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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025151531
(43)【公開日】2025-10-09
(54)【発明の名称】リンゴガイ類の検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6851 20180101AFI20251002BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20251002BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20251002BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6851 Z ZNA
C12Q1/6888 Z
C12M1/34 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024053014
(22)【出願日】2024-03-28
(71)【出願人】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】神村 学
(72)【発明者】
【氏名】松倉 啓一郎
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB20
4B029CC01
4B029FA15
4B029GA03
4B029GA08
4B029GB06
4B029GB10
4B063QA18
4B063QQ18
4B063QQ28
4B063QQ42
4B063QQ62
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR42
4B063QS03
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX02
(57)【要約】 （修正有）
【課題】環境ＤＮＡから高い検出率でリンゴガイ類を検出する。
【解決手段】特定の塩基配列を有する第１のプライマー、別の特定の塩基配列を有する第２のプライマー、及びさらに別の塩基配列を有するプローブを用いて、試料中の環境ＤＮＡを増幅・検出する。
【選択図】なし
【解決手段】特定の塩基配列を有する第１のプライマー、別の特定の塩基配列を有する第２のプライマー、及びさらに別の塩基配列を有するプローブを用いて、試料中の環境ＤＮＡを増幅・検出する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を用いて、試料中の核酸を増幅する工程、を含む、
リンゴガイ類の検出方法。
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を用いて、試料中の核酸を増幅する工程、を含む、
リンゴガイ類の検出方法。
【請求項2】
前記試料が、淡水環境又は土壌環境から採取された試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記核酸が、環境ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記プローブが、塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備える、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を含む、リンゴガイ類を検出するための試薬又はキット。
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を含む、リンゴガイ類を検出するための試薬又はキット。
【請求項6】
リアルタイムＰＣＲ用である、請求項５に記載の試薬又はキット。
【請求項7】
以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
からなる、リンゴガイ類を検出するためのプライマーセット。
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
からなる、リンゴガイ類を検出するためのプライマーセット。
【請求項8】
以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有する、リンゴガイ類を検出するためのプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列。
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、環境ＤＮＡを用いてリンゴガイ類を検出する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
スクミリンゴガイは、南米原産の淡水性巻貝の一種で、わが国には食用を目的とした養殖用として持ち込まれた後、環境中で野生化した侵略的外来種である。水田に生息して田植え後の若いイネを食害するため、害虫として防除の対象となっている。わが国には、スクミリンゴガイと非常によく似た形態を有する近縁種のラプラタリンゴガイも侵入しており、各地でスクミリンゴガイと交雑している。スクミリンゴガイとラプラタリンゴガイは、その外観や生態等からは容易には区別できない。
【0003】
環境中のスクミリンゴガイ等のリンゴガイ類の存在の有無は、通常は、ピンク色の卵塊が周辺に存在するか否かで判定される。しかし、生息密度が低い場合には、卵塊の観測は、必ずしも確実な判定方法ではなかった。
【0004】
環境ＤＮＡとは、海、川、湖沼等の水環境、土壌、大気等の環境中に存在する生物由来のＤＮＡの総称である。環境ＤＮＡの分析により、その環境中に存在する生物、特に水生生物の種類等を推定する技術が知られている。非特許文献１には、環境ＤＮＡから、スクミリンゴガイ及びラプラタリンゴガイのチトクローム酸化酵素１（ＣＯＩ）遺伝子を検出する方法が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】P. Banerjee, et al., Hydrobiologia (2022), 849: 4241-4257
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
非特許文献１に記載の方法では、環境ＤＮＡからのスクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイの検出率は５０～７０％であった。非特許文献１に記載の方法は、スクミリンゴガイとラプラタリンゴガイを区別することを目的としている。しかし、リンゴガイ類の防除を考える上で、これらを在来種と区別しながら検出することには意義はあるものの、これらのリンゴガイ間を区別することについては、両種が交雑することもあり、その意義が大きいとはいえない。そのため、スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイおよびこれらの2種の交雑個体を区別なく高感度に検出することが求められている。
【0007】
本発明は、環境ＤＮＡから高い検出率でリンゴガイ類を検出可能な方法、及び該方法に使用するための試薬又はキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本明細書は、以下の発明を提供する。
［１］以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を用いて、試料中の核酸を増幅する工程、を含む、
リンゴガイ類の検出方法。
［２］前記試料が、淡水環境又は土壌環境から採取された試料である、［１］に記載の方法。
［３］前記核酸が、環境ＤＮＡである、［１］又は［２］のいずれかに記載の方法。
［４］前記プローブが、塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備える、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を含む、リンゴガイ類を検出するための試薬又はキット。
［６］リアルタイムＰＣＲ用である、［５］に記載の試薬又はキット。
［７］以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
