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特開2025-21327カンナビノイド類化合物の生産に用いられる放線菌及びそれを用いた生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025021327
(43)【公開日】2025-02-13
(54)【発明の名称】カンナビノイド類化合物の生産に用いられる放線菌及びそれを用いた生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20250205BHJP
C12P 7/22 20060101ALI20250205BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20250205BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20250205BHJP
C12N 9/00 20060101ALN20250205BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20250205BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P7/22
C12N15/52 Z
C12N15/54
C12N9/00
C12N9/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】14
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023125160
(22)【出願日】2023-07-31
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 公開の事実 （１）ウェブサイトの掲載日 別紙に記載 （２）ウェブサイトのアドレス 別紙に記載 （３）公開者 別紙に記載 （４）公開された発明の内容 別紙に記載の公開者が、別紙に記載のアドレスのウェブサイトにて、新家一男、末永光、工藤慧、渡来直生及び中村祐哉が発明したカンナビノイド類化合物の生産に用いられる放線菌及びそれを用いた生産方法について公開した。
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(71)【出願人】
【識別番号】522127324
【氏名又は名称】株式会社ｄｉｇｚｙｍｅ
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100219265
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 崇大
(74)【代理人】
【識別番号】100216839
【弁理士】
【氏名又は名称】大石 敏幸
(72)【発明者】
【氏名】新家 一男
(72)【発明者】
【氏名】末永 光
(72)【発明者】
【氏名】工藤 慧
(72)【発明者】
【氏名】渡来 直生
(72)【発明者】
【氏名】中村 祐哉
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AC16
4B064CA03
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA20
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA05
(57)【要約】
【課題】
より効率的にカンナビノイド類の生産するための放線菌及び当該放線菌を用いたカンナビノイド類の生産方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子及び環化酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌を用いる。
【選択図】図１
より効率的にカンナビノイド類の生産するための放線菌及び当該放線菌を用いたカンナビノイド類の生産方法を提供することを課題とする。
【解決手段】
ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子及び環化酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌を用いる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子及び環化酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌。
【請求項2】
前記ポリケチド合成酵素及び前記環化酵素は、前記カンナビノイド類化合物の前駆体であるオリベトール酸の合成を触媒することが可能な酵素である、請求項１に記載の放線菌。
【請求項3】
前記ポリケチド合成酵素は、（Ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ａ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってポリケチド合成酵素の活性を有するタンパク質、又は（Ａ３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってポリケチド合成酵素の活性を有するタンパク質のいずれかである、請求項１に記載の放線菌。
【請求項4】
前記環化酵素は、（Ｂ１）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｂ２）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって環化酵素の活性を有するタンパク質、又は（Ａ３）配列番号３に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であって環化酵素の活性を有するタンパク質のいずれかである、請求項１に記載の放線菌。
【請求項5】
カンナビノイド類化合物の前駆体であるオリベトール酸の合成において利用されるヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌。
【請求項6】
前記ヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素は、（Ｃ１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｃ２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（Ｃ３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかである、請求項５に記載の放線菌。
【請求項7】
ゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌。
【請求項8】
前記ゲラニル基転移酵素は、前記カンナビノイド類化合物の前駆体であるオリベトール酸に対するゲラニル基転移によるカンナビゲロール酸の合成を触媒することが可能な酵素である、請求項７に記載の放線菌。
【請求項9】
前記ゲラニル基転移酵素は、（Ｄ１）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｄ２）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（Ｄ３）配列番号５に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかである、請求項７に記載の放線菌。
【請求項10】
前記カンナビノイド類化合物は、カンナビジオール、カンナビジオール酸及びカンナビゲロール酸のうちの少なくともいずれか一つである、請求項１に記載の放線菌。
【請求項11】
請求項１に記載の放線菌を培養する段階を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法。
【請求項12】
請求項５に記載の放線菌を培養する段階を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法。
【請求項13】
請求項７に記載の放線菌を培養する段階を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法。
【請求項14】
放線菌に対して、ヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、
前記放線菌に対して、前記ヘキサノイル－ＣｏＡからオリベトール酸を合成するのに用いられるポリケチド合成酵素をコードする遺伝子及び環化酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、
前記放線菌に対して、前記オリベトール酸からカンナビゲロール酸を合成するのに用いられるゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、
前記ヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素をコードする遺伝子、前記ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子、前記環化酵素をコードする遺伝子及びゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子が導入された前記放線菌を培養する段階と、
を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法。
前記放線菌に対して、前記ヘキサノイル－ＣｏＡからオリベトール酸を合成するのに用いられるポリケチド合成酵素をコードする遺伝子及び環化酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、
前記放線菌に対して、前記オリベトール酸からカンナビゲロール酸を合成するのに用いられるゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、
前記ヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素をコードする遺伝子、前記ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子、前記環化酵素をコードする遺伝子及びゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子が導入された前記放線菌を培養する段階と、
を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、カンナビノイド類化合物の生産に用いられる放線菌及び当該放線菌を用いたカンナビノイド類化合物の生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
カンナビノイド類は、アサ（大麻草）に含まれる化学物質の一つとして知られる。このようなアサ由来のカンナビノイド類として、カンナビジオール、テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール、カンナビゲロール等が存在し、その中でもとりわけカンナビジオールは医療用途だけではなく飲食料用途や嗜好品、化粧品用途などの様々な用途で用いられるようになった。しかし、このようなカンナビノイド類の生産においては栽培された大麻草から抽出する方法が主流となるにとどまり、その生産には圃場の整備や抽出工程の煩雑さなどの問題があった。
【0003】
特許文献１には、大気圧下で無溶媒状態でのカンナビジオールの前駆体化合物に塩基溶液を添加し、水及び溶媒を除去することによって合成する合成カンナビジオールの製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０２１－１３０６５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
そこで、本開示は、より効率的にカンナビノイド類を生産するための放線菌及び当該放線菌を用いたカンナビノイド類の生産方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示者らは、上記課題を解決するために、カンナビノイド類化合物の前駆体の合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した放線菌を用いることによって、効率的にカンナビノイド類化合物の生産が可能であることを見出した。したがって、本開示の第１の局面は、
（１）ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子及び環化酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌である。
（１）ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子及び環化酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌である。
【0007】
本開示の好適な態様は、
（２）上記ポリケチド合成酵素及び上記環化酵素は、上記カンナビノイド類化合物の前駆体であるオリベトール酸の合成を触媒することが可能な酵素である、上記（１）に記載の放線菌である。
（２）上記ポリケチド合成酵素及び上記環化酵素は、上記カンナビノイド類化合物の前駆体であるオリベトール酸の合成を触媒することが可能な酵素である、上記（１）に記載の放線菌である。
【0008】
本開示の好適な態様は、
（３）上記ポリケチド合成酵素は、（Ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ａ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってポリケチド合成酵素の活性を有するタンパク質、又は（Ａ３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってポリケチド合成酵素の活性を有するタンパク質のいずれかである、上記（１）に記載の放線菌である。
（３）上記ポリケチド合成酵素は、（Ａ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ａ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であってポリケチド合成酵素の活性を有するタンパク質、又は（Ａ３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってポリケチド合成酵素の活性を有するタンパク質のいずれかである、上記（１）に記載の放線菌である。
【0009】
本開示の好適な態様は、
