質がＰＯＲＣＮ阻害剤としての活性を有している場合は、細胞からのＷｎｔの分泌が阻害される一方で馴化培地中のＷｎｔの活性には影響しないので、Ｗｎｔ３Ａ常時発現細胞を使用する系ではレポーター活性が低下し、Ｗｎｔ含有馴化培地を使用する系では活性が低下しない。被験物質がＰＯＲＣＮ阻害剤以外の、例えば細胞内のＷｎｔシグナル伝達経路の下流因子であるＴａｎｋｙｒａｓｅ阻害活性等を有している場合は、Ｗｎｔ３Ａ常時発現細胞を使用する系及びＷｎｔ含有馴化培地を使用する系のいずれでもレポーター活性が低下する。あるいは、被験物質のＰＯＲＣＮ阻害剤としての活性は、Ｗｎｔ３Ａを常時発現するＨＥＫ２９３－ＳＴＦ細胞等の細胞を被験物質で処理した際の培地中に分泌されたＷｎｔ量を、ＥＬＩＳＡ等の手法により定量・比較することによっても、測定することができる。

【0158】

ＰＯＲＣＮ阻害剤として例えばＩＷＰ－２（Ｎ－（６－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２－［（３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－４－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｔｈｉｏ］－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－３（２－［［３－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－４－ｏｘｏｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｔｈｉｏ］－Ｎ－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－４（Ｎ－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２－［［３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－３－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－ｏｘｏｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｔｈｉｏ］－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－Ｌ６（Ｎ－（５－ｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－２－［（３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－４－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｔｈｉｏ］－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－１２（Ｎ－（６－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２－［（３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－３，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－４－ｏｘｏｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｔｈｉｏ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－Ｏ１（１Ｈ－１，２，３－Ｔｒｉａｚｏｌｅ－１－ａｃｅｔａｍｉｄｅ，５－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－（５－ｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－４－（４－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－）、ＩＷＰ－２９ （Ｎ－（４－ｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－｛［４－ｐｈｅｎｙｌ－５－（ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－４Ｈ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌ－３－ｙｌ］ｓｕｌｆａｎｙｌ｝ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＬＧＫ－９７４（２－（２’，３－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，４’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎ－５－ｙｌ）－Ｎ－（５－（ｐｙｒａｚｉｎ－２－ｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ｗｎｔ－Ｃ５９（２－［４－（２－Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－［４－（ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＥＴＣ－１３１、ＥＴＣ－１５９（１，２，３，６－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１，３－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，６－ｄｉｏｘｏ－Ｎ－（６－ｐｈｅｎｙｌ－３－ｐｙｒｉｄａｚｉｎｙｌ）－７Ｈ－ｐｕｒｉｎｅ－７－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＧＮＦ－１３３１（Ｎ－（６－ｍｅｔｈｏｘｙ－１，３－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２－［（４－ｐｒｏｐｙｌ－５－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌ－３－ｙｌ）ｓｕｌｆａｎｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＧＮＦ－６２３１（Ｎ－［５－（４－Ａｃｅｔｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］－２’－ｆｌｕｏｒｏ－３－ｍｅｔｈｙｌ［２，４’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ］－５－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ｐｏｒｃｎ－ＩＮ－１（Ｎ－［［５－ｆｌｕｏｒｏ－６－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］－９Ｈ－ｃａｒｂａｚｏｌｅ－２－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＷＩＣ１（ Ｎ－［４－（４－Ｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－２－ｏｘｏ－２Ｈ－１－ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＲＸＣ００４、ＣＧＸ１３２１、ＡＺＤ５０５５及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は組み合わせて用いてもよい。またＰＯＲＣＮ阻害剤として、例えばＵＳ９０４５４１６Ｂ２、ＷＯ２０１３１６９６３１Ａ２、ＵＳ９７８３５５０Ｂ２、ＷＯ２０１６／０５５７８６等に、Ｗｎｔ調節剤又はＰＯＲＣＮ阻害剤として記載されている化合物を用いてもよい。

【0159】

ＪＮＫ阻害剤としては、例えばＪＮＫ－ＩＮ－８（（Ｅ）－３－（４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｂｕｔ－２－ｅｎａｍｉｄｏ）－Ｎ－（３－ｍｅｔｈｙｌ－４－（（４－（ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＳＰ６００１２５（Ａｎｔｈｒａ［１－９－ｃｄ］ｐｙｒａｚｏｌ－６（２Ｈ）－ｏｎｅ）、ＤＢ０７２６８（２－［［２－［（３－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｔａｎｚｉｓｅｒｔｉｂ（ｔｒａｎｓ－４－［［９－［（３Ｓ）－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－３－ｆｕｒａｎｙｌ］－８－［（２，４，６－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－９Ｈ－ｐｕｒｉｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｌ）、Ｂｅｎｔａｍａｐｉｍｏｄ（１，３－Ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）［２－［［４－［（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｂｅｎｚｙｌ］ｏｘｙ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、ＴＣＳ ＪＮＫ ６ｏ（Ｎ－（４－Ａｍｉｎｏ－５－ｃｙａｎｏ－６－ｅｔｈｏｘｙ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－２，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＳＵ３３２７（５－［（５－Ｎｉｔｒｏ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）ｔｈｉｏ］－１，３，４ｔｈｉａｄｉａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ）、ＣＥＰ１３４７（（９Ｓ，１０Ｒ，１２Ｒ）－５－１６－Ｂｉｓ［（ｅｔｈｙｌｔｈｉｏ）ｍｅｔｈｙｌ］－２，３，９，１０，１１，１２－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙ－９－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｏｘｏ－９，１２－ｅｐｏｘｙ－１Ｈ－ｄｉｉｎｄｏｌｏ［１，２，３－ｆｇ：３’，２’，１’－ｋｌ］ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４－ｉ］［１，６］ｂｅｎｚｏｄｉａｚｏｃｉｎｅ－１０－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ｃ－ＪＵＮ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＡＥＧ３４８２（６－Ｐｈｅｎｙｌｉｍｉｄａｚｏ［２，１－ｂ］－１，３，４－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｅ－２－ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ＴＣＳ ＪＮＫ ５ａ（Ｎ－（３－Ｃｙａｎｏ－４，５，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｅｎｙｌ－２－ｙｌ）－１－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＢＩ－７８Ｄ３（４－（２，３－Ｄｉｈｙｄｒｏ－１，４－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎ－６－ｙｌ）－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－５－［（５－ｎｉｔｒｏ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）ｔｈｉｏ］－３Ｈ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌ－３－ｏｎｅ）、ＩＱ－３（１１Ｈ－Ｉｎｄｅｎｏ［１，２－ｂ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－１１－ｏｎｅ Ｏ－（２－ｆｕｒａｎｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）ｏｘｉｍｅ）、ＳＲ ３５７６（３－［４－［［［（３－Ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－１－ｙｌ］－Ｎ－（３，４，５－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＩＱ－１Ｓ（１１Ｈ－Ｉｎｄｅｎｏ［１，２－ｂ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－１１－ｏｎｅ ｏｘｉｍｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ）、ＪＩＰ－１（１５３－１６３）、ＣＣ－４０１（３－［３－［２－（１－Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］－５－（１Ｈ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌ－５－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がＪＮＫ阻害剤としての活性を有することは、例えばＪ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０２０； ３５（１）： ５７４－５８３に記載されており、当業者にとって公知である。

【0160】

Ｒａｃ阻害剤としては、例えばＥＨＴ１８６４（５－（５－（７－（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎ－４－ｙｌｔｈｉｏ）ｐｅｎｔｙｌｏｘｙ）－２－（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）－４Ｈ－ｐｙｒａｎ－４－ｏｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＮＳＣ２３７６６（Ｎ６－［２－［［４－（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－１－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－６－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］－２－ｍｅｔｈｙｌ－４，６－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＥＨｏｐ－０１６（Ｎ４－（９－Ｅｔｈｙｌ－９Ｈ－ｃａｒｂａｚｏｌ－３－ｙｌ）－Ｎ２－［３－（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ］－２，４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、１Ａ－１１６（Ｎ－（３，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ’－［２－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ＺＣＬ２７８（２－（４－ｂｒｏＭｏ－２－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）－Ｎ－（４－（Ｎ－（４，６－ｄｉＭｅｔｈｙｌｐｙｒｉＭｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｓｕｌｆａＭｏｙｌ）ｐｈｅｎｙｌｃａｒｂａＭｏｔｈｉｏｙｌ）ａｃｅｔａＭｉｄｅ）、ＭＢＱ－１６７（９－ｅｔｈｙｌ－３－（５－ｐｈｅｎｙｌ－１Ｈ－１，２，３－ｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ）－９Ｈ－ｃａｒｂａｚｏｌｅ）、ＫＲｐｅｐ－２ｄ（ａｃｔｉｎｉｕｍ；［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－［［（３Ｒ，８Ｒ，１１Ｓ，１４Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ，２９Ｓ，３２Ｓ，３５Ｓ，３８Ｓ）－８－［［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－［［（２Ｓ）－１－ａｍｉｎｏ－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ｃａｒｂａｍｏｙｌ］－２９－［（２Ｒ）－ｂｕｔａｎ－２－ｙｌ］－２０－（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－２６－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－２３，３２－ｂｉｓ［（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－３５－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）－２，１０，１３，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７－ｄｅｃａｏｘｏ－１１－ｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ－５，６－ｄｉｔｈｉａ－１，９，１２，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６－ｄｅｃａｚａｔｒｉｃｙｃｌｏ［３６．３．０．０１４，１８］ｈｅｎｔｅｔｒａｃｏｎｔａｎ－３－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｚａｎｉｄｅ）、ＡＲＳ－８５３（１－［３－［４－［２－［［４－Ｃｈｌｏｒｏ－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－（１－ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］－１－ａｚｅｔｉｄｉｎｙｌ］－２－ｐｒｏｐｅｎ－１－ｏｎｅ）、Ｓａｌｉｒａｓｉｂ（２－（（（２Ｅ，６Ｅ）－３，７，１１－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃａ－２，６，１０－ｔｒｉｅｎ－１－ｙｌ）ｔｈｉｏ）ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＭＬ１４１（４－（５－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｐｈｅｎｙｌ－４，５－ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。上記の化合物等がＲａｃ阻害剤としての活性を有することは、例えばＣａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１８， ７８．１２： ３１０１－３１１１に記載されており、当業者にとって公知である。

【0161】

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＰＯＲＣＮ阻害剤、ＫＹ０２１１１及びＫＹ０３－Ｉからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＰＯＲＣＮ阻害剤を含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、Ｗｎｔの非古典的Ｗｎｔ経路への阻害活性を有する物質を含むこともまた好ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、より好ましくはＷｎｔ／Ｐｌａｎａｒ Ｃｅｌｌ Ｐｏｌａｒｉｔｙ（ＰＣＰ）経路への阻害活性を有する物質を含む。本発明で用いられるＰＯＲＣＮ阻害剤は、好ましくはＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＩＷＰ－１２、ＬＧＫ－９７４、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ＥＴＣ－１５９及びＧＮＦ－６２３１からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＩＷＰ－２又はＷｎｔ－Ｃ５９を含み、さらに好ましくはＩＷＰ－２を含む。

【0162】

本実施形態の一側面において、前記Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質が、１）非古典的Ｗｎｔ経路に対する阻害活性を有し、前記阻害活性がＰｏｒｃｕｐｉｎｅによる標的タンパク質のアシル化又はパルミトイル化に対する阻害活性であり、
前記阻害活性を有する物質は、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＩＷＰ－１２、ＩＷＰ－Ｏ１、ＬＧＫ－９７４、Ｗｎｔ－Ｃ５９、ＥＴＣ－１３１、ＥＴＣ－１５９、ＧＮＦ－１３３１、ＧＮＦ－６２３１、Ｐｏｒｃｎ－ＩＮ－１、ＲＸＣ００４、ＣＧＸ１３２１、ＡＺＤ５０５５及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含むことが好ましい。

【0163】

培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で、用いる物質に応じて適宜設定することが可能である。上気道組織を構成する細胞の製造効率向上の観点からは、例えばＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質としてＰＯＲＣＮ阻害剤の１種であるＩＷＰ－２を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｎＭ～約５０μＭであり、好ましくは約１０ｎＭ～約３０μＭであり、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約１０μＭであり、最も好ましくは約０．５μＭである。ＰＯＲＣＮ阻害剤の１種であるＷｎｔ－Ｃ５９を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｐＭ～約１μＭであり、好ましくは約１００ｐＭ～約５００ｎＭであり、より好ましくは約５０ｎＭである。ＫＹ０２１１１を用いる場合は、その濃度は通常約１０ｎＭ～約５０μＭであり、好ましくは約１０ｎＭ～約３０μＭであり、より好ましくは約１００ｎＭ～約１０μＭであり、さらに好ましくは約５μＭである。上記以外のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記の濃度と同等のＷｎｔシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として効果は、当業者であれば例えばＮａｔ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２００９ Ｆｅｂ； ５（２）： １００－１０７に記載のＬ－Ｗｎｔ－ＳＴＦ細胞を用いた抗リン酸化ＬＲＰ－６、抗リン酸化Ｄｖｌ、抗β－Ｃａｔｅｎｉｎ抗体によるウエスタンブロット、ルシフェラーゼレポーターアッセイ等の手法により測定できる。ＰＯＲＣＮ阻害剤としての効果は、当業者であれば例えばＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌｕｍｅ ９， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ４７３９ （２０１９）に記載のヒト皮膚リンパ管内皮細胞（ＨＤ－ＬＥＣ）を用いたＣｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ／ｓｃｒａｔｃｈ ａｓｓａｙ等の手法により測定可能である。

【0164】

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の添加時期は、通常工程（ａ）の多能性幹細胞の培養開始より４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは培養開始と同時である。

【0165】

工程（ａ）の培地中には、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質がさらに存在することが好ましい。工程（ａ）において用いられるＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としては工程（ｉ）で例示したものと同じものが用いられ得る。工程（ｉ）及び工程（ａ）のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は同一であっても異なっていてもよい。本願の工程（ａ）にて用いられるＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質としては、好ましくはＳＢ４３１５４２、ＲｅｐＳｏｘ、乃至ＳＢ４３１５４２とＲｅｐＳｏｘの併用である。

【0166】

培地中のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＴＧＦβ伝達経路阻害物質としてＳＢ４３１５４２を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約１００μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用される。ＴＧＦβ伝達経路阻害物質としてＲｅｐＳｏｘを用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約１００μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用される。また、ＳＢ４３１５４２及びＲｅｐＳｏｘ以外のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＳＢ４３１５４２及びＲｅｐＳｏｘと同等のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。本発明の好ましい一態様として、ＳＢ４３１５４２とＲｅｐＳｏｘを同時に添加して工程（ａ）を実施する場合は、例えばＳＢ４３１５４２を約１μＭ、ＲｅｐＳｏｘを約１μＭ添加する。

【0167】

工程（ａ）及び以降の工程において、中内胚葉への分化を抑制し、プラコード領域及び上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ １（ＴＡＫ１）に対する阻害物質を添加することもまた好ましい。ＴＡＫ１は、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターロイキン１（ＩＬ－１）、ＴＮＦ－α等により活性化されるシグナル伝達を媒介する、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）ファミリーのセリンスレオニンタンパク質キナーゼである。

【0168】

ＴＡＫ１阻害物質は、ＴＡＫ１が媒介するシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。ＴＡＫ１阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＴＡＫ１と基質の結合を阻害する物質、ＴＡＫ１のリン酸化を阻害する物質、ＴＡＫ１の脱リン酸化を促進する物質、ＴＡＫ１の転写又は翻訳を阻害する物質、ＴＡＫ１の分解を促進する物質等が挙げられる。

【0169】

ＴＡＫ１阻害物質として、例えば（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ（（３Ｓ，５Ｚ，８Ｓ，９Ｓ，１１Ｅ）－３，４，９，１０－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－８，９，１６－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ－１４－ｍｅｔｈｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－２－ｂｅｎｚｏｘａｃｙｃｌｏｔｅｔｒａｄｅｃｉｎ－１，７（８Ｈ）－ｄｉｏｎｅ）、Ｎ－Ｄｅｓ（ａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）ＡＺ－ＴＡＫ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（３－Ａｍｉｎｏ－５－［４－（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－２－ｔｈｉｏｐｈｅｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｔａｋｉｎｉｂ（Ｎ１－（１－Ｐｒｏｐｙｌ－１Ｈ－ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）－１，３－ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＮＧ２５（Ｎ－［４－［（４－Ｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－３－（１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌｏｘｙ）－ｂｅｎｚａｍｉｄｅ ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）及びこれらの誘導体、類縁体が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。

【0170】

ＴＡＫ１阻害物質は、好ましくは（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌである。工程（１）におけるＴＡＫ１阻害物質として（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌを用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約２５μＭ、さらに好ましくは約５００ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用される。また、（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ以外のＴＡＫ１阻害物質を使用する場合、上記濃度の（５Ｚ）－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌと同等のＴＡＫ１阻害活性を示す濃度で用いられることが好ましい。ＴＡＫ１阻害物質としての活性は、当業者であれば例えばＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００３ Ｍａｙ １６；２７８（２０）：１８４８５－９０に記載のキナーゼアッセイ等の手法により決定可能である。

【0171】

製造する細胞塊に含まれる嗅上皮幹細胞及びその前駆細胞の割合を制御する観点から、上記ＴＡＫ１阻害物質は、工程（ａ）及び以降の工程の任意の段階で添加することができる。一態様として、得られた細胞集団における嗅上皮を構成する細胞の割合を増加させることを企図するのであれば、工程（ａ）の開始と同時にＴＡＫ１阻害物質を添加することが好ましい。得られた細胞集団における上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の割合を増加させることを企図するのであれば、後述する工程（ｃ）の開始と同時、又は工程（ｃ）の開始から一定期間以内、例えば工程（ｃ）の開始から１４日間以内にＴＡＫ１阻害物質を添加することが好ましい。

【0172】

工程（ａ）において用いられる培地は、上記定義の項で記載したようなものである限り特に限定されない。工程（ａ）において用いられる培地は血清培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。調製の煩雑さを回避するには、例えば市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約３０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。無血清培地としては、例えばＩＭＤＭとＦ－１２の１：１の混合液に５％ＫＳＲ、４５０μＭ １－モノチオグリセロール及び１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地、又はＧＭＥＭに５％～２０％ＫＳＲ、ＮＥＡＡ、ピルビン酸及び２－メルカプトエタノールが添加された培地が挙げられる。

【0173】

工程（ａ）の開始時において、細胞は接着状態又は浮遊状態のいずれでもよい。好ましい一態様として、多能性幹細胞を単一細胞に分散させた後に再凝集させ、浮遊状態の細胞凝集体を形成させる。このために、工程（ａ）の開始前に、工程（ｉ）で得られた多能性幹細胞を単一細胞に分散する操作（工程（ｉｉ）ともいう。）を行うことが好ましい。分散させる操作により得られた「分散された細胞」は、好ましくは単一細胞であるが、例えば２以上１００以下の少数の細胞からなる細胞の塊を含んでもよく、２以上５０以下の細胞からなる細胞の塊を含んでもよい。「分散された細胞」は、例えば単一細胞を７割以上及び細胞の塊を３割以下含んでいてもよく、好ましくは単一細胞を８割以上及び細胞の塊を２割以下含む。別の一態様として、多能性幹細胞を単一細胞に分散させた後に細胞接着性の培養器材へと播種し、接着状態で培養を実施してもよい。

【0174】

多能性幹細胞を分散させる方法としては、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられ、これらの処理を単独で又は組み合わせて行ってもよい。細胞を分散させる方法としては、好ましくは細胞保護剤添加処理と同時に細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。

【0175】

細胞保護剤添加処理に用いられる細胞保護剤としては、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＲＯＣＫ）阻害物質、ミオシン阻害物質、ポリアミン類、統合的ストレス応答（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ＩＳＲ）阻害剤、カスパーゼ阻害剤、細胞接着促進物質、血清、又は血清代替物等を挙げることができる。好ましい細胞保護剤としては、ＲＯＣＫ阻害物質が挙げられる。分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒトの多能性幹細胞）の細胞死を抑制するために、ＲＯＣＫ阻害物質を第一工程の培養開始時から添加することは好ましい。ＲＯＣＫ阻害物質としては、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－４－（１－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）（１－（５－Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｈ－１１５２（５－［［（２Ｓ）－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－１，４－ｄｉａｚｅｐｉｎ－１－ｙｌ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＨＡ－１１００（Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ）（［１－（１－Ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｃｈｒｏｍａｎ １（（３Ｓ）－Ｎ－［２－［２－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ］－４－（１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－６－ｍｅｔｈｏｘｙ－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｃｈｒｏｍｅｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｂｅｌｕｍｏｓｕｄｉｌ（ＫＤ０２５、２－［３－［４－［（１Ｈ－Ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎ－２－ｙｌ］ｐｈｅｎｏｘｙ］－Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＨＳＤ１５９０（［２－Ｍｅｔｈｏｘｙ－３－（４，５，１０－ｔｒｉａｚａｔｅｔｒａｃｙｃｌｏ［７．７．０．０２，６．０１２，１６］ｈｅｘａｄｅｃａ－１（９），２（６），３，７，１０，１２（１６）－ｈｅｘａｅｎ－１１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｂｏｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＲＴ００６６８５４（（Ｓ）－３－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ１－（２－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏ［４，５］ｔｈｉｅｎｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｅ－１，２－ｄｉａｍｉｎｅ）、ＲＫＩ１４４７（１－（３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）－３－（４－（ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｕｒｅａ）、Ｒｉｐａｓｕｄｉｌ（４－Ｆｌｕｏｒｏ－５－［［（２Ｓ）－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－１，４－ｄｉａｚｅｐｉｎ－１－ｙｌ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＧＳＫ２６９９６２Ａ（Ｎ－［３－［２－（４－ａｍｉｎｏ－１，２，５－ｏｘａｄｉａｚｏｌ－３－ｙｌ）－１－ｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｐｙｒｉｄｉｎ－６－ｙｌ］ｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－４－（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＧＳＫ４２９２８６Ａ（Ｎ－（６－ｆｌｕｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）－２－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｏｘｏ－４－（４－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）－１，４，５，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｙ－３３０７５（（Ｒ）－４－（１－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－Ｎ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＬＸ７１０１（Ｎ，Ｎ－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｃａｒｂａｍｉｃ ａｃｉｄ ３－［［［４－（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）－１－（５－ｍｅｔｈｙｌ－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ］ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｈｅｎｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ＡＴ１３１４８（（ａｌｐｈａＳ）－ａｌｐｈａ－（Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）－ａｌｐｈａ－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｍｅｔｈａｎｏｌ）、ＳＡＲ４０７８９９（６－（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌｏｘｙ）ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎ－１（２Ｈ）－ｏｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＧＳＫ１８０７３６Ａ（４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）－６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｈｙｄｒｏｘｙｆａｓｕｄｉｌ（１－（１－ｈｙｄｒｏｘｙ－５－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ，ＨＣｌ）、ｂｄｐ５２９０（４－Ｃｈｌｏｒｏ－１－（４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）－Ｎ－［３－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ｓｒ－３６７７（Ｎ－［２－［２－（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｏｘｙ］－４－（１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－１，４－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｉｎ－２－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＣＣＧ－２２２７４０（Ｎ－（４－Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－１－（３－（ｆｕｒａｎ－２－ｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ）ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＲＯＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－２（Ｎ－［（１Ｒ）－１－（３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］－４－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｒｈｏ－Ｋｉｎａｓｅ－ＩＮ－１（Ｎ－［１－［（４－ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ］－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－５－ａｍｉｎｅ）、ＺＩＮＣ００８８１５２４（Ｎ－（４，５－ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈｏ［１，２－ｄ］ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２－（３，４－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＳＢ７７２０７７Ｂ（（３Ｓ）－１－［［２－（４－Ａｍｉｎｏ－１，２，５－ｏｘａｄｉａｚｏｌ－３－ｙｌ）－１－ｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｃ］ｐｙｒｉｄｉｎ－７－ｙｌ］ｃａｒｂｏｎｙｌ］－３－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｖｅｒｏｓｕｄｉｌ（Ｎ－（１，２－Ｄｉｈｙｄｒｏ－１－ｏｘｏ－６－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）－ａｌｐｈａ－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－３－ｔｈｉｏｐｈｅｎｅａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＧＳＫ－２５（４－（４－ｃｈｌｏｒｏ－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－（２－ｃｈｌｏｒｏｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－１－（６－ｆｌｕｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）－６－ｍｅｔｈｙｌ－４Ｈ－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）及びこれらの誘導体等を挙げることができる。細胞接着促進物質としては、例えばアドへサミン及びアドヘサミン－ＲＧＤＳ誘導体（長瀬産業社製）等が挙げられる。細胞保護剤としては、調製済みの細胞保護剤を用いることもできる。調製済みの細胞保護剤としては、例えばＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、ＣｌｏｎｅＲ、ＣｌｏｎｅＲ２（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等が挙げられる。これらの物質は単独で又は組み合わせて用いてもよい。工程（ａ）において、細胞保護剤としてＲＯＣＫ阻害物質であるＹ－２７６３２を添加する場合は、通常約１０ｎＭ～約１０ｍＭ、好ましくは約１００ｎＭ～約１ｍＭ、より好ましくは約１μＭ～約１００μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。工程（ａ）において、細胞保護剤としてＲＯＣＫ阻害物質であるＣｈｒｏｍａｎ １を添加する場合は、通常約１０ｐＭ～約１ｍＭ、好ましくは約１００ｐＭ～約１００μＭ、より好ましくは約１ｎＭ～約１０μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。細胞保護剤としてＹ－２７６３２及びＣｈｒｏｍａｎ １以外の物質を用いる場合は、例えばＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ２５， ｐａｇｅｓ６８１－６８６ （２００７）に記載のヒトＥＳ細胞によるコロニー形成アッセイ等により添加する濃度を決定することができる。

【0176】

細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びパパイン等の酵素、並びに、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤の少なくとも１つを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えばＴｒｉｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ、ＴｒｉｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等を用いることもできる。工程（ｉ）の後に得られた多能性幹細胞の工程（ｉｉ）の処理における好ましい細胞分散液は、５ｍＭのＥＤＴＡを添加したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）であるが、これに限定されない。

【0177】

機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。分散された細胞は上記培地中に懸濁される。

【0178】

多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば多能性幹細胞のコロニーをＲＯＣＫ阻害物質の存在下で、エチレンジアミン四酢酸又はＡｃｃｕｍａｘで処理し、さらにピペッティングにより分散させる方法が挙げられる。

【0179】

工程（ａ）において浮遊培養を実施する場合は、分散された多能性幹細胞の懸濁液を非細胞接着性の培養器材中に播種する。培養器材が非接着性である場合、細胞は浮遊培養され、複数の多能性幹細胞が集合して細胞凝集体を形成する。

【0180】

浮遊培養する際、分散された多能性幹細胞を、１０ｃｍディッシュのような比較的大きな培養器材に播種することにより、１つの培養器材中に複数の細胞凝集体を同時に形成させてもよい。一方、細胞凝集体ごとの大きさのばらつきを生じにくくする観点からは、例えば非細胞接着性の９６ウェルマイクロプレートのようなマルチウェルプレート（Ｕ底、Ｖ底）の各ウェルに一定数の分散された多能性幹細胞を播種することが好ましい。これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルに１個の細胞凝集体を形成させることができる。例えば培養器材の表面に超親水性のポリマーをコートする等の加工により培養器材を非細胞接着性とすることができる。非細胞接着性のマルチウェルプレートとしては、例えばＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６Ｖ底プレート（ＭＳ－９０９６Ｖ、住友ベークライト社製）等が挙げられる。より迅速に細胞凝集体を形成させるために遠心操作を行ってもよい。各ウェルで形成された細胞凝集体を複数のウェルから回収することにより、均一な細胞凝集体の集団を得ることができる。細胞凝集体が均一であれば、その後の工程において、ウェルごと及び反復実験ごとの製造効率をより安定させることができ、より再現性よく上気道組織を構成する細胞を製造することができる。

【0181】

分散された多能性幹細胞から細胞凝集体を形成させるための別の態様としては、一つのウェルが複数のマイクロウェルに分割され、２つ以上の細胞塊が形成される培養器材を用いる方法が挙げられる。言い換えると、本実施形態の一側面において、前記工程（ａ）、前記工程（ｂ）前記工程（ｃ）のいずれか一つ以上の任意の工程の浮遊培養を、少なくとも１つのウェルが形成されている培養器材中で実施し、前記ウェルは、複数のマイクロウェルに分割されていて、前記マイクロウェルの１つにつき、１つの細胞塊が形成されるように浮遊培養を実施し、１つのウェルにつき分割されたマイクロウェルに相当する数の細胞塊を調製してもよい。上記マイクロウェルとして、底面に細胞が一ヶ所に沈降して凝集体の形成が促進されるすり鉢、下向きの四角錐、凹状等の加工、グリッド、若しくは隆起等が複数形成されている培養器材、又は、凝集体を形成しやすいように、底面の一部のみに細胞が接着可能な加工が施されている培養器材等を用いることもできる。マイクロウェルを有する培養器材のウェル一つ当たりの培養面積は特に限定されないが、細胞塊を効率よく生産する観点から、好ましくは底面積が１ｃｍ^２（４８ウェルプレート相当）より大きく、より好ましくは２ｃｍ^２（２４ウェルプレート相当）より大きく、さらに好ましくは４ｃｍ^２（１２ウェルプレート相当）より大きい。上記のような培養器材としては、例えば胚様体形成プレートＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＰＡＭＣＥＬＬ（ＡＮＫ社製）、スフェロイドマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ Ｐｌａｔｅ／Ｄｉｓｈ（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｉｘ社製）、Ｃｅｌｌ－ａｂｌｅ（東洋合成社製）、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＡＧＣテクノグラス社製）、ＳＰＨＥＲＩＣＡＬＰＬＡＴＥ ５Ｄ（水戸工業社製）、ＴＡＳＣＬ（シムスバイオ社製）、マイクロウェルバッグ（例、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０２２， １２．１： １－１１に記載のもの）等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0182】

分散された多能性幹細胞から細胞凝集体を形成させるための培養器材としては、各ウェル内に細胞凝集体が入ったままの状態でプレート全体の培地を一度に交換することが可能な三次元細胞培養容器を用いることもまた好ましい。このような三次元細胞培養容器としては、例えばＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６スリットウェルプレート（住友ベークライト社製）等が挙げられる。このプレートには９６ウェルのそれぞれの上部に培地が出入りできる細い開口部（スリット）が設けられている。スリットは細胞凝集体が通過しにくい幅に設定されているため、細胞凝集体同士の癒着を防止しながら、プレート全体の培地を一度に交換することができ、操作の効率性及び細胞凝集体の質を向上させることができる。