からなる、リンゴガイ類を検出するためのプライマーセット。
［８］以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有する、リンゴガイ類を検出するためのプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列。
［１］以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を用いて、試料中の核酸を増幅する工程、を含む、
リンゴガイ類の検出方法。
［２］前記試料が、淡水環境又は土壌環境から採取された試料である、［１］に記載の方法。
［３］前記核酸が、環境ＤＮＡである、［１］又は［２］のいずれかに記載の方法。
［４］前記プローブが、塩基配列の５’末端側及び３’末端側に蛍光物質及びクエンチャー物質をそれぞれ備える、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を含む、リンゴガイ類を検出するための試薬又はキット。
［６］リアルタイムＰＣＲ用である、［５］に記載の試薬又はキット。
［７］以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列；
からなる、リンゴガイ類を検出するためのプライマーセット。
［８］以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有する、リンゴガイ類を検出するためのプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列。
【発明の効果】
【0009】
本発明によると、環境ＤＮＡから、高い検出率でリンゴガイ類を検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】スクミリンゴガイのチトクローム酸化酵素１（ＣＯＩ）遺伝子の塩基配列上のプライマー、プローブの一例の設計位置を示す模式図である。ラプラタリンゴガイについては、３５４～４２０位に対応する塩基配列のうち、不一致の塩基のみを表示する。他の淡水性巻貝については、３８２～４０７位に対応する塩基配列のうち、不一致の塩基のみを表示する。
【図2】環境ＤＮＡの採取、検出の手順の一例を示すフロー図である。
【図3】各種淡水性巻貝の組織及び飼育水由来のＤＮＡ溶液の定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。縦軸に蛍光強度、横軸にＰＣＲサイクル数を示す。図３Ａは組織由来のＤＮＡ溶液、図３Ｂは飼育水由来のＤＮＡ溶液の定量ＰＣＲの結果を示す。
【図4】環境Ａ及び環境Ｂから採取した環境ＤＮＡの定量ＰＣＲの結果を示すグラフである。縦軸に蛍光強度、横軸にＰＣＲサイクル数を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
１ 定義・構成
本明細書において、「リンゴガイ類」とは、リンゴガイ科（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｉｄａｅ）に属する淡水性の巻貝を意味し、特に、日本に侵略的外来種として広く繁殖する、スクミリンゴガイ（Ｐｏｍａｃｅａ ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ）、ラプラタリンゴガイ（Ｐｏｍａｃｅａ ｍａｃｕｌａｔａ）及びこれらの交雑種を指すものとする。ここでいう「侵略的外来種」とは、外来種のうち、地域の自然環境に大きな影響を与え、生物多様性を脅かすおそれのあるものを意味する。
本明細書において、「リンゴガイ類」とは、リンゴガイ科（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｉｄａｅ）に属する淡水性の巻貝を意味し、特に、日本に侵略的外来種として広く繁殖する、スクミリンゴガイ（Ｐｏｍａｃｅａ ｃａｎａｌｉｃｕｌａｔａ）、ラプラタリンゴガイ（Ｐｏｍａｃｅａ ｍａｃｕｌａｔａ）及びこれらの交雑種を指すものとする。ここでいう「侵略的外来種」とは、外来種のうち、地域の自然環境に大きな影響を与え、生物多様性を脅かすおそれのあるものを意味する。
【0012】
本明細書において、「淡水環境」は、川、湖沼、水田、用水路等、生態系が構築されている淡水域全般を包含する。本明細書において、「土壌環境」とは、生態系が構築されている土壌を指す。一般に、土壌とは、岩石、泥炭、火山灰に、長期間にわたって生物、地形、気候等が作用してできた、地球の表面を覆う層を意味する。
【0013】
本明細書において、「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を包含する。本明細書において、「環境ＤＮＡ」とは、水、土壌、大気等の環境中に放出されたＤＮＡを指す。環境ＤＮＡは、サンプリングした水や土壌から抽出され、その環境中に存在する生物を網羅的に把握したり、特定の生物の存在を検出したりするために使用される。
【0014】
本明細書において、塩基配列における「Ｔ」は、必要に応じて「Ｕ」に変更することができる。本明細書において、塩基配列における「Ｄ」は「Ａ／Ｇ／Ｔ」、「Ｈ」は「Ａ／Ｔ／Ｃ」、「Ｋ」は「Ｇ／Ｔ」、「Ｍ」は「Ａ／Ｃ」、「Ｒ」は「Ａ／Ｇ」、「Ｙ」は「Ｃ／Ｔ」を示す。本明細書において、プライマーの塩基配列に「Ｄ」、「Ｈ」、「Ｋ」、「Ｍ」、「Ｒ」及び／又は「Ｙ」が存在する場合、当該塩基がいずれか１つの塩基であるか（例えば、「Ｙ」はＣ又はＴ、「Ｋ」はＧ又はＴ）、あるいは、当該プライマーが縮重プライマーであることを示す。
【0015】
本明細書において、核酸増幅としては、核酸、特にＤＮＡの増幅が可能な手法のいずれを使用してもよい。核酸増幅手法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＥＡＲ（Ｎｉｃｋｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等、多数の手法が知られる。核酸の増幅と増幅後の核酸の検出とは、同時（リアルタイム）に行っても順次行ってもよい。以下、特段の記載のない限り、核酸増幅手法としてリアルタイムＰＣＲ法を使用する態様について記載するが、本発明の核酸増幅手法をリアルタイムＰＣＲに限定することを意図するものではない。
【0016】
本明細書において、「プライマー」とは、核酸増幅の起点となる、人工的に調製された、１０～３０塩基長程度のオリゴヌクレオチドを指す。本明細書において、「プローブ」とは、増幅した核酸と特異的に結合する配列を有する、人工的に調製された１０～５０塩基長程度のオリゴヌクレオチドを指す。
【0017】
本明細書において、塩基配列の「配列同一性」とは、２つの塩基配列にギャップを導入して、又はギャップを導入しないで整列させた場合の、最適なアラインメントにおいて、オーバーラップする全塩基配列に対する同一塩基の割合（パーセンテージ）を意味し、式（１）によって算出される値を指す。
配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士は無視する）／短いほうの配列長（ギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）
配列同一性は、この分野で汎用されているアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）等を用いて容易に調べることができる。
配列同一性（％）＝一致数（ギャップ同士は無視する）／短いほうの配列長（ギャップを含まない長さ）×１００・・・式（１）
配列同一性は、この分野で汎用されているアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）等を用いて容易に調べることができる。
【0018】
本明細書において、「試薬」とは、容器に収納された溶液、部材等の要素のうち、１つの要素からなる（ただし、包装材を別途備えてもよい）を指す。一方、「キット」とは、容器に収納された溶液、部材等の要素を２つ以上含むものを指す。本明細書において、試薬及びキットは、目的のために必要な要素を備えていれば、その要素の数は特に限定されないことから、特に区別することを要しない。本明細書において、試薬及びキットは、まとめて「試薬等」とも称する。
【0019】
２ リンゴガイ類の検出方法