（４）上記環化酵素は、（Ｂ１）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｂ２）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって環化酵素の活性を有するタンパク質、又は（Ａ３）配列番号３に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であって環化酵素の活性を有するタンパク質のいずれかである、上記（１）に記載の放線菌である。
（４）上記環化酵素は、（Ｂ１）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｂ２）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって環化酵素の活性を有するタンパク質、又は（Ａ３）配列番号３に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であって環化酵素の活性を有するタンパク質のいずれかである、上記（１）に記載の放線菌である。
【0010】
本開示者らは、上記課題を解決するために、カンナビノイド類化合物の前駆体の合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した放線菌を用いることによって、効率的にカンナビノイド類化合物の生産が可能であることをさらに見出した。したがって、本開示の第２の局面は、
（５）カンナビノイド類化合物の前駆体であるオリベトール酸の合成において利用されるヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌である。
（５）カンナビノイド類化合物の前駆体であるオリベトール酸の合成において利用されるヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌である。
【0011】
本開示の好適な態様は、
（６）上記ヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素は、（Ｃ１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｃ２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（Ｃ３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかである、上記（５）に記載の放線菌である。
（６）上記ヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素は、（Ｃ１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｃ２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（Ｃ３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかである、上記（５）に記載の放線菌である。
【0012】
本開示の好適な態様は、
（７）ゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌である。
（７）ゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子が導入された、カンナビノイド類化合物を生産するための放線菌である。
【0013】
本開示者らは、上記課題を解決するために、カンナビノイド類化合物の前駆体に対するゲラニル基転移に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した放線菌を用いることによって、より効率的にカンナビノイド類化合物の生産が可能であることをさらに見出した。したがって、本開示の第３の局面は、
（８）上記ゲラニル基転移酵素は、上記カンナビノイド類化合物の前駆体であるオリベトール酸に対するゲラニル基転移によるカンナビゲロール酸の合成を触媒することが可能な酵素である、上記（７）に記載の放線菌である。
（８）上記ゲラニル基転移酵素は、上記カンナビノイド類化合物の前駆体であるオリベトール酸に対するゲラニル基転移によるカンナビゲロール酸の合成を触媒することが可能な酵素である、上記（７）に記載の放線菌である。
【0014】
本開示の好適な態様は、
（９）上記ゲラニル基転移酵素は、（Ｄ１）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｄ２）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（Ｄ３）配列番号５に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかである、上記（７）に記載の放線菌である。
（９）上記ゲラニル基転移酵素は、（Ｄ１）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、（Ｄ２）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（Ｄ３）配列番号５に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかである、上記（７）に記載の放線菌である。
【0015】
本開示の好適な態様は、
（１０）上記カンナビノイド類化合物は、カンナビジオール、カンナビジオール酸及びカンナビゲロール酸のうちの少なくともいずれか一つである、上記（１）に記載の放線菌である。
（１０）上記カンナビノイド類化合物は、カンナビジオール、カンナビジオール酸及びカンナビゲロール酸のうちの少なくともいずれか一つである、上記（１）に記載の放線菌である。
【0016】
本開示者らは、上記課題を解決するために、カンナビノイド類化合物の前駆体の合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した放線菌を用いることによって、効率的にカンナビノイド類化合物の生産が可能であることを見出した。したがって、本開示の第４の局面は、
（１１）上記（１）に記載の放線菌を培養する段階を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法である。
（１１）上記（１）に記載の放線菌を培養する段階を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法である。
【0017】
本開示者らは、上記課題を解決するために、カンナビノイド類化合物の前駆体の合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した放線菌を用いることによって、効率的にカンナビノイド類化合物の生産が可能であることをさらに見出した。したがって、本開示の第５の局面は、
（１２）上記（５）に記載の放線菌を培養する段階を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法である。
（１２）上記（５）に記載の放線菌を培養する段階を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法である。
【0018】
本開示者らは、上記課題を解決するために、カンナビノイド類化合物の前駆体の合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した放線菌を用いることによって、効率的にカンナビノイド類化合物の生産が可能であることをさらに見出した。したがって、本開示の第６の局面は、
（１３）上記（７）に記載の放線菌を培養する段階を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法である。
（１３）上記（７）に記載の放線菌を培養する段階を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法である。
【0019】
本開示者らは、上記課題を解決するために、カンナビノイド類化合物の前駆体の合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した放線菌を用いることによって、効率的にカンナビノイド類化合物の生産が可能であることをさらに見出した。したがって、本開示の第７の局面は、
（１４）放線菌に対して、ヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、上記放線菌に対して、上記ヘキサノイル－ＣｏＡからオリベトール酸を合成するのに用いられるポリケチド合成酵素をコードする遺伝子及び環化酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、上記放線菌に対して、上記オリベトール酸からカンナビゲロール酸を合成するのに用いられるゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、上記ヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素をコードする遺伝子、上記ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子、上記環化酵素をコードする遺伝子及びゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子が導入された上記放線菌を培養する段階と、を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法である。
（１４）放線菌に対して、ヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、上記放線菌に対して、上記ヘキサノイル－ＣｏＡからオリベトール酸を合成するのに用いられるポリケチド合成酵素をコードする遺伝子及び環化酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、上記放線菌に対して、上記オリベトール酸からカンナビゲロール酸を合成するのに用いられるゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子を導入する段階と、上記ヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有する酵素をコードする遺伝子、上記ポリケチド合成酵素をコードする遺伝子、上記環化酵素をコードする遺伝子及びゲラニル基転移酵素をコードする遺伝子が導入された上記放線菌を培養する段階と、を含む、カンナビノイド類化合物の生産方法である。
【発明の効果】
【0020】
本開示は、より効率的にカンナビノイド類の生産するための放線菌及び当該放線菌を用いたカンナビノイド類の生産方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【発明を実施するための形態】
【0022】
以下で本開示のカンナビノイド類化合物の生産に用いられる放線菌及び当該放線菌を用いたカンナビノイド類化合物の生産方法を実施するための形態を詳細に説明する。ただし、以下の実施形態は、本開示を説明するための一例であり、本開示が当該実施形態のみに限定されるものではない。なお、本開示において「複数」という言葉が用いられているが、当該用語は特定の個数（例えば２個）のみに限定的に解釈されるわけではなく、例えば３個、４個などの任意の個数を含みうる。
【0023】
１．カンナビノイドの生合成経路
カンナビノイド類化合物は、アサ（大麻草）に含まれる化学物質の一つであるところ、本開示におけるカンナビノイド類化合物は、大麻草由来の抽出物に限らない。このようなカンナビノイド類化合物には、カンナビジオール（Ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ：ＣＢＤ）、テトラヒドロカンナビノール（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ：ＴＨＣ）、カンナビノール（Ｃａｎｎａｂｉｎｏｌ：ＣＢＮ）、カンナビゲロール（Ｃａｎｎａｂｉｇｅｒｏｌ：ＣＢＧ）などのカンナビノイドに加えて、これらカンナビノイドの合成において生産されるその前駆体を含む。このような前駆体としては、一例としては、カンナビジオール酸（Ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌｉｃ ａｃｉｄ：ＣＢＤＡ）及びカンナビゲロール酸（Ｃａｎｎａｂｉｇｅｒｏｌｉｃ ａｃｉｄ：ＣＢＧＡ）、オリベトール酸（Ｏｌｉｖｅｔｏｌｉｃ Ａｃｉｄ：ＯＡ）が挙げられる。本開示では、カンナビノイド類化合物としては、その有用性の観点からカンナビジオール及びその前駆体（カンナビジオール酸若しくはカンナビゲロール酸）が特に好ましい例として挙げられる。
カンナビノイド類化合物は、アサ（大麻草）に含まれる化学物質の一つであるところ、本開示におけるカンナビノイド類化合物は、大麻草由来の抽出物に限らない。このようなカンナビノイド類化合物には、カンナビジオール（Ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ：ＣＢＤ）、テトラヒドロカンナビノール（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃａｎｎａｂｉｎｏｌ：ＴＨＣ）、カンナビノール（Ｃａｎｎａｂｉｎｏｌ：ＣＢＮ）、カンナビゲロール（Ｃａｎｎａｂｉｇｅｒｏｌ：ＣＢＧ）などのカンナビノイドに加えて、これらカンナビノイドの合成において生産されるその前駆体を含む。このような前駆体としては、一例としては、カンナビジオール酸（Ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌｉｃ ａｃｉｄ：ＣＢＤＡ）及びカンナビゲロール酸（Ｃａｎｎａｂｉｇｅｒｏｌｉｃ ａｃｉｄ：ＣＢＧＡ）、オリベトール酸（Ｏｌｉｖｅｔｏｌｉｃ Ａｃｉｄ：ＯＡ）が挙げられる。本開示では、カンナビノイド類化合物としては、その有用性の観点からカンナビジオール及びその前駆体（カンナビジオール酸若しくはカンナビゲロール酸）が特に好ましい例として挙げられる。
【0024】
図１は、カンナビジオールが生合成されるまでの例示的な経路を示す。図１に示された経路には、カンナビジオールの前駆体であるオリベトール酸からカンナビジオールを生合成するためのカンナビノイド生合成経路に加えて、オリベトール酸の生成に用いられるマロニル－ＣｏＡ生合成経路も含む。マロニル－ＣｏＡは、生体内において、アセチル－ＣｏＡのカルボキシル化をアセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）が触媒することによって生成される。他方、ヘキサノイル－ＣｏＡは、脂肪酸生成経路においてアセチル－ＣｏＡから生合成されるヘキサノイルＡＣＰ由来のヘキサン酸に対してリガーゼ（合成酵素）による触媒反応により生成される。なお、ヘキサン酸については、ここでは説明の便宜のために脂肪酸合成によって生成される例を挙げて説明したが、当然に脂肪酸分解によって生成されるものであってもよい。
