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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2021-12-16
(45)【発行日】2022-01-14
(54)【発明の名称】放射線治療用増感剤
(51)【国際特許分類】
A61K 33/26 20060101AFI20220106BHJP
A61K 31/197 20060101ALI20220106BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220106BHJP
【ＦＩ】
A61K33/26
A61K31/197
A61P31/12
A61P35/00
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2017253583
(22)【出願日】2017-12-28
(65)【公開番号】P2019119692
(43)【公開日】2019-07-22
【審査請求日】2020-11-04
(73)【特許権者】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】510097747
【氏名又は名称】国立研究開発法人国立がん研究センター
(73)【特許権者】
【識別番号】508123858
【氏名又は名称】ＳＢＩファーマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100102255
【弁理士】
【氏名又は名称】小澤 誠次
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100188352
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 一弘
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100198074
【弁理士】
【氏名又は名称】山村 昭裕
(74)【代理人】
【識別番号】100145920
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100096013
【弁理士】
【氏名又は名称】富田 博行
(72)【発明者】
【氏名】高橋 淳子
(72)【発明者】
【氏名】岩橋 均
(72)【発明者】
【氏名】成田 善孝
(72)【発明者】
【氏名】井垣 浩
(72)【発明者】
【氏名】田中 徹
(72)【発明者】
【氏名】石塚 昌宏
(72)【発明者】
【氏名】原 武史
【審査官】藤代 亮
(56)【参考文献】
【文献】特開２００９－１５５２３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】PLOS ONE，2015年03月30日，DOI:10.1371/journal.pone.0122351
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
・ＩＰＣ
Ａ６１Ｋ ３３／２６
Ａ６１Ｋ ３１／１９７
Ａ６１Ｐ ３１／１２
Ａ６１Ｐ ３５／００
・ＤＢ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物を含有し、Ｘ線照射前に治療対象に投与され、対象のＸ線治療に使用されるＸ線治療用増感剤。
【化1】
【請求項2】
鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及び硫化グリシン鉄から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項１に記載のＸ線治療用増感剤。
【請求項3】
鉄化合物が、クエン酸第一鉄であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＸ線治療用増感剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、放射線照射により、がん細胞等の悪性新生物；がん前駆細胞、ウイルスに感染した細胞、細菌に感染した細胞等の病変部における細胞；を選択的に損傷又は死滅させる放射線治療に用いられる放射線治療用増感剤に関する。
【背景技術】
【0002】
従来の放射線治療では、Ｘ線、ガンマ線等の高エネルギーの放射線が腫瘍に集中的に照射されると、細胞内の水がヒドロキシラジカルと水素原子に分解され、これらが細胞内の酸素と反応して、スーパーオキシド及びヒドロペルオキシラジカルが生成される。これらの活性酸素及びフリーラジカルは細胞中のＤＮＡに損傷を与え、更に、細胞膜の脂質から水素を引き抜き、過酸化ラジカルの連鎖によって過酸化脂質に変質させて細胞膜傷害を引き起こす。しかし、放射線を標的細胞にのみ選択的に照射できないことから、ＤＮＡ損傷と細胞膜傷害は患部周囲の正常細胞でも進行していた。
【0003】