本発明の第１の実施形態はリンゴガイ類の検出方法である。本実施形態の方法は、以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１（表１）で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２（表１）で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３（表１）で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４（表１）で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を用いて、試料中の核酸を増幅する工程、を含むことを特徴とする。
本実施形態の方法は、上記の特徴を有することにより、在来種との交差反応を生じることなく、リンゴガイ類を高感度で検出できるという利点を有する。
本発明の第１の実施形態はリンゴガイ類の検出方法である。本実施形態の方法は、以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１（表１）で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２（表１）で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３（表１）で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４（表１）で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を用いて、試料中の核酸を増幅する工程、を含むことを特徴とする。
本実施形態の方法は、上記の特徴を有することにより、在来種との交差反応を生じることなく、リンゴガイ類を高感度で検出できるという利点を有する。
【0020】
２－１ プライマー、プローブ
前記第１のプライマーは、配列番号１で表される塩基配列、配列番号１で表される塩基配列の部分配列、配列番号１で表される塩基配列に１～９塩基の変異を有する塩基配列、及びこれらの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される。もっとも好ましくは、第１のプライマーは、配列番号１で表される塩基配列を有する。
前記第１のプライマーは、配列番号１で表される塩基配列、配列番号１で表される塩基配列の部分配列、配列番号１で表される塩基配列に１～９塩基の変異を有する塩基配列、及びこれらの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される。もっとも好ましくは、第１のプライマーは、配列番号１で表される塩基配列を有する。
【0021】
前記第２のプライマーは、配列番号２で表される塩基配列、配列番号２で表される塩基配列の部分配列、配列番号２で表される塩基配列に１～９塩基の変異を有する塩基配列、及びこれらの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択される。もっとも好ましくは、第２のプライマーは、配列番号２で表される塩基配列を有する。
【0022】
前記プローブは、配列番号３で表される塩基配列、配列番号３で表される塩基配列の部分配列、配列番号３で表される塩基配列に１～９塩基の変異を有する塩基配列、及びこれらの塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列から選択されるが、いずれの場合も配列番号４で表される塩基配列を含むことを要する。もっとも好ましくは、プローブは、配列番号３で表される塩基配列を有する。
【0023】
表１にスクミリンゴガイのチトクローム酸化酵素１（ＣＯＩ）の塩基配列（配列番号５）を示す。図１に、スクミリンゴガイのＣＯＩ遺伝子の部分配列と、ラプラタリンゴガイ、他の淡水性巻貝（ヒメタニシ、マルタニシ、オオタニシ、サカマキガイ、チリメンカワニナ、モノアラガイ、ヒラマキミズマイマイ）の対応する配列のアライントを示す。ラプラタリンゴガイの塩基配列については、配列番号５と相違する塩基のみ表示する。スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイ以外は、配列番号５の塩基配列の３８２～４０７位の配列と相違する塩基のみを表示する。配列番号５の塩基配列は、スクミリンゴガイミトコンドリア全ゲノム塩基配列（NCBI Reference Sequence: NC_024586.1）のうち、ＣＯＩのオープンリーディングフレームに相当する１～１５３６位の塩基配列である。
【0024】
前記第１のプライマー、特に配列番号１の塩基配列を有するプライマーは、配列番号５で表されるＣＯＩ遺伝子の塩基配列の３５３～３７７位の相補鎖に特異的に結合する。前記第２のプライマー。特に配列番号２の塩基配列を有するプライマーは、配列番号５で表されるＣＯＩ遺伝子の塩基配列の４０１～４１９位に特異的に結合する。図中、第１のプライマーは５’末端側に結合し、第２のプライマーは３’末端側に結合することから、以降、第１のプライマーはフォワードプライマー、第２のプライマーはリバースプライマーとも称する。上記のフォワードプライマー及びリバースプライマーは、配列番号５で表される塩基配列の３５３～４１９位の部分配列を増幅することが可能である。
【0025】
前記プローブ、特に配列番号３の塩基配列を有するプローブは、配列番号５で表されるＣＯＩ遺伝子の塩基配列の３８２～３９９位の相補鎖に特異的に結合する。前記プローブは、少なくとも部分配列として、配列番号４で表される塩基配列を有する。配列番号４で表される塩基配列は、配列番号５で表されるＣＯＩ遺伝子の塩基配列の３８８～３９７位の相補鎖に特異的に結合する。特にこの部位において、リンゴガイ類と他の淡水性巻貝との塩基配列の差異が見られることから、前記プローブを使用することにより、リンゴガイ類を特異的に検出することが可能である。
【0026】
前記第１のプライマー、第２のプライマー及びプローブは、核酸増幅及び検出に使用される。核酸増幅手法は、既知の手法をいずれも使用できるが、リアルタイムＰＣＲ法を用いることが好ましい。特に、プローブの５’末端側に蛍光物質（レポーター色素）、３’末端側にクエンチャー物質を結合させたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用することが好ましい。蛍光物質とクエンチャー物質の組み合わせは、通常、ＴａｑＭａｎプローブに使用される組み合わせであれば特に限定されない。また、クエンチャー物質は、蛍光クエンチャー、非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）のいずれも使用できる。蛍光物質とクエンチャー物質の組み合わせとしては、例えば、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ（蛍光波長５２０ｎｍ）、ＨＥＸ－ＴＡＭＲＡ（蛍光波長５５６ｎｍ）、ＴＥＴ－ＴＡＭＲＡ（蛍光波長５３６ｎｍ）、ＦＡＭ－ＢＨＱ（登録商標）－１（蛍光波長５２０ｎｍ）、ＨＥＸ－ＢＨＱ－１（蛍光波長５５６ｎｍ）、ＴＥＴ－ＢＨＱ－１（蛍光波長５３６ｎｍ）、ＴＡＭＲＡ－ＢＨＱ－２（蛍光波長５８３ｎｍ）、ＲＯＸ－ＢＨＱ－２（蛍光波長６１０ｎｍ）、Ｃｙ５－ＢＨＱ－３（蛍光波長６６９ｎｍ）等とすることができる。あるいは、任意の蛍光物質とＮＦＱの組み合わせとすることができる。ＴａｑＭａｎプローブには、さらに、３’末端側にＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ）が結合していてもよい。ＴａｑＭａｎプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ法は、例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）等の機器を用いて実施することができる。
【0027】
プローブは必ずしも蛍光物質等の標識を有していてなくてもよい。この場合、ＰＣＲ法として、第１のプライマー及び／又は第２のプライマーを蛍光物質、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ビオチン等で標識し、標的ＤＮＡを増幅した後、メンブレン、マイクロプレート等に固定したプローブに増幅後のＤＮＡを結合させ、検出してもよい。この場合、増幅時にプローブを使用しない他の核酸増幅手法を用いても、増幅後のＤＮＡから標的ＤＮＡを検出することが可能である。