【0025】
ここで、このような合成酵素としては、アサ（大麻草）や細菌及び真核生物等の生体において内因性の酵素であるか、宿主に導入可能な酵素であればいずれでも好適に利用することが可能である。このような合成酵素としては、大麻草における生合成経路において利用される合成酵素であるＣｓＡＡＥ１及びＣｓＡＡＥ３や、酵母における生合成経路において導入されうる合成酵素であるＳｃＦＡＡ１、ＳｃＦＡＡ２、ＳｃＦＡＡ３、ＳｃＦＡＡ４、ＳｃＦＡＴ１及びＳｃＦＡＴ２や、放線菌におけるカンナビノイド生合成経路において導入されうる合成酵素であるＫＳＥ＿６５５２０（配列番号１）が例として挙げられる。この中でも、合成酵素としては、カンナビジオールの生合成に用いられるオリベトール酸の高生産化という観点から、ＫＳＥ＿６５５２０を好適に利用することができる。
【0026】
［配列番号１］
MTDRVPGTAPHALPNALPDGPFDATPDTAPDTTPAAASDGTPATTSATTSATTPAATPAAASDGRPGALPSLPDVLARRAVEQPDELAYAFLHNGEEVAETLTYRQLDARARAVAARLTALRLAGRSVLLLHPSGLGFVSDLLGCMYAGVAAAPVQVPSRARGLARLRAIADDAGTTVVLTTPEVRRDLLERFGALPELAGLTLHDPETLAAEAELTDPAAVAGWRPRPIGSEELALLQYTSGSTGTPKGVRVTHANFGANVDETDRLWPCRGDARVVNWLPLFHDMGMLFGVVLPLWAGIPSYLMAPDAFIRRPARWLEAVSRFGGTHAAAPSFAYELCVRAVGEEGLPSGLDLSSWRVAANGAEPVRWQTVRAFTEALAPAGFRPEAMCPGYGLAENTLKATGSPEDRVPTVLWLSAEELRAGRAVRVPRSDAPGVLPAVGCGAVVGDSLVRIVDPVERTTRPEGRVGEIWVSGPCVASGYHGRPEESEETFRARRSDRTEQRSWLRTGDLGFLADGELFVTGRIKDVVIRQGRNFYPQDIELSAESADPGLHPNCAAAFSADDGTSERLVLVVEADGRTLRGGGELLRERIRRAVHENQRLEADEILLVRRGSLPKTSSGKVQRRETLRRYLDGEFGSAQAVAPRERVEAGR
MTDRVPGTAPHALPNALPDGPFDATPDTAPDTTPAAASDGTPATTSATTSATTPAATPAAASDGRPGALPSLPDVLARRAVEQPDELAYAFLHNGEEVAETLTYRQLDARARAVAARLTALRLAGRSVLLLHPSGLGFVSDLLGCMYAGVAAAPVQVPSRARGLARLRAIADDAGTTVVLTTPEVRRDLLERFGALPELAGLTLHDPETLAAEAELTDPAAVAGWRPRPIGSEELALLQYTSGSTGTPKGVRVTHANFGANVDETDRLWPCRGDARVVNWLPLFHDMGMLFGVVLPLWAGIPSYLMAPDAFIRRPARWLEAVSRFGGTHAAAPSFAYELCVRAVGEEGLPSGLDLSSWRVAANGAEPVRWQTVRAFTEALAPAGFRPEAMCPGYGLAENTLKATGSPEDRVPTVLWLSAEELRAGRAVRVPRSDAPGVLPAVGCGAVVGDSLVRIVDPVERTTRPEGRVGEIWVSGPCVASGYHGRPEESEETFRARRSDRTEQRSWLRTGDLGFLADGELFVTGRIKDVVIRQGRNFYPQDIELSAESADPGLHPNCAAAFSADDGTSERLVLVVEADGRTLRGGGELLRERIRRAVHENQRLEADEILLVRRGSLPKTSSGKVQRRETLRRYLDGEFGSAQAVAPRERVEAGR
【0027】
より具体的には、本開示においては、カンナビノイド類化合物の生産において放線菌を利用する。そのため、放線菌において、ヘキサノイル－ＣｏＡなどの中鎖脂肪酸－ＣｏＡを生合成の中間体とする化合物の生成に関与する遺伝子を利用することによって、放線菌においてもオリベトール酸生成において開始基質であるヘキサノイル－ＣｏＡをより効率的に生産することが期待できる。そこで、多数の放線菌株の中から、ヘキサノイル－ＣｏＡの生成に用いられるヘキサン酸に由来する部分構造を持つ二次代謝産物を探索し、当該二次代謝産物の産生に関与する酵素を特定することで、本開示において好適に利用可能な合成酵素をスクリーニングすることができる。
【0028】
当該スクリーニングにより得られた上記合成酵素には、少なくとも、下記（１）～（３）のタンパク質が含まれる。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有するタンパク質
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有するタンパク質
上記（３）におけるアミノ酸配列の同一性については、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有するタンパク質
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってヘキサノイル－ＣｏＡの合成活性を有するタンパク質
上記（３）におけるアミノ酸配列の同一性については、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【0029】
次に、マロニル－ＣｏＡ生合成経路によって合成されたヘキサノイル－ＣｏＡを開始基質とし、マロニル－ＣｏＡを伸長基質としてポリケチド合成酵素の触媒により、図１に記載のテトラケト中間体が生成される。さらに、このように生成されたテトラケト中間体に対して、環化酵素が脱水を伴う芳香環化を触媒することによって、オリベトール酸が生成される。
【0030】
ここで、ポリケチド合成酵素は、具体的には、ヘキサノイル－ＣｏＡに対してマロニル－ＣｏＡの３回の縮合反応を触媒することよって、３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡを生成させる。このようなポリケチド合成酵素は、上記のとおりヘキサノイル－ＣｏＡの縮合反応を触媒できるものであればいずれでもよく、オリベトール酸の高生産化という観点から、ＣｓＴＫＳ（配列番号２）が例として挙げられる。
【0031】
［配列番号２］
MNHLRAEGPASVLAIGTANPENILLQDEFPDYYFRVTKSEHMTQLKEKFRKICDKSMIRKRNCFLNEEHLKQNPRLVEHEMQTLDARQDMLVVEVPKLGKDACAKAIKEWGQPKSKITHLIFTSASTTDMPGADYHCAKLLGLSPSVKRVMMYQLGCYGGGTVLRIAKDIAENNKGARVLAVCCDIMACLFRGPSESDLELLVGQAIFGDGAAAVIVGAEPDESVGERPIFELVSTGQTILPNSEGTIGGHIREAGLIFDLHKDVPMLISNNIEKCLIEAFTPIGISDWNSIFWITHPGGKAILDKVEEKLHLKSDKFVDSRHVLSEHGNMSSSTVLFVMDELRKRSLEEGKSTTGDGFEWGVLFGFGPGLTVERVVVRSVPIKY
MNHLRAEGPASVLAIGTANPENILLQDEFPDYYFRVTKSEHMTQLKEKFRKICDKSMIRKRNCFLNEEHLKQNPRLVEHEMQTLDARQDMLVVEVPKLGKDACAKAIKEWGQPKSKITHLIFTSASTTDMPGADYHCAKLLGLSPSVKRVMMYQLGCYGGGTVLRIAKDIAENNKGARVLAVCCDIMACLFRGPSESDLELLVGQAIFGDGAAAVIVGAEPDESVGERPIFELVSTGQTILPNSEGTIGGHIREAGLIFDLHKDVPMLISNNIEKCLIEAFTPIGISDWNSIFWITHPGGKAILDKVEEKLHLKSDKFVDSRHVLSEHGNMSSSTVLFVMDELRKRSLEEGKSTTGDGFEWGVLFGFGPGLTVERVVVRSVPIKY
【0032】
上記ポリケチド合成酵素には、少なくとも、下記（１）～（３）のタンパク質が含まれる。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってポリケチド合成酵素の活性を有するタンパク質
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってポリケチド合成酵素の活性を有するタンパク質
上記（３）におけるアミノ酸配列の同一性については、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってポリケチド合成酵素の活性を有するタンパク質
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってポリケチド合成酵素の活性を有するタンパク質
上記（３）におけるアミノ酸配列の同一性については、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【0033】
また、環化酵素は、具体的には、縮合反応により得られた３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡに対して脱水を伴う芳香環化を触媒することによってオリベトール酸を生成させる。このような環化酵素には、上記のとおり３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡの環化を触媒できるものであればいずれでもよく、オリベトール酸の高生産化という観点から、ＣｓＯＡＣ（配列番号３）が例として挙げられる。
【0034】
［配列番号３］
MAVKHLIVLKFKDEITEAQKEEFFKTYVNLVNIIPAMKDVYWGKDVTQKNKEEGYTHIVEVTFESVETIQDYIIHPAHVGFGDVYRSFWEKLLIFDYTPRK
MAVKHLIVLKFKDEITEAQKEEFFKTYVNLVNIIPAMKDVYWGKDVTQKNKEEGYTHIVEVTFESVETIQDYIIHPAHVGFGDVYRSFWEKLLIFDYTPRK
【0035】
上記環化酵素には、少なくとも、下記（１）～（３）のタンパク質が含まれる。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって環化酵素の活性を有するタンパク質
（３）配列番号３に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であって環化酵素の活性を有するタンパク質
上記（３）におけるアミノ酸配列の同一性については、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であって環化酵素の活性を有するタンパク質
（３）配列番号３に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であって環化酵素の活性を有するタンパク質
上記（３）におけるアミノ酸配列の同一性については、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【0036】
次に、生成されたオリベトール酸に対して、ゲラニル基転移酵素がＣ３位のゲラニル化を触媒することによってカンナビゲロール酸が生成される。
【0037】
このようなゲラニル基転移酵素としては、アサ（大麻草）や細菌及び真核生物等の生体において内因性の酵素であるか、宿主に導入可能な酵素であればいずれでも好適に利用することが可能である。このようなゲラニル基転移酵素としては、大麻草における生合成経路において利用されるゲラニル基転移酵素であるＣｓＰＴ４や、放線菌における生合成経路において導入可能なＮｐｈＢ（文献１：Ｋｕｚｕｙａｍａ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４３５，９８３－９８７（２００５）に記載）又はその改良酵素（文献２：Ｖａｌｌｉｅｒｅ，Ｍ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ｐｌａｔｆｗｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈe ｐｒｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｋａｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０，５６５（２０１９）に記載のＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号４）又は文献３：Ｌｉｍ，Ｋ．Ｊ．Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＮｐｈＢ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ ａｎｄ Ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．１２（８），４６２８－４６３９ （２０２２）に記載の変異体）が例として挙げられる。この中でも、ゲラニル基転移酵素としては、カンナビゲロール酸の高生産化という観点から、文献２に記載されたＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号４）が例として挙げられる。
【0038】
［配列番号４］
MSEAADVERVYAAMEEAAGLLGVACARDKIYPLLSTFQDTLVEGGSVVVFSMASGRHSTELDFSISVPTSHGDPYATVVEKGLFPATGHPVDDLLADTQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKTYAFFPTDNMPGVAELSAIPSMPPAVAENAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELSAQTLEAESVLALVRELGLHVPNELGLKFCKRSFSVYPTLNWETGKIDRLCFSVISNDPTLVPSSDEGDIEKFHNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSPKEEYYKLGAAYHITDVQRGLLKAFDSLED
