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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2025000074
(43)【公開日】2025-01-07
(54)【発明の名称】育児放棄モデル動物
(51)【国際特許分類】
A01K 67/027 20240101AFI20241224BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20241224BHJP
【ＦＩ】
A01K67/027 ZNA
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023099719
(22)【出願日】2023-06-19
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110002620
【氏名又は名称】弁理士法人大谷特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】清末 和之
(57)【要約】
【課題】育児行動に異常を持つ新たなモデル動物の提供を課題とする。
【解決手段】Ｒａｂｅｐ１遺伝子の発現が抑制された非ヒト哺乳類である、育児放棄モデル動物。
【選択図】なし
【解決手段】Ｒａｂｅｐ１遺伝子の発現が抑制された非ヒト哺乳類である、育児放棄モデル動物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｒａｂｅｐ１遺伝子の発現が抑制された非ヒト哺乳類である、育児放棄モデル動物。
【請求項2】
Ｒａｂｅｐ１遺伝子が欠損した非ヒト哺乳類である、請求項１に記載の育児放棄モデル動物。
【請求項3】
ホモ接合体である、請求項２に記載の育児放棄モデル動物。
【請求項4】
マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）である、請求項１に記載の育児放棄モデル動物。
【請求項5】
被験処置を施した請求項１～４のいずれか１項に記載の育児放棄モデル動物の育児行動と、対照モデル動物の育児行動とを比較する工程、及び
前記被験処置を施した非ヒト動物が、前記対照モデル動物と比べて育児放棄が改善している場合、前記被験処置を育児放棄の予防手段及び／又は改善手段の候補として選択する工程を含む、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法。
前記被験処置を施した非ヒト動物が、前記対照モデル動物と比べて育児放棄が改善している場合、前記被験処置を育児放棄の予防手段及び／又は改善手段の候補として選択する工程を含む、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、育児放棄モデル動物、並びに、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
少子高齢化の進む現代社会において育児放棄は大きな問題の一つである。育児放棄の要因は、養育者における、社会的、経済的、心理的ストレスであると推測されているが、その行動に至る過程の十分な理解はされていない。
育児行動は種の維持において効率的な行動である。特に、比較的未熟な状態で生まれてくる哺乳類においては、非常に重要な行動である。しかしながら、その行動が、どのような脳内機構により惹起されるかは十分に理解されていない。
育児行動は種の維持において効率的な行動である。特に、比較的未熟な状態で生まれてくる哺乳類においては、非常に重要な行動である。しかしながら、その行動が、どのような脳内機構により惹起されるかは十分に理解されていない。
【0003】
モデル動物であるマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）において、育児行動には、下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の階層があると考えられている。（ａ）母マウスが、仔マウスを聴覚、触覚、嗅覚等を用いて認識する；（ｂ）母マウスが、仔マウスを育児対象と判断する；及び（ｃ）母マウスが、育児行動を起こす。
育児放棄様行動を示すマウスとして、プロラクチン欠損マウス及びオキシトシン欠損マウスが報告されている（非特許文献１、２）。プロラクチン欠損マウスは明確に前記階層（ｃ）の異常である。オキシトシン欠損マウスは、未解明な点はあるが、前記階層（ｃ）の異常であると考えられる。
育児放棄様行動を示すマウスとして、プロラクチン欠損マウス及びオキシトシン欠損マウスが報告されている（非特許文献１、２）。プロラクチン欠損マウスは明確に前記階層（ｃ）の異常である。オキシトシン欠損マウスは、未解明な点はあるが、前記階層（ｃ）の異常であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｔ．Ｊ．Ｓａｉｒｅｎｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１７，Ｖｏｌ．１１４，Ｎｏ．４９．ｐ．１３０４２－１３０４７
【非特許文献2】Ｄ．Ｄ．Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００２，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．５．ｐ．３４９－３５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者は、育児行動の改善を目指す技術を確立するために、育児行動に異常を持つ新たなモデル動物を利用し、その分子メカニズムを理解すれば、育児行動の改善に資する手法の開発に供し、大きな進展を生むと考えた。
本発明は、育児放棄モデル動物、並びに、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