【0028】
【表1】
【0029】
２－２ 環境ＤＮＡの採取及び検出
本実施形態において、試料は、リンゴガイ類のＤＮＡの存在が疑われる試料であれば、特に限定されず、例えば、リンゴガイ類か否かの同定を要する淡水性巻貝から直接採取し生体試料（例えば、筋肉組織）であってもよいが、淡水環境又は土壌環境から採取された試料とすることが好ましい。淡水環境におけるリンゴガイ類の被害を防ぐという目的から、淡水環境から採取された試料とすることがより好ましい。つまり、試料から増幅・検出されるＤＮＡは、環境ＤＮＡ、特に淡水環境由来の環境ＤＮＡであることが好ましい。以下、淡水環境から採取された試料からの環境ＤＮＡの検出方法について、例示的に説明するが、本実施形態における試料を限定することを意図するものではない。
本実施形態において、試料は、リンゴガイ類のＤＮＡの存在が疑われる試料であれば、特に限定されず、例えば、リンゴガイ類か否かの同定を要する淡水性巻貝から直接採取し生体試料（例えば、筋肉組織）であってもよいが、淡水環境又は土壌環境から採取された試料とすることが好ましい。淡水環境におけるリンゴガイ類の被害を防ぐという目的から、淡水環境から採取された試料とすることがより好ましい。つまり、試料から増幅・検出されるＤＮＡは、環境ＤＮＡ、特に淡水環境由来の環境ＤＮＡであることが好ましい。以下、淡水環境から採取された試料からの環境ＤＮＡの検出方法について、例示的に説明するが、本実施形態における試料を限定することを意図するものではない。
【0030】
環境ＤＮＡの採取、検出の手順は、例えば、環境ＤＮＡ学会、環境ＤＮＡ技術標準化委員会編「環境ＤＮＡ調査・実験マニュアルＶｅｒ．２．２」（２０２０年４月３日発行）等を参照することができる。上記マニュアルに記載の手順は、必要に応じて適宜変更してもよい。図２に、環境ＤＮＡの採取、検出の手順の一例を示す。図中の手順は、環境ＤＮＡの採取、検出は、淡水環境から試料を採水する工程、試料をフィルター濾過する工程、フィルターを保存液中に保存する工程、フィルターからＤＮＡを回収する工程、ＤＮＡを精製する工程、リンゴガイ類のＤＮＡを増幅、検出する工程を含む。以下、各工程を例示的に説明するが、各工程の条件等を限定することを意図するものではない。
【0031】
２－２－１ 採水工程
川、湖沼、水田、用水路等から環境試料を採水する。まず、採水ポイントを決定し、採水を行う。採水するための容器（紙コップ等）は、未使用のものを利用するか、再利用する場合は採水の前に容器内部に次亜塩素酸ナトリウム水溶液（０．１％程度）等を噴霧してふき取る等の操作を行い、容器内部に付着する核酸を除去することとする。
川、湖沼、水田、用水路等から環境試料を採水する。まず、採水ポイントを決定し、採水を行う。採水するための容器（紙コップ等）は、未使用のものを利用するか、再利用する場合は採水の前に容器内部に次亜塩素酸ナトリウム水溶液（０．１％程度）等を噴霧してふき取る等の操作を行い、容器内部に付着する核酸を除去することとする。
【0032】
２－２－２ フィルター濾過工程
採水した試料から、ＤＮＡ分解が生じる前に、フィルター濾過によりできる限り早期に環境ＤＮＡを濃縮する。フィルターは、例えば、ステリベクスフィルターカートリッジ（孔径０．４５μｍ、メルク・ミリポア社、ＳＶＨＶ０１０ＲＳ）、グラスファイバーフィルター等を使用することができる。ステリベクスフィルターカートリッジを用いる場合、５０ｍＬシリンジで試料を吸引した後、シリンジにフィルターカートリッジを取り付け、通水する。吸引と通水を繰り返すことで、１本のフィルターカートリッジで通常２００ｍＬ～１Ｌ程度の試料を濾過することができる。
採水した試料から、ＤＮＡ分解が生じる前に、フィルター濾過によりできる限り早期に環境ＤＮＡを濃縮する。フィルターは、例えば、ステリベクスフィルターカートリッジ（孔径０．４５μｍ、メルク・ミリポア社、ＳＶＨＶ０１０ＲＳ）、グラスファイバーフィルター等を使用することができる。ステリベクスフィルターカートリッジを用いる場合、５０ｍＬシリンジで試料を吸引した後、シリンジにフィルターカートリッジを取り付け、通水する。吸引と通水を繰り返すことで、１本のフィルターカートリッジで通常２００ｍＬ～１Ｌ程度の試料を濾過することができる。
【0033】
２－２－３ 保存工程
濾過後のフィルターカートリッジは、内部ＤＮＡの分解を防ぐため、保存液で満たすことが好ましい。シリンジでフィルターカートリッジに空気を通し、内部に残存する水を除去した後、フィルターカートリッジの排出孔をパラフィルム、ルアーフィッティング（例えば、株式会社アイシス、ＶＲＳＰ６）等で封止した後、シリンジで保存液を注入する。保存液としては、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）安定化溶液（Thermo Fisher Scientific社）、エタノール、塩化ベンザルコニウム水溶液等を使用することができる。保存液注入後、フィルターカートリッジの注入孔をパラフィルム、ルアーフィッティング（例えば、株式会社アイシス製、ＶＲＭＰ６）等で封止する。フィルターカートリッジは、その後、直ちにクーラーボックス内に入れる等、冷暗所に保存することが好ましい。その後、できるだけ早期に冷凍保存（例えば、－２０℃以下）することが好ましい。
濾過後のフィルターカートリッジは、内部ＤＮＡの分解を防ぐため、保存液で満たすことが好ましい。シリンジでフィルターカートリッジに空気を通し、内部に残存する水を除去した後、フィルターカートリッジの排出孔をパラフィルム、ルアーフィッティング（例えば、株式会社アイシス、ＶＲＳＰ６）等で封止した後、シリンジで保存液を注入する。保存液としては、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）安定化溶液（Thermo Fisher Scientific社）、エタノール、塩化ベンザルコニウム水溶液等を使用することができる。保存液注入後、フィルターカートリッジの注入孔をパラフィルム、ルアーフィッティング（例えば、株式会社アイシス製、ＶＲＭＰ６）等で封止する。フィルターカートリッジは、その後、直ちにクーラーボックス内に入れる等、冷暗所に保存することが好ましい。その後、できるだけ早期に冷凍保存（例えば、－２０℃以下）することが好ましい。
【0034】
なお、上記のフィルター濾過工程、保存工程を採水地で実施することが困難な場合は、採水した水を未使用、もしくは次亜塩素酸ナトリウム水溶液等で除染した密封容器内に入れて、必要に応じて塩化ベンザルコニウム等の保存剤を添加して、直ちにクーラーボックス等に入れて運搬した後、できるだけ早期にフィルター濾過を行うことが好ましい。
【0035】
２－２－４ ＤＮＡ回収工程
次いで、フィルターに付着したＤＮＡを回収する。フィルターカートリッジを保存液を満たした状態で冷凍保存した場合は、まず、これを室温で融解し、吸引、遠心分離等により、フィルターカートリッジ内の保存液を除去する。吸引による場合は、例えば、アスピレーターに接続したＱＩＡｖａｃ（キアゲン社）にフィルターカートリッジをセットして、吸引することにより保存液を除去することができる。遠心分離による場合は、例えば、５０ｍＬコニカルチューブ内に５ｍＬチューブを入れ、５ｍＬチューブに両端を開放したフィルターカートリッジを注入孔を下にして入れた後、５０ｍＬコニカルチューブの蓋を閉め、遠心分離をすることにより、保存液を除去することができる。
次いで、フィルターに付着したＤＮＡを回収する。フィルターカートリッジを保存液を満たした状態で冷凍保存した場合は、まず、これを室温で融解し、吸引、遠心分離等により、フィルターカートリッジ内の保存液を除去する。吸引による場合は、例えば、アスピレーターに接続したＱＩＡｖａｃ（キアゲン社）にフィルターカートリッジをセットして、吸引することにより保存液を除去することができる。遠心分離による場合は、例えば、５０ｍＬコニカルチューブ内に５ｍＬチューブを入れ、５ｍＬチューブに両端を開放したフィルターカートリッジを注入孔を下にして入れた後、５０ｍＬコニカルチューブの蓋を閉め、遠心分離をすることにより、保存液を除去することができる。
【0036】