MSEAADVERVYAAMEEAAGLLGVACARDKIYPLLSTFQDTLVEGGSVVVFSMASGRHSTELDFSISVPTSHGDPYATVVEKGLFPATGHPVDDLLADTQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKTYAFFPTDNMPGVAELSAIPSMPPAVAENAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELSAQTLEAESVLALVRELGLHVPNELGLKFCKRSFSVYPTLNWETGKIDRLCFSVISNDPTLVPSSDEGDIEKFHNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSPKEEYYKLGAAYHITDVQRGLLKAFDSLED
【0039】
なお、配列番号４で示されるＮｐｈＢの２アミノ酸置換体は、ＮｐｈＢに対して２３２番目のアラニンがセリンに、２８８番目のチロシンがアラニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有する。また、ＮｐｈＢはＮａｐｈｔｅｒｐｉｎの生合成に関与する酵素であるところ、当該化合物の類縁化合物を生産することができる放線菌であればＮｐｈＢと同様にゲラニル基転移活性を示す内因性の酵素を有する可能性が高い。そこで、類縁化合物を生産可能な放線菌を対象としてゲノム解析を行うことによってＮｐｈＢホモログを探索し、ＮｐｈＢと同等かそれ以上の活性を示す酵素を特定することが可能である。Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢは、これによって特定された酵素である。さらに、Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢに対して２３０番目のアラニンがセリンに、２８６番目のチロシンがアラニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有する酵素（配列番号５）がより好ましい。
【0040】
［配列番号５］
MSGAADVERVYAAMEEAAGLLGVTCAREKIYPLLTEFQDTLTDGVVVFSMASGRRSTELDFSISVPTSQGDPYATVVDKGLFPATGHPVDDLLADTQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKTYAFFPTDDMPGVAQLSAIPSMPASVAQNAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELSQQTLAPESVLALVRELGLHVPTELGLEFCKRSFSVYPTLNWDTGKIDRLCFSVISTDPTLVPSEDERDIEQFRDYGTKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSPTEEYYKLGAAYHITDIQRRLLKAFDALED
MSGAADVERVYAAMEEAAGLLGVTCAREKIYPLLTEFQDTLTDGVVVFSMASGRRSTELDFSISVPTSQGDPYATVVDKGLFPATGHPVDDLLADTQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKTYAFFPTDDMPGVAQLSAIPSMPASVAQNAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELSQQTLAPESVLALVRELGLHVPTELGLEFCKRSFSVYPTLNWDTGKIDRLCFSVISTDPTLVPSEDERDIEQFRDYGTKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSPTEEYYKLGAAYHITDIQRRLLKAFDALED
【0041】
上記ゲラニル基転移酵素には、少なくとも、下記（１）～（６）のタンパク質をコードする核酸が含まれる。
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってゲラニル基転移酵素の活性を有するタンパク質
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってゲラニル基転移酵素の活性を有するタンパク質
（４）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（５）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってゲラニル基転移酵素の活性を有するタンパク質
（６）配列番号５に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってゲラニル基転移酵素の活性を有するタンパク質
上記（３）及び（６）におけるアミノ酸配列の同一性については、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってゲラニル基転移酵素の活性を有するタンパク質
（３）配列番号４に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってゲラニル基転移酵素の活性を有するタンパク質
（４）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質
（５）配列番号５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってゲラニル基転移酵素の活性を有するタンパク質
（６）配列番号５に記載のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を示すアミノ酸配列であってゲラニル基転移酵素の活性を有するタンパク質
上記（３）及び（６）におけるアミノ酸配列の同一性については、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【0042】
次に、生成されたカンナビゲロール酸はカンナビジオール酸合成酵素の基質として働き、当該合成酵素の触媒により、カンナビジオール酸を生成する。そして、カンナビジオールの前駆体であるカンナビジオール酸は光や熱による脱炭酸を経てカンナビジオールが生成される。
【0043】
なお、本開示においては、上記のとおりカンナビノイド類化合物の生産に用いられる放線菌又は当該放線菌を用いた生産方法に係るところ、カンナビノイド類化合物は上記カンナビジオールに限定されるわけではない。カンナビノイド類化合物には、カンナビジオールの生成における前駆体となるカンナビジオール酸やカンナビゲロール酸なども含む。また、特に図１において記載はしていないものの、カンナビジオールの生合成経路において、カンナビジオール以外にも、テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール及びカンナビゲロールなども生成される。したがって、カンナビノイド類化合物には、テトラヒドロカンナビノール、カンナビノール及びカンナビゲロールも含む。
【0044】
２．カンナビノイド類化合物の生産方法
例えば、カンナビジオールは図１に記載のとおり生合成されるが、このカンナビジオールなどのカンナビノイド類化合物の生産には、各酵素をコードする遺伝子が導入され、各酵素活性が発現可能になった放線菌が用いられる。そして、当該放線菌を所定の培地で培養し、その培養物から目的化合物を抽出することにより生産される。したがって、本開示におけるカンナビノイド類化合物の生産方法は、一例としては、（Ａ）宿主となる放線菌を選択する段階と、（Ｂ）各酵素をコードする遺伝子が導入された発現ベクターを構成する段階と、（Ｃ）発現ベクターを宿主である放線菌に導入する段階と、（Ｄ）発現ベクターが導入された放線菌を所定の培地において培養する段階とを含む。なお、上記の各段階は、本開示におけるカンナビノイド類化合物の生産方法において必ずしもすべてを備える必要はない。以下、各段階について詳細に説明する。
例えば、カンナビジオールは図１に記載のとおり生合成されるが、このカンナビジオールなどのカンナビノイド類化合物の生産には、各酵素をコードする遺伝子が導入され、各酵素活性が発現可能になった放線菌が用いられる。そして、当該放線菌を所定の培地で培養し、その培養物から目的化合物を抽出することにより生産される。したがって、本開示におけるカンナビノイド類化合物の生産方法は、一例としては、（Ａ）宿主となる放線菌を選択する段階と、（Ｂ）各酵素をコードする遺伝子が導入された発現ベクターを構成する段階と、（Ｃ）発現ベクターを宿主である放線菌に導入する段階と、（Ｄ）発現ベクターが導入された放線菌を所定の培地において培養する段階とを含む。なお、上記の各段階は、本開示におけるカンナビノイド類化合物の生産方法において必ずしもすべてを備える必要はない。以下、各段階について詳細に説明する。
【0045】
（Ａ）宿主となる放線菌の選択段階
植物由来の化合物の微生物生産において、必要となる酵素をコードする遺伝子を導入する宿主として酵母（文献４：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）を用いた例が知られている（Ｌｕｏ，Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ， Ｎａｔｕｒｅ， ５６７，１２３～１２６，（２０１９））しかし、酵母は、酵素などのタンパク質の生産には適しているものの、カンナビノイド類化合物のように二次代謝産物である化合物の生産においてヘキサノイル－ＣｏＡやゲラニル二リン酸の供給能力の問題から必ずしも適切な微生物とは言えない。他方で、本開示においては、カンナビノイド類化合物のような二次代謝産物の生産において放線菌を宿主として用いる。放線菌は、様々な二次代謝産物を生産することから明らかなように、酵母等の宿主に比して基質の供給能力が高いため、より効率的にカンナビノイド類化合物を異種発現生産すると期待できる。
植物由来の化合物の微生物生産において、必要となる酵素をコードする遺伝子を導入する宿主として酵母（文献４：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）を用いた例が知られている（Ｌｕｏ，Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ， Ｎａｔｕｒｅ， ５６７，１２３～１２６，（２０１９））しかし、酵母は、酵素などのタンパク質の生産には適しているものの、カンナビノイド類化合物のように二次代謝産物である化合物の生産においてヘキサノイル－ＣｏＡやゲラニル二リン酸の供給能力の問題から必ずしも適切な微生物とは言えない。他方で、本開示においては、カンナビノイド類化合物のような二次代謝産物の生産において放線菌を宿主として用いる。放線菌は、様々な二次代謝産物を生産することから明らかなように、酵母等の宿主に比して基質の供給能力が高いため、より効率的にカンナビノイド類化合物を異種発現生産すると期待できる。
【0046】
宿主として用いることが可能な放線菌としては、一例としては、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、マイクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フランキア属（Ｆｒａｎｋｉａ）及びビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のいずれかに属する放線菌が用いられる。これらの放線菌の中でも、生産効率の観点から、好ましくはストレプトマイセス属に属する放線菌、より好ましくはストレプトマイセス・ツイラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｕｉｒｕｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・アレナー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｒｅｎａｅ）、ストレプトマイセス・フラギリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・バイオラセオルーバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）、ストレプトマイセス・コリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｌｉｎｕｓ）、ストレプトマイセス・フラベオラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｅｏｌｕｓ）、ストレプトマイセス・ミシオネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｉｓｉｏｎｅｎｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ヘイミ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｅｉｍｉ）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・アルブラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ）及びストレプトマイセス・グリセオフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）のいずれかに属する放線菌、さらに好ましくは、ストレプトマイセス・アベルミチリスに属する放線菌、特に好ましくはストレプトマイセス・アベルミチリスＳＵＫＡ株（Ｋｏｍａｔｓｕ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｍｉｎｉｍｉｚｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｏｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０７，２６４６－２６５１（２０１０）、Ｋｏｍａｔｓｕ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ｈｏｓｔ ｆｏｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｏｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ． ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ. Ｂｉｏｌ. ２，３８４－３９６（２０１３））のうちのいずれかの放線菌が用いられる。なお、ストレプトマイセス・アベルミチリスＳＵＫＡ株には、ＳＵＫＡ１７株、ＳＵＫＡ２２株、ＳＵＫＡ２４株、ＳＵＫＡ２５株、ＳＵＫＡ３４株及びＳＵＫＡ５４株等が存在するが、これらのうちいずれを用いてもよい。例えば、ＳＵＫＡ１７株は理研バイオリソースセンターにおいて、寄託番号「ＪＣＭ１８２５１」として登録されている。また、上記に例示する放線菌は、１種のみで用いられてもよいし、２種以上を組み合わせて用いられてもよい。