本発明は、育児放棄モデル動物、並びに、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者は、Ｒａｂｅｐ１遺伝子を欠損する雌マウスは、高頻度で育児放棄様行動を示すことを見出した。本発明はかかる発見に基づき、更に検討を重ねて完成したものである。
本発明は、下記［１］～［５］の態様を含む。
［１］ Ｒａｂｅｐ１遺伝子の発現が抑制された非ヒト哺乳類である、育児放棄モデル動物。
［２］ Ｒａｂｅｐ１遺伝子が欠損した非ヒト哺乳類である、［１］に記載の育児放棄モデル動物。
［３］ ホモ接合体である、［２］に記載の育児放棄モデル動物。
［４］ マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の育児放棄モデル動物。
［５］ 被験処置を施した［１］～［４］のいずれか１項に記載の育児放棄モデル動物の育児行動と、対照モデル動物の育児行動とを比較する工程、及び
前記被験処置を施した非ヒト動物が、前記対照モデル動物と比べて育児放棄が改善している場合、前記被験処置を育児放棄の予防手段及び／又は改善手段の候補として選択する工程を含む、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法。
本発明は、下記［１］～［５］の態様を含む。
［１］ Ｒａｂｅｐ１遺伝子の発現が抑制された非ヒト哺乳類である、育児放棄モデル動物。
［２］ Ｒａｂｅｐ１遺伝子が欠損した非ヒト哺乳類である、［１］に記載の育児放棄モデル動物。
［３］ ホモ接合体である、［２］に記載の育児放棄モデル動物。
［４］ マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の育児放棄モデル動物。
［５］ 被験処置を施した［１］～［４］のいずれか１項に記載の育児放棄モデル動物の育児行動と、対照モデル動物の育児行動とを比較する工程、及び
前記被験処置を施した非ヒト動物が、前記対照モデル動物と比べて育児放棄が改善している場合、前記被験処置を育児放棄の予防手段及び／又は改善手段の候補として選択する工程を含む、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【0007】
本発明により、育児放棄モデル動物、並びに、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
［育児放棄モデル動物］
本発明の育児放棄モデル動物は、Ｒａｂｅｐ１遺伝子の発現が抑制された非ヒト哺乳類である。
＜育児放棄モデル動物＞
本発明の育児放棄モデル動物は、育児放棄様行動を示す。
育児放棄様行動とは、非ヒト哺乳類の母親が妊娠中及び出産後に通常示す育児行動（母性行動ともいう）の異常を意味する。このような育児行動としては、例えば非ヒト哺乳類がマウスである場合、母マウスによる巣の設営、仔マウスを巣へ運搬、仔マウスに対するリッキング、仔マウスに対する授乳等の行動が挙げられる。
本発明の育児放棄モデル動物は、Ｒａｂｅｐ１遺伝子の発現が抑制された非ヒト哺乳類である。
＜育児放棄モデル動物＞
本発明の育児放棄モデル動物は、育児放棄様行動を示す。
育児放棄様行動とは、非ヒト哺乳類の母親が妊娠中及び出産後に通常示す育児行動（母性行動ともいう）の異常を意味する。このような育児行動としては、例えば非ヒト哺乳類がマウスである場合、母マウスによる巣の設営、仔マウスを巣へ運搬、仔マウスに対するリッキング、仔マウスに対する授乳等の行動が挙げられる。
【0010】
代表的な育児行動について、以下に説明する。
巣の設営：母マウスは、妊娠中ごろから、通常と比べて大きく深い巣を設営する。仔マウスの保温、外敵からの保護等のためである。
仔マウスの巣への運搬：母マウスは、出産後、仔マウスを巣へ運搬し、一か所に集める。仔マウスが巣の外へ出てしまった場合や別の場所の巣への移動の際にも、仔マウスの運搬をする。複数の仔マウスは、接触し合うように集められる。
仔マウスに対するリッキング：母マウスは、仔マウスの身体、特に会陰部を清潔にし、排泄を促す目的で、なめる。この行動をリッキングという。
仔マウスに対する授乳：仔マウスは自分では移動することができず、自ら捕食はできないため、母マウスは仔マウスに対する授乳を行う。母マウスは乳首を仔マウスにたいして露出する授乳姿勢をとる。仔マウスは、嗅覚と触覚をたよりに乳首を探し吸乳する。
巣の設営：母マウスは、妊娠中ごろから、通常と比べて大きく深い巣を設営する。仔マウスの保温、外敵からの保護等のためである。
仔マウスの巣への運搬：母マウスは、出産後、仔マウスを巣へ運搬し、一か所に集める。仔マウスが巣の外へ出てしまった場合や別の場所の巣への移動の際にも、仔マウスの運搬をする。複数の仔マウスは、接触し合うように集められる。
仔マウスに対するリッキング：母マウスは、仔マウスの身体、特に会陰部を清潔にし、排泄を促す目的で、なめる。この行動をリッキングという。
仔マウスに対する授乳：仔マウスは自分では移動することができず、自ら捕食はできないため、母マウスは仔マウスに対する授乳を行う。母マウスは乳首を仔マウスにたいして露出する授乳姿勢をとる。仔マウスは、嗅覚と触覚をたよりに乳首を探し吸乳する。
【0011】
このようなマウスの育児行動は公知であり、例えば文献：Ｋ．Ｏ．ＫＵＲＯＤＡ，ＫＡＧＡＫＵ ＴＯ ＳＥＩＢＵＴＳＵ，２０１３，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．１１，ｐ．７４５－７５３に概説されている。
【0012】
育児行動の異常は、当業者が適宜評価することができる。評価は、定性的な評価又は定量的な評価のいずれであってもよい。好ましくは定量的な評価であり、より好ましくは統計的有意差を検定して評価することができる。
【0013】
＜非ヒト哺乳類＞
