特開 2025-31929 椎間板再生用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2025031929

(43)【公開日】2025-03-07

(54)【発明の名称】椎間板再生用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20250228BHJP

   A61P 19/04 20060101ALI20250228BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20250228BHJP

   A61K 31/734 20060101ALI20250228BHJP

【ＦＩ】

A61K35/28

A61P19/04

A61P43/00 107

A61P43/00 121

A61K31/734

【審査請求】有

【請求項の数】31

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024229131

(22)【出願日】2024-12-25

(62)【分割の表示】P 2022578547の分割

【原出願日】2022-01-28

(31)【優先権主張番号】P 2021013667

(32)【優先日】2021-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(31)【優先権主張番号】P 2021167913

(32)【優先日】2021-10-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）開催日 令和３年（２０２１年）年９月８日 （２）集会名： 令和３年度ＡＭＥＤ再生・細胞医療・遺伝子治療研究開発交流会 開催形式： ハイブリッド開催（大手町プレイスカンファレンスセンター／Ｗｅｂ開催） （３）公開者 須藤英毅 （４）公開された発明の内容 須藤英毅が、令和３年度ＡＭＥＤ再生・細胞医療・遺伝子治療研究開発交流会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「高純度同種間葉系幹細胞（ＲＥＣ）と硬化性ゲルを用いた腰部脊柱管狭窄症に対する細胞治療」について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼開催日 令和２年（２０２０年）年２月１日 ▲２▼集会名、開催場所 第１３８回北海道整形災害外科学会 北海道大学学術交流会館 ▲３▼公開者 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、岩崎倫政 ▲４▼公開された発明の内容 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、岩崎倫政が、第１３８回北海道整形災害外科学会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「ウサギ髄核摘出モデルにおける高純度硬化性ゲルと自家骨髄濃縮液による組織修復効果」について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）開催日 令和３年（２０２１年）年１０月１５日 （２）集会名： 第３６回日本整形外科学会基礎学術集会 開催形式： ハイブリッド開催（三重県営サンアリーナ／Ｗｅｂ開催） （３）公開者 須藤英毅、筌場大介、陶山隆史、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政、渡部正利喜、伊佐次三津子、松崎有未 （４）公開された発明の内容 須藤英毅、筌場大介、陶山隆史、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政、渡部正利喜、伊佐次三津子及び松崎有未が、第３６回日本整形外科学会基礎学術集会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「超高純度同種間葉系幹細胞と硬化性ゲルを用いた変性椎間板に対する細胞治療法の開発」について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）ウェブサイトの掲載日 令和４年（２０２２年）１月２４日 （２）ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｌａｎｃｅｔ．ｃｏｍ／ｊｏｕｒｎａｌｓ／ｅｂｉｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／ＰＩＩＳ２３５２－３９６４（２２）０００２９－９／ｆｕｌｌｔｅｘｔ （３）公開者 筌場大介、山田勝久、陶山隆史、ダーレン アール レブル（Ｄａｒｒｅｎ Ｒ．Ｌｅｂｌ）、辻本武尊、野々山貴行、杉野弘和、岩崎倫政、渡部正利喜、松崎有未、須藤英毅 （４）公開された発明の内容 筌場大介、山田勝久、陶山隆史、ダーレン アール レブル、辻本武尊、野々山貴行、杉野弘和、岩崎倫政、渡部正利喜、松崎有未及び須藤英毅が、上記アドレスのウェブサイトで公開されたＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ２０２２；７６：１０３８４５にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「超精製された幹細胞とｉｎ ｓｉｔｕで形成する生体吸収性ゲルとの組み合わせは、椎間板の再生を促進する」（Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎ ｓｉｔｕ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ ｇｅｌ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼開催日 令和２年（２０２０年）２月９日 ▲２▼集会名、開催場所 Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０２０ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ，ＵＳＡ（ＯＲＳ ２０２０米国整形外科学会議、米国アリゾナ州フェニックス、フェニックスコンベンションセンター） ▲３▼公開者 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、岩崎倫政 ▲４▼公開された発明の内容 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、岩崎倫政が、ＯＲＳ ２０２０米国整形外科学会議にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｌｇｉｎａｔｅ ｇｅｌ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｏｒ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｓｐｉｒａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ ｏｎ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ．」（骨髄由来間葉系幹細胞又は骨髄穿刺液濃縮物と組み合わせた生体吸収性超精製アルギン酸ゲルがウサギ椎間板再生に及ぼす影響）について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼ウェブサイトの掲載日 令和２年（２０２０年）９月３日 ▲２▼ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｇｒｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｓｒ２０２０／ｄａｔａ／ｐｒｏｇｒａｍ／ｊｓｓｒ２０２０＿ａｂｓｔｒａｃｔ．ｐｄｆ ▲３▼公開者 筌場大介、須藤英毅、浦 勝郎、辻本武尊、岩崎倫政 ▲４▼公開された発明の内容 筌場大介、須藤英毅、浦 勝郎、辻本武尊及び岩崎倫政が、上記アドレスのウェブサイトで公開された第４９回日本脊椎脊髄病学会学術集会抄録集にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「ウサギ髄核摘出モデルにおける高純度硬化性ゲルと自家骨髄濃縮液による組織修復効果」について公開した（演題番号：１－Ｐ３７－５）。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼開催日 令和２年（２０２０年）年９月７日～２３日 ▲２▼集会名、開催場所 第４９回日本脊椎脊髄病学会学術集会 兵庫県神戸市、神戸コンベンションセンター 発表形式：オンライン（Ｗｅｂ掲載） 学術集会ホームページ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｎｇｒｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｓｓｒ２０２０／ ▲３▼公開者 筌場大介、須藤英毅、浦 勝郎、辻本武尊、岩崎倫政 ▲４▼公開された発明の内容 筌場大介、須藤英毅、浦 勝郎、辻本武尊、岩崎倫政が、第１３８回北海道整形災害外科学会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「ウサギ髄核摘出モデルにおける高純度硬化性ゲルと自家骨髄濃縮液による組織修復効果」について公開した（演題番号：１－Ｐ３７－５）。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼発行日 令和２年（２０２０年）年９月１４日 ▲２▼刊行物 第３５回日本整形外科学会基礎学術集会抄録集，Ｓ１７２１頁 ▲３▼公開者 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、岩崎倫政 ▲４▼公開された発明の内容 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、岩崎倫政が、第３５回日本整形外科学会基礎学術集会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「骨髄由来間葉系幹細胞とバイオマテリアルによる椎間板細胞治療」について公開した（演題番号：１－８－２６）。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼開催日 令和２年（２０２０年）年１０月１５日 ▲２▼集会名 第３５回日本整形外科学会基礎学術集会 開催形式： オンライン学術集会（Ｌｉｖｅ－Ｗｅｂ開催） 学術集会ホームページ：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅ２．ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｏａｋｉｓｏ２０２０／ ▲３▼公開者 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、山田勝、岩崎倫政 ▲４▼公開された発明の内容 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、山田勝、岩崎倫政が、第３５回日本整形外科学会基礎学術集会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「骨髄由来間葉系幹細胞とバイオマテリアルによる椎間板細胞治療」について公開した（演題番号：１－８－２６）。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼発行日 令和２年（２０２０年）年９月１４日 ▲２▼刊行物 第３５回日本整形外科学会基礎学術集会抄録集，Ｓ１９４９頁 ▲３▼公開者 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、岩崎倫政 ▲４▼公開された発明の内容 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、岩崎倫政が、第３５回日本整形外科学会基礎学術集会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「自家骨髄濃縮液とバイオマテリアルによる椎間板治療」について公開した（演題番号：Ｐｏ－６２）。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼開催日 令和２年（２０２０年）年１０月１５日 ▲２▼集会名： 第３５回日本整形外科学会基礎学術集会 開催形式： オンライン学術集会（Ｌｉｖｅ－Ｗｅｂ開催） 学術集会ホームページ： ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅ２．ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｏａｋｉｓｏ２０２０／ ▲３▼公開者 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、山田勝久、岩崎倫政▲４▼公開された発明の内容 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、山田勝久、岩崎倫政が、第３５回日本整形外科学会基礎学術集会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「自家骨髄濃縮液とバイオマテリアルによる椎間板治療」について公開した（演題番号：Ｐｏ－６２）。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼ウェブサイトの掲載日 令和３年（２０２１年）１月２１日 ▲２▼ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｌｗｗ．ｃｏｍ／ｊｂｊｓｊｏｕｒｎａｌ／Ｆｕｌｌｔｅｘｔ／９９００／Ｂｏｎｅ＿Ｍａｒｒｏｗ＿Ａｓｐｉｒａｔｅ＿Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ＿Ｃｏｍｂｉｎｅｄ＿ｗｉｔｈ＿ｉｎ．１２０．ａｓｐｘ ▲３▼公開者 筌場大介、山田勝久、辻本武尊、浦 勝郎、野々山貴行、岩崎倫政、須藤英毅 ▲４▼公開された発明の内容 筌場大介、山田勝久、辻本武尊、浦 勝郎、野々山貴行、岩崎倫政及び須藤英毅が、上記アドレスのウェブサイトで公開されたＪ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２０２１；００：１－１１にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「Ｉｎ ｓｉｔｕで形成した生体吸収性ゲルと組み合わせた骨髄穿刺液濃縮物はウサギの椎間板再生を促進する」 （Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ａｓｐｉｒａｔｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ Ｇｅｌ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ Ｄｉｓｃ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ）について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼ウェブサイトの掲載日 令和２年（２０２０年）３月４日 ▲２▼ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｒｓ．ｏｒｇ／ｗｐ－ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０２０／０２／ＯＲＳ＿２０２０＿Ｐｒｏｇｒａｍ＿Ｂｏｏｋ＿ＦＩＮＡＬ．ｗｅｂ２０９２０．ｐｄｆ ▲３▼公開者 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、山田勝久、岩崎倫政 ▲４▼公開された発明の内容 筌場大介、須藤英毅、辻本武尊、浦 勝郎、山田勝久及び岩崎倫政が、上記アドレスのウェブサイトで公開されたＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ ５３（２０２０）１０２６９８にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「変性した椎間板の切除後の再生治療戦略としての超精製アルギン酸ゲルと組み合わせた骨髄間葉系幹細胞」 （Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｌｇｉｎａｔｅ ｇｅｌ ａｓ ａ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｆｔｅｒ ｄｉｓｃｅｃｔｏｍｙ ｆｏｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃｓ）について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）ウェブサイトの掲載日 令和３年（２０２１年）２月４日 （２）ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｒｓ．ｏｒｇ／Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ／６７／１１９２．ｐｄｆ （３）公開者 筌場大介、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政、須藤英毅 （４）公開された発明の内容 筌場大介、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政及び須藤英毅が、上記アドレスのウェブサイトで公開されたＯＲＳ ２０２１ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ（Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ）にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「高度に精製されたヒト間葉系幹細胞とアルギン酸ゲルは、前臨床の大型動物モデルで椎間板の再生を促進する」（Ｈｉｇｈｌｙ－Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｇｅｌ ｐｒｏｍｏｔｅ Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ Ｄｉｓｃ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｒｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ）について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）開催日 令和３年（２０２１年）２月１２日～８月１６日 （２）集会名：ＯＲＳ ２０２１ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ（Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ） 開催形式：オンライン学術集会 学術集会ホームページ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｏｒｓ．ｏｒｇ／２０２１ａｎｎｕａｌｍｅｅｔｉｎｇ／ （３）公開者 筌場大介、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政、須藤英毅 （４）公開された発明の内容 筌場大介、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政及び須藤英毅が、上記アドレスのウェブサイトで公開されたＯＲＳ ２０２１ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ（Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｃｉｅｔｙ）にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「高度に精製されたヒト間葉系幹細胞とアルギン酸ゲルは、前臨床の大型動物モデルで椎間板の再生を促進する」（Ｈｉｇｈｌｙ－Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｇｅｌ ｐｒｏｍｏｔｅ Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ Ｄｉｓｃ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｒｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ）について公開した。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）発行日 令和３年（２０２１年）５月１５日 （２）刊行物第１４０回北海道整形災害外科学会 （３）公開者 筌場大介、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政、須藤英毅、陶山隆史、松崎有美、渡部正利喜 （４）公開された発明の内容 筌場大介、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政、須藤英毅、陶山隆史、松崎有美及び渡部正利喜が、第１４０回北海道整形災害外科学会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「高純度同種間葉系幹細胞と硬化性ゲルを用いた変性椎間板に対する細胞治療法の開発」について公開した（演題番号：１－Ｉ－４－１）。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）開催日 令和３年（２０２１年）６月５日 （２）集会名：第１４０回北海道整形災害外科学会 開催形式：オンライン学術集会（Ｌｉｖｅ－Ｗｅｂ開催） 学術集会ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｚａ．ｕｍｉｎ．ａｃ．ｊｐ／～ｈｏｋｕｓｅｉｓａｉ１４０／ （３）公開者 筌場大介、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政、須藤英毅、陶山隆史、松崎有美、渡部正利喜 （４）公開された発明の内容 筌場大介、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政、須藤英毅、陶山隆史、松崎有美及び渡部正利喜が、第１４０回北海道整形災害外科学会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「高純度同種間葉系幹細胞と硬化性ゲルを用いた変性椎間板に対する細胞治療法の開発」について公開した（演題番号：１－Ｉ－４－１）。

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）ウェブサイトの掲載日 令和３年（２０２１年）９月３日 （２）ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅ．ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｏａｋｉｓｏ２０２１／ （３）公開者 須藤英毅、筌場大介、陶山隆史、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政、渡部正利喜、伊佐次美津子、松崎有未 （４）公開された発明の内容 須藤英毅、筌場大介、陶山隆史、山田勝久、辻本武尊、岩崎倫政、渡部正利喜、伊佐次美津子及び松崎有未が、上記アドレスのウェブサイトで公開された第３６回 日本整形外科学会基礎学術集会にて、須藤英毅、筌場大介、伊谷有未及び陶山隆史が発明した、「高純度同種間葉系幹細胞と硬化性ゲルを用いた変性椎間板に対する細胞治療法の開発」について公開した（演題番号：２－４－Ｓ１４－４）。

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「再生医療実現拠点ネットワークプログラム技術開発個別課題」「高純度同種間葉系幹細胞（ＲＥＣ）と硬化性ゲルを用いた腰部脊柱管狭窄症に対する細胞治療」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(71)【出願人】

【識別番号】504173471

【氏名又は名称】国立大学法人北海道大学

(71)【出願人】

【識別番号】516385996

【氏名又は名称】ＰｕＲＥＣ株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】000181147

【氏名又は名称】持田製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】須藤 英毅

(72)【発明者】

【氏名】筌場 大介

(72)【発明者】

【氏名】山田 勝久

(72)【発明者】

【氏名】浦 勝郎

(72)【発明者】

【氏名】鈴木 久崇

(72)【発明者】

【氏名】伊谷 有未

(72)【発明者】

【氏名】陶山 隆史

(57)【要約】

【課題】椎間板の髄核再生促進用組成物の提供。
【解決手段】低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する、椎間板の髄核再生促進用組成物を提供する。特に、本発明の組成物は、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又はヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する、椎間板再生用組成物。

【請求項2】

間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又は間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記間葉系幹細胞が、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞である請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、請求項３に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である

【請求項5】

前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性であることを指標に分離された高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、請求項３又は４に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である

【請求項6】

対象の椎間板に適用し、適用後に組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させるように用いられ、当該適用時には流動性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

椎間板の髄核部位に適用するための請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記髄核部位への適用は、髄核欠損部への前記組成物の充填である、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記架橋剤が２価以上の金属イオン化合物である、請求項６～８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項10】

前記アルギン酸の１価金属塩は、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項11】

前記アルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項12】

アルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％～５．０ｗ／ｗ％である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項13】

椎間板変性及び／又は椎間板損傷の治療、予防又は再発抑制のために用いられる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項14】

前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

アルギン酸の１価金属塩とヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞とを含む椎間板再生用組成物であって、対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用されるための椎間板再生用組成物。

【請求項16】

対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用された後に、該組成物に架橋剤を接触させることなく用いられる請求項１５に記載の椎間板再生用組成物。

【請求項17】

前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又は前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する、請求項１５又は１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞が、適用時に未分化状態である及び／又は誘導分化の処置なしに適用される請求項１５～１７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項19】

前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である

【請求項20】

前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である

【請求項21】

前記アルギン酸の１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、請求項１５～２０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項22】

前記アルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子 量（絶対分子量）が８万以上である、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項23】

前記アルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％～５．０ｗ／ｗ％である、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項24】

椎間板変性及び／又は椎間板損傷の治療、予防又は再発抑制のために用いられる、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項25】

前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、慢性腰痛、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症）及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、慢性腰痛を伴う、請求項２４又は２５に記載の組成物。

【請求項27】

椎間板性疼痛を抑制するために用いる、請求項１５～２３のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する、椎間板再生用組成物に関する。本発明は、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞を含有する椎間板再生用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