【0183】

工程（ａ）における多能性幹細胞の濃度（細胞の密度）は、細胞凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば９６ウェルマイクロウェルプレートを用いてヒト多能性幹細胞（例えば工程（ｉ）から得られたヒトｉＰＳ細胞）を浮遊培養する場合、１ウェルあたり通常約１×１０^３から約１×１０^５細胞、好ましくは約３×１０^３から約５×１０^４細胞、より好ましくは約４×１０^３から約２×１０^４細胞、さらに好ましくは約４×１０^３から約１．８×１０^４細胞、特に好ましくは約８×１０^３から約１．５×１０^４細胞となるように調製した液を各ウェルに添加し、プレートを静置して細胞凝集体を形成させる。例えば１ディッシュあたり約２６０個のマイクロウェルを有する培養器材であるＥＺＳＰＨＥＲＥ ＳＰ ディッシュ３５ｍｍ Ｔｙｐｅ９０５を用いてヒト多能性幹細胞（例えば工程（ｉ）から得られたヒトｉＰＳ細胞）を浮遊培養する場合、１ディッシュあたり通常約１×１０^４から約１×１０^８細胞、好ましくは約３×１０^４から約５×１０^７細胞、より好ましくは約４×１０^４から約２×１０^７細胞、さらに好ましくは約４×１０^４から約１．６×１０^７細胞、特に好ましくは約８×１０^４から約１．２×１０^７細胞となるように調製した液をディッシュに添加し、ディッシュを静置して細胞凝集体を形成させる。例えば１ウェルあたり約１８００個のマイクロウェルを有する培養器材であるＡｇｇｒｅＷｅｌｌ ８００， ６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いてヒト多能性幹細胞（例えば工程（ｉ）から得られたヒトｉＰＳ細胞）を浮遊培養する場合、１ウェルあたり通常約１×１０^４から約１×１０^８細胞、好ましくは約３×１０^４から約５×１０^７細胞、より好ましくは約４×１０^４から約２×１０^７細胞、さらに好ましくは約４×１０^４から約１．６×１０^７細胞、特に好ましくは約８×１０^４から約１．２×１０^７細胞となるように調製した液を各ウェルに添加し、プレートを遠心して細胞凝集体を形成させる。細胞数は、血球計算盤乃至自動セルカウンター等で計数することによって求めることができる。

【0184】

細胞凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。分散された細胞が、細胞凝集体が形成されるに至るまでの工程は、細胞が集合する工程、及び集合した細胞が凝集体を形成する工程に分けられる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞が集合するまでは、例えばヒト多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞等）の場合には、好ましくは約２４時間以内、より好ましくは約１２時間以内である。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞凝集体が形成されるまでは、例えばヒト多能性幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞等）の場合には、好ましくは約７２時間以内、より好ましくは約４８時間以内である。細胞凝集体を形成するまでの時間は、細胞を凝集させる用具又は、遠心条件等を調整することにより適宜調節することが可能である。

【0185】

多能性幹細胞を迅速に集合させて細胞凝集体を形成させると、形成された細胞凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。細胞凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えばウェルの小さなプレート（例えばウェルの底面積が平底換算で０．１～２．０ｃｍ^２程度のプレート）又はマイクロポア等を用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、例えば２４ウェルプレート（面積が平底換算で１．８８ｃｍ^２程度）、４８ウェルプレート（面積が平底換算で１．０ｃｍ^２程度）、９６ウェルプレート（面積が平底換算で０．３５ｃｍ^２程度、内径６～８ｍｍ程度）、３８４ウェルプレートが挙げられる。好ましくは９６ウェルプレートが挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを上から見たときの底面の形状としては、多角形、長方形、楕円、真円が挙げられ、好ましくは真円が挙げられる。なお、本実施形態において「ウェルの底面の形状が真円である」とは、幾何学的な真円に限らず略真円の形状も含まれる。他の形状についても同様である。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを横から見たときの底面の形状としては、外周部が高く内部が低くくぼんだ構造であることが好ましく、例えばＵ底、Ｖ底、Ｍ底が挙げられ、好ましくはＵ底又はＶ底、最も好ましくはＶ底が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、細胞培養皿（例えば６０ｍｍ～１５０ｍｍディッシュ、カルチャーフラスコ）の底面に凹凸又はくぼみがあるものを用いてもよい。ウェルの小さなプレートの底面は、細胞非接着性の底面、好ましくは細胞非接着性コートした底面を用いるのが好ましい。

【0186】

細胞凝集体を形成させる別の手法として、立体印刷機、３Ｄプリンターを用いることもまた好ましい。分散された単一の細胞、若しくは複数の細胞から構成されるスフェロイドを、生体適合性を有するインク（バイオインク）に懸濁し、バイオ３Ｄプリンター（例えばＣｅｌｌｉｎｋ社製 ＢＩＯ Ｘ等）で出力する、又は、細胞集団をニードルに刺して積み上げる（サイフューズ社製 Ｓｐｉｋｅ等）といった手法により、所望の形態の細胞凝集体を調製することができる。

【0187】

細胞凝集体が形成されたことは、細胞凝集体のサイズ及び細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性、分化及び未分化マーカーの発現及びその均一性、分化マーカーの発現制御及びその同期性、並びに、分化効率の凝集体間の再現性等に基づき判断することが可能である。

【0188】

工程（ａ）の開始時において、好ましい一態様として、接着培養を実施する。工程（ｉ）後の培養器材上の多能性幹細胞をそのまま工程（ａ）に用いてもよいし、多能性幹細胞を工程（ｉｉ）の処理により単一細胞に分散させた後に再度接着性の培養器材に播種してもよい。多能性幹細胞の単一細胞への分散後の再播種を実施する際に、適切な細胞外マトリクス又は合成細胞接着分子を足場として培養器材の表面にコーティングしてもよい。上記足場により、表面をコーティングした培養器材中で、多能性幹細胞を接着培養できる。細胞外マトリクスは、好ましくはマトリゲル又はラミニンである。合成細胞接着分子としては、ポリ－Ｄ－リジン、ＲＧＤ配列等細胞接着性のドメインを含有する合成ペプチド等が挙げられる。工程（ａ）の接着培養における細胞の播種数としては、細胞接着性の平底９６ウェルプレートに播種する場合、１ウェルあたり通常約１×１０^１から約１×１０^６細胞、好ましくは約１×１０^２から約１×１０^５細胞、より好ましくは約２×１０^２から約５×１０^４細胞、さらに好ましくは約１×１０^３から約２×１０^４細胞、特に好ましくは約２×１０^３から約１×１０^４細胞である。上述の播種数となるように調製した液を各ウェルに添加し、接着培養を実施することが可能になる。異なる大きさの培養器材を用いる場合は、培養面積及び培地量に応じて上記細胞の播種数を適宜変更可能である。

【0189】

接着性の培養器材として、温度応答性細胞培養基材を用いることもまた好ましい。本願に記載の方法によって製造される細胞を含む接着性細胞は、一般に一定程度の疎水性表面に接着しやすく、親水性表面においては接着が阻害される性質を有している。このため、温度応答によって適度な疎水性から親水性へ、又はその逆方向に変化する表面を有する基材を用いることにより、接着細胞の表面への接着を温度変化により制御することが可能となる。その結果、タンパク質分解酵素又はキレート剤を用いることなく、細胞－細胞間の接着を保ったまま、例えば上皮細胞をシートのまま、上記培養器材から回収することが可能となる。上記のような性能を有する培養器材を一般に「温度応答性細胞培養基材」と称する。温度応答性細胞培養基材は、例えばポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）を表面に固定化することにより製造される。上記のような温度応答性細胞培養基材としては、例えばＵｐＣｅｌｌ（セルシード社製）、特許第５８４６５８４号公報に記載の器材等が挙げられる。

【0190】

接着性の培養器材として、マイクロパターンが施された培養器材を用いることもまた好ましい。培養器材上のマイクロパターンは、細胞接着性領域と細胞非接着性領域から構成することができ、細胞接着性領域で細胞が接着培養されることが好ましい。細胞接着性領域は、好ましくは細胞非接着性領域により同一表面上で囲われている。前記細胞接着性領域の形状は適宜設定可能であるが、例えば円形、楕円形、三角形、正方形、長方形、五角形、六角形、八角形、星形等の形態に設定することができる。細胞接着性領域の形状は好ましくは円形、正方形または長方形のいずれかであるが、これに限定されない。細胞接着性領域と細胞非接着性領域は、一つの培養器材上に単一の領域が形成されていてもよいし、複数個形成されていてもよい。前記細胞接着性領域は細胞接着性の処理（ガスプラズマ処理等）が実施されているか、細胞接着を促進する物質で処理されていることが好ましい。本態様における好ましい細胞接着促進物質は好ましくはラミニンであり、さらに好ましくはラミニン５１１ないし５２１であるが、これに限定されない。ラミニンは、Ｅ８断片であっても良い。前記細胞接着性領域は、前記温度応答性細胞培養基材であるか、温度応答性を有するポリマーによって処理されたものであっても良い。前記細胞非接着性領域は、細胞接着性の処理が実施されていない状態であるか、細胞接着を阻害する処理を実施されていることが好ましい。本態様における好ましい細胞接着阻害処理としては、例えば２－ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＭＰＣ）ポリマー、Ｐｏｌｙ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（Ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）等のコーティングによる超親水性処理、タンパク低吸着処理等が挙げられる。前記細胞接着性領域の面積は適宜設定可能であるが、例えば０．１ｃｍ^２から１００ｃｍ^２であり、好ましくは０．３ ｃｍ^２から８０ｃｍ^２であり、さらに好ましくは０．５ ｃｍ^２から６０ｃｍ^２であるが、これに限定されない。前記マイクロパターンを有する培養器材に播種する多能性幹細胞の細胞数は、細胞接着性領域の面積当たり例えば１×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２～１×１０^７ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２、好ましくは１×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２～１×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であるが、これに限定されない。

【0191】

マイクロパターンが施された培養器材としては、例えばＣＹＴＯＯｃｈｉｐ（ＣＹＴＯＯ社製）、ｉｂｉｄｉ Ｍｉｃｒｏｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ（ｉｂｉｄｉ社製）等が挙げられる。ＰＤＭＳ製モールドとマトリクス等を用いて培養器材を調製することもできる。または、細胞外マトリックス、細胞接着を促進する基質等でコートされた培養器材を例えば細胞プロセシング装置（Ｍｏｄｅｌ：ＣＰＤ－０１７、片岡製作所社製）等を用いてレーザー等で加工し、細胞接着性領域と細胞非接着性領域を任意の形状に作成してもよい。工程（ｉ）で得られた多能性幹細胞をマイクロパターンが施された培養器材上で培養する場合、例えば既報の方法を参照し実施することができる（Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１１（１１），２２２３－２２３２．）。

【0192】

培養器材が培地の灌流を行なうための流路（マイクロ流路）を有することも好ましく、工程（ａ）及びその後の工程において、灌流環境下で細胞を培養してもよい。このような培養器材をマイクロ流体チップともいう。培養器材（例えばマイクロ流体チップ）には、センサーを備えていてもよい。培養器材の流路には、バルブを備えていてもよい。培養器材は、本発明の製造方法において培養される細胞以外の細胞又は組織を培養する他の培養器材と流路により接続されていてもよい。これにより、上気道組織と他の細胞又は組織との相互作用を再現することができる。上気道組織と共培養する他の細胞又は組織としては、上気道組織の成長、分化、成熟、生存を促進する組織、例えば間葉系細胞、並びに、脳、頭頚部、血管、骨、筋肉、脂肪、甲状腺、肝臓、副腎、精巣、卵巣及び乳房の細胞及び組織等が挙げられるが、これらに限定されない。上気道組織と共培養する他の細胞は、細胞株、初代培養細胞、幹細胞、及び、幹細胞由来の分化した細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。培地の灌流の為の方法としては、例えばマグネティックスターラー、ペリスタルティックポンプ、シリンジポンプ、ダイアフラムバルブ等の使用が挙げられるが、これに限定されない。

【0193】

培養器材は、酸素又は培地を透過可能な膜（「物質透過性を有する膜」と記載する場合がある。）を有してもよい。培養器材は、化合物、増殖因子等の濃度勾配を形成可能であってもよい。上記膜は、例えば多孔質膜である。このような膜を有する培養器材においては、膜で隔てた一方で本発明の製造方法によって細胞を培養し、他方でそれ以外の細胞又は組織、フィーダー細胞などを培養することができる。これにより、上気道組織を構成する細胞又はその前駆細胞及びこれらを含む細胞集団と、他の細胞又は組織とをコンタミネーションさせることなく培養することができる。培養器材は、以降の工程で培養器材として用いてもよい。

【0194】

工程（ａ）及び以降の工程において、培地の交換操作を行う場合、例えば元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の３０～９０％程度、例えば４０～６０％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の３０～９０％、例えば４０～６０％程度）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の９０％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の９０％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。

【0195】

ある時点で、特定の成分を添加する場合、例えば終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度で含む新しい培地を半量程度加える操作（半量培地交換操作）を行ってもよい。ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば培地交換操作を、１日に複数回、好ましくは１時間以内に複数回（例えば２～３回）行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞又は細胞凝集体を別の培養容器に移してもよい。培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えばピペッター、ピペットマン（登録商標）、マルチチャンネルピペット、連続分注器等が挙げられる。例えば培養器材として９６ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルピペットを使ってもよい。

【0196】

工程（ａ）における培養の時間は、通常８時間～６日間程度、好ましくは１２時間～４８時間程度である。

【0197】

細胞の分化の方向性の制御、並びに、細胞又は組織の生存及び増殖を促進する観点から、工程（ａ）及び以降の工程のいずれか１つ以上の工程を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともできる。前述の通り、Ｗｎｔシグナル伝達経路として古典的Ｗｎｔ経路、非古典的Ｗｎｔ経路等が挙げられる。

【0198】

Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質とは、Ｗｎｔファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を活性化し得るものである限り限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、Ｗｎｔの自己分泌を促進する物質、Ｗｎｔを安定化させて分解を抑制する物質、Ｗｎｔの組換えタンパク質、Ｗｎｔの部分配列ペプチド及びその派生物又は誘導体、Ｗｎｔ受容体に作用し活性化させる物質、Ｗｎｔの細胞内シグナル伝達機構を活性化させる物質、Ｗｎｔの細胞内シグナル伝達因子及びその改変体（β－Ｃａｔｅｎｉｎ Ｓ３３Ｙ等）、並びに、Ｗｎｔ応答配列下流の遺伝子発現を活性化させる物質等を挙げることができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質として知られているタンパク質として、Ｗｎｔ、Ｒ－スポンジンが挙げられる。

【0199】

Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としてＷｎｔの組換えタンパク質を用いる場合は、由来は特に限定されず、対象の細胞に対し活性を有する限り各種生物由来のＷｎｔタンパク質を用いることができる。中でも、哺乳動物由来のＷｎｔタンパク質であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ等が挙げられる。より好ましくは、本発明に係る細胞集団の製造に用いられる多能性幹細胞と同種に由来する組換えタンパク質である。哺乳動物のＷｎｔタンパク質としては、例えばＷｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６等が挙げられるがこれらに限定されない。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ ｖｏｌｕｍｅ ８， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ９０ （２００９）に記載の通り、Ｗｎｔタンパク質のうち、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２Ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ８Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、及びＷｎｔ１０Ｂは、主としてＷｎｔ ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路を活性化させるＷｎｔシグナル伝達経路作用物質である。また、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ５Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、及びＷｎｔ１１は、主としてＷｎｔ ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路を活性化させるＷｎｔシグナル伝達経路作用物質である。本発明に係る細胞集団の製造において、Ｗｎｔタンパク質は、単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。本発明に係る細胞集団の製造に用いることができるＷｎｔの組換えタンパク質は、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、富士フイルム和光純薬社から入手が可能である。本発明に係る細胞集団の製造において、用いられるＷｎｔタンパク質は、好ましくはＷｎｔ ｃａｎｏｎｉｃａｌ経路を活性化させるＷｎｔシグナル伝達経路作用物質である。

【0200】

本発明に係る細胞集団の製造において、Ｗｎｔの組換えタンパク質を培地中で安定させ、活性を維持する物質を添加することもできる。上記のような活性を有する物質として、例えばアファミンが挙げられる。アファミンはアルブミンファミリーに属する糖タンパク質であり、疎水性の高いＷｎｔのタンパク質の凝集及び不活性化を抑制し、活性を維持することが知られている。アファミンの組換えタンパク質は、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手が可能である。アファミンとＷｎｔの組換えタンパク質との混合物は、ＭＢＬライフサイエンス社から入手が可能である。

【0201】

Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質として用いることができるＲ－スポンジンとしては、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３及びＲ－スポンジン４からなるＲ－スポンジンファミリーに属するタンパク質が挙げられる。Ｒ－スポンジンファミリーは、分泌タンパク質であり、例えばＮａｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ４８５， ｐａｇｅｓ１９５－２００ （２０１２）に記載の通り、細胞膜表面上のＷｎｔ受容体量を負に制御する７回膜貫通型ユビキチンリガーゼＺＮＲＦ／４３／ＲＮＦ４３の活性を阻害し、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化及び制御に関わる。本発明に係る細胞集団の製造において、Ｒ－スポンジンを複数種組み合わせて用いてもよい。本発明に係る細胞集団の製造に用いることができるＲ－スポンジンの組換えタンパク質は、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、富士フイルム和光純薬社から入手が可能である。

【0202】

Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としての活性を有する化合物として、例えばＧＳＫ３βに対する阻害活性を有する化合物、Ｗｎｔ脱アシル化酵素に対する阻害活性を有する化合物、ＡＡＫ１に対する阻害活性を有する化合物等が挙げられる。上記のような活性を有する化合物として、例えば塩化リチウム、ＳＧＣ ＡＡＫ１ １（Ｎ－（６－（３－（（Ｎ，Ｎ－ｄｉｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｍｏｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－３－ｙｌ）ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｆｏｘｙ ５（Ｎ－ｆｏｒｍｙｌ－Ｌ－ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ－Ｌ－ａｌｐｈａ－ａｓｐａｒｔｙｌ－ｇｌｙｃｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ－Ｌ－ａｌｐｈａ－ｇｌｕｔａｍｙｌ－Ｌ－ｌｅｕｃｉｎｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［２－［４－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（４－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＣＨＩＲ９８０１４（Ｎ６－［２－［［４－（２，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（１Ｈ－ｉＭｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２－ｐｙｒｉＭｉｄｉｎｙｌ］ａＭｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］－３－ｎｉｔｒｏ－２，６－ｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉａＭｉｎｅ）、ＴＷＳ１１９（３－［６－（３－ａｍｉｎｏ－ｐｈｅｎｙｌ）－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－Ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌｏｘｙ］－ｐｈｅｎｏｌ）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－２，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－（２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、ＢＩＯ（（２Ｚ，３Ｅ）－６－ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３－ｏｘｉｍｅ）、ＡＺＤ２８５８（３－Ａｍｉｎｏ－６－［４－［（４－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｎ－３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ－ｐｙｒａｚｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＡＺＤ１０８０（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－３－（５－（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－５－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＡＲ－Ａ０１４４１８（Ｎ－（４－Ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）－ｎ－（５－ｎｉｔｒｏ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｕｒｅａ）、ＴＤＺＤ－８（４－Ｂｅｎｚｙｌ－２－ｍｅｔｈｙｌ－１，２，４－ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ－３，５－ｄｉｏｎｅ）、ＬＹ２０９０３１４（７－（２，５－Ｄｉｈｙｄｒｏ－４－ｉｍｉｄａｚｏ［１，２－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ－２，５－ｄｉｏｘｏ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌ－３－ｙｌ）－９－ｆｌｕｏｒｏ－１，２，３，４－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－２－（１－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｙｒｒｏｌｏ［３，２，１－ｊｋ］［１，４］ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）、ＩＭ－１２（３－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｅｔｈｙｌａＭｉｎｏ）－１－Ｍｅｔｈｙｌ－４－（２－Ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ（［２，３－Ｂｉｉｎｄｏｌｉｎｙｌｉｄｅｎｅ］－２，３－ｄｉｏｎｅ）、Ｂｉｋｉｎｉｎ（４－（（５－Ｂｒｏｍｏ－２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ａｍｉｎｏ）－４－ｏｘｏｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、Ａ－１０７０７２２（１－（７－Ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎ－４－ｙｌ）－３－［６－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｕｒｅａ）、３Ｆ８（５－Ｅｔｈｙｌ－７，８－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４－ｃ］ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－１，３（２Ｈ）－ｄｉｏｎｅ）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－Ｂｒｏｍｏ－７，１２－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｉｎｄｏｌｏ［３，２－ｄ］［１］ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎ－６（５Ｈ）－ｏｎｅ）、１０Ｚ－Ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ（（４Ｚ）－４－（２－Ａｍｉｎｏ－１，５－ｄｉｈｙｄｒｏ－５－ｏｘｏ－４Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌｉｄｅｎｅ）－２－ｂｒｏｍｏ－４，５，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｃ］ａｚｅｐｉｎ－８（１Ｈ）－ｏｎｅ）、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（３－［１，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－３－（ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｎｏ）－２Ｈ－ｉｎｄｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ］－１，３－ｄｉｈｙｄｒｏ－２Ｈ－ｉｎｄｏｌ－２－ｏｎｅ）、ＮＳＣ ６９３８６８（１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［３，４－ｂ］ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－３－ａｍｉｎｅ）、ＴＣ－Ｇ ２４（Ｎ－（３－Ｃｈｌｏｒｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－５－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｏｌ－２－ａｍｉｎｅ）、ＴＣＳ ２００２（２－Ｍｅｔｈｙｌ－５－［３－［４－（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－５－ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｙｌ］－１，３，４－ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ）、ＴＣＳ ２１３１１（３－［５－［４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙ－２－Ｍｅｔｈｙｌ－１－ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］－２－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏＭｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－４－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、ＣＰ２１Ｒ７（３－（３－Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、ＢＭＬ－２８４（ＡＭＢＭＰ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｎ４－（１，３－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ－５－ｙｌｍｅｔｈｙｌ）－６－（３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２，４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＳＫＬ２００１（Ｎ－（３－（１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ）－５－（ｆｕｒａｎ－２－ｙｌ）ｉｓｏｘａｚｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＷＡＹ－２６２６１１（１－［４－（２－Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）－２－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ］－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｍｅｔｈａｎａｍｉｎｅ）、ＩＩＩＣ３ａ（９－Ｃａｒｂｏｘｙ－３－（ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）－６，７－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－１０－ｍｅｔｈｙｌ－３Ｈ－ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎ－１０－ｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）、Ｍｅｔｈｙｌ Ｖａｎｉｌｌａｔｅ、ＩＱ－１（２－［（４－Ａｃｅｔｙｌｐｈｅｎｙｌ）ａｚｏ］－２－（３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－３，３－ｄｉＭｅｔｈｙｌ－１（２Ｈ）－ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌｉｄｅｎｅ）ａｃｅｔａＭｉｄｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。

【0203】

工程（ａ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加しているが、作用点の異なるＷｎｔシグナル伝達経路作用物質とＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を併用することで、前述の複数あるＷｎｔシグナル伝達経路のうち特定の経路のみを活性化、あるいは阻害することができる。Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質は、工程（ａ）にて添加するＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の下流の因子に作用する物質であることが好ましい。添加するＷｎｔシグナル伝達経路作用物質が古典的Ｗｎｔ経路を活性化させる物質であることもまた好ましく、細胞内のＷｎｔシグナル伝達因子であるβカテニンの分解の阻害、安定化作用によりＷｎｔシグナル伝達経路を活性化させる物質であることがさらに好ましい。βカテニンの分解の阻害、安定化作用を有する物質としては、例えばＧＳＫ３阻害剤及びＢＭＬ－２８４、ＳＫＬ２００１等が挙げられる。添加するＷｎｔシグナル伝達経路作用物質がβカテニン応答性転写（β－ｃａｔｅｎｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＣＲＴ）を促進又は活性化させる物質であることもまた好ましい。

【0204】

ＧＳＫ３阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＴＷＳ１１９、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、ＡＺＤ１０８０、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＴＤＺＤ－８、ＬＹ２０９０３１４、ＩＭ－１２、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｂｉｋｉｎｉｎ、Ａ １０７０７２２、３Ｆ８、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、１０Ｚ－Ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ、ＮＳＣ ６９３８６８、ＴＣ－Ｇ ２４、ＴＣＳ ２００２、ＴＣＳ ２１３１１、ＣＰ２１Ｒ７及びこれらの誘導体等が挙げられる。

【0205】

好ましいＷｎｔシグナル伝達経路作用物質とＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせとして、ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤が挙げられる。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤を併用した場合、古典的Ｗｎｔ経路は活性化され、非古典的Ｗｎｔ経路は阻害される。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤とを併用した場合、ＧＳＫ３阻害剤は、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、及びＢＩＯからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＣＨＩＲ９９０２１を含む。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤とを併用した場合、ＰＯＲＣＮ阻害剤は、好ましくはＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、ＩＷＰ－Ｌ６、ＩＷＰ－１２、ＬＧＫ－９７４、ＥＴＣ－１５９、ＧＮＦ－６２３１、及びＷｎｔ－Ｃ５９からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＩＷＰ－２を含む。また、ＧＳＫ３阻害剤とＫＹ０２１１１又はその誘導体等とを組み合わせて用いてもよい。ＧＳＫ３阻害剤とは作用機序の異なるβカテニンの分解の阻害、安定化作用を有する物質としては例えばＢＭＬ－２８４、ＳＫＬ２００１が挙げられ、これら化合物又はその誘導体もＰＯＲＣＮ阻害剤、ＫＹ０２１１１又はその誘導体等と組み合わせて用いてもよい。さらに好ましいＷｎｔシグナル伝達経路作用物質とＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせとして、ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤及びＪＮＫ阻害剤とが挙げられる。ＧＳＫ３阻害剤とＰＯＲＣＮ阻害剤及びＪＮＫ阻害剤とを併用した場合、ＪＮＫ阻害剤は、好ましくはＪＮＫ－ＩＮ－８を含む。

【0206】

培地中のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。細胞塊内部における神経系細胞又は組織の生存及び増殖を促進する観点からは、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合は、通常約１０ｐＭ～約１０ｍＭ、好ましくは約１００ｐＭ～約１ｍＭ、より好ましくは約１ｎＭ～約１００μＭ、さらに好ましくは約１０ｎＭ～約３０μＭ、最も好ましくは約１００ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。また、ＣＨＩＲ９９０２１以外のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同等のＷｎｔシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路促進活性は、例えばＨＥＫ２９３細胞を用いたＴｏｐｆｌａｓｈレポーターアッセイによって決定することができる。

【0207】

工程（ａ）及び以降の工程において、嗅上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、プラコード領域への分化を促進する化合物を添加することもまた好ましい。上記のような作用を有する化合物として、例えば米国特許出願公開第２０１６／０３２６４９１号明細書に記載のＢＲＬ－５４４４３、Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ、Ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅ等が挙げられる。プラコード領域への分化を促進する化合物として、ＢＲＬ－５４４４３を用いる場合は通常１０ｎＭ～１００μＭの濃度で用いられ、Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅを用いる場合は通常１０ｎＭ～１００μＭの濃度で用いられ、Ｐａｒｔｈｅｎｏｌｉｄｅを用いる場合は通常１０ｎＭ～１００μＭの濃度で用いられる。

【0208】

＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で、工程（ａ）で培養した細胞を培養する。工程（ａ）で細胞を浮遊培養している場合は、工程（ｂ）でも引き続き形成された細胞凝集体を浮遊培養すればよい。工程（ａ）で細胞を接着培養している場合は、工程（ｂ）でも引き続き細胞を接着培養すればよい。工程（ａ）で細胞を浮遊培養した後、工程（ｂ）で接着培養してもよい。工程（ａ）で細胞を接着培養した後、工程（ｂ）で浮遊培養してもよい。

【0209】

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、並びに、ＢＭＰ部分ペプチド等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。生物学的活性の見地からのＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、マウス前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５、マウス頭蓋冠由来細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１、及びマウス横紋筋由来細胞株Ｃ２Ｃ１２等の細胞に対する骨芽細胞様細胞への分化誘導能、及びアルカリホスファターゼ産生誘導能を有する物質が挙げられる。上記活性を有する物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１３／ＧＤＦ６、ＢＭＰ１４／ＧＤＦ５、ＧＤＦ７等が挙げられる。

【0210】

ＢＭＰ２タンパク質及びＢＭＰ４タンパク質は、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である。ＢＭＰ７タンパク質は、例えばＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社から入手可能である。ＧＤＦ７タンパク質は、例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰ１３及びＧＤＦ７からなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質を含み、より好ましくはＢＭＰ４を含む。

【0211】

培地中のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の製造効率向上の観点から、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としてＢＭＰ４を用いる場合は、通常約１ｐＭ～約１００ｎＭ、好ましくは約１０ｐＭ～約５０ｎＭ、より好ましくは約２５ｐＭ～約２５ｎＭ、さらに好ましくは約２５ｐＭ～約５ｎＭ、特に好ましくは約１００ｐＭ～約５ｎＭ、最も好ましくは約５００ｐＭ～約２ｎＭの濃度で使用される。また、ＢＭＰ４以外のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上述の濃度のＢＭＰ４と同等のＢＭＰシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。当業者であれば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質として例えば市販の組換えＢＭＰタンパク質等を用いる場合、製品の添付書類に記載の活性、例えばマウス前駆軟骨細胞株ＡＴＤＣ５に対するアルカリホスファターゼ産生誘導能のＥＤ５０等の値と、上述のＢＭＰ４の濃度と活性を比較することにより、添加するＢＭＰシグナル伝達経路作用物質濃度を容易に決定することができる。

【0212】

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＳｍｕｒｆ１阻害物質、Ｃｈｋ１阻害物質等が挙げられる。上記のような活性を有する化合物としては、例えばＡ－０１（［４－［［４－Ｃｈｌｏｒｏ－３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｓｕｌｆｏｎｙｌ］－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］［４－（５－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈａｎｏｎｅ）、ＰＤ ４０７８２４（９－Ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｐｈｅｎｙｌ－ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４－ｃ］ｃａｒｂａｚｏｌｅ－１，３（２Ｈ，６Ｈ）－ｄｉｏｎｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。

【0213】

工程（ｂ）において用いられる培地は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む限り特に限定されない。工程（ｂ）において用いられる培地としては、例えば工程（ａ）に挙げた培地が挙げられる。

【0214】

嗅上皮の製造効率向上の観点から、工程（ｂ）の開始時期は、工程（ａ）における培養開始から好ましくは０．５時間以降６日以内であり、より好ましくは０．５時間以降７２時間以内であり、さらに好ましくは１２時間以降６０時間以内であり、１８時間以降６０時間以内であってもよい。浮遊培養を実施する場合、Ｗｎｔシグナル経路阻害物質存在下で、上記期間に工程（ｂ）を開始すると、細胞凝集体の表面に非神経上皮様の組織が形成され、極めて効率よく嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞が形成される。

【0215】

工程（ａ）で浮遊培養を行なっている場合、上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の製造効率の向上の観点から、工程（ｂ）の開始時期は、好ましくは工程（ａ）において形成された細胞凝集体の表層における１割以上１０割以下、より好ましくは３割以上１０割以下、さらに好ましくは５割以上１０割以下の細胞が互いに密着結合を形成している時期である。細胞凝集体において密着結合が形成しているかは、例えば抗ＺＯ－１抗体を用いた免疫染色等の手法により判別することができる。

【0216】

工程（ｂ）におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下での培養開始は、工程（ａ）を行った培養容器を用いて、上述の培地交換操作（例えば培地添加操作、半量培地交換操作、全量培地交換操作等）を行ってもよいし、細胞を別の培養容器に移してもよい。

【0217】

工程（ｂ）におけるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養の期間は、適宜設定できる。工程（ｂ）における培養の時間は、通常８時間～６日間程度、好ましくは１０時間～１０８時間程度、より好ましくは１２時間～９６時間程度、さらに好ましくは１８時間～７２時間程度、最も好ましくは２４時間～６０時間程度である。本実施形態の一側面において、工程（ｂ）における培養の時間は、通常８時間～６日間程度、好ましくは１０時間～９６時間程度、より好ましくは１２時間～７２時間程度、さらに好ましくは１４時間～４８時間程度、最も好ましくは１６時間～３６時間程度である。

【0218】

工程（ｂ）において、工程（ｉ）又は工程（ａ）において用いた添加物、例えばＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、ＴＡＫ１阻害物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程（ｂ）で添加するＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質又はＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、それ以前の工程に用いられた物質と異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。これらの物質の添加時期は、工程（ｂ）の開始と同時であってもよいし、異なっていてもよい。