そこで、５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）が腫瘍に選択的に取り込まれ、プロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）が生成され、次いでＸ線照射によりＰｐＩＸから活性酸素及びフリーラジカルが発生することに着目し、５－ＡＬＡを有効成分として含有するＸ線治療用増感剤が検討された（例えば、特許文献１参照）。５－アミノレブリン酸類（５－ＡＬＡ類）を対象に投与すると、ＰｐＩＸが腫瘍等の病変部に特異的に蓄積される生理現象は他の治療方法にも応用され、ＰｐＩＸが蓄積された病変部に波長４００～７００ｎｍのレーザー光を照射し、ＰｐＩＸから活性酸素を発生させて、選択的に病変部組織を傷害壊滅する光線力学的治療方法が検討された（例えば、特許文献２参照）。
【0004】
５－ＡＬＡ類の摂取は、他の生理作用をもたらすことが知られている。５－ＡＬＡ類と鉄化合物の摂取が、放射線に被曝した生物の造血障害と体重低下を緩和できることが見いだされ、５－ＡＬＡ類と鉄化合物を含有する放射線障害の予防及び／又は治療剤が検討された（例えば、特許文献３参照）。さらに、５－ＡＬＡ類と鉄化合物の摂取が、ミトコンドリアの電子伝達系からの電子の漏れを防止して活性酸素の発生を抑制することが見いだされ、５－ＡＬＡ類と鉄化合物を含有するがんの予防・改善組成物が検討された（例えば、特許文献４参照）。
【0005】
ところで、５－ＡＬＡと鉄化合物の投与により、正常細胞におけるＰｐＩＸの蓄積が抑制され、ＰｐＩＸががん細胞で特異的に蓄積されることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特許第５１８２８５８号公報
【文献】特開２０１７－７９９４０号公報
【文献】特許第５９２０９０２号公報
【文献】特開２０１１－１６７５３号公報
【非特許文献】
【0007】
【文献】PLOS ONE, Hayashi M. et al. DOI:10.1371/journal.pone.0122351 March 30, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
Ｘ線治療では、小線量のＸ線が繰り返し対象に照射されることが多い。Ｘ線治療のため、特許文献１に示されるＸ線治療用増感剤を繰り返し対象に投与した場合、正常細胞におけるＰｐＩＸの蓄積による副作用が懸念された。そこで、繰り返し対象に投与しても正常細胞におけるＰｐＩＸの蓄積を抑制できる放射線治療用増感剤が求められていたが、そのような放射線治療用増感剤は提供されていなかった。すなわち本発明の課題は、繰り返し対象に投与しても正常細胞におけるＰｐＩＸの蓄積を抑制できる放射線治療用増感剤の提供である。
【課題を解決するための手段】
【0009】
非特許文献１に示される知見によれば、５－ＡＬＡと鉄化合物の投与時のがん細胞におけるＰｐＩＸの蓄積量は、５－ＡＬＡのみ投与時のがん細胞におけるＰｐＩＸの蓄積量より少なくなるから、５－ＡＬＡと鉄化合物の投与時のＸ線増感作用は、５－ＡＬＡのみ摂取時のＸ線増感作用より低くなること、及び、５－ＡＬＡと鉄化合物の投与によりＰｐＩＸと鉄ががん細胞で特異的に蓄積される一方、正常細胞におけるＰｐＩＸの蓄積が抑制されることが予想される。本発明者らは、５－ＡＬＡと鉄化合物の投与により、正常細胞におけるＰｐＩＸの蓄積が抑制され、かつ蓄積されたＰｐＩＸと鉄に放射線が照射されると活性酸素及びフリーラジカルを発生させることを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【0010】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］以下の式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物を含有し、
放射線照射前に治療対象に投与され、対象の放射線治療に使用される放射線治療用増感剤。
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
［２］Ｒ１及びＲ２が、水素原子であることを特徴とする上記［１］に記載の放射線治療用増感剤。
［３］鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及び硫化グリシン鉄から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載の放射線治療用増感剤。
［４］鉄化合物が、クエン酸第一鉄であることを特徴とする上記［１］～［３］のいずれかに記載の放射線治療用増感剤。
［１］以下の式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物を含有し、
放射線照射前に治療対象に投与され、対象の放射線治療に使用される放射線治療用増感剤。
【化1】
［２］Ｒ１及びＲ２が、水素原子であることを特徴とする上記［１］に記載の放射線治療用増感剤。
［３］鉄化合物が、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、及び硫化グリシン鉄から選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする上記［１］又は［２］に記載の放射線治療用増感剤。