人間の背骨（脊椎）は24個の骨（椎骨）で構成されており、その椎骨と椎骨との間のクッションの役割を果たす組織を椎間板という。椎間板は、加齢、外傷、疾病などにより変性、損傷が生じる。椎間板の変性は、椎間板の細胞数、水分含有量、細胞外マトリックス（タイプＩＩコラーゲン、アグリカンなど）等が低下している状態であり、進行すると椎間板のショック吸収体としての機能が果たせなくなる。椎間板変性および椎間板損傷は、具体的には、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、外傷などによる椎間板損傷などである。例えば、椎間板ヘルニアでは、髄核を覆う線維輪が変形または亀裂を生じることによってヘルニアを形成して椎間板外へ突出し、変形また生じた亀裂から逸脱した髄核が、脊髄神経を圧迫し、痛み、麻痺などを引き起こす。

【0003】

椎間板ヘルニアに対する治療の一つに椎間板髄核摘出（切除）術があり、一定の効果が確認されている。しかしながら、椎間板髄核摘出（切除）術では、椎間板髄核摘出術後の手術部位に処置を施さないため、椎間板の変性変化が進行することがあることが知られている。椎間板髄核摘出術で髄核の一部を取り除くと、髄核部位に空洞（本明細書において「欠損部」ともいう）ができる。髄核には自己修復能及び再生能が著しく低いため、髄核の空洞は物理的にも弱くなりやすい。また、空洞部分には、線維芽様細胞が集積して本来の髄核とは力学的特性の異なる組織が形成されることがある。このため、椎間板髄核摘出術後は、ヘルニアの再発率が高い。椎間板髄核摘出後の５年以内の再発率は４～１５％程度といわれているが、最近の長期データでは１０年後には過半数に再発することが分かってきた。ヘルニアが再発すると再手術が必要になるが、脊髄神経は、１回目の手術後に形成された瘢痕組織の中に埋没しており、脊髄神経の位置を確認することが困難となる。

【0004】

これまで、アルギン酸を基盤とした高純度硬化性ゲルを開発し、ゲル単独投与（無細胞）でも椎間板組織が自然修復することを実証し（特許6487110号、Tsujimoto et al., EBioMedicine 37 (2018) 521-534）、20～49歳の腰椎椎間板ヘルニア患者に対してヘルニア摘出術後にゲルを埋植する臨床試験が実施されている。

【0005】

ところで、間葉系幹細胞 （Mesenchymal Stem Cells：MSC）は、細胞採取に伴う倫理的問題が少なく、骨・軟骨・脂肪などへの多様な分化能を持つことから、造血幹細胞に次いで臨床応用が盛んに行われている体性幹細胞の一つである。MSCは、比較的簡単な手技により分離できることから、主に試験管内で軟骨や骨などへ分化誘導後に局所へ移植するなど、再生医療へ向けた材料として広く用いられている。そして、臨床応用を進める際には、一定の機能を維持する細胞を必要量製造できることが、製品化の必須条件となる。

【0006】

そして、本発明者らは、骨髄液からLNGFR、Thy-1共陽性細胞をフローサイトメトリーにより分離し、増殖の早いクローン（Rapidly Expanding Clone：REC）を得ており、ドナーに由来するMSCの増殖性の差を排除できる精製分離方法を確立した（特許第6463029号、WO2016/017795、Mabuchi Y. et al., Stem Cell Reports 1(2): 152-165, 2013）

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特許第6487110号

【特許文献2】特許第6463029号

【特許文献3】国際公開2016/017795号パンフレット

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Tsujimoto T et al., An acellular bioresorbable ultra-purified alginate gel promotes intervertebral disc repair: A preclinical proof-of-concept study, EBioMedicine 37 (2018) 521-534

【非特許文献2】Mabuchi Y et al., LNGFR+ Thy-1+ Vcam-1hi+ cells reveal functionally distinct subpopulations in mesenchymal stem cells. Stem Cell Reports 1(2): 152-165, 2013

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

前記の通り、これまで、アルギン酸を基盤とした高純度硬化性ゲルを開発し、腰椎椎間板ヘルニア患者に対してヘルニア摘出術後にゲルを埋植する探索的医師主導治験が実施されている。しかしながら、自己修復能及び再生能がほとんどないと言われている髄核は、中高年期ではさらに自己修復能が乏しく、そのような患者にはゲル単独治療では明らかな限界がある。
このため、椎間板組織が修復・再生できるさらなる組成物の開発が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者は、上記課題を解決するため検討を行った結果、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含む組成物が、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。また、本発明の別の態様では、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞を含む組成物が、上記課題を解決し得ることを見出した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] 低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する、椎間板再生用組成物。
[１－１] アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する、椎間板再生用組成物。
[２] 間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又は間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する、[１]又は[１－１]に記載の組成物。
[３] 前記間葉系幹細胞が、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞である[１]～[２]のいずれか１項に記載の組成物。
[４] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[３]に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が35％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[４－１] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、 [３]に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が35％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[４－２] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、 [３]に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が35％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[４－３] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[３]に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[４－４] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、 [３]に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[４－５] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、 [３]に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[５] 対象の椎間板に適用し、当該適用時には流動性を有する、 [１]～[４－５]のいずれか１項に記載の組成物。
[５－１] 対象の椎間板髄核部位に適用し、適用後に組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させるように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する、[１]～[４]のいずれか１項に記載の組成物。
[５－２] 対象の椎間板髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する、 [１]～[４]のいずれか１項に記載の組成物。
[６] 前記髄核部位への適用は、髄核欠損部への前記組成物の充填である、[５]～[５－２] のいずれか１項に記載の組成物。
[７] 前記一部分の硬化は、組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させることにより行われる、[５－２]又は[６]に記載の組成物。
[８] 前記架橋剤が２価以上の金属イオン化合物である、[５－１]又は[７]に記載の組成物。
[８－１] 前記アルギン酸の１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、[１]～[８]のいずれか１項に記載の組成物。
[９] 前記低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、[１]～[８－１]のいずれか１項に記載の組成物。
[１０] 低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％～５．０ｗ／ｗ％である、[１]～[９]のいずれか１項に記載の組成物。
[１１] 椎間板変性及び／又は椎間板損傷の治療、予防又は再発抑制のために用いられる、[１]～[１０]のいずれか１項に記載の組成物。
[１２] 前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症を伴う椎間板ヘルニア及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、[１１]に記載の組成物。
[１２－１] 前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、慢性腰痛 を伴う、[１１]又は[１２]に記載の組成物。

【0011】

[１３] ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞を含有する、対象の椎間板髄核部位に適用される、椎間板再生用組成物。
[１４] ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又はヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する、[１３]に記載の組成物。
[１５] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞が、適用時に未分化状態である及び／又は誘導分化の処置なしに適用される [１３]又は[１４]に記載の組成物。
[１６] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[１３]～[１５]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が35％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[１６－１] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90) が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[１３]～[１５]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が35％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[１６－２] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90) が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[１３]～[１５]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が35％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[１６－３] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[１３]～[１５]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[１６－４] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90) が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[１３]～[１５]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[１６－５] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90) が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[１３]～[１５]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[１７] 前記組成物が、細胞を包埋するための担体をさらに含む、[１３]～[１６－５]のいずれか１項に記載の組成物。
[１８] 前記担体が、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびガラクトサミノグリクロングリカン硫酸、並びにこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される、[１７]に記載の組成物。
[１９] 前記担体が、アルギン酸の１価金属塩である[１７]に記載の組成物。
[２０] 対象の椎間板髄核部位に適用し、適用後に組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させるように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する、[１３]～[１９]のいずれか１項に記載の組成物。
[２１] 対象の椎間板髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する、[１３]～[１９]のいずれか１項に記載の組成物。
[２２] 前記髄核部位への適用は、髄核欠損部への前記組成物の充填である、[２０]又は[２１]に記載の組成物。
[２３] 前記架橋剤が２価以上の金属イオン化合物である、[２０]～[２２]のいずれか１項に記載の組成物。
[２４] 前記アルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、[１９]～[２３]のいずれか１項に記載の組成物。
[２５] 前記アルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％～５．０ｗ／ｗ％である、[１９]～[２４]のいずれか１項に記載の組成物。
[２６] 前記アルギン酸の１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、[１９]～[２５]のいずれか１項に記載の組成物。
[２７] 椎間板変性及び／又は椎間板損傷の治療、予防又は再発抑制のために用いられる、[１３]～[２６]のいずれか１項に記載の組成物。
[２８] 前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症）及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、[２７]に記載の組成物。
[２８－１] 前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、慢性腰痛を伴う、[２７]又は[２８]に記載の組成物。
[２９] 椎間板性疼痛を抑制するために用いられる、[１]～[２８－１]のいずれか１項に記載の組成物。
[３０] 前記椎間板性疼痛が、慢性腰痛である[２９]に記載の組成物。

【0012】

[３１] アルギン酸の１価金属塩とヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞とを含む椎間板再生用組成物であって、対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用されるための椎間板再生用組成物。
[３１－１] 対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用された後に、組成物を硬化させる処置を要しない使用のための、上記[３１]に記載の椎間板再生用組成物。
[３１－２] 対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用された後に、該組成物に架橋剤を接触させることなく用いられる上記[３１]又は[３１－１]に記載の椎間板再生用組成物。
[３２] ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又はヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する、[３１]～[３１－２]のいずれか１項に記載の組成物。
[３３] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞が、適用時に未分化状態である及び／又は誘導分化の処置なしに適用される[３１]～[３２]のいずれか１項に記載の組成物。
[３４] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[３１]～[３３]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[３４－１] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[３１]～[３３]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[３４－２] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[３１]～[３３]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[３４－３] 前記変動係数が35％以下である、[３４]～[３４－２]のいずれか１項に記載の組成物。
[３５] 前記髄核部位への適用は、髄核欠損部への前記組成物の充填である、[３１]～[３４] のいずれか１項に記載の組成物。
[３６] 前記アルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、[３１]～[３５]のいずれか１項に記載の組成物。
[３７] 前記アルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％～５．０ｗ／ｗ％である、[３１]～[３６]のいずれか１項に記載の組成物。
[３８] 前記アルギン酸の１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、[３１]～[３７]のいずれか１項に記載の組成物。
[３９] 椎間板変性及び／又は椎間板損傷の治療、予防又は再発抑制のために用いられる、[３１]～[３８]のいずれか１項に記載の組成物。
[４０] 前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、慢性腰痛、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症）及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、[３９]に記載の組成物。
[４１] 前記椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、慢性腰痛を伴う、[３９]又は[４０]に記載の組成物。
[４２] 椎間板性疼痛を抑制するために用いられる、[３１]～[４１]のいずれか１項に記載の組成物。
[４３] 前記椎間板性疼痛が、慢性腰痛である[４２]に記載の組成物。

【0013】

[４４] アルギン酸の１価金属塩とヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞とを含む、椎間板性疼痛抑制用組成物であって、対象の髄核部位に流動性を有する状態で適用されるための組成物。
[４４－１] 対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用された後に、組成物を硬化させる処置を要しない使用のための、上記[４４]に記載の椎間板性疼痛抑制用組成物。
[４４－２] 対象の椎間板髄核部位に流動性を有する状態で適用された後に、該組成物に架橋剤を接触させることなく用いられる上記[４４]又は[４４－１]に記載の椎間板性疼痛抑制用組成物。
[４５] 前記疼痛が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症）及び椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種を伴う疼痛である、[４４]～[４４－２]のいずれか１項に記載の組成物。
[４６] 前記疼痛が、慢性腰痛である、[４４]～[４５]に記載の組成物。
[４７] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞が、適用時に未分化状態である及び／又は誘導分化の処置なしに適用される [４４]～[４６]のいずれか１項に記載の組成物。
[４８] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[４４]～[４７]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[４８－１] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性であることを指標に分離された、高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[４４]～[４７]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[４８－２] 前記ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞は、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の細胞に由来する高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団であって、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす細胞集団である、[４４]～[４７]のいずれか１項に記載の組成物。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である
[４８－３] 前記変動係数が35％以下である、[４８]～[４８－２]のいずれか１項に記載の組成物。
[４８－４] 前記髄核部位への適用は、髄核欠損部への前記組成物の充填である、[４４]～[４８－３] のいずれか１項に記載の組成物。
[４９] 前記アルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、[４４]～[４８－４]のいずれか１項に記載の組成物。
[５０] 前記アルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％～５．０ｗ／ｗ％である、[４４]～[４９]のいずれか１項に記載の組成物。
[５１] 前記アルギン酸の１価金属塩が、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩である、[４４]～[５０]のいずれか１項に記載の組成物。
[５２] 対象の椎間板髄核部位に、Ｘ線透視下で適用し、髄核部位への適用時に流動性を有し、該組成物に架橋剤を接触させることなく用いられる [３１]～[５１]のいずれか１項に記載の組成物。
[５３] 対象の椎間板髄核部位に、Ｘ線透視下で圧力計シリンジを用いて適用し、髄核部位への適用時に流動性を有し、該組成物に架橋剤を接触させることなく用いられる[５２]に記載の組成物。

【0014】

[５４] ヒツジ重度椎間板変性モデルを用いて、当該モデルの椎間板に適用した組成物における椎間板の再生能を評価する方法であって、以下の（ａ１）又は（ａ２）の工程、及び（ｂ１）又は（ｂ２） の工程を含む方法により作製された重度椎間板変性モデルの椎間板に、細胞含有組成物を投与する工程を含む、前記評価方法。
（ａ１）ヒツジ椎間板からヒツジ体重の０．００００４％～０．００００５％に相当する量の髄核組織を除去し、変性椎間板を作製する工程
（ａ２）ヒツジ椎間板から２０ｍｇの髄核組織を除去し、変性椎間板を作製する工程
（ｂ１）前記工程（ａ１）又は（ａ２）の４週後に、さらにヒツジ体重の０．０００１４％～０．０００１７５％に相当する量の髄核組織を除去する工程
（ｂ２）前記工程（ａ１）又は（ａ２）の４週後に、さらに７０ｍｇの髄核組織を除去する工程
[５５] 組成物を投与する工程が、工程（ｂ１）又は（ｂ２）の後に行われる、[５４]に記載の方法。
[５６] 評価は、組成物投与後に、変性モデルから採取した椎体及び椎間板に対して、MRI、組織染色、免疫組織化学染色（IHC）からなる群から選択される少なくとも１つの評価方法により行う、[５４]又は[５５]に記載の方法。

【0015】

また本発明は、以下の態様を含む。
[５７] 椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法であって、
アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する組成物を、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含む、前記方法。
[５８] 椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法であって、
ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞を、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含む、前記方法。
[５９] 椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法であって、
ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞及びアルギン酸の１価金属塩を含む組成物を、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含み、前記組成物は、当該髄核部位への適用時に流動性を有する、前記方法。
[６０] 椎間板性疼痛の治療、予防または再発抑制のための方法であって、
ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞及びアルギン酸の１価金属塩を含む組成物を、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含み、前記組成物は、当該髄核部位への適用時に流動性を有する、前記方法。
[６１] アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞を含有する組成物を、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制において使用されるためのアルギン酸の１価金属塩および間葉系幹細胞。
[６２] 椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制に使用するための、アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞とを含有する組成物。
[６３] 椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制に使用するための、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞。
[６４] 椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制に使用するための、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞及びアルギン酸の１価金属塩を含む組成物であって、当該組成物は、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含み、前記組成物は、当該髄核部位への適用時に流動性を有する、前記組成物。
[６５] 椎間板性疼痛の治療、予防または再発抑制に使用するための、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞及びアルギン酸の１価金属塩を含む組成物であって、当該組成物は、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用することを含み、前記組成物は、当該髄核部位への適用時に流動性を有する、前記組成物。

【発明の効果】

【0016】

本発明により、椎間板の髄核の再生を促進することが可能な髄核補填用組成物が提供される。本発明の組成物によれば、椎間板髄核のみならず線維輪も含めた椎間板組織全体の変性変化も抑制することも可能となる。また、本発明の組成物は、髄核におけるタイプＩＩコラーゲン陽性の硝子軟骨様細胞の割合を増加させる効果を有する。そして、中高年期の自己修復作用の弱い症例、例えば50歳以上の中高年期に多くみられる混合性の腰部脊柱管狭窄症（脊柱管狭窄症と椎間板ヘルニアを合併）に対しても、再生促進効果を得ることができる。

