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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025002254
(43)【公開日】2025-01-09
(54)【発明の名称】人工培養皮膚およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241226BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20241226BHJP
C12M 1/00 20060101ALN20241226BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12Q1/02
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023102304
(22)【出願日】2023-06-22
(71)【出願人】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(71)【出願人】
【識別番号】592042750
【氏名又は名称】株式会社アルビオン
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(72)【発明者】
【氏名】竹内 昌治
(72)【発明者】
【氏名】杉原 守
(72)【発明者】
【氏名】佐野 桂
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA08
4B029BB11
4B029CC02
4B063QA05
4B063QQ08
4B065AA93X
4B065BC46
4B065CA44
(57)【要約】
【課題】良好な皮膚組織（例えば、角層の良好な形成、遺伝子の良好な発現など）を有する人工培養皮膚を提供する。
【解決手段】本発明は、脂肪由来幹細胞およびゲルを含む、基部組織層；基部組織層の上に設けられ、線維芽細胞およびゲルを含む、真皮組織層；および、真皮組織層の上に設けられ、表皮細胞を含む、表皮層、を含む、人工培養皮膚に関する。好ましくは、ゲルは、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルである。好ましくは、脂肪由来幹細胞は、ヒト脂肪由来幹細胞である。好ましくは、線維芽細胞は、正常ヒト皮膚線維芽細胞である。好ましくは、表皮細胞は、正常ヒト表皮角化細胞である。
【選択図】図１
【解決手段】本発明は、脂肪由来幹細胞およびゲルを含む、基部組織層；基部組織層の上に設けられ、線維芽細胞およびゲルを含む、真皮組織層；および、真皮組織層の上に設けられ、表皮細胞を含む、表皮層、を含む、人工培養皮膚に関する。好ましくは、ゲルは、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルである。好ましくは、脂肪由来幹細胞は、ヒト脂肪由来幹細胞である。好ましくは、線維芽細胞は、正常ヒト皮膚線維芽細胞である。好ましくは、表皮細胞は、正常ヒト表皮角化細胞である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
脂肪由来幹細胞およびゲルを含む、基部組織層、
基部組織層の上に設けられ、線維芽細胞およびゲルを含む、真皮組織層、および、
真皮組織層の上に設けられ、表皮細胞を含む、表皮層、
を含む、人工培養皮膚。
基部組織層の上に設けられ、線維芽細胞およびゲルを含む、真皮組織層、および、
真皮組織層の上に設けられ、表皮細胞を含む、表皮層、
を含む、人工培養皮膚。
【請求項2】
基部組織層のゲルが、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルであり、および、真皮組織層のゲルが、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルである、請求項１に記載の人工培養皮膚。
【請求項3】
脂肪由来幹細胞が、ヒト脂肪由来幹細胞であり、線維芽細胞が、正常ヒト皮膚線維芽細胞であり、および、表皮細胞が、正常ヒト表皮角化細胞である、請求項１または２に記載の人工培養皮膚。
【請求項4】
表皮層が、気液界面培養によって表皮細胞が分化して形成された角層を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の人工培養皮膚。
【請求項5】
表皮層が、基底膜関連因子、基底細胞関連因子、バリア機能関連因子、および保湿関連因子から選ばれる１つ以上の遺伝子発現が活性化した表皮層である、請求項１～４のいずれか１項に記載の人工培養皮膚。
【請求項6】
ＣＯＬ１７Ａ１、ＫＲＴ１５、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＯＣＬＮ、ＨＡＳ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＧＦ１０、およびＶＥＧＦから選ばれる１つ以上の遺伝子の発現が活性化されているか、またはＭＭＰ－１の遺伝子の発現が抑制されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の人工培養皮膚。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載の人工培養皮膚を製造する方法であって、
（ａ）脂肪由来幹細胞およびゲルを含む混合物を供給して基部組織層を形成する工程、
（ｂ）基部組織層の上に、線維芽細胞およびゲルを含む混合物を供給して真皮組織層を形成する工程、
（ｃ）真皮組織層の上に、表皮細胞を供給して表皮層を形成する工程、および、
（ｄ）基部組織層、真皮組織層および表皮層を含む積層物を培養する工程、
を含む、人工培養皮膚の製造方法。
（ａ）脂肪由来幹細胞およびゲルを含む混合物を供給して基部組織層を形成する工程、
（ｂ）基部組織層の上に、線維芽細胞およびゲルを含む混合物を供給して真皮組織層を形成する工程、
（ｃ）真皮組織層の上に、表皮細胞を供給して表皮層を形成する工程、および、
（ｄ）基部組織層、真皮組織層および表皮層を含む積層物を培養する工程、
を含む、人工培養皮膚の製造方法。
【請求項8】
工程（ｂ）の後に、基部組織層および真皮組織層を含む積層物を培養する工程、をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
工程（ｄ）が、未分化用の培地に積層物を浸漬して培養する工程、分化用の培地に積層物を浸漬して培養する工程、および、分化用の培地で積層物を気液界面培養する工程、を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
工程（ｄ）が、内壁に突起を有する筒状のデバイスを用い、突起を基部組織層または真皮組織層に係合させて、培養を行うものである、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
工程（ｄ）が、上下に貫通する複数の穴を有する台座を用い、前記デバイスを前記台座に載せて、培養を行うものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～６のいずれか１項に記載の人工培養皮膚に、薬剤を接触させること、および、
薬剤接触後の人工培養皮膚を分析して、人工培養皮膚の状態の変化、および人工培養皮膚中の薬剤の状態、から選ばれる少なくとも１つを調べること、
を含む、人工培養皮膚を用いた薬剤の評価方法。
薬剤接触後の人工培養皮膚を分析して、人工培養皮膚の状態の変化、および人工培養皮膚中の薬剤の状態、から選ばれる少なくとも１つを調べること、
を含む、人工培養皮膚を用いた薬剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、皮膚科学に関連する研究（例えば化粧品または皮膚外用剤のスクリーニングなど）に使用することが可能な、人工培養皮膚およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、３次元的に細胞を培養して形成される人工培養皮膚が開発されている。人工培養皮膚は、化粧品および皮膚外用剤のスクリーニング試験などに有用である。特許文献１には、真皮組織層および表皮層を含んだ人工皮膚組織の製造方法が開示されている。特許文献２には、ヒト脂肪組織幹細胞を、ヒト線維芽細胞およびヒトケラチノサイトと共に培養する再生ヒト皮膚組織の製造方法が開示されている。
【0003】
しかしながら、人工培養皮膚の開発においては、ヒト皮膚にさらに近い人工培養皮膚が求められており、特に、皮膚各層の状態（例えば、角層の良好な形成、遺伝子発現など）がより実際の皮膚に近い良好な皮膚組織を有する人工培養皮膚が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特許第６９３３８５５号公報
【特許文献2】特開２０２２－０１８９４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、良好な皮膚組織（例えば、角層の良好な形成、遺伝子の良好な発現など）を有する人工培養皮膚を提供することを目的とする。また、良好な皮膚組織を有する人工培養皮膚の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は、下記に挙げる実施態様を含むが、これらに限定されるものではない。
［１］ 脂肪由来幹細胞およびゲルを含む、基部組織層、
基部組織層の上に設けられ、線維芽細胞およびゲルを含む、真皮組織層、および、
真皮組織層の上に設けられ、表皮細胞を含む、表皮層、
を含む、人工培養皮膚。
［２］ 基部組織層のゲルが、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルであり、および、真皮組織層のゲルが、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルである、項［１］に記載の人工培養皮膚。
［３］ 脂肪由来幹細胞が、ヒト脂肪由来幹細胞であり、線維芽細胞が、正常ヒト皮膚線維芽細胞であり、および、表皮細胞が、正常ヒト表皮角化細胞である、項［１］または［２］に記載の人工培養皮膚。
［４］ 表皮層が、気液界面培養によって表皮細胞が分化して形成された角層を有する、項［１］～［３］のいずれか１項に記載の人工培養皮膚。
［５］ 表皮層が、基底膜関連因子、基底細胞関連因子、バリア機能関連因子、および保湿関連因子から選ばれる１つ以上の遺伝子発現が活性化した表皮層である、項［１］～［４］のいずれか１項に記載の人工培養皮膚。
［６］ ＣＯＬ１７Ａ１、ＫＲＴ１５、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＯＣＬＮ、ＨＡＳ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＧＦ１０、およびＶＥＧＦから選ばれる１つ以上の遺伝子の発現が活性化されているか、またはＭＭＰ－１の遺伝子の発現が抑制されている、項［１］～［５］のいずれか１項に記載の人工培養皮膚。
［７］ 項［１］～［６］のいずれか１項に記載の人工培養皮膚を製造する方法であって、
（ａ）脂肪由来幹細胞およびゲルを含む混合物を供給して基部組織層を形成する工程、
（ｂ）基部組織層の上に、線維芽細胞およびゲルを含む混合物を供給して真皮組織層を形成する工程、
（ｃ）真皮組織層の上に、表皮細胞を供給して表皮層を形成する工程、および、
（ｄ）基部組織層、真皮組織層および表皮層を含む積層物を培養する工程、
を含む、人工培養皮膚の製造方法。
［８］ 工程（ｂ）の後に、基部組織層および真皮組織層を含む積層物を培養する工程、をさらに含む、項［７］に記載の方法。
［９］ 工程（ｄ）が、未分化用の培地に積層物を浸漬して培養する工程、分化用の培地に積層物を浸漬して培養する工程、および、分化用の培地で積層物を気液界面培養する工程、を含む、項［７］または［８］に記載の方法。
［１０］ 工程（ｄ）が、内壁に突起を有する筒状のデバイスを用い、突起を基部組織層または真皮組織層に係合させて、培養を行うものである、項［７］～［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］ 工程（ｄ）が、上下に貫通する複数の穴を有する台座を用い、前記デバイスを前記台座に載せて、培養を行うものである、項［１０］に記載の方法。
［１２］ 項［１］～［６］のいずれか１項に記載の人工培養皮膚に、薬剤を接触させること、および、