［４］鉄化合物が、クエン酸第一鉄であることを特徴とする上記［１］～［３］のいずれかに記載の放射線治療用増感剤。
【0011】
また、本発明の別の態様は、以下のとおりである。
［５］上記［１］～［４］のいずれかに記載の放射線治療用増感剤を対象に投与した後、放射線治療を必要とする対象に放射線を照射することを特徴とする放射線治療方法。
［６］ａ）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
ｂ）鉄化合物；
を同時又は前後して対象に投与した後、放射線治療を必要とする対象に放射線を照射することを特徴とする放射線治療方法。
［７］放射線治療を必要とする対象に放射線照射前に投与される、
ａ）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
ｂ）鉄化合物；
を含む、放射線治療に使用されるための放射線治療用キット。
［８］放射線治療を必要とする対象に放射線照射前に投与される、放射線治療用増感剤として用いるための、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物。
［９］放射線治療を必要とする対象に放射線照射前に投与される放射線治療用増感剤を調製するための、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物との使用。
［５］上記［１］～［４］のいずれかに記載の放射線治療用増感剤を対象に投与した後、放射線治療を必要とする対象に放射線を照射することを特徴とする放射線治療方法。
［６］ａ）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
ｂ）鉄化合物；
を同時又は前後して対象に投与した後、放射線治療を必要とする対象に放射線を照射することを特徴とする放射線治療方法。
［７］放射線治療を必要とする対象に放射線照射前に投与される、
ａ）上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩；
ｂ）鉄化合物；
を含む、放射線治療に使用されるための放射線治療用キット。
［８］放射線治療を必要とする対象に放射線照射前に投与される、放射線治療用増感剤として用いるための、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物。
［９］放射線治療を必要とする対象に放射線照射前に投与される放射線治療用増感剤を調製するための、上記式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と鉄化合物との使用。
【発明の効果】
【0012】
本発明の放射線治療用増感剤は、５－ＡＬＡのみを有効成分として含有するＸ線治療用増感剤と同等以上の放射線増感作用を示す。さらに、本発明の放射線治療用増感剤を繰り返し対象に投与しても、正常細胞におけるＰｐＩＸの蓄積を抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】混合モル比の異なる５－ＡＬＡと鉄剤とを併用した場合の、マウスメラノーマ細胞に蓄積されるＰｐＩＸ濃度を示す図である。
【図2】混合モル比の異なる５－ＡＬＡと鉄剤とを併用した場合の、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞に蓄積されるＰｐＩＸ濃度を示す図である。
【図3】５－ＡＬＡ単独、及び５－ＡＬＡと鉄とを併用した場合の、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞に蓄積される鉄イオン濃度を示す図である。
【図7】５－ＡＬＡ単独、及び５－ＡＬＡと鉄との併用投与した場合のin vivoにおける抗腫瘍効果の検証結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明の放射線治療用増感剤は、上記式（Ｉ）で示される化合物を含有する。上記式（Ｉ）のＲ１及びＲ２が共に水素原子である５－ＡＬＡは、δ－アミノレブリン酸とも呼ばれるアミノ酸の１種である。本発明の放射線治療用増感剤が含有する５－ＡＬＡ類は、上記式（Ｉ）のＲ１が水素原子又はアシル基であり、上記式（Ｉ）のＲ２が水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基である。
【0015】
上記式（Ｉ）におけるアシル基の具体例は、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１～８のアルカノイル基；ベンゾイル、１－ナフトイル、２－ナフトイル基等の炭素数７～１４のアロイル基等である。
【0016】
上記式（Ｉ）におけるアルキル基の具体例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１～８のアルキル基等である。
【0017】
上記式（Ｉ）におけるシクロアルキル基の具体例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１－シクロヘキセニル基等の飽和又は一部不飽和結合が存在してもよい炭素数３～８のシクロアルキル基等である。
【0018】