【0017】

また、本発明の一態様では、組成物投与時の簡便性、身体への侵襲の低減を考慮し、細胞を包埋するための担体を硬化するための処置なしに用い、椎間板性疾患に伴う疼痛、特に腰痛、より好ましくは慢性的な腰痛を抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】アルギン酸ナトリウム溶液（以下、「ＵＰＡＬ」（低エンドトキシン高純度アルギン酸ゲル（Ｕｌｔｒａ－ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｌｇｉｎａｔｅ ｇｅｌ）という場合がある）を用いた7日間の共培養後の、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFDA‐SE)で標識した骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)及び非標識髄核細胞(NPC)の分離のための細胞選別データを示す図。(a) : 共培養細胞の二次元(2D)ドットプロット。P1ゲートは、単一の生細胞の周りに配置された。(b): 分類されたP2ゲート中の非標識NPC及びP3ゲート中のCFDA-SE標識BMSCの2Dドットプロット。FSC-A:前方散乱領域; FSC-W:前方散乱幅; SSC-A:側方散乱領域; CFDA-SE-A: CFDA-SE-領域。各細胞の遺伝子発現をハウスキーピング遺伝子GAPDHを基準とし、対数スケール(y軸)でプロットした。データは、4つの異なるウサギNPC系統の平均値である。(c) : HIF-1α、(d): GLUT-1、(e): Brachyury、(f): CDMP-1、(g): TGF-β、(h): IGF-1、(i):II型コラーゲン、及び(j):アグリカン。データは平均値±標準誤差で表し、p値はTukey-Kramerの事後検定を用いた一元配置分散分析により求めた。

【図2】骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)が椎間板(IVD)で生存することを示す図。 カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFDA‐SE)で標識した移植後の骨由来間葉系幹細胞(BMSC)は、術後4週目及び12週目の椎間板(IVD)で生存する。IVDの凍結切片を4’,6-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI)で染色した。画像は、4回の反復試験(無傷対照及びBMSC+Gel、n = 4; 4週間及び12週間)の代表である。スケールバー=50μｍ。

【図3】骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)と組み合わせたゲルは、椎間板切除後の変性椎間板(IVD)の水分含量を保存することを示す図。(a): 術後4週目と12週目の変性IVDのT2強調、正中矢状断像。画像は、8回の撮像の代表画像である。(b): IVD変性のPfirrmann分類。データは平均値±標準誤差(無傷の対照、穿刺, 椎間板切除,ゲル, 及びBMSC +ゲル, n=8; 4週及び12週)である。(c)NPの変性変化に対する磁気共鳴イメージング(MRI)index(髄核(NP)面積×平均信号強度)。数値は、無傷の対照IVDと比較した割合（％）として表される。データは平均値±標準誤差であり、Tukey-Kramer検定を用いて事後解析を伴う一元配置分散分析によりp値を求めた。

【図4】骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)と組み合わせたゲルは、椎間板切除後の椎間板(IVD)変性を予防することを示す図。(a, b):ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)又はサフラニンOで染色されたIVDの正中矢状断切片画像（8回の実験画像の代表例） (無傷対照（Intact control）、穿刺（Puncture）、椎間板切除（Discectomy）、ゲル、BMSC+ゲル、n = 8; 4及び12週間)。AF: 線維輪、NP：髄核。スケールバー=(A):500μｍ(上から1番目及び3番目のセクション)、50mm(上から2番目及び4番目のセクション)、及び(B):500μｍ。(c) : 4週目と12週目の組織学的変性度を示す。データは平均値±標準誤差であり、p値はTukey-Kramerの事後検定を用いた一元配置分散分析により求めた。

【図5】ウサギ髄核(NP)におけるII型コラーゲン陽性細胞を示す図。(a):ウサギ椎間板(IVD)の正中矢状断切片をII型コラーゲンに対して染色した。画像は、8回の反復実験結果 (無傷対照、穿刺、椎間板切除、ゲル、BMSC+ゲル、n= 8; 4及び12週間)の代表画像である。矢印は、II型コラーゲンに対して陽性の細胞を示す。スケールバー=500μｍ (上から1番目及び3番目のセクション)及び20μｍ (上から2番目及び4番目のセクション)。(b): II型コラーゲン陽性細胞の割合。データは平均値±標準誤差であり、p値はTukey-Kramerの事後検定を用いた一元配置分散分析により求めた。

【図6】ウサギNPにおける髄核(NP)マーカー陽性細胞を示す図。(a-c):1、7、28日目にHIF-1α、GLUT-1、Brachyury染色したウサギ椎間板(IVD)の水平切片。画像は4回の反復実験(無傷対照、椎間板切除、及びBMSC+ゲル、n=4; day 1、7、28)の代表画像である。スケールバー=50μｍ。(d-f):全細胞に対するNPマーカー陽性細胞の割合。(g-i):CFDA-SE陽性細胞(移植されたBMSCを代表する)に対するNPマーカー陽性細胞の割合。データは平均±標準誤差であり、p値は対応のあるt検定を用いて決定した。

【図7】椎間板(IVD)再生のメカニズムを示す図。 移植された骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)は、既存の髄核細胞(NPC)の活性化をもたらす成長因子と細胞外マトリックス(ECM)を産生する。既存のNPC活性化はまた、増殖因子及びECMの産生を増加させる。移植されたBMSCはNPCに分化する。UPAL：超精製アルギン酸塩（低エンドトキシン高純度アルギン酸塩ともいう）。

【図8】RECクローンの網羅的解析結果を示す図である。

【図9】ヒトの健常椎間板髄核細胞（NPC）及び高純度間葉系細胞（REC）における各種遺伝子の発現量を示す図。

【図10】移植後４週目のヒツジモデルにおける椎間板のMRIの結果を示す図。

【図11】移植後４週目のヒツジモデルにおける椎間板の組織学的検査結果を示す図。

【図12】移植後４週目のヒツジモデルにおける椎間板の組織学的検査結果を示す図。

【図13】3D共培養の7日後のヒトNPC及びRECの発現プロフィールを示す図。(A) REC単離を示す概略図。CD271(LNGFR)及びCD90(THY-1)について染色したヒト骨髄細胞のフローサイトメトリープロフィール。1ウェルから収集した細胞を35mm培養皿に播種し、14日まで増殖させて、高い分化能及び増殖能を有する均一な細胞集団を得る。(B及びC) 細胞選別データを用いて、CFDA-SE標識RECと非標識NPCとを区別する。(B) P1ゲートは、死細胞及び残屑生細胞を排除する。(C) P2ゲートでのラベルなしNPCとP3ゲートでのCFDA-SE標識RECを示す2Dドットプロット。(D～K) 各細胞の遺伝子発現レベルをハウスキーピング遺伝子GAPDHの発現レベルに対して正規化し、対数スケール(y軸)でプロットした。4つの異なるヒトNPC株から得られたデータを平均化した。(D)HIF‐1α, (E)GLUT‐1,(F)brachyury,(G)CDMP‐1,(H)TGF‐β,(I)IGF‐1,(J)II型コラーゲン、(K)アグリカン データは、平均± SD値(n = 4)として表す。有意差は、post hoc Tukey-Kramer検定による一元配置分散分析で評価した。 NPC：髄核細胞 REC：急速に増殖するクローン CFDA-SE：5,6-カボキシフルオレセインジアクタトスクシニミジルエステル ANOVA：分散分析 FSC-A：前方散乱面積 FSC-W：前方散乱幅 SSC-A：側方散乱面積 CFDA-SE-A：CFDA-SE面積

【図14】2種類のゲルの弾性比を示す図。(A) CaCl₂で誘導させたゲル化(直径、4.5mm;厚さ、2mm)後の円盤状UPAL及びREC + UPALゲルの形成。(B及びC) 引張圧縮機械試験装置。サンプルを0.5mm/分の一定速度で圧縮した。(D) 応力歪曲線。ヤング率は、圧縮値10～20%の間の接線の傾きに従って計算した。4つの反復試験を行い、代表的な画像を示す。(E) 2種類のゲルのヤング率。データは、平均± SD値(n = 4)を示す。有意差はWelchの検定後、Student's t-testにより評価した。 N.S：有意差なし UPAL：超精製アルギン酸塩（低エンドトキシン高純度アルギン酸塩ともいう） REC：迅速に増殖するクローン SD：標準偏差

【図15】各群の実験スケジュール及び治療の詳細を示す図。(A及びB) 最初の手術で20mgの新鮮なNP組織を処置IVDから除去して、重度の変性IVDモデルを確立した。(C) 最初の手術の4週間後、70mgの変性NP組織を変性IVDからさらに除去した。(D) 変性NPの除去後、UPAL又はREC + UPAL溶液を椎間板内の空隙に移植した。 NP：髄核 UPAL：超精製アルギン酸（低エンドトキシン高純度アルギン酸ともいう） IVD：椎間板

【図16】埋植後4週目及び24週目における治療したIVDのMRI評価を示す図。(A) ヒツジにおける術後4週目及び24週目のIVDのT2強調、正中矢状断画像。画像は、6又は8回の反復結果の代表である。(B) PfirrmannグレードのIVD変性。(C) NPの変性変化に対するMRI指数(NP面積×平均シグナル強度)値。数値は、無処置の対照IVDについての値に対する割合（％）として表される。(D) IVD治療のための椎間板高さ指数。数値は、無処置の対照IVDの数値に対する割合（％）として示す。データは、平均 ± SD値として表す (無処置対照, n = 6; 椎間板切除, n = 6; ゲル, n = 8; REC + gel, n =8)。有意差は、Tukey‐Kramer検定を用いたpost hoc解析による一元配置ANOVAにより評価した。 NP:髄核 MRI:磁気共鳴画像法 IVD:椎間板 ANOVA:分散分析 SD:標準偏差

【図17】埋植4週後及び24週後の治療したIVDの組織学的評価を行った結果を示す図。(A及びB) H&E又はサフラニン-O染色によって染色された処理IVDの代表的な正中矢状切片(無処置対照、n=6;椎間板切除術、n=6;ゲル、n=8; REC +ゲル、n = 8)。スケールバー(A);50μm(上から2番目及び4番目の部分)又は1mm(上から1番目及び3番目の部分)(B);1mm。(C) 組織学的グレードは、改変Boos分類を介して決定した。データは平均値±標準偏差で表す。有意差はpost hoc Tukey-Kramer検定による一元配置分散分析で評価した。 IVD：椎間板 H&E：ヘマトキシリン&エオシン SD：標準偏差 AF：線維輪 NP：髄核

【図18】埋植4週後及び24週後の処置IVDにおけるII型又はI型コラーゲン陽性細胞を示す図。(A及びB) II型コラーゲン又はI型コラーゲンについて染色された処置IVDの代表的な正中矢状切片(無処置対照、n=6;椎間板切除術、n=6;ゲル、n=8; REC +ゲル、n = 8)。スケールバー、1mm(第1及び第3のライン)又は50μm(第2及び第4のライン)。(C及びD) 処置されたIVD中の総細胞に対するII型又はI型コラーゲン陽性細胞の割合。データは平均値±標準偏差で表す。有意差はpost hoc Tukey-Kramer検定による一元配置分散分析で評価した。 IVD：椎間板 REC：急速増殖クローン SD：標準偏差 ANOVA：分散分析

【図19】NP組織除去後4週目の組織学的評価を示す図。(A) IVDから除去したNP組織(無処置対照、又は20、50、100、200mg除去)の中矢状部（H&E又はサフラニン-Oで染色）。ヒツジモデルにおいて、4週間後にNP組織の20mg以上の除去に伴ってIVD変性が生じた。スケールバー; 1mm(全て)。(B)組織学的グレードは、改変Boos分類を介して決定した。データは平均値±標準偏差。 NP：髄核 IVD：椎間板 H&E：ヘマトキシリン及びエオシン SD：標準偏差

【図20】T2強調中間矢状画像を用いた、隣接する椎骨の椎間板高さに対する椎間板高さの測定結果を示す図。BCとEFはそれぞれ前方及び後方椎間板高であり、ABとDEは頭側の隣接椎体高である。椎間板高さ(BC + EF)と椎体高さ(AB + DE)との比としてDHI値を計算し、無処置対照IVDのDHIに対する処置IVDのDHIの比として相対DHI値を計算した。 DHI：椎間板高さ指数 IVD：椎間板

【発明を実施するための形態】

【0019】

１．概要
本発明は、アルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞（例えばヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞）とを含有する、椎間板再生用組成物に関する。本発明の一態様において、本発明は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩と間葉系幹細胞（例えばヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞）とを含有する、椎間板再生用組成物に関する。本発明の組成物は、間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又は間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する。本発明の組成物は、対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられる。本発明のいくつかの態様では、本発明の組成物は、対象の髄核部位に適用し、表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させるように用いられる。

【0020】

本発明においては、骨髄由来間葉系幹細胞（BMSCs）とゲルとの併用によって、ゲル単独よりも組織修復効果が有意に促進されたことをウサギ由来の間葉系幹細胞を用いたin vivo試験で実証し、そのメカニズムとして、ゲル包埋のBMSCsと髄核細胞の共培養によって、1）成長因子産生による両細胞の相互活性化、2）BMSCsの髄核細胞への分化、3）両細胞からの細胞外基質産生能の向上を明らかにした。

【0021】

本発明の組成物に含まれるアルギン酸は、カジメ、アラメ、コンブなどの褐藻類から抽出される多糖類であり、カルシウムなどの２価の金属イオンを加えると架橋し硬化する性質を有する。この性質を利用して、患部で金属イオンと接触させることにより、表面を硬化させ、患部へ留めることが可能となる。本発明において、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを含む組成物をゾル状態で椎間板髄核部位に注入し、注入口に架橋剤を接触させて組成物の一部を硬化させると、髄核の変性を抑制し、髄核再生に好ましいタイプＩＩコラーゲン陽性細胞の割合を増加させ、椎間板髄核の再生を促進することを見出した。

【0022】

本発明において、間葉系幹細胞をアルギン酸（例えば低エンドトキシンアルギン酸）の１価金属塩で包埋することで、埋植された間葉系幹細胞は患部にとどまり長期的に効果を発揮する。すなわち、埋植された高純度間葉系幹細胞が成長因子や細胞外基質を産生し、髄核細胞を活性化する。そして、活性化された髄核細胞は成長因子や細胞外基質を産生する。その結果、埋植された間葉系幹細胞は髄核細胞へと分化し、髄核細胞と間葉系幹細胞との相互作用を介して障害部の再生が促進される。本発明の別の態様では、ヒアルロン酸などの生体適合性材料に細胞を包埋し得る。

【0023】

また、本発明の組成物に含まれる間葉系幹細胞において、その一態様であるヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞(REC)は、2種類の抗体とセルソータにより骨髄から直接分離する技術により作製される超高純度ヒト間葉系幹細胞である。セルソーターを用いた分離によって均一な細胞集団が得られるため品質管理が容易であり、かつ増殖性が極めて高いため大量培養による製剤化が可能である。

【0024】

本発明は、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞を含有する、椎間板再生用組成物にも関する。本発明の一態様では、本発明の組成物は、未分化状態で及び／又は分化誘導の処置なしに椎間板髄核に適用される。本発明の組成物は、ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞による髄核細胞の活性化及び／又は間葉系幹細胞の髄核細胞への分化を介して、椎間板の髄核再生を促進する。本発明の組成物は、対象の髄核部位に適用し、表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させるように用いられ得る。本発明の一態様では、本発明の組成物は、対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ得る。

【0025】

２．定義
「低エンドトキシン」、「アルギン酸の１価金属塩」は後述する。
「椎間板」は、脊椎に連なる椎骨と椎骨との間にある円柱状の組織である。椎間板は、円板状の無血管組織であり、髄核を中心にして周りを線維輪が取り巻き、さらに上下に終板が配置された構造をしている。
「髄核」は、椎間板の中心に存在するゲル状の組織であり、髄核細胞と、主にプロテオグリカンとＩＩ型コラーゲンで構成される細胞外基質と、水を主として含有する。髄核には、自己修復能・再生能が著しく低いと考えられている。

【0026】

「髄核補填」とは、加齢、外傷、感染、およびそれらに対する外科的手術（例えば、椎間板髄核摘出（切除）術）などにより、変性、縮小、または除去した髄核の変性分、縮小分、または除去分を補填することをいう。なお、本明細書において「髄核充填」の語は、「髄核補填」と同じ意味で用いられ、本発明の「髄核補填用組成物」は「髄核充填用組成物」と同義である。
「髄核部位」とは、髄核が存在する部位、髄核の変性若しくは縮小が生じている部位、又は、髄核の少なくとも一部を除去することで形成された髄核の欠損部をいい、髄核が存在する部位の周辺部も含む。

【0027】

「対象」は、ヒト、またはヒト以外の生物、例えば、トリおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、およびウマ）である。
「適用」とは、本発明の組成物を椎間板の髄核部位の変性分、縮小分、除去分、欠損部などを埋めるのに十分な量で髄核部位に充填することを意味する。
「包埋する」とは、生体適合性材料、好ましくは、アルギン酸の１価金属塩の溶液に細胞を懸濁又は混合することをいう。
「一部分を硬化する」とは、後述の通りである。

【0028】

「低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有する」とは、本発明の組成物が、適用された髄核部位において、髄核を再生するのに十分な量の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有することを意味する。
「流動性を有する」とは、後述の通りである。
「椎間板変性および／または椎間板損傷」、「治療、予防または再発抑制」とは、後述の通りである。
「椎間板性疼痛」とは、椎間板に起因して生じる疼痛のことを意味する。
「腰痛」とは、椎間板の周囲に生じる疼痛であり、背部痛・臀部痛を含む。
「慢性腰痛」とは、腰痛の発症から１２週以上続く腰痛を意味する。