薬剤接触後の人工培養皮膚を分析して、人工培養皮膚の状態の変化、および人工培養皮膚中の薬剤の状態、から選ばれる少なくとも１つを調べること、
を含む、人工培養皮膚を用いた薬剤の評価方法。
［１］ 脂肪由来幹細胞およびゲルを含む、基部組織層、
基部組織層の上に設けられ、線維芽細胞およびゲルを含む、真皮組織層、および、
真皮組織層の上に設けられ、表皮細胞を含む、表皮層、
を含む、人工培養皮膚。
［２］ 基部組織層のゲルが、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルであり、および、真皮組織層のゲルが、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルである、項［１］に記載の人工培養皮膚。
［３］ 脂肪由来幹細胞が、ヒト脂肪由来幹細胞であり、線維芽細胞が、正常ヒト皮膚線維芽細胞であり、および、表皮細胞が、正常ヒト表皮角化細胞である、項［１］または［２］に記載の人工培養皮膚。
［４］ 表皮層が、気液界面培養によって表皮細胞が分化して形成された角層を有する、項［１］～［３］のいずれか１項に記載の人工培養皮膚。
［５］ 表皮層が、基底膜関連因子、基底細胞関連因子、バリア機能関連因子、および保湿関連因子から選ばれる１つ以上の遺伝子発現が活性化した表皮層である、項［１］～［４］のいずれか１項に記載の人工培養皮膚。
［６］ ＣＯＬ１７Ａ１、ＫＲＴ１５、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＯＣＬＮ、ＨＡＳ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＧＦ１０、およびＶＥＧＦから選ばれる１つ以上の遺伝子の発現が活性化されているか、またはＭＭＰ－１の遺伝子の発現が抑制されている、項［１］～［５］のいずれか１項に記載の人工培養皮膚。
［７］ 項［１］～［６］のいずれか１項に記載の人工培養皮膚を製造する方法であって、
（ａ）脂肪由来幹細胞およびゲルを含む混合物を供給して基部組織層を形成する工程、
（ｂ）基部組織層の上に、線維芽細胞およびゲルを含む混合物を供給して真皮組織層を形成する工程、
（ｃ）真皮組織層の上に、表皮細胞を供給して表皮層を形成する工程、および、
（ｄ）基部組織層、真皮組織層および表皮層を含む積層物を培養する工程、
を含む、人工培養皮膚の製造方法。
［８］ 工程（ｂ）の後に、基部組織層および真皮組織層を含む積層物を培養する工程、をさらに含む、項［７］に記載の方法。
［９］ 工程（ｄ）が、未分化用の培地に積層物を浸漬して培養する工程、分化用の培地に積層物を浸漬して培養する工程、および、分化用の培地で積層物を気液界面培養する工程、を含む、項［７］または［８］に記載の方法。
［１０］ 工程（ｄ）が、内壁に突起を有する筒状のデバイスを用い、突起を基部組織層または真皮組織層に係合させて、培養を行うものである、項［７］～［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］ 工程（ｄ）が、上下に貫通する複数の穴を有する台座を用い、前記デバイスを前記台座に載せて、培養を行うものである、項［１０］に記載の方法。
［１２］ 項［１］～［６］のいずれか１項に記載の人工培養皮膚に、薬剤を接触させること、および、
薬剤接触後の人工培養皮膚を分析して、人工培養皮膚の状態の変化、および人工培養皮膚中の薬剤の状態、から選ばれる少なくとも１つを調べること、
を含む、人工培養皮膚を用いた薬剤の評価方法。
【発明の効果】
【0007】
本発明によれば、良好な皮膚組織（例えば、角層の良好な形成、遺伝子の良好な発現など）を有する人工培養皮膚を提供することができる。また、良好な皮膚組織を有する人工培養皮膚の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】人工培養皮膚１を模式的に示した斜視断面図である。
【図3】人工培養皮膚１の製造を示す概略的な断面図であり、特に、基部組織層１０の形成を示している。
【図4】人工培養皮膚１の製造を示す概略的な断面図であり、特に、真皮組織層２０の形成を示している。
【図5】人工培養皮膚１の製造を示す概略的な断面図であり、特に、基部組織層１０および真皮組織層２０を含む積層物の培養を示している。
【図6】人工培養皮膚１の製造を示す概略的な断面図であり、特に、基部組織層１０および真皮組織層２０を含む積層物の培養後の状態を示している。
【図7】人工培養皮膚１の製造を示す概略的な断面図であり、特に、表皮層３０の形成の準備を示している。
【図8】人工培養皮膚１の製造を示す概略的な断面図であり、特に、積層物の培養の準備を示している。
【図9】人工培養皮膚１の製造に用いる台座の平面図である。
【図10】人工培養皮膚１の製造を示す概略的な断面図であり、特に、積層物の培養を示している。
【図11】人工培養皮膚１の製造を示す概略的な断面図であり、特に、積層物の気液界面培養を示している。
【図12】比較例の人工培養皮膚１Ａを示す概略的な断面図である。
【図13】実施例１および比較例１により得た人工培養皮膚の皮膚切片の画像である。
【図14】実施例１および比較例１により得た人工培養皮膚の皮膚切片の画像である。
【図15】実施例２により得た人工培養皮膚の皮膚切片の画像である。
【図16】実施例２、比較例２および３により得た人工培養皮膚の皮膚切片の画像である。
【図17】実施例２、比較例２および３により得た人工培養皮膚の皮膚切片の画像である。
【図18】免疫染色の結果（Ｃｏｌｌａｇｅｎ４、Ｃｏｌｌａｇｅｎ１７）を示す画像である。
【図19】免疫染色の結果（Ｃｏｌｌａｇｅｎ７、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ）を示す画像である。
【図20】免疫染色の結果（ＣＫ１５、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ）を示す画像である。
【図21】免疫染色の結果（ＦＬＧ、ＨＡＳ１）を示す画像である。
【図22】ＰＣＲ測定の結果を示すグラフ（ＣＯＬ４Ａ１）である。
【図23】ＰＣＲ測定の結果を示すグラフ（ＣＯＬ７Ａ１）である。
【図24】ＰＣＲ測定の結果を示すグラフ（ＣＯＬ１７Ａ１）である。
【図25】ＰＣＲ測定の結果を示すグラフ（ＣＫ１５）である。
【図26】ＰＣＲ測定の結果（ＯＣＬＮ）を示すグラフである。
【図27】ＰＣＲ測定の結果（ＨＡＳ１）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、本発明の人工培養皮膚およびその製造方法の実施の形態を、図１～図１１を参照して説明する。
なお、以下の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、本発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。
なお、以下の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、本発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。
【0010】
人工培養皮膚
まず、本発明に係る人工培養皮膚（以下、「本発明人工培養皮膚」とも称する）について、図１を参照して説明する。図１は、人工培養皮膚の一実施形態である人工培養皮膚１を模式的に示した斜視断面図である。
まず、本発明に係る人工培養皮膚（以下、「本発明人工培養皮膚」とも称する）について、図１を参照して説明する。図１は、人工培養皮膚の一実施形態である人工培養皮膚１を模式的に示した斜視断面図である。
【0011】
人工培養皮膚１は、基部組織層１０、真皮組織層２０、および表皮層３０を含む。基部組織層１０、真皮組織層２０、および表皮層３０は、この順に積層されている。真皮組織層２０は基部組織層１０に接して配置され、表皮層３０は真皮組織層２０に接して配置されている。人工培養皮膚１は、基部組織層１０、真皮組織層２０および表皮層３０の３つの層が、積層された方向（図１における上下方向、以下、積層方向と称する）と直交する平面に沿った所定方向に延びて形成されている。ここで、便宜上、前記平面に沿った所定方向について、図１における左右方向を、以下、第１方向と称し、第１方向および上下方向の両方に直交する方向（図１における斜め方向）を、以下、第２方向と称する。
【0012】
基部組織層１０は、脂肪由来幹細胞１１（第１細胞とも称する）およびゲル１２（第１のゲルとも称する）を含む。基部組織層１０は、ゲル１２中で脂肪由来幹細胞１１を培養することにより形成されたものである。基部組織層１０は、人工培養皮膚１の下部に配置される。ゲル１２は、脂肪由来幹細胞の周囲の組織として機能する。ゲル１２としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。良好な皮膚組織（特に表皮層および真皮組織層）を得る観点から、基部組織層のゲルは、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルであることが好ましく、フィブリンゲルであることがさらに好ましい。
【0013】
本発明の人工培養皮膚においては、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ：Ａｄｉｐｏｓｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）を含む層が、線維芽細胞を含む層の下に配置される。脂肪由来幹細胞は、皮下脂肪組織などに存在しており、脂肪以外にも分化することが可能な間葉系幹細胞である。脂肪に分化する場合、間葉系幹細胞（脂肪由来幹細胞）から、前駆脂肪細胞を経て、成熟脂肪細胞へと分化する。多分化能を有し、比較的簡便に多量の細胞を採取できる利点を有する。再生医療分野でも開発が進められている。本発明においては、脂肪由来幹細胞の層を設けることにより、皮膚組織の状態の向上が見出された。具体的には、後述の実施例で示すように、脂肪由来幹細胞の層を設けることにより、表皮層の状態の著しい向上（例えば、角層の良好な形成、遺伝子発現など）が見出された。また、後述の実施例で示すように、脂肪由来幹細胞の層を設けることにより、真皮組織層およびそれを含む皮膚組織全体の状態の向上（遺伝子発現など）も見出された。理論に縛られるものではないが、表皮層および真皮組織層の状態の向上は、脂肪由来幹細胞から分泌される物質（エクソソームなどの細胞外小胞や各種サイトカイン等）の影響により、基部組織層による上層としての表皮層および真皮組織層の安定化などに関係しているものと推測される。
【0014】
脂肪由来幹細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト脂肪由来幹細胞が好ましい。ヒト脂肪由来幹細胞としては、ヒト皮下脂肪由来幹細胞が好ましい。脂肪由来幹細胞は、継代数などを重ねておらず（例えば、継代数が３以下、２以下または１以下）、かつ分化誘導していない高い幹細胞性を有する脂肪由来幹細胞が好ましい。
【0015】
基部組織層は、皮下組織を模したものとなり得る。すなわち、ヒトなどの動物の実際の皮下組織においては、脂肪由来幹細胞の周囲に脂肪細胞や疎性結合組織、パチニ小体などが存在する。そして、皮下組織は、表皮と真皮を支える。基部組織層は、皮下組織と同様に、表皮層および真皮組織層を支えるものとなる。本発明の人工培養皮膚においては、基部組織層が皮下組織的な機能を果たし、人工培養皮膚をより実際の皮膚に近づけるものである。
【0016】
ここで、基部組織層１０は、ゲル１２中で脂肪由来幹細胞１１を培養することにより形成されるものであるが、基部組織層１０に含まれる細胞は、脂肪由来幹細胞１１が分化した細胞であってもよい。人工培養皮膚１は、培養の工程を経て得られるものであり、脂肪由来幹細胞１１は、上記のように分化能を有し得るからである。したがって、基部組織層１０は、脂肪由来幹細胞１１のみを含む層であってもよいし、脂肪由来幹細胞１１と、脂肪由来幹細胞１１から分化した細胞を含む層であってもよいし、あるいは、脂肪由来幹細胞１１から分化した細胞のみを含む層であってもよい。
【0017】
真皮組織層２０は、線維芽細胞２１（第２細胞とも称する）およびゲル２２（第２のゲルとも称する）を含む。真皮組織層２０は、基部組織層１０の上に設けられている。真皮組織層２０は、ゲル２２中で線維芽細胞２１を培養することにより形成されたものである。真皮組織層２０は、人工培養皮膚１の中間（基部組織層１０と表皮層３０の間）に配置される。ゲル２２は、細胞外マトリックスとして機能する。ゲル２２としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。良好な皮膚組織（特に表皮層および真皮組織層）を得る観点から、真皮組織層のゲルは、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルであることが好ましく、フィブリンゲルであることがさらに好ましい。