上記式（Ｉ）におけるアリール基の具体例は、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６～１４のアリール基等である。
【0019】
上記式（Ｉ）におけるアラルキル基のアリール部分は、上記アリール基と同様に例示され、上記アラルキル基のアルキル部分は、上記アルキル基と同様に例示される。上記アラルキル基の具体例は、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７～１５のアラルキル基等である。
【0020】
上記５－ＡＬＡ類は、生体内で、上記式（Ｉ）で示される５－ＡＬＡ又はその誘導体の状態で本発明の効果を奏せればよく、投与する形態に応じて、溶解性を高めるための各種の５－ＡＬＡ塩、または生体内の酵素で分解される５－ＡＬＡのエステル誘導体等のプロドラッグ（前駆体）として投与される。５－ＡＬＡ及びその誘導体の塩の具体例は、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等である。上記酸付加塩の具体例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の無機酸塩；ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の有機酸付加塩である。上記金属塩の具体例は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；亜鉛塩等である。上記アンモニウム塩の具体例は、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等である。有機アミン塩の具体例は、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等である。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられてよい。
【0021】
上記５－ＡＬＡ類のうち、特に好ましい化合物は、５－ＡＬＡ；５－ＡＬＡメチルエステル、５－ＡＬＡエチルエステル、５－ＡＬＡプロピルエステル、５－ＡＬＡブチルエステル、５－ＡＬＡペンチルエステル等の５－ＡＬＡエステル誘導体；並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩である。５－ＡＬＡ、５－ＡＬＡ塩酸塩及び５－ＡＬＡリン酸塩は最も好ましい。
【0022】
上記５－ＡＬＡ類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの公知の方法によって製造されていてよい。上記５－ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよい。上記５－ＡＬＡ類のいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【0023】
本発明の放射線治療用増感剤は鉄化合物を含有する。上記鉄化合物は、有機塩でも無機塩でもよい。上記無機塩の具体例は、塩化第二鉄、三二酸化鉄、硫酸鉄、ピロリン酸第一鉄等である。上記有機塩の具体例は、ヒドロキシカルボン酸塩等のカルボン酸塩、クエン酸第一鉄、クエン酸鉄ナトリウム、クエン酸第一鉄ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、ピロリン酸第二鉄、乳酸鉄、グルコン酸第一鉄、ジエチレントリアミン五酢酸鉄ナトリウム、ジエチレントリアミン五酢酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸鉄ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸鉄アンモニウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄ナトリウム、ジカルボキシメチルグルタミン酸鉄アンモニウム、フマル酸第一鉄、酢酸鉄、シュウ酸鉄、コハク酸第一鉄、コハク酸クエン酸鉄ナトリウム、ヘム鉄、デキストラン鉄、トリエチレンテトラアミン鉄、ラクトフェリン鉄、トランスフェリン鉄、鉄クロロフィリンナトリウム、フェリチン鉄、含糖酸化鉄、硫化グリシン鉄等である。上記鉄化合物の１種又は２種以上を用いることができる。
【0024】
上記鉄化合物の投与量は、上記５－ＡＬＡ類の投与量に対してモル比で０．００００１倍～１００倍であればよく、好ましくは０．００００３倍～１０倍であり、より好ましくは０．００００５倍～２倍である。
【0025】
本発明の放射線治療用増感剤に含有される５－ＡＬＡ類と鉄化合物は、５－ＡＬＡ類と鉄化合物を含む組成物としても、あるいは、それぞれ単独でも対象に投与できる。５－ＡＬＡ類と鉄化合物をそれぞれ単独で投与する場合、これらを同時に対象に投与してもよく、対象へのこれらの投与時期をずらしてもよく、こられのいずれかを徐放性製剤として対象に投与してもよい。病変部における細胞に蓄積されるＰｐＩＸ濃度のピークと鉄濃度のピークが重複すると、放射線治療の治療効果が高くなる。例えば、５－ＡＬＡの対象への投与によりがん細胞におけるＰｐＩＸ濃度のピーク時期が５－ＡＬＡ投与から６時間後、鉄化合物の対象への投与により血中の鉄濃度のピーク時期が鉄化合物投与から４時間後である場合、鉄化合物の対象への投与時期を５－ＡＬＡの対象への投与時期より２時間程度遅らせると、放射線増感作用をより高くできる、若しくは、これらの化合物の投与量を減らせる。
