特開 2025-11743 液体中微粒子分析システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025011743

(43)【公開日】2025-01-24

(54)【発明の名称】液体中微粒子分析システム

(51)【国際特許分類】

   G01N 15/1429 20240101AFI20250117BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20250117BHJP

   G01N 15/1434 20240101ALI20250117BHJP

【ＦＩ】

G01N15/14 B

G01N21/64 B

G01N15/14 D

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023114027

(22)【出願日】2023-07-11

(71)【出願人】

【識別番号】319006047

【氏名又は名称】シャープセミコンダクターイノベーション株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】佐藤 大紀

(72)【発明者】

【氏名】金 秀▲弦▼

(72)【発明者】

【氏名】満仲 健

(72)【発明者】

【氏名】飯塚 邦彦

【テーマコード（参考）】

2G043

【Ｆターム（参考）】

2G043AA04

2G043BA16

2G043CA04

2G043DA05

2G043EA01

2G043FA03

2G043KA09

2G043LA02

2G043MA01

(57)【要約】

【課題】特許文献１に記載の液体中微粒子分析システムと比較して、蛍光の検出精度を向上させることである。
【解決手段】液体中微粒子分析システム（１）は、集積回路チップ（１３）と、微粒子が流れる流路（１０）と、該流路（１０）にパルス状の励起光を照射する光源（半導体レーザー１７）と、単一光子アバランシェダイオード（１４Ａ）の状態を、受光可能状態と待機状態との何れかに制御する制御部（１５）と、を備え、制御部（１５）は、光源（半導体レーザー１７）の照射タイミングから単一光子アバランシェダイオード（１４Ａ）の状態を前記受光可能状態にするまでの遅延時間を、第１の遅延時間と第２の遅延時間とから選択し、当該受光可能状態において、単一光子アバランシェダイオード（１４Ａ）におけるアバランシェ電流に応じてパルス状の光子を検出し、前記第１の遅延時間を用いた光子の検出回数を第１の検出回数と、前記第２の遅延時間を用いた光子の検出回数を第２の検出回数と、を繰り返し求めることにより、前記微粒子に付随した蛍光物質の検出を行う。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単一光子アバランシェダイオードを含む集積回路チップと、
該集積回路チップの前記単一光子アバランシェダイオードの側に形成された、微粒子が流れる流路と、
該流路にパルス状の励起光を照射する光源と、
前記単一光子アバランシェダイオードの状態を、受光可能状態と待機状態との何れかに制御する制御部と、を備え、
前記制御部は、
前記光源が前記励起光を照射する照射タイミングから、前記単一光子アバランシェダイオードの状態を前記受光可能状態にするまでの遅延時間を、第１の遅延時間と、該第１の遅延時間よりも長い第２の遅延時間と、から選択し、
前記照射タイミングから前記遅延時間が経過したのち、前記単一光子アバランシェダイオードの状態を所定の受光期間に亘って前記受光可能状態にし、
当該受光可能状態において、単一光子アバランシェダイオードにおけるアバランシェ電流に応じてパルス状の光子を検出し、
前記第１の遅延時間を用いた前記光子の検出を一定回数繰り返し、その繰り返しの中における前記光子の検出回数を第１の検出回数とし、
前記第２の遅延時間を用いた前記光子の検出を前記一定回数繰り返し、その繰り返しの中における前記光子の検出回数を第２の検出回数とし、
前記第１の検出回数と前記第２の検出回数とを繰り返し求めることにより、前記微粒子に付随した蛍光物質の検出を行う、
ことを特徴とする液体中微粒子分析システム。

【請求項2】

前記光源は、互いに異なる複数の波長の励起光をそれぞれ互いに異なる前記照射タイミングで照射し、
前記制御部は、前記第１の検出回数及び前記第２の検出回数の各々を、前記励起光ごとに繰り返し求めることにより、前記検出を行う、
ことを特徴とする請求項１に記載の液体中微粒子分析システム。

【請求項3】

前記制御部は、
前記流路に微粒子が流れていない状態における、前記第１の検出回数の時間平均値である第１の平均値と、前記第２の検出回数の時間平均値である第２の平均値と、を算出し、
前記第１の検出回数を、前記第１の平均値で正規化した値を第１の正規化検出回数とし、
前記第２の検出回数を、前記第２の平均値で正規化した値を第２の正規化検出回数とし、
前記第１の正規化検出回数と前記第２の正規化検出回数との比に応じて前記検出を行う、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の液体中微粒子分析システム。

【請求項4】

前記第１の正規化検出回数及び前記第２の正規化検出回数の少なくとも何れかの変化であって、前記微粒子による散乱及び屈折の少なくとも何れかに起因する変化に応じて、前記微粒子を検出する、
ことを特徴とする請求項３に記載の液体中微粒子分析システム。

【請求項5】

前記制御部は、
前記流路に微粒子が流れていない状態において、前記遅延時間を掃引し、掃引した各遅延時間を用いた前記光子の検出を一定回数繰り返し、その繰り返しの中における前記光子の検出回数をバックグラウンド検出回数として、当該バックグラウンド検出回数の遅延時間依存性を取得し、
前記蛍光物質における蛍光寿命から計算される指数関数的減衰量の遅延時間依存性に対する前記バックグラウンド検出回数の前記遅延時間依存性の比が最大になる最適遅延時間を求め、
前記第１の遅延時間及び前記第２の遅延時間の何れかとして前記最適遅延時間を用いる、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の液体中微粒子分析システム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体中の微粒子を光学的に分析するための液体中微粒子分析システム及び液
体中微粒子分析方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