【0029】

本発明の組成物は、溶媒を用いて溶液状態で提供されてもよいし、凍結乾燥体（特には、凍結乾燥粉体）などの乾燥状態で提供されてもよい。乾燥状態として提供される場合、本発明の組成物は、適用時には溶媒を用いて、溶液状などの流動性を有する状態で使用される。溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、注射用水、精製水、蒸留水、イオン交換水（または脱イオン化水）、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。好ましくは、ヒトおよび動物の治療に用いることが可能な注射用水、蒸留水、生理食塩水などである。

【0030】

３．アルギン酸の１価金属塩
本発明において、担体として使用される「アルギン酸の１価金属塩」は、アルギン酸の６位のカルボン酸の水素原子を、Ｎａ^＋やＫ^＋などの１価金属イオンとイオン交換することでつくられる水溶性の塩である。アルギン酸の１価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムなどを挙げることができるが、特に、市販品により入手可能なアルギン酸ナトリウムが好ましい。アルギン酸の１価金属塩の溶液は、架橋剤と混合したときにゲルを形成する。

【0031】

本発明に用いる「アルギン酸」は、生分解性の高分子多糖類であって、Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ）とＬ－グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ－マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ－グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、およびＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸がランダムに配列した画分（ＭＧ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。アルギン酸のＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．４の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。

【0032】

アルギン酸の１価金属塩は高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であるが、分子量が低すぎると粘度が低くなり、適用した部位の周辺組織への密着性が弱くなる恐れがあり、また、分子量が高すぎるものは製造が困難であるとともに、溶解性が低下する、溶液状にした際に粘度が高すぎて取扱いが悪くなる、長期間の保存で物性を維持しにくい等の問題を生じるため、一般的に重量平均分子量で１万～１０００万、好ましくは２万～８００万、より好ましくは５万～５００万の範囲である。本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。

【0033】

一方、天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロマトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィーともいう）により測定した重量平均分子量は、本発明の実施例で示された効果によれば、好ましくは１０万以上、より好ましくは５０万以上であり、また好ましくは、５００万以下、より好ましくは３００万以下である。その好ましい範囲は、１０万～５００万であり、より好ましくは５０万～３５０万である。

【0034】

また、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と多角度光散乱検出器（Multi Angle Light Scattering：ＭＡＬＳ）とを組み合わせたＧＰＣ－ＭＡＬＳ法によれば、絶対重量平均分子量を測定することができる。ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量（絶対分子量）は、本発明の実施例で示された効果によれば、好ましくは１万以上、より好ましくは８万以上、さらに好ましくは９万以上であり、また好ましくは、１００万以下、より好ましくは８０万以下、さらに好ましくは７０万以下、とりわけ好ましくは５０万以下である。その好ましい範囲は、１万～１００万であり、より好ましくは８万～８０万であり、よりさらに好ましくは９万～７０万、とりわけ好ましくは９万～５０万である。

【0035】

通常、高分子多糖類の分子量を上記のような手法で算出する場合、１０～２０％以上の測定誤差を生じうる。例えば、４０万であれば３２～４８万、５０万であれば４０～６０万、１００万であれば８０～１２０万程度の範囲で値の変動が生じうる。

【0036】

アルギン酸の１価金属塩の分子量の測定は、常法に従い測定することができる。
分子量測定にゲル浸透クロマトグラフィーを用いる場合の代表的な条件は、本明細書の実施例に記載のとおりである。カラムは、例えば、ＧＭＰＷ－ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ－ＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ）を用いることができ、溶離液は、例えば、２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液とすることができ、分子量標準としてプルランを用いることができる。

【0037】

分子量測定にＧＰＣ－ＭＡＬＳを用いる場合の代表的な条件は、本明細書の実施例に記載のとおりである。検出器として、例えば、ＲＩ検出器と光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を用いることができる。

【0038】

アルギン酸の１価金属塩は、褐藻類から抽出された当初は、分子量が大きく、粘度が高めだが、熱による乾燥、精製などの過程で、分子量が小さくなり、粘度は低めとなる。製造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画などの手法により分子量の異なるアルギン酸の１価の金属塩を製造することができる。さらに、異なる分子量あるいは粘度を持つ別ロットのアルギン酸の１価金属塩と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸の１価金属塩とすることも可能である。

【0039】

本発明に用いられるアルギン酸の１価金属塩は、好ましくは、アルギン酸の１価金属塩をMilliQ水に溶解して１ｗ／ｗ％濃度の溶液とし、コーンプレート型粘度計を用いて、２０℃の条件で、粘度測定を行ったときの見掛け粘度が、４０ｍPa・ｓ～８００ｍPa・ｓであることが好ましく、より好ましくは、５０ｍPa・ｓ～６００ｍPa・ｓであることが望ましい。見掛け粘度の測定条件は、後述の条件に従うことが望ましい。なお、本明細書において「見掛け粘度」を単に「粘度」という場合がある。

【0040】

本発明に用いるアルギン酸は、天然由来でも合成物であってもよいが、天然由来であるのが好ましい。天然由来のアルギン酸としては、例えば、褐藻類から抽出されるものを挙げることができる。アルギン酸を含有する褐藻類は世界中の沿岸域に繁茂しているが、実際にアルギン酸原料として使用できる海藻は限られており、南米のレッソニア、北米のマクロシスティス、欧州のラミナリアやアスコフィラム、豪のダービリアなどが代表的なものである。アルギン酸の原料となる褐藻類としては、例えば、レッソニア（Ｌｅｓｓｏｎｉａ）属、マクロシスティス（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、ラミナリア（Ｌａｍｉｎａｒｉａ）属（コンブ属）、アスコフィラム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ダービリア（Ｄｕｒｖｉｌｌｅａ）属、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ）属、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ）属などがあげられる。

【0041】

本発明の別の態様では、細胞を包埋するための担体として、他の生体適合性材料を用いてもよい。たとえば、その薬学的に許容可能な塩（生理学的塩）を含む、ヒアルロン酸(HA)、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ガラクトサミノグリシロングリカン(galactosaminoglycuronglycan)硫酸(GGGS)などの1つもしくは複数の天然もしくは合成グリコサミノグリカン(GAG)またはムコ多糖類を、細胞を包埋するための担体として用いてもよい。本発明の別の態様では、細胞を包埋するための担体として、特に限定されないが、セルロース、セルロース誘導体、アガロース、キチン、キトサン、でんぷん、ペクチン等の多糖類、ゼラチン、コラーゲン、ポリペプチド等のタンパク質、アミノ酸誘導体およびこれらの共重合体並びにこれらの誘導体から選択されるものであって、いずれか１つもしくは複数が用いられてもよい。本発明の別の態様では、担体としてコラーゲンやゼラチン様組成物といったハイドロゲルを使用してもよい。

【0042】

４．低エンドトキシン処理
本発明で用いるアルギン酸の１価金属塩は特に限定されるものではなく、例えば低エンドトキシンのアルギン酸の１価金属塩である。本発明の一態様では、細胞を包埋するための担体は、低エンドトキシンであることが好ましい。すなわち、本発明で用いるアルギン酸の１価金属塩は、低エンドトキシンのアルギン酸の１価金属塩であることが好ましい。低エンドトキシンとは、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルが低いことをいう。より好ましくは、低エンドトキシン処理されたアルギン酸の１価金属塩であることが望ましい。

【0043】

低エンドトキシン処理は、公知の方法またはそれに準じる方法によって行うことができる。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する、菅らの方法（例えば、特開平９－３２４００１号公報など参照）、β１，３－グルカンを精製する、吉田らの方法（例えば、特開平８－２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の生体高分子塩を精製する、ウィリアムらの方法（例えば、特表２００２－５３０４４０号公報など参照）、ポリサッカライドを精製する、ジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１３６号パンフレットなど参照）、ルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号明細書など参照）、アルギネートを精製する、ハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９４）４０：６３８－６４３など参照）等またはこれらに準じる方法によって実施することができる。本発明の低エンドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルターや帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎水性物質、樹脂または活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５－０３６０３６号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施することができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。アルギン酸の種類などに合わせて適宜選択するのが望ましい。

【0044】

エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ）による方法、エントスペシー（登録商標）ＥＳ－２４Ｓセット（生化学工業株式会社）を用いる方法などによって測定することができる。

【0045】

本発明の組成物に含有されるアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシンの処理方法は特に限定されないが、その結果として、アルギン酸の１価金属塩のエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、１００ＥＵ／ｇ以下、とりわけ好ましくは５０ＥＵ／ｇ以下、特には３０ＥＵ／ｇ以下である。低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（持田製薬株式会社）、ＰＲＯＮＯＶＡ^ＴＭＵＰ ＬＶＧ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）など市販品により入手可能である。
このように低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムを、本明細書では「高純度アルギン酸ナトリウム」（UPAL）ともいう。

【0046】

５．アルギン酸の１価金属塩の溶液の調製
本発明の組成物は、アルギン酸の１価金属塩の溶液を用いて調製してもよい。アルギン酸の１価金属塩の溶液は、公知の方法またはそれに準じる方法により調製することができる。すなわち、本発明で用いられるアルギン酸の１価金属塩は、前述の褐藻類を用いて、酸法、カルシウム法など公知の方法により製造することができる。具体的には、例えば、これらの褐藻類から、炭酸ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液を用いて抽出した後、酸（例えば、塩酸、硫酸など）を添加することによってアルギン酸を得ることができ、アルギン酸のイオン交換によりアルギン酸の塩を得ることができる。前述のとおり、低エンドトキシン処理を行う。アルギン酸の１価金属塩の溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、精製水、蒸留水、イオン交換水、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。例えば、ミリＱ水をろ過滅菌して用いることができる。

【0047】

本発明の組成物が、凍結乾燥体などの乾燥状態で提供される場合にも、上記の溶媒を用いて流動性のある溶液に調製することができる。
また、本発明の組成物を得るための操作は全てエンドトキシンレベル、および、細菌レベルの低い環境下で行うことが望ましい。例えば、操作はクリーンベンチで、滅菌器具を使用して行うことが好ましく、使用する器具を市販のエンドトキシン除去剤で処理してもよい。

【0048】

６．本発明の組成物の見掛け粘度
本発明のいくつかの態様の組成物は、流動性のある液体状、すなわち、溶液状である。本発明の組成物は、髄核部位への適用時に流動性を有する。本発明の態様の１つでは、好ましくは、本発明の組成物は、組成物を２０℃で１時間静置した後に、２１Ｇの注射針で注入できる流動性を有する。この態様の本発明の組成物の見掛け粘度は、本発明の効果が得られれば、特に限定されないが、粘度が低すぎると適用した部位の周辺組織への密着性が弱くなる恐れがあるため、好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１００ｍＰａ・ｓ以上、さらに好ましくは２００ｍＰａ・ｓ以上、とりわけ好ましくは５００ｍＰａ・ｓ以上である。見掛け粘度が高すぎると取扱性が悪くなる恐れがあるため、好ましくは５００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下であり、さらに好ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下である。見掛け粘度が２００００ｍＰａ・ｓ以下のときシリンジ等での適用がより容易に行える。しかし、見掛け粘度が２００００ｍＰａ・ｓ以上であっても加圧型や電動型の充填器具やその他の手段を用いて適用可能である。本発明の組成物の好ましい範囲は、１０ｍＰａ・ｓ～５００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは、１００ｍＰａ・ｓ～３００００ｍＰａ・ｓ、さらに好ましくは２００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓ、またさらに好ましくは５００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓ、とりわけ好ましくは７００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓである。別の好ましい態様では、５００ｍＰａ・ｓ～１００００ｍＰａ・ｓ、あるいは２０００ｍＰａ・ｓ～１００００ｍＰａ・ｓであってもよい。本発明のいくつかの態様の組成物は、シリンジ等で対象に適用することもできる粘度である。

【0049】

アルギン酸類の水溶液などアルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の見掛け粘度の測定は、常法に従い測定することができる。例えば、回転粘度計法の、共軸二重円筒形回転粘度計、単一円筒形回転粘度計（ブルックフィールド型粘度計）、円すい－平板形回転粘度計（コーンプレート型粘度計）等を用いて測定することができる。好ましくは、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従うことが望ましい。本発明において粘度測定は２０℃の条件で行うことが望ましい。後述のように本発明の組成物が細胞など溶媒に溶解しないものを含有する場合には、粘度測定を正確に行うため、組成物の見掛け粘度は、細胞などを含有しない状態の見掛け粘度とすることが好ましい。

【0050】

本発明においては、アルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の見掛け粘度の測定は、特に、コーンプレート型粘度計を用いて測定することがより望ましい。例えば、以下のような測定条件で測定することが望ましい。試料溶液の調製は、MilliQ水を用いて行う。測定温度は２０℃とする。コーンプレート型粘度計の回転数は、アルギン酸１価金属塩の１％溶液測定時は１ｒｐｍ、２％溶液測定時は０．５ｒｐｍとし、これを目安にして決定する。読み取り時間は、アルギン酸１価金属塩の１％溶液測定の場合は２分間測定し、開始１分から２分までの平均値とする。２％溶液測定の場合は２．５分間測定し、開始０．５分から２．５分までの平均値とする。試験値は３回の測定の平均値とする。

【0051】

本発明の組成物の見掛け粘度は、例えば、アルギン酸の１価金属塩の濃度、分子量、又はＭ／Ｇ比等を制御することにより調整することができる。
アルギン酸の１価金属塩の溶液の見掛け粘度は、溶液中のアルギン酸１価金属塩濃度が高い場合に粘度が高く、濃度が低い場合に粘度が低くなる。またアルギン酸１価金属塩の分子量が大きい場合に粘度が高く、分子量が小さい場合に粘度が低くなる。

【0052】

アルギン酸の１価金属塩の溶液の見掛け粘度は、Ｍ／Ｇ比によって影響を受けるため、例えば、溶液の粘度等により好ましいＭ／Ｇ比を有するアルギン酸を適宜選択することができる。本発明に用いるアルギン酸のＭ／Ｇ比は、約０．１～５．０であり、好ましくは約０．１～４．０、より好ましくは約０．２～３．５である。
前述のように、Ｍ／Ｇ比が主に海藻の種類によって決まることなどから、原料として用いられる褐藻類の種類はアルギン酸の１価金属塩の溶液の粘度に影響を及ぼす。本発明で用いられるアルギン酸としては、好ましくは、レッソニア属、マクロシスティス属、ラミナリア属、アスコフィラム属、ダービリア属の褐藻由来であり、より好ましくはレッソニア属の褐藻由来であり、特に好ましくはレッソニア・ニグレッセンズ（Ｌｅｓｓｏｎｉａ ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）由来である。

【0053】

７．間葉系幹細胞
本発明において使用される間葉系幹細胞は、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞であり、骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用が期待されている。
間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織、胎盤組織、歯髄又は臍帯組織等の種々の組織から取得できる。その精製プロセスは、例えば以下のとおりである。
ヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、およびウマヤギ、ウサギ等 ）から採取した少量の脂肪片を酵素処理して得られる細胞型の混合集団から、遠心分離によって浮遊性の脂肪細胞集団を分離し、培養液を満たした培養器の天井面に接触させた状態で静置したときに下床面に沈降して増殖する線維芽様細胞を継代培養によって増殖させる。
また、本発明においては、iPS細胞由来の間葉系幹細胞や、市販の間葉系幹細胞を使用することも可能である。本発明において、間葉系幹細胞は、好ましくは未分化状態である及び／又は誘導分化の処置なしに髄核に適用される。未分化状態とは、分化能を有する幹細胞が分化していない状態が維持されていることをいう。「分化誘導の処置なしに」とは、例えば、分化能を有する幹細胞を分化誘導培地を用いて特定の細胞に分化させる等の処置をしないことを指す。

【0054】

８．ヒト骨髄由来高純度間葉系幹細胞
（１）RECクローン
本発明者は、以前の研究により、LNGFR（CD271)が陽性の間葉系幹細胞（CD271+細胞）、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の間葉系幹細胞（CD271+CD90+細胞）の中から、増殖が早い高速増殖性の細胞クローン（Rapidly Expanding Clone：REC）を単離することに成功した。

【0055】

このRECは、96ウェルプレートに1個ずつ細胞を播種して培養したときに、2週間でコンフルエントに達することができる細胞であり、従来法で得た間葉系幹細胞と比較し、増殖能、分化能及び遊走能の全てが1000倍以上の能力を有する。そして、特に遊走能を保持しているため、経静脈内投与が可能となり、骨・軟骨形成不全症等の重篤な全身性疾患への応用が期待できる。
本発明においては、上記RECクローンのうち、分化能や増殖能においてばらつきの少ない細胞クローンを使用することができる。

【0056】

本発明の細胞クローンを含む細胞集団は、LNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性であり、かつ、増殖が早い間葉系幹細胞クローンの集団であり、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴を満たす。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である。
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である。

【0057】

（２）ヒト間葉系幹細胞濃縮方法
本発明において、LNGFR（CD271)が陽性、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の間葉系幹細胞を得るには、例えばWO2009/31678号に記載の方法に従うことができる。
その方法の概要は以下の通りである。