【0018】
線維芽細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来線維芽細胞が好ましい。ヒト由来線維芽細胞としては、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ：Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、ヒト肺線維芽細胞（ＨＰＦ：Ｈｕｍａｎ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ：Ｈｕｍａｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、ヒト大動脈外膜線維芽細胞（ＨＡｏＡＦ：Ｈｕｍａｎ Ａｏｒｔｉｃ Ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、ヒト子宮線維芽細胞（ＨＵＦ：Ｈｕｍａｎ Ｕｔｅｒｉｎｅ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、ヒト絨毛間葉系線維芽細胞（ＨＶＭＦ：Ｈｕｍａｎ Ｖｉｌｌｏｕｓ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）などが挙げられ、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）が好ましい。
【0019】
真皮組織層は、実際の真皮を模したものとなり得る。すなわち、ヒトなどの動物の実際の真皮においては、線維芽細胞などの細胞が存在し、その細胞の周囲にコラーゲンなどの細胞外マトリックスが存在する。真皮組織層は、実際の真皮と同様に、細胞および細胞外マトリックスを含むものとなる。本発明の人工培養皮膚においては、真皮組織層が真皮的な機能を果たし、人工培養皮膚をより実際の皮膚に近づけるものである。
【0020】
ここで、各層のゲルについて、基部組織層１０のゲル１２（第１のゲル）が、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルであり、および、真皮組織層２０のゲル２２（第２のゲル）が、コラーゲンゲルまたはフィブリンゲルであることが好ましい。また、第１のゲルと第２のゲルとが同じゲルであることが好ましい。例えば、第１のゲルおよび第２のゲルがどちらもコラーゲンゲルであり、あるいは、第１のゲルおよび第２のゲルがどちらもフィブリンゲルであってもよい。第１のゲルおよび第２のゲルがどちらもフィブリンゲルであることがより好ましい。
【0021】
各層のゲルは、液状のゲル成分を固化させることによって得られ得る。コラーゲンゲルは、例えば、中性条件下にてコラーゲンの溶液を３７℃に加熱（インキュベーション）することによって得ることができる。フィブリンゲルは、例えば、フィブリノーゲンに、凝固剤として機能するトロンビンを添加することによって得ることができる。細胞を含有するゲルは、液状のゲル成分に細胞懸濁液を混合し、この混合物を固化させることで、細胞を含有する各層（基部組織層１０および真皮組織層２０）のゲルを形成することができる。
【0022】
表皮層３０は、表皮細胞３１（第３細胞とも称する）を含む。表皮層３０は、真皮組織層２０の上に設けられている。表皮層３０は、真皮組織層２０上に表皮細胞３１を播種して培養することにより形成されたものである。表皮細胞３１としては、例えば、表皮角化細胞を使用することができる。
【0023】
表皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来表皮細胞が好ましい。ヒト由来表皮細胞としては、表皮角化細胞、表皮メラノサイトが挙げられ、表皮角化細胞が好ましい。表皮角化細胞としては、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ：Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）が挙げられる。表皮メラノサイトとしては、正常ヒト表皮メラノサイト（ＮＨＥＭ：Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）が挙げられる。好適なヒト皮膚モデルを得る観点から、表皮細胞は、正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）であることが好ましい。本発明の人工培養皮膚においては、脂肪由来幹細胞が、ヒト脂肪由来幹細胞であり、線維芽細胞が、正常ヒト皮膚線維芽細胞であり、および、表皮細胞が、正常ヒト表皮角化細胞であることが好ましい。
【0024】
ここで、表皮細胞３１は、培養により分化し得るが、人工培養皮膚１の表皮層３０は、分化した表皮細胞３１も含めた表皮細胞３１全体で構成され得る。表皮細胞３１は、分化して、例えば、基底層、有棘層、顆粒層および角層を含む表皮の各層を形成し得る。このように、人工培養皮膚の表皮層は、実際の表皮を模したものとなり得る。すなわち、ヒトなどの動物の実際の表皮においては、表皮細胞が存在し、その表皮細胞が分化して、表皮の各層を形成し得る。本発明の人工培養皮膚においては、表皮層が実際の表皮と同様の機能を果たし、人工培養皮膚をより実際の皮膚に近づけるものである。そして、本発明の人工培養皮膚においては、皮下組織に対応する基部組織層、真皮に対応する真皮組織層、および表皮に対応する表皮層を有するため、実際の皮膚（特にヒト皮膚）に近い人工培養皮膚を得ることができる。
【0025】
人工培養皮膚１の表皮層３０は、後述するように、気液界面培養によって表皮細胞が分化して形成された角層を有し得る。そのため、人工培養皮膚１は、実際の皮膚の状態に近い皮膚モデルを提供することができる。
【0026】
また、表皮層３０は、後述の実施例で示すように、基底膜関連因子、基底細胞関連因子、バリア機能関連因子、および保湿関連因子から選ばれる１つ以上の遺伝子発現が活性化した表皮層であり得る。そのため、人工培養皮膚１は、良好な表皮層を有する皮膚モデルを提供することができる。また、人工培養皮膚１は、ＣＯＬ１７Ａ１、ＫＲＴ１５、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＯＣＬＮ、ＨＡＳ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＧＦ１０、およびＶＥＧＦから選ばれる１つ以上の遺伝子の発現が活性化されているか、またはＭＭＰ－１の遺伝子の発現が抑制されている人工培養皮膚であり得る。そのため、人工培養皮膚１は、良好な表皮層および真皮組織層を有する皮膚モデルを提供することができる。
【0027】
ここで、ＣＯＬ１７Ａ１は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ １７に関する遺伝子である。ＫＲＴ１５は、Ｋｅｒａｔｉｎ １５に関する遺伝子である。ＣＯＬ４Ａ１は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ４に関する遺伝子である。ＣＯＬ７Ａ１は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ７に関する遺伝子である。ＯＣＬＮは、Ｏｃｃｌｕｄｉｎに関する遺伝子である。ＨＡＳ１は、Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ Ｓｙｎｔｈａｓｅ １に関する遺伝子である。ＣＯＬ１Ａ１は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ １に関する遺伝子である。ＦＧＦ１０は、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ １０に関する遺伝子である。ＶＥＧＦは、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒに関する遺伝子である。ＭＭＰ－１は、Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１に関する遺伝子である。これらは公知の遺伝子であり、皮膚に関係する遺伝子であることが知られている。皮膚の遺伝子発現については、適宜公知の文献等を参照することができ、例えば、Journal of Histochemistry & Cytochemistry 2015, Vol. 63(2) 129-141などの文献を参照でき、また、ヒトタンパク質発現情報データベース The Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org/）などの情報を参照することができる。
【0028】
人工培養皮膚の製造方法
以下、人工培養皮膚の製造方法の一例として、人工培養皮膚１の製造方法について、図２～図１１を参照して説明する。なお、以下の説明は、上記の人工培養皮膚の好ましい態様を説明するものでもある。
以下、人工培養皮膚の製造方法の一例として、人工培養皮膚１の製造方法について、図２～図１１を参照して説明する。なお、以下の説明は、上記の人工培養皮膚の好ましい態様を説明するものでもある。
【0029】
本発明に係る人工培養皮膚の製造方法は、
（ａ）脂肪由来幹細胞およびゲルを含む混合物を供給して基部組織層を形成する工程、
（ｂ）基部組織層の上に、線維芽細胞およびゲルを含む混合物を供給して真皮組織層を形成する工程、
（ｃ）真皮組織層の上に、表皮細胞を供給して表皮層を形成する工程、および、
（ｄ）基部組織層、真皮組織層および表皮層を含む積層物を培養する工程、
を含む。
（ａ）脂肪由来幹細胞およびゲルを含む混合物を供給して基部組織層を形成する工程、
（ｂ）基部組織層の上に、線維芽細胞およびゲルを含む混合物を供給して真皮組織層を形成する工程、
（ｃ）真皮組織層の上に、表皮細胞を供給して表皮層を形成する工程、および、
（ｄ）基部組織層、真皮組織層および表皮層を含む積層物を培養する工程、
を含む。
【0030】
人工培養皮膚の製造方法においては、好ましくは、工程（ｂ）の後に、基部組織層および真皮組織層を含む積層物を培養する工程、をさらに含み得る。また、好ましくは、工程（ｄ）が、未分化用の培地に積層物を浸漬して培養する工程、分化用の培地に積層物を浸漬して培養する工程、および、分化用の培地で積層物を気液界面培養する工程、を含み得る。
【0031】
人工培養皮膚１の製造にあたっては、人工培養皮膚製造用のデバイスを用いる。図２は、人工培養皮膚を製造するためのデバイス４０の概略的な図を示し、図２Ａは、断面図であり、図２Ｂは平面図である。デバイス４０は、培養皿５０に設置されて使用される。デバイス４０と培養皿５０によって、培養槽が形成される。デバイス４０は、例えば、プラスチック製であり、例えば、樹脂を用いた３Ｄプリンターの造形により製造することができる。デバイス４０は、好ましくは、生体適合性を高めるためのコーティング処理（例えば、パリレンコーティング）を施すことができる。細胞培養皿５０は、市販のものを使用することができる。培養槽は、デバイス４０が、培養皿５０に接着剤（例えば、ＰＤＭＳ；ポリジメチルシロキサン）などによって接着されることにより、形成し得る。なお、図２Ａでは、培養皿５０は、底部のみを図示しており、側壁は図示を省略している。
【0032】
デバイス４０は、側壁４１に囲まれ上下方向に貫通する培養空間４３を有する筒状に形成されている。培養空間４３の形状は、四角形筒状であってもよいし、あるいは、円形筒状、楕円形筒状、または六角形筒状などの多角形筒状であってもよい。本形態では、４つの側壁４１が四角形状に配置されて、培養空間４３は、四角形筒状に形成されている。デバイス４０は、筒状の構造が連結した構造であってもよい。１つの筒状の構造が、デバイス４０における細胞培養の一区画となり得る。一区画は、例えば、０．１～５ｃｍ×０．１～５ｃｍの大きさとすることができる。
【0033】