【0026】
本発明の放射線治療用増感剤の投与経路は、舌下投与を含む経口投与；カテーテルによる腎臓直接投与；吸入投与；点滴を含む静脈内投与；発布剤等による経皮投与；座薬、経鼻胃管、経鼻腸管、胃ろうチューブ又は腸ろうチューブを用いる強制的経腸栄養法による非経口投与等である。
【0027】
本発明の放射線治療用増感剤の剤型を上記経路投与に応じて適宜決定できる。上記剤形の具体例は、注射剤、点滴剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、散在、液剤、シロップ等に溶解した水剤、発布剤、座薬剤等である。
【0028】
本発明の放射線治療用増感剤を調製するため、必要に応じて、薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤、添加剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等を添加できる。これらの具体例は、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリン等である。なお、本発明の放射線治療用増感剤を水溶液として調製する場合、５－ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意することが望ましく、水溶液がアルカリ性となる場合、酸素の除去によって５－ＡＬＡ類の分解を防止できる。
【0029】
本発明の放射線治療用増感剤の対象への投与後、通常２４時間以内、好ましくは１８時間以内、更に好ましくは３～１２時間以内に放射線治療が開始される。本発明の放射線治療用増感剤の投与量は、放射線治療の対象となる患者の慎重、体重、年齢、症状等に応じて変更できる。本発明の放射線治療用増感剤に含まれる５－ＡＬＡ類の投与量は、５－ＡＬＡ（すなわち、式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２が水素原子である）換算で、対象１ｋｇ当たり、１ｍｇ～１，５００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ～１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ～３０ｍｇ、更に好ましくは１５ｍｇ～２５ｍｇの範囲で調節できる。
【0030】
本発明の放射線治療用増感剤の対象への投与後、対象に照射される放射線は、γ線、Ｘ線、電子線、α線、中性子線等の電離性放射線である。
【0031】
以下に実験例と実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実験例と実施例に限定されるものではない。
【0032】
［実験例１］
二酸化炭素雰囲気（空気中の二酸化炭素濃度を５体積％に調製）下、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養されたマウスメラノーマＢ１６／ＢＬ６細胞を９６穴マイクロプレートに播種してコンフリュエントになるまで培養した。５－ＡＬＡと鉄剤のモル比が１：０．００００５、１：０．０００５、１：０．００５、１：０．０５、１：０．５となるように、１００μｇ／ｍＬの５－ＡＬＡにクエン酸第一鉄が添加された培養液を、マウスメラノーマＢ１６／ＢＬ６細胞を培養しているプレートへ加えて３時間培養し、マイクロプレートリーダーを用いて、ＰｐＩＸの励起波長である４０５ｎｍの光を上記細胞に照射し、上記細胞から放射される６３６ｎｍの蛍光を観測してＰｐＩＸ濃度を測定した。結果を図１に示す。なお、縦軸の値（ratio）は鉄剤を加えない場合に対する比で示した（ｎ＝４）。その結果、培地中の５－ＡＬＡに対する鉄のモル比が増加するに従って、マウスメラノーマＢ１６／ＢＬ６細胞に蓄積されるＰｐＩＸ濃度が低下することが判明した。
二酸化炭素雰囲気（空気中の二酸化炭素濃度を５体積％に調製）下、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養されたマウスメラノーマＢ１６／ＢＬ６細胞を９６穴マイクロプレートに播種してコンフリュエントになるまで培養した。５－ＡＬＡと鉄剤のモル比が１：０．００００５、１：０．０００５、１：０．００５、１：０．０５、１：０．５となるように、１００μｇ／ｍＬの５－ＡＬＡにクエン酸第一鉄が添加された培養液を、マウスメラノーマＢ１６／ＢＬ６細胞を培養しているプレートへ加えて３時間培養し、マイクロプレートリーダーを用いて、ＰｐＩＸの励起波長である４０５ｎｍの光を上記細胞に照射し、上記細胞から放射される６３６ｎｍの蛍光を観測してＰｐＩＸ濃度を測定した。結果を図１に示す。なお、縦軸の値（ratio）は鉄剤を加えない場合に対する比で示した（ｎ＝４）。その結果、培地中の５－ＡＬＡに対する鉄のモル比が増加するに従って、マウスメラノーマＢ１６／ＢＬ６細胞に蓄積されるＰｐＩＸ濃度が低下することが判明した。