非ヒト哺乳類は、育児行動を示し、かつ、Ｒａｂｅｐ１遺伝子を有するものである限り、いかなる種の非ヒト哺乳類でもよい。このような哺乳類としては、サルなどの類人猿、齧歯類（ネズミ目）、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ等が挙げられる。実験動物としての取り扱いが容易であるとの観点から、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の齧歯類が好ましく、遺伝子改変操作を容易に行えるとの観点からマウスがより好ましい。マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）としては、Ｃ５６ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ等の近交系化された系統に属するマウスが特に好ましい例として挙げられる。
育児放棄モデル動物は、非ヒト哺乳類の雌性個体である。
非ヒト哺乳類は、育児行動を示し、かつ、Ｒａｂｅｐ１遺伝子を有するものである限り、いかなる種の非ヒト哺乳類でもよい。このような哺乳類としては、サルなどの類人猿、齧歯類（ネズミ目）、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ等が挙げられる。実験動物としての取り扱いが容易であるとの観点から、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の齧歯類が好ましく、遺伝子改変操作を容易に行えるとの観点からマウスがより好ましい。マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）としては、Ｃ５６ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ等の近交系化された系統に属するマウスが特に好ましい例として挙げられる。
育児放棄モデル動物は、非ヒト哺乳類の雌性個体である。
【0014】
＜Ｒａｂｅｐ１遺伝子＞
Ｒａｂｅｐ１遺伝子（ＲＡＢ ＧＴＰａｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １；Ｒａｂａｐｔｉｎ－５ともいう。）は、公知の遺伝子であり、Ｒａｂｅｐ１タンパク質をコードする。Ｒａｂｅｐ１タンパク質は、細胞中エンドソームへの局在が知られている。Ｒａｂｅｐ１タンパク質は小胞体輸送に関与する分子であり、具体的には初期エンドソームの膜融合に関与すると考えられている。
Ｒａｂｅｐ１遺伝子（ＲＡＢ ＧＴＰａｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ １；Ｒａｂａｐｔｉｎ－５ともいう。）は、公知の遺伝子であり、Ｒａｂｅｐ１タンパク質をコードする。Ｒａｂｅｐ１タンパク質は、細胞中エンドソームへの局在が知られている。Ｒａｂｅｐ１タンパク質は小胞体輸送に関与する分子であり、具体的には初期エンドソームの膜融合に関与すると考えられている。
【0015】
例えば、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のＲａｂｅｐ１遺伝子は、マウスの１１番染色体上に位置する。
マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の１１番染色体のゲノム配列、Ｒａｂｅｐ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列及びＲａｂｅｐ１タンパク質のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が提供するＧｅｎＢａｎｋに、下記のアクセッション番号で登録されている（複数のリビジョン（ｒｅｖｉｓｉｏｎ）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）：
マウス１１番染色体：ＮＣ＿００００７７（ＮＣ＿００００７７．７）
マウスＲａｂｅｐ１遺伝子：ＮＭ＿００１２９１１４１（ＮＭ＿００１２９１１４１．１）、ＮＭ＿００１２９１１４２（ＮＭ＿００１２９１１４１．１）、ＮＭ＿００１２９１１４３（ＮＭ＿００１２９１１４３．１）、ＮＭ＿０１９４００（ＮＭ＿０１９４００．３）
マウスＲａｂｅｐ１タンパク質：
ＮＰ＿００１２７８０７０（ＮＰ＿００１２７８０７０．１）、ＮＰ＿００１２７８０７１（ＮＰ＿００１２７８０７１．１）、ＮＰ＿００１２７８０７２（ＮＰ＿００１２７８０７２．１）、ＮＰ＿０６２２７３（ＮＰ＿０６２２７３．２）
マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の１１番染色体のゲノム配列、Ｒａｂｅｐ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列及びＲａｂｅｐ１タンパク質のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が提供するＧｅｎＢａｎｋに、下記のアクセッション番号で登録されている（複数のリビジョン（ｒｅｖｉｓｉｏｎ）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）：
マウス１１番染色体：ＮＣ＿００００７７（ＮＣ＿００００７７．７）
マウスＲａｂｅｐ１遺伝子：ＮＭ＿００１２９１１４１（ＮＭ＿００１２９１１４１．１）、ＮＭ＿００１２９１１４２（ＮＭ＿００１２９１１４１．１）、ＮＭ＿００１２９１１４３（ＮＭ＿００１２９１１４３．１）、ＮＭ＿０１９４００（ＮＭ＿０１９４００．３）
マウスＲａｂｅｐ１タンパク質：
ＮＰ＿００１２７８０７０（ＮＰ＿００１２７８０７０．１）、ＮＰ＿００１２７８０７１（ＮＰ＿００１２７８０７１．１）、ＮＰ＿００１２７８０７２（ＮＰ＿００１２７８０７２．１）、ＮＰ＿０６２２７３（ＮＰ＿０６２２７３．２）
【0016】
Ｒａｂｅｐ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列の例として、図４－１及び図４－２にＮＭ＿００１２９１１４１．１の塩基配列（配列番号４）を示す。Ｒａｂｅｐ１タンパク質のアミノ酸配列の例として、図５にＮＰ＿００１２７８０７０．１のアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【0017】
＜Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現抑制＞