保存液を除去した後のフィルターカートリッジの排出孔を封止し、溶出溶液で満たす。溶出溶液は、特に限定されないが、例えば、カオトロピックタンパク質変性剤（例えば、グアニジン塩酸塩）、タンパク質分解酵素（例えば、プロテナーゼＫ）を含む溶液を使用できる。溶出溶液は、例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（キアゲン社、６９５０４）のＢｕｆｆｅｒＡＬ、プロテナーゼＫをＰＢＳ（－）で希釈することで調製することができる。
【0037】
溶出溶液を満たしたフィルターカートリッジは、両端を封止し、５０～６０℃程度（例えば、５６℃）の条件下で加温する。加温には、例えば、乾熱滅菌機を用いることができる。加温時間は、２０～３０分程度とすることができる。加温時は、フィルターカートリッジ内部に溶出溶液を満遍なく行きわたらせるため、ローテーターを用いて１０ｒｐｍ程度の速度で回転させてもよい。あるいは、使用する溶出溶液量を増量させてもよい（例えば、Wong et al., Nature Scientific Reports,(2020) 10:21531を参照のこと）。
【0038】
加温後のフィルターカートリッジから、溶出溶液を回収する。例えば、５０ｍＬコニカルチューブ内に入れた５ｍＬチューブに、両端を開放したフィルターカートリッジを注入孔を下にして入れた後、５０ｍＬコニカルチューブの蓋を閉め、遠心分離をすることにより、５ｍＬチューブ内に溶出溶液を回収することができる。
【0039】
２－２－５ ＤＮＡ精製工程
回収した溶出溶液中のＤＮＡを精製する。ＤＮＡ精製の手法は、特に限定されず、既知の精製手法を採用することができる。例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔを用いることができる。あるいは、フェノール／クロロホルム法、エタノール沈殿法等の既知の手法を用いることができる。
回収した溶出溶液中のＤＮＡを精製する。ＤＮＡ精製の手法は、特に限定されず、既知の精製手法を採用することができる。例えば、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔを用いることができる。あるいは、フェノール／クロロホルム法、エタノール沈殿法等の既知の手法を用いることができる。
【0040】
２－２－６ ＤＮＡ増幅・検出工程
精製したＤＮＡを含む溶液（以下、ＤＮＡ溶液）中のＤＮＡを増幅し、リンゴガイ類由来のＤＮＡを検出する。ＤＮＡ増幅は、既知の核酸増幅手法のいずれも使用できるが、特に、核酸増幅とプローブによる検出を同時に実施できるリアルタイムＰＣＲ法、特にＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ法を好適に使用できる。
精製したＤＮＡを含む溶液（以下、ＤＮＡ溶液）中のＤＮＡを増幅し、リンゴガイ類由来のＤＮＡを検出する。ＤＮＡ増幅は、既知の核酸増幅手法のいずれも使用できるが、特に、核酸増幅とプローブによる検出を同時に実施できるリアルタイムＰＣＲ法、特にＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ法を好適に使用できる。
【0041】
リアルタイムＰＣＲ法は、通常、ＤＮＡ増幅用反応液と、鋳型ＤＮＡを含むＤＮＡ溶液とを混合した後、これらを反応させる。リアルタイムＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅用反応液には、通常は、少なくとも以下の成分が含まれる：
－ＤＮＡポリメラーゼ；
－第１のプライマー；
－第２のプライマー；
－プローブ；
－デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）；
－二価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）
－ｐＨ緩衝剤。
また、ＤＮＡ増幅用反応液のｐＨは、通常は、７．５～１０．５、特に８．０～９．０程度である。
－ＤＮＡポリメラーゼ；
－第１のプライマー；
－第２のプライマー；
－プローブ；
－デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）；
－二価金属イオン、好ましくはマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）
－ｐＨ緩衝剤。
また、ＤＮＡ増幅用反応液のｐＨは、通常は、７．５～１０．５、特に８．０～９．０程度である。
【0042】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。前記ｐＨ緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ，リン酸バッファー、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝液等のリアルタイムＰＣＲ用に通常使用される、既知のｐＨ緩衝剤をいずれも使用できる。前記二価金属イオンは、Ｍｇ２＋の場合、例えば、２ｍＭ程度の濃度とすることができる。プローブは、蛍光標識プローブ、特にＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用することができる。
【0043】
蛍光物質の結合のないプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲ法ではなく、ＰＣＲ法（増幅）と検出を別々に実施してもよい。この場合、前記第１のプライマー及び／又は第プライマーとして、蛍光物質、ＤＩＧ、ビオチン等で標識したものを使用することで、プローブを固定したマイクロプレート（マイクロプレートハイブリダイゼーション法）、メンブレン（サザンハイブリダイゼーション法）等により増幅ＤＮＡを検出することができる。
【0044】
ＤＮＡ溶液と上記のＤＮＡ増幅用試薬とを混合して、所定の温度条件下で反応させることでＤＮＡを増幅することができる。ＤＮＡ増幅は、例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）等のリアルタイムＰＣＲ用又はＰＣＲ用のサーマルサイクラーを使用して実施することができる。
【0045】
ＤＮＡ回収工程から、サーマルサイクラーにセットする直前までの作業は、大気中のＤＮＡの混入によるエラー、特にキャリーオーバーコンタミネーションによるエラーのリスクを低減するために、ＤＮＡ増幅後の作業を実施する実験室等とは別の実験室等で実施することが好ましい。あるいは、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ等を使用して、キャリーオーバーコンタミネーションのリスクを低減することが好ましい。
【0046】
リアルタイムＰＣＲ法等により得られたシグナルより、ＤＮＡ溶液中にリンゴガイ類のＤＮＡが存在するか否かを判定することができる。ＤＮＡ溶液中にリンゴガイ類のＤＮＡの存在が検出された場合、当該ＤＮＡ溶液の元の試料が採取された環境に、リンゴガイ類が生息していると判定することができる。
【0047】
３ リンゴガイ類を検出するための試薬又はキット
本発明の第２の実施形態は、リンゴガイ類を検出するための試薬又はキットである。本実施形態の試薬又はキット（以下、「試薬等」とも称する）は、以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を含む、ことを特徴とする。
本発明の第２の実施形態は、リンゴガイ類を検出するための試薬又はキットである。本実施形態の試薬又はキット（以下、「試薬等」とも称する）は、以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有するプローブ：
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列；
を含む、ことを特徴とする。
【0048】
本実施形態の試薬等は、上記の特徴を有することにより、在来種との交差反応を生じることなく、リンゴガイ類を高感度で検出するために使用することができる。
【0049】
本実施形態の試薬等は、リアルタイムＰＣＲ用の試薬等であることが好ましい。リアルタイムＰＣＲ用の試薬等である場合、前記プローブは、例えば、ＴａｑＭａｎプローブとすることができる。
【0050】
本実施形態の試薬等は、具体的には、「２ リンゴガイ類の検出方法」の節に記載の方法に使用される試薬等である。検出対象の試料、検出時の条件等は、特に記載のない限り、「２ リンゴガイ類の検出方法」の節に記載した通りである。