デバイス４０は、内壁に突起を有する筒状のデバイスである。具体的には、デバイス４０の対向する側壁４１および４１には、それぞれ、突起４２が設けられている。突起４２は、それぞれの側壁４１に複数設けられている。突起４２は、デバイス４０の内側に向かって突出している。突起４２は、突起基部４２ａおよび突起基部４２ａよりも横断面の径が大きく形成された突起先端部４２ｂから構成されている。突起先端部４２ｂの径が突起基部４２ａよりも大きくなることで、後述するように、培養中にゲルの収縮が発生した際に、ゲルが突起先端部４２ｂに引っ掛かるため、ゲルの収縮が抑制される。突起４２は、４つの側壁４１のそれぞれに設けられている。なお、引っ掛かり（アンカー）構造として、先端が大きくなる突起４２を示したが、引っ掛かり（アンカー）の構造はこの構造に限定されるものではない。
【0034】
基部組織層１０および真皮組織層２０の形成
上記のデバイス４０を用いて、基部組織層１０および真皮組織層２０を形成する。基部組織層１０および真皮組織層２０の形成は、脂肪由来幹細胞１１およびゲル１２を含む混合物を供給して基部組織層１０を形成する工程（ａ）、および線維芽細胞２１およびゲル２２を含む混合物を供給して真皮組織層２０を形成する工程（ｂ）により行うことができる。
上記のデバイス４０を用いて、基部組織層１０および真皮組織層２０を形成する。基部組織層１０および真皮組織層２０の形成は、脂肪由来幹細胞１１およびゲル１２を含む混合物を供給して基部組織層１０を形成する工程（ａ）、および線維芽細胞２１およびゲル２２を含む混合物を供給して真皮組織層２０を形成する工程（ｂ）により行うことができる。
【0035】
基部組織層１０の形成は、図３に示すように、脂肪由来幹細胞と第１のゲル（固化前のゲル材料）との混合物を培養槽の培養空間４３に注ぎ込むことで行うことができる。第１のゲルの成分としては、コラーゲンまたはフィブリノーゲンが好ましく用いられる。ここで、注ぎ込んだゲルの上端の位置を、突起４２の位置とずらすことが好ましい。具体的には、図３に示すように、この上端の位置を突起４２よりも上にする、あるいは、下にする。これにより、突起４２が、２層の接合部分である基部組織層１０および真皮組織層２０の境界の位置からずれて配置される。そのため、後述するように、突起４２を強固にゲルに引っ掛けることができ、ゲル収縮を確実に抑制することができる。
【0036】
脂肪由来幹細胞と第１のゲルを含む混合物を注ぎ込んだ後、ゲルを固化させる。コラーゲンの場合、例えば、中性条件下３７℃で５～１０分程度インキュベーションすることによりゲルを固化させることができる。また、フィブリノーゲンの場合、冷却下でフィブリノーゲンとトロンビンを含む混合物を調製し、この混合物を室温下でデバイス４０に注ぎ込むことにより直ちに固化させることができる。ゲルの固化により、基部組織層１０が形成される。基部組織層１０の形成の後、真皮組織層２０を形成する。
【0037】
真皮組織層２０の形成は、図４に示すように、線維芽細胞と第２のゲルとの混合物を培養槽の培養空間４３（図３参照）に注ぎ込むことで行うことができる。第２のゲルの成分としては、コラーゲンまたはフィブリノーゲンが好ましく用いられる。
【0038】
線維芽細胞と第２のゲルを含む混合物を注ぎ込んだ後、ゲルを固化させる。コラーゲンの場合、例えば、中性条件下３７℃で５～１０分程度インキュベーションすることによりゲルを固化させることができる。また、フィブリノーゲンの場合、冷却下でフィブリノーゲンとトロンビンを含む混合物を調製し、この混合物を室温下でデバイス４０に注ぎ込むことにより直ちに固化させることができる。ゲルの固化により、真皮組織層２０が形成される。
【0039】
次に、基部組織層１０と真皮組織層２０との積層物を培養する。培養は、積層物を培地に浸漬して行うことができる。例えば、図５に示すように、積層物が完全に培地に浸かるように培地６０を培養皿５０に入れて、培養を行うことができる。培地としては、脂肪由来幹細胞用の培地と線維芽細胞用の培地との混合物（例えば、混合比１：２～２：１、具体的には１：１）を用いることができる。培養条件は、例えば、３７℃の温度下で、１日～１４日間、好ましくは３日～１０日間、より好ましくは６～８日間である。
【0040】
培養によって基部組織層１０と真皮組織層２０のゲルは収縮する。ここで、ゲルは、突起４２に引っ掛かって係合するため、積層方向の収縮は拘束されないが、積層方向と直交する水平な方向（第１方向および第２方向）の収縮は拘束される。また、ゲルは、積層方向への収縮により、突起４２の外周に圧着されることになる。このため、ゲルと突起４２との引っ掛かりが大きくなり、第１方向および第２方向への収縮に対する抵抗力が大きくなる。このように、突起４２を基部組織層１０または真皮組織層２０に係合させて、培養を行うことができる。それにより、ゲルの収縮が抑制されて、良好な形状の人工培養皮膚１を得ることができる。
【0041】
基部組織層１０および真皮組織層２０を含む積層物の培養が完了することにより、積層物は、図６に示すように、ゲルが収縮した形状となる。ここで、上記で述べたように、積層物は、第１方向および第２方向の収縮が、積層方向の収縮よりも抑制されている。
【0042】
表皮層３０の形成
表皮層３０の形成は、表皮細胞を供給して表皮層を形成する工程（ｃ）により行うことができる。具体的には、表皮層３０の形成は、図７に示すように、培地を除去して、基部組織層１０と真皮組織層２０の積層物を露出させ、この上（すなわち、真皮組織層２０の上）に表皮細胞３１を播種することにより行うことができる。その際、表皮細胞３１が流れたり落ちたりすることを防止するために筒状体４４（例えば、プラスチック製のリング）などを置き、その筒状体４４の中に表皮細胞３１を含む細胞懸濁液を注ぎ込むことができる。表皮細胞３１の播種後、数時間（例えば、１～２４時間）放置すると、表皮細胞３１は、真皮組織層２０に接着する。接着後、筒状体４４を除去する。これにより、基部組織層１０と真皮組織層２０と表皮層３０を含む積層物が形成される。なお、筒状体４４を除去すると、表皮層３０は少し広がることがある。
表皮層３０の形成は、表皮細胞を供給して表皮層を形成する工程（ｃ）により行うことができる。具体的には、表皮層３０の形成は、図７に示すように、培地を除去して、基部組織層１０と真皮組織層２０の積層物を露出させ、この上（すなわち、真皮組織層２０の上）に表皮細胞３１を播種することにより行うことができる。その際、表皮細胞３１が流れたり落ちたりすることを防止するために筒状体４４（例えば、プラスチック製のリング）などを置き、その筒状体４４の中に表皮細胞３１を含む細胞懸濁液を注ぎ込むことができる。表皮細胞３１の播種後、数時間（例えば、１～２４時間）放置すると、表皮細胞３１は、真皮組織層２０に接着する。接着後、筒状体４４を除去する。これにより、基部組織層１０と真皮組織層２０と表皮層３０を含む積層物が形成される。なお、筒状体４４を除去すると、表皮層３０は少し広がることがある。
【0043】
次に、図８に示すように、積層物（表皮層３０／真皮組織層２０／基部組織層１０）の培養（気液界面培養を含む）の準備のため、デバイス４０と培養皿５０との間に台座５１を挿入する。具体的には、積層物を含むデバイス４０を培養皿５０から一旦取り外し、培養皿５０の上に粗メッシュ状の台座５１を置き、その台座５１の上に、積層物を含むデバイス４０を置く。そして、培養皿５０に、積層物が浸漬するように培地を入れる。
【0044】
図９は、台座５１の平面図（上下方向に沿って見た図）である。台座５１は、デバイス４０と同様に、例えば、プラスチック製であり、例えば、樹脂を用いた３Ｄプリンターの造形により製造することができる。台座５１は、粗メッシュ状となっており、上下に貫通する穴５２を複数有している。穴５２は、デバイス４０の培養槽（筒状の構造）よりも小さい。そして、台座５１の下は、培地６０が通ることができる。このため、培地は、台座５１の下を通って積層物の下面（すなわち基部組織層１０の底部）に接触することができる。このように、上下に貫通する複数の穴５２を有する台座５１を用い、デバイス４０を台座５１に載せて、培養を行うことが好ましい。それにより、培地が穴５２を通り抜けることができるので、培地基部組織層１０の底面に培地を接触させることができ、脂肪由来幹細胞に培地成分を供給することが容易になる。また、台座５１を設けることにより、真皮組織層２０の上面の位置が上がるため、気液界面培養をより安定して行うことが可能になる。
【0045】
次いで、図１０で示すように、積層物（表皮層３０／真皮組織層２０／基部組織層１０）を培養する。培養は、好ましくは、未分化用の培地に積層物を浸漬して培養し、次いで、分化用の培地に積層物を浸漬して培養し、その後、分化用の培地で積層物を気液界面培養することができる。培地としては、脂肪由来幹細胞用の培地と、線維芽細胞用の培地と、表皮細胞用の培地との混合物（例えば、混合比１～２：１～２：１～２、具体的には混合比１：１：１）を用いることができる。培地は、例えば、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を含まない培地を未分化用の培地とし、この未分化用の培地に塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を添加した培地を分化用の培地とすることができる。塩化カルシウムは、細胞、特に表皮細胞の分化を促進し得る成分である。培養においては、まず、未分化用の培地（分化を促進する成分を含有しない培地）で培養する。これにより、各細胞を安定化することができる。そして、培地交換して、分化用の培地（分化を促進する成分を含有する培地）で培養する。これにより、分化能を有する細胞（特に表皮細胞）の分化を開始させることができる。未分化用の培地による培養は、例えば、１～１４日間（具体例として７日間）行うことでき、分化用の培地による培養は、例えば、１～７日間（具体例として３日間）行うことできる。
【0046】
そして、図１１に示すように、積層物を気液界面培養する。気液界面培養においては、まず、培地を一旦除去した後、再度、培地を培養皿５０に入れる。その際、培地の上端の位置を真皮組織層２０の上面と同じかそれよりも少し下に配置するようにする。図１１では、培地６０が真皮組織層２０の上面よりも少し下に配置されている。これにより、表皮層３０を気体に曝すとともに、基部組織層１０および真皮組織層２０を液体に浸漬しながら、培養（気体と液体との界面での培養）を行うことができる。気液界面培養は、例えば、３日～４週間行うことができる。気液界面培養により、表皮細胞の分化を促進させることができるとともに、表皮細胞の角化を進行させることができる。このように、工程（ｄ）は、本例においては、未分化用の培地に積層物を浸漬して培養する工程、分化用の培地に積層物を浸漬して培養する工程、および、分化用の培地で積層物を気液界面培養する工程を含むものである。
【0047】
気液界面培養により、表皮細胞３１が分化誘導される。これにより、表皮細胞３１は、角質を含んだ表皮層３０を形成することができる。実際のヒト表皮は、下から順に、基底層、有棘層、顆粒層、および角層を有しており、これを模した層構成を形成し得る。
【0048】
以上の操作により、図１に示すような、人工培養皮膚１を製造することができる。上記のようにして製造された人工培養皮膚１は、後述の実施例で示すように、皮膚の状態、特に表皮層の状態が良好で（例えば、角層の良好な形成、遺伝子発現など）、また、皮膚組織全体の状態も良好で（例えば、遺伝子発現など）、より実際の皮膚に近いものである。
【0049】
薬剤の評価方法
本発明は、さらなる態様として、上記の人工培養皮膚を用いた薬剤の評価方法に関する。薬剤の評価方法は、上記の人工培養皮膚に、薬剤を接触させること、および、薬剤接触後の人工培養皮膚を分析して、人工培養皮膚の状態の変化、および人工培養皮膚中の薬剤の状態、から選ばれる少なくとも１つを調べること、を含む。この方法により、皮膚に対する薬剤の有効性または毒性あるいは刺激性などを評価することができる。ここで、薬剤とは、評価対象となる物質のことを意味する。薬剤には、医薬品等の薬物、化粧品や医薬部外品などが含まれる。薬剤は、単一の成分であってもよし、２つ以上の成分を含む組成物や製剤であってもよい。薬剤の成分としては、有機化合物、無機化合物などが含まれ得る。人工培養皮膚の状態の変化としては、皮膚組織（角層、表皮層、真皮組織層など）の外観の変化、遺伝子発現の変化、薬剤の接触による刺激に対する応答などが挙げられる。人工培養皮膚中の薬剤の状態としては、皮膚組織への薬剤の浸透性や保持性などが挙げられる。
本発明は、さらなる態様として、上記の人工培養皮膚を用いた薬剤の評価方法に関する。薬剤の評価方法は、上記の人工培養皮膚に、薬剤を接触させること、および、薬剤接触後の人工培養皮膚を分析して、人工培養皮膚の状態の変化、および人工培養皮膚中の薬剤の状態、から選ばれる少なくとも１つを調べること、を含む。この方法により、皮膚に対する薬剤の有効性または毒性あるいは刺激性などを評価することができる。ここで、薬剤とは、評価対象となる物質のことを意味する。薬剤には、医薬品等の薬物、化粧品や医薬部外品などが含まれる。薬剤は、単一の成分であってもよし、２つ以上の成分を含む組成物や製剤であってもよい。薬剤の成分としては、有機化合物、無機化合物などが含まれ得る。人工培養皮膚の状態の変化としては、皮膚組織（角層、表皮層、真皮組織層など）の外観の変化、遺伝子発現の変化、薬剤の接触による刺激に対する応答などが挙げられる。人工培養皮膚中の薬剤の状態としては、皮膚組織への薬剤の浸透性や保持性などが挙げられる。