本発明の育児放棄モデル動物は、Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制された非ヒト哺乳類である。
「Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制」とは、Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制するあらゆる態様を指し、非限定的な例示として、Ｒａｂｅｐ１遺伝子の欠損、Ｒａｂｅｐ１遺伝子及び／又はＲａｂｅｐ１遺伝子がコードするＲａｂｅｐ１タンパク質の機能を阻害すること、Ｒａｂｅｐ１タンパク質の発現を抑制すること（Ｒａｂｅｐ１遺伝子の転写の抑制、Ｒａｂｅｐ１タンパク質の翻訳の抑制など）などが挙げられる。
本発明の育児放棄モデル動物は、Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制された非ヒト哺乳類である。
「Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制」とは、Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制するあらゆる態様を指し、非限定的な例示として、Ｒａｂｅｐ１遺伝子の欠損、Ｒａｂｅｐ１遺伝子及び／又はＲａｂｅｐ１遺伝子がコードするＲａｂｅｐ１タンパク質の機能を阻害すること、Ｒａｂｅｐ１タンパク質の発現を抑制すること（Ｒａｂｅｐ１遺伝子の転写の抑制、Ｒａｂｅｐ１タンパク質の翻訳の抑制など）などが挙げられる。
【0018】
Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制された非ヒト哺乳類の好ましい態様として、Ｒａｂｅｐ１遺伝子が欠損した（ノックアウトされた）非ヒト動物が挙げられる。
Ｒａｂｅｐ１遺伝子が欠損する態様には、Ｒａｂｅｐ１遺伝子をコードする領域で１又は複数の塩基が欠失し、当該領域の一部又は全部が存在しない態様；Ｒａｂｅｐ１遺伝子をコードする領域において１又は複数の塩基が置換又は挿入され、正常なＲａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制される態様等が含まれる。
Ｒａｂｅｐ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、公知の手法により作製することができる。このような手法として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法、ＴＡＬＥＮ法等のゲノム編集技術；相同組み換え法、ジーントラップ法等のその他の遺伝子工学技術；薬剤、紫外線、放射線等の変異原を使用したランダム変異導入技術等が挙げられる。
Ｒａｂｅｐ１遺伝子を欠損する態様として、細胞組織特異的及び時期特異的にＲａｂｅｐ１遺伝子を欠損するコンディショナルノックアウトも挙げられる。
Ｒａｂｅｐ１遺伝子が欠損する態様には、Ｒａｂｅｐ１遺伝子をコードする領域で１又は複数の塩基が欠失し、当該領域の一部又は全部が存在しない態様；Ｒａｂｅｐ１遺伝子をコードする領域において１又は複数の塩基が置換又は挿入され、正常なＲａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制される態様等が含まれる。
Ｒａｂｅｐ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、公知の手法により作製することができる。このような手法として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法、ＴＡＬＥＮ法等のゲノム編集技術；相同組み換え法、ジーントラップ法等のその他の遺伝子工学技術；薬剤、紫外線、放射線等の変異原を使用したランダム変異導入技術等が挙げられる。
Ｒａｂｅｐ１遺伝子を欠損する態様として、細胞組織特異的及び時期特異的にＲａｂｅｐ１遺伝子を欠損するコンディショナルノックアウトも挙げられる。
【0019】
Ｒａｂｅｐ１遺伝子が欠損した非ヒト動物は、好ましくは対立遺伝子（アリル）の双方が欠損したホモ接合体である。
【0020】
Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制された非ヒト哺乳類の別の態様としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなどのＲａｂｅｐ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的としたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有するＲＮＡ分子や、Ｒａｂｅｐ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制することができるｍｉＲＮＡ等のＲａｂｅｐ１遺伝子の機能発現を抑制できる核酸を投与した又は発現可能な非ヒト哺乳類が挙げられる。
Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制された非ヒト哺乳類のまた別の態様としては、Ｒａｂｅｐ１タンパク質に対する特異的な抗体、その他のＲａｂｅｐ１タンパク質に対する特異的な阻害剤を投与した非ヒト哺乳類が挙げられる。
Ｒａｂｅｐ１遺伝子の機能発現が抑制された非ヒト哺乳類のまた別の態様としては、Ｒａｂｅｐ１タンパク質に対する特異的な抗体、その他のＲａｂｅｐ１タンパク質に対する特異的な阻害剤を投与した非ヒト哺乳類が挙げられる。
【0021】
本発明の育児放棄モデル動物は、例えば、後述する育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段の評価方法において使用することができる。
【0022】
［育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法］