【0047】
（Ｂ）各酵素をコードする遺伝子が導入された発現ベクターを構成する段階
次に、上記放線菌の中から選択された１種又は２種以上の組み合わせからなる放線菌を宿主として、大麻草において生合成されるカンナビノイド類化合物を異種生産させるために、外因性の各酵素をコードする遺伝子を導入する。
次に、上記放線菌の中から選択された１種又は２種以上の組み合わせからなる放線菌を宿主として、大麻草において生合成されるカンナビノイド類化合物を異種生産させるために、外因性の各酵素をコードする遺伝子を導入する。
【0048】
宿主である放線菌に対して各酵素をコードする遺伝子等の核酸を導入する方法は、用いる宿主に応じて適宜選択することが可能であるが、一例としては宿主に導入可能で且つ組み込まれた核酸を発現可能なベクターが用いられる。本開示においては、ヘキサノイル－ＣｏＡの合成酵素、ポリケチド合成酵素、環化酵素及びゲラニル基転移酵素の各酵素をコードする遺伝子を導入する必要があるが、これらの遺伝子は１つのベクターに組み込まれてもよいし、２以上の異なるベクターに組み込まれてもよい。また、１つのベクターに複数の遺伝子が組み込まれる場合には、各遺伝子を共通のプロモータによって発現させてもよいし、それぞれ別々のプロモータによって発現させてもよい。また、本開示において利用可能なベクターは、すでに公知のベクターのみならず、プロモータ等の転写制御や複製領域等に関わる領域を目的に応じて改変したものを用いることも可能である。さらに、ベクターを用いる導入方法は、その遺伝子導入の一例であって、突然変異やゲノムシャッフリングなどの他の方法を用いてもよい。
【0049】
本開示においては、上記のとおり放線菌を宿主として発現ベクターが組み込まれる。このような放線菌宿主に好適な発現ベクターとしては、上記に記載する発現ベクターのうち、例えば、ｐＩＪ１０１及びｐＳＧ５等の環状プラスミド、ＳＡＰ１及びＳＣＰ１等の線状プラスミド、ＳＬＰ１、ｐＫＵ５９０、ｐＫＵ５９１、ｐＫＵ５９２、ｐＫＵ５９３、ｐＫＵ５９４及びｐＫＵ５９５等のゲノム組み込み型プラスミド、並びにこれらの誘導体が用いられる。なお、以下においては、特定の発現ベクターについて記載しているが、これらはあくまで例示であって、当該発現ベクターのみに限定されるわけではない。
【0050】
［ヘキサノイル－ＣｏＡ合成酵素（例えばＫＳＥ＿６５５２０）の発現ベクターの構築］
図１に示すとおり、カンナビノイド類化合物の合成において、オリベトール酸生成の開始基質となるヘキサノイル－ＣｏＡを効率的に生成することが極めて重要である。そこで、上記に例示するような多数の放線菌の中から、ヘキサノイル－ＣｏＡの生成に用いられるヘキサン酸に由来する部分構造を持つ二次代謝産物を探索し、当該二次代謝産物の産生に関与する酵素を特定することで、本開示において好適に利用可能な合成酵素をスクリーニングする。本開示では、図１において説明したとおり、種々の合成酵素の中でもＫＳＥ＿６５５２０（配列番号１）が特に好適に用いられる。
図１に示すとおり、カンナビノイド類化合物の合成において、オリベトール酸生成の開始基質となるヘキサノイル－ＣｏＡを効率的に生成することが極めて重要である。そこで、上記に例示するような多数の放線菌の中から、ヘキサノイル－ＣｏＡの生成に用いられるヘキサン酸に由来する部分構造を持つ二次代謝産物を探索し、当該二次代謝産物の産生に関与する酵素を特定することで、本開示において好適に利用可能な合成酵素をスクリーニングする。本開示では、図１において説明したとおり、種々の合成酵素の中でもＫＳＥ＿６５５２０（配列番号１）が特に好適に用いられる。
【0051】
当該合成酵素の発現ベクターは、まず、当該酵素がスクリーニングされた放線菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、当該合成酵素をコードする遺伝子をＰＣＲによる増幅することにより生成される。得られた断片はｐＫＵ５６５ベクターの制限酵素サイトＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入されることで、ＫＳＥ＿６５５２０のＤＮＡ断片が挿入されたｐＫＵ５６５ベクターが生成される。そして当該ｐＫＵ５６５ベクターをさらにＮｈｅＩ及びＮｓｉＩで消化することで得られた断片がｐＫＵ５９４ベクターの制限酵素サイトＮｈｅＩ／ＮｓｉＩに挿入されることで、ＫＳＥ＿６５５２０のＤＮＡ断片が挿入されたｐＫＵ５９４ベクターが生成される。
【0052】
［ポリケチド合成酵素及び環化酵素の発現ベクターの構築］
図１に示すとおり、カンナビノイド類化合物の合成において、オリベトール酸生成の中間体である３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡを効率的に生成することが極めて重要である。本開示では、この３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡの生成において縮合反応を触媒するポリケチド合成酵素として、ＣｓＴＫＳ（配列番号２）が特に好適に用いられる。また、図１に示すとおり、カンナビノイド類化合物の合成において、オリベトール酸の高生産化は、最終的な目的化合物のカンナビノイド類化合物の生成において極めて重要である。本開示では、３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡの芳香環化を触媒する環化酵素として、ＣｓＯＡＣ（配列番号３）が特に好適に用いられる。
図１に示すとおり、カンナビノイド類化合物の合成において、オリベトール酸生成の中間体である３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡを効率的に生成することが極めて重要である。本開示では、この３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡの生成において縮合反応を触媒するポリケチド合成酵素として、ＣｓＴＫＳ（配列番号２）が特に好適に用いられる。また、図１に示すとおり、カンナビノイド類化合物の合成において、オリベトール酸の高生産化は、最終的な目的化合物のカンナビノイド類化合物の生成において極めて重要である。本開示では、３，５，７－トリオキソドデカノイル－ＣｏＡの芳香環化を触媒する環化酵素として、ＣｓＯＡＣ（配列番号３）が特に好適に用いられる。
【0053】
これらのポリケチド合成酵素及び環化酵素の発現ベクターの構築は、一例としては、両酵素がリンカー配列を介して連結したアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成し、発現ベクターに挿入するためのＤＮＡ断片を生成することにより開始される。生成された断片はｐＫＵ５６５ベクターの制限酵素サイトＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入されることで、上記ＤＮＡ断片が挿入されたｐＫＵ５６５ベクターが生成される。そして当該ｐＫＵ５６５ベクターをさらにＮｈｅＩ及びＮｓｉＩで消化することで得られた断片がｐＫＵ５９２ベクターの制限酵素サイトＮｈｅＩ／ＮｓｉＩに挿入されることで、ポリケチド合成酵素（例えばＣｓＴＫＳ）と環化酵素（例えばＣｓＯＡＣ）のＤＮＡ断片が挿入されたｐＫＵ５９２ベクターが生成される。
【0054】
なお、上記ではポリケチド合成酵素及び環化酵素がリンカー配列を介して連結されたアミノ酸をコードするＤＮＡ断片を用いているが、当然各酵素をコードするＤＮＡ断片を別々に合成し一つの発現ベクターに導入してもよいし、それぞれ異なる発現ベクターに導入してもよい。
【0055】
［ゲラニル基転移酵素の発現ベクターの構築］
図１に示すとおり、カンナビノイド類化合物の合成において、カンナビノイド類化合物の一つであってカンナビジオールの中間体であるカンナビゲロール酸を効率的に生成することが極めて重要である。本開示では、このカンナビゲロール酸の生成においてゲラニル基転移酵素として、ＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号４）又はＮｐｈＢの類縁酵素として発見したＳｐｒｕ＿ＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号５）が特に好適に用いられる。
図１に示すとおり、カンナビノイド類化合物の合成において、カンナビノイド類化合物の一つであってカンナビジオールの中間体であるカンナビゲロール酸を効率的に生成することが極めて重要である。本開示では、このカンナビゲロール酸の生成においてゲラニル基転移酵素として、ＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号４）又はＮｐｈＢの類縁酵素として発見したＳｐｒｕ＿ＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号５）が特に好適に用いられる。
【0056】
ゲラニル基転移酵素の発現ベクターの構築は、一例としては、当該酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成し、発現ベクターに挿入するためのＤＮＡ断片を生成することにより開始される。生成された断片はｐＫＵ５６５ベクターの制限酵素サイトＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに挿入されることで、上記ＤＮＡ断片が挿入されたｐＫＵ５６５ベクターが生成される。
【0057】
なお、上記において特に詳細に説明はしていないが、発現ベクターに導入される酵素は上記に例示した酵素のみに限らない。当然に宿主となる放線菌においてカンナビノイド類化合物の生産を触媒する各酵素を有していない場合には、外因性の各酵素を上記と同様の方法により発現ベクターに導入することが可能である。
【0058】
また上記のとおり生成された発現ベクターはそのまま宿主である放線菌に導入することも可能であるが、脱メチル化などの処理をさらに行ってもよい。
【0059】
（Ｃ）発現ベクターを宿主である放線菌に導入する段階
上記のとおり生成された発現ベクターは、公知の導入法を用いて宿主である放線菌に導入することができる。このような導入法として、一例としては、化学的方法、生物学的方法、融合法及び物理的方法を挙げることができるが、好ましくは生物学的方法または融合法、より好ましくは接合伝達法またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法が挙げられる。このような導入法を用いることで、宿主である放線菌に発現ベクターを導入することが可能である。
上記のとおり生成された発現ベクターは、公知の導入法を用いて宿主である放線菌に導入することができる。このような導入法として、一例としては、化学的方法、生物学的方法、融合法及び物理的方法を挙げることができるが、好ましくは生物学的方法または融合法、より好ましくは接合伝達法またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法が挙げられる。このような導入法を用いることで、宿主である放線菌に発現ベクターを導入することが可能である。
【0060】
（Ｄ）発現ベクターが導入された放線菌を所定の培地において培養する段階
上記のとおり発現ベクターが導入された放線菌を所定の培地で培養することによってカンナビノイド類化合物を生産することが可能である。当該培養には、培地として、液体培地、半流動培地又は固形培地など、所望に応じていずれの培地を用いることが可能である。本開示においては、これらの培地の中でも好ましくは液体培地が、より好ましくはＧＹ培地やＧＫｄｙ培地が用いられる。当該培地に対して、エネルギー源としてのグルコースのほかに、窒素源、生育促進物質として添加されるエキス類、生育を補助する目的で添加される炭素源、ｐＨを放線菌の生育に好適な範囲に調整するためのバッファ、水、核酸や無機塩等が適宜含まれてもよい。
上記のとおり発現ベクターが導入された放線菌を所定の培地で培養することによってカンナビノイド類化合物を生産することが可能である。当該培養には、培地として、液体培地、半流動培地又は固形培地など、所望に応じていずれの培地を用いることが可能である。本開示においては、これらの培地の中でも好ましくは液体培地が、より好ましくはＧＹ培地やＧＫｄｙ培地が用いられる。当該培地に対して、エネルギー源としてのグルコースのほかに、窒素源、生育促進物質として添加されるエキス類、生育を補助する目的で添加される炭素源、ｐＨを放線菌の生育に好適な範囲に調整するためのバッファ、水、核酸や無機塩等が適宜含まれてもよい。
【0061】
上記培地に発現ベクターが導入された放線菌は継代されると所定の培養温度で所定の培養期間、振盪培養される。この培養温度は好ましくは５℃～４５℃、より好ましくは１５℃～４０℃、さらに好ましくは２５℃～３５℃であり、培養期間は好ましくは１時間～６０日間、より好ましくは１日間～３０日間、さらに好ましくは２日間～１０日間であり、生産効率等を考慮して適宜調整することが可能である。また、培養条件は、上記のとおり一例としては振盪培養が挙げられるが、これに限らず静置、通気、撹拌等の培養条件から菌株に応じて適宜選択することが可能である。
【0062】
なお、上記においては放線菌を直接液体培地に添加して培養したが、あらかじめ前培養をすることも可能である。このような前培養には、上記と同様に、培地として、液体培地、半流動培地又は固形培地など、所望に応じていずれの培地を用いることか可能である。本開示においては、これらの培地の中でも好ましくは液体培地が、より好ましくはＧＳＹ培地が用いられる。当該培地に対して、エネルギー源としてのグルコースのほかに、窒素源、生育促進物質として添加されるエキス類、生育を補助する目的で添加される炭素源、ｐＨを放線菌の生育に好適な範囲に調整するためのバッファ、水、核酸や無機塩等が適宜含まれてもよい。
【0063】
上記培地に発現ベクターが導入された放線菌が接種されると所定の培養温度で所定の培養期間、前培養として振盪培養される。この培養温度は好ましくは５℃～４５℃、より好ましくは１５℃～４０℃、さらに好ましくは２５℃～３５℃であり、培養期間は好ましくは１時間～２０日間、より好ましくは１２時間～１０日間、さらに好ましくは１日間～５日間であり、生産効率等を考慮して適宜調整することが可能である。また、培養条件は、上記のとおり一例としては振盪培養が挙げられるが、これに限らず静置、通気、撹拌等の培養条件から菌株に応じて適宜選択することが可能である。前培養によって得られた培養液を上記液体培地に継代することで本培養が行われる。
【0064】
上記のとおり発現ベクターが導入された放線菌が培養されると、その培養液を遠心分離によって培地上清画分と菌体画分に分離し、当該培地上清画分に酢酸エチルを添加又は当該菌体画分にクロロホルム－メタノールの２対１混合液を添加して分配抽出した。これにより、目的化合物であるカンナビノイド類化合物の抽出を行うことが可能である。なお、当該カンナビノイド類化合物の回収は、上記方法に限らず公知の固相抽出法や他の液液抽出法などを用いて、分離・濃縮することにより得ることが可能である。