生物学および医学などにおける研究および臨床検査などで用いられる検査手法の１つとして、蛍光を用いた検査手法が挙げられる。蛍光とは、励起光（例えば紫外光または可視光）を吸収して基底状態から励起状態になった後、中間励起状態に落ちた分子またはイオンが、基底状態に戻るときに放出する、励起光より長い波長の光である。生体または非生体試料についての蛍光を用いた検査手法は、細胞構成成分の染色、遺伝子発現、および動的成分の局在移動の観察など、幅広い分野に応用されて成果を挙げている。

【0003】

一般に多く用いられている蛍光検査手法は、励起光を対象物に照射し、放出される蛍光のみを検知するものである。対象物から放出される蛍光と対象物により反射される励起光とを分離する方法の１つとして、蛍光と励起光とで波長が異なることを利用して、光学的なフィルタにより両者を分離する方法がある。

【0004】

一方、蛍光と励起光とを分離する別の方法として、蛍光寿命を利用する方法がある。蛍光寿命とは、対象物が励起状態から基底状態に戻るまでの平均時間である。蛍光寿命は、多くの種類の分子でサブナノ秒～数ナノ秒程度であり、分子の種類によって異なる。蛍光寿命を利用することで、励起光の消光後に放出される蛍光を検知することができる。

【0005】

特許文献１には、蛍光寿命を用いて蛍光を検知する装置の例として、図１と図２に示す構成が記載されている。特許文献１に記載されている装置は、励起光の消光後に単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ，ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ａｖａｌａｎｃｈｅ ｄｉｏｄｅ）を光子検出可能状態にして、ＳＰＡＤが蛍光光子を受けた際に流れるアバランシェ電流によるパルスをカウントするように構成されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特許第６８６０８９０号（２０２１年３月３１日登録）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

ところで、特許文献１の液体中微粒子分析システムでは、流路を流れる微粒子が単一光子アバランシェダイオードの近傍に存在する場合に、当該微粒子により励起光が散乱あるいは屈折して、ＳＰＡＤに入射する場合がある。この場合、単一光子アバランシェダイオードに入射する光子の量は、流路を流れる微粒子が単一光子アバランシェダイオードの近傍に存在しない場合と比較して増加する。その結果、蛍光寿命を用いて蛍光を検知する液体中微粒子分析システムにおいては、ＳＰＡＤの検出結果に応じて励起光と蛍光とを分離することが難しい場合がある。

【0008】

本願発明は、上述した課題に鑑みなされたものであり、その目的は、特許文献１に記載の液体中微粒子分析システムと比較して、蛍光の検出精度を向上させることである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上述した課題を解決するために、本発明の第１の態様に係る液体中微粒子分析システムは、単一光子アバランシェダイオードを含む集積回路チップと、該集積回路チップの前記単一光子アバランシェダイオードの側に形成された、微粒子が流れる流路と、該流路にパルス状の励起光を照射する光源と、前記単一光子アバランシェダイオードの状態を、受光可能状態と待機状態との何れかに制御する制御部と、を備えている。

【0010】

本液体中微粒子分析システムにおいて、前記制御部は、前記光源が前記励起光を照射する照射タイミングから、前記単一光子アバランシェダイオードの状態を前記受光可能状態にするまでの遅延時間を、第１の遅延時間と、該第１の遅延時間よりも長い第２の遅延時間と、から選択し、前記照射タイミングから前記遅延時間が経過したのち、前記単一光子アバランシェダイオードの状態を所定の受光期間に亘って前記受光可能状態にし、当該受光可能状態において、単一光子アバランシェダイオードにおけるアバランシェ電流のパルスとして光子を検出し、前記第１の遅延時間を用いた前記光子の検出を一定回数繰り返し、その繰り返しの中における前記光子の検出回数を第１の検出回数とし、前記第２の遅延時間を用いた前記光子の検出を前記一定回数繰り返し、その繰り返しの中における前記光子の検出回数を第２の検出回数とし、前記第１の検出回数と前記第２の検出回数とを繰り返し求めることにより、前記微粒子に付随した蛍光物質の検出を行う、構成が採用されている。

【発明の効果】

【0011】

本発明の一態様に係る蛍光検査システムによれば、特許文献１に記載の液体中微粒子分析システムと比較して、蛍光の検出精度を向上させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本発明の一実施形態に係る液体中微粒子分析システムの概略構成を示す模式図である。

【図2】図１に図示する液体中微粒子分析システムが備えている集積回路チップの概略構成を示す模式図である。

【図3】図１に図示する液体中微粒子分析システムが備えている光源の照射動作と、図１に図示する液体中微粒子分析システムが備えている制御部が実施する第１遅延測定及び第２遅延測定とのタイミングを示すタイミングチャートである。

【図4】第１遅延測定の出力、第１遅延測定のバックグラウンド時間平均、第２遅延測定の出力、第２遅延測定のバックグラウンド時間平均、正規化された第１遅延測定の出力及び第２遅延測定の出力、並びに、正規化された第１遅延測定の出力の正規化された第２遅延測定の出力に対する比を示すグラフである。