本発明は、上記育児放棄モデル動物の用途の一つとして、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法も提供する。
本発明の育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法は、被験処置を施した上記育児放棄モデル動物の育児行動と、対照モデル動物の育児行動とを比較する工程、及び
前記被験処置を施した非ヒト動物が、前記対照非ヒト動物と比べて育児放棄が改善している場合、前記被験処置を育児放棄の予防手段及び／又は改善手段の候補として選択する工程を含む。
本発明は、上記育児放棄モデル動物の用途の一つとして、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法も提供する。
本発明の育児放棄の予防手段及び／又は改善手段のスクリーニング方法は、被験処置を施した上記育児放棄モデル動物の育児行動と、対照モデル動物の育児行動とを比較する工程、及び
前記被験処置を施した非ヒト動物が、前記対照非ヒト動物と比べて育児放棄が改善している場合、前記被験処置を育児放棄の予防手段及び／又は改善手段の候補として選択する工程を含む。
【0023】
育児放棄の予防手段とは、育児放棄の発現を未然に防止するあるいは一定期間遅延させる手段を意味する。育児放棄の予防手段には、再発を防止する手段も含まれる。
育児放棄の改善手段とは、発現している育児放棄を改善し、育児行動を促進する手段を意味する。
育児放棄の改善手段とは、発現している育児放棄を改善し、育児行動を促進する手段を意味する。
【0024】
上記被験手段は、有効な育児放棄の予防手段及び／又は育児放棄の改善手段の候補となりうる手段であれば、特に限定されない。
上記被験手段は、１つの態様では候補物質の投与である。被験物質は投与により育児放棄を予防及び／又は改善し得る物質の候補であれば、特に限定されない。候補物質は、単体物質、天然化合物（例えば、生体由来物質）又は合成化合物のいずれであってもよい。上記被験物質の具体例として、低分子化合物、抗体などのタンパク質、タンパク質の発現を抑制できる核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）、糖鎖もしくは複合糖質などが挙げられるが、これに限定されない。
候補物質の投与手段は、経口投与、経皮投与、注射投与、静脈内投与、静脈内投与等が挙げられる。
上記被験手段は、１つの態様では候補物質の投与である。被験物質は投与により育児放棄を予防及び／又は改善し得る物質の候補であれば、特に限定されない。候補物質は、単体物質、天然化合物（例えば、生体由来物質）又は合成化合物のいずれであってもよい。上記被験物質の具体例として、低分子化合物、抗体などのタンパク質、タンパク質の発現を抑制できる核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）、糖鎖もしくは複合糖質などが挙げられるが、これに限定されない。
候補物質の投与手段は、経口投与、経皮投与、注射投与、静脈内投与、静脈内投与等が挙げられる。
【0025】
上記被験手段は、別の態様では環境変化である。例えば、気温、湿度、気圧、明るさ、騒音、酸素、二酸化炭素等のガス濃度等である。
上記被験手段は、また別の態様では、肉体的ストレス又は精神的ストレスの負荷又は軽減である。
上記被験手段は、また別の態様では、肉体的ストレス又は精神的ストレスの負荷又は軽減である。
【0026】
対照モデル動物は、例えば未処置の上記育児放棄モデル動物、被験手段以外の処置を施した上記育児放棄モデル動物等であり、当業者が適宜選択することができる。
育児行動の比較、及び、育児放棄が改善しているとの評価は、当業者が適宜行うことができる。
育児行動の比較、及び、育児放棄が改善しているとの評価は、当業者が適宜行うことができる。
【0027】
本発明により、育児放棄の予防手段及び／又は改善手段の候補が選択される。
選択された育児放棄の予防手段及び／又は改善手段の候補の処置対象は、育児放棄モデル動物と同種の哺乳類に限定されない。ヒトを含む異種の哺乳類を処置対象とすることができる。
被験処置を施した本発明の育児放棄モデル動物の育児行動と、対照モデル動物の育児行動とを比較する工程からなる方法は、被験処置の評価方法とすることもできる。
選択された育児放棄の予防手段及び／又は改善手段の候補の処置対象は、育児放棄モデル動物と同種の哺乳類に限定されない。ヒトを含む異種の哺乳類を処置対象とすることができる。
被験処置を施した本発明の育児放棄モデル動物の育児行動と、対照モデル動物の育児行動とを比較する工程からなる方法は、被験処置の評価方法とすることもできる。
【実施例0028】
以下、実施例により本開示を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0029】
（１）Ｒａｂｅｐ１ノックアウトマウス
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトマウスは、熊本大学生命資源研究・支援センター動物資源開発研究施設から入手したＲａｂｅｐ１遺伝子がノックアウトされたマウスＥＳ細胞から個体化し、系統を樹立した。具体的には、Ｒａｂｅｐ１遺伝子がノックアウトされたマウスＥＳ細胞は、特許５９３５６９２号明細書の記載に従いジーントラップ法により作製したクローンであり、ショットガン的にトラップベクターがゲノムに挿入された母集団から、ゲノムシーケンシングによりトラップベクターの挿入位置を特定したクローンである。
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトマウスにおいて、Ｒａｂｅｐ１遺伝子のエキソン１と２の間にトラップベクター（Ｔｒａｐ ｖｅｃｔｏｒ；ｐＵ－２１Ｗ）が２コピー挿入されている。