【0050】
上記評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の皮膚に近い皮膚モデルで薬剤の評価を行うことができる。また、上記評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用である。
【実施例0051】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0052】
デバイスおよび培養槽の調製
図２に記載するようなデバイス（１ディッシュあたり６区画、プラスチック製、高さ６ｍｍ）を、３Ｄプリンター（キーエンス、Ａｇｉｌｉｓｔａ－３１００）で造形した。次いで、造形物をパリレンコーター（日本パリレン、ＰＤＳ２０１０）でパリレンコーティングし、培養皿（直径６ｃｍ）に入れて、ＰＤＭＳポリマー（ダウ・東レ株式会社、ＳＩＬＰＯＴ １８４ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｅｌａｓｔｍｅｒ）で固定した。培養皿の底に、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（日油、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ－ＣＭ５２０６）０．５％を含む１００％エタノール溶液を数滴滴下し、加熱処理でコーティングした。
図２に記載するようなデバイス（１ディッシュあたり６区画、プラスチック製、高さ６ｍｍ）を、３Ｄプリンター（キーエンス、Ａｇｉｌｉｓｔａ－３１００）で造形した。次いで、造形物をパリレンコーター（日本パリレン、ＰＤＳ２０１０）でパリレンコーティングし、培養皿（直径６ｃｍ）に入れて、ＰＤＭＳポリマー（ダウ・東レ株式会社、ＳＩＬＰＯＴ １８４ Ｓｉｌｉｃｏｎｅ Ｅｌａｓｔｍｅｒ）で固定した。培養皿の底に、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（日油、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ－ＣＭ５２０６）０．５％を含む１００％エタノール溶液を数滴滴下し、加熱処理でコーティングした。
【0053】
ＡＤＳＣ（脂肪由来幹細胞）は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌから入手した。ＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚線維芽細胞）は、ＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｒｐから入手した。ＮＨＥＫ（正常ヒト表皮角化細胞）は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌから入手した。
【0054】
実施例１．コラーゲンゲルを用いた人工培養皮膚の製造
ＡＤＳＣ細胞懸濁液
ＡＤＳＣ培養用の培地（以下「ＡＤＳＣ用培地」と称する）として、ペニシリンとストレプトマイシンが添加されたＭＳＣＧＭ２（Ｃ－２８００９、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を用いた。ＡＤＳＣ（脂肪由来幹細胞）をＡＤＳＣ用培地に懸濁させ、ＡＤＳＣの細胞懸濁液（０．７～２×１０５個／ｍＬ）を調製した。
ＡＤＳＣ細胞懸濁液
ＡＤＳＣ培養用の培地（以下「ＡＤＳＣ用培地」と称する）として、ペニシリンとストレプトマイシンが添加されたＭＳＣＧＭ２（Ｃ－２８００９、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を用いた。ＡＤＳＣ（脂肪由来幹細胞）をＡＤＳＣ用培地に懸濁させ、ＡＤＳＣの細胞懸濁液（０．７～２×１０５個／ｍＬ）を調製した。
【0055】
ＮＨＤＦ細胞懸濁液
ＮＨＤＦ培養用の培地（以下「ＮＨＤＦ用培地」と称する）として、１０％ＦＢＳを含み、アスコルビン酸およびペニシリンとストレプトマイシンが添加された、ＤＭＥＭ（０８４５９－６４、ナカライテスク）を用いた。ＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚線維芽細胞）をＮＨＤＦ用培地に懸濁させ、ＮＨＤＦの細胞懸濁液（０．７～２×１０５個／ｍＬ）を調製した。
ＮＨＤＦ培養用の培地（以下「ＮＨＤＦ用培地」と称する）として、１０％ＦＢＳを含み、アスコルビン酸およびペニシリンとストレプトマイシンが添加された、ＤＭＥＭ（０８４５９－６４、ナカライテスク）を用いた。ＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚線維芽細胞）をＮＨＤＦ用培地に懸濁させ、ＮＨＤＦの細胞懸濁液（０．７～２×１０５個／ｍＬ）を調製した。
【0056】
ＮＨＥＫ細胞懸濁液
ＮＨＥＫ培養用の培地（以下「ＮＨＥＫ用培地」と称する）として、ＫＧＭ２（Ｃ－２０１１１、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を用いた。ＮＨＥＫ（正常ヒト表皮角化細胞）をＮＨＥＫ用培地に懸濁させ、ＮＨＥＫの細胞懸濁液（０．７～４×１０５個／ｍＬ）を調製した。
ＮＨＥＫ培養用の培地（以下「ＮＨＥＫ用培地」と称する）として、ＫＧＭ２（Ｃ－２０１１１、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を用いた。ＮＨＥＫ（正常ヒト表皮角化細胞）をＮＨＥＫ用培地に懸濁させ、ＮＨＥＫの細胞懸濁液（０．７～４×１０５個／ｍＬ）を調製した。
【0057】
コラーゲンゲル材料
コラーゲンゲルの材料として、コラーゲン酸性溶液（ＩＡＣ－５０、アテロコラーゲン、高研）を使用した。
コラーゲンゲルの材料として、コラーゲン酸性溶液（ＩＡＣ－５０、アテロコラーゲン、高研）を使用した。
【0058】
ＡＤＳＣ／コラーゲン混合液
氷冷中で、コラーゲン酸性溶液と、１０×ＰＢＳ（Ｄ１４０８、Ｓｉｇｍａ）溶液と、ＡＤＳＣの細胞懸濁液とを、９：１：５の割合で混合し、ＡＤＳＣ／コラーゲン混合液を調製した。
氷冷中で、コラーゲン酸性溶液と、１０×ＰＢＳ（Ｄ１４０８、Ｓｉｇｍａ）溶液と、ＡＤＳＣの細胞懸濁液とを、９：１：５の割合で混合し、ＡＤＳＣ／コラーゲン混合液を調製した。
【0059】
ＮＨＤＦ／コラーゲン混合液
氷冷中で、コラーゲン酸性溶液と、１０×ＰＢＳ（Ｄ１４０８、Ｓｉｇｍａ）溶液と、ＮＨＤＦの細胞懸濁液とを、９：１：５の割合で混合し、ＮＨＤＦ／コラーゲン混合液を調製した。
氷冷中で、コラーゲン酸性溶液と、１０×ＰＢＳ（Ｄ１４０８、Ｓｉｇｍａ）溶液と、ＮＨＤＦの細胞懸濁液とを、９：１：５の割合で混合し、ＮＨＤＦ／コラーゲン混合液を調製した。
【0060】
細胞播種およびインキュベーション
デバイスに、ＡＤＳＣ／コラーゲン混合液を加え、３７℃でインキュベーターに５～１０分間静置して、コラーゲンを固化させ、ＡＤＳＣゲル層（基部組織層）を得た（図３参照）。ＡＤＳＣゲル層の上に、ＮＨＤＦ／コラーゲン混合液を加え、３７℃でインキュベーターに５～１０分間静置して、コラーゲンを固化させ、ＮＨＤＦゲル層（真皮組織層）を得た（図４参照）。ＡＤＳＣゲル層およびＮＨＤＦゲル層の積層物が浸漬するように、ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地を１：１で混合した培地を加えた（図５参照）。得られた細胞含有ゲルを含むデバイスを５日間、インキュベートした。インキュベートによりゲルは収縮したが、デバイスの突起により、ゲル収縮は、突起がない場合に比べて抑えられた（図６参照）。
ゲル外の培地を、ＮＨＤＦゲル層の表面が露出するまで除去した。ＮＨＤＦゲル層の上に、リングを置き、リング内にＮＨＥＫの細胞懸濁液を加えた（図７参照）。３時間静置すると、ＮＨＥＫがＮＨＤＦゲル層に接着した。リングを取り除いた。ゲル外の培地を除去し、ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地を加えて、得られた細胞含有ゲル積層物を培地に浸漬させ、１日間、インキュベートした。
積層物を含むデバイスを培養皿から取り外し、培養皿の上に粗メッシュ状の台座を置き、その台座の上に、積層物を含むデバイスを置いた（図８参照）。ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地を加え、積層物を培地に浸漬させ、７日間、インキュベートした（図１０参照）。
ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地に、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を添加して、１．８ｍＭのＣａＣｌ２を含む培地（細胞分化用培地）を調製した。なお、塩化カルシウムを添加する前の培地は、細胞を未分化のまま維持させる培地（細胞未分化用培地）であり、塩化カルシウムを添加した培地は、細胞分化用培地である。
培地を、細胞分化用培地に培地交換し、積層物を培地に浸漬させ、３日間、インキュベートした。次いで、培地を除去した後、細胞分化用培地を、ＮＨＤＦゲル層の上面よりもわずかに下の位置に培地の表面が位置するように加えた。これにより、コラーゲンゲル部分が培地に浸漬し、ＮＨＥＫが培地の外に配置され、気液界面培養が可能になった（図１１参照）。積層物を、１～３週間、インキュベートした。インキュベートにより、ＮＨＥＫは分化し、表皮層に対応する構造が形成された。これにより、人工培養皮膚１が得られた。
得られた人工培養皮膚１をデバイスから取り出し、後述の試験を行った。
デバイスに、ＡＤＳＣ／コラーゲン混合液を加え、３７℃でインキュベーターに５～１０分間静置して、コラーゲンを固化させ、ＡＤＳＣゲル層（基部組織層）を得た（図３参照）。ＡＤＳＣゲル層の上に、ＮＨＤＦ／コラーゲン混合液を加え、３７℃でインキュベーターに５～１０分間静置して、コラーゲンを固化させ、ＮＨＤＦゲル層（真皮組織層）を得た（図４参照）。ＡＤＳＣゲル層およびＮＨＤＦゲル層の積層物が浸漬するように、ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地を１：１で混合した培地を加えた（図５参照）。得られた細胞含有ゲルを含むデバイスを５日間、インキュベートした。インキュベートによりゲルは収縮したが、デバイスの突起により、ゲル収縮は、突起がない場合に比べて抑えられた（図６参照）。
ゲル外の培地を、ＮＨＤＦゲル層の表面が露出するまで除去した。ＮＨＤＦゲル層の上に、リングを置き、リング内にＮＨＥＫの細胞懸濁液を加えた（図７参照）。３時間静置すると、ＮＨＥＫがＮＨＤＦゲル層に接着した。リングを取り除いた。ゲル外の培地を除去し、ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地を加えて、得られた細胞含有ゲル積層物を培地に浸漬させ、１日間、インキュベートした。
積層物を含むデバイスを培養皿から取り外し、培養皿の上に粗メッシュ状の台座を置き、その台座の上に、積層物を含むデバイスを置いた（図８参照）。ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地を加え、積層物を培地に浸漬させ、７日間、インキュベートした（図１０参照）。
ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地に、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を添加して、１．８ｍＭのＣａＣｌ２を含む培地（細胞分化用培地）を調製した。なお、塩化カルシウムを添加する前の培地は、細胞を未分化のまま維持させる培地（細胞未分化用培地）であり、塩化カルシウムを添加した培地は、細胞分化用培地である。
培地を、細胞分化用培地に培地交換し、積層物を培地に浸漬させ、３日間、インキュベートした。次いで、培地を除去した後、細胞分化用培地を、ＮＨＤＦゲル層の上面よりもわずかに下の位置に培地の表面が位置するように加えた。これにより、コラーゲンゲル部分が培地に浸漬し、ＮＨＥＫが培地の外に配置され、気液界面培養が可能になった（図１１参照）。積層物を、１～３週間、インキュベートした。インキュベートにより、ＮＨＥＫは分化し、表皮層に対応する構造が形成された。これにより、人工培養皮膚１が得られた。