【図5】本発明の一実施形態に係る液体中微粒子分析システムが備えている光源の照射動作と、本液体中微粒子分析システムが備えている制御部が実施する第１遅延測定、第２遅延測定、第３遅延測定、及び第４遅延測定とのタイミングを示すタイミングチャートである。

【図6】本発明の実施形態２に係る液体中微粒子分析システムにおけるＳＰＡＤの応答時間分布であって、流路に微粒子が流れていない状態におけるＳＰＡＤの応答時間分布と、流路に蛍光物質が付随する微粒子が流れている状態におけるＳＰＡＤの応答時間分布と、を示すグラフである。

【図7】本発明の一実施形態に係る液体中微粒子分析システムにおけるＳＰＡＤの応答時間分布であって、流路に微粒子が流れていない状態におけるＳＰＡＤの応答時間分布と、微粒子に付随された蛍光物質の蛍光寿命と同じ時定数の指数関数的減衰曲線と、を示すグラフである。

【図8】光源の照射タイミングと、遅延時間として０ｎｓｅｃ、１ｎｓｅｃ、及び２ｎｓｅｃの各々を用いた場合におけるＳＰＡＤの受光可能状態と、を示すタイミングチャートである。

【図9】流路を流れる微粒子により散乱された光子がＳＰＡＤにより検出される様子を示す液体中微粒子分析システムの模式図である。

【図10】本発明の一実施形態に係る液体中微粒子分析システム及び従来の液体中微粒子分析システムにおけるＳＰＡＤの応答時間分布であって、（１）流路に微粒子が流れていない状態におけるＳＰＡＤの応答時間分布と、（２）流路に蛍光物質が付随していない微粒子が流れている状態におけるＳＰＡＤの応答時間分布と、（３）流路に蛍光物質が付随している微粒子が流れている状態におけるＳＰＡＤの応答時間分布と、を示すグラフである。

【図11】従来の液体中微粒子分析システムが備えている光源の照射動作を示すタイミングチャートである。

【図12】従来の液体中微粒子分析システムにおけるＳＰＡＤの出力を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

〔実施形態１〕
以下、本発明の実施形態１について、詳細に説明する。

【0014】

＜液体中微粒子分析システム１の構成＞
図１は、本発明の実施形態１に係る液体中微粒子分析システム１の概略構成を示す模式図であり、液体中微粒子分析システム１を側面視した場合を示す模式図である。図２は、集積回路チップ１３の概略構成を示す模式図であり、集積回路チップ１３を上面視した場合を示す模式図である。

【0015】

図１に示すように、液体中微粒子分析システム１は、制御部１５と、集積回路チップ１３と、光源制御回路１６と、を備えている。制御部１５は、液体中微粒子分析システム１の各部を統括的に制御する機能を備えている演算装置である。制御部１５は、例えば１つ以上のプロセッサ（例えばＣＰＵなど）が、１つ以上のメモリ（例えばＲＡＭやＲＯＭなど）に記憶されているプログラムを実行することで液体中微粒子分析システム１の各構成要素を制御する。

【0016】

集積回路チップ１３は、流路１０と、光子測定部１４と、を備えている。集積回路チップ１３は、液体を流す流体回路部である流路１０と、電子回路部である光子測定部１４とが、ＣＭＯＳ等のシリコンを用いた半導体集積回路に内蔵されている構成であってもよい。例えば、集積回路チップ１３は、所謂ＭＥＭＳ技術を用いて流路１０と、光子測定部１４とが、一体に形成されている構成とすることができる。流路１０は、集積回路チップ１３の一対の主面のうち、後述する単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ，ｓｉｎｇｌｅ ｐｈｏｔｏｎ ａｖａｌａｎｃｈｅ ｄｉｏｄｅ）の側の主面に（図１においてはＳＰＡＤの上側の主面に）設けられている。

【0017】

また、集積回路チップ１３は、流路１０と、光子測定部１４とが重畳され一体化されている構成であってもよい。例えば、集積回路チップ１３は、ガラス基板およびシリコン樹脂等の光透過性部材に形成された微小流路である流路１０が、光子測定部１４が内蔵されたシリコン集積回路上に載置されている構成とすることができる。

【0018】

集積回路チップ１３は、半導体レーザー１７に対向する表面側に流路１０を備え、流路１０の下層に光子測定部１４が設けられている。流路１０には、注入孔１１と、排出孔１２と、が設けられている。流路１０は、注入孔１１から排出孔１２に向かって流れる微粒子を含む液体の流路として用いられる。

【0019】

光子測定部１４は、単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）１４Ａと、光子計数回路１４Ｂと、を有している。光子計数回路１４Ｂは、制御部１５から供給される制御信号に応じて、ＳＰＡＤ１４Ａを制御し、ＳＰＡＤ１４Ａの出力信号を処理する。

【0020】

光子計数回路１４Ｂは、ＳＰＡＤ１４Ａに光子が入射することにより発生した電気パルスの数を計測する機能を有している。

【0021】

光源制御回路１６は、制御部１５から供給される制御信号に応じて、半導体レーザー１７の発光駆動を制御して、半導体レーザー１７から励起光パルス１８を照射対象に照射する照射動作を行う。なお、図１では、制御部１５、および光源制御回路１６は、集積回路チップ１３とは別体である例を示しているが、制御部１５、および光源制御回路１６は、集積回路チップ１３の中に形成されている構成であってもよい。