【0065】
このように生産されるカンナビノイド類化合物は、最終的に抽出された状態で医薬品、嗜好品、飲食料品や化粧品などの様々な用途において、有効成分や添加物として用いられる。なお、当該用途において、最終的にカンナビノイド類化合物が抽出された状態で利用しているが、当然に培養液そのものやカンナビノイド類化合物が含まれたカンナビノイド類化合物の含有組成物として利用することも可能である。
【0066】
以上、本開示おける放線菌又は当該放線菌を用いた生産方法によれば、カンナビノイド類化合物をより効率的に生産することが可能である。
【実施例0067】
以下、実施例により本開示の放線菌又は当該放線菌を用いた生産方法等についてさらに詳しく説明するが、当然本開示に係る発明がそれらに限定はされない。
【0068】
＜実施例１：放線菌宿主におけるオリベトール酸の生産＞
上記のとおりオリベトール酸の高生産化はカンナビノイド類化合物の生産効率を上げるうえで重要な要素となる。ここでは、放線菌にオリベトール酸の生産に関与するポリケチド合成酵素及び環化酵素をコードする遺伝子を導入することで効果的にオリベトール酸の生産ができることを確認した。
上記のとおりオリベトール酸の高生産化はカンナビノイド類化合物の生産効率を上げるうえで重要な要素となる。ここでは、放線菌にオリベトール酸の生産に関与するポリケチド合成酵素及び環化酵素をコードする遺伝子を導入することで効果的にオリベトール酸の生産ができることを確認した。
【0069】
ポリケチド合成酵素としては配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣｓＴＫＳを、環化酵素としては配列番号３に示されるＣｓＯＡＣをそれぞれ用いた。ＣｓＴＫＳ及びＣｓＯＡＣの各酵素がリンカー配列を介して互いに連結されたＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣアミノ酸配列はＬｕｏ，Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｎａｔｕｒｅ ５６７，１２３－１２６（２０１９）に記載のものを用いた。ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣをコードする遺伝子を放線菌に導入するにあたりコドン最適化を行い、５‘末端にはＸｂａＩ認識配列を、３’末端にはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を配した遺伝子（配列番号６）を用意した。
【0070】
［配列番号６］
tctagatATGAACCACCTGCGCGCCGAGGGCCCGGCCTCCGTCCTCGCCATCGGCACCGCCAACCCGGAGAACATCCTGCTCCAGGACGAGTTCCCGGACTACTACTTCCGCGTCACCAAGTCCGAGCACATGACCCAGCTCAAGGAGAAGTTCCGCAAGATCTGCGACAAGTCCATGATCCGCAAGCGCAACTGCTTCCTGAACGAGGAGCACCTGAAGCAGAACCCGCGCCTGGTGGAGCACGAGATGCAGACCCTGGACGCCCGCCAGGACATGCTGGTCGTCGAGGTCCCGAAGCTGGGGAAGGACGCCTGCGCCAAGGCCATCAAGGAGTGGGGCCAGCCCAAGTCCAAGATCACCCACCTGATCTTCACCAGCGCCTCCACCACCGACATGCCCGGCGCCGACTACCACTGCGCCAAGCTGCTCGGCCTGTCCCCCTCCGTGAAGCGCGTGATGATGTACCAGCTGGGCTGCTACGGCGGCGGCACCGTCCTGCGCATCGCCAAGGACATCGCCGAGAACAACAAGGGCGCCCGCGTCCTCGCCGTGTGCTGCGACATCATGGCCTGCCTGTTCCGCGGGCCGTCCGAGTCCGACCTGGAGCTGCTGGTGGGCCAGGCCATCTTCGGCGACGGGGCCGCCGCGGTGATCGTCGGCGCCGAGCCCGACGAGTCCGTCGGGGAGCGCCCGATCTTCGAGCTGGTGTCCACCGGGCAGACCATCCTGCCGAACTCGGAGGGCACCATCGGGGGCCACATCCGCGAGGCCGGCCTGATCTTCGACCTGCACAAGGACGTGCCGATGCTGATCTCCAACAACATCGAGAAGTGCCTGATCGAGGCCTTCACCCCGATCGGGATCTCCGACTGGAACTCCATCTTCTGGATCACCCACCCGGGCGGGAAGGCCATCCTGGACAAGGTGGAGGAGAAGCTGCACCTGAAGTCCGACAAGTTCGTGGACTCCCGCCACGTGCTGTCCGAGCACGGGAACATGAGCAGCTCCACCGTCCTGTTCGTCATGGACGAGCTGCGCAAGCGCTCGCTGGAGGAGGGGAAGTCCACCACCGGCGACGGCTTCGAGTGGGGCGTCCTGTTCGGGTTCGGCCCGGGCCTGACCGTCGAGCGCGTGGTCGTGCGCTCCGTCCCCATCAAGTACGCCGCCACCAGCGGCTCCACGGGCTCCACGGGCTCCACCGGCTCCGGGCGCAGCACCGGGTCCACGGGCTCCACCGGCTCCGGCCGCTCCCACATGGTCGCCGTGAAGCACCTGATCGTCCTGAAGTTCAAGGACGAGATCACCGAGGCCCAGAAGGAGGAGTTCTTCAAGACGTACGTGAACCTGGTGAACATCATCCCGGCCATGAAGGACGTCTACTGGGGCAAGGACGTGACCCAGAAGAACAAGGAGGAGGGGTACACCCACATCGTCGAGGTCACCTTCGAGTCCGTGGAGACGATCCAGGACTACATCATCCACCCGGCCCACGTCGGCTTCGGCGACGTCTACCGCTCCTTCTGGGAGAAGCTGCTCATCTTCGACTACACCCCGCGCAAGTAGaagctt
tctagatATGAACCACCTGCGCGCCGAGGGCCCGGCCTCCGTCCTCGCCATCGGCACCGCCAACCCGGAGAACATCCTGCTCCAGGACGAGTTCCCGGACTACTACTTCCGCGTCACCAAGTCCGAGCACATGACCCAGCTCAAGGAGAAGTTCCGCAAGATCTGCGACAAGTCCATGATCCGCAAGCGCAACTGCTTCCTGAACGAGGAGCACCTGAAGCAGAACCCGCGCCTGGTGGAGCACGAGATGCAGACCCTGGACGCCCGCCAGGACATGCTGGTCGTCGAGGTCCCGAAGCTGGGGAAGGACGCCTGCGCCAAGGCCATCAAGGAGTGGGGCCAGCCCAAGTCCAAGATCACCCACCTGATCTTCACCAGCGCCTCCACCACCGACATGCCCGGCGCCGACTACCACTGCGCCAAGCTGCTCGGCCTGTCCCCCTCCGTGAAGCGCGTGATGATGTACCAGCTGGGCTGCTACGGCGGCGGCACCGTCCTGCGCATCGCCAAGGACATCGCCGAGAACAACAAGGGCGCCCGCGTCCTCGCCGTGTGCTGCGACATCATGGCCTGCCTGTTCCGCGGGCCGTCCGAGTCCGACCTGGAGCTGCTGGTGGGCCAGGCCATCTTCGGCGACGGGGCCGCCGCGGTGATCGTCGGCGCCGAGCCCGACGAGTCCGTCGGGGAGCGCCCGATCTTCGAGCTGGTGTCCACCGGGCAGACCATCCTGCCGAACTCGGAGGGCACCATCGGGGGCCACATCCGCGAGGCCGGCCTGATCTTCGACCTGCACAAGGACGTGCCGATGCTGATCTCCAACAACATCGAGAAGTGCCTGATCGAGGCCTTCACCCCGATCGGGATCTCCGACTGGAACTCCATCTTCTGGATCACCCACCCGGGCGGGAAGGCCATCCTGGACAAGGTGGAGGAGAAGCTGCACCTGAAGTCCGACAAGTTCGTGGACTCCCGCCACGTGCTGTCCGAGCACGGGAACATGAGCAGCTCCACCGTCCTGTTCGTCATGGACGAGCTGCGCAAGCGCTCGCTGGAGGAGGGGAAGTCCACCACCGGCGACGGCTTCGAGTGGGGCGTCCTGTTCGGGTTCGGCCCGGGCCTGACCGTCGAGCGCGTGGTCGTGCGCTCCGTCCCCATCAAGTACGCCGCCACCAGCGGCTCCACGGGCTCCACGGGCTCCACCGGCTCCGGGCGCAGCACCGGGTCCACGGGCTCCACCGGCTCCGGCCGCTCCCACATGGTCGCCGTGAAGCACCTGATCGTCCTGAAGTTCAAGGACGAGATCACCGAGGCCCAGAAGGAGGAGTTCTTCAAGACGTACGTGAACCTGGTGAACATCATCCCGGCCATGAAGGACGTCTACTGGGGCAAGGACGTGACCCAGAAGAACAAGGAGGAGGGGTACACCCACATCGTCGAGGTCACCTTCGAGTCCGTGGAGACGATCCAGGACTACATCATCCACCCGGCCCACGTCGGCTTCGGCGACGTCTACCGCTCCTTCTGGGAGAAGCTGCTCATCTTCGACTACACCCCGCGCAAGTAGaagctt
【0071】
なお、当該ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣをコードする遺伝子は委託機関による委託合成によって、ｐＵＣ５７－Ｋａｎ：：ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ＿ＧＣとして得た。ｐＵＣ５７－Ｋａｎ：：ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ＿ＧＣをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩの各制限酵素で消化し、発現ベクターであるｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ（文献５：Ｋｉｍ， Ｊ． Ｈ．ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ１１５， ６８２８－６８３３（２０１８）に記載）のＸｂａＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することでｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ＿ＧＣを構築した。ｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ＿ＧＣはＸｂａＩ認識配列の上流にＳＡＶ＿２７９４遺伝子のプロモータを配したベクターである（Ａｍａｇａｉ，Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｏｒ ｔｅｌｏｍｅｓｔａｔｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ａ ｃｌｅａｎ ｈｏｓｔ． Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ７，３３８２（２０１７））。次にｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ＿ＧＣをＮｈｅＩとＮｓｉＩで消化し、ｐＫＵ５９２ＡＴ＿ａｐｈＩＩ（文献４）のＮｈｅＩ―ＮｓｉＩ部位に挿入することでｐＫＵ５９２ＡＴ＿ａｐｈＩＩ：：ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ＿ＧＣを構築した。ここで、図２は、構築された発現ベクターであるｐＫＵ５９２ＡＴ＿ａｐｈＩＩ：：ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ＿ＧＣの構成を示す図である。このように、当該発現ベクターは、ＴＧ１インテグラーゼ遺伝子とＴＧ１インテグラーゼのａｔｔＰ配列を持つゲノム組み込み型ベクターである。そして、メチル化修飾されていないベクターを得るため、ｐＫＵ５９２ＡＴ＿ａｐｈＩＩ：：ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ＿ＧＣでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＧＭ２９２９を形質転換した。形質転換体の培養液からベクターを抽出し、脱メチル化ｐＫＵ５９２ＡＴ＿ａｐｈＩＩ：：ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ＿ＧＣを得た。
【0072】
次に、脱メチル化ｐＫＵ５９２ＡＴ＿ａｐｈＩＩ：：ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ＿ＧＣを用い、プロトプラスト－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法によって放線菌宿主を形質転換した。なお、放線菌宿主には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＳＵＫＡ２５株を用いた。当該ＳＵＫＡ２５株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＳＵＫＡ２４株（Ｏｋｕｂｏ，Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ａｎｄ ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ． ＥＡＳ－ＡＢ２６０８ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０５，４１７７－４１８７ （２０２１））のエリスロマイシン耐性遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子に置換した株である。そして、当該ＳＵＫＡ２５株を形質転換してＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣを構築した。形質転換体はＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣチェック用フォワードプライマー（配列番号７）とＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣチェック用リバースプライマー（配列番号８）を用いたＰＣＲによってＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ遺伝子を持つことを確認した。