【0058】

まず、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団から、LNGFR（CD271)が陽性（CD271+）、又はCD271及びCD90が共陽性（CD271+CD90+）の細胞分画を選別することにより、間葉系幹細胞を高度に濃縮する。なお、ヒト間葉系幹細胞が含まれる細胞集団に血球系細胞が含まれる場合は、非血球系の細胞を選別するために、CD45及びCD235aが共陰性（CD45-CD235a-）の細胞を選別する工程を加えてもよい。

【0059】

間葉系幹細胞が含まれる細胞集団は、フローサイトメトリーやアフィニティー・クロマトグラフィーによって調製することができる。
この細胞集団を得るための材料は特に限定されないが、例えば、骨髄、脂肪組織、臍帯血、末梢血（G-CSF投与後の末梢血を含む）等が挙げられる。なお、骨髄は、脊椎、胸骨、腸骨等の骨髄を用いればよい。また、細胞として、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を挙げることもできる。

【0060】

細胞調製の際、材料が間葉系幹細胞を巻き込んだ細胞塊になっている場合には、必要により、材料に対してピペッティング等による物理的処理や、トリプシン、コラゲナーゼ等による酵素処理を行うことができる。また、材料に赤血球が混入している場合には、予め赤血球を溶血しておくことが好ましい。
上記の通り調製された細胞集団を用い、CD271+細胞又はCD271+CD90+細胞を選別する。

【0061】

CD271+細胞又はCD271+CD90+細胞を選別する方法としては、例えば、抗体を用いる方法が挙げられる。
抗体は、CD271+細胞又はCD271+CD90+細胞を選別することが可能な、抗CD271抗体及び/又は抗CD90抗体である。選別にフローサイトメトリーを用いる場合には、FITC、PE、APC等の異なる蛍光色素で標識された抗CD271抗体、又は抗CD271抗体と抗CD90抗体を、適宜組み合わせて用いることにより、生細胞を短時間で選別することが可能になる。また、フローサイトメトリー以外にも、磁気ビーズを用いる方法やアフィニティー・クロマトグラフィーを用いる方法によって、CD271+CD90+細胞を選別することが可能である。
なお、これらの方法を用いる前に、予め、死細胞を染色する蛍光色素（例えば、PI）を細胞集団と反応させ、蛍光で染色された細胞を除去することにより、死細胞を除去してもよい。

【0062】

（３）REC細胞濃縮
次に、選別したLNGFR陽性細胞、又はLNGFR及びThy1共陽性細胞を単一細胞（クローン）培養し、増殖が速いロットを選択することで、増殖能・分化能・遊走能にすぐれた高純度ヒト間葉系幹細胞（REC: Rapidly Expanding Clone）を得る。

【0063】

ヒト骨髄又は脂肪・胎盤絨毛膜から単核細胞を調製し、骨髄単核細胞を抗LNGFR単独、又は抗LNGFR及び抗Thy1で染色する。次に、フローサイトメトリー（セルソータ）を用い、LNGFR陽性細胞、又はLNGFR陽性及びThy1陽性細胞を96穴培養プレートにクローンソートする。すなわち、１ウェルに細胞１個ずつ播種する。単一細胞培養２週間後に培養プレートを顕微鏡下で撮影し、コンフルエント又はセミコンフルエントになったウェルを選別し、当該ウェルに含まれる細胞をRECとする。

【0064】

ここで、「増殖が速い」、「高速増殖性」とは、96穴培養プレートの１ウェルに細胞１個ずつ播種して培養したときに、培養開始２週間後又はそれ以前に培養プレートがコンフルエント又はセミコンフルエントになる程度の増殖速度(倍加時間(ダブリングタイム)が２６±１時間）を有することを意味する。

【0065】

コンフルエントとは、培養容器表面（培養面）の90％以上を培養細胞が覆っている状態である。また、セミコンフルエントとは、培養容器表面（培養面）の70～90％を培養細胞が覆っている状態である。使用する培養器具のサイズ及び種類は、細胞の増殖速度に応じ適宜変更可能である。遅れて増殖している細胞（Moderately/Slowly Expanding Cells）、すなわち単一細胞培養２週後になってもセミコンフルエント又はコンフルエントにならなかった細胞は破棄する。RECとして選別した各ウェルから回収したRECを各ウェル毎に培養フラスコに移入し、さらにコンフルエントになるまで培養する（拡大培養）。その後、拡大培養した細胞を別々に回収する。１ウェル由来のRECを１ロットとする。

【0066】

本発明において使用されるRECは、１ウェルに細胞１個ずつ播種するクローンソートにより得られたものであるから、増殖した細胞同士の遺伝形質はすべて同じである。従って、本発明においては細胞集団全体を「クローン」と言うことも、細胞集団を構成する個々の細胞を「クローン」ということもある。

【0067】

また、本発明において、選別に使用するためのRECは、RECマーカー（抗Ror2）により予め評価しておくこともできる。例えば、前記拡大培養後、全ロットから付着増殖した細胞を回収し、各ロットの一部 (1～3×10⁵個程度)の細胞をとりわけて、抗Ror2に対するモノクローナル抗体で単一染色を行う。抗Ror2に対するモノクローナル抗体で単一染色を行う手法は公知である（WO2016/17795）。要約すると、RECマーカーを用いたフローサイトメトリー解析により、回収細胞におけるRECマーカー陽性細胞の比率を求める。比率は、定量的PCRを用いてRor2のmRNA発現を定量してもよいし、顕微鏡により同比率をマニュアルにより求めてもよい。上記陽性比率が一定値（例えば65％）以上のロット（細胞集団）を合格とし、これを後述の選別に使用することもできる。

【0068】

（４）幹細胞集団の選別
本発明においては、個々のロットのRECクローンについて、細胞の増殖能、脂肪分化能、REC特異的マーカー発現量、細胞サイズの均一性を調べ、それぞれの相関性を解析することにより、高純度でより細胞性能の高いRECを選別することが可能となった。
本発明においては、前方散乱光の変動係数（Coefficient of Variation：CV値）及び細胞の平均サイズを選別の指標とする。
前方散乱光（Forward Scatter）とは、レーザー光の軸に対して前方向の小さい角度で散乱する光である。前方散乱光は、細胞表面で生じるレーザー光の散乱光、回折光及び屈折光からなり、サンプルの大きさに関する情報が得られる。

【0069】

変動係数（Coefficient of Variation：CV）は、標準偏差を平均値で割った値のことで、単位の異なるデータのばらつきや、平均値に対するデータとばらつきの関係を相対的に評価する際に用いる数値である。
本発明においては、上記CV値が40％以下、好ましくは35％以下のものを選別する。CV値が40％以下の細胞集団、より好ましくは35％以下の細胞集団は、大きさが均一な細胞により構成されている細胞集団である。好ましくは、CV値は30％以下、25％以下、又は20％以下である。 また、本発明により選別された細胞集団における細胞の平均サイズは、20μｍ以下である。好ましくは18μｍ以下であり、14μｍ～18μｍの範囲の大きさである。

【0070】

本発明は、LNGFR陽性細胞、又はLNGFR（CD271)及びThy-1（CD90)が共陽性の高速増殖性間葉系幹細胞クローンの細胞集団の品質を評価する方法も提供する。本発明においては、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴、好ましくは両方の特徴を満たす細胞集団を、高品質であると判定する。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が40％以下である。
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である。
このようにして評価及び選別された細胞集団は、当該集団を構成する細胞クローンの数が限定されるものではなく、例えば1mlの溶液に0.8X10⁷～1.2X10⁷個程度の細胞を有する。

【0071】

また、本発明の好ましい態様においては、以下の（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つの特徴、好ましくは両方の特徴を満たす細胞集団を、高品質であると判定する。
（ａ）フローサイトメトリーの前方散乱光の変動係数が35％以下である。
（ｂ）平均細胞サイズが20μｍ以下である。
このようにして評価及び選別された細胞集団は、当該集団を構成する細胞クローンの数が限定されるものではなく、例えば1mlの溶液に0.8X10⁷～1.2X10⁷個程度の細胞を有する。

【0072】

９．本発明の組成物の調製
本発明の組成物は、例えば低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩、及び上記間葉系幹細胞を有効成分として含有することを特徴とする。本発明者らは、本発明の組成物を生体の髄核部位に充填した場合に、アルギン酸の１価金属塩自体が髄核組織の再生または治療効果を発揮することを初めて見出した。有効成分として含有するとは、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩が患部に適用された際に、髄核組織の再生または治療効果を発揮できる量で含有されていればよく、少なくとも、組成物全体の０．１ｗ／ｖ％以上であることが好ましく、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは、１ｗ／ｖ％である。本発明の組成物中の好ましいアルギン酸の１価金属塩濃度は、好ましくは０．５ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％、より好ましくは１ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、さらに好ましくは、１ｗ／ｖ％～３ｗ／ｖ％で、とりわけ好ましくは１．５ｗ／ｖ％～２．５ｗ／ｖ％である。また、別の態様では、本発明の組成物中のアルギン酸の１価金属塩濃度は、好ましくは、０．５ｗ／ｗ％～５ｗ／ｗ％、より好ましくは１ｗ／ｗ％～５ｗ／ｗ％であり、さらに好ましくは、１ｗ／ｗ％～３ｗ／ｗ％で、とりわけ好ましくは１．５ｗ／ｗ％～２．５ｗ／ｗ％であってもよい。

【0073】

好ましいエンドトキシンレベルを示すまで精製したアルギン酸の１価金属塩を用いて、上記のように組成物を作製した場合には、組成物のエンドトキシン含有量は、通常、５００ＥＵ／ｇ以下であり、より好ましくは３００ＥＵ／ｇ以下、さらに好ましくは１５０ＥＵ／ｇ以下であり、とりわけ好ましくは１００ＥＵ／ｇ以下である。

【0074】

本発明の組成物中に含有させる細胞数（細胞濃度）は、例えば、１×１０^４個／ｍｌ以上、または１×１０^５個／ｍｌ以上、好ましくは、１×１０^４個／ｍｌ～１×１０^７個／ｍｌの細胞である。

【0075】

本発明の組成物は、細胞の成長を促進する因子を含ませることもできる。そのような因子としては、例えば、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ－β、ＩＧＦ－１，ＰＤＧＦ，ＣＤＭＰ（cartilage-derived-morphogenetic protein），ＣＳＦ，ＥＰＯ、ＩＬ、ＰＲＰ（Platelet Rich Plasma）、ＳＯＸおよびＩＦ等が挙げられる。これらの因子は、組み換え法により製造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。尚、本発明のいくつかの態様の組成物は、これらの成長因子を含まない。成長因子を含まない場合でも、髄核の再生は十分に良好であるし、積極的に細胞の成長を促す場合と比較してより安全性も高い。

【0076】

本発明の組成物は、細胞死を抑制する因子を含ませることもできる。細胞死を引き起こす因子としては、例えば、Caspase、TNFα等が挙げられ、これらを抑制する因子としては、抗体やsiRNA等が挙げられる。これらの細胞死を抑制する因子は、組み換え法により製造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。尚、本発明のいくつかの態様の組成物は、これらの細胞死を抑制する因子を含まない。細胞死を抑制する因子を含まない場合でも、髄核の再生は十分に良好であるし、積極的に細胞死を抑制する場合と比較してより安全性も高い。

【0077】

尚、本発明の１つの態様では、本発明の組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩以外に、椎間板の髄核組織に対し薬理作用を発揮する成分を含まない。低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩のみを有効成分として含有する組成物においても、充分な髄核の再生または治療効果を発揮しうる。
本発明のいくつかの態様では、必要に応じて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤等、通常医薬に用いられる成分を本発明の組成物に含有させることもできる。

【0078】

１０．本発明の組成物の硬化
本発明の組成物は、髄核部位への適用後に一部分を硬化するように用いられる。
「一部分を硬化する」とは、流動性を有する本発明の組成物の一部分に架橋剤を接触させて、架橋剤と接触した組成物の全体ではなく一部分をゲル化し、固めることをいう。好ましくは、流動性を有する本発明の組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させることで本発明の組成物の一部分を硬化する。本発明では、使用する担体に適した架橋剤や硬化手段を選択できる。

【0079】

本発明のいくつかの態様では、「組成物を髄核部位への適用後に一部分を硬化させる」とは、髄核部位への充填と同様の架橋剤の使用方法および使用比率を用いて、in vitroで、直径６ｍｍの試験管に低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム５００μＬおよび架橋剤を充填して１時間静置後に、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割はゲル化しておらず、ゲル化していない部分は、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割が２１Ｇの注射針をつけたシリンジで吸引できることで示されてもよい。

【0080】

組成物が髄核部位への充填後にもこのような性状を示すことにより、充填後に椎間板の頭尾側から圧縮力をかけた場合でも組成物が逸脱することがないと考えられる。「組成物の表面の少なくとも一部分」は、例えば、髄核へつながる椎間板の表面の開口部であり、好ましくは、髄核部位に組成物を適用するのに使用した椎間板の表面の開口部、すなわち組成物の充填口である。組成物の表面の少なくとも一部分をゲル化して固めることで、椎間板から組成物が漏れ出すのを効果的に防ぐことができる。椎間板表面の組成物の充填口は、例えば、椎間板の表面にシリンジの針やメスで作製した組成物の充填に用いられた開口部、あるいは、椎間板ヘルニア摘出時にメス等により作製された椎間板表面の開口部であることが好ましい。この態様における椎間板とは好ましくは線維輪である。

【0081】

本発明の組成物は、好ましくは、対象の髄核部位に適用する前に、組成物を硬化させる量の架橋剤を含有しない。このため、本発明の組成物には、一定時間経過後も組成物を硬化させない量の架橋剤が含まれていてもよい。ここでの一定時間とは、特に限定されないが、好ましくは３０分～１２時間程度である。「組成物を硬化させる量の架橋剤を含有しない」ことは、例えば、組成物を２０℃で１時間静置した後に、２１Ｇの注射針をつけたシリンジで注入できることで示されてもよい。本発明のいくつかの態様の組成物には、架橋剤が含まれていない。

【0082】

架橋剤としては、アルギン酸の１価金属塩の溶液を架橋することにより、その表面を固定化することができるものであれば、特に限定されない。架橋剤として、例えば、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｂａ^２＋、Ｓｒ^２＋などの２価以上の金属イオン化合物、分子内に２～４個のアミノ基を有する架橋性試薬などが挙げられる。より具体的には、２価以上の金属イオン化合物として、ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＣａＳＯ_４、ＢａＣｌ_２等を、分子内に２～４個のアミノ基を有する架橋性試薬として、窒素原子上にリジル（ｌｙｓｙｌ）基（－ＣＯＣＨ（ＮＨ_２）－（ＣＨ_２）_４－ＮＨ_２）を有することもあるジアミノアルカン、すなわちジアミノアルカンおよびそのアミノ基がリジル基で置換されてリジルアミノ基を形成している誘導体が包含され、具体的にはジアミノエタン、ジアミノプロパン、Ｎ－（リジル）－ジアミノエタン等を挙げることができるが、入手しやすいこと、ゲルの強度等の理由から、特に、ＣａＣｌ_２溶液とするのが好ましい。

【0083】

本発明のいくつかの態様の１つでは、本発明の組成物の表面に架橋剤を接触させるタイミングは、好ましくは、本発明の組成物を髄核部位へ適用した後である。本発明の組成物の一部分に架橋剤（例えば、２価以上の金属イオン）を接触させる方法としては、特に限定されないが、例えば、シリンジ、噴射器（スプレー）などで、２価以上の金属イオンの溶液を組成物表面にかける方法などを挙げることができる。例えば、架橋剤は、ゆっくりと数秒～１０数秒、椎間板に形成された組成物の充填口にかけ続けてもよい。その後は、必要に応じて、充填口付近に残存する架橋剤を除去する処理を加えてもよい。架橋剤の除去は、例えば、生理食塩水等による適用部位の洗浄であってもよい。

【0084】

架橋剤の使用量は、本発明の組成物の適用量、椎間板表面の組成物の充填口の大きさ、椎間板の髄核の適用部位サイズ、などを考慮して適宜調節するのが望ましい。組成物の充填口の周囲組織に架橋剤の影響を強く及ぼさないためには、架橋剤の使用量を過剰にならないよう調節する。２価以上の金属イオンの使用量としては、アルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の表面を固めることができる量であれば、特に限定されない。しかし、例えば、１００ｍＭのＣａＣｌ₂溶液を用いる場合には、椎間板の表面の充填口が直径１ｍｍ程度の場合には、ＣａＣｌ₂溶液の使用量は０．３ｍｌ～５．０ｍｌ程度であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｌ～３．０ｍｌ程度である。椎間板表面の充填口が椎間板ヘルニア摘出時にメス等により作製され、辺縁が５ｍｍ×１０ｍｍ程度の場合には、１００ｍＭのＣａＣｌ２溶液の使用量は、０．３ｍｌ～１０ｍｌ程度であることが好ましく、より好ましくは、０．５ｍｌ～６．０ｍｌ程度である。適用部位における本発明の組成物の状態を見ながら、適宜増減できる。