【0022】

液体中微粒子分析システム１では、流路１０内に液体を流すとともに、光源制御回路１６により半導体レーザー１７をパルス発光させ、励起光を照射する。半導体レーザー１７の照射範囲では、半導体レーザー１７からの励起光パルス１８の照射により、流路１０内の液体中の蛍光分子ＦＭが励起する。光子測定部１４は、蛍光分子ＦＭが励起したことにより発生した蛍光光子を検知する光子検知動作を行う。

【0023】

光源制御回路１６による半導体レーザー１７の照射動作と、光子測定部１４の光子測定動作とは、制御部１５によって同期的に制御される。図８は、制御部１５の制御に基づく励起光パルス１８の照射動作と、光子測定部１４の光子測定動作と、の制御のタイミングの例を示すタイミングチャートである。励起光パルス１８は、パルス発振レーザーの照射トリガー３０の立ち上がりエッジにおいて発光し、ＳＰＡＤ受光可能期間３５の期間にＳＰＡＤに入射した光子によりアバランシェ電流によるパルスを発生可能になる。

【0024】

＜液体中微粒子分析システム１による液体中微粒子分析方法＞
図８のパルス発振レーザーとＳＰＡＤ１４Ａの同期制御ダイアグラムには、パルス発振レーザーの照射トリガー３０の立ち上がりエッジから、ＳＰＡＤ受光可能期間３５の開始までの遅延時間の異なるＳＰＡＤ制御タイミング３２，３３，３４が示されている。実施例１における制御部１５は、このように遅延時間を変更することができる。図３は実施例１における測定の方法を示す図である。単位測定シーケンス１００は、制御部１５によりパルス発振レーザーの照射トリガー３０の立ち上がりエッジから、ＳＰＡＤ受光可能期間３５の開始までの遅延を図１０における第１遅延時間７２に設定して６５５３６回のパルス発振レーザーの照射を繰り返し、その間のＳＰＡＤの出力パルスをカウントする第１遅延測定１０１と、第２遅延時間７３に設定してＳＰＡＤの６５５３６回のパルス発振レーザーの照射を繰り返してＳＰＡＤの出力パルスをカウントする第２遅延測定１０２とで構成される。なお、図１０については、従来の液体中微粒子分析システムの課題の項において後述する。

【0025】

図４の出力１１１は、単位測定シーケンス１００を繰り返すことで得られる第１遅延測定の出力の時系列プロットであり、第１遅延測定１０１の繰り返しの中における光子の検出回数（第１の検出回数）を表す。図４の出力１１３は、第２遅延測定の時系列プロットであり、第２遅延測定１０２の繰り返しの中における光子の検出回数（第２の検出回数）を表す。１１５は、第１遅延測定の出力を第１遅延測定のバックグラウンド時間平均１１２で正規化した値（第１の正規化検出回数）と、第２遅延測定の出力を第２遅延測定のバックグラウンド時間平均１１４で正規化した値（第２の正規化検出回数）の時系列プロットである。１１６は、同一単位測定シーケンス内の正規化された第１遅延測定値の正規化された第２遅延測定値に対する比（第１の正規化検出回数と第２の正規化検出回数との比）の時系列プロットである。この測定において観測対象の蛍光の蛍光寿命が０．２ｎｓｅｃより長いと、ＳＰＡＤの時間応答の分布は、図１０のようになっているため、第１遅延時間７２での測定と第２遅延時間７３での測定を比較すると、蛍光が加わった時の応答７１の直接入射光のみの時の応答６１に対する比は、第１遅延時間７２におけるより第２遅延時間７３においてのほうが大きくなる。また、散乱または屈折により入射光が増加した時の応答６２の直接入射光のみの時の応答６１に対する比は、第１遅延時間７２においても第２遅延時間７３においても同じである。したがって、図４においては、蛍光により信号が変化する区間１１７においては、１１６の同一単位測定シーケンス内の正規化された第１遅延測定値の正規化された第２遅延測定値に対する比が１より大きくなる変化が現れ、散乱または屈折により信号が変化する区間１１８においては、１１６の同一単位測定シーケンス内の正規化された第１遅延測定値の正規化された第２遅延測定値に対する比は１からほぼ変化しない。よって、１１６の時系列プロットを観測することで、観測対象である蛍光分子ＦＭを伴った粒子の通過を検知することができる。また、出力１１１あるいは１１３の変化を検知した時に、１１６の時系列プロットが変化しない場合、粒子の通過により、散乱または屈折により入射光量の変化が起きたことを検知することができる。