得られた人工培養皮膚１をデバイスから取り出し、後述の試験を行った。
【0061】
比較例１．コラーゲンゲルを用いた人工培養皮膚（ＡＤＳＣ非含有）の製造
比較例の人工培養皮膚として、ＡＤＳＣゲル層を有さない人工培養皮膚を製造した。図１２に、比較例で製造した人工培養皮膚１Ａの概略的な断面図を示す。図１２では、人工培養皮膚１Ａは、真皮組織層２０（厚みは実施例１の基部組織層１０と真皮組織層２０を合わせたものに相当）と、表皮層３０とにより構成されている。
比較例の人工培養皮膚として、ＡＤＳＣゲル層を有さない人工培養皮膚を製造した。図１２に、比較例で製造した人工培養皮膚１Ａの概略的な断面図を示す。図１２では、人工培養皮膚１Ａは、真皮組織層２０（厚みは実施例１の基部組織層１０と真皮組織層２０を合わせたものに相当）と、表皮層３０とにより構成されている。
【0062】
細胞懸濁液およびコラーゲン材料
細胞懸濁液およびコラーゲン材料は実施例１と同様のものを用いた。
細胞懸濁液およびコラーゲン材料は実施例１と同様のものを用いた。
【0063】
細胞播種およびインキュベーション
デバイスに、ＮＨＤＦ／コラーゲン混合液を加え、３７℃でインキュベーターに５～１０分間静置して、コラーゲンを固化させた。ＮＨＤＦゲル層が浸漬するように、ＮＨＤＦ用培地を加えた。得られた細胞含有ゲルを含むデバイスを５日間、インキュベートした。
ゲル外の培地を、ＮＨＤＦゲル層の表面が露出するまで除去した。ＮＨＤＦゲル層の上に、リングを置き、リング内にＮＨＥＫの細胞懸濁液を加えた。３時間静置すると、ＮＨＥＫがＮＨＤＦゲル層に接着した。リングを取り除いた。ゲル外の培地を除去し、ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地を加えて、得られた積層物を培地に浸漬させ、１日間、インキュベートした。
積層物を含むデバイスを培養皿から取り外し、培養皿の上に粗メッシュ状の台座を置き、その台座の上に、積層物を含むデバイスを置いた。ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地を加え、積層物を培地に浸漬させ、７日間、インキュベートした。
ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地に、塩化カルシウムを添加して、１．８ｍＭのＣａＣｌ２を含む培地（細胞分化用培地）を調製した。
培地を、細胞分化用培地に培地交換し、積層物を培地に浸漬させ、３日間、インキュベートした。次いで、培地を除去した後、細胞分化用培地を、ＮＨＤＦゲル層の上面よりもわずかに下の位置に培地の表面が位置するように加えた。これにより、コラーゲンゲル部分が培地に浸漬し、ＮＨＥＫが培地の外に配置され、気液界面培養が可能になった。積層物を、１～３週間、インキュベートした。インキュベートにより、ＮＨＥＫは分化し、表皮層に対応する構造が形成された。これにより、人工培養皮膚１Ａが得られた（図１２参照）。
デバイスに、ＮＨＤＦ／コラーゲン混合液を加え、３７℃でインキュベーターに５～１０分間静置して、コラーゲンを固化させた。ＮＨＤＦゲル層が浸漬するように、ＮＨＤＦ用培地を加えた。得られた細胞含有ゲルを含むデバイスを５日間、インキュベートした。
ゲル外の培地を、ＮＨＤＦゲル層の表面が露出するまで除去した。ＮＨＤＦゲル層の上に、リングを置き、リング内にＮＨＥＫの細胞懸濁液を加えた。３時間静置すると、ＮＨＥＫがＮＨＤＦゲル層に接着した。リングを取り除いた。ゲル外の培地を除去し、ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地を加えて、得られた積層物を培地に浸漬させ、１日間、インキュベートした。
積層物を含むデバイスを培養皿から取り外し、培養皿の上に粗メッシュ状の台座を置き、その台座の上に、積層物を含むデバイスを置いた。ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地を加え、積層物を培地に浸漬させ、７日間、インキュベートした。
ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地に、塩化カルシウムを添加して、１．８ｍＭのＣａＣｌ２を含む培地（細胞分化用培地）を調製した。
培地を、細胞分化用培地に培地交換し、積層物を培地に浸漬させ、３日間、インキュベートした。次いで、培地を除去した後、細胞分化用培地を、ＮＨＤＦゲル層の上面よりもわずかに下の位置に培地の表面が位置するように加えた。これにより、コラーゲンゲル部分が培地に浸漬し、ＮＨＥＫが培地の外に配置され、気液界面培養が可能になった。積層物を、１～３週間、インキュベートした。インキュベートにより、ＮＨＥＫは分化し、表皮層に対応する構造が形成された。これにより、人工培養皮膚１Ａが得られた（図１２参照）。
【0064】
実施例２．フィブリンゲルを用いた人工培養皮膚の製造
６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液
１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で６－アミノカプロン酸（６－ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ、Ａ２５０４、Ｍｅｒｃｋ）のＰＢＳ溶液を調製した。
６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液
１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で６－アミノカプロン酸（６－ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ、Ａ２５０４、Ｍｅｒｃｋ）のＰＢＳ溶液を調製した。
【0065】
ＡＤＳＣ細胞懸濁液（フィブリンゲル用）
ＡＤＳＣ培養用の培地（以下「ＡＤＳＣ用培地」と称する）として、ＭＳＣＧＭ２（Ｃ－２８００９、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）に、上記６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を加えた培地（６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を１００倍希釈）を用いた。ＡＤＳＣ（脂肪由来幹細胞）をＡＤＳＣ用培地に懸濁させ、ＡＤＳＣの細胞懸濁液（０．７～２×１０５個／ｍＬ）を調製した。
ＡＤＳＣ培養用の培地（以下「ＡＤＳＣ用培地」と称する）として、ＭＳＣＧＭ２（Ｃ－２８００９、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）に、上記６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を加えた培地（６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を１００倍希釈）を用いた。ＡＤＳＣ（脂肪由来幹細胞）をＡＤＳＣ用培地に懸濁させ、ＡＤＳＣの細胞懸濁液（０．７～２×１０５個／ｍＬ）を調製した。
【0066】
ＮＨＤＦ細胞懸濁液（フィブリンゲル用）
ＮＨＤＦ培養用の培地（以下「ＮＨＤＦ用培地」と称する）として、１０％ＦＢＳを含み、アスコルビン酸およびペニシリンとストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭに、上記６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を加えた培地（６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を１００倍希釈）を用いた。ＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚線維芽細胞）をＮＨＤＦ用培地に懸濁させ、ＮＨＤＦの細胞懸濁液（０．７～２×１０５個／ｍＬ）を調製した。
ＮＨＤＦ培養用の培地（以下「ＮＨＤＦ用培地」と称する）として、１０％ＦＢＳを含み、アスコルビン酸およびペニシリンとストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭに、上記６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を加えた培地（６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を１００倍希釈）を用いた。ＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚線維芽細胞）をＮＨＤＦ用培地に懸濁させ、ＮＨＤＦの細胞懸濁液（０．７～２×１０５個／ｍＬ）を調製した。
【0067】
ＮＨＥＫ細胞懸濁液（フィブリンゲル用）
ＮＨＥＫ培養用の培地（以下「ＮＨＥＫ用培地」と称する）として、ＫＧＭ２（Ｃ－２０１１１、タカラバイオ）に、上記６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を加えた培地（６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を１００倍希釈）を用いた。ＮＨＥＫ（正常ヒト表皮角化細胞）をＮＨＥＫ用培地に懸濁させ、ＮＨＥＫの細胞懸濁液（０．７～２×１０５個／ｍＬ）を調製した。
ＮＨＥＫ培養用の培地（以下「ＮＨＥＫ用培地」と称する）として、ＫＧＭ２（Ｃ－２０１１１、タカラバイオ）に、上記６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を加えた培地（６－アミノカプロン酸ＰＢＳ溶液を１００倍希釈）を用いた。ＮＨＥＫ（正常ヒト表皮角化細胞）をＮＨＥＫ用培地に懸濁させ、ＮＨＥＫの細胞懸濁液（０．７～２×１０５個／ｍＬ）を調製した。
【0068】
フィブリンゲル材料
フィブリンゲルの材料として、フィブリノーゲン（Ｆ８６３０－１Ｇ、Ｍｅｒｃｋ、粉末）を使用し、これをＰＢＳに７．５～２０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解して使用した（フィブリノーゲン液）。
フィブリンゲルの材料として、フィブリノーゲン（Ｆ８６３０－１Ｇ、Ｍｅｒｃｋ、粉末）を使用し、これをＰＢＳに７．５～２０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解して使用した（フィブリノーゲン液）。
【0069】
ＡＤＳＣ／フィブリノーゲン混合液
氷冷中で、フィブリノーゲン液と、５０～１００ＵＮとなるようＰＢＳで希釈したトロンビン（Ｔ４６４８－１０ＫＵ、Ｍｅｒｃｋ）の液と、ＡＤＳＣの細胞懸濁液とを、１０：１：１４の割合で混合し、ＡＤＳＣ／フィブリノーゲン混合液を調製した。
氷冷中で、フィブリノーゲン液と、５０～１００ＵＮとなるようＰＢＳで希釈したトロンビン（Ｔ４６４８－１０ＫＵ、Ｍｅｒｃｋ）の液と、ＡＤＳＣの細胞懸濁液とを、１０：１：１４の割合で混合し、ＡＤＳＣ／フィブリノーゲン混合液を調製した。
【0070】
ＮＨＤＦ／フィブリノーゲン混合液
氷冷中で、フィブリノーゲン液と、５０～１００ＵＮとなるようＰＢＳで希釈したトロンビン（Ｔ４６４８－１０ＫＵ、Ｍｅｒｃｋ）の液と、ＮＨＤＦの細胞懸濁液とを、１０：１：１４の割合で混合し、ＮＨＤＦ／フィブリノーゲン混合液を調製した。
氷冷中で、フィブリノーゲン液と、５０～１００ＵＮとなるようＰＢＳで希釈したトロンビン（Ｔ４６４８－１０ＫＵ、Ｍｅｒｃｋ）の液と、ＮＨＤＦの細胞懸濁液とを、１０：１：１４の割合で混合し、ＮＨＤＦ／フィブリノーゲン混合液を調製した。
【0071】
細胞播種およびインキュベーション
デバイスに、ＡＤＳＣ／フィブリノーゲン混合液を加えた（図３参照）。添加後すぐに、フィブリノーゲンは固化し、フィブリンゲルになった。これにより、ＡＤＳＣゲル層（基部組織層）を得た。ＡＤＳＣゲル層の上に、ＮＨＤＦ／フィブリノーゲン混合液を加えた（図４参照）。添加後すぐに、フィブリノーゲンは固化し、フィブリンゲルになった。これにより、ＮＨＤＦゲル層（真皮組織層）を得た。ＡＤＳＣゲル層およびＮＨＤＦゲル層の積層物が浸漬するように、ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地を１：１で混合した培地を加えた（図５参照）。得られた細胞含有ゲルを含むデバイスを７日間、インキュベートした。インキュベートによりゲルは収縮したが、デバイスの突起により、ゲル収縮は、突起がない場合に比べて抑えられた（図６参照）。