【0085】

架橋剤にカルシウムが含まれる場合、カルシウムの濃度が高い方が、ゲル化が早く、また、より硬いゲルを形成することができることが知られている。しかし、カルシウムには細胞毒性があるため、濃度が高すぎると、本発明の組成物の椎間板の髄核再生作用に悪影響を及ぼす恐れもある。そこで、アルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の表面を固めるのに、例えばＣａＣｌ₂溶液を用いる場合には、好ましくは、２５ｍＭ～２００ｍＭ、より好ましくは、５０ｍＭ～１５０ｍＭの濃度とするのが望ましい。

【0086】

本発明においては、好ましくは、組成物に架橋剤を添加後、一定時間静置した後に、添加した部位に残存する架橋剤を洗浄などにより除去することが望ましい。静置する一定時間は特に限定されないが、好ましくは、約１分間以上、より好ましくは約４分間以上静置して組成物の表面をゲル化させることが望ましい。あるいは、約１分～約１０分間、より好ましくは約４分～約１０分間、約４分間～約７分間、さらに好ましくは約５分間静置することが好ましい。この一定時間の間は、組成物と架橋剤とを接触させた状態にすることが望ましく、組成物の液面が乾かないように、架橋剤を適宜追加してもよい。

【0087】

例えば、アルギン酸ナトリウム溶液をＣａＣｌ₂溶液中に滴下し、ゲル化して作成したものにアルギン酸ビーズがある。しかし、アルギン酸ビーズは、適用部位に押し付けて適用する必要があるが、適用部位の大きさにあったものを作成する必要があり、実際の臨床で使うには、技術的に困難である。また、ＣａＣｌ₂溶液を架橋剤として用いた場合、ビーズ表面のＣａイオンが周囲組織に接触するため、カルシウムの細胞毒性の問題もある。これに対して、本発明の組成物は、溶液状であるから、いずれの形状の適用部位へも容易に適用することができるし、適用部位の全体を本組成物で覆うことができ、周囲組織への密着性も良い。本発明の組成物の周囲組織に接触する部分は、カルシウム濃度を低く保つことが可能であり、カルシウムの細胞毒性の問題も少ない。本発明の組成物の周囲組織に接触する部分は、架橋剤の影響が少ないから、本発明の組成物は、容易に適用部位の細胞や組織にコンタクトできる。好ましくは、本発明の組成物は、髄核部位に適用した後、約４週間も経過すれば、適用した部位において識別できなくなるほど生体の組織と融合し、生体への親和性も高い。

【0088】

本発明の組成物を髄核部位に適用する際に、架橋剤により一部分をゲル化させると、本発明の組成物は患部で一部分が硬化し、周囲組織に密着した状態で局在し、髄核部位からの漏出を防ぐことができる。加えて、本発明の組成物が周囲組織に密着することにより、本発明の組成物の髄核再生効果がより強力に発揮される。

【0089】

髄核部位へ充填した補填材全体をゲル化させ硬化させた場合には、椎間板に頭尾側から圧縮力をかけると椎間板表面の組成物充填口から硬化ゲルが逸脱する現象がみられたのに対し、本発明の溶液状の組成物を髄核部位に充填した場合には、頭尾側から圧縮力をかけた場合にも椎間板表面の充填口からの逸脱はない。すなわち、実際に本発明の組成物により髄核補填を行った場合、椎間板に対する上下からの圧力に対しても、補填した組成物が漏れ出る恐れが低いといえる。

【0090】

また、硬化したゲルを髄核部位へ充填する場合には、硬化したゲルが脊柱管内に突出し、重大な神経障害を引き起こす危険性がある。一方、本発明の溶液状の組成物は、そのような危険性は低く、合併症発症の危険が低い。

【0091】

本発明の一態様では、細胞を包埋する担体を硬化せず用いてもよい。臨床症状や損傷部の大きさ・形状に合わせて、架橋剤を用いずに適用することもできる。

【0092】

１１．本発明の組成物の適用
本発明の組成物は、ヒト、またはヒト以外の生物、例えば、トリおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、およびウマ）の椎間板の髄核部位に適用し、髄核の再生を促進するために用いられる。

【0093】

本発明の組成物の形態は、好ましくは流動性のある液体状、すなわち、溶液状である。本発明において「流動性を有する」とは、その形態を不定形に変化させる性質を持つことを意味し、例えば溶液のように、常に流れ動く性質を持つことを必要としない。好ましくは、例えば、組成物をシリンジなどに封入し、椎間板の髄核部位へ注入することができるような流動性を有することが望ましい。また、本発明のいくつかの態様の１つでは、組成物を２０℃で１時間静置した後に、１４Ｇ～２６Ｇの注射針をつけたシリンジで椎間板の髄核部位へ注入できるような流動性を有することが望ましく、さらに好ましくは２１Ｇの注射針で注入できることが望ましい。本発明の組成物が凍結乾燥体などの乾燥状態で提供される場合には、適用時に溶媒などを用いて上述のような流動性のある組成物とすることができる。

【0094】

溶液状である本発明の組成物は、シリンジ、ゲル用ピペット、専用注射器、専用注入器、充填器具などで椎間板の髄核部位に容易に適用することができる。
本発明の組成物の粘度が高い場合には、シリンジで適用するのが困難になるため、加圧型や電動型などのシリンジを用いてもよい。シリンジなどを使用しなくても、例えば、へら、棒などで髄核部位の欠損部へ適用してもよい。シリンジで注入する場合、例えば、１４Ｇ～２７Ｇまたは１４Ｇ～２６Ｇの針を使用するのが好ましい。

【0095】

本発明の組成物の髄核部位への適用方法は、特に限定されないが、好ましくは、公知の外科的手法により患部を直視下に露出した後に、あるいは、顕微鏡下又は内視鏡下で、シリンジ、充填器具等を用いて、本発明の組成物を髄核部位に適用することができる。好ましい態様の一つでは、例えば、線維輪表面から髄核部位へ向かって充填器具の針などを挿入し、本発明の組成物を適用してもよい。

【0096】

本発明の組成物は溶液状であるため、髄核の縮小、髄核部位の空洞や欠損部など、いずれの形状の髄核部位にも適合することができ、髄核の縮小、空洞または欠損部の全体を充填することもできる。髄核の縮小、髄核部位の空洞や欠損部は、椎間板の変性または損傷により生じたものであり得るし、あるいは、外科的手術で髄核の少なくとも一部を除去または吸引することにより生じたものでもあり得る。好ましくは、髄核の少なくとも一部を除去することで形成した髄核欠損部に、本発明の組成物を適用することが望ましい。

【0097】

髄核の少なくとも一部の除去は、特に限定されず、例えば、直視下、経皮的、顕微鏡視下、又は内視鏡的に行われる椎間板髄核摘出術等であってもよい。また例えば、背中に２ｃｍ～１０ｃｍの切開を加え、筋肉を椎弓という脊椎の後方要素後面から剥離し、椎弓間の靭帯を切除し、神経と椎間板ヘルニアを確認し、神経を圧迫しているヘルニアを摘出する方法（ラブ法）であってもよい。また、髄核にレーザーを照射し、髄核の容量を減少させる方法であってもよい。

【0098】

本発明の組成物の髄核部位への適用後は、前術のとおり、架橋剤により組成物の一部を硬化させることができる。
本発明の組成物の適用量は、適用する対象の髄核の適用部位の容積に応じて決めれば良く、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｌ～１０ｍｌ、より好ましくは、０．１ｍｌ～５ｍｌであり、さらに好ましくは０．２ｍｌ～３ｍｌである。本発明の組成物を髄核欠損部に適用する場合は、髄核部位の欠損部容積を十分に満たすように注入されるのが望ましい。

【0099】

本発明の組成物の適用回数・頻度は、症状と効果に応じて増減可能である。例えば、１回のみの適用であってもよいし、１月～１年に１回の適用を継続して行ってもよい。
アルギン酸は動物の体内に元来存在しない物質であるため、動物はアルギン酸を特異的に分解する酵素を保有していない。アルギン酸は動物体内においては、通常の加水分解により徐々に分解されるが、ヒアルロン酸等のポリマーに比べ体内の分解が緩やかであり、また髄核内には血管が存在しないため、髄核内に充填した場合、長期間の効果持続が期待できる。

【0100】

本発明の組成物が、前述のような細胞や成長因子とともに提供されない場合でも、本発明の組成物が髄核部位へ適用される際に、前述の細胞や成長因子、細胞死抑制因子、後述の他の薬剤などが併用して用いられてもよい。
本発明の組成物は、髄核部位へ適用することにより、椎間板組織全体及び髄核の変性変化を抑制し、再生を促進する効果を発揮する。そのため、本発明の組成物は、椎間板の髄核補填用組成物として好ましく用いられる。

【0101】

本発明の組成物の好ましい態様の１つは、椎間板の変性抑制のための組成物、より好ましくは、椎間板髄核の変性抑制のための組成物である。「椎間板又は髄核の変性」とは、加齢などにより椎間板の細胞数、水分含有量、細胞外マトリックス（タイプＩＩコラーゲン、アグリカン等）等が低下して形態的な変化が生じ、機能低下をきたす状態をいい、進行すると椎間板のショック吸収体としての機能が果たせなくなる。本明細書において「変性の抑制」は、未処置の場合と比較して、変性変化が抑制されていればよく、必ずしも変性のない状態にすることを意味するものではない。

【0102】

本発明の組成物の態様の１つは、髄核再生のための組成物である。髄核再生とは、線維芽様細胞の集積を防ぎ、髄核細胞の比率が高い髄核が再生されることを目的とするものであり、ＩＩ型コラーゲンやプロテオグリカンに富む髄核組織が再生されることを意図するものである。この髄核再生の語には、髄核の変性を抑制することも包含される。本発明の好ましい態様のひとつは、本発明の組成物を適用して再生された髄核の組成が、天然の正常な髄核の組成に近いことが望ましい。

【0103】

また、本発明の好ましい態様の組成物は、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のために用いられる。本明細書において「治療、予防または再発抑制」は、治療、予防、再発抑制、低減、抑制、改善、除去、発症率の減少、発症時期の遅延、進行抑制、重症度の軽減、再発率の低下、再発時期の遅延、臨床症状の緩和等を含む。本明細書において「治療、予防または再発抑制」は、（慢性的な）疼痛の緩和を含む。本発明の組成物の好ましい態様、特に細胞を包埋する担体を硬化せずに用いる場合は、椎間板変性および／または椎間板損傷に伴う（慢性的な）疼痛（特に腰痛）を抑制するために用いられる。

【0104】

これらの本発明の組成物の好ましい態様、組成物の使用方法等は、前記の記載に従う。
椎間板変性および／または椎間板損傷は、例えば、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、腰部脊柱管狭窄症、椎間板損傷、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症ともいう）からなる群から選択される少なくとも１種の状態または疾患である。椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、腰痛を伴うものであってもよい。
本発明の組成物は、臨床症状や損傷部の大きさ・形状に合わせて、細胞を包埋する担体を硬化せず用いてもよく、そのような態様において、椎間板変性および／または椎間板損傷に伴う疼痛、特に慢性的な腰痛を抑制するために用いられる。

【0105】

１２．治療方法
本発明は、前記本発明の組成物を用いる、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法を提供する。好ましくは、本発明の治療方法は、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法であって、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組成物を、前記治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、適用した前記組成物の一部分を硬化することを含む。

【0106】

本発明の治療方法は、本発明の組成物を髄核部位へ適用する前に、髄核の少なくとも一部を除去する工程を含んでもよい。
前記椎間板変性および／または椎間板損傷は、例えば、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、椎間板損傷からなる群から選択される少なくとも１種の状態または疾患である。本発明のいくつかの態様の治療方法では、前記椎間板変性および／または椎間板損傷は、椎間板ヘルニアであり、特には、腰椎椎間板ヘルニアである。本発明のいくつかの態様の治療方法では、前記椎間板変性および／または椎間板損傷は、腰部脊柱管狭窄症に伴う椎間板ヘルニア（混合性腰部脊柱管狭窄症ともいう）である。椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、慢性腰痛であってもよい。椎間板変性及び／又は椎間板損傷が、これらの状態または疾患の組み合わせであってもよい。

【0107】

また、本発明のいくつかの態様の１つでは、前記本発明の組成物を用いる、椎間板の変性変化を抑制する方法を提供する。また、本発明の好ましい態様の１つでは、前記本発明の組成物を用いる、椎間板の髄核を再生する方法を提供する。
これらの方法は、間葉系幹細胞及び低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組成物を、椎間板変性抑制または髄核再生を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、適用した組成物の一部を硬化することを含む。前記の方法は、本発明の組成物を髄核部位へ適用する前に、髄核の少なくとも一部を除去する工程を含んでもよい。

【0108】

本発明の組成物の好ましい態様、具体的な椎間板の髄核部位への適用方法、組成物の硬化方法、用語の意義等は、前述のとおりである。他の椎間板の治療方法や治療薬を適宜組み合せて本発明の治療方法を行ってもよい。

【0109】

また、髄核部位に本発明の組成物を適用する前に、あるいは同時に、あるいは後で、ストレプトマイシン、ペニシリン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、およびアンホテリシンＢ等の抗生物質、アスピリン、非ステロイド性解熱鎮痛剤（NSAIDｓ）、アセトアミノフェン等の抗炎症薬、タンパク分解酵素、副腎皮質ステロイド薬、シンバスタチン、ロバスタチン等のＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤等の併用薬を充填するようにしても良い。これらの薬剤は本発明の組成物に混入して用いてもよい。または、経口あるいは非経口で併用して投与されてもよい。その他、筋弛緩薬、オピオイド鎮痛薬、神経性疼痛緩和薬等が必要に応じて経口あるいは非経口で併用して投与されてもよい。

【0110】

本発明は、本発明の組成物を製造するための低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の使用にも関する。
本発明の使用は、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための組成物を製造するための低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の使用であって、前記組成物が、対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する。

【0111】

本発明は、さらに、間葉系幹細胞及び低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組成物を、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、適用した組成物の一部を硬化する、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制において使用されるための低エンドトキシンアルギン酸の１価の金属塩を提供する。

【0112】

１３．本発明の組成物の評価
本発明の組成物は、発明者らが新たに確立したヒツジ重度椎間板変性モデルを用いて評価することができる。重度椎間板変性モデルは、（ａ）１回目の手術において、ヒツジ椎間板からヒツジ体重の０．００００４％～０．００００５％に相当する量の髄核組織を除去し、変性椎間板を作製すること、および（ｂ）１回目の手術の4週間後に、（ａ）で作製した変性椎間板からさらにヒツジ体重の０．０００１４％～０．０００１７５％に相当する量の髄核組織を除去することで、重度椎間板変性ヒツジモデルを作製することができる。

【0113】

好ましい態様では、体重４０～５０ｋｇのヒツジに対して、（ａ）１回目の手術において、ヒツジ椎間板から２０ｍｇの髄核組織を除去し、変性椎間板を作製すること、および（ｂ）１回目の手術の4週間後に、（ａ）で作製した変性椎間板からさらに７０ｍｇの髄核組織を除去することで、重度椎間板変性ヒツジモデルを作製することができる。
本発明の組成物は、下記の（ａ）～（ｄ）の手順で評価することができる。（ａ）１回目の手術において、ヒツジ椎間板から２０ｍｇの髄核組織を除去し、変性椎間板を作製すること、（ｂ）２回目の手術として、１回目の手術の４週間後に、（ａ）で作製した変性椎間板からさらに７０ｍｇの髄核組織を除去することで重度椎間板変性ヒツジモデルを作製すること（ｃ）２回目の手術の後、生じた空隙に対象の組成物を投与すること、および（ｄ）組成物の投与後に、変性モデルから採取した椎体及び椎間板に対してMRI、組織染色、免疫組織染色（IHC）からなる群から選択される少なくとも１つの評価方法にて、椎間板の再生を評価する。

【0114】

従前の大型動物モデルでは、正常椎間板を部分摘出することで椎間板変性モデルを作製していたため椎間板が自然治癒する可能性があった。しかし、既に変性した椎間板を部分摘出するこの動物モデルによって、ヒトの変性椎間板に対する本実施例の効果をより正確に評価することができる。

【0115】

実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。

【実施例0116】

ウサギ椎間板障害モデルにおける椎間板障害治療試験
本実施例では、骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）と生体吸収性超精製アルギン酸塩(低エンドトキシン高純度アルギン酸塩、UPALともいう)ゲルとを含む組成物を用いて、椎間板（IVD）を切除した後の変性IVDに対するBMSCの移植の再生効果を試験した。

【0117】

１. 材料及び方法
１．１．動物実験
すべての動物に対する処置は、北海道大学の動物管理使用委員会(承認番号: 13-0051)によって承認され、承認されたガイドラインに従って実施した。オスの日本白色ウサギ(20週齢、3.2～3.5kg)は、三共ラボサービス株式会社(東京、日本)から入手した。