【0026】

〔実施形態２〕
第２の実施形態について図５を用いて説明する。本実施例における液体中微粒子分析システムは、波長の異なる二つのレーザー、第１レーザーと第２レーザーを備えている。図５の単位測定シーケンスは、第１レーザー発光期間１２１と第２レーザー発光期間１２２とで構成されている。さらに、第１レーザー発光期間１２１は、制御部１５によりパルス発振レーザー１の照射トリガー３０の立ち上がりエッジから、ＳＰＡＤ受光可能期間３５の開始までの遅延を第１遅延時間に設定して６５５３６回のパルス発振レーザーの照射を繰り返し、その間のＳＰＡＤの出力パルスをカウントする第１遅延測定１０１と、第２遅延時間に設定して６５５３６回のパルス発振レーザーの照射を繰り返してＳＰＡＤの出力パルスをカウントする第２遅延測定１０２とで構成され、第２レーザー発光期間は、制御部１５によりパルス発振レーザー２の照射トリガーの立ち上がりエッジから、ＳＰＡＤ受光可能期間の開始までの遅延を第３遅延時間に設定して６５５３６回のパルス発振レーザーの照射を繰り返しその間のＳＰＡＤの出力パルスをカウントする第３遅延測定１２３と、第４遅延時間に設定して６５５３６回のパルス発振レーザーの照射を繰り返してＳＰＡＤの出力パルスをカウントする第４遅延測定１２４とで構成される。測定対象の蛍光分子ＦＭとして、第１レーザーで励起され、第２レーザーでは励起されない第１の蛍光分子と、第１レーザーでは励起されず、第２レーザーで励起される第２の蛍光分子を用いる。

【0027】

同一単位測定シーケンス内の正規化された第１遅延測定値の正規化された第２遅延測定値に対する比の変化を観測することで、第１の蛍光分子を伴った微粒子の通過を検知することができる。また、同一単位測定シーケンス内の正規化された第３遅延測定値の正規化された第４遅延測定値に対する比の変化を観測することで、第２の蛍光分子を伴った微粒子の通過を検知することができる。

【0028】

〔実施形態３〕
第３の実施形態について図６及び図７を用いて説明する。実施形態１の液体中微粒子分析システムにおける直接入射光のみの時のＳＰＡＤの応答時間分布１３１は、遅延時間を掃引して測定することにより測定することができる。１３１は、流路に微粒子が流れていない状態において、遅延時間を掃引し、掃引した各遅延時間を用いた光子の検出を一定回数繰り返し、その繰り返しの中における前記光子の検出回数（バックグラウンド検出回数）の遅延時間依存性である。測定対象とする蛍光分子ＦＭを伴った微粒子の通過により、蛍光が加わった時の応答は、図６の１４１のようになると想定される。実施形態１における測定で、蛍光が加わった時の応答を高感度に検出するためには、１４１と１３１の比が大きくなる遅延時間での測定が望ましい。ここで、遅延時間０での蛍光による出力パルス増加量をＡ、蛍光寿命をτ、遅延時間をｔ、直接入射光のみの時の応答をＢＧ（ｔ）と記すと、蛍光が加わった時の応答１４１は、数式１であらわされる。したがって、バックグラウンドである１３１との比は、数式２のように計算される。数式２の値を最大化するためには、遅延時間を掃引して得られた応答時間分布１３１と蛍光寿命τを時定数とする指数的減衰関数（図７の１５１）との比（数式３）が最大になる最適遅延時間（図７の１５２）を使えばよいことがわかる。数式３の分子は蛍光寿命がわかれば計算可能であり、分母は遅延時間を掃引した測定から算出可能であるので、数式３は評価することができ、最適遅延時間１５２の導出が実施時に可能である。

【数1】

【数2】

【数3】

〔従来の液体中微粒子分析システムの課題〕
生物学および医学などにおける研究および臨床検査などで用いられる検査手法の１つとして、蛍光を用いた検査手法が挙げられる。蛍光とは、励起光（例えば紫外光または可視光）を吸収して基底状態から励起状態になった後、中間励起状態に落ちた分子またはイオンが、基底状態に戻るときに放出する、励起光より長い波長の光である。生体または非生体試料についての蛍光を用いた検査手法は、細胞構成成分の染色、遺伝子発現、および動的成分の局在移動の観察など、幅広い分野に応用されて成果を挙げている。

【0029】

一般に多く用いられている蛍光検査手法は、励起光を対象物に照射し、放出される蛍光のみを検知するものである。対象物から放出される蛍光と対象物により反射される励起光とを分離する方法の１つとして、蛍光と励起光とで波長が異なることを利用して、光学的なフィルタにより両者を分離する方法がある。

【0030】

一方、蛍光と励起光とを分離する別の方法として、蛍光寿命を利用する方法がある。蛍光寿命とは、対象物が励起状態から基底状態に戻るまでの平均時間である。蛍光寿命は、多くの種類の分子でサブナノ秒～数ナノ秒程度であり、分子の種類によって異なる。蛍光寿命を利用することで、励起光の消光後に放出される蛍光を検知することができる。

【0031】

特許文献１には、蛍光寿命を用いて蛍光を検知する装置の例として、液体中微粒子分析システムが記載されている。特許文献１の液体中微粒子分析システムは、図１及び図２に示す液体中微粒子分析システム１と似た構造を有する。特許文献１の液体中微粒子分析システムは、液体中微粒子分析システム１と同様に、励起光の消光後にＳＰＡＤを光子検出可能状態にして、ＳＰＡＤが蛍光光子を受けた際に流れるアバランシェ電流によるパルスをカウントするように構成されている。