【0033】
［実験例２］
二酸化炭素雰囲気（空気中の二酸化炭素濃度を５体積％に調製）下、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養されたヒト肺胞基底上皮腺癌Ａ５４９細胞を９６穴マイクロプレートに播種してコンフリュエントになるまで培養した。５－ＡＬＡと鉄剤のモル比が１：０．００００５、１：０．０００５、１：０．００５、１：０．０５、１：０．５となるように、１００μｇ／ｍＬの５－ＡＬＡにクエン酸第一鉄が添加された培養液を、ヒト肺胞基底上皮腺癌Ａ５４９細胞を培養しているプレートへ加えて３時間培養し、マイクロプレートリーダーを用いて、ＰｐＩＸの励起波長である４０５ｎｍの光を上記細胞に照射し、上記細胞から放射される６３６ｎｍの蛍光を観測してＰｐＩＸ濃度を測定した。結果を図２に示す。なお、値（ratio）は鉄剤を加えない場合に対する比で示した（ｎ＝４）。その結果、培地中の５－ＡＬＡに対する鉄のモル比が増加するに従って、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞に蓄積されるＰｐＩＸ濃度が低下することが判明した。
二酸化炭素雰囲気（空気中の二酸化炭素濃度を５体積％に調製）下、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養されたヒト肺胞基底上皮腺癌Ａ５４９細胞を９６穴マイクロプレートに播種してコンフリュエントになるまで培養した。５－ＡＬＡと鉄剤のモル比が１：０．００００５、１：０．０００５、１：０．００５、１：０．０５、１：０．５となるように、１００μｇ／ｍＬの５－ＡＬＡにクエン酸第一鉄が添加された培養液を、ヒト肺胞基底上皮腺癌Ａ５４９細胞を培養しているプレートへ加えて３時間培養し、マイクロプレートリーダーを用いて、ＰｐＩＸの励起波長である４０５ｎｍの光を上記細胞に照射し、上記細胞から放射される６３６ｎｍの蛍光を観測してＰｐＩＸ濃度を測定した。結果を図２に示す。なお、値（ratio）は鉄剤を加えない場合に対する比で示した（ｎ＝４）。その結果、培地中の５－ＡＬＡに対する鉄のモル比が増加するに従って、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞に蓄積されるＰｐＩＸ濃度が低下することが判明した。
【0034】
［実験例３］
ヒト肺胞基底上皮腺癌Ａ５４９細胞を２５ｃｍ２の面積でフラスコに播種して、二酸化炭素雰囲気（空気中の二酸化炭素濃度を５体積％に調製）下、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でコンフリュエントになるまで培養した。上記フラスコ中の培養液を、５－ＡＬＡが１００μｇ／ｍＬ、クエン酸第一鉄が０．３０ｍＭとなるように調製された培養液（５－ＡＬＡと鉄のモル比＝１：０．５）に交換して２時間培養を行った後、５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄が含まれていない通常の培養液に交換した。その２時間後と翌朝に通常の培養液に交換し、細胞内及び培地内から５－ＡＬＡ、クエン酸第一鉄及びＰｐＩＸ完全に除去した。翌朝の培地交換から２時間後に上記５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄を含む培養液に交換して２時間培養を行った。この細胞培養方法で２日間培養を行った。２日目の培養終了後、培養された細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスした。その後、１０％トリプシン－ＥＤＴＡを加えて３７℃で５分間静置し、培養された細胞をフラスコから剥がして採取した。採取した細胞に５００μＬのＰＢＳを添加し、更に、５μＬの６Ｍ－ＨＣｌを添加して試料とした。その後、メタロアッセイ鉄測定キット（Metallogenics社）を用いてフェロジン法により試料となった細胞内の鉄イオン濃度を測定した。さらに、５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄が上記濃度で含まれるように調製された培養液に代えて５－ＡＬＡが１００μｇ／ｍＬとなるように調製された培養液を使用して上記と同様の培養を行い、細胞内の鉄イオン濃度を測定した。ヒト肺胞基底上皮腺癌Ａ５４９細胞を通常の培養液で２日間培養した場合の細胞内の鉄イオン濃度も測定した。結果を図３に示す。
なお、フェロジン法では、トランスフェリン等の輸送タンパク質に結合している鉄を、弱酸と変性剤で解離させ、鉄－フェロジン錯体を形成させ、この錯体を波長５６０ｎｍの光で検出して鉄濃度を測定している。