【0051】
４ リンゴガイ類を検出するためのプライマーセット
本発明の第３の実施形態は、リンゴガイ類を検出するためのプライマーセットである。本実施形態のプライマーセットは、以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
からなる、ことを特徴とする。
本発明の第３の実施形態は、リンゴガイ類を検出するためのプライマーセットである。本実施形態のプライマーセットは、以下の（ａ１）～（ａ４）のいずれかの塩基配列を有する第１のプライマー：
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列；
（ａ２）配列番号１で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ａ３）配列番号１で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ａ４）（ａ１）～（ａ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
及び、以下の（ｂ１）～（ｂ４）のいずれかの塩基配列を有する第２のプライマー：
（ｂ１）配列番号２で表される塩基配列；
（ｂ２）配列番号２で表される塩基配列上の連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｂ３）配列番号２で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列；
（ｂ４）（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列；
からなる、ことを特徴とする。
【0052】
本実施形態のプライマーセットは、具体的には、「２ リンゴガイ類の検出方法」の節に記載の方法に使用するためのプライマーセットである。また、「３ リンゴガイ類を検出するための試薬又はキット」の節に記載の試薬又はキットを製造するために使用されるプライマーセットである。本実施形態のプライマーセットは、後述する「５ リンゴガイ類を検出するためのプローブ」の節に記載のプローブと組み合わせて使用することができる。
【0053】
５ リンゴガイ類を検出するためのプローブ
本発明の第４の実施形態は、リンゴガイ類を検出するためのプローブである。本実施形態のプローブは、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有することを特徴とする。
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列。
本発明の第４の実施形態は、リンゴガイ類を検出するためのプローブである。本実施形態のプローブは、以下の（ｃ１）～（ｃ４）から選択される塩基配列を有することを特徴とする。
（ｃ１）配列番号３で表される塩基配列；
（ｃ２）配列番号３で表される塩基配列上の配列番号４で表される塩基配列を含む連続する１０塩基長以上の塩基配列；
（ｃ３）配列番号３で表される塩基配列において、１～９塩基、好ましくは、８塩基、７塩基、６塩基、５塩基、４塩基、３塩基、２塩基又は１塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列であって、配列番号４で表される塩基配列部分には欠失、若しくは付加が存在しない塩基配列；
（ｃ４）（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかの塩基配列と８０％以上、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であって配列番号４で表される塩基配列部分には変異を有しない塩基配列。
【0054】
本実施形態のプローブは、具体的には、「２ リンゴガイ類の検出方法」の節に記載の方法に使用するためのプローブである。また、「３ リンゴガイ類を検出するための試薬又はキット」の節に記載の試薬又はキットを製造するために使用されるプローブである。本実施形態のプライマーセットは、「４ リンゴガイ類を検出するためのプライマーセット」の節に記載のプライマーセットと組み合わせて使用することができる。
【0055】
本実施形態のプローブは、特に限定されないが、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとすることが好ましい。ＴａｑＭａｎプローブに使用する蛍光物質、クエンチャー物質は、通常、ＴａｑＭａｎプローブに使用されるものをいずれも使用できる。また、ＴａｑＭａｎプローブには、３’末端側にＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ）が結合していてもよい。
【実施例0056】
［実施例１］各種淡水性巻貝の飼育水及び組織来の試料からのＤＮＡ検出
（１）飼育水からのＤＮＡ採取
スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイ、ヒメタニシ、チリメンカワニナ及びサカマキガイをそれぞれ２週間飼育した。飼育時の生育密度は、スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイは、２～３頭／５Ｌ、他の巻貝は２０頭／０．５Ｌとした。飼育後の水を紙コップに採取し、５０ｍＬシリンジを用いて飼育水を吸引して、ステリベクスフィルターカートリッジ（孔径０．４５μｍ、メルク・ミリポア社、ＳＶＨＶ０１０ＲＳ）をシリンジの吸引口に装着して加圧濾過を行った。吸引と濾過を繰り返して、２００ｍＬ～１Ｌの飼育水の濾過を行った。 濾過後のフィルターカートリッジに空気を満たしたシリンジを再装着し、加圧してカートリッジ内の水分を押し出した。この操作をカートリッジ内の水分がなくなるまで数回繰り返した。マイクロピペットを用いてカートリッジ内に核酸保存液（ＲＮＡｌａｔｅｒ液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＡＭ７０２１））を注入し、内部を満たした。フィルターカートリッジの排出孔と注入孔にルアーフィッティング（アイシス社ＶＲＳＰ６およびＶＲＭＰ６）を装着して密封した。密封後のフィルターカートリッジは、冷凍条件下（－２０℃以下、又は－３０℃以下）で保管した。
（１）飼育水からのＤＮＡ採取
スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイ、ヒメタニシ、チリメンカワニナ及びサカマキガイをそれぞれ２週間飼育した。飼育時の生育密度は、スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイは、２～３頭／５Ｌ、他の巻貝は２０頭／０．５Ｌとした。飼育後の水を紙コップに採取し、５０ｍＬシリンジを用いて飼育水を吸引して、ステリベクスフィルターカートリッジ（孔径０．４５μｍ、メルク・ミリポア社、ＳＶＨＶ０１０ＲＳ）をシリンジの吸引口に装着して加圧濾過を行った。吸引と濾過を繰り返して、２００ｍＬ～１Ｌの飼育水の濾過を行った。 濾過後のフィルターカートリッジに空気を満たしたシリンジを再装着し、加圧してカートリッジ内の水分を押し出した。この操作をカートリッジ内の水分がなくなるまで数回繰り返した。マイクロピペットを用いてカートリッジ内に核酸保存液（ＲＮＡｌａｔｅｒ液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＡＭ７０２１））を注入し、内部を満たした。フィルターカートリッジの排出孔と注入孔にルアーフィッティング（アイシス社ＶＲＳＰ６およびＶＲＭＰ６）を装着して密封した。密封後のフィルターカートリッジは、冷凍条件下（－２０℃以下、又は－３０℃以下）で保管した。
【0057】
（２）飼育水由来のＤＮＡの回収
冷凍保存したＤＮＡを含むフィルターカートリッジを室温に戻し、ＲＮＡＬａｔｅｒ液を融解した。蓋を開けた５０ｍＬコニカルチューブの中に蓋を開けた５ｍＬチューブを開口部を上にしてセットし、ルアーフィッティングを外したフィルターカートリッジを、注入孔を下側に向けて、注入孔が５ｍＬチューブの開口部内に入るように設置した。５０ｍＬコニカルチューブを４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ液を５ｍＬチューブに回収した。