【0032】

一方、M. Ghioni, A. Gulinatti, I. Rech, F. Zappa and S. Cova, "Progress in Silicon Single-Photon Avalanche Diodes," in IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, vol. 13, no. 4, pp. 852-862, 2007に記載されているように、ＳＰＡＤは光子が空乏層に入射してからアバランシェ現象が起きるまでの時間の確率分布に、いくつかの時定数による減衰特性の分布が含まれることが知られている。すなわち、光子入射とほぼ同時にアバランシェを起こす場合のほかに、光子の入射から遅れてアバランシェ電流が発生することがある。

【0033】

ここで、ＳＰＡＤに光子が入射してからアバランシェ電流が発生するまでの応答特性の例を図８～図１０を用いて説明する。図８は、半値幅が数１０ｐｓｅｃ程度のパルス発振レーザーのＳＰＡＤへの周期的照射タイミング３１とＳＰＡＤの動作とを同期して制御する関係の例を示すダイアグラムである。図８のＳＰＡＤ受光可能期間３５とは、ＳＰＡＤの逆バイアスをブレークダウン電圧以上に上げて、ＳＰＡＤが光子の入射をトリガーとしてアバランシェ電流を発生できる状態にしている期間である。遅延０ｎｓｅｃでのＳＰＡＤ制御タイミング３２は、パルス発振レーザーの照射と同時にＳＰＡＤの受光可能期間が開始する制御を示している。また、遅延１ｎｓｅｃでのＳＰＡＤ制御タイミング３３は、パルス発振レーザーの照射から１ｎｓｅｃ遅れてＳＰＡＤの受光可能期間が開始する制御を示している。さらに、遅延２ｎｓｅｃでのＳＰＡＤ制御タイミング３４は、パルス発振レーザーの照射から２ｎｓｅｃ遅れてＳＰＡＤの受光可能期間が開始する制御を示している。各遅延時間での測定は、各受光開始期間内にアバランシェ電流によるパルスが発生したか否かを検出し、その測定を一定回数繰り返して、パルス発生回数を積算することで行われる。

【0034】

図１０は、図８に示すような制御により、パルス発振レーザーの照射からＳＰＡＤの受光開始までの遅延時間を０ｎｓｅｃから５ｎｓｅｃまで０．０２ｎｓｅｃずつ変更して、各遅延時間での測定を２^１６＝６５５３６回繰り返し、積算されたパルス発生数を指数関数の組み合わせで近似してグラフにプロットした一例である。図１０のグラフの縦軸は、対数目盛で表示されている。各遅延時間における測定回数が６５５３６回であるため、パルスカウントの最大値は６５５３６で飽和している。

【0035】

図１０における飽和領域４１は、パルス発振されたレーザー光の光子の入射からほぼ即時にアバランシェ電流によるパルスが発生している状態で、各遅延時間での測定繰り返し回数が６５５３６回であるため、また、繰り返された全測定でパルスがカウントされるため、パルスカウントは６５５３６で飽和している。遅延時間０．１ｎｓｅｃから１．５ｎｓｅｃの間には、時定数０．２ｎｓｅｃで減衰する高速テール４２の領域、遅延時間１．３ｎｓｅｃ以降には、時定数２０ｎｓｅｃで減衰する低速テール４３の領域が存在する。高速テール４２、低速テール４３におけるパルスカウントの指数関数的減少は、ＳＰＡＤに入射した光子により生成した電荷キャリアが拡散により空乏層の端に到達しアバランシェを引き起こすまでの時間が統計的に揺らぐためと考えられる。また、高速テール４２と低速テール４３の二つの減衰特性の存在は、光子が吸収された位置の違いによると考えられている。図１０は、実験に用いたＳＰＡＤのデータを模式的に示した一例であり、実際には指数的に減少する成分の様々な組み合わせで近似される応答を示すことが知られている。

【0036】

以上に説明したＳＰＡＤにおける応答時間分布の特性に鑑みると、特許文献１に示された蛍光寿命を用いて蛍光を検知する方法は、高速テールあるいは低速テールの領域でＳＰＡＤのアバランシェ電流によるパルスをカウントし、蛍光がないときのカウント数（バックグラウンド）からカウント数が増加することをで、蛍光の検知とみなしていると理解できる。

【0037】

特許文献１の液体中微粒子分析システム（図９において符号５０を付す）の集積回路チップ５７においては、ＳＰＡＤ５６の受光面以外の領域には、光を透過させない配線メタル５４，５５が設けられている。このように構成された集積回路チップ５７においては、図９のように液中を矢印５１の向きに流れる微粒子５２により励起光５３が散乱あるいは屈折して、ＳＰＡＤ５６に入射する励起光量が、微粒子５２がＳＰＡＤ５６近傍に存在しないときに比べ増加することがある。そのような状況のＳＰＡＤ５６の応答特性は、図１０の応答６２に示すように、直接入射光のみの時の応答特性に比べて、励起光の入射量の増加に比例して増加し、入射光増加時の応答６２に示すような特性となる。一方、蛍光分子を伴った微粒子５２がＳＰＡＤ上を通過する場合、励起光により蛍光分子が励起され蛍光がＳＰＡＤに入射するような状態でのＳＰＡＤ５６の応答特性は、図１０の蛍光が加わった時の応答７１のようになる。ここで、蛍光分子の蛍光寿命は２ｎｓｅｃ程度と仮定している。特許文献１の液体中微粒子分析システムにおいて、蛍光分子を伴わない細胞Ｘ１が応答６２のような状態と同じようにＳＰＡＤ５６近傍を通過し、その後、蛍光分子を伴った細胞Ｘ２が応答７１の応答特性が想定されるＳＰＡＤ５６近傍を通過した場合、図１１に示すような、パルス発振レーザーの繰り返し照射により、パルス発振から例えば図１０の第１遅延時間７２の遅延において、６５５３６回ずつの光子測定を行い、ＳＰＡＤの出力パルスをカウントすると、図１２のようなパルスカウント９０の時系列グラフが得られることになる。