【0073】
［配列番号７］
ATCTCCAACAACATCGAGAAGTG
［配列番号８］
GTTCACGTACGTCTTGAAGAACTC
ATCTCCAACAACATCGAGAAGTG
［配列番号８］
GTTCACGTACGTCTTGAAGAACTC
【0074】
次に、試験管に分注した１５ｍＬのＧＳＹ培地にＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣを接種し、２７℃で２日間、３２０ｒｐｍで振盪（レシプロ）培養した。なお、利用したＧＳＹ培地の成分は表１に記載のとおりである。
【表1】
【0075】
上記培養により得られた培養液を、１２５ｍＬ容の三角フラスコに分注した１５ｍＬのＧＹ培地に４５０μＬ（３％（ｖ／ｖ））継代し、２７℃で７日間、１８０ｒｐｍで振盪（ロータリー）培養した。なお、利用したＧＳＹ培地の成分は表２に記載のとおりである。
【表2】
【0076】
得られた培養液を遠心分離によって培地上清画分と菌体画分に分け、培地上清画分に等量の酢酸エチルを加えて分配抽出した。酢酸エチル層を乾固して得られた抽出物をメタノールに溶解し分析サンプルとした。分析サンプルをカラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ（１．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ）：Ｗａｔｅｒｓ社製）を装着した高速液体クロマトグラフィー／質量分析装置（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ／Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２：Ｗａｔｅｒｓ社製）によって分析し、購入したオリベトール酸の標品（Ａ１ ＢｉｏＣｈｅｍ Ｌａｂｓ（米国ノースカロライナ州）社製）と保持時間、紫外吸光スペクトル及びマスクロマトグラムを比較することでオリベトール酸の生産を確認した。
【0077】
図３は、オリベトール酸の標品のマスクロマトグラムとＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣをコードする遺伝子が導入された放線菌によって生産された分析サンプルのマスクロマトグラムの比較結果を示す図である。図３によれば、ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣをコードする遺伝子が導入された放線菌によっても同様にオリベトール酸の生産が可能であることが確認できた。つまり、オリベトール酸を中間体とするカンナビノイド類化合物の生産において、当該放線菌が有用であることが示された。
【0078】
＜実施例２：中鎖脂肪酸合成酵素を利用したオリベトール酸の生産＞
上記のとおりオリベトール酸の高生産化はカンナビノイド類化合物の生産効率を上げるうえで重要な要素となる。ここでは、オリベトール酸の生成において開始基質となるヘキサノイル－ＣｏＡを合成するのに利用される合成酵素としてＫＳＥ＿６５５２０（配列番号１）の酵素をコードする遺伝子が導入された放線菌によって効果的にオリベトール酸の生産ができることを確認した。
上記のとおりオリベトール酸の高生産化はカンナビノイド類化合物の生産効率を上げるうえで重要な要素となる。ここでは、オリベトール酸の生成において開始基質となるヘキサノイル－ＣｏＡを合成するのに利用される合成酵素としてＫＳＥ＿６５５２０（配列番号１）の酵素をコードする遺伝子が導入された放線菌によって効果的にオリベトール酸の生産ができることを確認した。
【0079】
まず、ＫＳＥ＿６５５２０をコードする遺伝子は、Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｓｅｔａｅのゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号９のフォワードプライマーと配列番号１０のリバースプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。
【0080】
［配列番号９］
CGtctagaATGACCGATCGCGTTCCCGGCACCGCGCCG
［配列番号１０］
GCGaagcttTCATCGTCCCGCCTCCACCCGTTCGCGCGG
CGtctagaATGACCGATCGCGTTCCCGGCACCGCGCCG
［配列番号１０］
GCGaagcttTCATCGTCCCGCCTCCACCCGTTCGCGCGG
【0081】
得られた増幅断片をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎのＸｂａＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することでｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ＫＳＥ＿６５５２０を構築した。次にｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ＫＳＥ＿６５５２０をＮｈｅＩとＮｓｉＩで消化し、ｐＫＵ５９４ＡＴ＿ａａｃ（３）ＩＶのＮｈｅＩ－ＮｓｉＩ部位に挿入することでｐＫＵ５９４ＡＴ＿ａａｃ（３）ＩＶ：：ＫＳＥ＿６５５２０を構築した。ここで、図４は、構築された発現ベクターであるｐＫＵ５９４ＡＴ＿ａａｃ（３）ＩＶ：：ＫＳＥ＿６５５２０の構成を示す図である。このように、当該発現ベクターは、ｐＫＵ５９２ＡＴ＿ａｐｈＩＩのＴＧ１インテグラーゼ遺伝子とＴＧ１インテグラーゼのａｔｔＰ配列を、ΦＢＴ１インテグラーゼ遺伝子とΦＢＴ１インテグラーゼのａｔｔＰ配列にそれぞれ置換し、さらにカナマイシン耐性遺伝子（ａｐｈＩＩ遺伝子）をアプラマイシン耐性遺伝子（ａａｃ（３）ＩＶ遺伝子）に置換したゲノム組み込み型ベクターである。
【0082】
ｐＫＵ５９４ＡＴ＿ａａｃ（３）ＩＶ：：ＫＳＥ＿６５５２０でｐＵＢ３０７を保持する大腸菌へ形質転換し、次いでＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣへ接合伝達することによりＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０を構築した。
【0083】
構築されたＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０は、実施例１と同様の方法により振盪培養され、その培養液から酢酸エチル等を用いて分析サンプルを分配抽出し調製した。そして、実施例１と同様の方法によりオリベトール酸の生産を確認した。
【0084】
図５は、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０のオリベトール酸の生産能力を示す図である。図５によれば、ＬＣ／ＭＳの抽出クロマトグラムから生産量を算出した結果が示されており、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０（図５の「ＫＳＥ_ＣｏＬ有り」）は９０８μｇ／Ｌのオリベトール酸を生産したのに対し、ＫＳＥ＿６５５２０をコードする遺伝子が導入されていない内因性の合成酵素を利用したＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ（実施例１で得られた放線菌：（図５の「ＫＳＥ_ＣｏＬ無し」）では５２μｇ／Ｌにとどまった。ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０が、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ（実施例１で得られた放線菌）に対して、実に１７倍のオリベトール酸生産能力を有していることが確認できた。つまり、オリベトール酸を中間体とするカンナビノイド類化合物の生産において、ＫＳＥ＿６５５２０をコードする遺伝子が導入された放線菌を用いることで極めて効率的にオリベトール酸を生産できることが示された。
【0085】
＜実施例３：中鎖脂肪酸合成酵素を利用したカンナビゲロール酸の生産＞
実施例２においては中鎖脂肪酸合成酵素であるＫＳＥ＿６５５２０をコードする遺伝子を導入した放線菌によって極めて効率的にオリベトール酸を生産できることが確認できた。ここで、オリベトール酸は、大麻草においてはゲラニル基転移酵素ＣｓＰＴ４がゲラニル化を触媒することによってカンナビゲロール酸へ変換される。他方、放線菌においてはゲラニル基転移酵素としてＮｐｈＢが知られているもののより効率よくオリベトール酸のゲラニル化を触媒し、カンナビゲロール酸の生産の効率を上げることができる酵素が求められる。そこで、実施例３においては、文献２に記載のＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号４）を利用してカンナビゲロール酸の生産を試みた。
実施例２においては中鎖脂肪酸合成酵素であるＫＳＥ＿６５５２０をコードする遺伝子を導入した放線菌によって極めて効率的にオリベトール酸を生産できることが確認できた。ここで、オリベトール酸は、大麻草においてはゲラニル基転移酵素ＣｓＰＴ４がゲラニル化を触媒することによってカンナビゲロール酸へ変換される。他方、放線菌においてはゲラニル基転移酵素としてＮｐｈＢが知られているもののより効率よくオリベトール酸のゲラニル化を触媒し、カンナビゲロール酸の生産の効率を上げることができる酵素が求められる。そこで、実施例３においては、文献２に記載のＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号４）を利用してカンナビゲロール酸の生産を試みた。
【0086】
ＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号４）であるＮｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａをコードする遺伝子（配列番号１１）は、委託機関による委託合成によってｐＵＣ５７－Ｋａｎ：：ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａとして得た。
【0087】
［配列番号１１］
tctagaTACAAGGAGCGGTCAGATGTCCGAAGCCGCTGATGTCGAGCGCGTGTACGCGGCCATGGAGGAAGCGGCTGGACTGCTGGGTGTGGCCTGCGCACGCGACAAGATCTATCCGCTGCTGAGCACGTTCCAGGACACGCTCGTCGAGGGCGGCAGCGTCGTCGTCTTCTCCATGGCGAGCGGGCGTCATTCCACGGAACTGGACTTCAGCATCTCGGTGCCGACCAGCCACGGCGACCCGTACGCCACCGTCGTGGAAAAGGGGCTGTTCCCGGCGACCGGCCACCCCGTGGACGACCTGCTCGCGGACACCCAGAAGCACCTTCCGGTCTCCATGTTCGCCATCGACGGCGAGGTCACCGGCGGCTTCAAGAAGACGTACGCCTTCTTCCCCACCGACAACATGCCCGGCGTCGCCGAGCTGAGCGCCATCCCCTCCATGCCGCCGGCCGTCGCCGAGAACGCGGAGCTGTTCGCCCGCTACGGTCTGGACAAGGTCCAGATGACGTCGATGGACTACAAGAAGCGGCAGGTCAACCTCTACTTCAGCGAGCTGAGCGCGCAGACCCTGGAGGCGGAATCCGTCCTCGCCCTGGTGCGCGAGCTGGGCCTGCACGTGCCGAACGAGCTGGGCCTGAAGTTCTGCAAGCGCTCCTTCTCGGTCTACCCCACCCTCAACTGGGAGACCGGCAAGATCGACCGGCTGTGTTTCAGCGTCATCTCCAACGACCCCACCCTGGTGCCGTCCTCGGACGAGGGCGACATCGAGAAGTTCCACAACTACGCGACCAAGGCGCCGTACGCGTACGTCGGCGAGAAGCGCACCCTCGTCTATGGGCTCACGCTGTCGCCCAAGGAGGAGTACTACAAGCTGGGCGCGGCCTACCACATCACCGATGTCCAGCGCGGACTGCTGAAGGCGTTCGACTCGCTGGAGGACTGAaagctt
tctagaTACAAGGAGCGGTCAGATGTCCGAAGCCGCTGATGTCGAGCGCGTGTACGCGGCCATGGAGGAAGCGGCTGGACTGCTGGGTGTGGCCTGCGCACGCGACAAGATCTATCCGCTGCTGAGCACGTTCCAGGACACGCTCGTCGAGGGCGGCAGCGTCGTCGTCTTCTCCATGGCGAGCGGGCGTCATTCCACGGAACTGGACTTCAGCATCTCGGTGCCGACCAGCCACGGCGACCCGTACGCCACCGTCGTGGAAAAGGGGCTGTTCCCGGCGACCGGCCACCCCGTGGACGACCTGCTCGCGGACACCCAGAAGCACCTTCCGGTCTCCATGTTCGCCATCGACGGCGAGGTCACCGGCGGCTTCAAGAAGACGTACGCCTTCTTCCCCACCGACAACATGCCCGGCGTCGCCGAGCTGAGCGCCATCCCCTCCATGCCGCCGGCCGTCGCCGAGAACGCGGAGCTGTTCGCCCGCTACGGTCTGGACAAGGTCCAGATGACGTCGATGGACTACAAGAAGCGGCAGGTCAACCTCTACTTCAGCGAGCTGAGCGCGCAGACCCTGGAGGCGGAATCCGTCCTCGCCCTGGTGCGCGAGCTGGGCCTGCACGTGCCGAACGAGCTGGGCCTGAAGTTCTGCAAGCGCTCCTTCTCGGTCTACCCCACCCTCAACTGGGAGACCGGCAAGATCGACCGGCTGTGTTTCAGCGTCATCTCCAACGACCCCACCCTGGTGCCGTCCTCGGACGAGGGCGACATCGAGAAGTTCCACAACTACGCGACCAAGGCGCCGTACGCGTACGTCGGCGAGAAGCGCACCCTCGTCTATGGGCTCACGCTGTCGCCCAAGGAGGAGTACTACAAGCTGGGCGCGGCCTACCACATCACCGATGTCCAGCGCGGACTGCTGAAGGCGTTCGACTCGCTGGAGGACTGAaagctt
【0088】