冷凍保存したＤＮＡを含むフィルターカートリッジを室温に戻し、ＲＮＡＬａｔｅｒ液を融解した。蓋を開けた５０ｍＬコニカルチューブの中に蓋を開けた５ｍＬチューブを開口部を上にしてセットし、ルアーフィッティングを外したフィルターカートリッジを、注入孔を下側に向けて、注入孔が５ｍＬチューブの開口部内に入るように設置した。５０ｍＬコニカルチューブを４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ液を５ｍＬチューブに回収した。
【0058】
プロテナーゼＫ（６００ｍＡＵ／ｍｌ、ＱＩＡＧＥＮ社１９１３３）、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＬ（ＱＩＡＧＥＮ １９０７５）及びＰＢＳ（－）を、１０：９１：９９の体積比で混合し、溶出溶液を調製した。フィルターカートリッジの排出孔にルアーフィッティングを装着した後、マイクロピペットを用いて、注入孔から溶出溶液を各２ｍＬ注入した。注入孔にルアーフィッティングを装着して密閉した後、５６℃の乾熱滅菌器内で３０分間加温した。
【0059】
蓋を開けた５０ｍＬコニカルチューブの中に蓋を開けた５ｍＬチューブを開口部を上にしてセットし、加温後のフィルターカートリッジのルアーフィッティングを外し、注入孔を下側に向けて、注入孔が５ｍＬチューブの開口部内に入るように設置した。５０ｍＬコニカルチューブを４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、カートリッジ内の液体を５ｍＬチューブに回収した。５ｍＬチューブ内の液体を、同じ５０ｍＬコニカルチューブに移し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を回収し、ＤＮＡ回収液とした。
【0060】
（３）組織由来のＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）の回収
スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイ、ヒメタニシ、チリメンカワニナ及びサカマキガイの組織から、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（キアゲン社、６９５０４）を用いて、ＤＮＡを抽出した。各淡水性巻貝の組織各２００ｍｇを採取し、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＴＬ １８０μＬとプロテナーゼＫ ２０μＬを混合した溶液に入れ、ホモジナイザーで破砕した。破砕後、５６℃で３０分間加温したものを回収し、さらにＢｕｆｆｅｒ ＡＬ ２００μＬを加えたものをＤＮＡ回収液とした。
スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイ、ヒメタニシ、チリメンカワニナ及びサカマキガイの組織から、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（キアゲン社、６９５０４）を用いて、ＤＮＡを抽出した。各淡水性巻貝の組織各２００ｍｇを採取し、Ｂｕｆｆｅｒ ＡＴＬ １８０μＬとプロテナーゼＫ ２０μＬを混合した溶液に入れ、ホモジナイザーで破砕した。破砕後、５６℃で３０分間加温したものを回収し、さらにＢｕｆｆｅｒ ＡＬ ２００μＬを加えたものをＤＮＡ回収液とした。
【0061】
（４）ＤＮＡの精製
（２）及び（３）で得た各ＤＮＡ回収液それぞれ約２ｍＬ及び約０．４ｍＬを５ｍＬチューブに入れ、それぞれ１ｍＬ及び０．２ｍＬのエタノールを加えてピペットで混和した。以後、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（キアゲン社、６９５０４）を用いてＤＮＡを抽出した。混和した溶液６５０μＬを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔのスピンカラムに入れ、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。混和溶液が残る場合は、排出された液を除き、再度同じスピンカラムに残りの溶液のうち６５０μＬを入れ、同様に遠心分離を行った。この操作を、チューブ内の溶液がなくなるまで繰り返した。
（２）及び（３）で得た各ＤＮＡ回収液それぞれ約２ｍＬ及び約０．４ｍＬを５ｍＬチューブに入れ、それぞれ１ｍＬ及び０．２ｍＬのエタノールを加えてピペットで混和した。以後、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（キアゲン社、６９５０４）を用いてＤＮＡを抽出した。混和した溶液６５０μＬを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔのスピンカラムに入れ、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。混和溶液が残る場合は、排出された液を除き、再度同じスピンカラムに残りの溶液のうち６５０μＬを入れ、同様に遠心分離を行った。この操作を、チューブ内の溶液がなくなるまで繰り返した。
【0062】
スピンカラムを新しい２ｍＬコレクションチューブにセットした後、スピンカラムに８００μＬのＢｕｆｆｅｒＡＷ１を入れ、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。さらに、スピンカラムに８００μＬのＢｕｆｆｅｒＡＷ２を入れ、１３０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。スピンカラムを新しい２ｍＬコレクションチューブにカラムに載せ替え、再度１３０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。新しい１．５ｍＬチューブを用意し、遠心分離後のスピンカラムを載せ、５６℃に温めておいた７５μＬのＢｕｆｆｅｒＡＥをカラムのメンブレン上に注いだ。室温で１分間静置した後、８０００ｒｐｍで１分間遠心して１．５ｍＬチューブ内にＤＮＡ溶液を溶出させた。
【0063】
（５）定量ＰＣＲ
各ＤＮＡ溶液の定量ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、４３９８０２１）を用いて行った。定量ＰＣＲ用の８連チューブに、表２に示す組成の増幅検出溶液を調製・分注した。
各ＤＮＡ溶液の定量ＰＣＲは、ＴａｑＭａｎ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２．０（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、４３９８０２１）を用いて行った。定量ＰＣＲ用の８連チューブに、表２に示す組成の増幅検出溶液を調製・分注した。
【0064】
【表2】
【0065】
使用したフォワードプライマー、リバースプライマー、プローブは、以下の塩基配列を有するものを使用した。プライマーはいずれも縮重プライマーを使用した。
フォワードプライマー： 5'- GTGCYGGAACKGGATGRACAGTATA -3' （配列番号１）
リバースプライマー： 5'- ACAGAMCCACCYGCATGAG -3' （配列番号２）
プローブ： 5'- FAM-CCTTTAGCTGGTAATTTA -NFQ-MGB-3' （配列番号３）
フォワードプライマー： 5'- GTGCYGGAACKGGATGRACAGTATA -3' （配列番号１）
リバースプライマー： 5'- ACAGAMCCACCYGCATGAG -3' （配列番号２）
プローブ： 5'- FAM-CCTTTAGCTGGTAATTTA -NFQ-MGB-3' （配列番号３）
【0066】
８連チューブの両端のウェルには、対照として、鋳型ＤＮＡを含まない増幅検出溶液、鋳型を蒸留水で希釈した溶液をそれぞれ分注した。
【0067】
増幅検出溶液を分注した８連チューブをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）にセットして、ＰＣＲ反応を。ＰＣＲ条件は、９５℃１０分、（９５℃５秒＋６０℃１分）×５０サイクルで行った。
【0068】