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトマウスは、熊本大学生命資源研究・支援センター動物資源開発研究施設から入手したＲａｂｅｐ１遺伝子がノックアウトされたマウスＥＳ細胞から個体化し、系統を樹立した。具体的には、Ｒａｂｅｐ１遺伝子がノックアウトされたマウスＥＳ細胞は、特許５９３５６９２号明細書の記載に従いジーントラップ法により作製したクローンであり、ショットガン的にトラップベクターがゲノムに挿入された母集団から、ゲノムシーケンシングによりトラップベクターの挿入位置を特定したクローンである。
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトマウスにおいて、Ｒａｂｅｐ１遺伝子のエキソン１と２の間にトラップベクター（Ｔｒａｐ ｖｅｃｔｏｒ；ｐＵ－２１Ｗ）が２コピー挿入されている。
【0030】
Ｒａｂｅｐ１遺伝子座の模式図を図１Ａに示す。エキソン１－エキソン２間へトラップベクターが挿入されており、エキソン１－エキソン２間の正しいスプライシングが行われず、中間に生じる終止コドンによりＲａｂｅｐ１遺伝子の全長発現が抑制される。
【0031】
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトマウスは、昼夜サイクル１２時間／１２時間、温度２３℃湿度５５％の環境下で維持管理した。
給餌及び給水は制限なしで与えた。
給餌及び給水は制限なしで与えた。
【0032】
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトマウスは、下記のプライマーを使用してゲノムＰＣＲによりジェノタイピングした。
・プライマー
Ｂ０６６２：ＧＡＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＡＣＡＴＣＣＣ（配列番号１）
Ｂ０６６３：ＣＡＡＣＣＴＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＡＴ（配列番号２）
Ｂ０６６４：ＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣ（配列番号３）
プライマーＢ０６６２はトラップベクターの挿入位置の上流側配列、プライマーＢ０６６３はトラップベクター内部の下流側配列、プライマーＢ０６６４はトラップベクターの挿入位置の下流側配列である。
プライマーＢ０６６２、プライマーＢ０６６３及びプライマーＢ０６６４の３種のプライマーセットを使用すると、トラップベクターが挿入されたゲノムからはプライマーＢ０６６２とプライマーＢ０６６３による３９８ｂｐのＰＣＲ産物、トラップベクターが挿入されていないゲノムからはプライマーＢ０６６２とプライマーＢ０６６４による５５７ｂｐのＰＣＲ産物がそれぞれ増幅される。
・プライマー
Ｂ０６６２：ＧＡＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＡＣＡＴＣＣＣ（配列番号１）
Ｂ０６６３：ＣＡＡＣＣＴＣＣＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＡＴ（配列番号２）
Ｂ０６６４：ＧＴＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣ（配列番号３）
プライマーＢ０６６２はトラップベクターの挿入位置の上流側配列、プライマーＢ０６６３はトラップベクター内部の下流側配列、プライマーＢ０６６４はトラップベクターの挿入位置の下流側配列である。
プライマーＢ０６６２、プライマーＢ０６６３及びプライマーＢ０６６４の３種のプライマーセットを使用すると、トラップベクターが挿入されたゲノムからはプライマーＢ０６６２とプライマーＢ０６６３による３９８ｂｐのＰＣＲ産物、トラップベクターが挿入されていないゲノムからはプライマーＢ０６６２とプライマーＢ０６６４による５５７ｂｐのＰＣＲ産物がそれぞれ増幅される。
【0033】
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトマウスホモ接合体Ｈｏとしては、ヘテロ接合体マウスＨｅの雌から生まれた個体を用いた。
【0034】
（２）ウェスタンブロッティング解析
ウェスタンブロッティング解析を、文献：Ｓ．Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．２４，ｐ．６４１７－６４２７及びＴ．Ｏｃｈｉｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１９，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１，ｐ．１７３６８に従い行った。具体的には各遺伝子型マウスから、氷冷したｄＡＣＳＦ（ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ；人工脳脊髄液）内で大脳（Ｃｅｒｅｂｒｕｍ）及び海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）を解剖して採取し、－８０℃で保存した。
採取した脳組織を１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含む氷冷したＴＢＳバッファー又はＲＩＰＡバッファー（ナカライテスク株式会社製）中でホモジナイズした。１０，０００×ｇ、３０分間の遠心分離により、上清を回収した。
ＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、上清中の全タンパク質濃度を測定した。各試料を１０μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｌａｎｅ（図中、１０μｇ）及び２倍量（図中、２０μｇ）アプライしてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。
ブロッキングワン（ナカライテスク株式会社製）で希釈した１次抗体を、ＰＶＤＦ膜を４℃で一晩反応させた。次いで、２次抗体を室温で３０分反応させた。