【0219】

＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）では、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、工程（ｂ）で培養した細胞を培養する。工程（ｂ）で細胞を浮遊培養している場合は、工程（ｃ）でも引き続き細胞凝集体を浮遊培養すればよい。工程（ｂ）で細胞を接着培養している場合は、工程（ｃ）でも引き続き細胞を接着培養すればよい。工程（ｂ）で細胞を浮遊培養した後、工程（ｃ）で接着培養してもよい。工程（ｂ）で細胞を接着培養した後、工程（ｃ）で浮遊培養してもよい。工程（ｃ）の培養を行うことで、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第一細胞集団が得られる。

【0220】

工程（ｃ）において、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の少なくとも一方を培地に添加する。本実施形態の一側面において、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質とＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質とを両方とも添加して細胞を培養してもよい。

【0221】

ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）により媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である限り特に限定はされない。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＦＧＦ１、ＦＧＦ２（「ｂＦＧＦ」と称することもある。）、ＦＧＦ３、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、及びＦＧＦ１０等のＦＧＦタンパク質、抗ＦＧＦ受容体抗体、並びに、ＦＧＦ部分ペプチド等が挙げられる。これらの物質は、タンパク質の改変体又は融合体であってもよい。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。本発明に用いられるＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは線維芽細胞増殖因子受容体１（ＦＧＦＲ１）又は線維芽細胞増殖因子受容体２（ＦＧＦＲ２）へと結合し、受容体チロシンキナーゼとしての活性を向上させる物質である。上記活性を有する物質は、例えばＣａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． （２０１５） ３４：４７９－４９６に記載のＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３である。

【0222】

ＦＧＦ２タンパク質及びＦＧＦ８タンパク質は、例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３であり、より好ましくはＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ８及びＦＧＦ１０、並びにこれらの改変体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＦＧＦ２を含み、その上好ましくは組換えヒトＦＧＦ２を含む。

【0223】

培地中のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。上気道組織、嗅上皮又は鼻腔上皮を構成する細胞への分化、並びに、細胞の生存及び増殖を促進する観点からは、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質としてＦＧＦ２を用いる場合は、通常約１ｐｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度で使用され、好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの濃度で使用され、より好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの濃度で使用され、さらに好ましくは約５００ｐｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌの濃度で使用され、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。また、ＦＧＦ２以外のＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＦＧＦ２と同等のＦＧＦシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。添加する物質のＦＧＦシグナル伝達経路促進活性については、例えば３Ｔ３細胞を用いた細胞増殖試験、線維芽細胞増殖因子受容体１を用いたキナーゼアッセイ等の手法により測定することができる。

【0224】

培地中でのＦＧＦタンパク質の活性を保持する作用を有する物質を添加することもまた好ましい。上記のような作用を有する物質としては、例えばヘパリン、ヘパラン硫酸が挙げられる。ヘパリンは、ナトリウム塩として、例えば富士フィルム和光純薬株式会社から入手可能である。培地中のヘパリン又はヘパラン硫酸の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。培地中のヘパリンナトリウムの濃度は、通常約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは約５００ｎｇ／ｍｌ～約１ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは約１μｇ／ｍｌ～約２００μｇ／ｍｌである。ヘパラン硫酸を用いる場合、上記濃度のヘパリンと同様のＦＧＦタンパク質保護の活性をもつ濃度であることが好ましい。３７℃等での細胞培養環境下でＦＧＦタンパク質の活性を保持する目的から、例えば米国特許第８７７２４６０号明細書に記載のＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＦＧＦ２及びＦＧＦ－１／ＦＧＦ－２ ｃｈｉｍｅｒａ等のＦＧＦの改変体、又は、生分解性ポリマーにＦＧＦ２を結合させたＳｔｅｍＢｅａｄｓ ＦＧＦ２等のＦＧＦ徐放性ビーズを用いることもまた好ましい。Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＦＧＦ２は、例えばＨｕｍａｎＺｙｍｅ社から入手可能である。ＦＧＦ－１／ＦＧＦ－２ ｃｈｉｍｅｒａは、例えば医学生物学研究所社から入手可能である。ＳｔｅｍＢｅａｄｓ ＦＧＦ２は例えばＳｔｅｍＣｕｌｔｕｒｅ社から入手可能である。

【0225】

ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質とは、ＢＭＰファミリー・タンパク質により惹起されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り限定されない。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えばＢＭＰのプロセシングと細胞外への分泌を阻害する物質、ＢＭＰに直接作用する物質（例えばタンパク質、抗体、アプタマー等）、ＢＭＰをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、ＢＭＰ受容体とＢＭＰの結合を阻害する物質、及び、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。ＢＭＰ受容体にはＩ型ＢＭＰ受容体とＩＩ型ＢＭＰ受容体が存在する。Ｉ型ＢＭＰ受容体としては、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ＡＣＶＲが知られている。ＩＩ型ＢＭＰ受容体としては、ＴＧＦ－ｂｅｔａ Ｒ－ＩＩ、ＡｃｔＲ－ＩＩ、ＡｃｔＲ－ＩＩＢ、ＢＭＰＲ２、ＭＩＳＲ－ＩＩが知られている。

【0226】

ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、例えばＮｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、Ｇｒｅｍｌｉｎ、Ｉｎｈｉｂｉｎ、Ｔｗｉｓｔｅｄ Ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ、Ｃｏｃｏ、ＤＡＮファミリーに属する分泌タンパク質等が挙げられる。これらの物質はタンパク質の改変体又は融合体であってもよい。上記工程（ｂ）において培養液中にＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していることから、以降のＢＭＰシグナル伝達経路をより効果的に阻害するという観点から、工程（ｃ）におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、細胞外へのＢＭＰの分泌よりも後のシグナル伝達経路を阻害する物質、例えばＢＭＰ受容体とＢＭＰとの結合を阻害する物質、ＢＭＰ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質等を含むことが好ましく、より好ましくはＩ型ＢＭＰ受容体の阻害剤を含む。

【0227】

ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としては、例えばＩ型ＢＭＰ受容体の阻害物質が挙げられる。上記のような活性を有する化合物としては、例えばＫ０２２８８（３－［（６－Ａｍｉｎｏ－５－（３，４，５－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ，３－［６－Ａｍｉｎｏ－５－（３，４，５－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］－ｐｈｅｎｏｌ）、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６－［４－［２－（１－Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］－３－（４－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、ＬＤＮ－１９３１８９（４－［６－［４－（１－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＬＤＮ－２１２８５４（５－［６－［４－（１－Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉＭｉｄｉｎ－３－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＬＤＮ－２１４１１７（１－（４－（６－ｍｅｔｈｙｌ－５－（３，４，５－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、ＭＬ３４７（５－［６－（４－Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ））、ＤＭＨ１（４－（６－（４－Ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ＤＭＨ２（４－［６－［４－［２－（４－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ］－ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、Ｍ４Ｋ２１６３ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（１－［４－［５－（４－Ｆｌｕｏｒｏ－３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌ－３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質としては、例えばＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ２０２１ ６ （３２）， ２０７２９－２０７３４に記載のＡｌｋ２に対する阻害活性を有する物質を用いることもできる。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質のＡｌｋ２に対する阻害活性は、例えばＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０１３ Ｊｕｎｅ ２１； ８（６）： １２９１－１３０２に記載のキナーゼアッセイ及びＣ２Ｃ１２細胞を用いたルシフェラーゼレポーターアッセイ等の手法により測定することができる。

【0228】

ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＩ型ＢＭＰ受容体阻害剤であり、より好ましくはＫ０２２８８、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ＬＤＮ－２１４１１７、ＭＬ３４７、ＤＭＨ１及びＤＭＨ２からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＫ０２２８８を含む。

【0229】

培地中のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の形成効率の観点から、工程（ｃ）におけるＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＫ０２２８８を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、より好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約５００ｎＭ～約２５μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＬＤＮ－１９３１８９を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用され、より好ましくは約２５ｎＭ～約１μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＬＤＮ－２１２８５４を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用され、より好ましくは約２５ｎＭ～約５μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約２５０ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＭＬ－３４７を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、より好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約１μＭ～約２５μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＤＭＨ２を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用され、より好ましくは約２５ｎＭ～約５μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約２５０ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。また、Ｋ０２２８８以外のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＫ０２２８８と同等のＢＭＰシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。ＢＭＰシグナル伝達経路阻害活性は、例えばＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２０１３ Ｊｕｎ ２１； ８（６）： １２９１－１３０２．に記載のキナーゼアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ等の手法により測定可能である。

【0230】

上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の形成効率の観点から、工程（ｃ）の開始時期は、工程（ｂ）のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加から好ましくは０．５時間以降２４０時間以内であり、より好ましくは６時間以降１９２時間以内であり、さらに好ましくは９時間以降１２０時間以内であり、特に好ましくは１２時間以降７２時間以内である。工程（ｃ）におけるＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質それぞれの添加時期は同時でもよいし、異なっていてもよい。

【0231】

工程（ｃ）における一態様としては、まずＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を添加し、その後にＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよい。具体的には、例えば工程（ｂ）の開始後４８時間以内にまずＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を添加し、その後、９６時間以内にＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよい。または、細胞集団中に混入する未分化細胞の増殖を抑制する観点からの別の一態様としては、例えば工程（２）の開始後７２時間以降１２０時間以内にＦＧＦシグナル伝達経路作用物質とＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよい。

【0232】

上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の形成効率の観点から、工程（ｃ）の開始時期は、工程（ｂ）のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の添加後に細胞凝集体の表面に非神経上皮組織が形成されるよりも前に開始することが好ましい。細胞凝集体の表面に非神経上皮組織が形成されたかを調べるためには、顕微鏡等により細胞凝集体表面に上皮様の組織が形成されたかを観察、又は細胞凝集体の切片を作製し、サイトケラチン、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ等の非神経上皮組織で発現するマーカーに対する蛍光免疫染色等の手法により行うことができる。

【0233】

浮遊培養を行なっている場合、工程（ｃ）の培養は、例えば細胞凝集体中に上気道組織、嗅上皮及び鼻腔上皮のいずれかの細胞が分化するまで行えばよい。鼻腔上皮細胞への分化は、例えば細胞の免疫染色によって確認することができる。このとき、マーカーとしてはサイトケラチン１５、サイトケラチン１８、および前記した鼻腔上皮を構成する各種細胞のマーカー遺伝子等を用いることができる。または、工程（ｃ）の培養は、嗅神経前駆細胞が分化するまで行えばよい。嗅神経前駆細胞への分化は、例えば細胞の免疫染色によって確認することができ、マーカーとしてはＥｂｆ２、ＮｅｕｒｏＤ、Ｌｈｘ２、Ｔｕｊ１、ＮＣＡＭ、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎを用いることができる。

【0234】

工程（ｃ）において用いられる培地は、特に限定されないが、工程（１）において用いられる培地の他、ＮｅｕｒｏｂａｓａｌにＢ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２にＮ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地、ＳｔｅｍＰｒｏ ＮＳＣ ＳＦＭ 無血清ヒト神経幹細胞培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の調製済の神経細胞培養用の培地が挙げられる。

【0235】

工程（ｃ）において、以前の工程において用いた添加物、例えばＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、ＴＡＫ１阻害物質等を引き続き添加することもまた好ましい。工程（ｃ）で添加するＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質及びＴＡＫ１阻害物質は、以前の工程において用いられた物質と異なっていてもよいが、好ましくは同一である。添加物の濃度及び種類については、適宜調整することができる。工程（ｃ）において使用される添加物は、好ましくはＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含み、さらに好ましくはＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、ＪＮＫシグナル伝達経路阻害物質及びＴＡＫ１阻害物質を含む。本実施形態の一側面において、工程（ｃ）をＴＡＫ１阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で実施することが好ましい。

【0236】

嗅上皮の形成、並びに、細胞の生存及び増殖を促進する観点から、工程（ｃ）は、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質とは、上皮成長因子（ＥＧＦ）により媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＡＲ（アンフィレギュリン）、ＥＰＧ、ＨＢ－ＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子）、ＢＴＣ（ベータセルリン）、及びＥＰＲ（エピレグリン）等のＥＧＦＲリガンドタンパク質、ＮＲＧ（ニューレグリン）１～４のＥｒｂＢ３／４（上皮成長因子受容体、ＨＲＥ）リガンドタンパク質、並びに、アルプレノール、及びカルベジロール等の低分子化合物等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。ＥＧＦタンパク質は、例えばＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社及びＰｒｉｍｅＧｅｎｅ社から入手可能である。ＴＧＦ－α及びＨＢ－ＥＧＦタンパク質は、例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能である。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＥＧＦまたはＴＧＦ－αを含む。

【0237】

培地中のＥＧＦシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質としてＥＧＦを用いる場合は、通常約１ｐｇ／ｍｌ～約１００μｇ／ｍｌの濃度で使用され、好ましくは約１０ｐｇ／ｍｌ～約５０μｇ／ｍｌの濃度で使用され、より好ましくは約１００ｐｇ／ｍｌ～約１０μｇ／ｍｌの濃度で使用され、さらに好ましくは約５００ｐｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌの濃度で使用され、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用される。またＥＧＦ以外のＥＧＦシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＥＧＦと同等のＥＧＦシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質としての活性は、例えばＳｃｉｅｎｃｅ ２２３：１０７９に記載のＢａｌｂ／３Ｔ３細胞の細胞増殖アッセイ等の手法により測定可能である。

【0238】

上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織中における細胞の分化傾向の調節、並びに細胞の生存及び増殖を促進する観点からは、工程（ｃ）は、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともできる。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、上記工程（ｉ）にて記載のもの等を用いることができる。工程（ｃ）におけるＳｈｈシグナル伝達経路作用物質は、工程（ｉ）で用いるものと同じでもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一の物質である。工程（ｃ）におけるＳｈｈシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＳＡＧ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、及びＧＳＡ－１０からなる群より含まれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＳＡＧを含む。培地中のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＳＡＧは、工程（ｃ）においては通常約１ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約７μＭの濃度で使用され、より好ましくは約５０ｎＭ～約５μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約３μＭの濃度で使用され、特に好ましくは約３００ｎＭ～約２μＭの濃度で使用され、最も好ましくは約５００ｎＭ～約１．５μＭの濃度で使用される。また、ＳＡＧ以外のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＳＡＧと同等のＳｈｈシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

【0239】

上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程（ｃ）は、レチノイン酸シグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。レチノイン酸伝達経路作用物質としては、例えばレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）又はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に結合し、下流の転写を活性化させる物質等が挙げられる。上記のような作用を有する化合物としては、例えばオールトランスレチノイン酸、イソトレチノイン、９－ｃｉｓレチノイン酸、ＴＴＮＰＢ（４－［（Ｅ）－２－［（５，５，８，８－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）－２－ｙｌ］－１－ｐｒｏｐｅｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、Ｃｈ５５（４－［（Ｅ）－３－（３，５－ｄｉ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｙｌ）－３－ｏｘｏ－１－ｐｒｏｐｅｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＣ１９（３－［２－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＣ２３（４－［２－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｎｙｌ）－ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、Ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｒｅｔｉｎａｍｉｄｅ）、Ａｃｉｔｒｅｔｉｎ（（ａｌｌ－ｅ）－９－（４－ｍｅｔｈｏｘｙ－２，３，６－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－３，７－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，４，６，８－ｎｏｎａｔｅｔｒａｅｎ）、Ｔｒｉｆａｒｏｔｅｎｅ、Ａｄａｐａｌｅｎｅ、ＡＣ ２６１０６６（４－［４－（２－Ｂｕｔｏｘｙｅｔｈｏｘｙ－）－５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－２－ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＡＣ ５５６４９（４－Ｎ－Ｏｃｔｙｌｂｉｐｈｅｎｙｌ－４－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＭ ５８０（４－［（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＭ８０（４－［（５，５，８，８－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－６，７－ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－２－ｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＢＭＳ ７５３（４－［［（２，３－Ｄｉｈｙｄｒｏ－１，１，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－１Ｈ－ｉｎｄｅｎ－５－ｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＢＭＳ ９６１（３－Ｆｌｕｏｒｏ－４－［（ｒ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－２－（５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－２－ｙｌ）－ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ］－ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＤ１５３０（４－（６－Ｈｙｄｒｏｘｙ－７－ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃ－１－ｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＣＤ２３１４（５－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）－３－ｔｈｉｏｐｈｅｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＤ４３７（２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ，６－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｔｒｉｃｙｃｌｏ（３．３．１．１（３，７））ｄｅｃ－１－ｙｌｐｈｅｎｙｌ）、ＣＤ２７１（６－［３－（１－Ａｄａｍａｎｔｙｌ）－４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。

【0240】

工程（ｃ）におけるレチノイン酸伝達経路作用物質は、好ましくはＥＣ２３を含む。培地中のレチノイン酸伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されない。レチノイン酸伝達経路作用物質としてＥＣ２３を用いる場合は、例えばＥＣ２３の濃度が約１０ｐＭ～約３０μＭであり、好ましくは約１００ｐＭ～約２０μＭであり、より好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭであり、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５μＭである。ＥＣ２３以外のレチノイン酸伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＥＣ２３と同等のレチノイン酸伝達経路作用活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

【0241】

上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程（ｃ）は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行うこともまた好ましい。本発明において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路とは、細胞膜上に発現する受容体であるＮｏｔｃｈタンパク質と、隣接細胞の膜上に発現するＮｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄ等）と、の直接相互作用により活性化されるシグナル伝達経路を表す。Ｎｏｔｃｈシグナルが伝達された細胞においては、Ｎｏｔｃｈタンパク質が段階的にプロセシングを受けて膜上で切り出された細胞内ドメインが核内へと運ばれて下流遺伝子の発現を制御する。

【0242】

当該物質として例えば、機能欠失型のＮｏｔｃｈ受容体及びそのリガンド、Ｎｏｔｃｈのプロセシング（Ｓ１切断）を阻害する物質、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈリガンドの糖鎖修飾を阻害する物質、細胞膜移行を阻害する物質、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）のプロセシング（Ｓ２切断、Ｓ３切断）を阻害する物質（γセクレターゼ阻害剤）、ＮＩＣＤを分解する物質、ＮＩＣＤ依存的な転写を阻害する物質等を挙げることができる。

【0243】

Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質としての活性を有する化合物として、例えばＤＡＰＴ（Ｎ－［Ｎ－（３，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ）－ｌ－ａｌａｎｙｌ］－Ｓ－ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ｔ－ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ＤＢＺ（（２Ｓ）－２－［［２－（３，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－Ｎ－［（７Ｓ）－５－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｏｘｏ－７Ｈ－ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１］ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎ－７－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）、ＭＤＬ２８１７０（ｂｅｎｚｙｌ Ｎ－［（２Ｓ）－３－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｏｘｏ－１－［［（２Ｓ）－１－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｂｕｔａｎ－２－ｙｌ］ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ＦＬＩ－０６（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ２，７，７－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－４－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｏｘｏ－１，４，６，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、Ｌ－６８５，４５８（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ Ｎ－［６－［［１－［（１－ａｍｉｎｏ－１－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｂｅｎｚｙｌ－３－ｈｙｄｒｏｘｙ－６－ｏｘｏ－１－ｐｈｅｎｙｌｈｅｘａｎ－２－ｙｌ］ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ＣＢ－１０３（６－（４－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ａｍｉｎｅ）及びこれらの誘導体等、並びにＯｎｃｏ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ．２０１３；６：９４３－９５５に記載の物質等が挙げられる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＤＡＰＴを含む。

【0244】

培地中におけるＮｏｔｃｈシグナル阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されない。例えばＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質としてＤＡＰＴを用いる場合は、例えばＤＡＰＴの濃度が約１００ｐＭ～約５０μＭであり、好ましくは約１ｎＭ～約３０μＭであり、より好ましくは約１００ｎＭ～約２０μＭであり、さらに好ましくは約１μＭ～約１０μＭである。ＤＡＰＴ以外のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＤＡＰＴと同等のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

【0245】

上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程（ｃ）および以降の工程を、Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰシグナル伝達経路調節物質の存在下で行うこともまた好ましい。本発明において、Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰシグナル伝達経路とは、細胞増殖又はアポトーシス、幹細胞における自己複製の制御、器官のサイズ調節等に関与するシグナル伝達経路であって、Ｍｓｔ１／２又はＬＡＴＳ１／２等により構成されるキナーゼカスケードと、転写因子ＹＡＰ／ＴＡＺにより制御されるシグナル伝達経路とを表す。例えば、細胞の増殖と幹細胞の未分化性の維持とを企図する場合は、当業者であれば、Ｈｉｐｐｏ経路を阻害し、ＹＡＰ／ＴＡＺタンパク質の脱リン酸化と核内移行を促進する作用を有する物質、ＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される転写を促進する物質等を添加することにより行うことができる。細胞の分化促進を企図する場合は、当業者であれば、Ｈｉｐｐｏ経路を活性化し、ＹＡＰ／ＴＡＺタンパク質のリン酸化とユビキチン・プロテオソーム系等による分解を促進する作用を有する物質、ＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される転写を抑制する物質等を添加することにより行うことができる。

【0246】

Ｈｉｐｐｏ経路阻害物質としては上流のキナーゼカスケードを阻害し、またはＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される下流の標的遺伝子の転写若しくは細胞応答を亢進させるものである限り特に限定されない。

【0247】

Ｈｉｐｐｏ経路活性化物質としてはＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される下流の遺伝子の転写又は細胞応答を抑制させるものである限り特に限定されない。Ｈｉｐｐｏ経路活性化物質は核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。Ｈｉｐｐｏ経路活性化物質としては、例えば、ＴＥＡＤ阻害物質、ＹＡＰ－ＴＥＡＤ結合阻害物質、ＡＭＰＫ活性化剤、ＹＡＰ／ＴＡＺ転写活性阻害物質、細胞間および細胞外マトリックスへの接着刺激の擬似活性化物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては例えばＶｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ（３－［（２３Ｓ，２４Ｒ）－１４－ｅｔｈｅｎｙｌ－２２，２３－ｂｉｓ（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－５－（３－ｍｅｔｈｏｘｙ－３－ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）－４，１０，１５，２４－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２５，２６，２７，２８－ｔｅｔｒａｚａｈｅｘａｃｙｃｌｏ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］ｏｃｔａｃｏｓａ－１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１－ｄｏｄｅｃａｅｎ－９－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ；３－［（２３Ｓ，２４Ｒ）－１４－ｅｔｈｅｎｙｌ－２２，２３－ｂｉｓ（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－９－（３－ｍｅｔｈｏｘｙ－３－ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）－４，１０，１５，２４－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２５，２６，２７，２８－ｔｅｔｒａｚａｈｅｘａｃｙｃｌｏ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］ｏｃｔａｃｏｓａ－１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１－ｄｏｄｅｃａｅｎ－５－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＩＣＡＲ（５－ａｍｉｎｏ－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－５－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｏｘｏｌａｎ－２－ｙｌ］ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｋ－９７５（Ｎ－（３－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ＭＹＦ－０１－３７（１－［３－ｍｅｔｈｙｌ－３－［３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｏ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ－１－ｙｌ］ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－１－ｏｎｅ）、ＴＥＤ－３４７（２－ｃｈｌｏｒｏ－１－［２－［３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｏ］ｐｈｅｎｙｌ］ｅｔｈａｎｏｎｅ）、ＶＴ１０７（Ｎ－［（１Ｓ）－１－（６－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｅｔｈｙｌ］－５－［４－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＹＡＰ－ＴＥＡＤ－ＩＮ－１（（４Ｓ）－４－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，２４Ｓ，２７Ｓ，３０Ｓ，３３Ｓ）－１５－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－（３－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－６－（４－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ）－２４－ｂｅｎｚｙｌ－３－ｂｕｔｙｌ－９－（３－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）－２７－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－３０－ｍｅｔｈｙｌ－１２－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）－２，５，８，１１，１４，２３，２６，２９，３２－ｎｏｎａｏｘｏ－１８，１９－ｄｉｔｈｉａ－１，４，７，１０，１３，２２，２５，２８，３１－ｎｏｎａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［３１．３．０］ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｅ－２１－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－６－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ａｍｉｎｏ－５－ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、Ｓｕｐｅｒ－ＴＤＵ（（４Ｓ）－５－ａｍｉｎｏ－４－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｓ）－２－［２－［（３Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－１－［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－４－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｒ）－２－［［（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－４－ａｍｉｎｏ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－５－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－３－ｃａｒｂｏｘｙ－２－［［（２Ｓ）－３－ｃａｒｂｏｘｙ－２－［［（２Ｓ）－２－［２－［（２Ｓ）－１－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｏｘｏｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ］ｈｙｄｒａｚｉｎｙｌ］－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－（１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｏｘｏｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｏｘｏｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ－２－ｙｌ］－１，２，６－ｔｒｉｏｘｏｈｅｘａｎ－３－ｙｌ］ｈｙｄｒａｚｉｎｙｌ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）およびこれらの誘導体等が挙げられる。

【0248】

上記の物質等がＨｉｐｐｏ経路阻害物質又はＨｉｐｐｏ経路活性化物質としての活性を有することは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｓ， ２０１７， １８．４： ４４７－４５４に記載されており、当業者にとって公知である。上記文献に記載の物質等をＨｉｐｐｏ経路阻害物質又はＨｉｐｐｏ経路活性化物質として用いることもできる。

【0249】

前述の通り、上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程（ｃ）は、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。培地中のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点からは、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合は、通常約１０ｐＭ～約１０ｍＭの濃度で使用され、好ましくは約１００ｐＭ～約１ｍＭの濃度で使用され、より好ましくは約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約１０ｎＭ～約３０μＭの濃度で使用され、最も好ましくは約１００ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。また、ＣＨＩＲ９９０２１以外のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＣＨＩＲ９９０２１と同等のＷｎｔシグナル伝達経路促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路促進活性は、例えばＨＥＫ２９３細胞を用いたＴｏｐｆｌａｓｈレポーターアッセイを用いて決定することができる。

【0250】

上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織中の細胞の分化傾向の調節の観点から、工程（ｃ）及び以降の工程をアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質とは、アクチビン／ＴＧＦ－βにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質としては、例えばアクチビン、及びＴＧＦ－β等の組換えタンパク質、並びに、Ａｌａｎｔｏｌａｃｔｏｎｅ等のアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路を活性化させる物質等が挙げられる。これらの物質は、単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。生物学的活性の見地からのアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質としては、例えばヒト慢性骨髄性白血病由来細胞株Ｋ５６２等の細胞に対するヘモグロビン発現誘導能を有する物質が挙げられる。アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質としてヒト組換えアクチビン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いる場合は、通常１ｐｇ／ｍｌ～１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で用い、好ましくは１００ｐｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で用い、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で用いる。ヒト組換えアクチビン以外のアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質を用いる場合は、当業者にとって周知の、前記ヒト組替アクチビン添加濃度と同様の生理活性を示す濃度で添加すればよい。工程（ｃ）より以前の工程においてアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質を添加している場合は、例えば細胞凝集体を培養器材から回収後、アクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質を含まない培地、緩衝液等で複数回洗浄し、新しい培養器材に細胞凝集体を移設したあとアクチビン／ＴＧＦ－βシグナル伝達経路作用物質を含む培地を添加することが好ましい。

【0251】

上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織中における細胞の分化傾向を調節する観点から、工程（ｃ）及び以降の工程をＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行うこともまた好ましい。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としてはＦＧＦにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、ＦＧＦと直接結合してトラップする物質、ＦＧＦ受容体のキナーゼ活性を阻害する物質、ＦＧＦによって活性化される細胞内シグナル伝達を阻害する物質、ＦＧＦ刺激によって誘導される遺伝子発現を抑制する物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては、例えば抗ＦＧＦ抗体、ＧＰ３６９（抗ＦＧＦＲ２抗体）、ＳＵ５４０２（３－［４－Ｍｅｔｈｙｌ－２－［（２－ｏｘｏ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌ－３－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＢＧＪ３９８（３－（２，６－Ｄｉｃｈｌｏｒｏ－３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１－［６－［［４－（４－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］－１－ｍｅｔｈｙｌｕｒｅａ）、ＰＤ１７３０７４（１－（Ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ）－３－（２－（（４－（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｂｕｔｙｌ）ａｍｉｎｏ）－６－（３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－７－ｙｌ）ｕｒｅａ）、ＡＺＤ４５４７（ｒｅｌ－Ｎ－［５－［２－（３，５－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｌ］－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－４－［（３Ｒ，５Ｓ）－３，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ（Ｎ－（３，５－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－Ｎ－（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－Ｎ－［３－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－４－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｘａｌｉｎ－６－ｙｌ］ｅｔｈａｎｅ－１，２－ｄｉａｍｉｎｅ）、ＢＹＬ７１９（（２Ｓ）－Ｎ１－［４－Ｍｅｔｈｙｌ－５－［２－（２，２，２－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏ－１，１－ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－４－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ］－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－１，２－ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅｄｉｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＧＳＫ２６３６７７１（２－Ｍｅｔｈｙｌ－１－［［２－Ｍｅｔｈｙｌ－３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏＭｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］Ｍｅｔｈｙｌ］－６－（４－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）－１Ｈ－ｂｅｎｚｉＭｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、Ｔａｓｅｌｉｓｉｂ（２－Ｍｅｔｈｙｌ－２－［４－［２－（５－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌ－３－ｙｌ）－５，６－ｄｉｈｙｄｒｏｉＭｉｄａｚｏ［１，２－ｄ］［１，４］ｂｅｎｚｏｘａｚｅｐｉｎ－９－ｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌ－１－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎａＭｉｄｅ）、Ｃａｐｉｖａｓｅｒｔｉｂ（４－Ａｍｉｎｏ－Ｎ－［（１Ｓ）－１－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］－１－（７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－４－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｓａｐａｎｉｓｅｒｔｉｂ（２－（（（１Ｒ，４Ｒ）－４－（（（（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）（ｐｈｅｎｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ（Ｎ－［３－［５－（２－Ａｍｉｎｏ－４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）－２－（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ）－４－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ］－２，６－ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ（５－［（４－Ｂｒｏｍｏ－２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－ｆｌｕｏｒｏ－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）－１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（Ｎ－［３－［３－Ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－５－［（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］－３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－６，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，４，７－ｔｒｉｏｘｏｐｙｒｉｄｏ［４，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－１（２Ｈ）－ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。

【0252】

ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞を効率よく製造できる範囲で適宜設定することができる。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としてＳＵ５４０２を用いる場合には、工程（ｃ）におけるＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、通常１ｎＭから１００ｍＭであり、好ましくは１０ｎＭ～１０ｍＭであり、より好ましくは１００ｎＭ～１ｍＭである。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としてＰＤ１７３０７４を用いる場合には、工程（ｃ）におけるＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、１ｎＭから１００ｍＭであり、好ましくは１０ｎＭ～１０ｍＭであり、より好ましくは１００ｎＭ～１ｍＭである。上記以外のＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記濃度のＳＵ５４０２と同等のＦＧＦシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが好ましい。工程（ｃ）及びより以前の工程においてＦＧＦシグナル伝達経路作用物質を添加していた場合の操作として、そのままＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を添加してもよいし、細胞を別の滅菌済み容器（１５ｍｌチューブ、浮遊培養用シャーレ等）に回収し、培地又は生理食塩水等で洗浄したのちに移してもよい。その際の移設後の培養に用いる培養容器は、工程（ｃ）までで用いていたものと同様の物（９６ウェルプレート等）でもよいし、別の容器（浮遊培養用ディッシュ等）でもよい。