【0118】

１．２．ウサギ髄核細胞(NPC)の調製
髄核（NP）試料は、4匹のウサギを、静脈内ペントバルビタール過剰投与を介して安楽死させた後、腰部IVD(L1/2からL5/6まで;全部で20のIVD)から得た。NPCを髄核（NP）組織から単離し、既報の方法で培養した[2,5,7,8]。具体的には、無菌条件下で、ゼラチン状NP組織を、マイクロ鉗子を用いて線維輪（AF）から分離した。組織標本は、10%ウシ胎仔血清(Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、及び1.25mg/mlファンギゾン(Life Technologies, Waltham, MA, USA)をダルベッコ改変イーグル培地(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)を含有する培養培地に入れた。外因性成長因子は使用しなかった。試料を、0.25%コラゲナーゼを補充した培地(和光純薬工業、大阪、日本)に再懸濁し、振盪インキュベーター中、37℃、20% O₂及び5% CO₂で4時間インキュベートし、酵素消化により単離した。NP組織から分離した細胞を培養皿中で増殖させ、加湿大気中、20% O₂及び5% CO₂を含む37℃で上記培地で培養した。培地は週2回交換し、NPCは継代2で使用した。

【0119】

１．３．ウサギ同種BMSCの調製
ウサギ同種BMSCとして、Cyagen(Santa Clara, CA, USA; カタログ番号: RBXMX-01,001、ロット番号: 151114I31)から購入したOriCell^TMウサギ間葉系幹細胞を使用した。これらの細胞は、特徴、解凍後の生存性、細胞周期、未分化状態の検証、並びに骨形成、軟骨形成、及び脂肪形成系統に沿った多能性分化能について試験されている。BMSCは製造業者の説明書に従って培養し、培地は週2回交換し、BMSCを継代2で使用した。

【0120】

１．４．UPALゲル及び三次元(3D)培養物の調製
本実施例では、UPALゲル(Mochida Pharmaceutical Co. Ltd., Tokyo, Japan)を3D培養のためのアルギン酸塩足場として使用した[2]。UPALゲルの精製プロセスは、既報の通りである[2]。具体的には、海藻中のアルギン酸塩を、清澄化手順[2]によって水溶性アルギン酸ナトリウムに変換することによって抽出した。このアルギン酸塩溶液は、高粘性であったため大量の水で希釈した[2]。次に、抽出物を濾過して、繊維状残渣からアルギン酸ナトリウム溶液を分離した[2]。高品質のアルギン酸を単離するため、この溶液に酸を添加した[2]。

【0121】

リン酸緩衝生理食塩水(和光純薬工業)及び102mM CaCl₂に溶解した2%(w/v)UPAL液をゲル化用に調製した。3D培養前に、最終濃度20mMの5,6カボキシフルオレセインジアクテートコハク酸イミジルエステル(CFDA-SE; CFDA-SE Cell Proliferation Assay Kit; BIO RAD, Hercules, CA, USA)を用いて、製造業者の説明書に従ってBMSCを蛍光標識した[9]。続いて、標識BMSC及び非標識NPCを、1:1(それぞれ1×10⁶細胞/ml)[1,10]の比率でUPAL液中に包埋し、2×10⁶細胞/mlの最終細胞濃度を得た[9,10]。UPAL/細胞混合物は、ゲル化のため、102mM CaCl₂に22ゲージ針を通して入れた。ゲルビーズは、低酸素条件(5% O₂及び5% CO₂)下で7日間、上記培地で培養した[10]。さらに、NPC及びBMSCを、1×10⁶細胞/mlの細胞濃度でUPAL液中に別々に包埋した。細胞濃度は、各群において異なる総細胞数を用いて効果を比較する既報の例[11]に基づいて設定した。ゲル化後、ゲルビーズを前記と同様に低酸素条件下で培養した。実験群は以下の通りである:(a)NPC単培養; (b)BMSC単培養; 及び(c)NPC + BMSC共培養。

【0122】

培養0日及び7日後に、全てのゲルビーズを、既報の方法[8]に従いゲル及び細胞が分離されるまで55mMクエン酸ナトリウムに溶解した。NPC + BMSC共培養群では、回収した細胞を、Divaソフトウェアversion7.0(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)を有するBD FACSAria III High speed cell sorterを使用して選別した[1,12]。死細胞及び残渣を除去し、530nmで蛍光を発する細胞をBMSCとして同定し、非蛍光細胞をNPCとして同定した。

【0123】

１．５．RNA抽出及びリアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)
回収したNPC及びBMSCを1mlのTRIzol^(TM)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)に溶解し、RNeasy Miniキット(Qiagen, Valencia, CA, USA)を用いてサンプルから全RNAを抽出した。TaqMan^TM遺伝子表現アッセイとカスタムTaqMan^TM遺伝子表現アッセイ（表１）(Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)を用いて、リアルタイムqRT-PCR解析を行った。各試料についてサイクル閾値 (Ct)を得、2^-ΔCt 方法を用いて、ハウスキーピング遺伝子GAPDHのCt値を基準とした各標的遺伝子の相対的mRNA発現を計算した[1]。

【0124】

【表1】

【0125】

１．６．ウサギ変性IVDモデルを用いたin vivo試験
In vivo試験には合計48匹のウサギを用いた。サンプルサイズは、採用した2つの時点の各々について、以前の報告[2,7,8]に基づいて決定した。48匹のウサギのうち32匹を無作為に選択して、IVD変性の定性分析(磁気共鳴画像(MRI)、組織学、免疫組織化学(IHC))を行い、計80のIVDを、無傷対照（Intact control）群、穿刺（Puncture）群(変性作成のための穿刺のみ)、椎間板切除（Discectomy）群(変性IVDに対して空洞を作るための部分的椎間板切除)、ゲル群(変性IVDに対する部分的椎間板切除及びUPALゲル埋植)、BMSC+ゲル群(変性IVDに対する部分椎間板切除及びBMSCとUPALゲルの埋植)に、無作為に割り付けた(各群8のIVD)。

【0126】

4匹のウサギNP組織の凍結切片を用いて、移植したBMSCの生存評価を行い、合計8匹のIVDを、無傷対照群及びBMSC+ゲル群(1群あたり4匹のIVD)に無作為に割り当てた。残りの12匹のウサギを用いて、HIF-1a、GLUT-1、Brachyuryの発現評価を行った。これらのマーカーは、健康なヒトNPCに発現する主要なマーカーとして提唱されている[13]（ウサギNP組織のパラフィン切片のIHCを用いている）。計36のIVDを無作為に、無傷対照群、椎間板切除群、BMSC+ゲル群(各群4のIVD)に割り付けた。

【0127】

１．７．UPAL溶液中のBMSC標識及び包埋
In vivo実験において、移植細胞としてin vitro実験と同様のOriCell^TMウサギ間葉系幹細胞を継代2で用いた。BMSCは、移植前にCFDA-SEで標識し、2% UPAL液中に包埋し、1×10⁶細胞/mlの最終細胞濃度に調製した[14]。

【0128】

１．８．IVD変性の作成及び細胞移植
20週齢ウサギは、高齢のヒト集団の状態を模倣するのに十分に老化しておらず、均一な老化を有する高齢ウサギを得ることは困難である。そこで本実施例では、変性IVDを得るためにウサギ椎間板の線維輪（AF）穿刺モデルを使用した[8,15,16]。ケタミン(10mg/kg)及びキシラジン(3mg/kg)の静脈内注射により全身麻酔を行い、自発換気でセボフルラン(2～3%)と混合したO₂及び空気(3.0l/分)で麻酔維持した。IVD変性は、L2/3及びL4/5 IVDで18ゲージ針を使用するAF穿刺によって作成した。L3/4 IVDは、対照として無処置とした。

【0129】

IVD穿刺の4週間後、BMSCを含有するUPAL溶液を、L2/3及びL4/5の変性IVDの部位に移植した[8]。全身麻酔下に、前外側後腹膜アプローチで脊椎を露出させた。椎間板切除群、ゲル群、及びBMSC+ゲル群では、18ゲージ針を穿刺して刺入口を作成した後、変性NP組織を10mlシリンジを用いて吸引し、残りのNP組織をマイクロ鉗子(Nagashima Medical Instruments Co., Ltd., Tokyo, Japan)を用いてL2/3及びL4/5 IVD(IVD当たり約10～12mg湿重量)で除去して、IVD空洞を作製した。L3/4 IVDは、対照として無処置とした。

【0130】

ゲル群では27ゲージ針を装着したマイクロシリンジ(Hamilton Medical, Bonaduz, Switzerland)を使用して、IVD欠損を20μlの2% UPAL溶液で満たし、BMSC+ゲル群ではIVD欠損をBMSCを含有するUPAL溶液で満たした。特に、26ゲージ針が細胞生存率又は組織変性に影響を及ぼさないことが示されているので、27ゲージ針を用いた[2,7,8,17]。次に、1mLの102mM CaCl₂をUPAL液の上に散布してゲル化を誘導した。5分後、手術創を生理食塩水で洗浄し閉じた。穿刺群では偽手術を行った。IVD変性の分析のために手術の4週後と12週後、又はNPCマーカーの発現評価のために、手術の1日後、7日後、及び28日後に、ウサギを静脈内ペントバルビタール過量投与により屠殺した。ヒトBMSCがウサギIVDに及ぼす効果を評価するため、骨髄由来ヒト間葉系幹細胞(hMSC-BM; PromoCell, Heidelberg, Germany;カタログ番号: C-12974、ロット番号: 412Z022.4)を用いて同様の埋植実験も行った。

【0131】

１．９．移植されたBMSC生存の評価
埋植後4週目と12週目に、CFDA-SE蛍光標識[18,19]に基づいて埋植BMSCの生存確認した。IVD(無傷対照群及びBMSC+ゲル群)を半分に水平切断し、液体窒素中で凍結し、5mmスライスに切片化し、次いで対比染色として4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI; Invitrogen; P36935)で染色した。特に、DAPI陽性細胞は生存対死滅のNPC及びBMSCを特定できないため、移植BMSCの生存率を定量することはできなかった。

【0132】

１．１０．MRI解析
術後4週目と12週目に、7.0-T MRスキャナー(Varian Unity Inova; Varian Medical Systems, Palo Alto, CA, USA)を用いてIVDのT2強調正中矢状断像を得た[2,8,16]。Pfirrmann分類(グレード5は重度変性として分類した)を用いて、IVD変性をグレード化した[20]。MRIindexを算出するために、分析ソフトウェアバージョン12.0(AnalyzeDirect, Overland Park, KS, USA)を用いて定量分析も行った。MRIindex(NP面積と平均信号強度との積)をNPの変性の定量化に適用し、定量データは、未処置対照IVDで得られたMRIindex(相対MRIindex)に対するパーセンテージとして表した[2,8,16]。

【0133】

１．１１．組織学的分析
MRI分析後、各IVDを組織学的染色のために処理した。プロテオグリカン発現を評価するため、正中矢状断切片 (5mm厚)をヘマトキシリンとエオシン(H&E)並びにサフラニンO-ファストグリーンによって染色した[8]。IVDの半定量分析を行い、0(正常)から5(高度変性)に等級分けした[21,22]。具体的には、この組織学的尺度はAF構造の形態学的変化に焦点を当てている。

【0134】

１．１２．IHC分析
術後4週目及び12週目にI型及びII型コラーゲンを検出するために免疫組織化学（IHC）染色を行い [8]、術後1日目、7日目、28日目にHIF-1α、GLUT-1及びBrachyuryを検出した。I型及びII型コラーゲン染色には、I型コラーゲン(Sigma-Aldrich; C2456, RRID: AB_476836)及びII型コラーゲン(Kyowa Pharma Chemical, Toyama, Japan; F-57)に対するマウスモノクローナル抗体を適用した。染色は、対比染色として3,3’-ジアミノベンジジン塩酸塩(Dako)及びMayer’sヘマトキシリン(Merck, Darmstadt, Germany)を用いて展開した。HIF-1α、GLUT-1、及びBrachyury染色については、HIF-1αに対するDyLight 550結合ウサギポリクローナル抗体(Novus Biologicals, Centennial, CO, USA; NB100-479R, RRID: AB_1642267)、GLUT-1に対するPE結合ウサギポリクローナル抗体(LS Bio, Seattle, WA, USA; LS-A109342-100)、及びBrachyuryに対する非結合ウサギポリクローナル抗体(LS Bio; LS-C31179-100, RRID: AB_911118)を適用した。さらに、Alexa Fluor 594結合ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体(Invitrogen; A32740)をBrachyuryの二次抗体として使用した。染色は、対比染色としてDAPIを用いて展開した。

【0135】

I型及びII型コラーゲン、HIF-1α、GLUT-1及びBrachyuryの陽性細胞は、独立した無作為に選択した5視野で別々に計測した[2,8]。視野は、深い領域及び表面領域の両方を含むNPの幅に及ぶ。数値は、すべての評価項目における総細胞数に対する陽性細胞の割合で、また、NPCマーカー評価のためのCFDA-SE陽性細胞数に対する割合で表される。すべての実験は、I型及びII型コラーゲン評価のために8個のIVD、及び各処置群からのNPCマーカー評価のために4個のIVDについて、それぞれの時点で行った。

【0136】

１．１３．統計解析
全てのデータは、平均±標準誤差(SE)として示される。多群比較についてはOne-way分散分析(ANOVA)及びTukey‐Kramer事後検定を行った。2群比較についてはPaired t検定を行った。すべての統計計算は、有意閾値p<0.05で、JMP Pro-version 14.0統計ソフトウェア(SAS Institute, Cary, NC, USA)を用いて行った。

【0137】

２．結果
２．１．NPC及びBMSC共培養は、BMSCのNPCへの分化並びに成長因子及びECMの産生を促進する
各細胞型に対するNPC及びBMSC共培養の効果を調べるために、非標識NPC及びCFDA-SE標識BMSCを、3D培養のためにUPALゲル中に包埋した。本発明者は、共培養群において、細胞ソーターを用いて両方の細胞型を収集した。リン酸緩衝食塩水/細胞懸濁液分析は、前方散乱及び側方散乱を用いて行った。P1ゲートは2Dドットプロット(図1a)で描き、死細胞及び残渣を除外した。非標識NPC及びCFDA-SE標識BMSCを、蛍光対側方散乱ドットプロットにおいて異なるゲートを用いて選別した(図1b)。従って、P2ゲートを非標識細胞の上に設定し、P3ゲートをCFDA-SE標識細胞の上に設定し、交差汚染を回避するために2つのゲートの間に間隙を設けた[1]。ゲル溶解及び細胞選別に続いて、(a)NPC対照(day0)、(b)NPC単培養、(c)NPC共培養、(d)BMSC対照(day0)、(e)BMSC単培養、及び(f)BMSC共培養の6つのタイプの細胞を得た。BMSC分化の解析については、6種類の細胞において、NPCマーカーとしてHIF‐1α、GLUT‐1及びBrachyuryの遺伝子発現、成長因子としてCDMP‐1、TGF‐β及びIGF‐1の遺伝子発現、そして細胞外マトリックス（ECM）としてタイプIIコラーゲン及びアグリカンの遺伝子発現を、qRT‐PCRを用いて評価した。

【0138】

NPC共培養におけるHIF-1αの遺伝子発現は、NPC対照と比較して有意に増加し(p=0.0218、Tukey-Kramer検定)、BMSC共培養ではBMSC対照(p=0.0041、Tukey-Kramer検定)及び単培養(p= 0.0041、0.0116、Tukey-Kramer検定)と比較して有意に増加した(図1c)。
NPC共培養におけるGLUT‐1の発現は、NPC対照(p<0.0001、Tukey‐Kramer試験)及び単培養(p <0.0001、Tukey‐Kramer試験)と比較して有意な増加を示し、NPC単培養では、NPC対照(p <0.0001、Tukey‐Kramer試験)と比較して有意な増加を示した。BMSC共培養では、BMSC対照(p=0.0189、Tukey‐Kramer検定)と比較してGLUT‐1発現の有意な増加を示した(図1d)。これに対し、Brachyuryの遺伝子発現は、3種類のNPC間で統計的有意差を示さなかった。さらに、Brachyuryの遺伝子発現は、BMSC共培養においてのみ観察され、BMSC対照及び単培養のいずれにおいても観察されなかった(図1e)。

【0139】

NPC共培養におけるCDMP-1、TGF-β及びIGF-1の遺伝子発現は、NPC対照(p<0.0001、p<0.0001、p=0.0002、Tukey-Kramer試験)及び単培養(p<0.0001、p<0.0001、p=0.0082、Tukey-Kramer試験)と比較して有意に増加し、NPC単培養における発現は、NPC対照(p =0.0179、p<0.0001、p=0.0079、Tukey-Kramer試験)と比較して有意に増加した。BMSC共培養における発現は、BMSC対照(p =0.0011、p<0.0001、p<0.0001、Tukey-Kramer試験)及び単培養(p =0.0015、p=0.0386、p<0.0001、Tukey-Kramer試験)と比較して有意に増加した(図1f-h）。