【0038】

図１２に示すように、この状況では、励起光増加による信号変化９２と、蛍光による信号変化９１とが順次観測されるが、これらの信号変化が蛍光に基づくものなのか否かの判定は、この観測データからだけでは困難であるという課題がある。

【0039】

〔まとめ〕
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。

【0040】

〔付記事項〕
本発明の第１の態様に係る液体中微粒子分析システムは、単一光子アバランシェダイオードを含む集積回路チップと、該集積回路チップの前記単一光子アバランシェダイオードの側に形成された、微粒子が流れる流路と、該流路にパルス状の励起光を照射する光源と、前記単一光子アバランシェダイオードの状態を、受光可能状態と待機状態との何れかに制御する制御部と、を備えている。

【0041】

本液体中微粒子分析システムにおいて、前記制御部は、前記光源が前記励起光を照射する照射タイミングから、前記単一光子アバランシェダイオードの状態を前記受光可能状態にするまでの遅延時間を、第１の遅延時間と、該第１の遅延時間よりも長い第２の遅延時間と、から選択し、前記照射タイミングから前記遅延時間が経過したのち、前記単一光子アバランシェダイオードの状態を所定の受光期間に亘って前記受光可能状態にし、当該受光可能状態において、単一光子アバランシェダイオードにおけるアバランシェ電流に応じてパルス状の光子を検出し、前記第１の遅延時間を用いた前記光子の検出を一定回数繰り返し、その繰り返しの中における前記光子の検出回数を第１の検出回数とし、前記第２の遅延時間を用いた前記光子の検出を前記一定回数繰り返し、その繰り返しの中における前記光子の検出回数を第２の検出回数とし、前記第１の検出回数と前記第２の検出回数とを繰り返し求めることにより、前記微粒子に付随した蛍光物質の検出を行う、構成が採用されている。

【0042】

図３に示すように、第１遅延測定１０１においては、図１０の第１遅延時間７２における測定を６５５３２回繰り返し、ＳＰＡＤの出力パルスをカウントし、第２遅延測定１０２においては、図１０の第２遅延時間７３における測定を６５５３２回繰り返し、ＳＰＡＤの出力パルスをカウントする。この第１遅延測定と第２遅延測定を単位測定シーケンス１００として繰り返すことで、図４の第１遅延測定の出力１１１、第２遅延測測定の出力１１３が得られる。第１遅延測定の出力１１１を第１遅延測定のバックグラウンド時間平均１１２で正規化し、第２遅延測定の出力１１３を第２遅延測定のバックグラウンド時間平均１１４で正規化すると、バックグラウンド時間平均による正規化グラフ１１５が得られる。さらに、同一単位測定シーケンス内の正規化された第１遅延測定値の、正規化された第２遅延測定値に対する比をプロットすると１１６のグラフが得られる。

【0043】

１１６のグラフにおいては、蛍光による出力変化のみが現れ、励起光の入射量が変化に対しては変化が見られない。したがって、１１６の時系列データに基づいて、蛍光の検知を行うことが可能である。すなわち、上記の構成によれば、特許文献１に記載の液体中微粒子分析システムと比較して、蛍光の検出精度を向上させることができる。

【0044】

また、この結果は以下のように説明できる。励起光の入射量変化も、蛍光光子の入射もないときの、第１遅延、第２遅延で観測されるＳＰＡＤ出力は、図６の高速テール１３１の応答に基づくもので、０．２ｎｓｅｃの時定数の指数関数的減衰特性を有している。ここで、励起光の散乱または屈折によりＳＰＡＤへの入射量が増加すると、その増加割合に比例して、高速テールの領域の出力も増加する。そのため、第１遅延測定の正規化値の変化率と第２遅延での正規化値の変化率とは同じであり、１１６に示した、同一単位測定シーケンス内のそれら二つの値の比はほぼ１になり、変化が起こらない。一方、蛍光寿命が高速テールの減衰時定数より長い蛍光の蛍光光子が入射している場合のＳＰＡＤの応答特性は、図１０の応答７１で示されるもので、応答６１または応答６２の出力に、蛍光寿命（ここでは２ｎｓｅｃと仮定している）を時定数とする指数関数的減衰量を加えたものとなる。応答６１または応答６２の高速テール領域の減衰は、蛍光の減衰より時定数が短く急激であるため、第１遅延時間７２の遅延での応答７１（蛍光が加わった時の応答）の値のバックグラウンド（応答６１）に対する比より、第２遅延時間７３の遅延での応答７１の値のバックグラウンド（応答６１）に対する比が大きくなり、１１６のような変化が起こる。