【0253】

工程（ｃ）におけるＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の添加時期は、例えばＦＧＦシグナル伝達経路作用物質又はＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の添加後２４時間後以降であり、好ましくは４８時間後以降であり、より好ましくは７２時間後以降であり、さらに好ましくは９６時間後以降である。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の添加時期の別の態様は、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質又はＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の添加後に細胞塊の表面に上皮様の構造が形成された以降の時期である。

【0254】

上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織中における細胞の分化傾向を調節する観点から、工程（ｃ）及び以降の工程を再度ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下で行うこともまた好ましい。工程（ｃ）における再添加時のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の種類は、工程（ｂ）で添加したものと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。工程（ｃ）における再添加時のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としてＢＭＰ４を用いる場合は、通常約１ｐＭ～約１００ｎＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｐＭ～約５０ｎＭの濃度で使用され、より好ましくは約２５ｐＭ～約２５ｎＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約２５ｐＭ～約５ｎＭの濃度で使用され、特に好ましくは約１００ｐＭ～約５ｎＭの濃度で使用され、最も好ましくは約５００ｐＭ～約２ｎＭの濃度で使用される。工程（ｃ）においてＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を添加していた場合の操作として、細胞を別の滅菌済み容器（１５ｍｌチューブ、浮遊培養用シャーレ等）に回収し、培地又は生理食塩水等で洗浄したのちに移してもよい。その際の移設後の培養に用いる培養容器は、工程（ｃ）までで用いていたものと同様の物（９６ウェルプレート等）でもよいし、別の容器（浮遊培養用ディッシュ等）でもよい。

【0255】

浮遊培養を実施している場合、工程（ｃ）及び以降の工程において細胞凝集体同士の接着を抑制する観点、細胞の保護の観点、及び生体の物理的環境を模して上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、増粘剤を含有し、粘性を有する培地中で細胞凝集体を培養することもできる。

【0256】

培地に粘性を付与する手段は特に制限されないが、例えば、一般に増粘剤として知られる物質を適当な濃度で培地に添加することにより実施されうる。増粘剤としては、培地に上記の適度な粘度を付与し得るものであって、当該粘度を付与し得る濃度範囲において、細胞に悪影響を及ぼさない（細胞毒性がない）ものであれば、いかなる増粘剤も使用することができる。増粘剤としては、例えばペクチン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、カラギーナン、ローカストビーンガム、ジェランガム、デキストリン、ダイユータンガム、デンプン、タラガム、アルギン酸、カードラン、カゼインナトリウム、カロブビーンガム、キチン、キトサン、グルコサミン、プルラン、食物繊維及びこれらの化学修飾された物質又は誘導体、セルロース及びアガロースなどの多糖、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシエチルヒドロキシプロピルセルロースなどの多糖のエーテル、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、ポリエチレンイミンポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸及びマレイン酸共重合体などの合成高分子、並びに、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸及びデキストランなどの生体高分子並びにそれらを模倣した人工高分子（例えば、エラスチン様ペプチドなど）が挙げられる。好ましくは、これら増粘剤は単独で用いてもよいし、何種類かの増粘剤の混合物として用いることもできる。また、増粘剤として用いられる水溶性高分子の共重合体を用いてもよい。好ましくは、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース又はそれらの混合物、より好ましくはメチルセルロースを用いることができる。

【0257】

粘性を有する培地は、培養環境として好適に用いられる３７℃条件下で、通常１００ｍＰａ・Ｓ以上の粘性を有するもの、好ましくは２５０ｍＰａ・Ｓ以上の粘性を有するもの、より好ましくは５００ｍＰａ・Ｓ以上の粘性を有するもの、さらに好ましくは１０００ｍＰａ・Ｓ以上の粘性を有するものが用いられる。上記粘性の上限は、特に制限されないが例えば、１０００Ｐａ・Ｓ以下であってもよい。上記粘性は、例えば日本産業規格（ＪＩＳ）に基づき、細管粘度計、落球粘度計、回転粘度計、振動粘度計等を用いて測定することが可能である。

【0258】

培地に添加される増粘剤の濃度は、粘性を付与可能であり細胞に対する障害性を有しない限り適宜調製可能である。増粘剤としてメチルセルロース（４０００ｃＰ）を用いる場合は、通常０．１質量％から１０質量％の濃度で用いられ、好ましくは０．３質量％から７．５質量％の濃度で用いられ、さらに好ましくは０．５質量％から５質量％の濃度で用いられる。「質量％」は「ｗ／ｗ％」と表記することも可能である。

【0259】

浮遊培養を実施している場合、工程（ｃ）及び以降の工程において細胞凝集体同士の接着又は凝集を抑制する観点、剪断力等の物理的刺激からの細胞の保護の観点、及び生体の物理的環境を模して上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮様組織の製造効率を向上させる観点から、界面活性作用を有する物質を添加することもできる。このような物質としては例えば、アラキドン酸、リノール酸、リノレイン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトイル酸、及びステアリン酸等の脂肪酸、プルロニック Ｆ－６８、及びＴｗｅｅｎ ８０等の界面活性剤、並びに、コレステロールが挙げられる。

【0260】

浮遊培養を実施している場合、工程（ｃ）及び以降の工程において製造される細胞塊のサイズを均一にし、分化誘導の効率を制御する観点から、形成された細胞塊同士の接着を防止するような処置を講じることも望ましい。上記を実現する手段としては例えば、国際公開第２０１６／１２１７３７号に記載のリゾリン脂質類の添加、国際公開第２０１９／１３１９４１号に記載のトロンビン受容体アゴニストの添加、国際公開第２０１６／１２１８４０号に記載の細胞間接着の阻害物質の添加等の手段が挙げられるが、これらに限定されない。細胞塊同士の接着を防止する別の態様として、細胞接着を制御するＲｈｏシグナル伝達経路に対する阻害物質の添加が挙げられる。細胞塊同士の接着を防止するＲｈｏシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＲＯＣＫ阻害物質である。細胞塊同士の接着を防止する目的でＲＯＣＫ阻害物質であるＹ－２７６３２又はＣｈｒｏｍａｎ １を添加する場合は、細胞保護物質として使用する場合と同様の条件にて添加することができる。ＲＯＣＫ阻害物質であるＹ－２７６３２を添加する場合は、通常１０ｎＭから１０ｍＭ、好ましくは１００ｎＭから１ｍＭ、より好ましくは１μＭから１００μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。ＲＯＣＫ阻害物質であるＣｈｒｏｍａｎ １を添加する場合は通常１０ｐＭから１ｍＭ、好ましくは１００ｐＭから１００μＭ、より好ましくは１ｎＭから１０μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。

【0261】

工程（ｂ）まで浮遊培養を実施している場合、工程（ｃ）及び以降の工程において形成された上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の分化成熟を促進する観点から、形成された細胞凝集体を接着培養することもまた好ましい。浮遊培養から接着培養への移行の際には細胞凝集体をそのまま細胞培養ディッシュ上に静置することで接着させてもよいし、カッティング処置、又は細胞分散処置等を実施し、より小さな細胞凝集体又は単離された細胞の懸濁液を調製し、播種後に接着させてもよい。

【0262】

細胞を接着させる培養器材として、前述した平面の細胞培養ディッシュ、又はＴｒａｎｓｗｅｌｌ等の物質透過性を有する薄膜状の細胞培養器材のいずれの形態でも用いることができる。培養器材は、細胞の接着を促進するために基底膜標品、ラミニン等の細胞外マトリクス、ポリ－Ｄ－リジン等の合成細胞接着分子等でコーティングされていてもよい。

【0263】

工程（ｃ）及び以降の工程において、上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の生存及び分化成熟を促進する観点から、細胞凝集体を気相液相境界面培養法で培養することもまた好ましい。気相液相境界面培養法（Ａｉｒ ｌｉｑｕｉｄ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）とは、細胞又は組織の少なくとも一面が大気に暴露されているか、極めて近い位置にある条件での培養を表す。気相液相境界面培養法を実施するためには、例えば細胞又は組織を多孔性メンブレン上又はカルチャーインサート内で培養し、インサート内（内腔側）の培養液を抜き取り、インサート外側のウェル内の培養液のみで培養する方法、アガロース等のハイドロゲルを培養ディッシュ内に置き、その上に細胞又は組織等を置いてディッシュ内の培地から露出しつつ乾燥しない条件下で培養する方法、及び、アガロース等に包埋後、振動刃ミクロトーム等で細胞凝集体を薄切し、セルインサート内で薄切片を培養する方法等が挙げられる。主として酸素による大気への暴露の毒性を軽減する目的から、ＰＤＭＳ等の酸素透過性の膜又は板を細胞又は組織等の上に置き、暴露条件を調節することもできる。上記のような気相液相境界面培養法は、例えばＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ １８．１（２０１７）：１９５、Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６，２１４７２、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９ Ａｐｒ；２２（４）：６６９－６７９等を参照して実施することができる。

【0264】

工程（ｃ）及び以降の工程において、上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の生存及び分化成熟を促進する観点から、細胞凝集体をゲル中に包埋して培養する工程を含んでもよい。ゲルとしては、例えばアガロース、メチルセルロース、コラーゲン、及びマトリゲル等を用いたゲルが挙げられ、マトリゲルを用いることが好ましい。

【0265】

工程（ｃ）及び以降の工程のゲル中に包埋して細胞を培養する工程において、細胞凝集体をそのまま包埋してもよいし、分散及び単離した後の細胞をゲル中に播種してもよい。セルソーター等を用いて基底細胞等特定の細胞腫を分取した後に播種してもよい。ゲル中に包埋する培養法のさらなる一態様として、線維芽細胞、間葉系細胞、血管系の細胞等の上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮以外の細胞との共培養を実施することもできる。上記のようなゲル包埋培養は、例えばＮａｔｕｒｅ ５０１，３７３－３７９（２０１３）、Ｎａｔｕｒｅ，４９９，４８１－４８４（２０１３）、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １４，５１８－５４０（２０１９）、Ｇｅｎｅｓ ２０２０，１１，６０３等を参照して実施することができる。

【0266】

工程（ｃ）及び以降の工程において、細胞への栄養及び酸素の供給を改善し、物質交換を改善し、細胞塊同士の融合を抑制する目的から、細胞が物理的に揺動される培養方法を実施することも好ましい。このような培養方法としては、静置培養以外の方法、例えば振盪培養、回転培養、及び攪拌培養等の方法が挙げられる。振盪培養、回転培養、攪拌培養等を実施するための手段は特に限定されないが、例えば細胞を培養している培養器材をローテーター、シェーカー等に設置する、又は細胞をスターラー等が回転している環境下に置くことにより実施することができる。振盪培養、回転培養、攪拌培養の速度等のパラメーターは当業者であれば細胞への障害が生じない範囲で適宜設定可能である。例えば波動形揺動の３Ｄシェーカー（例えばＭｉｎｉ－Ｓｈａｋｅｒ ３Ｄ、Ｂｉｏｓａｎ社製）を用いて振盪培養を実施する場合は、例えば５～６０ｒｐｍ、好ましくは５～４０ｒｐｍ、より好ましくは５～２０ｒｐｍの範囲で振盪速度範囲を設定可能である。往復式のシェーカー（例えばＮＳ－ＬＲ、アズワン社製）を用いて振盪培養を実施する場合は、例えば１５～６０ｒｐｍ、好ましくは１５～５０ｒｐｍ、より好ましくは１５～４５ｒｐｍの範囲で振盪速度範囲を設定可能である。シーソー式のシェーカー（例えばＮＳ－Ｓ、アズワン社製）を用いて振盪培養を実施する場合は、例えば５～５０ｒｐｍ、好ましくは５～４０ｒｐｍ、より好ましくは５～３０ｒｐｍの範囲で振盪速度範囲を設定可能である。細胞凝集体を攪拌培養、回転培養で培養する場合は、例えばスピナーフラスコ（例えば３１５２、コーニング社製）をマグネティックスターラー上に設置し、細胞凝集体が目視で沈降しない程度の回転数で培養を実施することもできる。三次元回転浮遊培養装置（例えばＣｅｌｌＰｅｔ ＣＵＢＥ、ジェイテック社製；Ｃｌｉｎｏｓｔａｒ、Ｃｅｌｖｉｖｏ社製）を用いて培養を実施することもできる。細胞への摩擦等の物理的な障害を抑制する観点から、前記のゲルに包埋した細胞凝集体を振盪培養、回転培養又は攪拌培養することもまた好ましい。細胞への摩擦等の物理的な障害を抑制する別の態様としては、細胞が物理的に揺動される培養方法を間欠的に実施することもまた好ましい。前述したシェーカー、スターラー等とタイムスイッチ、間欠タイマー等を組み合わせることにより、振盪培養、回転培養、攪拌培養等を間欠的に実施することができる。間欠運転の時間条件は適宜設定可能である。間欠タイマー（例えばＦＴ－０１１、東京器械硝子社製）と往復式のシェーカーを用いて間欠運転を実施する場合は、例えば静止１５秒から１２時間、作動１秒から６０分の範囲で、好ましくは静止３０秒から６時間、作動１秒から１０分の範囲で、より好ましくは静止６０秒から２時間、作動２秒から５分の範囲で、間欠運転の時間条件を設定できる。

【0267】

工程（ｃ）及び以降の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、培地中にさらなる増殖因子を添加することもまた好ましい。添加される増殖因子の種類は、上記目的を達成可能な限り特に限定されない。かかる目的で用いられる増殖因子としては、例えば、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＩＧＦ）、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ：ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４／５、毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ：ＣＮＴＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ：ＰＥＤＦ）、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）等が挙げられる。これらの増殖因子は、上記目的を達成可能な濃度で添加すればよい。

【0268】

工程（ｃ）及び以降の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）等の血小板由来成長因子受容体作用物質を培地中に添加することもまた好ましい。ＰＤＧＦにはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの四種類の遺伝子が存在し、ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤのホモ又は特定の組み合わせのヘテロの二量体を形成してリガンドとして機能する。ＰＤＧＦ受容体にはα及びβの二種類の遺伝子が存在し、αα、αβ、ββの組み合わせのホモ又はヘテロの二量体を形成して受容体として機能する。このうち、プラコードを含む非神経外胚葉ではＰＤＧＦＲβがよく発現している。本発明で用いる血小板由来成長因子受容体作用物質は、好ましくはＰＤＧＦＲββ又はＰＤＧＦＲαβに対する作用を有している。上記血小板由来成長因子受容体作用物質は、より好ましくはＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ及びＰＤＧＦ－ＤＤのからなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＰＤＧＦ－ＢＢ及びＰＤＧＦ－ＣＣからなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ及びＰＤＧＦ－ＤＤは、組換えタンパク質としてＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社等から入手可能である。

【0269】

工程（ｃ）及び以降の工程において、細胞死を抑制し、細胞の増殖を促進する観点から、高酸素の雰囲気下で培養することもまた好ましい。培養過程における高酸素条件は、例えば細胞を培養するインキュベーターに酸素ボンベを接続し、人工的に酸素を供給することにより実現できる。かかる目的での酸素濃度は、通常２５体積％から８０体積％であり、より好ましくは３０体積％から６０体積％である。

【0270】

工程（ｃ）及び以降の工程において、細胞凝集体を培養する培地中への酸素供給量を増やす観点から、ガス交換効率の高い培養器材を用いることもできる。このような培養器材の例として、細胞培養ディッシュ、プレートの底面をガス透過性のフイルムとしたＬｕｍｏｘディッシュ（ザルスタット株式会社製）、ＶＥＣＥＬＬ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（株式会社ベセル製）等が挙げられる。前述した高酸素濃度条件下での培養と組み合わせて用いることもまた好ましい。

【0271】

工程（ｃ）及び以降の工程において、細胞凝集体中における上皮組織の構造を維持する観点から、細胞保護剤を培地に添加することもできる。工程（ｃ）及び以降の工程において用いられる細胞保護剤としては、上述したＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ヘパリン、ＲＯＣＫ阻害物質、基底膜標品、ミオシン阻害物質、ポリアミン類、ＩＳＲ阻害剤、カスパーゼ阻害剤、血清、及び血清代替物等が挙げられる。ミオシン阻害物質としては、例えば非筋型ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼの阻害物質であるＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）の阻害物質であるＭＬ－７、ＭＬ－９、Ｗ－７、ＭＬＣＫ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ １８及びこれらの誘導体等が挙げられる。添加する細胞保護剤は、工程（ａ）で添加したものと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。好ましい細胞保護剤としては、ＲＯＣＫ阻害物質が挙げられる。工程（ｃ）及び以降の工程において、細胞保護剤としてＲＯＣＫ阻害物質であるＹ－２７６３２を添加する場合は、通常１０ｎＭから１０ｍＭの濃度となるように、好ましくは１００ｎＭから１ｍＭの濃度となるように、より好ましくは１μＭから１００μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。ＲＯＣＫ阻害物質であるＣｈｒｏｍａｎ １を添加する場合は、通常１０ｐＭから１ｍＭの濃度となるように、好ましくは１００ｐＭから１００μＭの濃度となるように、より好ましくは１ｎＭから１０μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。細胞保護剤として非筋型ミオシンＩＩ ＡＴＰアーゼの阻害物質であるＢｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎを添加する場合は、通常１０ｎＭから１０ｍＭの濃度となるように、好ましくは１００ｎＭから１ｍＭの濃度となるように、より好ましくは１μＭから１００μＭの濃度となるように培養環境中に添加する。

【0272】

工程（ｃ）及び以降の工程において、細胞保護剤以外の、上皮組織の構造を維持する作用を有する物質を添加することもできる。上記のような物質として、例えば細胞接着を促進する物質、基底膜成分の合成を促進する物質、基底膜成分の分解を阻害する物質等が挙げられる。細胞接着を促進する物質は、細胞－細胞間の接着、細胞－基底膜間の接着、細胞－培養器材間の接着等いずれを促進するものであってもよいし、細胞接着に関与する因子の産生を促すものであってもよい。細胞接着を促進する物質として例えばアドヘサミン、アドヘサミン－ＲＧＤＳ誘導体、Ｐｙｒｉｎｔｅｇｒｉｎ、Ｂｉｏｔｉｎ ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ－１、Ａｃｅｔｙｌ Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ－３、ＲＧＤＳ Ｐｅｐｔｉｄｅ及びこれらの誘導体等が挙げられる。基底膜成分の合成を促進する物質として例えばアスコルビン酸誘導体等が挙げられる。アスコルビン酸誘導体としては、例えばアスコルビン酸リン酸ナトリウム、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸２－グルコシド、３－Ｏ－エチルアスコルビン酸、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、アスコルビン酸－２リン酸－６パルミチン酸、グリセリルオクチルアスコルビン酸等が挙げられる。基底膜成分の分解を阻害する物質として、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼの阻害剤等が挙げられる。基底膜成分の合成を促進する物質であるアスコルビン酸誘導体の一種であるアスコルビン酸２－リン酸を添加する場合は、通常１０μｇ／ｍｌ以上１０００μｇ／ｍｌ以下の濃度となるように、好ましくは３０μｇ／ｍｌ以上５００μｇ／ｍｌ以下の濃度となるように、さらに好ましくは５０μｇ／ｍｌ以上３００μｇ／ｍｌ以下の濃度となるように培養環境中に添加する。他のアスコルビン酸及びアスコルビン酸の誘導体等を添加する際は、上記の濃度とモル当量が同程度となるように添加すればよい。

【0273】

工程（ｃ）及び以降の工程において、上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の生存を促進する観点から、酸化ストレスを軽減する作用を有する物質を添加することも好ましい。上記のような活性を有する物質として例えば抗酸化物質、フリーラジカルスカベンジャー作用を有する物質、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ阻害物質、シクロオキシゲナーゼ阻害物質、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）阻害物質、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）様物質、Ｎｒｆ２活性化剤等が挙げられる。上記のような活性を有する物質として例えばアスコルビン酸、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン、酢酸（±）－α－トコフェロール、Ａｐｏｃｙｎｉｎ（４’－Ｈｙｄｒｏｘｙ－３’－ｍｅｔｈｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）、ニコチンアミド、タウリン（２－アミノエタンスルホン酸）、ＩＭ－９３（１－Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－３－（１－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－Ｉｎｄｏｌｅ－３－ｙｌ）－４－（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉａｍｉｎｅ）－１Ｈ－Ｐｙｒｒｏｌｅ－２、５Ｈ－ｄｉｏｎｅ）、Ｃａｆｆｅｉｃ Ａｃｉｄ（３，４－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ Ａｃｉｄ）、Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ（３－Ｈｙｄｒｏｘｙ－２４－ｎｏｒ－２－ｏｘｏ－１（１０），３，５，７－ｆｒｉｅｄｅｌａｔｅｔｒａｅｎ－２９－ｏｉｃ Ａｃｉｄ；Ｔｒｉｐｔｅｒｉｎ）、Ｅｂｓｅｌｅｎ（２－Ｐｈｅｎｙｌ－１，２－ｂｅｎｚｉｓｏｓｅｌｅｎａｚｏｌ－３（２Ｈ）－ｏｎｅ）、（－）－Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ Ｇａｌｌａｔｅ（（２Ｒ，３Ｒ）－２－（３，４，５－Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１［２Ｈ］－ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ－３，５，７－ｔｒｉｏｌ－３－（３，４，５－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ））、ＥＵＫ－８（Ｎ，Ｎ’－Ｂｉｓ（ｓａｌｉｃｙｌｉｄｅｎｅａｍｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅ－ｍａｎｇａｎｅｓｅ（ｉ））、Ｅｄａｒａｖｏｎｅ（３－Ｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｙｒａｚｏｌｉｎ－５－ｏｎｅ）、ＭｎＴＢＡＰ（Ｍｎ（ＩＩＩ）ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ Ａｃｉｄ、Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ（ｔｒａｎｓ－３，４，５－Ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂｅｎｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定はされない。細胞培養用に調製済の試薬（例えば抗酸化サプリメント、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ａ１３４５）を用いることもできる。本発明で用いる酸化ストレスを軽減する作用を有する物質は、好ましくはアスコルビン酸、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含む。アスコルビン酸は、例えばその誘導体であるアスコルビン酸２リン酸として、１ｎＭから１Ｍの濃度で、好ましくは１０ｎＭから１００ｍＭの濃度で、より好ましくは１００ｎＭから１０ｍＭの濃度で、さらに好ましくは１μＭから３ｍＭの濃度で培地中に添加することができる。Ｎ－アセチル－Ｌ－システインは、例えば１ｎＭから１Ｍの濃度で、好ましくは１０ｎＭから１００ｍＭの濃度で、より好ましくは１００ｎＭから１０ｍＭの濃度で、さらに好ましくは１μＭから５ｍＭの濃度で培地中に添加することができる。

【0274】

工程（ｃ）及び以降の工程において、上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の生存を促進する観点から、ストレス応答シグナル伝達経路に対する阻害物質（ストレスに対する細胞内シグナル伝達機構を阻害する物質）を添加することもまた好ましい。ストレス応答性ＭＡＰキナーゼ経路（ｓｔｒｅｓｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：ＳＡＰＫ）はストレスに対する細胞内シグナル伝達機構の主要なものの一つである。ストレス応答性ＭＡＰキナーゼ経路の阻害剤としては例えばＭＡＰ３Ｋ阻害剤、ＭＡＰ２Ｋ阻害剤、ＡＳＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、Ｒｈｏファミリーキナーゼ阻害剤、ＪＮＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＭＳＫ阻害剤、ＳＴＡＴ阻害剤、ＮＦ－κＢ阻害剤、ＣＡＭＫ阻害剤等が挙げられる。

【0275】

ＭＥＫ阻害剤としては、例えばＳｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ（ＡＺＤ６２４４，６－（４－ｂｒｏｍｏ－２－ｃｈｌｏｒｏａｎｉｌｉｎｏ）－７－ｆｌｕｏｒｏ－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）－３－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｍｉｒｄａｍｅｔｉｎｉｂ（ＰＤ０３２５９０１，Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ］－３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－２－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（ＧＳＫ１１２０２１２，Ｎ－［３－［３－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－５－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－６，８－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，４，７－ｔｒｉｏｘｏｐｙｒｉｄｏ［４，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－１－ｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ｕ０１２６（１，４－ｄｉａｍｉｎｏ－２，３－ｄｉｃｙａｎｏ－１，４－ｂｉｓ（２－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）ｂｕｔａｄｉｅｎｅ）、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ－１０４０，２－（２－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－Ｎ－（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）－３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＰＤ９８０５９（２－（２－ａｍｉｎｏ－３－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｃｈｒｏｍｅｎ－４－ｏｎｅ）、ＢＩＸ ０２１８９（３－［Ｎ－［３－［（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｃ－ｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎｉｍｉｄｏｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｐｉｍａｓｅｒｔｉｂ（ＡＳ－７０３０２６，Ｎ－［（２Ｓ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］－３－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｐｅｌｉｔｉｎｉｂ（ＥＫＢ－５６９，（Ｅ）－Ｎ－［４－（３－ｃｈｌｏｒｏ－４－ｆｌｕｏｒｏａｎｉｌｉｎｏ）－３－ｃｙａｎｏ－７－ｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎ－６－ｙｌ］－４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｂｕｔ－２－ｅｎａｍｉｄｅ）、ＢＩＸ ０２１８８（３－［Ｎ－［３－［（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｃ－ｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎｉｍｉｄｏｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＴＡＫ－７３３（３－［（２Ｒ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］－６－ｆｌｕｏｒｏ－５－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－８－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ－４，７－ｄｉｏｎｅ）、ＡＺＤ８３３０ （２－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）－１，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－６－ｏｘｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ（ＭＥＫ１６２，６－（４－ｂｒｏｍｏ－２－ｆｌｕｏｒｏａｎｉｌｉｎｏ）－７－ｆｌｕｏｒｏ－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）－３－ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＳＬ－３２７（（Ｚ）－３－ａｍｉｎｏ－３－（４－ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆａｎｙｌ－２－［２－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｒｏｐ－２－ｅｎｅｎｉｔｒｉｌｅ）、Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ（ＲＤＥＡ１１９，Ｎ－［３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－２－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－６－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－１－［（２Ｓ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ］ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ＧＤＣ－０６２３（５－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）－Ｎ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）ｉｍｉｄａｚｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＢＩ－８４７３２５（３－［３－［Ｎ－［４－［（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］－Ｃ－ｐｈｅｎｙｌｃａｒｂｏｎｉｍｉｄｏｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－６－ｙｌ］－Ｎ－ｅｔｈｙｌｐｒｏｐ－２－ｙｎａｍｉｄｅ）、ＲＯ５１２６７６６（ＣＨ５１２６７６６，３－［［３－ｆｌｕｏｒｏ－２－（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｍｏｙｌａｍｉｎｏ）ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－７－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌｏｘｙｃｈｒｏｍｅｎ－２－ｏｎｅ）、Ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ（ＧＤＣ－０９７３，［３，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏ－２－（２－ｆｌｕｏｒｏ－４－ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－［３－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－［（２Ｓ）－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ａｚｅｔｉｄｉｎ－１－ｙｌ］ｍｅｔｈａｎｏｎｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。

【0276】

ｐ３８阻害剤としては、例えば、ＳＢ２０３５８０（４－［４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ（ＢＩＲＢ ７９６，１－［５－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－２－（４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－３－［４－（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－１－ｙｌ］ｕｒｅａ）、ＳＢ２０２１９０（ＦＨＰＩ，４－［４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－２－ｙｌ］ｐｈｅｎｏｌ）、Ｒａｌｉｍｅｔｉｎｉｂ ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ（５－［２－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］－３－（２，２－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ａｍｉｎｅ；ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＶＸ－７０２（６－（Ｎ－ｃａｒｂａｍｏｙｌ－２，６－ｄｉｆｌｕｏｒｏａｎｉｌｉｎｏ）－２－（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＰＨ－７９７８０４（３－［３－ｂｒｏｍｏ－４－［（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｏｘｙ］－６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏｐｙｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ］－Ｎ，４－ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、Ｎｅｆｌａｍａｐｉｍｏｄ（ＶＸ－７４５，５－（２，６－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆａｎｙｌｐｙｒｉｍｉｄｏ［１，６－ｂ］ｐｙｒｉｄａｚｉｎ－６－ｏｎｅ）、ＴＡＫ－７１５（Ｎ－［４－［２－ｅｔｈｙｌ－４－（３－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＰＤ １６９３１６（４－［４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ＴＡ－０２（４－［２－（２－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ＳＤ ０００６（１－［４－［３－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ］－２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈａｎｏｎｅ）、Ｐａｍａｐｉｍｏｄ（６－（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）－２－（１，５－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｅｎｔａｎ－３－ｙｌａｍｉｎｏ）－８－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－７－ｏｎｅ）、ＢＭＳ－５８２９４９（４－［５－（ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）－２－ｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｎｏ］－５－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｐｒｏｐｙｌｐｙｒｒｏｌｏ［２，１－ｆ］［１，２，４］ｔｒｉａｚｉｎｅ－６－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＳＢ２３９０６３（４－［４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ）ｉｍｉｄａｚｏｌ－１－ｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎ－１－ｏｌ）、Ｓｋｅｐｉｎｏｎｅ－Ｌ（１３－（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏａｎｉｌｉｎｏ）－５－［（２Ｒ）－２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｏｘｙ］ｔｒｉｃｙｃｌｏ［９．４．０．０３，８］ｐｅｎｔａｄｅｃａ－１（１１），３（８），４，６，１２，１４－ｈｅｘａｅｎ－２－ｏｎｅ）、ＤＢＭ １２８５（Ｎ－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－４－［４－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ａｍｉｎｅ；ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＳＢ ７０６５０４（１－ｃｙａｎｏ－２－［２－［［８－（２，６－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－ｆｌｕｏｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－７－ｏｘｏｐｙｒｉｄｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌ］ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ＳＣＩＯ ４６９（２－［６－ｃｈｌｏｒｏ－５－［（２Ｒ，５Ｓ）－４－［（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］－２，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｎｙｌ］－１－ｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ］－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）、Ｐｅｘｍｅｔｉｎｉｂ（１－［５－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ－２－（４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌ－３－ｙｌ］－３－［［５－ｆｌｕｏｒｏ－２－［１－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ］ｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｕｒｅａ）、ＵＭ－１６４（２－［［６－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ］－２－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－Ｎ－［２－ｍｅｔｈｙｌ－５－［［３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｈｅｎｙｌ］－１，３－ｔｈｉａｚｏｌｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ｐ３８ ＭＡＰＫ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（４－（２，４－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－８－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－７－ｏｘｉｄｏ－１，７－ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ－７－ｉｕｍ）、ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ＩＩＩ（４－［５－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌ－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ］－Ｎ－（１－ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｙｒｉｄｉｎ－２－ａｍｉｎｅ）、ｐ３８ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＶ（３，４，６－ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ－２－（２，３，５－ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ－６－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌｐｈｅｎｏｌ）、ＣＡＹ１０５５７１（４－［５－（４－ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－２－［４－（ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ］－ｐｙｒｉｄｉｎｅ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。

【0277】

ＪＮＫ阻害剤としては、例えば工程（ａ）で記載したものと同様の物が挙げられる。本発明で用いるストレスに対する細胞内シグナル伝達機構を阻害する物質は、好ましくはＭＥＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、及びＪＮＫ阻害剤からなる群から選ばれる一つ以上である。ｐ３８阻害剤としてＳＢ２０３５８０を用いる場合は、通常１ｎＭから１ｍＭの濃度で、好ましくは１０ｎＭから１００μＭの濃度で、より好ましくは１００ｎＭから１０μＭの濃度で、さらに好ましくは５００ｎＭから５μＭの濃度で、培地中に添加することができる。ＭＥＫ阻害剤としてＰＤ０３２５９０１を用いる場合は、通常１ｎＭから１ｍＭの濃度で、好ましくは１０ｎＭから１００μＭの濃度で、より好ましくは１００ｎＭから１０μＭの濃度で、さらに好ましくは５００ｎＭから５μＭの濃度で、培地中に添加することができる。ＪＮＫ阻害剤としてＪＮＫ－ＩＮ－８を用いる場合は、工程（ａ）に記載の濃度と同様の濃度で、培地中に添加することができる。他のＭＥＫ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ＪＮＫ阻害剤を用いる場合は上記阻害剤の添加濃度と同等の阻害活性を有する濃度で添加することが好ましい。ＪＮＫ阻害剤の阻害活性は、例えばＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２００８ Ｏｃｔ ２８； １０５（４３）： １６８０９－１６８１３に記載のＤＥＬＦＩＡアッセイ、キナーゼアッセイ等の手法により測定可能である。