【0140】

NPC共培養及び単培養におけるII型コラーゲンの発現は、NPC対照(p=0.0036、p=0.0035、Tukey-Kramer試験)と比較して有意に増加し、BMSC共培養における発現は、BMSC対照(p =0.004、Tukey-Kramer試験)及び単培養(p=0.0226、Tukey-Kramer試験)と比較して有意に増加した(図1i)。アグリカンについては、NPC共培養における遺伝子発現は、NPC対照(p = 0.0047、Tukey‐Kramer試験)及び単培養(p=0.0392、Tukey‐Kramer試験)と比較して有意に増加し、単培養における発現はNPC対照(p=0.0274、Tukey‐Kramer試験)と比較して有意に増加した。特に、アグリカンはBMSC共培養でのみ発現されたが、BMSC対照又は単一培養では発現しなかった(図1j)。

【0141】

２．２．移植BMSCの生存
In vivo試験において、BMSC + ゲル群ではCFDA-SE標識BMSCが観察されたが、術後4週目と12週目では無傷対照群では観察されなかった(図2)。ヒトBMSC群もBMSC+ゲル群(ウサギBMSC)と同様の所見を示し、移植されたBMSCが移植後12週目にIVDで生存したことが確認された。切開すると、ゲルの押し出しは認められなかった。

【0142】

２．３．BMSCとUPALゲルの併用は、変性IVDにおける椎間板切除後のIVD再生を促進する
治療されたIVDにおける変性変化をMRIによって定性的に分析し、T2強調正中矢状断画像を捕捉した(図3a)。BMSC+ゲル群におけるPfirrmannグレードは、4週目に椎間板切除群より有意に低く(p=0.003、Tukey‐Kramer検定)、12週目に穿刺群と椎間板切除群で有意に低かった(p=0.0009, p<0.0001, Tukey‐Kramer検定)。さらに、ゲル群の変性度も12週目に椎間板切除群より有意に低かった(p=0.0028、Tukey-Kramer検定)(図3b)。ゲル群とBMSC+ゲル群との間に有意差は観察されなかった。BMSC+ゲル群のMRIindexは、4週で椎間板切除群(p=0.0085、Tukey‐Kramer試験)及び12週での穿刺、椎間板切除及びゲル群 (p=0.0002, p<0.0001, p=0～0248, Tukey‐Kramer試験)よりも有意に高かった。また、12週後ではゲル群のindexが椎間板切除群よりも有意に高かった(p=0.0092、Tukey-Kramer検定)(図3c)。特に、ウサギBMSC群とヒトBMSC群との間では、Pfirrmannグレード又はMRIindexのいずれにおいても有意差は観察されなかった。

【0143】

組織学的変性度分類の前に、NP及びAFを含むIVDの全体構造を評価し、群間で肉眼的な違いを観察した。IVDの組織学的評価の結果、無傷の対照標本は、内部AFの構造的崩壊を伴わず、NP組織は典型的な楕円形を示した(図4a及びb)。椎間板切除群では、内側はAFが崩壊し、NP組織の線維性変化が4週目と12週目の両方で観察された。しかしながら、BMSC +ゲル群における内側AFは、NP組織の線維性変化は最小に止まり、4週目と12週目の両方の時点で良好に保存されているようであり、ゲル群における内側AFもまた、比較的良好に保存されているようであった(図4a及びb)。BMSC+ゲル群の組織学的変性スコアは、4週目及び12週目ともに、穿刺群(p=0.0006、p<0.0001、Tukey-Kramer検定)、椎間板切除群(p<0.0001、p<0.0001、Tukey-Kramer検定)、ゲル群(p=0.00,134、p<0.0001、Tukey-Kramer検定)よりも有意に低く、12週目にゲル群の変性のスコアは椎間板切除群よりも有意に低かった(p=0.0006、Tukey-Kramer）。また、ウサギBMSC群とヒトBMSC群との間に有意差は認められなかった。骨棘形成はいずれの群でも認められなかった。

【0144】

２．４．BMSCとUPALゲルの併用は、変性したIVDにおけるECM産生を促進する
次に、本発明者はIVDにおけるECM産生を評価した。特に、II型コラーゲンはIVD機能に必要な必須成分であるが、IVD変性過程ではI型コラーゲン合成の増加が観察される[23]。II型コラーゲン陽性細胞の割合は、BMSC+ゲル群では4週目において穿刺群及び椎間板切除群に比べ有意に高く(p=0.0001, p<0.0001, Tukey-Kramer検定)、12週目において穿刺群、椎間板切除群及びゲル群よりも有意に高かった(p<0.0001, p<0.0001, p<0.0001, Tukey-Kramer検定)。また、ゲル群は、4週目において椎間板切除群と比較して有意に高い割合を示し(p<0.0001, Tukey-Kramer検定)、12週目において穿刺群及び椎間板切除群と比較して有意に高かった(p=0.0231, p<0.0001, Tukey-Kramer検定)(図5)。

【0145】

一方、I型コラーゲン陽性細胞の割合は、4週目及び12週目のいずれも、BMSC+ゲル群は穿刺群(p<0.0001, p<0.0001, Tukey-Kramer検定)、椎間板切除群(p<0.0001, p<0.0001, Tukey-Kramer検定)、ゲル群(p<0.0001, p<0.0001, Tukey-Kramer検定)より有意に低かった。また割合は、4週ではゲル群が椎間板切除群よりも有意に低く(p<0.0001、Tukey-Kramer検定)、12週では穿刺群及び椎間板切除群よりも有意に低かった (p=0.0007、p<0.0001、Tukey-Kramer検定)。IHC分析による両評価において、ウサギBMSC群とヒトBMSC群との間に有意差は観察されなかった。

【0146】

２．５．変性IVDにおける移植BMSCのNPCへの分化
最後に、HIF-1α、GLUT-1及びBrachyury陽性細胞を経時的に観察し、in vivoにおいて移植BMSCがNPCに分化するメカニズムを検討した(図6a-c)。無傷対照群では、ほとんどすべての細胞がすべての時点で3つのNPCマーカーについて陽性であった。BMSC+ゲル群ではHIF‐1α、GLUT‐1及びBrachyury陽性細胞が1日目に低レベルで観察されたが、陽性細胞数は経時的に増加した。全細胞数に対する3種類のNPCマーカー陽性細胞の割合は、1日目及び7日目と比較して28日目で有意に高かった(p<0.0001, p<0.0001, Studentのt検定)。これに対し、椎間板切除群では、約20%の細胞が全ての時点で陽性であった(図6d-f)。同様に、CFDA-SE陽性細胞数(移植BMSCを表す)に対する3種類のNPCマーカー陽性細胞の割合は、1日目及び7日目と比較して28日目で有意に高かった(p<0.0001、p<0.0001、Student's t-test)(図6g-i)。

【0147】

３．考察
IVDの再生能は著しく低いため、椎間板切除により生じた欠損は組織修復が不十分であり、さらなるIVD変性につながる可能性がある[2]。本実施例において、UPALゲル単独でも椎間板切除後と比較してIVD変性を抑制したが、BMSCとUPALゲルとを併用すると、IVD再生を誘導するより強力な効果を発揮した。さらに、ヒトBMSCとウサギBMSCでは、IVD再生は両群間で同等に観察された。いくつかの以前の研究においても、変性IVDにおける種々のBMSCの再生能力が実証されている[18、24、25]。さらに、UPALゲルは、高い生体適合性及び十分な生体力学的特性を示し内因性修復治療戦略を支持するため [2]、変性IVD部位にBMSCを移植した後のIVD再生及びさらなる変性予防のための最適な環境を提供する。

【0148】

本実施例では、NPCマーカー、成長因子及びECMの遺伝子発現は、in vitroでの各3D単培養と比較して、NPCとBMSCとの3D共培養で有意に増加した。これらの結果は、NPCとBMSCとの共培養がNPCへのBMSC分化を導き、その結果、NPCとBMSCとの間の相互活性を導き、両細胞型におけるECM産生の増強をもたらすことを示す。このことは、NPCとBMSCとの共培養がBMSCを刺激してNPC様表現型に分化させることを示している他のいくつかのin vitro研究の知見とも一致しており[1,12,26]、成長因子の産生[1,11,27]及びECM合成のアップレギュレーションを介したNPCとBMSCと間の相互活性化を支持する[1,5,10,26]。

【0149】

さらに、埋植されたBMSCにおけるNPCマーカーの発現の経時的増加、及び椎間板切除単独後の結果と比較してECM産生の増強を示す同様の結果が、in vivo試験において観察された。我々の知る限りでは、アルギン酸塩及びBMSCをin vivoで移植したときのBMSCがNPCに分化する際のメカニズムを検討した報告はないが、ある研究において、アテロコラーゲンに埋め込まれた移植されたMSCがNPCに分化できることが実証された[28]。具体的には、緑色蛍光タンパク質で標識した自家BMSCを成熟ウサギIVDに移植し、IHC分析により移植細胞の分化を測定した。移植後48週目に、移植BMSCはHIF-1α、GLUT-1及びMMP-2が陽性であることが示され、これは、BMSCがNPCの代表的表現型の特徴のいくつかを発現する細胞に分化したことを意味する [28]。

【0150】

In vivo試験では、組織学的解析により、ゲル単独の移植は椎間板切除後と比較してIVD変性を予防すること、及びBMSC+ゲルの併用は変性の予防により強力な効果を発揮することがさらに示された。これは、ゲル単独では椎間板切除術と比較してIVDの含水量を保存するが、BMSC+ゲルの組み合わせでは含水量保存に対してより強力な効果をもたらすことを示唆するMRI所見と一致する。IHCの結果はさらに、BMSC+ゲルの組み合わせは、変性NP組織におけるECM合成を促進することを示唆し、これは適切なIVD機能に重要であり、I型コラーゲンの産生の低下を介する変性進行の予防につながる。さらに、穿刺群(椎間板切除を伴わない変性IVD)と比較したBMSC+ゲルの組織学的結果は、BMSC移植がIVD再生につながることを示唆した。合わせて、これらの結果は、移植されたBMSCが経時的にNPCに分化し、in vivoでのIVD再生を生じることを示す。

【0151】

AF再生に関しては、ゲル群及びBMSC+ゲル群は、NPにおけるコラーゲンI産生を有意に減少させたが、ゲル及びBMSC+ゲルの充填で穿刺によるAF欠損は修復された。IVD変性はNP細胞外マトリックスの分解によって特徴づけられるため[2]、本実施例では主にNPの保存/再生に焦点を当てた。

【0152】

椎間板細胞治療においては、移植細胞の椎間板内での生着が得られず、注入部位から移植細胞が漏出するリスクが報告されており、その結果、骨棘が形成されるという報告もある[5,29,30]。従って、椎間板切除後のBMSC移植の場合、細胞漏出を防止するために担体材料が必要である。本発明においては、BMSC+ゲル群で骨棘形成は観察されなかった。UPALゲルとBMSCとを組み合わせて使用すると即時硬化性という重要な特徴を有し、その結果、細胞漏出を防ぐという点で臨床的に有用である。

【0153】

本発明の結果と以前の報告[1,11,12,26‐28]に基づき、本発明者は、IVD再生のメカニズムは以下の通りであると考えた。
1) 埋植されたBMSCは、UPALゲル中への包埋を介して、椎間板外へ漏れることなくIVDの空洞内に局在化することができる。
2) 埋植されたBMSCは、成長因子及びECMを産生し、既存のNPCの活性化をもたらす。
3) 活性化したNPCはまた、成長因子及びECMの産生を増加させる。
4) その結果、埋植されたBMSCはNPCに分化する。
5) さらに、BMSC及び既存のNPCは互いに活性化し、IVD再生を生じる(図7)。

【0154】

今回のin vitro実験においてBMSCとNPCが細胞融合していれば、細胞の分離が不可能であったと考えられるため、IVD変性の主な作用機序を細胞結合作用が構成している可能性は低いと考える。また、BMSCとNPCはin vivoで直接接触は認められなかった。従って、作用の基礎となるメカニズムは、成長因子及び/又はBMSCとNPCとの間の相互作用を調節するいくつかの重要な液性因子に起因し得る。

【0155】

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【実施例0156】

髄核細胞（NPC)と高純度間葉系幹細胞（REC)の共培養（in vitro)による遺伝子発現の変化
１．材料と方法
１．１．ヒトの健常椎間板髄核細胞（NPC）
ヒトの健常椎間板髄核細胞（NPC）は、北海道大学病院における思春期特発性側弯症の若年患者（15.3±3.3歳）の脊椎前方固定術の際に得られた細胞を用いた。

【0157】

１．２．高度に均一性を有する高純度間葉系幹細胞の調製
（１）フローサイトメトリーによる前方散乱光（FSC)のCV値測定
公知方法（WO2016/17795）により予め調製しておいた複数のRECクローンを、フローサイトメトリーによる前方散乱光のCV値測定に用いた。
フローサイトメトリーにおけるFSCは細胞の表面積又は大きさに比例する。本実施例では、FSCのCV値を指標として細胞サイズのばらつきを評価した。
（a）個々のRECクローンに対してPI染色を行い、PI陰性の生細胞集団にゲートを設定して、死細胞を解析の対象から除外した。
（b）PI陰性の生細胞集団をFSC/SSCのサイトグラムで展開し、メインの細胞集団にゲート（P1）を設定して、ゴミやノイズを解析の対象から除外した。
（c）P1ゲート内の細胞集団をFSCのヒストグラムで展開し、マーカー（M1）を設定して、CV値を計測した。

【0158】

（２）細胞増殖能及び脂肪分化能の評価
細胞増殖能の評価のため、1x10⁵個のREC細胞を100mm培養皿に播種して、37℃、5%CO₂環境下で５日間培養し、その後、セルカウンターを用いて細胞数及び平均細胞サイズを計測した。
培養液は、FBS、basic FGF、Hepes、Penicillin-Streptomycinを添加したDMEM培地（富士フイルム和光純薬社）を用いた。
また、脂肪分化能の評価のため、5x10⁴個のREC細胞を24穴プレートに播種して、37℃、5%CO₂環境下で２日間培養し、その後、脂肪分化誘導培地に置換して、さらに14日間培養した。培養14日後にオイルレッド0染色を行い、画像解析により脂肪滴面積を算出した。なお、脂肪分化誘導培地は、上記培養培地にDexamethasone、Indomethacin、IBMXを添加した培地を用いた。

【0159】

（３）網羅的解析
複数のRECクローンについて、FSCのCV値、細胞増殖率（増殖能）、平均細胞サイズ、脂肪分化能を調べたところ、FSCのCV値が低いRECクローン（CV=35％以下）は、増殖能、分化能が共に高く、平均細胞サイズが小さいことがわかった（平均細胞サイズ：20μｍ以下）（図８）。

【0160】

一方で、FSCのCV値が高いRECクローン（CV=35％以上）は、増殖能、分化能が共に低く、平均細胞サイズが大きいことがわかった。
CV値30%～35%のクローンの平均増殖率は6.4であり、CV値25%～30%のクローンの平均増殖率は9.2、CV値25%以下のクローンの平均増殖率は15.1であった。また平均細胞サイズが18μm～20μmのクローンの平均増殖率は7.0であり、平均細胞サイズが16μm～18μmのクローンの平均増殖率は12.7、平均細胞サイズが16μm以下のクローンの平均増殖率は21.3であった。
以下、本実施例ではFSCのCV値が低いRECクローン（CV=25％以下）を使用した。

【0161】

１．３．RECを含むUPAL組成物の調製
NPCと蛍光標識された高純度間葉系細胞（REC）を各単独群と混合群に群分けし、超高純度アルギン酸（UPAL：持田製薬提供）の3次元ゲル中で共培養又は単独培養し、培養前(day0)と培養7日後に、3次元ゲルを溶解後、セルソーターで下記の細胞に分離した。
(a)NPC 対照群（day0）
(b)NPC 単独培養群
(c)NPC 共培養群
(d)REC 対照群（day0）
(e)REC 単独培養群
(f)REC 共培養群

【0162】

上記6群の細胞につき定量的PCR解析（qRT-PCR）により下記の遺伝子発現を測定した。
髄核細胞のマーカー
HIF-1α
GLUT-1
Brachyury
成長因子
CDMP-1
TGF-β
IGF-1
細胞外基質
TypeII collagen
aggrecan
遺伝子発現量の測定法は、実施例１に準じて行った。

【0163】

２．結果
RECと髄核細胞を共培養すると、単独培養した場合と比較して分化指標（HIF-1α、GLUT-1,Brachrury)が髄核細胞、間葉系幹細胞の双方で上昇した（図９）。
成長因子（CDMP-1, TGFβ、IGF-1）、及び細胞外基質（TypeII collagen,Aggrecan）についても同様であった。
髄核細胞と高純度間葉系幹細胞は相互作用して活性化し、間葉系幹細胞は髄核細胞へと分化していくことが示唆される。