【0045】

本発明の第２の態様に係る液体中微粒子分析システムにおいては、上述した第１の態様に係る液体中微粒子分析システムの構成に加えて、前記光源は、互いに異なる複数の波長の励起光をそれぞれ互いに異なる前記照射タイミングで照射し、前記制御部は、前記第１の検出回数及び前記第２の検出回数の各々を、前記励起光ごとに繰り返し求めることにより、前記検出を行う、構成が採用されている。

【0046】

上記の構成によれば、互いに異なる複数の波長の励起光を用いて微粒子に付随した蛍光物質の検出を行うことができる。したがって、微粒子に付随する蛍光物質と、該蛍光物質において蛍光を生じさせる励起光の波長と、を適宜選択することによって、各蛍光物質の蛍光を、他の蛍光物質の蛍光とは分離した状態で検知することができる。より具体的に説明すると、吸収スペクトルが互いに重なりをもたない複数の蛍光物質を選択し、選択した蛍光物質のそれぞれに対し、その吸収スペクトルに含まれる波長の励起光を用いることで、複数の蛍光物質の判別が可能になる。

【0047】

本発明の第３の態様に係る液体中微粒子分析システムにおいては、上述した第１の態様又は第２の態様に係る液体中微粒子分析システムの構成に加えて、前記制御部は、前記流路に微粒子が流れていない状態における、前記第１の検出回数の時間平均値である第１の平均値と、前記第２の検出回数の時間平均値である第２の平均値と、を算出し、前記第１の検出回数を、前記第１の平均値で正規化した値を第１の正規化検出回数とし、前記第２の検出回数を、前記第２の平均値で正規化した値を第２の正規化検出回数とし、前記第１の正規化検出回数と前記第２の正規化検出回数との比に応じて前記検出を行う、構成が採用されている。

【0048】

単一光子アバランシェダイオードが検出する光子のうち、前記蛍光物質の蛍光に起因する光子は、遅延時間の変化に対して敏感に反応する傾向がある。一方、単一光子アバランシェダイオードが検出する光子のうち、微粒子による散乱及び屈折に起因する光子は、遅延時間の変化に対して鈍感に反応する傾向がある。したがって、上記の構成によれば、第１の正規化検出回数と第２の正規化検出回数との比に応じて光子の検出を行うため、遅延時間の変化に対して敏感に反応しやすい蛍光に起因する光子を確実に検出することができる。

【0049】

本発明の第４の態様に係る液体中微粒子分析システムにおいては、上述した第３の態様に係る液体中微粒子分析システムの構成に加えて、前記第１の正規化検出回数及び前記第２の正規化検出回数の少なくとも何れかの変化であって、前記微粒子による散乱及び屈折の少なくとも何れかに起因する変化に応じて、前記微粒子を検出する、構成が採用されている。

【0050】

上記の構成によれば、微粒子による散乱及び屈折の少なくとも何れかに起因する光子を検出することができるので、単一光子アバランシェダイオードの近傍に位置する流路のなかを微粒子が通過したことを検出することができる。したがって、微粒子に付随した蛍光物質が蛍光を発していることを確実に検出することができる。

【0051】

本発明の第５の態様に係る液体中微粒子分析システムにおいては、上述した第１の態様～第４の態様の何れか一態様に係る液体中微粒子分析システムの構成に加えて、前記制御部は、前記流路に微粒子が流れていない状態において、前記遅延時間を掃引し、掃引した各遅延時間を用いた前記光子の検出を一定回数繰り返し、その繰り返しの中における前記光子の検出回数をバックグラウンド検出回数として、当該バックグラウンド検出回数の遅延時間依存性を取得し、前記蛍光物質における蛍光寿命から計算される指数関数的減衰量の遅延時間依存性に対する前記バックグラウンド検出回数の前記遅延時間依存性の比が最大になる最適遅延時間を求め、前記第１の遅延時間及び前記第２の遅延時間の何れかとして前記最適遅延時間を用いる、構成が採用されている。

【0052】

上記の構成によれば、第１の遅延時間及び第２の遅延時間の何れかとして、微粒子に付随した既知である蛍光物質の蛍光寿命から計算された最適遅延時間を用いることができるので、特許文献１に記載の液体中微粒子分析システムと比較して、蛍光の検出精度を更に向上させることができる。

【符号の説明】

【0053】

１ 液体中微粒子分析システム
１０ 流路
１１ 注入孔
１２ 排出孔
１３ 集積回路チップ
１４Ａ 単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）
１４Ｂ 光子計測回路
１５ 制御部
１６ 光源制御回路
１７ 半導体レーザー（光源）
１８ 励起光パルス（励起光）
ＦＭ 蛍光分子
Ｘ１ 蛍光分子を伴わない細胞
Ｘ２ 蛍光分子を伴った細胞
Ｘ３ 次に観測する予定の細胞
７２ 第１遅延時間
７３ 第２遅延時間
１１１ 第１の検出回数
１１３ 第２の検出回数
１１５ 第１の正規化検出回数及び第２の正規化検出回数
１１６ 第１の正規化検出回数と第２の正規化検出回数との比
１３１ バックグラウンド検出回数
１５１ 蛍光物質における蛍光寿命から計算される指数関数的減衰量
１５２ 最適遅延時間

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】