【0278】

本実施形態の一側面において、前記工程（ａ）から前記工程（ｃ）のいずれか一つ以上の工程を、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質、ＲＯＣＫ阻害物質及びＪＮＫシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で実施することが好ましい。

【0279】

＜２－２．第一細胞集団からシート状細胞構造物を製造する方法＞
＜工程（１）＞
工程（１）では、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第一細胞集団を分散し、単一細胞を得る。上記単一細胞は、細胞懸濁液として調製されていてもよい。上記第一細胞集団は、好ましくは多能性幹細胞に由来する。なお、上記第一細胞集団に含まれる細胞が単一細胞になった状態も、便宜上「第一細胞集団」と呼ぶ。

【0280】

工程（１）に供する嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第一細胞集団は、培地中に浮遊していてもよいし、培養器材等に接着していてもよいが、好ましくは培地中に浮遊している。第一細胞集団に含まれる嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞は好ましくは組織を形成している。工程（１）に供する第一細胞集団は、細胞凝集体、細胞塊、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ）、スフェア（Ｓｐｈｅｒｅ）、スフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、オルガノイド（Ｏｒｇａｎｏｉｄ）等であってもよいが、好ましくは嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含むオルガノイドである。上記オルガノイドは、例えばヒト多能性幹細胞かＷＯ２０２０／０３９７３２、ＷＯ２０２２／０２６２３８に記載の工程、又は本願に記載の工程（ｉ）、工程（ｉｉ）、（ａ）、工程（ｂ）、及び工程（ｃ）を実施することにより製造することができる。

【0281】

上記第一細胞集団に含まれる嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞は、嗅上皮及び嗅上皮プラコードマーカー遺伝子を発現している。嗅上皮及び嗅上皮プラコードマーカー遺伝子としては、Ｓｉｘ１、Ｓｉｘ４、Ｄｌｘ５、Ｅｙａ２、Ｐａｘ６、Ｏｔｘ２、ＦｏｘＧ１（別名Ｂｆ１）、Ｓｏｘ２、Ｐｏｕ２ｆ１、Ｓｐ８、Ｃｈｄ７、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１８、ＰＤＧＦＲβ等が挙げられる。

【0282】

本実施形態の一側面において、前記第一細胞集団の少なくとも２０％が外胚葉由来の細胞であって、前記外胚葉由来の細胞が、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｏｔｘ２、サイトケラチン、及びＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つの嗅プラコード細胞マーカー又は嗅上皮幹細胞マーカーを発現する細胞を含有することが好ましい。嗅プラコード細胞マーカー又は嗅上皮幹細胞マーカーを発現する細胞以外の「外胚葉由来の細胞」としては、例えば、中枢神経系細胞、眼組織細胞、頭頚部組織細胞、鼻腔上皮細胞、及び口腔上皮細胞等が挙げられる。上記第一細胞集団における上記外胚葉由来の細胞の含有割合は、好ましくは２０％以上であり、より好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上である。

【0283】

上記第一細胞集団は、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞以外の細胞を含んでいてもよい。上記「嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞以外の細胞」としては、例えば中枢神経系細胞、眼組織細胞、頭頚部組織細胞、鼻腔上皮細胞、及び口腔上皮の細胞が挙げられる。上記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞以外の細胞は、好ましくは組織を形成している。

【0284】

本実施形態の一側面において、前記第一細胞集団は、中枢神経系の細胞を更に含み、
前記中枢神経系の細胞が、
１）Ｐａｘ６、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｄｌｘ５、ＦｏｘＧ１、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＡＰ２、ＲＡＸ、及びＶＳＸ２からなる群より選ばれる少なくとも一つの中枢神経系マーカーを発現し、かつ
２）サイトケラチンを発現しない細胞であることが好ましい。

【0285】

本実施形態の他の側面において、前記第一細胞集団が、１）前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む非神経上皮組織部、及び、２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、かつ、
前記神経組織部の表面における少なくとも一部が、前記非神経上皮組織部で被覆されている三次元の立体的な組織、又は細胞塊であり、
前記神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含むことが好ましい。ここで「三次元の立体的な」形状とは、幅、奥行き、及び高さを有する形状であって、二次元的な広がりを主とする形状（例えば、シート状）とは区別される概念である。

【0286】

本実施形態の他の側面において、前記第一細胞集団が、１）前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む非神経上皮組織部、及び、２）神経系細胞又はその前駆細胞を含む神経組織部を含み、かつ、
前記非神経上皮組織部と前記神経組織部が、前記培養器材の同一の表面上に接着していて、
前記神経系細胞又はその前駆細胞は、中枢神経系を構成する神経系細胞又はその前駆細胞を含むことが好ましい。なお、「培養器材の同一の表面」における表面は、平面であってもよいし、波打っている表面であってもよいし、凹凸を有する表面であってもよい。

【0287】

上記第一細胞集団に含まれる嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられ、これらの処理を単独で、又は複数種を組み合わせて行ってもよい。細胞分散液処理としては、ある細胞分散液で処理した後に、異なる細胞分散液で処理してもよい。細胞を分散させる方法としては、好ましくは細胞保護剤添加処理と同時に細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。

【0288】

工程（１）において用いられる細胞分散液に含まれる酵素としては、細胞を分散し得る酵素である限り特に限定されないが、例えば、パパイン、ＥＤＴＡ；トリプシン、コラゲナーゼ（コラゲナーゼ タイプＩ～ＶＩＩ）、メタロプロテアーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、及びデオキシリボヌクレアーゼ等の酵素又はこれらの混合物が挙げられる。細胞分散液としては、例えば上記工程（ａ）に記載の溶液を用いることもできる。工程（１）における好ましい細胞分散液は、パパインを含む緩衝液及びＤＮａｓｅを含む緩衝液であるが、これらに限定されない。細胞分散液としては、ＥＤＴＡ、Ｌ－システイン、２－メルカプトエタノール、硫酸マグネシウム等の、酵素の安定化又は酵素活性の増強等に関わる物質を更に含んでいてもよい。また、当該細胞分散液処理を促進させるために、当該処理前に、細胞集団を物理的に細断する工程（例えばメス、ハサミ等を用いて細断する工程）、又は細胞集団に物理的に切れ込みを入れる工程（例えばメス、ハサミ等を用いて切れ込みを入れる工程）を行ってもよい。工程（１）における好ましい細胞分散液処理の一態様としては、上記第一細胞集団に含まれる嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞をパパイン、ＥＤＴＡ、Ｌ－システイン、２－メルカプトエタノール、及びＹ－２７６３２を含むＨＢＳＳ緩衝液で処理し、次いで機械的分散処理を行い、続けてＤＮａｓｅ及び硫酸マグネシウムを含むＨＢＳＳ緩衝液で処理をすることが挙げられる。

【0289】

工程（１）においてタンパク質分解酵素を含有する細胞分散液処理を実施した後に、タンパク質分解酵素阻害物質を添加し、反応を停止することもまた好ましい。添加するタンパク質分解酵素阻害物質は、細胞分散液に含まれるタンパク質分解酵素に対する阻害活性を有する限り、特に限定はされない。タンパク質、ペプチド、化合物等、何れであってもよい。上記のような物質として例えばトリプシンインヒビター、アプロチニン、ペプスタチンＡ、キモスタチン、アンチパイン、ロイペプチン、エブセレン、Ｅ－６４ 等が挙げられる。工程（１）において細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としてパパインを用いた場合、好ましくは、タンパク質分解酵素阻害物質としてＥ－６４を用いるが、これに限定されない。

【0290】

＜工程（２）＞
工程（２）では、工程（１）で調製した細胞より嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を精製する。
工程（２）では、工程（１）で得られた前記単一細胞を精製し、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第二細胞集団を得る。工程（２）は、単一細胞を含む第一細胞集団を精製し、第二細胞集団を得る工程と把握することもできる。前記第二細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合は、前記第一細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合より高い。前記第二細胞集団における前記嗅プラコード細胞及び嗅上皮幹細胞の含有割合は、好ましくは、５０％以上であり、より好ましくは、８０％以上である。当該含有割合は、例えば、免疫染色によるカウント、画像解析、蛍光活性化セルソーティング法（ＦＡＣＳ）、又はシングルセル解析による分析等の手法で算出することが可能である。

【0291】

工程（２）において細胞集団から嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を精製する方法として、例えば、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞に特異的なマーカーを用いた手法が挙げられる。精製には、細胞表面マーカーに特異的親和性を有する試薬を用いることもできる。ここで、特異的親和性を有する試薬とは、抗体、アプタマー、ペプチドまたは特異的に認識する化合物等であり、好ましくは、抗体またはその断片である。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。抗体の断片として、抗体の一部（例えばＦａｂ断片）または合成抗体断片（例えば、一本鎖Ｆｖ断片「ＳｃＦｖ」）が例示される。嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を精製する為に、２種以上の「細胞表面マーカーに特異的親和性を有する試薬」を組み合わせて用いることもできる。

【0292】

細胞表面マーカーを発現する細胞を認識または単離するために、当該親和性を有する試薬は、例えば、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素、ビオチンおよびストレプトアビジン等の検出可能な物質、または、プロテインＡ、プロテインＧ、ビーズおよび磁気ビーズ等の単離抽出を可能とする物質と、結合されていてもよい。当該親和性を有する試薬はまた、間接的に標識されていてもよい。間接的標識の手法としては例えば、抗体に特異的に結合する予め標識された抗体（二次抗体）を用いることが挙げられる。当業者にとって周知の事実であるが、２種以上の「細胞表面マーカーに特異的親和性を有する試薬」を組み合わせて用いる場合、上記単離抽出を可能とする物質は、試薬ごとに異なるものが結合、又は間接的に標識されていることが好ましい。

【0293】

細胞を単離する方法として、親和性を有する試薬を粒子に結合させ沈降させる方法、磁気ビーズを用いて磁性により細胞を選別する方法（例えば、ＭＡＣＳ）、蛍光標識を用いてセルソーターを用いる方法（例えば、ＦＡＣＳ）、または抗体等が固定化された担体（例えば、細胞濃縮カラム）を用いる方法等が例示されるが、これらに限定されない。すなわち、工程（２）は、蛍光活性化セルソーティング法（ＦＡＣＳ）又は磁気ビーズによる細胞選別法（ＭＡＣＳ）によって、第一細胞集団を精製して第二細胞集団を得てもよい。

【0294】

上述の細胞表面マーカーに特異的親和性を有する試薬を用いた精製方法には、（１）目的細胞の細胞表面マーカーに特異的親和性を有する試薬を用いて、当該目的細胞を回収することで精製する方法と、（２）目的外細胞の細胞表面マーカーに特異的親和性を有する試薬を用いて、当該目的外細胞を除去回収することで精製する方法が挙げられる。ここで「目的細胞」とは、精製の対象となっている細胞を意味する。「目的外細胞」とは、「精製の対象となっている細胞」以外の細胞を意味する。

【0295】

工程（２）において用いる嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を標識し、精製可能なマーカーとしては、例えばＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌｄｎ４、Ｃｌｄｎ６、Ｃｌｄｎ７、ＬＡＭ１Ｂ、ＦＲＥＭ２、ＴＡＣＳＴＤ２、ＩＧＳＦ１、Ｆ１１Ｒ、ＦＲＡＳ１、ＳＯＲＬ１を利用することもできる。すなわち、本実施形態の一側面において、工程（２）は、目的細胞の細胞表面マーカーに対する特異的親和性を有する試薬を用いて、前記嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を回収することで、前記第一細胞集団を精製して前記第二細胞集団を得ることを含むことが好ましく、細胞表面マーカーとしてＳＯＲＬ１を利用することもできる。
前記目的細胞の細胞表面マーカーは、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌｄｎ４、Ｃｌｄｎ６、Ｃｌｄｎ７、ＬＡＭ１Ｂ、ＦＲＥＭ２、ＴＡＣＳＴＤ２、ＩＧＳＦ１、Ｆ１１Ｒ、ＦＲＡＳ１、ＳＯＲＬ１からなる群より選ばれる少なくとも一つを含むことが好ましい。

【0296】

上記目的細胞は、工程（２）においてさらに、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞である、と把握することもできる。

【0297】

本実施形態の他の側面において、工程（２）は、目的外細胞の細胞表面マーカーに対する特異的親和性を有する試薬を用いて、前記目的外細胞を除去することで、前記第一細胞集団を精製して前記第二細胞集団を得ることを更に含むことが好ましく、
前記目的外細胞の細胞表面マーカーで、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞以外の目的外細胞を標識し、精製過程において嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含有する陰性画分を回収し、第一細胞集団から目的外細胞を除去する工程によって実施することもできる。嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を標識せず、目的外細胞を標識し、除去可能なマーカーとしては例えばＡＴＰ１Ｂ２、ＣＤ８２、ＣＤＨ６、ＣＤＯＮ、ＣＥＬＳＲ２、ＣＬＵ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＰ、ＣＲＢ２、ＤＣＴ、ＤＫＫ３、ＥＦＮＢ１、ＦＢＬＮ２、ＦＢＮ２、ＦＮ１、ＧＰＭ６Ｂ、ＩＳＬＲ２、ＬＲＰ２、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＭＭＲＮ１、ＰＲＥＬＰ、ＰＲＳＳ３５、Ｓ１ＰＲ３、ＳＤＫ２、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＯＲＣＳ１、ＴＦＰＩ、ＴＨＳＤ７Ａ、ＴＨＹ１、ＴＭＥＭ１３２Ｂ、及びＴＳＰＡＮ１８からなる群より選ばれる少なくとも一つを含むことが好ましい。上記目的外細胞は、中胚葉・内胚葉の細胞、中枢神経系の細胞、網膜細胞、残存する多能性幹細胞、分化抵抗性の多能性幹細胞を含む。第一細胞集団中より造腫瘍性を有する細胞を除去する観点から、既知の未分化多能性幹細胞特異的に発現する細胞表面マーカーを認識する試薬を用いることもできる。細胞除去のために添加される上記目的外細胞を認識する試薬は、毒素、細胞傷害性の化合物等との複合体であってもよい。

【0298】

工程（２）において第一細胞集団から嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を精製する別の態様として、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞特異的に代謝される化合物であって、細胞を標識する作用を有する化合物等を用いることもできる。上記のような化合物としては、例えばｉＳｃｉｅｎｃｅ． ２０２２ Ｍａｙ ２０； ２５（５）： １０４２２２．に記載のＣｏｕｍａｒｉｎ、ｇＧｌｕ－ＨＭＲＧ及びこれらの誘導体等が挙げられる。

【0299】

工程（１）で調製した単一細胞を含む第一細胞集団の細胞懸濁液から嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を精製し、第二細胞集団を得る別の方法として、細胞に結合する試薬を添加しない、ラベルフリー細胞分離・分析システムを用いることもできる。精製には、細胞の形態、サイズ、照射光の散乱、誘電スペクトル、電気的特性等の非侵襲的に計測可能なパラメーターに基づき嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を精製する。上記のようなラベルフリー細胞分離・分析システム及び方法としては、例えばＥＬＥＳＴＡ ＣＲＯＳＳＯＲＴＥＲ（ＳＣＲＥＥＮ社製）、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０１８， ３６０．６３９４： １２４６－１２５１に記載のＧｈｏｓｔ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ等が挙げられる。

【0300】

工程（２）において調製した精製前の細胞または精製後の細胞を、凍結保存することもできる。すなわち、本実施形態の一側面において、工程（２）は、第二細胞集団を凍結保存することを更に含んでもよい。凍結保存を実施することにより、中間製造物の保存、品質評価、輸送が容易となる。精製後の細胞の凍結保存の為の方法としては、分散した細胞を凍結保存用媒体に懸濁し、所定の温度及び低温条件にて処理することにより細胞の凍結保存サンプルが調製可能である。凍結保存用媒体は、凍結保護物質を含んでいてもよい。凍結保存用の凍結方法は特に限定されないが、ガラス化方法又は緩慢法のいずれも用いられる。ガラス化法は、例えば凍結保存液に懸濁した細胞が入れられたチューブを、直接液体窒素に浸して行われる。緩慢法は、例えば、凍結保存液に懸濁した細胞が入れられたチューブを、プログラムフリーザー又はディープフリーザーで、約－１℃／分の冷却速度で－８０℃まで冷却して行われる。本発明においては、好ましくは緩慢法が用いられる。精製後の細胞の凍結保存は、ＷＯ２０２０／０１３２４７に記載の方法によって凍結保存することもできる。

【0301】

凍結保存用媒体としては、細胞の凍結保存に適した媒体であればよく、例えば、それぞれ後述する凍結保護物質が添加された、生理食塩水、ＰＢＳ、ＥＢＳＳもしくはＨＢＳＳなどの緩衝液、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭもしくはＲＰＭＩなどの培地、血清、血清代替物、又はこれらの混合物などの媒体が挙げられる。

【0302】

凍結保護物質は、細胞の凍結保存を行う際、細胞の機能又は生存率をできるだけ維持し、凍結に由来する様々な障害を防止するために添加される。凍結保護物質としては、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などのスルホキシド；エチレングリコール、グリセロール、プロパンジオール、プロピレングリコール、ブタンジオール、及びポリエチレングリコールなどの鎖状ポリオールが挙げられる。好ましくはさらにスクロース、トレハロース、ラクトース、及びラフィノースなどのオリゴ糖を含む。また、アセトアミドなどのアミド化合物、パーコール、フィコール７０、フィコール７００００、ポリビニルピロリドンなどを含めてもよい。スルホキシドの場合、終濃度で５～１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは９～１３％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１１％（ｗ／ｖ）前後添加してもよい。鎖状ポリオールの場合、終濃度で４～１５％（ｗ／ｖ）、好ましくは４．５％～８％（ｗ／ｖ）、より好ましくは５．５％（ｗ／ｖ）前後添加してもよい。オリゴ糖の場合は、終濃度で５～２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは８～１２％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）前後添加してもよい。凍結保護物質として前述の細胞保護物質を用いることもできる。本発明における凍結保護物質は、好ましくはＲＯＣＫ阻害剤を含む。

【0303】

凍結保存用媒体として、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業株式会社）、セルバンカー１、１プラス、２、３（十慈フィールド株式会社）、ＴＣプロテクター（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ（株式会社リプロセル）、クライオスカーレスＤＭＳＯフリー（株式会社バイオベルデ）、ステムセルキープ（株式会社バイオベルデ）、ＥＦＳ溶液（ＮＫ ｓｙｓｔｅｍ）などの市販の媒体を用いることもできる。

【0304】

工程（２）において調製した精製後の細胞を、拡大培養することもできる。拡大培養は、接着培養、浮遊培養のいずれでもよいが、好ましくは接着培養である。拡大培養は、凍結保存後に起眠した細胞を用いて実施してもよい。または、拡大培養を実施後に細胞を凍結保存してもよい。

【0305】

工程（２）の接着培養による拡大培養において、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の接着を促進する観点、あるいは細胞の性状を本発明にとって好ましい状態へ誘導または維持する観点から、物質透過性を有する膜の表面が前記した人工的に処理されている培養器材等を使用できる。工程（２）の接着培養による拡大培養における好ましい処理の一態様は、細胞接着性のドメイン（例えば、ＲＧＤ配列を含むドメイン）を含有する合成ペプチド（シンセマックス／コーニング社製）およびラミニンＥ８断片（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１／ニッピ社製）の混合物による培養器材のコーティング処理である。

【0306】

工程（２）の拡大培養に用いる培地は、前述の動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。工程（２）の拡大培養に用いる培地は、好ましくは無血清培地である。無血清培地は、適宜、前述の血清代替物、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。工程（２）の拡大培養には、上記基礎培地をベースとした調製済の培地、好ましくは公知の上皮細胞、呼吸器系細胞を培養するための培地等を用いることもできる。上記の様な培地として例えばＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ－Ｅｘ、Ｅｘ Ｐｌｕｓ、ＡＬＩ、Ａｉｒｗａｙ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｓｅｅｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ、Ａｉｒｗａｙ ｏｒｇａｎｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ａｉｒｗａｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、ＣｎＴ－Ｐｒｉｍｅ， Ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣｎＴ－Ｐｒｉｍｅ Ａｉｒｗａｙ， Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣｎＴ－Ｐｒｉｍｅ Ａｉｒｗａｙ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社製）、ＢＥＧＭ Ｂｒｏｎｃｈｉａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。公知の呼吸器系細胞培養用の培地として例えばＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ． ２０１８ Ｊａｎ ９；１０（１）：１０１－１１９またはＮａｔ Ｐｒｏｔｏｃ． ２０１５ Ｍａｒ；１０（３）：４１３－２５に記載の培地を使用してもよい。

【0307】

＜工程（３）＞
工程（３）では、工程（２）で調製した嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む細胞集団を播種し、培養し、上気道細胞を含むシート状細胞構造物を得る。工程（３）に用いる細胞は、工程（２）において凍結保存したものであってもよい。工程（３）に用いる細胞は、工程（２）の精製後に培養したものであってもよい。すなわち、本実施形態の一側面において、前記工程（２）は、前記第二細胞集団を凍結保存することを更に含み、前記工程（３）は、凍結保存した前記第二細胞集団を解凍することを更に含んでいてもよい。

【0308】

工程（３）において、工程（２）で調製した嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第二細胞集団の培養は、好ましくは物質透過性を有する膜上にて実施される。工程（３）は、培養器材に設けられている物質透過性を有する膜上で第二細胞集団を培養する、と把握することもできる。物質透過性を有する膜は、例えば多孔質膜、繊維から形成される膜である。多孔質膜は、例えばポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン製の多孔質膜等が使用可能である。多孔質膜は、例えばトラックエッチング法により製造される。多孔質膜のポアサイズは物質透過性を有する限り特に限定されないが、好ましくは細胞非透過性を有するポアサイズである。上記のような多孔質膜のポアサイズは、例えば約８μｍ以下であり、好ましくは約５μｍ以下であり、特に好ましくは約３μｍ以下である。上記多孔質膜のポアサイズの下限値は特に制限されないが、例えば、０．２μｍ以上である。これら物質透過性を有する膜は、生体適合性を有する材料を原料とすることが好ましい。

【0309】

工程（３）において嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の接着を促進する観点、あるいは細胞の性状を本発明にとって好ましい状態へ誘導または維持する観点から、物質透過性を有する膜の表面が前記した人工的に処理されている培養器材等を使用できる。工程（３）における好ましい処理の一態様は、細胞接着性のドメイン（例えば、ＲＧＤ配列を含むドメイン）を含有する合成ペプチド（シンセマックス／コーニング社製）およびラミニンＥ８断片（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１／ニッピ社製）の混合物による培養器材のコーティング処理である。

【0310】

工程（３）において用いられる物質透過性を有する膜からなる培養器材としては、例えばセルカルチャーインサート（サーモフィッシャー社製）、トランズウェル（コーニング社製）、ミリセル セルカルチャーインサート（メルク社製）、ａｄ－ＭＥＤビトリゲル（関東化学社製）等が挙げられる。

【0311】

工程（３）において第二細胞集団に含まれる嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の培養器材への播種密度は、シート状細胞構造体が形成可能である限り特に限定されない。通常約１×１０^３から約１×１０^７細胞／ｃｍ^２、好ましくは約２×１０^３から約５×１０^６細胞／ｃｍ^２、より好ましくは約５×１０^３から約２×１０^６細胞／ｃｍ^２、さらに好ましくは約１×１０^４から約１×１０^６細胞／ｃｍ^２、特に好ましくは約２×１０^４から約１×１０^６細胞／ｃｍ^２となるように調製した嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を懸濁した培地を培養器材に添加し、培養を開始する。

【0312】

工程（３）における培養日数もシート状細胞構造体が形成される限り特に限定されないが、例えば１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上である。工程（３）における培養日数の上限は、特に制限されないが、例えば、２００日以下であってもよい。工程（３）において播種した嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞が、培養器材へと接着したかどうか、細胞間の接着が生じているかどうか、上皮構造が生じ、シート状細胞構造体を形成したかどうかは、当業者であれば例えば光学顕微鏡による観察、前記した細胞接着因子及び上皮細胞マーカー（Ｅ―Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ、ＺＯ－１等）を用いた免疫染色等の手法で判別可能である。

【0313】

工程（３）では、好ましくはソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質）及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記第二細胞集団を培養する。

【0314】

工程（３）において用いられるＳｈｈシグナル伝達経路作用物質は、工程（ｉ）において用いられるものと同一でもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一である。工程（３）において用いられるＳｈｈシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはＳＡＧ、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、２０（Ｓ）－ｈｙｄｒｏｘｙ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ及びＧＳＡ－１０からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、より好ましくはＳＡＧを含む。培地中のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で用いる物質に応じて適宜設定することが可能である。ＳＡＧは、工程（３）においては、通常約１ｎＭ～約２０００ｎＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約１０００ｎＭの濃度で使用され、より好ましくは約１０ｎＭ～約７００ｎＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約５０ｎＭ～約７００ｎＭの濃度で使用され、特に好ましくは約１００ｎＭ～約６００ｎＭの濃度で使用され、最も好ましくは約１００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度で使用される。また、ＳＡＧ以外のＳｈｈシグナル伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＳＡＧと同等のＳｈｈシグナル伝達促進活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

【0315】

工程（３）において用いられるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、工程（ｃ）において用いられるものと同一でもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一である。工程（３）において用いられるＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＩ型ＢＭＰ受容体阻害剤であり、より好ましくはＫ０２２８８、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ－１９３１８９、ＬＤＮ－２１２８５４、ＬＤＮ－２１４１１７、ＭＬ３４７、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ １、ＶＵ５３５０、ＯＤ５２、Ｅ６２０１、Ｓａｒａｃａｔｉｎｉｂ、ＢＹＬ７１９及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＫ０２２８８を含む。

【0316】

培地中のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。上気道組織、嗅上皮、鼻腔上皮を構成する細胞の形成効率の観点から、工程（３）におけるＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＫ０２２８８を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、より好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約５００ｎＭ～約２５μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＬＤＮ－１９３１８９を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用され、より好ましくは約２５ｎＭ～約１μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＬＤＮ－２１２８５４を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用され、より好ましくは約２５ｎＭ～約５μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約２５０ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＭＬ－３４７を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、より好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約１μＭ～約２５μＭの濃度で使用される。ＢＭＰ伝達経路阻害物質としてＤＭＨ２を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭの濃度で使用され、より好ましくは約２５ｎＭ～約５μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約２５０ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。また、Ｋ０２２８８以外のＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＫ０２２８８と同等のＢＭＰシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

【0317】

工程（３）では、好ましくはＲＯＣＫ阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＥＧＦシグナル伝達経路作用物質、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、及びレチノイン酸シグナル伝達経路作用物質からなる群より選ばれる少なくとも１つの存在下で、前記第二細胞集団を培養する。

【0318】

工程（３）において用いられるＲＯＣＫ阻害物質、ＦＧＦシグナル伝達経路作用物質及びＥＧＦシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは前記工程（ｉ）及び工程（ａ）～（ｃ）と同様の物質、終濃度で添加する。

【0319】

工程（３）において用いられるＷｎｔシグナル伝達経路作用物質は、前記工程（ｉ）及び（ａ）～（ｃ）で用いる物質と同じでもよいし、異なっていてもよい。工程（３）における好ましいＷｎｔシグナル伝達経路作用物質はＧＳＫ３β阻害剤であり、より好ましくはＣＨＩＲ９９０２１である。工程（３）においてＷｎｔシグナル伝達経路作用物質としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合は、通常約１０ｐＭ～約１０ｍＭの濃度で使用され、好ましくは約１００ｐＭ～約１ｍＭの濃度で使用され、より好ましくは約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約１０ｎＭ～約３０μＭの濃度で使用され、最も好ましくは約１００ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。

【0320】

工程（３）において用いられるＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＡｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤を含む。Ａｌｋ５／ＴＧＦβＲ１阻害剤は、好ましくはＳＢ４３１５４２、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＬＹ２１５７２９９、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、ＥＷ－７１９７、Ａ８３－０１、Ａ７７－０１、ＲｅｐＳｏｘ、ＢＩＢＦ－０７７５、ＴＰ０４２７７３６、ＴＧＦＢＲ１－ＩＮ－１、ＳＭ－１６、ＴＥＷ－７１９７、ＬＹ３２００８８２、ＬＹ２１０９７６１、Ｒ２６８７１２、ＩＮ１１３０、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ、ＡＺ１２７９９７３４、ＫＲＣＡ ０００８、ＧＳＫ １８３８７０５、Ｃｒｉｚｏｔｉｎｉｂ、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、ＡＳＰ ３０２６、ＴＡＥ６８４、ＡＺＤ３４６３、からなる群より選ばれる少なくとも１つを含み、さらに好ましくはＳＢ４３１５４２、ＲｅｐＳｏｘ又はＡ８３－０１を含む。

【0321】

培地中のＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で用いる物質に応じて適宜設定することが可能である。工程（３）におけるＴＧＦβ伝達経路阻害物質としてＳＢ４３１５４２を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、より好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、特に好ましくは約１μＭ～約１０μＭの濃度で使用される。工程（３）におけるＴＧＦβ伝達経路阻害物質としてＲｅｐＳｏｘを用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、より好ましくは約１０ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、特に好ましくは約１μＭ～約１０μＭの濃度で使用される。工程（３）におけるＴＧＦβ伝達経路阻害物質としてＡ８３－０１を用いる場合は、通常約１ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、好ましくは約１０ｎＭ～約１００μＭの濃度で使用され、より好ましくは約２０ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５０μＭの濃度で使用され、特に好ましくは約２００ｎＭ～約３μＭの濃度で使用される。工程（３）におけるＴＧＦβ伝達経路阻害物質の好ましい一態様は、ＳＢ４３１５４２、ＲｅｐＳｏｘ、及びＡ８３－０１の併用である。