１次抗体として、抗Ｒａｂｅｐ１モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１：８０００希釈で使用した。２次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウス抗体（富士フイルム和光純薬株式会社製）を使用した。
洗浄後、膜をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質（Ｍｅｒｃｋ社製）と反応させ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ５００（Ｃｙｔｉｖａ社製）を使用してシグナルを検出した。
ウェスタンブロッティング解析を、文献：Ｓ．Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．２４，ｐ．６４１７－６４２７及びＴ．Ｏｃｈｉｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１９，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１，ｐ．１７３６８に従い行った。具体的には各遺伝子型マウスから、氷冷したｄＡＣＳＦ（ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ；人工脳脊髄液）内で大脳（Ｃｅｒｅｂｒｕｍ）及び海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）を解剖して採取し、－８０℃で保存した。
採取した脳組織を１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含む氷冷したＴＢＳバッファー又はＲＩＰＡバッファー（ナカライテスク株式会社製）中でホモジナイズした。１０，０００×ｇ、３０分間の遠心分離により、上清を回収した。
ＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、上清中の全タンパク質濃度を測定した。各試料を１０μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｌａｎｅ（図中、１０μｇ）及び２倍量（図中、２０μｇ）アプライしてＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した後、ＰＶＤＦ膜にトランスファーした。
ブロッキングワン（ナカライテスク株式会社製）で希釈した１次抗体を、ＰＶＤＦ膜を４℃で一晩反応させた。次いで、２次抗体を室温で３０分反応させた。
１次抗体として、抗Ｒａｂｅｐ１モノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を１：８０００希釈で使用した。２次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウス抗体（富士フイルム和光純薬株式会社製）を使用した。
洗浄後、膜をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｆｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質（Ｍｅｒｃｋ社製）と反応させ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ５００（Ｃｙｔｉｖａ社製）を使用してシグナルを検出した。
【0035】
結果を図１Ｂに示す。
野生型マウス（＋／＋）では１１０ＫＤａ相当のタンパク質を明確に検出できた。Ｒａｂｅｐ１ノックアウトヘテロ接合体マウス（＋／－）では当該バンドは減少し、Ｒａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体（－／－）では全く当該バンド全くは検出できなかった。
これによりＲａｂｅｐ１ノックアウトホモ型では、Ｒａｂｅｐ１タンパク質の発現が抑制されていることが明らかになった。
野生型マウス（＋／＋）では１１０ＫＤａ相当のタンパク質を明確に検出できた。Ｒａｂｅｐ１ノックアウトヘテロ接合体マウス（＋／－）では当該バンドは減少し、Ｒａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体（－／－）では全く当該バンド全くは検出できなかった。
これによりＲａｂｅｐ１ノックアウトホモ型では、Ｒａｂｅｐ１タンパク質の発現が抑制されていることが明らかになった。
【0036】
（３）実施例１：育児行動の観察
野生型Ｗｔ、Ｒａｂｅｐ１ノックアウトヘテロ接合体Ｈｅ及びＲａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体Ｈｏの各遺伝子型について、育児行動の観察に使用するマウスとして９～１５週齢のマウスを用いた。
雌雄それぞれの遺伝子型を交配させた。妊娠確認後、雌マウスを個別に飼育し、出産、育児行動を観察した。母マウスが育児行動を行うために、母マウスの生存が脅かされない、ストレス負荷がない環境が望ましい。そのため、実験従事者は、出産確認後はケージへ接触せず、母マウスに干渉しなかった。
ビデオカメラにて行動を記録し、母マウスの仔マウスへの行動を観察する場合は、オープン環境であるがストレスを軽減するため、照度を２０ルクスとした。
野生型Ｗｔ、Ｒａｂｅｐ１ノックアウトヘテロ接合体Ｈｅ及びＲａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体Ｈｏの各遺伝子型について、育児行動の観察に使用するマウスとして９～１５週齢のマウスを用いた。
雌雄それぞれの遺伝子型を交配させた。妊娠確認後、雌マウスを個別に飼育し、出産、育児行動を観察した。母マウスが育児行動を行うために、母マウスの生存が脅かされない、ストレス負荷がない環境が望ましい。そのため、実験従事者は、出産確認後はケージへ接触せず、母マウスに干渉しなかった。
ビデオカメラにて行動を記録し、母マウスの仔マウスへの行動を観察する場合は、オープン環境であるがストレスを軽減するため、照度を２０ルクスとした。
【0037】
野生型Ｗｔの典型例を図２Ａ及び図２Ｂに示す。