ｐＫＵ１０２１ｇｐｓ（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ：ＡＢ９８２１２４（文献６：Ｙｕｕｋｉ Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｔｅｒｐｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅｓ ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１１２（３），８５７－６２（２０１５）））をＮｈｅＩとＸｂａＩで消化し、ｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎのＮｈｅＩ－ＸｂａＩ部位に挿入することでｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ｇｐｓを構築した。ｐＫＵ１０２１ｇｐｓはｒｐｓＪプロモータの下流にゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子を配したプラスミドである（Ｙａｍａｄａ，Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｔｅｒｐｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅｓ ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．ＰＮＡＳ １１２（３），８５７－８６２（２０１４））。次にｐＵＣ５７－Ｋａｎ：：ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８ＡをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ｇｐｓのＸｂａＩ―ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することでｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａを構築した。ここで、図６は、構築された発現ベクターであるｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａの構成を示す図である。そして、メチル化修飾されていないプラスミドを得るため、ｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８ＡでＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＧＭ２９２９を形質転換した。形質転換体の培養液からプラスミドを抽出し、脱メチル化ｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａを得た。
【0089】
ｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８ＡでｐＵＢ３０７を保持する大腸菌へ形質転換し、次いでＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ及びＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０へ接合伝達することによりＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａ及びＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａを構築した。
【0090】
構築されたＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａ及びＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａは、実施例１と同様の方法により振盪培養され、その培養液から酢酸エチル等を用いて分析サンプルを分配抽出し調製した。そして、実施例１と同様の方法によりカンナビゲロール酸の生産を確認した。ただし、このときＧＹ培地に代えて、表３に記載のＧＫｄｙ培地を用いた。
【表3】
【0091】
図７は、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａのカンナビゲロール酸の生産能力を示す図である。図７によれば、ＬＣ／ＭＳの抽出クロマトグラムから生産量を算出した結果が示されており、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａ（ＫＳＥ＿ＣｏＬ無し）及びＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａ（ＫＳＥ＿ＣｏＬ有り）のいずれにおいてもカンナビゲロール酸が生産できることが確認でき、ゲラニル基転移酵素としてＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号４）は有用であることが確認できた。さらに、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａのカンナビゲロール酸の生産量は、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａのカンナビゲロールの生産量に対して、実に２１倍もの差を示し、中鎖脂肪酸合成酵素としてＫＳＥ＿６５５２０をコードする遺伝子が導入された放線菌を用いることで極めて効率的にカンナビゲロール酸を生産できることが示された。
【0092】
＜実施例４：Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢを用いたカンナビゲロール酸の高生産化＞
実施例３においては、ＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号４）を用いることで放線菌においても効率的にカンナビゲロール酸を生産できることが確認できたが、より生産能力に優れたゲラニル基転移酵素を探索することは、カンナビゲロール酸の高生産化において極めて重要である。ここで、ＮｐｈＢはＮａｐｈｔｅｒｐｉｎの生合成に関与する酵素であるところ、当該化合物の類縁化合物を生産することができる放線菌であればＮｐｈＢと同様にゲラニル基転移活性を示す内因性の酵素を有する可能性が高い。そこで、類縁化合物を生産可能な放線菌を対象としてゲノム解析を行うことによってＮｐｈＢホモログを探索し、ＮｐｈＢと同等かそれ以上の活性を示す酵素を特定した。その結果、Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢが特定された。さらに、Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢに対して２３０番目のアラニンがセリンに、２８６番目のチロシンがアラニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有する酵素（配列番号５：Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢ＿Ａ２３０Ｓ＿Ｙ２８６Ａ）が特に好ましい酵素として特定された。
実施例３においては、ＮｐｈＢの２アミノ酸置換体（配列番号４）を用いることで放線菌においても効率的にカンナビゲロール酸を生産できることが確認できたが、より生産能力に優れたゲラニル基転移酵素を探索することは、カンナビゲロール酸の高生産化において極めて重要である。ここで、ＮｐｈＢはＮａｐｈｔｅｒｐｉｎの生合成に関与する酵素であるところ、当該化合物の類縁化合物を生産することができる放線菌であればＮｐｈＢと同様にゲラニル基転移活性を示す内因性の酵素を有する可能性が高い。そこで、類縁化合物を生産可能な放線菌を対象としてゲノム解析を行うことによってＮｐｈＢホモログを探索し、ＮｐｈＢと同等かそれ以上の活性を示す酵素を特定した。その結果、Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢが特定された。さらに、Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢに対して２３０番目のアラニンがセリンに、２８６番目のチロシンがアラニンにそれぞれ置換されたアミノ酸配列を有する酵素（配列番号５：Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢ＿Ａ２３０Ｓ＿Ｙ２８６Ａ）が特に好ましい酵素として特定された。
【0093】
まず、配列番号５で示されるＳｐｒｕ＿ＮｐｈＢ＿Ａ２３０Ｓ＿Ｙ２８６Ａをコードする遺伝子（配列番号１２）は、委託機関による委託合成によってｐＵＣ５７－Ｋａｎ：：Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢ＿Ａ２３０Ｓ＿Ｙ２８６Ａとして得た。
【0094】
［配列番号１２］
ATGTCCGGAGCCGCTGATGTCGAGCGCGTGTACGCGGCCATGGAGGAGGCGGCTGGACTGCTGGGCGTGACCTGCGCACGCGAGAAGATCTACCCGCTGCTGACCGAGTTCCAGGACACCCTCACCGACGGTGTCGTCGTCTTCTCCATGGCGAGCGGACGTCGTTCCACGGAGCTGGACTTCAGCATCTCGGTGCCGACCAGCCAGGGCGACCCGTACGCCACCGTGGTGGACAAGGGGCTGTTCCCGGCGACCGGTCACCCCGTGGACGATCTGCTGGCCGACACCCAGAAGCATCTGCCGGTGTCGATGTTCGCCATCGACGGCGAGGTCACCGGTGGCTTCAAGAAGACGTACGCGTTCTTCCCGACCGACGACATGCCCGGGGTCGCGCAGCTGAGCGCCATCCCCTCGATGCCGGCGTCCGTGGCTCAGAACGCGGAGCTGTTCGCCCGCTACGGGCTGGACAAGGTCCAGATGACGTCGATGGACTACAAGAAGCGCCAGGTCAACCTGTACTTCAGCGAGCTGAGCCAGCAGACGCTGGCGCCGGAGTCGGTGCTGGCTCTGGTGCGTGAGCTGGGTCTGCACGTGCCGACCGAGCTGGGGCTGGAGTTCTGCAAGCGCTCGTTCTCGGTCTACCCGACGCTCAACTGGGACACCGGCAAGATCGACCGGCTGTGCTTCTCCGTGATCTCCACCGACCCGACGCTGGTGCCGTCCGAGGACGAGCGCGACATCGAGCAGTTCCGTGACTACGGCACGAAGGCGCCGTACGCGTATGTCGGCGAGAAGCGCACCCTCGTGTACGGGCTGACGCTGTCGCCCACGGAGGAGTACTACAAGCTCGGCGCGGCCTACCACATCACCGATATCCAGCGGCGGCTGCTGAAGGCGTTCGACGCGCTGGAGGACTGA
ATGTCCGGAGCCGCTGATGTCGAGCGCGTGTACGCGGCCATGGAGGAGGCGGCTGGACTGCTGGGCGTGACCTGCGCACGCGAGAAGATCTACCCGCTGCTGACCGAGTTCCAGGACACCCTCACCGACGGTGTCGTCGTCTTCTCCATGGCGAGCGGACGTCGTTCCACGGAGCTGGACTTCAGCATCTCGGTGCCGACCAGCCAGGGCGACCCGTACGCCACCGTGGTGGACAAGGGGCTGTTCCCGGCGACCGGTCACCCCGTGGACGATCTGCTGGCCGACACCCAGAAGCATCTGCCGGTGTCGATGTTCGCCATCGACGGCGAGGTCACCGGTGGCTTCAAGAAGACGTACGCGTTCTTCCCGACCGACGACATGCCCGGGGTCGCGCAGCTGAGCGCCATCCCCTCGATGCCGGCGTCCGTGGCTCAGAACGCGGAGCTGTTCGCCCGCTACGGGCTGGACAAGGTCCAGATGACGTCGATGGACTACAAGAAGCGCCAGGTCAACCTGTACTTCAGCGAGCTGAGCCAGCAGACGCTGGCGCCGGAGTCGGTGCTGGCTCTGGTGCGTGAGCTGGGTCTGCACGTGCCGACCGAGCTGGGGCTGGAGTTCTGCAAGCGCTCGTTCTCGGTCTACCCGACGCTCAACTGGGACACCGGCAAGATCGACCGGCTGTGCTTCTCCGTGATCTCCACCGACCCGACGCTGGTGCCGTCCGAGGACGAGCGCGACATCGAGCAGTTCCGTGACTACGGCACGAAGGCGCCGTACGCGTATGTCGGCGAGAAGCGCACCCTCGTGTACGGGCTGACGCTGTCGCCCACGGAGGAGTACTACAAGCTCGGCGCGGCCTACCACATCACCGATATCCAGCGGCGGCTGCTGAAGGCGTTCGACGCGCTGGAGGACTGA
【0095】
そして、ＮｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａに関して実施例３に示したプラスミドの構築と同様の方法で、Ｓｐｒｕ＿ＮｐｈＢ＿Ａ２３０Ｓ＿Ｙ２８６Ａ発現プラスミドｐＫＵ５６５ｔｓｒ＿２－ｃｉｓｔｒｏｎ：：ｇｐｓ－Ｓｐｒｕ＿ｎｐｈＢ＿Ａ２３０Ｓ＿Ｙ２８６Ａを構築した。さらに実施例３と同様の方法で放線菌へ導入することで、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－Ｓｐｒｕ＿ｎｐｈＢ＿Ａ２３０Ｓ＿Ｙ２８６Ａを構築した。その後、実施例３に示したのと同様の方法により、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８ＡおよびＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－Ｓｐｒｕ＿ｎｐｈＢ＿Ａ２３０Ｓ＿Ｙ２８６Ａを培養した。
【0096】
図８は、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－Ｓｐｒｕ＿ｎｐｈＢ＿Ａ２３０Ｓ＿Ｙ２８６Ａのカンナビゲロール酸の生産能力を示す図である。図８によれば、ＬＣ／ＭＳの抽出クロマトグラムから生産量を算出した結果が示されており、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－Ｓｐｒｕ＿ｎｐｈＢ＿Ａ２３０Ｓ＿Ｙ２８６Ａのカンナビゲロールの生産量は、ＳＵＫＡ２５／ＣｓＴＫＳ－ＣｓＯＡＣ／ＫＳＥ＿６５５２０／ｇｐｓ－ｎｐｈＢ＿Ａ２３２Ｓ＿Ｙ２８８Ａのカンナビゲロールの生産量に対して、２倍の差を示し、ゲラニル基転移酵素として配列番号５で示されるＳｐｒｕ＿ＮｐｈＢをコードする遺伝子が導入された放線菌を用いることで極めて効率的にカンナビゲロール酸を生産できることが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-12
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】