【0322】

工程（３）において用いられるレチノイン酸伝達経路作用物質としては、例えばレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）又はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に結合し、下流の転写を活性化させる物質等が挙げられる。上記のような作用を有する化合物としては、例えばオールトランスレチノイン酸、イソトレチノイン、９－ｃｉｓレチノイン酸、ＴＴＮＰＢ（４－［（Ｅ）－２－［（５，５，８，８－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）－２－ｙｌ］－１－ｐｒｏｐｅｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、Ｃｈ５５（４－［（Ｅ）－３－（３，５－ｄｉ－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｙｌ）－３－ｏｘｏ－１－ｐｒｏｐｅｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＣ１９（３－［２－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｎｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＣ２３（４－［２－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｅｔｈｙｎｙｌ）－ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、Ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｒｅｔｉｎａｍｉｄｅ）、Ａｃｉｔｒｅｔｉｎ（（ａｌｌ－ｅ）－９－（４－ｍｅｔｈｏｘｙ－２，３，６－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－３，７－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，４，６，８－ｎｏｎａｔｅｔｒａｅｎ）、Ｔｒｉｆａｒｏｔｅｎｅ、Ａｄａｐａｌｅｎｅ、ＡＣ ２６１０６６（４－［４－（２－Ｂｕｔｏｘｙｅｔｈｏｘｙ－）－５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ］－２－ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＡＣ ５５６４９（４－Ｎ－Ｏｃｔｙｌｂｉｐｈｅｎｙｌ－４－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＭ ５８０（４－［（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＭ８０（４－［（５，５，８，８－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－６，７－ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－２－ｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＢＭＳ ７５３（４－［［（２，３－Ｄｉｈｙｄｒｏ－１，１，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－１Ｈ－ｉｎｄｅｎ－５－ｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＢＭＳ ９６１（３－Ｆｌｕｏｒｏ－４－［（ｒ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙ－２－（５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－５，６，７，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ－２－ｙｌ）－ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ］－ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＤ１５３０（４－（６－Ｈｙｄｒｏｘｙ－７－ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃ－１－ｙｌ－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ）、ＣＤ２３１４（５－（５，６，７，８－Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－５，５，８，８－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２－ａｎｔｈｒａｃｅｎｙｌ）－３－ｔｈｉｏｐｈｅｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＣＤ４３７（２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ，６－（４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｔｒｉｃｙｃｌｏ（３．３．１．１（３，７））ｄｅｃ－１－ｙｌｐｈｅｎ）、ＣＤ２７１（６－［３－（１－Ａｄａｍａｎｔｙｌ）－４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－２－ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）及びこれらの誘導体等が挙げられる。これらの物質は、単独で又は複数種を組み合わせて用いてもよい。

【0323】

工程（３）におけるレチノイン酸伝達経路作用物質は、好ましくはＥＣ２３を含む。培地中のレチノイン酸伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されない。レチノイン酸伝達経路作用物質としてＥＣ２３を用いる場合は、例えばＥＣ２３の濃度が約１０ｐＭ～約３０μＭであり、好ましくは約１００ｐＭ～約２０μＭであり、より好ましくは約１０ｎＭ～約１０μＭであり、さらに好ましくは約１００ｎＭ～約５μＭである。ＥＣ２３以外のレチノイン酸伝達経路作用物質を使用する場合、上記濃度のＥＣ２３と同等のレチノイン酸伝達経路作用活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

【0324】

シート状細胞構造体に含まれる細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程（３）は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質の存在下で行うこともまた好ましい。本発明において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路とは、細胞膜上に発現する受容体であるＮｏｔｃｈタンパク質と隣接細胞の膜上に発現するＮｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ、Ｊａｇｇｅｄ等）との直接相互作用により活性化されるシグナル伝達経路を表す。Ｎｏｔｃｈシグナルが伝達された細胞においては、Ｎｏｔｃｈタンパク質が段階的にプロセシングを受け膜上で切り出された細胞内ドメインが核内へと運ばれて下流遺伝子の発現を制御する。

【0325】

Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質は、Ｎｏｔｃｈにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。 Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質は、Ｎｏｔｃｈにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質は、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、機能欠失型のＮｏｔｃｈ受容体及びリガンド、Ｎｏｔｃｈのプロセシング（Ｓ１切断）を阻害する物質、Ｎｏｔｃｈ及びＮｏｔｃｈリガンドの糖鎖修飾を阻害する物質、細胞膜移行を阻害する物質、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）のプロセシング（Ｓ２切断、Ｓ３切断）を阻害する物質（γセクレターゼ阻害剤）、ＮＩＣＤを分解する物質、ＮＩＣＤ依存的な転写を阻害する物質等を挙げることができる。

【0326】

Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することもできる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質としての活性を有する化合物として、例えばＤＡＰＴ（Ｎ－［Ｎ－（３，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎａｃｅｔｙｌ）－Ｌ－ａｌａｎｙｌ］－Ｓ－ｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ ｔ－ｂｕｔｙｌ ｅｓｔｅｒ）、ＤＢＺ（（２Ｓ）－２－［［２－（３，５－ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－Ｎ－［（７Ｓ）－５－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｏｘｏ－７Ｈ－ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１］ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎ－７－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｅ）、ＭＤＬ２８１７０（ｂｅｎｚｙｌ Ｎ－［（２Ｓ）－３－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｏｘｏ－１－［［（２Ｓ）－１－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｂｕｔａｎ－２－ｙｌ］ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ＦＬＩ－０６（ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ ２，７，７－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－４－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－ｏｘｏ－１，４，６，８－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、Ｌ－６８５，４５８（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ Ｎ－［６－［［１－［（１－ａｍｉｎｏ－１－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌ－１－ｏｘｏｐｅｎｔａｎ－２－ｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｂｅｎｚｙｌ－３－ｈｙｄｒｏｘｙ－６－ｏｘｏ－１－ｐｈｅｎｙｌｈｅｘａｎ－２－ｙｌ］ｃａｒｂａｍａｔｅ）、ＣＢ－１０３（６－（４－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ａｍｉｎｅ）及びこれらの誘導体等、並びにＯｎｃｏ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｔｈｅｒ．２０１３；６：９４３－９５５に記載の物質等が挙げられる。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはＤＡＰＴを含む。

【0327】

培地中におけるＮｏｔｃｈシグナル阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲であれば特に限定されない。例えばＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質としてＤＡＰＴを用いる場合は、例えばＤＡＰＴの濃度が約１００ｐＭ～約５０μＭであり、好ましくは約１ｎＭ～約３０μＭであり、より好ましくは約１００ｎＭ～約２０μＭであり、さらに好ましくは約１μＭ～約１０μＭである。ＤＡＰＴ以外のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、上記濃度のＤＡＰＴと同等のＮｏｔｃｈシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

【0328】

シート状細胞構造体に含まれる細胞の分化傾向の調節の観点からは、工程（３）および以降の工程を、Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰシグナル伝達経路調節物質の存在下で行うこともまた好ましい。本発明において、Ｈｉｐｐｏ／ＹＡＰシグナル伝達経路とは、細胞増殖又はアポトーシスの制御、幹細胞の自己複製の制御、器官のサイズ調節等に関与する、Ｍｓｔ１／２、ＬＡＴＳ１／２等により構成されるキナーゼカスケードと、転写因子ＹＡＰ／ＴＡＺにより制御されるシグナル伝達経路とを表す。例えば、細胞の増殖と幹細胞の未分化性の維持とを企図する場合は、当業者であれば、Ｈｉｐｐｏ経路を阻害し、ＹＡＰ／ＴＡＺタンパク質の脱リン酸化と核内移行を促進する作用を有する物質、ＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される転写を促進する物質等を添加することにより行うことができる。細胞の分化促進を企図する場合は、当業者であれば、Ｈｉｐｐｏ経路を活性化し、ＹＡＰ／ＴＡＺタンパク質のリン酸化とユビキチン・プロテオソーム系等による分解を促進する作用を有する物質、ＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される転写を抑制する物質等を添加することにより行うことができる。

【0329】

Ｈｉｐｐｏ経路阻害物質としては上流のキナーゼカスケードを阻害し、またはＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される下流の標的遺伝子の転写・細胞応答を亢進させるものである限り特に限定されない。Ｈｉｐｐｏ経路阻害物質は核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。Ｈｉｐｐｏ経路阻害物質としては、例えば、増殖因子、サイトカイン、Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２（Ｓ１ＰＲ２）活性化物質、ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｔｅｒｉｌｅ ２０－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ （ＭＳＴ） １／２阻害物質、ｌａｒｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｋｉｎａｓｅ １ ａｎｄ ２ （ＬＡＴＳ１／２） 阻害物質、ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２ （ＡＮＸＡ２）結合阻害物質、ＴＡＺ活性化物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては例えばＣＹＭ－５５２０（１－［２－（１－ｂｅｎｚｙｌ－２，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌ－３－ｙｌ）－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ］－６－ｏｘｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＸＭＵ－ＭＰ－１（４－［（２，９－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－８－ｏｘｏ－６－ｔｈｉａ－２，９，１２，１４－ｔｅｔｒａｚａｔｒｉｃｙｃｌｏ［８．４．０．０３，７］ｔｅｔｒａｄｅｃａ－１（１４），３（７），４，１０，１２－ｐｅｎｔａｅｎ－１３－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ＰＹ－６０（５－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－（３－（ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ）ｉｓｏｘａｚｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＧＡ－０１７（［（Ｅ）－２－（１－（２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ）－Ｎ－（３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒａｚｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ］）、Ｌａｔｓ－ＩＮ－１（Ｎ－（３－ｂｅｎｚｙｌ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＩＢＳ００８７３８（［３－（４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－５－［（Ｅ）－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｙｌｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅａｍｉｎｏ］ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ］－ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｏｎｅ）、ＴＭ－２５６５９（２－ｂｕｔｙｌ－５－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ－３－［［４－［２－（２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌ－５－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ＳＢＰ－３２６４（Ｎ－［１－［５－（３－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＶＴ０２９５６、ＴＤＩ－０１１５３６およびこれらの誘導体等が挙げられる。

【0330】

Ｈｉｐｐｏ経路阻害物質は核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。Ｈｉｐｐｏ経路阻害物質としては、例えば、増殖因子、サイトカイン、Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２（Ｓ１ＰＲ２）活性化物質、ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｔｅｒｉｌｅ ２０－ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅ （ＭＳＴ） １／２阻害物質、ｌａｒｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｋｉｎａｓｅ １ ａｎｄ ２ （ＬＡＴＳ１／２） 阻害物質、ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２ （ＡＮＸＡ２）結合阻害物質、ＴＡＺ活性化物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては例えばＣＹＭ－５５２０（１－［２－（１－ｂｅｎｚｙｌ－２，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌ－３－ｙｌ）－２－ｏｘｏｅｔｈｙｌ］－６－ｏｘｏｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＸＭＵ－ＭＰ－１（４－［（２，９－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－８－ｏｘｏ－６－ｔｈｉａ－２，９，１２，１４－ｔｅｔｒａｚａｔｒｉｃｙｃｌｏ［８．４．０．０３，７］ｔｅｔｒａｄｅｃａ－１（１４），３（７），４，１０，１２－ｐｅｎｔａｅｎ－１３－ｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、ＰＹ－６０（５－ｐｈｅｎｙｌ－Ｎ－（３－（ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ）ｉｓｏｘａｚｏｌｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＧＡ－０１７（［（Ｅ）－２－（１－（２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ）－Ｎ－（３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ｈｙｄｒａｚｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ］）、Ｌａｔｓ－ＩＮ－１（Ｎ－（３－ｂｅｎｚｙｌ－１，３－ｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌｉｄｅｎｅ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－３－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＩＢＳ００８７３８（［３－（４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）－５－［（Ｅ）－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ－４－ｙｌｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅａｍｉｎｏ］ｉｍｉｄａｚｏｌ－４－ｙｌ］－ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｏｎｅ）、ＴＭ－２５６５９（２－ｂｕｔｙｌ－５－ｍｅｔｈｙｌ－６－ｐｙｒｉｄｉｎ－３－ｙｌ－３－［［４－［２－（２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌ－５－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、ＳＢＰ－３２６４（Ｎ－［１－［５－（３－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＶＴ０２９５６、ＴＤＩ－０１１５３６およびこれらの誘導体等が挙げられる。

【0331】

Ｈｉｐｐｏ経路活性化物質としては、ＹＡＰ／ＴＡＺにより惹起される下流の遺伝子の転写・細胞応答を抑制させるものである限り特に限定されない。Ｈｉｐｐｏ経路活性化物質は核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。Ｈｉｐｐｏ経路活性化物質としては、例えば、ＴＥＡＤ阻害物質、ＹＡＰ－ＴＥＡＤ結合阻害物質、ＡＭＰＫ活性化剤、ＹＡＰ／ＴＡＺ転写活性阻害物質、細胞間および細胞外マトリックスへの接着刺激の擬似活性化物質等が挙げられる。上記のような作用を有する物質としては例えばＶｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ（３－［（２３Ｓ，２４Ｒ）－１４－ｅｔｈｅｎｙｌ－２２，２３－ｂｉｓ（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－５－（３－ｍｅｔｈｏｘｙ－３－ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）－４，１０，１５，２４－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２５，２６，２７，２８－ｔｅｔｒａｚａｈｅｘａｃｙｃｌｏ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］ｏｃｔａｃｏｓａ－１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１－ｄｏｄｅｃａｅｎ－９－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ；３－［（２３Ｓ，２４Ｒ）－１４－ｅｔｈｅｎｙｌ－２２，２３－ｂｉｓ（ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）－９－（３－ｍｅｔｈｏｘｙ－３－ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）－４，１０，１５，２４－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２５，２６，２７，２８－ｔｅｔｒａｚａｈｅｘａｃｙｃｌｏ［１６．６．１．１３，６．１８，１１．１１３，１６．０１９，２４］ｏｃｔａｃｏｓａ－１，３，５，７，９，１１（２７），１２，１４，１６，１８（２５），１９，２１－ｄｏｄｅｃａｅｎ－５－ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ＡＩＣＡＲ（５－ａｍｉｎｏ－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－５－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｏｘｏｌａｎ－２－ｙｌ］ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｋ－９７５（Ｎ－（３－（４－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）－４－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ＭＹＦ－０１－３７（１－［３－ｍｅｔｈｙｌ－３－［３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｏ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ－１－ｙｌ］ｐｒｏｐ－２－ｅｎ－１－ｏｎｅ）、ＴＥＤ－３４７（２－ｃｈｌｏｒｏ－１－［２－［３－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ａｎｉｌｉｎｏ］ｐｈｅｎｙｌ］ｅｔｈａｎｏｎｅ）、ＶＴ１０７（Ｎ－［（１Ｓ）－１－（６－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｅｔｈｙｌ］－５－［４－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ＹＡＰ－ＴＥＡＤ－ＩＮ－１（（４Ｓ）－４－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，２４Ｓ，２７Ｓ，３０Ｓ，３３Ｓ）－１５－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－ａｃｅｔａｍｉｄｏ－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－（３－ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－６－（４－ａｍｉｎｏｂｕｔｙｌ）－２４－ｂｅｎｚｙｌ－３－ｂｕｔｙｌ－９－（３－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）－２７－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）－３０－ｍｅｔｈｙｌ－１２－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｙｌ）－２，５，８，１１，１４，２３，２６，２９，３２－ｎｏｎａｏｘｏ－１８，１９－ｄｉｔｈｉａ－１，４，７，１０，１３，２２，２５，２８，３１－ｎｏｎａｚａｂｉｃｙｃｌｏ［３１．３．０］ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｅ－２１－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－６－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ａｍｉｎｏ－５－ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、Ｓｕｐｅｒ－ＴＤＵ（（４Ｓ）－５－ａｍｉｎｏ－４－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｓ）－２－［２－［（３Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－１－［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－４－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｒ）－２－［［（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－４－ａｍｉｎｏ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－５－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６－ａｍｉｎｏ－２－［［（２Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－３－ｃａｒｂｏｘｙ－２－［［（２Ｓ）－３－ｃａｒｂｏｘｙ－２－［［（２Ｓ）－２－［２－［（２Ｓ）－１－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｏｘｏｐｒｏｐａｎ－２－ｙｌ］ｈｙｄｒａｚｉｎｙｌ］－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－（１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌ－５－ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｏｘｏｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｏｘｏｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ－２－ｙｌ］－１，２，６－ｔｒｉｏｘｏｈｅｘａｎ－３－ｙｌ］ｈｙｄｒａｚｉｎｙｌ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｎｙｌｂｕｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｃａｒｂａｍｉｍｉｄａｍｉｄｏｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－４－ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］－３－ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ－２－ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］－５－ｏｘｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）およびこれらの誘導体等が挙げられる。

【0332】

工程（３）において用いられる培地は、上記定義の項で記載したようなものである限り特に限定されない。工程（３）において用いられる培地は血清培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。工程（３）において用いられる無血清培地としては、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２培地乃至Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にＮ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＨＥＰＥＳが添加された培地等が挙げられる。

【0333】

細胞構造体に含まれる細胞の生存及び分化成熟を促進する観点から、工程（３）を気相液相境界面培養法の条件下で実施することもまた好ましい。気相液相境界面培養法（Ａｉｒ ｌｉｑｕｉｄ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）とは、細胞又は組織の少なくとも一面が大気に暴露されているか、極めて近い位置にある条件での培養を表す。気相液相境界面培養法を実施するためには、例えば細胞又は組織を多孔性メンブレン上又はカルチャーインサート内で培養し、インサート内（内腔側）の培養液を抜き取り、インサート外側のウェル内の培養液のみで培養する方法、アガロース等のハイドロゲルを培養ディッシュ内に置き、その上に細胞又は組織等を置いてディッシュ内の培地から露出しつつ乾燥しない条件下で培養する方法、及び、アガロース等に包埋後、振動刃ミクロトーム等で細胞凝集体を薄切し、セルインサート内で薄切片を培養する方法等が挙げられる。主として酸素による大気への暴露の毒性を軽減する目的から、ＰＤＭＳ等の酸素透過性の膜や板を細胞又は組織等の上に置き、暴露条件を調節することもできる。上記のような気相液相境界面培養法は、例えばＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ １８．１（２０１７）：１９５、Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６，２１４７２、Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９ Ａｐｒ；２２（４）：６６９－６７９等を参照して実施することができる。

【0334】

シート状細胞構造体に含まれる細胞の生存又は増殖の促進の観点及び分化傾向の調節の観点からは、工程（３）を神経栄養因子の存在下で実施することもまた好ましい。神経栄養因子とは、神経の生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体へのリガンドである。神経栄養因子としては、例えば、Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ （ＮＧＦ）、Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ （ＢＤＮＦ）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ３ （ＮＴ－３）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ４／５ （ＮＴ－４／５）、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ ６ （ＮＴ－６）、ｂａｓｉｃ ＦＧＦ、ａｃｉｄｉｃ ＦＧＦ、ＦＧＦ－５、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ （ＥＧＦ）、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ （ＨＧＦ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １（ＩＧＦ １）、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ２ （ＩＧＦ ２）、Ｇｌｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ （ＧＤＮＦ）、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ （ＩＬ－６）、Ｃｉｌｉａｒｙ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ （ＣＮＴＦ）およびＬＩＦなどが挙げられる。また、これらの一種を単独で又は二種以上を適宜組み合わせて用いてもよい。

【0335】

工程（３）において、得られたシート状細胞構造体の積層化を行ってもよい。シート状細胞構造体の積層化は、例えば、上記製造方法によって得られたシート状細胞構造体を複数枚重ね合わせた状態で２～３０分程度インキュベートすることなどで実施できる。積層されるシート状細胞構造体の枚数は特に限定しない。例えば、２枚、３枚、４枚、５枚のシート状細胞構造体を積層することができる。積層するシート状細胞構造体の枚数が３枚以上である場合、一度に３枚積層してもよく、１枚ずつ追加で積層してもよく、積層したシート状細胞構造体同士を積層してもよい。

【0336】

また、積層化の際に、シート状細胞構造体の間に任意の物質を添加することができる。添加する物質としては、例えば、シート状細胞構造体同士の接着を促進する物質（例えば、スキャフォルド、マトリクスなど）、シート状細胞構造体間の細胞連絡を促進する物質（例えば、伸長誘導因子、遊走誘導因子など）、フィブロネクチン、増殖促進因子、栄養因子、分化促進若しくは分化抑制因子、又はそれらの組合せなどが挙げられる。添加の方法も特に限定しない。例えば、シート状細胞構造体表面に直接塗布、噴霧、滴下することにより、又は物質を投与した培地中に浸漬することにより添加を行うことができる。

【0337】

工程（３）において、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第二細胞集団を播種する物質透過性を有する膜の面の反対面に、上気道細胞以外の細胞を共培養しておくこともできる（両面培養、例えば、図２、図３Ａ、図３Ｂ）。共培養する上気道細胞以外の細胞としては例えば、神経堤細胞、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、中枢神経系の細胞、気管、気管支、肺の細胞、周皮細胞、アストロサイト、マイクログリア、脈絡叢上皮細胞、上衣細胞等が挙げられる。共培養する上気道細胞以外の細胞は初代細胞、株化細胞のいずれであってもよい。上記共培養する上気道細胞以外の細胞は、好ましくはヒトｉＰＳ細胞に由来する分化した細胞である。

【0338】

両面培養の具体的な手法としては例えば、物質透過性を有する膜からなる培養器材としてａｄ－ＭＥＤビトリゲルカルチャーインサートを用いる場合、カルチャーインサートの裏面を上に向けた後にシリコーン製等の培地保持用の囲い器具を設置し、共培養する細胞を播種し、少なくとも細胞が接着するまで培養する。その後、培地を除き、囲い器具を外し、培地中に裏面を下にしてインサートを設置した後に、インサート内部のウェルに嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む細胞集団を播種することにより、両面培養が実施可能である。

【0339】

工程（３）の別の態様として、第二細胞集団を培養器材へと播種後に、得られたシート状細胞構造体を培養器材から単離し、培養器材を含まないシート状細胞構造体を製造することもできる。上記のようなシート状細胞構造体は、例えば前記した温度応答性細胞培養基材を用いることにより製造することができる。得られた培養器材を含まないシート状細胞構造体は、前記したシート状細胞構造体の積層化等に用いることもできる。

【0340】

工程（３）の別の態様として、嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第二細胞集団を、マイクロパターンを有する培養器材上に播種し、シート状細胞構造体を製造することもできる。前記マイクロパターンは、細胞接着性領域と細胞非接着性領域から構成することができ、細胞接着性領域で細胞が接着培養されることが好ましい。前記マイクロパターンを有する培養器材は、物質透過性を有していてもよい。前記細胞接着性領域は細胞接着性の処理（ガスプラズマ処理等）が実施されているか、細胞接着を促進する物質で処理されていることが好ましい。細胞接着性領域と細胞非接着性領域は、一つの培養器材上に単一の領域が形成されていてもよいし、複数個形成されていてもよい。本態様における好ましい細胞接着促進物質は好ましくはラミニンであり、さらに好ましくはラミニン５１１ないし５２１であるが、これに限定されない。ラミニンは、Ｅ８断片であってもよい。前記細胞接着性領域は、前記温度応答性細胞培養基材であるか、温度応答性を有するポリマーによって処理されたものであってもよい。前記細胞非接着性領域は、細胞接着性の処理が実施されていない状態であるか、細胞接着を阻害する処理を実施されていることが好ましい。本態様における好ましい細胞接着阻害処理としては、例えば２－ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＭＰＣ）ポリマー、Ｐｏｌｙ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（Ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）、ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）等のコーティングによる超親水性処理、タンパク低吸着処理等が挙げられる。

【0341】

マイクロパターンを有する培養器材における細胞接着性領域は、好ましくは細胞非接着性領域により囲われている。前記細胞接着性領域の形状は適宜設定可能であるが、例えば円形、楕円形、三角形、正方形、長方形、五角形、六角形、八角形、星形等の形態に設定することができる。細胞接着性領域の形状は好ましくは円形、正方形または長方形のいずれかであるが、これに限定されない。前記細胞接着性領域の面積は適宜設定可能であるが、例えば０．１ｃｍ^２から１００ｃｍ^２であり、好ましくは０．３ ｃｍ^２から８０ｃｍ^２であり、さらに好ましくは０．５ ｃｍ^２から６０ｃｍ^２であるが、これに限定されない。前記マイクロパターンを有する培養器材に播種する第二細胞集団の細胞数は、細胞接着性領域の面積当たり例えば１×１０^３ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２～１×１０^７ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２、好ましくは１×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２～１×１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２であるが、これに限定されない。マイクロパターンを有する培養器材としては前記したものを用いるか、ＰＤＭＳ製モールドとマトリクス等を用いて培養器材を調製したものを用いることも好ましい。

【0342】

［３．上気道細胞を含むシート状細胞構造体］
本明細書において、「細胞」及び「組織」という表記は、それぞれ生体内に存在する対応する細胞及び組織と同様のマーカーによる免疫染色、形状観察その他特定の方法によってその存在を確認することができるが、「細胞」及び「組織」の機能、遺伝子発現、構造等は生体内に存在する細胞及び組織と必ずしも同一であるとは限らない。本明細書において、「細胞構造体」という表記は、細胞を含む２以上の要素から構成される物体を表す。細胞構造体は培養器材等、細胞及び生体以外の物を含んでいてもよい。「シート状」とは、２次元の面としての広がりを有し、厚みの距離を隔てて対向する第一主面および第二主面を有する形状を意味する。「シート状」は、フィルム状、膜状、箔状と把握することもできる。

【0343】

本発明の一実施形態は、上気道細胞を含むシート状細胞構造体を提供する。上記シート状細胞構造体は、上述の製造方法により製造されてもよい。本発明のシート状細胞構造体を構成する細胞数は特に限定されないが、好ましくは３０個以上であり、より好ましくは５００個以上である。上記シート状細胞構造体を構成する細胞数の上限は、特に限定されないが例えば、１×１０^７個以下であってもよいし、５×１０^６個以下であってもよい。シート状細胞構造体の大きさ（主面の面積）は、特に限定されないが、好ましくは０．４ｃｍ^２以上、より好ましくは１ｃｍ^２以上であり、さらに好ましくは３ｃｍ^２以上である。シート状細胞構造体の大きさの上限は、特に制限されないが、例えば、５０ｃｍ^２以下であってもよい。シート状細胞構造体の厚さは特に限定されないが、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは１５μｍ以上であり、さらに好ましくは２０μｍ以上である。シート状細胞構造体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、５０００μｍ以下であってもよい。

【0344】

シート状細胞構造体を構成する細胞は、好ましくは上皮構造を形成している。細胞が形成する上皮構造は、一層の細胞から構成される単層上皮、すべての細胞が基底面に接しており、なおかつ頂底方向に２つ以上の細胞が配置する偽重層上皮、複数の細胞が重なって配置されている重層上皮のいずれの構造であってもよいが、好ましくは偽重層上皮又は重層上皮である。本発明のシート状細胞構造体は、一部がひだ状に折りたたまれたシート状であってもよいし、一部が収縮したシート状等であってもよい。または、Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２０２２ Ｊａｎ ７；３７５（６５７６）に記載の方法等によって、腸の陰窩及び絨毛様構造、嗅上皮のボーマン腺等を模した立体構造（凸部及び凹部を有する立体構造）をシート状に形成してもよい。上記立体構造の凸部の高さ、凹部の深さ、及びこれらの直径等の値は適宜設定可能であるが、例えば凸部の高さ及び凹部の深さは通常１０μｍから２ｍｍの範囲で、好ましくは３０μｍから１ｍｍの範囲で、より好ましくは５０μｍから５００μｍの範囲で設定される。立体構造の直径は、通常２０μｍから１ｍｍの範囲で、好ましくは５０μｍから８００μｍの範囲で、より好ましくは１００μｍから５００μｍの範囲で設定される。

【0345】

本発明の一実施形態において、上気道細胞を含むシート状細胞構造体は、細胞及び生体以外の物として、好ましくは物質透過性を有する膜を含む。

【0346】

本発明の一実施形態において、上気道細胞を含むシート状細胞構造体は、１）基底細胞又はその前駆細胞、２）嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞、３）嗅神経細胞又はその前駆細胞の少なくとも３種の上気道細胞を含む。

【0347】

基底細胞又はその前駆細胞は、ｐ６３、サイトケラチン５、ｐ７５からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の基底細胞マーカーを発現している細胞を指し、さらにＷｔ１及びＬｇｒ５を発現していることが好ましい。

【0348】

嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞は、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｏｔｘ２、サイトケラチン、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞のマーカーを発現している細胞を指し、さらにＳｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｄｌｘ５、Ｅｍｘ２、Ｐａｘ６、ＥｐＣＡＭ、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎを発現していることが好ましい。

【0349】

嗅神経細胞又はその前駆細胞は、βＩＩＩチューブリン、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、Ｅｂｆ２、Ｌｈｘ２からなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の嗅神経細胞又はその前駆細胞のマーカーを発現している細胞を指し、さらにＮＣＡＭ、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ３、ＮｅｕｒｏＤ、Ａｓｃｌ１を発現していることが好ましい。また、本発明のシート状細胞構造体に含まれる嗅神経細胞は、好ましくは嗅覚受容体を発現しており、より好ましくは生体内の嗅上皮に局在する嗅神経細胞と同様に嗅覚情報を受容し、中枢神経系へ情報を伝達することができる。嗅神経細胞の前駆細胞とは、成熟すると嗅神経細胞となる細胞を指し、嗅神経細胞への分化能を有する細胞も含む。嗅神経細胞の前駆細胞は、好ましくは嗅上皮プラコードに存在する神経細胞と同様の性質を示す。

【0350】

すなわち、本実施形態のシート状細胞構造体は、上気道細胞を含むシート状細胞構造体であって、
前記上気道細胞は、
１）ｐ６３、サイトケラチン５、及びｐ７５からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の基底細胞マーカーを発現する基底細胞又はその前駆細胞、
２）Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ２、Ｄｌｘ５、サイトケラチン、及びＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の嗅上皮幹細胞マーカーを発現する嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞、並びに、
３）βＩＩＩチューブリン、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、Ｅｂｆ１、Ｅｂｆ２、Ｅｂｆ３、ＮｅｕｒｏＤ１、及びＬｈｘ２からなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の嗅神経細胞マーカーを発現する嗅神経細胞又はその前駆細胞、
を含んでもよい（例えば、図１の（Ａ）及び図２の（Ａ））。

【0351】

本発明の一実施形態において、上気道細胞を含むシート状細胞構造体は、嗅上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を更に含んでもよい。前記細胞としては、例えば支持細胞、ボーマン腺細胞及び嗅神経鞘細胞が挙げられる。

【0352】

支持細胞又はその前駆細胞は、ＨＩＦ２α、Ｓｏｘ２、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５及びＳｉｘ１からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。

【0353】

ボーマン腺細胞又はその前駆細胞は、サイトケラチン及びＡｓｃｌ３からなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。

【0354】

嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞はＳ１００、Ｓｏｘ１０及びビメンチンからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現している細胞を指す。嗅神経鞘細胞又はその前駆細胞のマーカーとして、例えばＢｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ２２２．４（２０１７）：１８７７－１８９５．に記載のマーカーを用いることもできる。

【0355】

支持細胞、ボーマン腺細胞もしくは嗅神経鞘細胞又はこれらの前駆細胞は、好ましくは生体内の嗅上皮又は嗅上皮プラコードに存在する支持細胞、ボーマン腺細胞もしくは嗅神経鞘細胞又はこれらの前駆細胞と同様の性質を示す。

【0356】

本発明の他の実施形態において、上気道細胞を含むシート状細胞構造体は、１）線毛細胞、２）分泌細胞の少なくとも２種の上気道細胞を含む。

【0357】

線毛細胞は、ＦｏｘＪ１、ＦｏｘＮ４、ｐ７３、アセチル化チューブリン及びβ４－Ｔｕｂｕｌｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の線毛上皮細胞マーカーを発現している細胞を指す。

【0358】

分泌細胞はムチン１、ムチン２、ムチン３、ムチン４、ムチン５ＡＣ、ムチン５Ｂ、ＦｏｘＡ１、ＦｏｘＡ２、Ｎｋｘ２．１／ＴＴＦ－１及びＳＰＤＥＦからなる群より選ばれる少なくとも１つの分泌細胞マーカーを発現している細胞を指す。

【0359】

すなわち、本実施形態のシート状細胞構造体は、上気道細胞を含むシート状細胞構造体であって、
前記上気道細胞は、
１）ＦｏｘＪ１、ＦｏｘＮ４、ｐ７３、ＭＹＢ、アセチル化チューブリン及びβ４－Ｔｕｂｕｌｉｎからなる群より選ばれる少なくとも一つ以上の線毛上皮細胞マーカーを発現する線毛細胞、並びに、
２）ムチン１、ムチン２、ムチン３、ムチン４、ムチン５ＡＣ、ムチン５Ｂ、ＦｏｘＡ１、ＦｏｘＡ２、Ｎｋｘ２．１／ＴＴＦ－１及びＳＰＤＥＦからなる群より選ばれる少なくとも１つの分泌細胞マーカーを発現する分泌細胞、
を含んでもよい（例えば、図１の（Ｂ）及び図２の（Ｂ））。