野生型Ｗｔの母マウスは、出産後に、巣の設営、仔マウスに対するリッキング、仔マウスに対する授乳、巣への仔マウスの運搬といった特徴的な育児行動を示す。図に示すように、巣を形成し（図２Ａ、上パネル）、仔マウスを巣に集めることが確認できた（図２Ａ、下パネル）。
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体マウスは、出産した仔マウスを放置した（図２Ｂ）。図は出産後２４時間以内の様子を示し、図中、矢印は母マウス、矢尻は仔マウスを示す。授乳、巣への運搬等の行動を示さないことをビデオ撮影により確認した。
野生型Ｗｔの母マウスは、出産後に、巣の設営、仔マウスに対するリッキング、仔マウスに対する授乳、巣への仔マウスの運搬といった特徴的な育児行動を示す。図に示すように、巣を形成し（図２Ａ、上パネル）、仔マウスを巣に集めることが確認できた（図２Ａ、下パネル）。
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体マウスは、出産した仔マウスを放置した（図２Ｂ）。図は出産後２４時間以内の様子を示し、図中、矢印は母マウス、矢尻は仔マウスを示す。授乳、巣への運搬等の行動を示さないことをビデオ撮影により確認した。
【0038】
出産から１週間後に仔マウスの生死を確認し、育児の有無を判定した結果を図２Ｃに示す。１週間後に仔マウスが生存している場合を育児（Ｎｕｒｓｉｎｇ）、仔マウスが生存していない場合は、育児放棄（Ｎｅｇｌｅｃｔ）と判定した。
雌の遺伝子型（ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）がＷｔ、Ｈｅ及びＨｏのそれぞれの場合において、育児＋育児放棄の全数に対する育児放棄の比（Ｎｅｇｌｅｃｔ（ｒａｔｉｏ））を図２Ｃに示す。
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体マウスは、高頻度で育児放棄様行動を示すことが明らかとなった。
雌の遺伝子型（ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）がＷｔ、Ｈｅ及びＨｏのそれぞれの場合において、育児＋育児放棄の全数に対する育児放棄の比（Ｎｅｇｌｅｃｔ（ｒａｔｉｏ））を図２Ｃに示す。
Ｒａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体マウスは、高頻度で育児放棄様行動を示すことが明らかとなった。
【0039】
（４）実施例２：遺伝子型に依存した育児放棄様行動の評価
上記で観察した育児放棄様行動が、雌の遺伝子型（ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）又は雄の遺伝子型（ｍａｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）のいずれに依存するかを評価した。
上記で観察した育児放棄様行動が、雌の遺伝子型（ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）又は雄の遺伝子型（ｍａｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）のいずれに依存するかを評価した。
【0040】
図３Ａは、雌の遺伝子型（ｆｅｍａｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）がＷｔ、Ｈｅ及びＨｏのそれぞれである群において、交配相手の雄の遺伝子型ごと（ｍａｌｅ／Ｗｔ、ｍａｌｅ／Ｈｅ、ｍａｌｅ／Ｈｏ）に育児行動をプロットした。いずれの雌の遺伝子型においても、育児行動が交配相手の雄に依存する傾向は見られなかった。
図３Ｂは、交配相手の雄の遺伝子型（ｍａｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）がＷｔ、Ｈｅ及びＨｏのそれぞれである群において、雌の遺伝子型ごと（ｆｅｍａｌｅ／Ｗｔ、ｆｅｍａｌｅ／Ｈｅ、ｆｅｍａｌｅ／Ｈｏ）に育児行動をプロットした。いずれの交配相手の雄の遺伝子型においても、育児行動が雌の遺伝子型に依存した。
図３Ｂは、交配相手の雄の遺伝子型（ｍａｌｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅ）がＷｔ、Ｈｅ及びＨｏのそれぞれである群において、雌の遺伝子型ごと（ｆｅｍａｌｅ／Ｗｔ、ｆｅｍａｌｅ／Ｈｅ、ｆｅｍａｌｅ／Ｈｏ）に育児行動をプロットした。いずれの交配相手の雄の遺伝子型においても、育児行動が雌の遺伝子型に依存した。
【0041】
育児放棄様行動が母マウスの成長不良等に依存した可能性を検討した。
図３Ｃに、母マウスの遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）ごとの体重（ｗｅｉｇｈｔ（ｇ））を示す。
成長の一つの指標である体重は、野生型とＲａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体との間で差がなかった。そのため、育児放棄様行動は、成長不良等に依存した表現型である可能性は低いと考えられる。
図３Ｃに、母マウスの遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）ごとの体重（ｗｅｉｇｈｔ（ｇ））を示す。
成長の一つの指標である体重は、野生型とＲａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体との間で差がなかった。そのため、育児放棄様行動は、成長不良等に依存した表現型である可能性は低いと考えられる。
【0042】
以上の結果から、Ｒａｂｅｐ１ノックアウトホモ接合体マウスは、高頻度で育児放棄様行動を示すマウスであるといえる。Ｒａｂｅｐ１遺伝子には育児行動との明確な因果関係が見当たらない。そのため、従来報告されている育児放棄モデル動物とは異なる階層での治療方法の開発に貢献することが大いに期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【配列表】