ゲル外の培地を、ＮＨＤＦゲル層の表面が露出するまで除去した。ＮＨＤＦゲル層の上に、リングを置き、リング内にＮＨＥＫの細胞懸濁液を加えた（図７参照）。３時間静置すると、ＮＨＥＫがＮＨＤＦゲル層に接着した。リングを取り除いた。ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地を加え、得られた積層物を培地に浸漬させ、１日間、インキュベートした。
積層物を含むデバイスを培養皿から取り外し、培養皿の上に粗メッシュ状の台座を置き、その台座の上に、積層物を含むデバイスを置いた（図８参照）。ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地（細胞未分化用培地）を加え、積層物を培地に浸漬させ、７日間、インキュベートした（図１０参照）。
ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地に、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を添加して、１．８ｍＭのＣａＣｌ２を含む培地（細胞分化用培地）を調製した。
培地を、細胞分化用培地に培地交換し、積層物を培地に浸漬させ、３日間、インキュベートした。次いで、培地を除去した後、細胞分化用培地を、ＮＨＤＦゲル層の上面よりもわずかに下の位置に培地の表面が位置するように加えた。これにより、フィブリンゲル部分が培地に浸漬し、ＮＨＥＫが培地の外に配置され、気液界面培養が可能になった（図１１参照）。積層物を、１～３週間、インキュベートした。インキュベートにより、ＮＨＥＫは分化し、表皮層に対応する構造が形成された。これにより、人工培養皮膚が得られた。
得られた人工培養皮膚をデバイスから取り出し、後述の試験を行った。
デバイスに、ＡＤＳＣ／フィブリノーゲン混合液を加えた（図３参照）。添加後すぐに、フィブリノーゲンは固化し、フィブリンゲルになった。これにより、ＡＤＳＣゲル層（基部組織層）を得た。ＡＤＳＣゲル層の上に、ＮＨＤＦ／フィブリノーゲン混合液を加えた（図４参照）。添加後すぐに、フィブリノーゲンは固化し、フィブリンゲルになった。これにより、ＮＨＤＦゲル層（真皮組織層）を得た。ＡＤＳＣゲル層およびＮＨＤＦゲル層の積層物が浸漬するように、ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地を１：１で混合した培地を加えた（図５参照）。得られた細胞含有ゲルを含むデバイスを７日間、インキュベートした。インキュベートによりゲルは収縮したが、デバイスの突起により、ゲル収縮は、突起がない場合に比べて抑えられた（図６参照）。
ゲル外の培地を、ＮＨＤＦゲル層の表面が露出するまで除去した。ＮＨＤＦゲル層の上に、リングを置き、リング内にＮＨＥＫの細胞懸濁液を加えた（図７参照）。３時間静置すると、ＮＨＥＫがＮＨＤＦゲル層に接着した。リングを取り除いた。ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地を加え、得られた積層物を培地に浸漬させ、１日間、インキュベートした。
積層物を含むデバイスを培養皿から取り外し、培養皿の上に粗メッシュ状の台座を置き、その台座の上に、積層物を含むデバイスを置いた（図８参照）。ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地（細胞未分化用培地）を加え、積層物を培地に浸漬させ、７日間、インキュベートした（図１０参照）。
ＡＤＳＣ用培地とＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１：１で混合した培地に、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を添加して、１．８ｍＭのＣａＣｌ２を含む培地（細胞分化用培地）を調製した。
培地を、細胞分化用培地に培地交換し、積層物を培地に浸漬させ、３日間、インキュベートした。次いで、培地を除去した後、細胞分化用培地を、ＮＨＤＦゲル層の上面よりもわずかに下の位置に培地の表面が位置するように加えた。これにより、フィブリンゲル部分が培地に浸漬し、ＮＨＥＫが培地の外に配置され、気液界面培養が可能になった（図１１参照）。積層物を、１～３週間、インキュベートした。インキュベートにより、ＮＨＥＫは分化し、表皮層に対応する構造が形成された。これにより、人工培養皮膚が得られた。
得られた人工培養皮膚をデバイスから取り出し、後述の試験を行った。
【0072】
比較例２．フィブリンゲルを用いた人工培養皮膚（ＡＤＳＣ非含有）の製造
比較例の人工培養皮膚として、ＡＤＳＣゲル層を有さない人工培養皮膚を製造した（図１２参照）。
比較例の人工培養皮膚として、ＡＤＳＣゲル層を有さない人工培養皮膚を製造した（図１２参照）。
【0073】
細胞懸濁液およびフィブリン材料
細胞懸濁液およびフィブリン材料は実施例２と同様のものを用いた。
細胞懸濁液およびフィブリン材料は実施例２と同様のものを用いた。
【0074】
細胞播種およびインキュベーション
デバイスに、ＮＨＤＦ／フィブリノーゲン混合液を加えた。フィブリノーゲンはすぐに固化し、フィブリンゲルになった。ＮＨＤＦゲル層が浸漬するように、ＮＨＤＦ用培地を加えた。得られた細胞含有ゲルを含むデバイスを７日間、インキュベートした。
ゲル外の培地を、ＮＨＤＦゲル層の表面が露出するまで除去した。ＮＨＤＦゲル層の上に、リングを置き、リング内にＮＨＥＫの細胞懸濁液を加えた。３時間静置すると、ＮＨＥＫがＮＨＤＦゲル層に接着した。リングを取り除いた。ゲル外の培地を除去し、ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地を加えて、得られた積層物を培地に浸漬させ、１日間、インキュベートした。
積層物を含むデバイスを培養皿から取り外し、培養皿の上に粗メッシュ状の台座を置き、その台座の上に、積層物を含むデバイスを置いた。ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地を加え、積層物を培地に浸漬させ、７日間、インキュベートした。
ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地に、塩化カルシウムを添加して、１．８ｍＭでＣａＣｌ２を含む培地（細胞分化用培地）を調製した。
培地を、細胞分化用培地に培地交換し、積層物を培地に浸漬させ、３日間、インキュベートした。次いで、培地を除去した後、細胞分化用培地を、ＮＨＤＦゲル層の上面よりもわずかに下の位置に培地の表面が位置するように加えた。これにより、フィブリンゲル部分が培地に浸漬し、ＮＨＥＫが培地の外に配置され、気液界面培養が可能になった。積層物を、１～３週間、インキュベートした。インキュベートにより、ＮＨＥＫは分化し、表皮層に対応する構造が形成された。これにより、人工培養皮膚が得られた（図１２参照）。
デバイスに、ＮＨＤＦ／フィブリノーゲン混合液を加えた。フィブリノーゲンはすぐに固化し、フィブリンゲルになった。ＮＨＤＦゲル層が浸漬するように、ＮＨＤＦ用培地を加えた。得られた細胞含有ゲルを含むデバイスを７日間、インキュベートした。
ゲル外の培地を、ＮＨＤＦゲル層の表面が露出するまで除去した。ＮＨＤＦゲル層の上に、リングを置き、リング内にＮＨＥＫの細胞懸濁液を加えた。３時間静置すると、ＮＨＥＫがＮＨＤＦゲル層に接着した。リングを取り除いた。ゲル外の培地を除去し、ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地を加えて、得られた積層物を培地に浸漬させ、１日間、インキュベートした。
積層物を含むデバイスを培養皿から取り外し、培養皿の上に粗メッシュ状の台座を置き、その台座の上に、積層物を含むデバイスを置いた。ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地を加え、積層物を培地に浸漬させ、７日間、インキュベートした。
ＮＨＤＦ用培地とＮＨＥＫ用培地とを１：１で混合した培地に、塩化カルシウムを添加して、１．８ｍＭでＣａＣｌ２を含む培地（細胞分化用培地）を調製した。
培地を、細胞分化用培地に培地交換し、積層物を培地に浸漬させ、３日間、インキュベートした。次いで、培地を除去した後、細胞分化用培地を、ＮＨＤＦゲル層の上面よりもわずかに下の位置に培地の表面が位置するように加えた。これにより、フィブリンゲル部分が培地に浸漬し、ＮＨＥＫが培地の外に配置され、気液界面培養が可能になった。積層物を、１～３週間、インキュベートした。インキュベートにより、ＮＨＥＫは分化し、表皮層に対応する構造が形成された。これにより、人工培養皮膚が得られた（図１２参照）。
【0075】
比較例３．フィブリンゲルを用いた人工培養皮膚（ＡＤＳＣ培養液の上清添加）の製造
比較例２において、ＮＨＤＦ用培地として、ＡＤＳＣを別途培養して得た培養液の上清を上記ＮＨＤＦ用培地に添加した培地（ＮＨＤＦ用培地：ＡＤＳＣ培養上清の割合は体積比で２：１）を用い、ＮＨＥＫ用培地として、ＡＤＳＣを別途培養して得た培養液の上清を上記ＮＨＥＫ用培地に添加した培地（ＮＨＥＫ用培地：ＡＤＳＣ培養上清の割合は体積比で２：１）を用いたこと以外は、比較例２と同様の方法で、ＮＨＤＦゲル層とＮＨＥＫ層とが積層された積層物を形成し、積層物の培養（浸漬培養および気液界面培養）を行った。
比較例２において、ＮＨＤＦ用培地として、ＡＤＳＣを別途培養して得た培養液の上清を上記ＮＨＤＦ用培地に添加した培地（ＮＨＤＦ用培地：ＡＤＳＣ培養上清の割合は体積比で２：１）を用い、ＮＨＥＫ用培地として、ＡＤＳＣを別途培養して得た培養液の上清を上記ＮＨＥＫ用培地に添加した培地（ＮＨＥＫ用培地：ＡＤＳＣ培養上清の割合は体積比で２：１）を用いたこと以外は、比較例２と同様の方法で、ＮＨＤＦゲル層とＮＨＥＫ層とが積層された積層物を形成し、積層物の培養（浸漬培養および気液界面培養）を行った。
【0076】
試験例１．ＨＥ染色による皮膚切片の評価
皮膚切片の作製
実施例および比較例で製造した人工培養皮膚を取り出し、４％パラホルムアルデヒドに浸漬して、４℃で３時間、固定した。液をＰＢＳに置換し、４℃で３０分間、静置した。３０％スクロースのＰＢＳ溶液に浸漬し、４℃で２４時間、保持した。実施例１および比較例１（図１３、図１４の試験の場合）、ならびに実施例２（図１５の試験の場合）については、ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）で包埋および凍結し、－８０℃のフリーザーで保存した。実施例２および比較例２、３（図１６、図１７の試験の場合）については、ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）を加え、４℃で２４時間、静置した後、新たなＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋および凍結し、－８０℃のフリーザーにて保存した。
皮膚切片の作製
実施例および比較例で製造した人工培養皮膚を取り出し、４％パラホルムアルデヒドに浸漬して、４℃で３時間、固定した。液をＰＢＳに置換し、４℃で３０分間、静置した。３０％スクロースのＰＢＳ溶液に浸漬し、４℃で２４時間、保持した。実施例１および比較例１（図１３、図１４の試験の場合）、ならびに実施例２（図１５の試験の場合）については、ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）で包埋および凍結し、－８０℃のフリーザーで保存した。実施例２および比較例２、３（図１６、図１７の試験の場合）については、ＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）を加え、４℃で２４時間、静置した後、新たなＯＣＴ Ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋および凍結し、－８０℃のフリーザーにて保存した。
【0077】
ＨＥ染色
上記のようにして作製した皮膚切片について、常法により、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色を行い、顕微鏡観察を実施した。
上記のようにして作製した皮膚切片について、常法により、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色を行い、顕微鏡観察を実施した。
【0078】