【0360】

本実施形態の他の側面において、前記シート状細胞構造体は、
Ｅｚｒｉｎ、及びＰＫＣζからなる群より選ばれる少なくとも１つを発現する、頂端面を含み、
前記上気道細胞は、前記頂端面と培養器材との間に、上皮構造を形成していて、
前記上気道細胞は、上皮細胞極性を有し、
前記シート状細胞構造体を構成する細胞の少なくとも７０％が、前記上皮構造中に局在していて、
前記上皮構造は、前記培養器材に接している基底細胞を含むことが好ましい（例えば、図１、図２）。

【0361】

本発明の他の実施形態において、上気道細胞を含むシート状細胞構造体は、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞を更に含んでもよい。前記細胞としては、例えばクラブ細胞、基底細胞、塩類細胞、神経内分泌細胞、孤立化学感覚上皮細胞等が挙げられる。鼻腔上皮を構成する細胞は、これらの細胞を少なくとも１種、好ましくは複数種の細胞を含む。

【0362】

鼻腔上皮は主として外胚葉性の非神経上皮に由来するため、鼻腔上皮を構成する細胞又はその前駆細胞は、好ましくは外胚葉マーカーを発現する。鼻腔上皮を構成する細胞の前駆細胞とは、成熟すると鼻腔上皮を構成する細胞になる細胞を指し、鼻腔上皮を構成する細胞への分化能を有する細胞も含む。

【0363】

鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくはクラブ細胞を含む。クラブ細胞又はその前駆細胞は、ＳＣＧＢ１Ａ１、ＳＣＧＢ３Ａ２、Ｃｙｐ２ｆ２、ｕｒｏｐｌａｋｉｎ３ａ、Ｃｌｄｎ１０、Ａｏｘ３、Ｐｏｎ１及びＣｃｋａｒからなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。クラブ細胞は、サイトケラチン４及びサイトケラチン１３から選ばれる少なくとも１つを発現しているＨｉｌｌｏｃｋ細胞を含んでいてもよい。

【0364】

鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは基底細胞を含む。基底細胞は、非神経上皮組織の基底面に位置し、好ましくは基底膜構造上に整列する。基底細胞又はその前駆細胞は、好ましくはサイトケラチン５、サイトケラチン１４、サイトケラチン１５、ｐ６３、ΔＮｐ６３及びｐ７５からなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。

【0365】

鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは塩類細胞を含む。塩類細胞又はその前駆細胞は、ＣＦＴＲを発現し、好ましくはＦｏｘｉ１、液胞型プロトンＡＴＰａｓｅ（ｖａｃｕｏｌａｒ Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅ、Ｖ－ＡＴＰａｓｅ）、Ａｓｃｌ３、Ｔｆｃｐ２ｌ１及びＤＭＲＴ２からなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。

【0366】

鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは神経内分泌細胞を含む。神経内分泌細胞又はその前駆細胞は、Ａｓｃｌ１、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ Ａ、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｉｓｉｎ、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）からなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。

【0367】

鼻腔上皮を構成する細胞は、好ましくは孤立化学感覚上皮細胞を含む。孤立化学感覚上皮細胞又はその前駆細胞は、ＣｈＡＴ／Ｔｒｐｍ５、Ｐｏｕ２ｆ３／Ｓｋｎ－１ａ、Ｔａｓ２ｒ、Ｇｎａｔ３、Ｐｌｃｂ２からなる群から選ばれる少なくとも１つを発現している細胞と定義することができる。

【0368】

本発明の一実施形態において、上気道細胞を含むシート状細胞構造体は、シート状細胞構造体の第一主面に上気道細胞を含み、第二主面に上気道細胞以外の細胞を含む細胞構造体である（例えば、図２の（Ａ）及び（Ｂ））。上記シート状細胞構造体に含まれる上気道細胞以外の細胞は特に限定されないが、上記第二主面における上気道細胞の生存、増殖、分化成熟、及び機能発揮、並びに、シート状細胞構造体の移植先組織への生着等を促進する作用がある細胞が好ましい。

【0369】

別の上記シート状細胞構造体に含まれる上気道細胞以外の細胞としては、上記第二主面における上気道細胞との相互作用、ウイルス・病原体等の伝播が生じる細胞であることもまた好ましい。上記シート状細胞構造体に含まれる上気道細胞以外の細胞としては例えば、神経堤細胞、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、中枢神経系の細胞、気管、気管支、肺の細胞、周皮細胞、アストロサイト、マイクログリア、脈絡叢上皮細胞、上衣細胞等が挙げられる。上記シート状細胞構造体に含まれる上気道細胞以外の細胞は、初代細胞、株化細胞のいずれであってもよい。上記シート状細胞構造体に含まれる上気道細胞以外の細胞は、好ましくはヒトｉＰＳ細胞に由来する細胞である。

【0370】

上記シート状細胞構造体に含まれる上気道細胞は、嗅上皮を構成する細胞を含むか、又は鼻腔上皮を構成する細胞を含む。上記シート状細胞構造体はさらに物質透過性を有する膜を含み、上気道細胞は物質透過性を有する膜のある面（第一主面側の面）に接着し、上気道細胞以外の細胞はその反対面（第二主面側の面）に接着している。

【0371】

本発明の一実施形態において、上気道細胞を含むシート状細胞構造体は、細胞及び生体以外のものとして、好ましくは物質透過性を有する膜を更に含む。本実施形態の一側面において、上記細胞が接着している上記膜は足場材料の表面に設置されていて、細胞シートと足場材料との複合体が形成されていてもよい。

【0372】

上記足場材料は、生体への移植の実施の観点から、生体適合性を有する材料であることが好ましい。上記のような材料としては、例えばハイドロキシアパタイト、β－ＴＣＰなどのリン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の無機化合物、チタン等の金属、及び高分子材料等が挙げられる。当該高分子は、合成高分子と天然高分子の２種類に分けられる。合成高分子としては、例えば生分解性ポリウレタン、ポリＬ－乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸とグリコール酸の共重合体（ＰＬＧＡ）、及びポリカプロラクトン（ＰＣＬ）等が挙げられる。天然高分子としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、及びポリペプチド等が挙げられる。上記高分子は、好ましくは生分解性または生体吸収性の材料である。

【0373】

上記高分子は、好ましくは物質透過性を有する多孔質体ハイドロゲルとして形成される。上記高分子を繊維、不織布、織物、スポンジ等の材料に加工し、目的とする組織の形状に合わせてロープ、シート、チューブ、ブロック状等の形に成形して足場材料に利用することができる。

【0374】

本発明の上気道細胞を含むシート状細胞構造体に含有される細胞は、好ましくは感染症に関連する因子、例えばウイルス受容体、ウイルス感染関連因子、パターン認識受容体を発現している。ウイルス受容体、ウイルス感染関連因子としては、上気道に感染するウイルスの受容体又はウイルス感染関連因子であってよい。ウイルス受容体、ウイルス感染関連因子は、例えばＡＣＥ２、Ｔｍｐｒｓｓ２、ＮＲＰ１、ＣＴＳＢ、ＣＴＳＬ、ＢＳＧ、ＨＳＰＡ５、ＤＰＰ４、ＦＵＲＩＮ、ＡＮＰＥＰ、Ｔｍｐｒｓｓ１１Ｄ、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴ３ＧＡＬ４、ＣＥＡＣＡＭ１、シアル酸α２，６Ｇａｌ及びシアル酸α２，３Ｇａｌ等が含まれる。

【0375】

本発明の上気道細胞を含むシート状細胞構造体に含有される細胞は、ウイルス感染関連因子又は疾患関連遺伝子が欠損若しくは変異していてもよい。すなわち、前記上気道細胞は、遺伝性疾患又は感染症に関連する遺伝子、及び、ウイルス受容体又はウイルス感染関連因子をコードする遺伝子からなる群より選ばれる一つ以上の遺伝子が欠損又は変異していてもよい。このような細胞を含む細胞集団は、例えば後述する再生医療用途の移植用細胞（移植用組成物）、疾患モデル（例えば、上気道の疾患モデル）、化合物（例えば、疾患治療用化合物）のスクリーニング等に利用できる。ウイルス感染関連因子は、例えばウイルス受容体を含み、ＡＣＥ２を含む。ウイルス感染関連因子を欠損又は変異させることにより、ウイルス感染に対する抵抗性を有することが期待される。

【0376】

疾患関連遺伝子は、例えば遺伝性疾患に関連する遺伝子又は感染症に関連する遺伝子である。遺伝子が欠損若しくは変異した嗅上皮または鼻腔上皮を構成する細胞、或いはそれらの前駆細胞は、遺伝病の患者から樹立又はゲノム編集を施した多能性幹細胞から分化させて得ることができる。疾患としては、例えば嚢胞性線維症、線毛機能不全症候群、カルマン症候群、カルタゲナー症候群、ムコ多糖症、喘息等が挙げられる。別の態様の疾患関連遺伝子は、鼻腔又は上気道の癌及び腫瘍発生に関わる遺伝子である。このような疾患関連遺伝子としては、例えばＡＢＬ１、ＢＲＡＦ、ＤＤＲ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＦＲＫ、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＡＰＫ１１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＲＡＦ１、ＲＥＴ、ＴＥＫ、ＴＲＮＡＫ２、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＫＭＴ２Ｄ、ＦＢＸＷ７、ＳＭＡＲＣＢ１、ＰＲＥＸ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＦＡＮＣＡ、ＩＤＨ２、ＰＲＫＤＣ、ＨＲＡＳ、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＦ１、ＴＳＣ２、ＥＰＨＡ７、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＡＴＲＸ、ＡＲＩＤ２、ＡＫＴ３、ＢＲＣＡ２、ＢＣＬ６、ＡＳＸＬ１、ＡＲ、及びＡＬＫ等が挙げられるが、これらに限定されない。鼻腔又は上気道組織の正常部及び病変部から細胞を採取し、ｉＰＳ細胞を樹立し、本願に記載のシート状細胞構造体に含有される細胞を調製することもできる。

【0377】

製造された上気道細胞を含むシート状細胞構造体中に含まれる細胞及び組織を検出する手法については特に限定されないが、信頼性と再現性が高く簡便に実施できる手法が好ましい。一例として顕微鏡による光学的な観察、各細胞又は組織マーカーに対する抗体を用いた免疫染色、マーカー遺伝子に対するリアルタイムＰＣＲ法等の遺伝子発現解析、シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ解析、電子顕微鏡による細胞種特異的な微細構造物の観察、マウス、ラット等への移植等が挙げられる。好ましくは上記記載のマーカーに対する抗体を用いた免疫染色又はシングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ解析である。

【0378】

免疫染色の結果の解釈は、当業者の目視による判別、又は撮影した画像に対する画像解析ソフト等を用いた定量的な解析等、当業者に周知の方法により行うことができる。免疫染色の結果の解釈に当たっては、例えば蛋白質核酸酵素Ｖｏｌ．５４ Ｎｏ．２（２００９）Ｐ１８５－１９２等を参照し、自家蛍光、二次抗体の非特異的吸着、多重染色時の蛍光の漏れこみ等により生じる偽陽性を排除せねばならない。

【0379】

シングルセルＲＮＡ－Ｓｅｑ解析の結果は、例えば得られた細胞集団の発現プロファイルを公知のデーターベース等の生体の組織のプロファイルと比較し、その遺伝子発現、構成する細胞集団の類似性から製造された細胞集団中に含まれる細胞及び組織を推定することができる。

【0380】

本実施形態に係るマイクロ流体チップ又は生体模倣システムは、
１）上記シート状細胞構造体、及び
２）前記上気道細胞以外の細胞、細胞集団のいずれか一つ以上、
を搭載する（例えば、図３Ａ、図３Ｂ）。上記マイクロ流体チップ又は生体模倣システムは、疾患治療用化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット、上気道の疾患モデルとしての利用、対象物質の薬効又は毒性の評価方法及び評価キット、疾患特異的なバイオマーカーの探索方法、移植用組成物、ウイルス又は微生物の分離培養、並びに、担上気道組織モデル動物又は担ヒト組織モデル動物として用いることが可能である。

【0381】

本発明の一実施形態は、上述の「上気道細胞を含むシート状細胞構造体」を用いた上気道のインビトロ疾患モデルを提供する。より具体的には、上気道細胞を含むシート状細胞構造体は、ウイルス及び微生物等の病原体による感染症の疾患モデルとして使用することができる。上気道細胞を含むシート状細胞構造体のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば上記構造体に病原体を接触させる工程と、病原体の増殖を検出する等の構造体における病原体の感染を確認する工程と、を含む。さらに、感染した細胞を解析することで、病原体の標的細胞の同定、宿主因子の解析を行うこともできる。上気道細胞を含むシート状細胞構造体の他のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば上記シート状細胞構造体に病原体を接触させる工程と、評価対象物質を接触させる工程と、病原体の増殖を検出する工程を含み、評価対象物質の薬効評価系として利用できる。上気道のインビトロ疾患モデルとしては、例えばＷＯ２０２２／０２６２３８に記載の方法によって行ってもよい。

【0382】

本発明の一実施形態は、上述の「上気道細胞を含むシート状細胞構造体」を用いた上気道の遺伝子治療の評価システムを提供する。より具体的には、上気道細胞を含むシート状細胞構造体は、遺伝子治療に用いるベクターの目的遺伝子の細胞への導入効率、ウイルス及び微生物等の病原体による感染症の疾患モデルとして使用することができる。上気道細胞を含むシート状細胞構造体の遺伝子治療の評価システムとしての使用方法は、例えば上記シート状細胞構造体にベクターを接触させる工程と、病原体の増殖を検出する等の構造体における病原体の感染を確認する工程と、を含む。さらに、感染した細胞を解析することで、病原体の標的細胞の同定、宿主因子の解析を行うこともできる。上気道細胞を含むシート状細胞構造体の他のインビトロ疾患モデルとしての使用方法は、例えば上記シート状細胞構造体に病原体を接触させる工程と、評価対象物質を接触させる工程と、病原体の増殖を検出する工程を含み、評価対象物質の薬効評価系として利用できる。上気道のインビトロ疾患モデルとしては、例えばＷＯ２０２２／０２６２３８に記載の方法によって行ってもよい。

【実施例0383】

以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。本明細書において、細胞の免疫染色結果の判断基準は、国際公開第２０２０／０３９７３２号の予備実験１と同じである。免疫染色結果の判断基準は、当業者であれば適宜設定可能であるが、例えば対象の試料の連続切片を用いて、染色時に一次抗体を添加せず蛍光標識二次抗体のみで処理する陰性対象を調製し、陰性対象上の組織の近傍領域の染色結果に対して少なくとも３倍の輝度・蛍光強度を示す結果を陽性とみなすことができる。

【0384】

［実験１：嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む細胞塊の製造方法］
図４の上段に示す培養工程に従って、多能性幹細胞から嗅上皮様組織を含む非神経上皮組織を含む細胞塊（嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第一細胞集団）を製造した。多能性幹細胞として、ヒトｉＰＳ細胞（１２３１Ａ３株、理研ＢＲＣより入手及びβ－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ株、メルク社より購入）を用いた。多能性幹細胞は、国際公開第２０２０／０３９７３２号に記載の通り、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４（２０１４）に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件で維持培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（ＡＫ０２Ｎ、味の素株式会社製）、フィーダーフリー足場にはＬａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８（株式会社ニッピ製）を用いた。ＳｔｅｍＦｉｔ培地は未分化維持因子としてｂＦＧＦを含む培地である。

【0385】

具体的な維持培養操作としては、まずサブコンフルエントになったヒトｉＰＳ細胞を、５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて２回洗浄後、さらに５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳで３７℃１０分間インキュベート処理した。インキュベート処理後の培養器材（培養ディッシュ）より５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳを除去した後、ＳｔｅｍＦｉｔ培地を添加してピペッティングを行い、培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散した。その後、単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１－Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー培養した。プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、細胞培養用、培養面積９．５ｃｍ^２）を用いた場合、単一細胞へ分散されたヒトｉＰＳ細胞の播種細胞数は５×１０^３細胞／ウェル、１０ｃｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、細胞培養用、培養面積５８ｃｍ^２）を用いた場合３×１０^４細胞／ディッシュとした。播種した１日後に、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に全量培地交換した。以降、１日～２日に１回、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地にて全量培地交換した。播種後７日間、サブコンフルエント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になるまで培養した。

【0386】

培養したヒトｉＰＳ細胞を分化誘導に用いる際には、播種した６日後にＳＢ４３１５４２（ＴＧＦ－βシグナル伝達経路阻害物質、富士フイルム和光純薬株式会社製、終濃度５μＭ、図４等では「ＳＢ４３１」と表記）とＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル経路作用物質、Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、終濃度３００ｎＭ）を添加して２４時間培養した（工程（ｉ）開始）。

【0387】

調製したサブコンフルエントのヒトｉＰＳ細胞を、上記継代時と同様に５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにてインキュベート処理した。分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散した。

【0388】

その後、単一細胞に分散されたヒトｉＰＳ細胞を、非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６Ｖ底プレート、ＭＳ－９０９６Ｖ、住友ベークライト株式会社製）に、１ウェルあたり１．３５×１０^４細胞になるように１００μｌの無血清培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）とＩＭＤＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）との混合液（体積比１：１）に、５％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、４５０μＭ １－モノチオグリセロール（富士フィルム和光純薬株式会社社製）、１ｘ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン－５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社製）を添加した無血清培地を用いた（工程（ａ）開始）。以降、この無血清培地を５％ ＫＳＲ ｇｆＣＤＭともいう。

【0389】

浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（ａ）開始）に、上記無血清培地にＹ－２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ－２（Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、終濃度１μＭ）、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦシグナル伝達経路阻害物質、富士フィルム和光純薬株式会社製、終濃度１μＭ）、ＲｅｐＳｏｘ（ＴＧＦシグナル伝達経路阻害物質、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、終濃度１μＭ）、ＪＮＫ－ＩＮ－８（ＪＮＫシグナル伝達経路阻害物質、メルク社製、終濃度１μＭ）を添加した。

【0390】

浮遊培養開始後１日目に、Ｙ－２７６３２、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＲｅｐＳｏｘ、ＪＮＫ－ＩＮ－８、ＢＭＰ４（ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、終濃度０．５ｎＭ）を含む無血清培地を１ウェルあたり５０μｌ加えた（工程（ｂ）開始）。

【0391】

さらに、浮遊培養開始後３日目にＢＭＰ４を含まず、Ｙ－２７６３２、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＲｅｐＳｏｘ、ＪＮＫ－ＩＮ－８、５Ｚ－７－Ｏｘｏ Ｚｅａｅｎｏｌ（ＴＡＫ１阻害物質、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、終濃度２μＭ）、Ｋ０２２８８（ＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、終濃度３００ｎＭ）を含む無血清培地を、１ウェルあたり５０μｌ加えた（工程（ｃ）開始）。以降、培養６、１０、１３、１７、２０日目に同様に半量培地交換を行った。培養１０日目以降の培地交換の際に、１ｍＭ Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、２５０μＭ アスコルビン酸２リン酸（ＡＡ２Ｐ）、５００μＭ ニコチンアミド（ＮＡＤ）、培養１３日目以降の培地交換の際に、ヒト組替ＥＧＦ（ＰｒｉｍｅＧｅｎｅ社製、終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。

【0392】

浮遊培養開始後２３日目に倒立顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＢＩＯＲＥＶＯ）を用いて、β－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ株由来の細胞凝集体の偏斜照明による明視野観察および蛍光観察を行った（図４のＡ及びＢ）。上記分化誘導法により直径約４００μｍから６００μｍ程度の球状の細胞凝集体（第一細胞集団）が形成されていた。球状の細胞凝集体の表面には、観察時に明るく表示される、厚みを持った上皮様の構造が形成されており、肥厚した上皮であるプラコードの特徴を示していた。β－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ株がβ－ａｃｔｉｎプロモーター下で恒常発現している蛍光タンパク質ＧＦＰに対する蛍光観察を実施したところ、細胞塊内部の細胞凝集部分と細胞塊表面の厚みを持った上皮様構造の二重構造を有していることが示された。１２３１Ａ３株由来の細胞凝集体も、細胞凝集体の外側に厚みを持った上皮様の構造が形成されており、β－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ株由来の細胞凝集体と同様の形態を呈していた。

【0393】

上記浮遊培養開始後２３日目の１２３１Ａ３株由来の細胞凝集体を、先端口径が太い２００μｌチップで培養用チューブに回収し、ＰＢＳで２回洗浄作業を行った後、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（富士フィルム和光純薬株式会社社製）で室温１５分固定した。固定後の細胞凝集体をＰＢＳで３回洗浄した後、２０％スクロース／ＰＢＳに４℃で少なくとも一晩浸漬し凍結保護処理を行った。凍結保護処理後の凝集体をクリオモルド＜２号＞（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ社製）に移し、細胞凝集体の周囲の余分な２０％スクロース／ＰＢＳをマイクロピペッターで除いた後にＯ．Ｃ．Ｔコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ社製）に包埋し、ドライアイスで冷却したアルミヒートブロック上で急速凍結し、凍結切片作製用のブロックを作製した。上記凝集体を包埋したブロックからライカＣＭ１９５０クライオスタット（Ｌｅｉｃａ社製）により１０μｍ厚の凍結切片を作製し、クレストスライドグラスもしくはＭＡＳコートスライドグラス（松浪硝子工業株式会社製）に張り付けた。スライドグラス上の凍結切片の周囲を免疫組織化学用パップペン（大道産業株式会社製）で囲んだ後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００／ＴＢＳで室温１０分間透過処理し、続けてブロッキング試薬Ｎ－１０２（日油株式会社製）とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＴＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の混合液（体積比１：４）で室温３０分間ブロッキング処理を行った。

【0394】

ブロッキング処理後の凍結切片に関し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＴＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで希釈した一次抗体をスライドグラス１枚あたり２５０μｌ添加し、湿箱中にて４℃で一晩反応させた。一次抗体処理後の凍結切片を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳで室温１０分間処理する洗浄操作を３回行った後に、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＴＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで二次抗体を希釈し、希釈液をスライドグラス１枚あたり２５０μｌ添加し、室温の暗所で１時間反応させた。二次抗体処理後の凍結切片を０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳで室温１０分間処理する洗浄操作を３回行った後に、純水で凍結切片を一回洗浄し、その後、ＮＥＯカバーグラス（松浪硝子工業株式会社製）とスライドグラス１枚当たり３０μｌのＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｌａｓｓ封入剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて凍結切片を封入した。封入後の標本を室温の暗所で一晩静置してＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｌａｓｓ封入剤を固化させたのち、透明のマニキュアでカバーグラスの周囲をコーティングし室温の暗所で風乾後、蛍光顕微鏡による観察を行った（図５）。標本の観察及び画像の取得には正立蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）及び附属ソフトウェアのＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎを用いた。

【0395】

一次抗体としては、表１に記載の抗体を用いた。二次抗体としては、表２に記載の蛍光標識抗体を用いた。これらの抗体を用いて多重染色を行った。核の対比染色には１μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を二次抗体希釈液中に添加した。

【0396】

【表1】

【0397】

【表2】

【0398】

その結果、１２３１Ａ３株由来の培養２３日目の細胞凝集体の表面に、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、サイトケラチン１８、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の細胞を含む上皮様の構造が形成されていることが示された。また、細胞凝集体の表面はＥｚｒｉｎ陽性であり頂端面側であった。細胞塊の内部は核の構造が崩れた死細胞が多く含まれていた。細胞塊の表面部分を中心に局在する生細胞のうち、少なくとも８０％以上がＯｔｘ２陽性の外胚葉系の細胞であった。また、Ｋｉ６７陽性の増殖性の細胞も当該生細胞中に含有されていた。上記遺伝子発現の結果から、上記細胞凝集体は少なくとも８０％以上が外胚葉系の細胞であり、外胚葉系の細胞中に増殖性を有する嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含んでいることが示された。上記細胞凝集体は本願の第一細胞集団に相当し、上記分化誘導法にて第一細胞集団が製造可能なことが示された。

【0399】

［実験２：ヒトｉＰＳ細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドに対するシングルセル解析］
実験１及び図６の上段に記載の方法で調製した培養２０日目のヒトｉＰＳ細胞株１２３１Ａ３株由来の、第一細胞集団に相当する嗅上皮・鼻腔上皮オルガノイドより調製した細胞を実験に用いた。具体的な手法としては、浮遊培養開始後２０日目に倒立顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＢＩＯＲＥＶＯ）を用いて明視野観察を行った後に、シングルセル解析を実施した（図５のＡ）。シングルセル解析用の試料調製の条件としては、１条件あたりオルガノイド９個を低吸着１５ｍｌチューブ（住友ベークライト社製、ステムフル）に回収し、ＰＢＳで洗浄した。その後、１０Ｕ／ｍＬ ｐａｐａｉｎ（ナカライテスク社製）及び１００μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製、ＤＰ）により３７℃２０分間インキュベート処理した。その際の反応液にはＨＢＳＳ（－）（ナカライテスク社製）に５ｍＭ Ｌ－Ｃｙｓｔｅｉｎ（富士フイルム和光純薬社製）、６μＭ ２－メルカプトエタノール（富士フイルム和光純薬社製）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）、１０μＭ Ｙ－２７６３２を添加したものを用いた。

【0400】

上記パパインによる組織分散処理後にＰ１０００のマイクロピペットを用いて単一細胞に分散後、４ｍｌの５％ＫＳＲ ｇｆＣＤＭを添加し、さらに孔径４０μｍのセルストレーナーを用いて夾雑物を除去した。上記細胞懸濁液をスイングローターで遠心し（１０００ｒｐｍ、５分）、上清を除いた後に細胞のペレットを１０μＭ Ｙ－２７６３２及び１００μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉを添加した５％ＫＳＲ ｇｆＣＤＭで懸濁し、３７℃５分間インキュベート処理した後に細胞数を計測した。約３ｘ１０^５個の細胞を含有する懸濁液を再度スイングローターで遠心し（１２０Ｇ、５分）、上清を除いた後に、氷冷したＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ中のＳａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを６００μｌ添加し、細胞を再度懸濁した。以降の工程をキット付属の手順書に従い、ＢＤ Ｒｈａｐｓｏｄｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍＲＮＡ ａｎｄ ＡｂＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用いてシングルセル解析用のｃＤＮＡライブラリを調製した。調製した各サンプルのｃＤＮＡライブラリを大規模シーケンサーＨｉＳｅｑＸ＿Ｔｅｎ（イルミナ社製）により塩基配列を解読し、得られたデータをＳｅｖｅｎ Ｂｒｉｄｇｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社のプラットフォームにより一次解析を実施して遺伝子発現マトリックスを算出した。その後、シングルセルデータ解析用ソフトＳｅｑＧｅｑ ｖ１．８（ＦｌｏｗＪｏ社製）により二次解析を実施した。

【0401】

得られた遺伝子発現マトリックスに対し主成分解析（ＰＣＡ）及びＵＭＡＰ（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）による次元削減を実施し、ｋ最近傍法に基づくＰｈｅｎｏＧｒａｐｈアルゴリズムを適用したクラスタリングにより得られたプロット図を図７に示す。クラスタリングの結果、上記オルガノイドに含まれる細胞を嗅上皮・鼻腔上皮を含む非神経上皮・上気道細胞の細胞集団（ＯＥ／ＮＥ）と中枢神経系の細胞集団（ＣＮＳ）に分類できた。各細胞集団はさらにサブクラスターに分類が可能であり、非神経上皮・上気道細胞の細胞集団にはＤｌｘ５、Ｐａｘ６、Ｓｐ８、Ｓｉｘ１、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ２、Ｋｉ６７の発現が高い嗅神経幹細胞のクラスター、Ｅｂｆ２、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｌｈｘ２の発現が高い嗅神経前駆細胞のクラスター、Ｅｂｆ２、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｌｈｘ２、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎの発現が高く、Ｋｉ６７の発現が低い未成熟嗅神経細胞のクラスターを含有していることが示された。中枢神経系の細胞集団にはＳｏｘ１、Ｐａｘ６、Ｋｉ６７陽性の中枢神経性の神経前駆細胞、及びＲａｘ、Ｖｓｘ２陽性の網膜細胞のクラスター、その他の神経核、領域特異的な神経のクラスターを含有していることが示された（図８、９、１０、１１）。

【0402】

［実験３：シングルセル解析によるヒトｉＰＳ細胞由来嗅上皮・鼻腔上皮細胞表面マーカーの同定］
実験２に記載の方法で得られたシングルセル解析データを用いて、ヒトｉＰＳ細胞由来嗅上皮幹細胞を含む嗅上皮・鼻腔上皮細胞集団において発現している表面マーカーの同定を試みた。具体的な手法としては、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０： ｅ０１２１３１４に記載の１４９２種のヒトの細胞表面タンパク質をコードする遺伝子のうち、嗅上皮・鼻腔上皮を含む非神経上皮・上気道細胞の細胞集団とそれ以外の細胞集団間で発現量差のある遺伝子を抽出した。上記手法で得られた遺伝子の発現量差の表及びシングルセル解析のプロット図を図１２～図１６に示す。

【0403】

その結果、ヒトの細胞表面タンパク質をコードする遺伝子のうち、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｌｄｎ４、Ｃｌｄｎ６、Ｃｌｄｎ７、ＬＡＭ１Ｂ、ＦＲＥＭ２、ＴＡＣＳＴＤ２、ＩＧＳＦ１、Ｆ１１Ｒ、ＦＲＡＳ１、ＳＯＲＬ１が嗅上皮・鼻腔上皮を含む非神経上皮・上気道細胞の細胞集団において高発現しており、これらのタンパク質を特異的に認識する抗体等の試薬が、細胞塊からの嗅上皮幹細胞を含む嗅上皮・鼻腔上皮細胞の同定及び精製に応用可能であることが示された（図１２、１３、１４、１５、１６）。加えて、ＡＴＰ１Ｂ２、ＣＤ８２、ＣＤＨ６、ＣＤＯＮ、ＣＥＬＳＲ２、ＣＬＵ、ＣＮＴＦＲ、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＰ、ＣＲＢ２、ＤＣＴ、ＤＫＫ３、ＥＦＮＢ１、ＦＢＬＮ２、ＦＢＮ２、ＦＮ１、ＧＰＭ６Ｂ、ＩＳＬＲ２、ＬＲＰ２、ＬＲＲＣ４Ｂ、ＭＭＲＮ１、ＰＲＥＬＰ、ＰＲＳＳ３５、Ｓ１ＰＲ３、ＳＤＫ２、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＯＲＣＳ１、ＴＦＰＩ、ＴＨＳＤ７Ａ、ＴＨＹ１、ＴＭＥＭ１３２Ｂ、及びＴＳＰＡＮ１８が神経前駆細胞、網膜細胞等を含む中枢神経系の細胞集団において高発現しており、これらのタンパク質を特異的に認識する抗体等の試薬が、細胞塊からの嗅上皮幹細胞を含む嗅上皮・鼻腔上皮細胞の同定及び精製する際に、副次的に生成する目的外細胞の除去に用いることができることが示された（図１２）。