ヒト肺胞基底上皮腺癌Ａ５４９細胞を２５ｃｍ２の面積でフラスコに播種して、二酸化炭素雰囲気（空気中の二酸化炭素濃度を５体積％に調製）下、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地でコンフリュエントになるまで培養した。上記フラスコ中の培養液を、５－ＡＬＡが１００μｇ／ｍＬ、クエン酸第一鉄が０．３０ｍＭとなるように調製された培養液（５－ＡＬＡと鉄のモル比＝１：０．５）に交換して２時間培養を行った後、５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄が含まれていない通常の培養液に交換した。その２時間後と翌朝に通常の培養液に交換し、細胞内及び培地内から５－ＡＬＡ、クエン酸第一鉄及びＰｐＩＸ完全に除去した。翌朝の培地交換から２時間後に上記５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄を含む培養液に交換して２時間培養を行った。この細胞培養方法で２日間培養を行った。２日目の培養終了後、培養された細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスした。その後、１０％トリプシン－ＥＤＴＡを加えて３７℃で５分間静置し、培養された細胞をフラスコから剥がして採取した。採取した細胞に５００μＬのＰＢＳを添加し、更に、５μＬの６Ｍ－ＨＣｌを添加して試料とした。その後、メタロアッセイ鉄測定キット（Metallogenics社）を用いてフェロジン法により試料となった細胞内の鉄イオン濃度を測定した。さらに、５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄が上記濃度で含まれるように調製された培養液に代えて５－ＡＬＡが１００μｇ／ｍＬとなるように調製された培養液を使用して上記と同様の培養を行い、細胞内の鉄イオン濃度を測定した。ヒト肺胞基底上皮腺癌Ａ５４９細胞を通常の培養液で２日間培養した場合の細胞内の鉄イオン濃度も測定した。結果を図３に示す。
なお、フェロジン法では、トランスフェリン等の輸送タンパク質に結合している鉄を、弱酸と変性剤で解離させ、鉄－フェロジン錯体を形成させ、この錯体を波長５６０ｎｍの光で検出して鉄濃度を測定している。
【0035】
５－ＡＬＡ及びクエン酸第一鉄を含む培地で培養されたヒト肺胞基底上皮腺癌細胞に蓄積される鉄の量は、５－ＡＬＡを含みクエン酸第一鉄を含まない培地で培養されたヒト肺胞基底上皮腺癌細胞に蓄積される鉄の量と、５－ＡＬＡ及びクエン酸第一鉄を含まない培地で培養されたヒト肺胞基底上皮腺癌細胞に蓄積される鉄の量よりも多くなることが判明した。
【0036】
［実験例４］
近交系実験用マウスであるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢雌）の皮下に、１×１０５個のマウスメラノーマＢ１６／ＢＬ６細胞を接種し、担がんマウスを作製した。作製した担がんマウスを、５－ＡＬＡ及び鉄化合物を含まないＰＢＳを７日間連続で腹腔投与するコントロール群(control)、２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの５－ＡＬＡを７日間連続で腹腔投与する群(ALA)、２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄（５－ＡＬＡと鉄のモル比＝１：０．５）を７日間連続で腹腔投与する群(ALA+Fe)の３群に分け、それぞれの担がんマウスを７日目の腹腔投与から４時間後に安楽死させ、ＰＢＳで灌流した後、腫瘍組織（Ｂ１６／ＢＬ６細胞）及び正常組織（脳）を摘出した。摘出した組織５０ｍｇに対して５００μＬのＰＢＳを添加し、更に、５μＬの６Ｍ－ＨＣｌを添加し、ホモジナイズを行い、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離して得られた上清を試料として、フェロジン法により試料となった組織内の鉄濃度を測定した。通常組織に蓄積された鉄濃度を図４Ａに、腫瘍組織に蓄積された鉄濃度を図４Ｂに示す。
近交系実験用マウスであるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６週齢雌）の皮下に、１×１０５個のマウスメラノーマＢ１６／ＢＬ６細胞を接種し、担がんマウスを作製した。作製した担がんマウスを、５－ＡＬＡ及び鉄化合物を含まないＰＢＳを７日間連続で腹腔投与するコントロール群(control)、２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの５－ＡＬＡを７日間連続で腹腔投与する群(ALA)、２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄（５－ＡＬＡと鉄のモル比＝１：０．５）を７日間連続で腹腔投与する群(ALA+Fe)の３群に分け、それぞれの担がんマウスを７日目の腹腔投与から４時間後に安楽死させ、ＰＢＳで灌流した後、腫瘍組織（Ｂ１６／ＢＬ６細胞）及び正常組織（脳）を摘出した。摘出した組織５０ｍｇに対して５００μＬのＰＢＳを添加し、更に、５μＬの６Ｍ－ＨＣｌを添加し、ホモジナイズを行い、８０００ｒｐｍで５分間遠心分離して得られた上清を試料として、フェロジン法により試料となった組織内の鉄濃度を測定した。通常組織に蓄積された鉄濃度を図４Ａに、腫瘍組織に蓄積された鉄濃度を図４Ｂに示す。
【0037】
３群の正常組織に蓄積される鉄濃度はほぼ同一であった。一方、腫瘍組織に蓄積さえる鉄濃度については、ALA+Feの腫瘍組織に蓄積される鉄濃度、ALAの腫瘍組織に蓄積される鉄濃度、controlの腫瘍組織に蓄積される鉄濃度の順に大きくなっていた。