図３に、組織及び飼育水由来のＤＮＡ溶液の定量ＰＣＲの結果を示す。縦軸に蛍光強度、横軸にＰＣＲサイクル数を示す。図３Ａは組織由来のＤＮＡ溶液、図３Ｂに飼育水由来のＤＮＡ溶液の定量ＰＣＲの結果を示す。スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイの組織由来のＤＮＡ溶液からはＤＮＡの増幅が確認されたが、ヒメタニシ、チリメンカワニナ及びサカマキガイの組織由来のＤＮＡ溶液からは、ＤＮＡの増幅は確認されなかった。飼育水においても同様に、スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイの飼育水由来のＤＮＡ溶液からはＤＮＡの増幅が確認されたが、ヒメタニシ、チリメンカワニナ及びサカマキガイの飼育水由来のＤＮＡ溶液からは、ＤＮＡの増幅は確認されなかった。これにより、定量ＰＣＲが、スクミリンゴガイ、ラプラタリンゴガイを特異的に検出できることが示された。
【0069】
［実施例２］環境ＤＮＡからの定量ＰＣＲ
（１）環境ＤＮＡのサンプリング
スクミリンゴガイが多数生息していることが確認されている小美玉市の用水路（以下、環境Ａ）と、スクミリンゴガイが生息していないことが確認されているつくば市の池（以下。環境Ｂ）由来の環境ＤＮＡから、定量ＰＣＲによるスクミリンゴガイの検出を行った。環境Ａ及び環境Ｂの環境水を紙コップに採取した。環境Ａでは２ヶ所、環境Ｂでは４か所でサンプリングを行った。その場で５０ｍＬシリンジを用いて環境水を吸引して、ステリベクスフィルターカートリッジ（孔径０．４５μｍ、メルク・ミリポア社、ＳＶＨＶ０１０ＲＳ）をシリンジの吸引口に装着して加圧濾過を行った。吸引と濾過を繰り返して、２００ｍＬ～１Ｌの環境水の濾過を行った。濾過後のフィルターカートリッジに空気を満たしたシリンジを再装着し、加圧してカートリッジ内の水分を押し出した。この操作をカートリッジ内の水分がなくなるまで数回繰り返した。マイクロピペットを用いてカートリッジ内に核酸保存液（ＲＮＡｌａｔｅｒ液（アプライドバイオシステムズ社、ＡＭ７０２１））を注入し、内部を満たした。フィルターカートリッジの排出孔と注入孔にルアーフィッティング（アイシス社ＶＲＳＰ６およびＶＲＭＰ６）を装着して密封した。密封後のフィルターカートリッジは、チャック付きポリ袋に入れ、保冷剤を入れたクーラーボックス内で一時保管した。カートリッジは、できるだけ早期に冷凍条件下（－２０℃以下、又は－３０℃以下）に移して保存した。
（１）環境ＤＮＡのサンプリング
スクミリンゴガイが多数生息していることが確認されている小美玉市の用水路（以下、環境Ａ）と、スクミリンゴガイが生息していないことが確認されているつくば市の池（以下。環境Ｂ）由来の環境ＤＮＡから、定量ＰＣＲによるスクミリンゴガイの検出を行った。環境Ａ及び環境Ｂの環境水を紙コップに採取した。環境Ａでは２ヶ所、環境Ｂでは４か所でサンプリングを行った。その場で５０ｍＬシリンジを用いて環境水を吸引して、ステリベクスフィルターカートリッジ（孔径０．４５μｍ、メルク・ミリポア社、ＳＶＨＶ０１０ＲＳ）をシリンジの吸引口に装着して加圧濾過を行った。吸引と濾過を繰り返して、２００ｍＬ～１Ｌの環境水の濾過を行った。濾過後のフィルターカートリッジに空気を満たしたシリンジを再装着し、加圧してカートリッジ内の水分を押し出した。この操作をカートリッジ内の水分がなくなるまで数回繰り返した。マイクロピペットを用いてカートリッジ内に核酸保存液（ＲＮＡｌａｔｅｒ液（アプライドバイオシステムズ社、ＡＭ７０２１））を注入し、内部を満たした。フィルターカートリッジの排出孔と注入孔にルアーフィッティング（アイシス社ＶＲＳＰ６およびＶＲＭＰ６）を装着して密封した。密封後のフィルターカートリッジは、チャック付きポリ袋に入れ、保冷剤を入れたクーラーボックス内で一時保管した。カートリッジは、できるだけ早期に冷凍条件下（－２０℃以下、又は－３０℃以下）に移して保存した。
【0070】
（２）環境ＤＮＡの回収
冷凍保存した環境ＤＮＡを含むフィルターカートリッジを室温に戻し、ＲＮＡｌａｔｅｒ液を融解した。蓋を開けた５０ｍＬコニカルチューブの中に蓋を開けた５ｍＬチューブを開口部を上にしてセットし、ルアーフィッティングを外したフィルターカートリッジを、注入孔を下側に向けて、注入孔が５ｍＬチューブの開口部内に入るように設置した。５０ｍＬコニカルチューブを４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ液を５ｍＬチューブに回収した。
冷凍保存した環境ＤＮＡを含むフィルターカートリッジを室温に戻し、ＲＮＡｌａｔｅｒ液を融解した。蓋を開けた５０ｍＬコニカルチューブの中に蓋を開けた５ｍＬチューブを開口部を上にしてセットし、ルアーフィッティングを外したフィルターカートリッジを、注入孔を下側に向けて、注入孔が５ｍＬチューブの開口部内に入るように設置した。５０ｍＬコニカルチューブを４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＲＮＡｌａｔｅｒ液を５ｍＬチューブに回収した。
【0071】
プロテナーゼＫ（６００ｍＡＵ／ｍｌ、キアゲン社、１９１３３）、ＢｕｆｆｅｒＡＬ（キアゲン社、１９０７５）、及びＰＢＳ（－）を、１０：９１：９９の比で混合し、溶出溶液を調製した。フィルターカートリッジの排出孔にルアーフィッティングを装着した後、マイクロピペットを用いて、注入孔から溶出溶液を各２ｍＬ注入した。注入孔にルアーフィッティングを装着して密閉した後、５６℃の乾熱器内で３０分間加温した。
【0072】
蓋を開けた５０ｍＬコニカルチューブの中に蓋を開けた５ｍＬチューブを開口部を上にしてセットし、加温後のフィルターカートリッジのルアーフィッティングを外し、注入孔を下側に向けて、注入孔が５ｍＬチューブの開口部内に入るように設置した。５０ｍＬコニカルチューブの蓋を閉め、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、溶出溶液を５ｍＬチューブに回収した。５ｍＬチューブ内の溶出溶液を、同じ５０ｍＬコニカルチューブに移し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。
【0073】
（３）環境ＤＮＡの精製
上記上清からのＤＮＡの精製は、実施例１（４）と同様の手順で実施した。
上記上清からのＤＮＡの精製は、実施例１（４）と同様の手順で実施した。
【0074】
（４）定量ＰＣＲ
環境ＤＮＡ溶液の定量ＰＣＲは、実施例１（５）と同様の手順で実施した。
環境ＤＮＡ溶液の定量ＰＣＲは、実施例１（５）と同様の手順で実施した。
【0075】
図４に、環境Ａ及び環境Ｂの環境ＤＮＡの定量ＰＣＲの結果を示す。縦軸に蛍光強度、横軸にＰＣＲサイクル数を示す。表３に、環境Ａ及び環境Ｂの環境ＤＮＡの定量ＰＣＲのＣｔ値を示す。環境Ａでは、ＤＮＡの増幅が確認されたが、環境Ｂでは、ＤＮＡの増幅は確認されなかった。これにより、定量ＰＣＲにより環境中のスクミリンゴガイを特異的に検出できることが示された。
【0076】
【表3】
【0077】
［実施例３］各地環境ＤＮＡからの定量ＰＣＲ
スクミリンゴガイの生息が確認された国内各地の環境ＤＮＡから、定量ＰＣＲによるスクミリンゴガイの検出を行った。環境ＤＮＡは、静岡県磐田市（３ヶ所）、三重県四日市市（３ヶ所）、三重県松坂市（２ヶ所）、滋賀県野洲市（２ヶ所）、奈良県奈良市（２ヶ所）、長崎県佐世保市（２ヶ所）の水環境から採取した。環境ＤＮＡのサンプリング、回収、精製及び定量ＰＣＲの手順は、いずれも実施例２と同様の手順とした。
スクミリンゴガイの生息が確認された国内各地の環境ＤＮＡから、定量ＰＣＲによるスクミリンゴガイの検出を行った。環境ＤＮＡは、静岡県磐田市（３ヶ所）、三重県四日市市（３ヶ所）、三重県松坂市（２ヶ所）、滋賀県野洲市（２ヶ所）、奈良県奈良市（２ヶ所）、長崎県佐世保市（２ヶ所）の水環境から採取した。環境ＤＮＡのサンプリング、回収、精製及び定量ＰＣＲの手順は、いずれも実施例２と同様の手順とした。
【0078】
表４に、各地から採取された環境ＤＮＡの定量ＰＣＲのＣｔ値を示す。すべての試料でＤＮＡの増幅が確認された。この結果より、地域差なく、日本全国で環境ＤＮＡからスクミリンゴガイの検出が可能であることが示された。
【0079】
【表4】
【産業上の利用可能性】
【0080】
本発明の方法、試薬又はキットは、稲作農業等における食害被害対策として有用であり、農業等の産業分野で利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】