【0404】

［実験４：ヒトｉＰＳ細胞からの細胞塊の調製、及びＥｐＣＡＭ陽性嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の精製］
図１７の上段及び実験１に記載の培養工程に従って製造した嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む細胞塊から、ＥｐＣＡＭ陽性嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を精製した。具体的な製造方法としては、図１７上段に記載の通りヒトｉＰＳ細胞株１２３１Ａ３由来の培養開始２３日目の細胞塊（第一細胞集団）を低吸着１５ｍｌチューブ（住友ベークライト社製、ステムフル）に回収し、ＰＢＳで洗浄後、１０Ｕ／ｍＬ ｐａｐａｉｎ（ナカライテスク社製）（終濃度）により３７℃、２０分間インキュベート処理した。その際の反応液にはＨＢＳＳ（－）（ナカライテスク社製）に５ｍＭ Ｌ－Ｃｙｓｔｅｉｎ（富士フイルム和光純薬社製）（終濃度）、６μＭ ２－メルカプトエタノール（富士フイルム和光純薬社製）（終濃度）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）（終濃度）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（終濃度）を添加し、ｐＨを７．２に調製したものを用いた。５分間に１回程度、チューブのタッピングにより沈殿した細胞塊を混和した。上記インキュベート処理後にＰ１０００のマイクロピペットと低吸着チップを用いてピペッティングにより単一細胞に分散した。分散後の細胞懸濁液にＨＢＳＳ（－）に５ｍＭ ＭｇＳＯ_４（終濃度）、２００μｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ Ｉ（終濃度）、２０μＭ Ｅ－６４（システインプロテアーゼ阻害剤、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）（終濃度）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（終濃度）を添加した反応液を等量添加し、室温で５分間処理し、パパインの不活化とＤＮＡの切断処理による粘性の低減を実施した（工程（１））。

【0405】

前記工程（１）で得られた細胞懸濁液中の生細胞数をトリパンブルー染色法により計数した。その後、細胞懸濁液をスイングローターで遠心し（１２０Ｇ、５分間）、上清を除いた後に細胞のペレットを２ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞分離用バッファーで再懸濁した。その際の細胞分離用バッファーには、ＨＢＳＳ（－）に２％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（終濃度）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（終濃度）、１０μＭ Ｙ－２７６３２（終濃度）を添加したものを用いた。前記細胞懸濁液の一部をＦＡＣＳでの解析用に１．５ｍｌチューブに分取した後、当該細胞懸濁液にＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を当該細胞懸濁液の１／１００量（体積比）添加し、氷上で１５分間反応させた。反応後の細胞懸濁液に、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ、前記実験３で同定した細胞表面タンパク質のうちの一つ）を特異的に認識するＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ， ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、１３０－０６１－１０１）を反応液の１／１０量（体積比）添加し、氷上で３０分間反応させた。その際に、約１０分ごとにタッピングにより沈殿した細胞を再度懸濁させた。反応後の細胞懸濁液に前記細胞分離用バッファーを添加して洗浄し、スイングローターで遠心し（１２０Ｇ、５分間）、上清を除いた後に細胞のペレットを２ｘ１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞分離用バッファーで再懸濁した。得られた細胞懸濁液を、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ及びＬＳ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、１３０－０９１－０５１及び１３０－０４２－４０１）を用いて、機器の手順書に従いＭＡＣＳ陽性画分の細胞（第二細胞集団）を回収した（工程（２））。陽性画分の細胞の一部をＦＡＣＳでの解析用に１．５ｍｌチューブに分取した。

【0406】

工程（２）の途中で分取したＭＡＣＳ精製前の細胞集団（第一細胞集団）及び精製後の細胞集団（第二細胞集団）それぞれに、ＡＰＣ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、１３０－１１１－１１７）を添加し、氷上で３０分間反応させた。反応後の細胞懸濁液それぞれに前記細胞分離用バッファーを添加して洗浄し、アングルローターで遠心（１２０Ｇ、５分）した。遠心処理後、上清を除いた後に細胞のペレットを１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように細胞分離用バッファーで再懸濁した。その際に、死細胞判別の為にヨウ化プロピジウム（同仁化学研究所製、Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ ＰＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｐ３７８）を終濃度１μｇ／ｍｌで添加した。上記染色後の細胞懸濁液を、セルソーター（ＳＯＮＹ社製、ＭＡ９００）により解析し、精製前及び精製後のＥｐＣＡＭ陽性細胞の割合を求めた（図１７）。その際に、未染色の細胞懸濁液を陰性対象とした。その結果、精製前の細胞懸濁液（第一細胞集団）では約１１．５％がＥｐＣＡＭ陽性であった。さらに、精製後の細胞懸濁液（第二細胞集団）では約８８％がＥｐＣＡＭ陽性であり（図１７、下段の左）、精製により、第一細胞集団と比較して嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む嗅覚系の細胞の割合が高まっていることが示された。また、ＭＡＣＳ陰性の通過画分は９９％以上がＥｐＣＡＭ陰性であった（図１７、下段の右）。

【0407】

［実験５：分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いたヒトｉＰＳ細胞からの細胞塊の調製、及びＥｐＣＡＭ陽性嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞の精製］
図１８の上段に記載の培養工程に従って製造した嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む細胞塊から、ＥｐＣＡＭ陽性嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を精製した。具体的な手法としては、以下の通りである。まず、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ ８００， ６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（３４８２１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）のウェルに２ｍｌのＡｎｔｉ－Ａｄｈｅｒｅｎｃｅ Ｒｉｎｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０７０１０、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加した。上記６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを、スイングローター遠心機によって遠心処理し、溶液中の気泡を除去した。遠心後にＲｉｎｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを除き、後述する分化誘導用の無血清培地によって各ウェルを洗浄した。その後、新しい無血清培地５ｍｌを各ウェルに添加し、１時間程度、ＣＯ_２インキュベーター中に静置し平衡化した。

【0408】

その後、工程（ｉ）を実施し、調製したサブコンフルエントのヒトｉＰＳ細胞株β－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ株を、上記継代時と同様に５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて処理した。細胞回収時に分化誘導用の無血清培地を添加し、ピペッティングを行って培養ディッシュ表面から細胞を剥がし、単一細胞へ分散した。事前に調製したＡｇｇｒｅＷｅｌｌ ８００， ６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ中で、１ウェルあたり５．４×１０^６細胞になるように平衡化した５ｍｌの無血清培地に当該単一細胞を懸濁した。その後、当該単一細胞を３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で浮遊培養した。その際の無血清培地には、５％ ＫＳＲ ｇｆＣＤＭを用いた（工程（ａ）開始）。

【0409】

浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目、工程（ａ）開始）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（終濃度２０μＭ）、ＩＷＰ－２（終濃度１μＭ）、ＳＢ４３１５４２（終濃度１μＭ）、ＪＮＫ－ＩＮ－８（終濃度１μＭ）を添加した。

【0410】

浮遊培養開始後１日目に顕微鏡にてマイクロウェル内に細胞凝集体が形成されているのを確認した後に、Ｙ２７６３２、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＪＮＫ－ＩＮ－８、及びＢＭＰ４（いずれも終濃度は、１ｎＭ）を含む無血清培地を１ウェルあたり１ｍｌ加えた（工程（ｂ）開始）。

【0411】

さらに、浮遊培養開始後３日目に、ワイドボアの１０００μｌピペットチップを用いて細胞凝集体を３７μｍ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｓｔｒａｉｎｅｒ Ｌａｒｇｅ（２７２５０、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に回収し、死細胞とデブリを除去後、１０ｃｍ浮遊培養用ディッシュへと移送した。その際の培地には、ＢＭＰ４を含まず、Ｙ２７６３２、ＩＷＰ－２、ＳＢ４３１５４２、ＪＮＫ－ＩＮ－８、Ｋ０２２８８（終濃度１μＭ）、及び５Ｚ－７－Ｏｘｏ Ｚｅａｅｎｏｌ（いずれも終濃度は、２μＭ）を含む５％ ＫＳＲ ｇｆＣＤＭを１２ｍｌ用いた（工程（ｃ）開始）。以降、培養開始後６、１０、１３、及び１７日目にディッシュより６ｍｌの培地を、細胞凝集体を吸わないように回収し、新しい培地を６ｍｌ添加する半量培地交換を行った。培養開始後６日目以降の培地交換の際には、Ｙ２７６３２を添加しない培地を用いた。培養開始後１０日目以降の培地交換の際に、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）（終濃度１ｍＭ）、アスコルビン酸２リン酸（ＡＡ２Ｐ）（終濃度２５０μＭ）、及びニコチンアミド（ＮＡＤ）（終濃度５００μＭ）を添加した。培養開始後１３日目以降の培地交換の際に、ＥＧＦ（終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。

【0412】

上記手法にて調製した培養２０日目の細胞塊（第一細胞集団）を、実験４に記載の方法でＭＡＣＳにより精製し第二細胞集団を得た（工程（１）及び工程（２））。その後、第一細胞集団及び第二細胞集団それぞれをＦＡＣＳにより解析した（図１８）。その結果、精製前の細胞懸濁液（第一細胞集団）では約４１．９％がＥｐＣＡＭ陽性であった。さらに、精製後の細胞懸濁液（第二細胞集団）では約９２・８％がＥｐＣＡＭ陽性であり（図１８、下段の左）、分割されたマイクロウェルを有する培養器材を用いることによっても、嗅プラコード細胞・嗅上皮幹細胞を含むＥｐＣＡＭ陽性の細胞集団を調製可能であることがわかった。また、ＭＡＣＳ陰性の通過画分は９９％以上がＥｐＣＡＭ陰性であった（図１８、下段の右）。

【0413】

［実験６：嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む細胞塊からの嗅上皮様の上気道細胞・嗅上皮組織を含むシート状細胞構造体の製造］
実験４及び図１７に記載の方法における工程（２）で得られた精製後の細胞（第二細胞集団）を、培地で懸濁した。得られた細胞懸濁液を培養器材へと播種することで、図１９に記載の工程（３）を実施し、上気道細胞を含むシート状細胞構造体の製造を行った。その際の培地には、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２に１／１００ Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１／５０ Ｂ２７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｗ／ｏ ＶＡ、ＨＥＰＥＳ（サーモフィッシャー社製、１２６３４０１０、１７５０２０４８、１２５８７０１０）（終濃度１０ｍＭ）、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（終濃度２ｍＭ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）（終濃度１ｍＭ）、アスコルビン酸２リン酸（ＡＡ２Ｐ）（終濃度２５０μＭ）、ニコチンアミド（ＮＡＤ）（ナカライテスク社製）（終濃度５００μＭ）、Ｙ２７６３２（終濃度１０μＭ）を添加したものを用いた。培養器材としては、細胞培養用カルチャーインサート（関東化学社製、ａｄ－ＭＥＤビトリゲル２ ２４ｗｅｌｌ、０８３６４－９６）に、ＰＢＳで希釈した２０μｇ／ｍｌ シンセマックス－２、０．５μｇ／ｍｌ Ｌａｍｉｎｉｎ５１１Ｅ８を２００μｌ添加し、３７℃で１時間以上コーティング処理したものを用いた。播種の条件としては、カルチャーインサートのインナーウェルに精製後の細胞約２ｘ１０^５個を２００μｌの培地に懸濁して添加した。アウターウェルには細胞を含まない同組成の培地を８００μｌ添加した。培養開始から３日毎又は４日毎に全量培地交換を実施した。

【0414】

さらに、培地条件を検討する為に、ＦＧＦ、ＥＧＦ、Ｗｎｔ３ａ＋Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、ＢＭＰ４、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤の添加について検討した。その結果、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤いずれかの添加により細胞の増殖が見られ、これらを組み合わせて用いることによりさらに増殖が促進された（図１９）。

【0415】

上記検討により細胞増殖性が優れていたＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤添加条件を基にさらに培地条件の検討を行った。具体的には、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰ４、ＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ／Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ阻害剤、Ｗｎｔアゴニスト、レチノイン酸アナログの添加について検討した。その結果、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質とＢＭＰ阻害剤を組み合わせて添加した条件において、さらなる細胞の増殖が確認された（図１９）。上記条件により、細胞間が接着した密な上皮シート様構造がカルチャーインサート上に形成されていた。

【0416】

上記のＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質とＢＭＰ阻害剤を組み合わせて添加した条件において製造した培養開始後２８日目及び３９日目のシート状細胞構造体を、免疫染色により解析した（図２０、２１）。

【0417】

その結果、形成されたシート状細胞構造体は、培養開始後２８日目の時点でＤｌｘ５、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン陽性の嗅プラコード細胞・嗅上皮幹細胞を含有していることが示された。さらに、サイトケラチン５、ｐ６３、ｐ７５陽性の基底細胞、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｌｈｘ２、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、Ｅｂｆ２、Ｔｕｊ１陽性の嗅神経前駆細胞・未成熟嗅神経細胞も含有していることが示された。さらに培養開始後３９日目シート状細胞構造体は培養開始後２８日目と比較して嗅プラコード細胞・嗅上皮幹細胞が保持されたままさらに肥厚化が進んでおり、シート状細胞構造体をインビトロで少なくとも１５日間維持可能であることが示された。上記結果により、本願に記載の方法により嗅上皮幹細胞、神経細胞、基底細胞を含有するシート状細胞構造体を製造可能であることが分かった。

【0418】

［実験７：凍結保存した精製後の嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞からの嗅上皮様の上気道細胞を含むシート状細胞構造体の製造］
実験４に記載の方法で精製したＥｐＣＡＭ陽性嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含有する第二細胞集団を凍結保存後に解凍・起眠し、シート状細胞構造体を製造した。具体的な手法としては、培養開始後２４日目の１２３１Ａ３株由来の細胞凝集体をＭＡＣＳ精製した第二細胞集団をセルカウントの後に遠心し、４ｘ１０^６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度となるようにＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（日本全薬工業社製）で再懸濁した。その後、細胞密度が８ｘ１０^５ ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｖｉａｌとなるようにクライオチューブ（サーモフィッシャー社製）に、細胞懸濁液を分注し、４℃で予冷した凍結保存容器（日本フリーザー社製、ＢＩＣＥＬＬ）に格納した後に、－８０℃に３時間以上静置し、緩慢凍結法による細胞凍結保存を実施した。

【0419】

その後、凍結した第二細胞集団を含むクライオチューブを３７℃ウォーターバス中で振盪しながら液中に氷の小片が残る程度まで迅速に融解した。融解後直ちに１５ｍｌチューブに分注しておいた培地１０ｍｌ程度に第二細胞集団を含む細胞懸濁液を混和し、遠心分離（１２０Ｇ、５分）し、アスピレーターで上清を取り除いた。遠心後の細胞のペレットを実験６に記載のＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤、Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質とＢＭＰ阻害剤を組み合わせて添加したＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２＋Ｎ２Ｂ２７培地で懸濁し、セルカウントにより生細胞数を計測した。その後、以降の条件を実験６と同様に工程（３）を実施し、培養開始後４０日目まで培養し、シート状細胞構造体を製造した。製造したシート状細胞構造体について実験６と同様に免疫染色による解析を実施した（図２２）。

【0420】

その結果、形成されたシート状細胞構造体はＤｌｘ５、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、P－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン陽性の嗅プラコード細胞・嗅上皮幹細胞、サイトケラチン５、ｐ６３、ｐ７５陽性の基底細胞、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｌｈｘ２、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、Ｅｂｆ２、Ｔｕｊ１陽性の嗅神経前駆細胞・未成熟嗅神経細胞を含有していた。上記の結果から、本願に記載の方法により凍結保存・融解後の第二細胞集団より工程（３）を経て嗅上皮幹細胞、神経細胞、基底細胞を含有する嗅上皮様のシート状細胞構造体を製造可能であることが分かった。

【0421】

［実験８：凍結保存した精製後の嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞からの鼻腔上皮様の上気道細胞を含むシート状細胞構造体の製造］
実験５、実験６及び図２３に記載の方法の工程（２）で得られた精製後の細胞（第二細胞集団）を、培地で懸濁し、培養器材へと播種する工程（３）を実施し、上気道細胞を含むシート状細胞構造体の製造を行った。具体的な手法としては、マイクロウェルプレートを用いて製造した培養開始後２３日目のβ－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ株由来の細胞凝集体をＭＡＣＳ精製した。精製により得られた第二細胞集団をセルカウントの後に遠心し、実験６の方法に従い２ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ／ｖｉａｌの条件で凍結保存した。解凍後の細胞を細胞培養用Ｔ７５セルカルチャーフラスコに１．８ｘ１０^６ ｃｅｌｌｓを播種し、４日間培養した。その際の培地には２０ｍｌのＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ Ｅｘ－ｐｌｕｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にＹ２７６３２（終濃度１０μＭ）を添加したものを用いた。また、セルカルチャーフラスコはＳｙｎｔｈｅｍａｘ ＩＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）（終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ）及びＬａｍｉｎｉｎ ５１１－Ｅ８（終濃度０．００５μｇ／ｍｌ）を希釈したＰＢＳを１０ｍｌ添加し、３７℃で少なくとも１時間処理し、コーティング処理を実施した。

【0422】

培養開始後４日目の細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳで２回洗浄した後、５ｍｌのＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャー社製）を添加し、３７℃で１０分間処理した。処理後の細胞に５ｍｌのＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ Ｅｘ－ｐｌｕｓ ｍｅｄｉｕｍを添加して細胞を回収し、遠心（１２０Ｇ、５分）を行った後、上清を除去した。得られた細胞を再度Ｙ２７６３２（終濃度１０μＭ）を添加したＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ Ｅｘ－ｐｌｕｓ ｍｅｄｉｕｍによって懸濁し、２４ｗｅｌｌ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３４７０）のアッパーウェルに６．６ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／２００μｌ／ｗｅｌｌの条件で播種し、３日間培養した。カルチャーインサートのアウターウェルには５００μｌの同組成の培地を添加した。セルカルチャーインサートはＳｙｎｔｈｅｍａｘ ＩＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）（終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ）及びＬａｍｉｎｉｎ ５１１－Ｅ８（終濃度０．００５μｇ／ｍｌ）を希釈したＰＢＳを１０ｍｌ添加し、３７℃で少なくとも１時間処理し、コーティング処理を実施した。

【0423】

培養開始後３日目の細胞のインナーウェルの培地を全量除去し、アウターウェルの培地を５００μｌのＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ ＡＬＩ ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）へと全量交換し、気相液相境界面培養（Ａｉｒ－Ｌｉｑｕｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）を実施した。培養開始から３日毎又は４日毎にアウターウェルの培地の全量培地交換を実施した。

【0424】

培養開始後２７日目のカルチャーフラスコ培養時、培養３０日目の気相液相境界面培養開始時及び培養開始後３７、４４、７４日目に倒立顕微鏡により明視野観察を実施した（図２３）。その結果、培養開始後２７日目では敷石状の単層の上皮様だった細胞が、培養開始後３０日目ではシート状の組織を形成していた。さらに、気相液相境界面培養により成熟し、培養開始後３７、４４、７４日目には立体的な隆起が形成されていた。同時に、培養開始後３７日目以降の細胞において、高倍率での観察により線毛運動が観察された。さらに培養開始後４４日目及び７４日目の細胞を固定し、免疫染色を実施した（図２４）。

【0425】

その結果、形成された培養開始後４４日目のシート状細胞構造体には、ＣＫ５、ｐ７５、ｐ６３、ＩＣＡＭ－１陽性の基底細胞、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｓｉｘ１陽性の嗅上皮幹細胞、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ５ＡＣ陽性の分泌細胞が含有されていた。さらに、培養開始後７４日目のシート状細胞構造体には、明視野観察によって線毛運動を確認した通り、アセチル化チューブリン陽性の構造を有する線毛細胞が含まれていた。上記の結果から、本出願に記載の製造法により嗅上皮幹細胞が鼻腔上皮へと一部分化転換を生じ、嗅上皮幹細胞、線毛細胞、基底細胞、分泌細胞を含有する鼻腔上皮様のシート状細胞構造体を製造可能であることが分かった。

【0426】

［実験９：凍結保存した精製後の嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞からの上気道細胞を含むシート状細胞構造体の電子顕微鏡による観察］
実験４に記載の方法で精製したＥｐＣＡＭ陽性嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含有する第二細胞集団を凍結保存後に解凍・起眠し、シート状細胞構造体を製造した。その後、製造したシート状細胞構造体について電子顕微鏡による解析を実施した。具体的な手法としては、まず、ヒトｉＰＳ細胞株 β－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ株より、実験５に記載のマイクロウェルプレートを用いた製造法によって、培養開始後２７日目の細胞凝集体である第一細胞集団を調製した。その後、調製した第一細胞集団を実験４に記載の方法によって精製し、第二細胞集団を得た。得られた第二細胞集団を１０ｃｍディッシュに播種し、３日間培養した後に回収し、凍結保存した。

【0427】

上記凍結保存した細胞を１．３ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で１２ウェルサイズのビトリゲルカルチャーインサートに播種し、ＰｎｅｕｍａＣｕｌｔ Ｅｘ Ｐｌｕｓ ｍｅｄｉｕｍにより１４日間培養した。その後に培養した細胞を固定し、電子顕微鏡観察用の試料を調製した。試料の調製方法は、以下の通りである。まず、４％パラホルムアルデヒド／２．５％グルタルアルデヒドによって培養した細胞を一晩処理した、その後に当該細胞にオスミウム固定を実施し、さらに脱水、ｔ－ブタノール凍結乾燥、白金パラジウムコーティングの工程を行った。試料の観察は走査型電子顕微鏡（日本電子社製、ＪＳＭ－７９００Ｆ）を用いて実施した。撮影した電子顕微鏡画像を図２５に示す。

【0428】

その結果、製造されたシート状細胞構造体は表面が平滑で、細胞間が密に結合した構造を有していることが示された。さらに、一部の細胞は表面に線毛を有する、呼吸器系の細胞に特有の構造を有していた。上記の結果から、本出願に記載の製造法により形成された細胞構造体はシート状であり、呼吸器系組織の特徴を有した細胞を含有していることが示された。

【0429】

［実験１０：嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む細胞塊の製造方法］
図２６の上段に示す培養工程に従って、多能性幹細胞から嗅上皮様組織を含む非神経上皮組織を含む細胞塊（嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含む第一細胞集団）を製造した。使用するヒトｉＰＳ細胞株及びヒト多能性幹細胞の維持培養操作は実験１と同様に行った。

【0430】

培養した多能性幹細胞を分化誘導に用いる際には、播種した５日後にＳｔｅｍＦｉｔ培地の培地交換と同時にＰＤ１７３０７４（ＦＧＦシグナル経路阻害物質、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、終濃度１００ｎＭ）、播種した６日後にＳＢ４３１５４２とＳＡＧを添加して約４８時間及び２４時間培養した（工程（ｉ）開始）。

【0431】

上記工程（ｉ）を実施して調製したサブコンフルエントのヒトｉＰＳ細胞を図２６の上段および実験１に記載の方法で分化誘導を実施した。浮遊培養開始後２３日目に倒立顕微鏡（株式会社キーエンス製、ＢＩＯＲＥＶＯ）を用いて、明視野観察を行った（図２６のＡ）。上記分化誘導法により直径約４００μｍから６００μｍ程度の球状の細胞凝集体（第一細胞集団）が形成されていた。球状の細胞凝集体の表面には、観察時に明るく表示される、厚みを持った上皮様の構造が形成されており、肥厚した上皮であるプラコードの特徴を示していた。β－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ株がβ－ａｃｔｉｎプロモーター下で恒常発現している蛍光タンパク質ＧＦＰに対する蛍光観察を実施したところ、細胞塊内部の細胞凝集部分と細胞塊表面の厚みを持った上皮様構造の二重構造を有していることが示された。１２３１Ａ３株由来の細胞凝集体も、細胞凝集体の外側に厚みを持った上皮様の構造が形成されており、β－ａｃｔｉｎ ＧＦＰ株由来の細胞凝集体と同様の形態を呈していた。

【0432】

さらに、実験１と同様の条件で、１２３１Ａ３株由来細胞凝集体に対する免疫染色による解析を実施した。その結果、実験１と同様に、実験１０の条件によっても１２３１Ａ３株由来の培養２３日目の細胞凝集体の表面に、Ｓｉｘ１、Ｓｐ８、サイトケラチン１８、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、ＥｐＣＡＭ、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｐ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性の細胞を含む上皮様の構造が形成されていることが示された（図２７）。また、細胞凝集体の表面はＥｚｒｉｎ陽性であり頂端面側であった。細胞塊の内部は核の構造が崩れた死細胞が多く含まれており、細胞塊の表面を中心に局在する生細胞のうち、少なくとも８０％以上がＯｔｘ２陽性の外胚葉系の細胞であり、Ｋｉ６７陽性の増殖性の細胞も含有されていた。上記免疫染色の解析の結果から、工程（ｉ）においてＦＧＦシグナル伝達経路阻害剤による処理をさらに行う実験１０の条件によっても、第一細胞集団が製造可能なことが示された。

【0433】

［実験１１：上気道細胞を含むシート状細胞構造体の動物移植及び担ヒト上気道組織モデル動物の作出］
実験４に記載の方法で精製したヒトｉＰＳ細胞１２３１Ａ３株由来ＥｐＣＡＭ陽性嗅プラコード細胞又は嗅上皮幹細胞を含有する第二細胞集団を、実験７に記載の方法で凍結保存後に解凍・起眠し、シート状細胞構造体を製造した。その後、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０２３ Ｎｏｖ；２９（１１）：５２６－５３４．、特許第４４９６４２５号、特許第７０６６１６２号および特開２０２１－２４８２５号公報を参照し、製造したシート状細胞構造体の動物への移植、及び担ヒト上気道組織モデル動物の作出を実施した。試験実施の概要を図２８の上段に示した。

【0434】

シート状細胞構造体移植用の足場材料として、コラーゲンスポンジを調製した。コラーゲンスポンジ及び移植用剤型、即ち細胞シート－足場材料複合体の具体的な調製方法は、以下の通りである。
１） １８ｇのＮＭＰコラーゲン ＰＳ（日本ハム株式会社製）を３Ｌの超純水（４℃）に投入し、４℃で３日間撹拌し、溶解させた。
２） 上記コラーゲン溶液を氷上に置き、１ＮのＮａＯＨを加えた後、ガラス棒で激しく撹拌した。粘性が低下するまで撹拌し、さらに、スターラーを用いて５分間４℃で撹拌した。
３） 上記コラーゲン溶液を氷上に再び置き、ｐＨ７．０～７．３になるまで、撹拌しながら１Ｎ ＮａＯＨを添加した。
４） 上記コラーゲン溶液を２時間スターラーを用いて４℃で撹拌した。
５） 上記コラーゲン溶液がｐＨ７．０～７．３の範囲にあることを再度確認した。ｐＨが７．０未満の場合には３）及び４）を繰り返した。
６） 上記コラーゲン溶液に対して、３５００ｇ，３０分，４℃の条件で遠心を行い、コラーゲンの沈殿を得た。
７） 得られたコラーゲン沈殿をプラスチックケースに入れ、－８０℃で一晩以上静置して凍結させた。
８） トラップの温度を予め－８０℃に冷却した凍結乾燥機にコラーゲン沈殿を入れ、４日間凍結乾燥を行った。乾燥後のコラーゲンは、すぐ使わない場合にはデシケーター内に保存した。
９） 乾燥コラーゲンから２．５ｇを秤量し、２３０ｍＬの超純水に懸濁した。
１０） 得られた懸濁液を撹拌機で２分間撹拌した後、０．１Ｎ 塩酸を１４ｍＬ添加した。
１１） 上記懸濁液をガラス棒で簡単に撹拌した後、撹拌機で一時間ごとに撹拌した。
１２） ３日間、毎日３-７回程度撹拌機による1時間の撹拌をしながら、ｐＨが３．０～３．３程度となるように０．１Ｎ 塩酸を上記懸濁液に適宜追加した。
１３） 上記懸濁液中のコラーゲンが全て溶解した後、１％コラーゲン溶液としてコラーゲンスポンジ作製に使用した。すぐに使わない場合には４℃で保存した。
１４） １％コラーゲン溶液（４℃）をプラスチック容器に１７．５ｍＬコラーゲン溶液でコーティングされたポリプロピレンメッシュ（Ｂａｒｄメッシュ、日本ベクトンディッキンソン）を乗せ、その上に１７．５ｍＬの１％コラーゲン溶液（４℃）を重層し、－８０℃で一晩静置した。
１５） トラップの温度を予め－８０℃に冷却しておいた凍結乾燥機に、上記コラーゲン溶液のプラスチック容器を入れ、１週間凍結乾燥を行った。
１６） 予め１４０℃に加熱しておいたＶａｃｕｕｍ Ｄｒｙｉｎｇ Ｏｖｅｎに凍結乾燥後のコラーゲンを入れ、脱気しながら１４０℃での加熱を行った（熱脱水架橋）。
１７） 熱脱水架橋後、エチレンオキサイドガスで上記コラーゲンを滅菌した。
１８）実験７に記載の方法で製造した培養中の上気道細胞シートをカルチャーインサートから足場のビトリゲル膜ごと切り取り、上記工程を経て作成したコラーゲンスポンジの表面を覆うように貼り付け、移植用の細胞シート－足場材料複合体とした。

【0435】

動物移植の実施のため、免疫不全ラット（系統：Ｆ３４４－Ｉｌ２ｒｇｅｍ１ＩｅｘａｓＲａｇ２ｅｍ１Ｉｅｘａｓ、１６－２０週齢）に塩酸メデトミジン（０．１４ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（１．９ｍｇ／ｋｇ）、酒石酸ブトルファノール（２．４ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔した。鼻骨の内鼻縫合線に沿って中心線の皮膚切開を実施し、鼻骨を露出させた。さらに、露出した鼻骨の内鼻縫合線の右側をドリルにより削開し、長さ２ｍｍ、幅１ｍｍの鼻腔欠損部を作成した。コラーゲンスポンジをビトリゲル膜上に上気道細胞が生着しているもので被覆した細胞シート－足場材料複合体を、シートの頂点側が鼻腔に向かうように上記鼻腔欠損部に挿入し、切開した皮膚を縫合した。

【0436】

移植１週間後、移植したラットの頭部を摘出した。免疫染色用の切片試料の調製の為、灌流固定後、皮膚、大脳、眼球、下顎を除去した。さらに上記移植ラット頭部を４％ＰＦＡにより一晩浸漬固定した後に、１０％ＥＤＴＡ脱灰液に浸漬し、１０日間脱灰処理を実施した。その後、脱灰済の移植ラット頭部を１０％、２０％、３０％の各濃度のスクロース溶液に各１日間ずつ浸漬し脱水処理した。上記凍結保護処理済の試料をモールド内に置き、Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンドに包埋して凍結し、切片作成用のブロックを作成した。作成したブロックからクライオスタットを用いて１０μｍ厚の移植ラット鼻腔部の冠状切片を作成した。

【0437】

上記切片に対し、実験１に記載の方法によって蛍光免疫染色を実施した。標本の観察及び画像の取得には正立蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｍ２（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）及び附属ソフトウェアのＡｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ、及び倒立蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ８００（キーエンス社製）及び附属ソフトウェアのＢＺ－Ｘ Ｖｉｅｗｅｒを用いた。一次抗体及び蛍光標識二次抗体としては、表１、表２及び表３に記載のものを用いた。

【0438】

【表3】

【0439】

その結果、移植したラットの鼻腔組織内に、移植組織が生着していることが示された。偏斜照明による明視野観察により、移植した上気道シートが検出可能であった（図２８Ａ）。さらに蛍光顕微鏡観察を実施したところ、移植組織はヒト細胞を特異的に検出する抗ヒト核抗体、ヒトＬａｍｉｎ Ｂ１特異的抗体およびヒトＮＣＡＭ特異的抗体陽性であり、さらにＮＣＡＭ、Ｔｕｊ１、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、サイトケラチン陽性の嗅上皮・鼻腔上皮様の組織であることが示された（図２８Ｂ－Ｍ）。上記の結果より、製造した上気道細胞シートが生体に移植、生着可能であること、および担ヒト上気道組織モデル動物が作出可能であることが示された。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】