図１３は、実施例１および比較例１において、細胞懸濁液濃度（ＮＨＥＫ：２×１０５個／モデル、ＮＨＤＦおよびＡＤＳＣ：いずれも２×１０５個／ｍＬ）および気液界面培養１週間、の条件で製造した人工培養皮膚から得た、皮膚切片の画像を示している。図１３Ａは比較例１により得た皮膚切片、図１３Ｂは、実施例１により得た皮膚切片を表す。ここで、理解しやすいように、図１３Ｂの右横に、真皮層、表皮層（角層以外）、および角層のおおよその範囲を示している。真皮層（真皮組織層）は、ＮＨＤＦゲル層から形成され、表皮層（角層を含む）は、ＮＨＥＫ層から（細胞の分化により）形成されている。なお、「個／モデル」とは１つの皮膚モデル（１区画分）における細胞個数を示す。
【0079】
図１４は、実施例１および比較例１において、細胞懸濁液濃度（ＮＨＥＫ：０．７×１０５個／モデル、ＮＨＤＦおよびＡＤＳＣ：いずれも２×１０５個／ｍＬ）および気液界面培養１週間、の条件で製造した人工培養皮膚から得た、皮膚切片の画像を示している。図１４Ａは比較例１により得た皮膚切片、図１４Ｂは、実施例１により得た皮膚切片を表す。
【0080】
図１５は、実施例２において、細胞懸濁液濃度（ＮＨＥＫ：２×１０５個／モデル、ＮＨＤＦおよびＡＤＳＣ：いずれも２×１０５個／ｍＬ）および気液界面培養２週間、の条件で製造した人工培養皮膚から得た、皮膚切片の画像を示している。
【0081】
図１６は、実施例２、比較例２および３において、細胞懸濁液濃度（ＮＨＥＫ：０．７×１０５個／モデル、ＮＨＤＦおよびＡＤＳＣ：いずれも２×１０５個／ｍＬ）および気液界面培養１週間、の条件で製造した人工培養皮膚から得た、皮膚切片の画像を示している。図１６Ａは比較例２により得た皮膚切片、図１６Ｂは、実施例２により得た皮膚切片を表し、図１６Ｃは、比較例３により得た皮膚切片を表す。
【0082】
図１７は、実施例２、比較例２および３において、細胞懸濁液濃度（ＮＨＥＫ：０．７×１０５個／モデル、ＮＨＤＦおよびＡＤＳＣ：いずれも２×１０５個／ｍＬ）および気液界面培養３週間、の条件で製造した人工培養皮膚から得た、皮膚切片の画像を示している。図１７Ａは比較例２により得た皮膚切片、図１７Ｂは、実施例２により得た皮膚切片を表し、図１７Ｃは、比較例３により得た皮膚切片を表す。
【0083】
評価
人工培養皮膚においては、表皮の分化の状態が重要であり、特に、細胞分化の基底となる基底層の形成の良否が鍵となる。図１３～図１４に示すように、実施例１により得た人工培養皮膚では、比較例１と比較して、基底層がきれいに形成されており、具体的には、基底細胞がつぶだってきれいに層状に形成されていることが確認された。また、図１５～図１７に示すように、実施例２により得た人工培養皮膚では、比較例２および３と比較して、基底層がきれい形成されており、具体的には、基底細胞がつぶだってきれいに層状に形成されていることが確認された。図１６～図１７から、ＡＤＳＣの培養上清を用いることにより（比較例３）、ＡＤＳＣを全く用いない場合（比較例２）よりも、基底層の状態がよくなることが確認されたが、ＡＤＳＣ細胞を用いた人工培養皮膚（実施例２）の方が、基底層の状態がさらに良好であった。
人工培養皮膚においては、表皮の分化の状態が重要であり、特に、細胞分化の基底となる基底層の形成の良否が鍵となる。図１３～図１４に示すように、実施例１により得た人工培養皮膚では、比較例１と比較して、基底層がきれいに形成されており、具体的には、基底細胞がつぶだってきれいに層状に形成されていることが確認された。また、図１５～図１７に示すように、実施例２により得た人工培養皮膚では、比較例２および３と比較して、基底層がきれい形成されており、具体的には、基底細胞がつぶだってきれいに層状に形成されていることが確認された。図１６～図１７から、ＡＤＳＣの培養上清を用いることにより（比較例３）、ＡＤＳＣを全く用いない場合（比較例２）よりも、基底層の状態がよくなることが確認されたが、ＡＤＳＣ細胞を用いた人工培養皮膚（実施例２）の方が、基底層の状態がさらに良好であった。
【0084】
試験例２．免疫染色による皮膚切片の評価
試験例１と同様の方法で、気液界面培養１週間の条件の人工培養皮膚について、皮膚切片を作製した。皮膚切片について、市販の免疫染色キットに従って免疫染色を行い、遺伝子の発現を調べた。調査した遺伝子は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ４、Ｃｏｌｌａｇｅｎ１７、Ｃｏｌｌａｇｅｎ７、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ＣＫ１５（ＫＲＴ１５とも称する）、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、ＦＬＧ（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎとも称する）、および、ＨＡＳ１である。これらの遺伝子は、それぞれ対応するタンパク質をコードする。
試験例１と同様の方法で、気液界面培養１週間の条件の人工培養皮膚について、皮膚切片を作製した。皮膚切片について、市販の免疫染色キットに従って免疫染色を行い、遺伝子の発現を調べた。調査した遺伝子は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ４、Ｃｏｌｌａｇｅｎ１７、Ｃｏｌｌａｇｅｎ７、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ＣＫ１５（ＫＲＴ１５とも称する）、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、ＦＬＧ（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎとも称する）、および、ＨＡＳ１である。これらの遺伝子は、それぞれ対応するタンパク質をコードする。
【0085】
図１８～図２１は、実施例および比較例による皮膚切片の免疫染色により得た画像を示す。図１８は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ４とＣｏｌｌａｇｅｎ１７、およびそれらの重ね合わせ（ｍｅｒｇｅ）を示し、図１９は、Ｃｏｌｌａｇｅｎ７とＯｃｃｌｕｄｉｎ、およびそれらの重ね合わせ（ｍｅｒｇｅ）を示し、図２０は、ＣＫ１５とＬｏｒｉｃｒｉｎ、およびそれらの重ね合わせ（ｍｅｒｇｅ）を示し、図２１は、ＦＬＧとＨＡＳ１、およびそれらの重ね合わせ（ｍｅｒｇｅ）を示す。なお、ＦＬＧとＨＡＳ１について、実施例１（コラーゲンゲルのＫ＋Ｆ＋Ａ）と比較例１（コラーゲンゲルのＫ＋Ｆ）は未実施である（図２１）。重ね合わせは、遺伝子発現の状態の確認のために行い、発現場所が少し異なるもので実施している。なお、「Ｋ＋Ｆ＋Ａ」は、ＮＨＥＫ、ＮＨＤＦおよびＡＤＳＣを含んだ（３層の）皮膚モデルを意味し、「Ｋ＋Ｆ」は、ＮＨＥＫおよびＮＨＤＦを含んだ（２層の）皮膚モデルを意味する。
【0086】
免疫染色の各画像から、実施例１と比較例１との比較、および、実施例２と比較例２との比較より、基部組織層あり「Ｋ＋Ｆ＋Ａ」（実施例１、２）は、基部組織層なし「Ｋ＋Ｆ」（比較例１、２）よりも遺伝子発現が良好であるといえる。さらに、実施例２と比較例３との比較より、基部組織層あり「Ｋ＋Ｆ＋Ａ」（実施例２）は、ＡＤＳＣの培養上清の添加「Ｋ＋Ｆ（＋Ａ上清）」（比較例３）よりも遺伝子発現が良好であるといえる。
【0087】
免疫染色による遺伝子発現の総合評価の結果を下記の表１にまとめた。
【表1】
【0088】
上記の結果から、ＡＤＳＣの存在により、表皮の基底膜、基底細胞、バリア機能、および保湿機能に関わる因子の発現が活性化され、その局在も均一化されることで、表皮構造が安定化する可能性が示唆される。
【0089】
試験例３．ＰＣＲによる表皮の遺伝子発現の解析
上記と同様の方法で得られた実施例および比較例の人工培養皮膚をホモジナイズし、公知のＰＣＲ測定法に従ってＰＣＲ測定を行い、遺伝子の発現を調べた。調査した遺伝子は、ＣＯＬ１７Ａ１、ＫＲＴ１５、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＯＣＬＮ、ＨＡＳ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＧＦ１０、ＶＥＧＦ、およびＭＭＰ－１である。これらの遺伝子は、それぞれ対応するタンパク質をコードする。測定結果は、ＧＡＰＤＨで規格化した。なお、ＧＡＰＤＨは、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを意味する。
上記と同様の方法で得られた実施例および比較例の人工培養皮膚をホモジナイズし、公知のＰＣＲ測定法に従ってＰＣＲ測定を行い、遺伝子の発現を調べた。調査した遺伝子は、ＣＯＬ１７Ａ１、ＫＲＴ１５、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＯＣＬＮ、ＨＡＳ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＧＦ１０、ＶＥＧＦ、およびＭＭＰ－１である。これらの遺伝子は、それぞれ対応するタンパク質をコードする。測定結果は、ＧＡＰＤＨで規格化した。なお、ＧＡＰＤＨは、Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅを意味する。
【0090】
図２２～図２７は、ＰＣＲ測定の結果（代表的なもの）を示すグラフである。図２２は、ＣＯＬ４Ａ１を示し、図２３は、ＣＯＬ７Ａ１を示し、図２４は、ＣＯＬ１７Ａ１を示し、図２５は、ＣＫ１５（ＫＲＴ１５の別称）を示し、図２６は、ＯＣＬＮを示し、図２７は、ＨＡＳ１を示す。
【0091】
ＰＣＲによる遺伝子発現量（％）（「Ｋ＋Ｆ」を１００％とする相対量）の結果を下記の表２にまとめた。表２では、２回試験の平均値を記載している。
【表2】
【0092】
図２２～２７および表２では、皮膚状態に関連する多くの遺伝子の発現が良好に制御（活性化または抑制）されていることが示されている。ＰＣＲによる遺伝子発現の結果から、実施例１と比較例１との比較、および、実施例２と比較例２との比較より、基部組織層あり「Ｋ＋Ｆ＋Ａ」（実施例１、２）は、基部組織層なし「Ｋ＋Ｆ」（比較例１、２）よりも遺伝子発現が良好であるといえる。
【0093】
上記の遺伝子のうち、ＣＯＬ１７Ａ１、ＫＲＴ１５、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＯＣＬＮ、およびＨＡＳ１は、表皮に特に影響し得る遺伝子であり、これらの遺伝子発現の活性化（発現量増加）は、表皮層を良好な状態にすることができると考えられる。また、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＧＦ１０、ＶＥＧＦ、およびＭＭＰ－１は、真皮に特に影響し得る遺伝子である。そして、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＧＦ１０、およびＶＥＧＦの活性化（発現量増加）、およびＭＭＰ－１（コラーゲン分解酵素）の抑制（発現量減少）は、真皮組織を良好な状態にすることができると考えられる。
【0094】
上記の結果から、ＡＤＳＣの存在により、表皮の基底膜、基底細胞、バリア機能、および保湿機能に関わる因子の発現が活性化され、その局在も均一化されることで、表皮構造が安定化する可能性が示唆される。また、ＡＤＳＣの存在により、表皮層の良好な形成とともに、真皮組織層およびそれを含めた皮膚組織全体が良好に形成されることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【0095】
本発明によれば、薬剤の評価などに使用することが可能な人工培養皮膚を提供することができる。
【符号の説明】
【0096】
１ 人工培養皮膚
１０ 基部組織層
１１ 脂肪由来幹細胞
１２ ゲル（第１のゲル）
２０ 真皮組織層
２１ 線維芽細胞
２２ ゲル（第２のゲル）
３０ 表皮層
３１ 表皮細胞
４０ デバイス
４１ 側壁
４２ 突起
４２ａ 突起基部
４２ｂ 突起先端部
４３ 培養空間
４４ 筒状体
５０ 培養皿
５１ 台座
５２ 穴
６０ 培地
１０ 基部組織層
１１ 脂肪由来幹細胞
１２ ゲル（第１のゲル）
２０ 真皮組織層
２１ 線維芽細胞
２２ ゲル（第２のゲル）
３０ 表皮層
３１ 表皮細胞
４０ デバイス
４１ 側壁
４２ 突起
４２ａ 突起基部
４２ｂ 突起先端部
４３ 培養空間
４４ 筒状体
５０ 培養皿
５１ 台座
５２ 穴
６０ 培地
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