【0038】
［実験例５］
BALB/c nu/nuマウス（６週齢雌）に、２００ｍｇ／ｋｇの５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄をモル比で１：０、１：０．０５、１：０．１になるように腹腔投与した。腹腔投与から０、１、２、３、４、６時間後のマウスの全身におけるＰｐＩＸの蛍光を、IVIS Imaging System（住商ファーマインターナショナル株式会社、励起波長４３０ｎｍ、蛍光波長６４０ｎｍ）で動態観察した。５－ＡＬＡを投与しないマウスをコントロール群とした。腹腔投与から３～４時間後にＰｐＩＸ蓄積量がピークを示した。蛍光強度の比較結果を図５－Ａに、動態観察の結果を図５－Ｂに示す。
BALB/c nu/nuマウス（６週齢雌）に、２００ｍｇ／ｋｇの５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄をモル比で１：０、１：０．０５、１：０．１になるように腹腔投与した。腹腔投与から０、１、２、３、４、６時間後のマウスの全身におけるＰｐＩＸの蛍光を、IVIS Imaging System（住商ファーマインターナショナル株式会社、励起波長４３０ｎｍ、蛍光波長６４０ｎｍ）で動態観察した。５－ＡＬＡを投与しないマウスをコントロール群とした。腹腔投与から３～４時間後にＰｐＩＸ蓄積量がピークを示した。蛍光強度の比較結果を図５－Ａに、動態観察の結果を図５－Ｂに示す。
【0039】
５－ＡＬＡに対するクエン酸第一鉄のモル比が高くなるほど、蛍光が弱くなり、蓄積されるＰｐＩＸの量が少なくなることが判明した。
【0040】
［実験例６］
鉄剤（クエン酸第一鉄、硫酸鉄(II)、酢酸鉄(II)）を濃度０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭになるようにＰＢＳに溶解した溶液を、細胞を播種していないマイクロプレートに添加した。次いで、活性酸素検出試薬であるアミノフェニルフルオレセイン（ＡＰＦ）を濃度５μＭとなるようにＰＢＳに添加した溶液を加えた後、作製したプレートにＸ線を照射し、マイクロプレートリーダーを用いてＡＰＦの蛍光（励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）をマルチ検出モードマイクロプレートリーダー装置（TECAN社）で観測し、発生したヒドロキシラジカルの量を測定した。結果を図６に示す。
鉄剤（クエン酸第一鉄、硫酸鉄(II)、酢酸鉄(II)）を濃度０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭになるようにＰＢＳに溶解した溶液を、細胞を播種していないマイクロプレートに添加した。次いで、活性酸素検出試薬であるアミノフェニルフルオレセイン（ＡＰＦ）を濃度５μＭとなるようにＰＢＳに添加した溶液を加えた後、作製したプレートにＸ線を照射し、マイクロプレートリーダーを用いてＡＰＦの蛍光（励起波長４８０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）をマルチ検出モードマイクロプレートリーダー装置（TECAN社）で観測し、発生したヒドロキシラジカルの量を測定した。結果を図６に示す。
【0041】
鉄化合物の種類によらず、鉄濃度と照射されたＸ線量が大きくなると、蛍光強度が強くなり、発生した活性酸素（主としてヒドロキシラジカル）の量が多くなることが判明した。
【0042】
［実施例１］
ルシフェラーゼ発現マウスメラノーマ細胞であるB16-luc細胞１×１０４個をBALB/c nu/nuマウス（６週齢雌）の脳に接種し、担がんマウスを作製した。B16-luc細胞の接種から２日後、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを担がんマウスに投与し、IVIS Imaging System（住商ファーマインターナショナル株式会社）でB16-luc細胞が発するルシフェラーゼ蛍光を定量し、ルシフェラーゼ蛍光の平均が均等になるように、Ｘ線を照射するのみの群、２００ｍｇ／ｋｇの５－ＡＬＡの投与から４時間後にＸ線を照射する群、２００ｍｇ／ｋｇの５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄（５－ＡＬＡと鉄のモル比＝１：０．５）の投与から４時間後にＸ線を照射する群に分けた。Ｘ線を、Faxitron CP-160型Ｘ線照射装置（アクロバイオ株式会社）を用いて、１Ｇｙ／分の強度で１日当たり２分間、７日間連続で照射した。B16-luc細胞の接種から２日後、４日後、６日後、９日後に１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを各群の担がんマウスに投与し、上記IVIS Imaging SystemでB16-luc細胞が発するルシフェラーゼ蛍光を測定した。がん組織におけるルミネッセンスの測定結果を図７－Ａに、動態観察の結果を図７－Ｂに示す。
ルシフェラーゼ発現マウスメラノーマ細胞であるB16-luc細胞１×１０４個をBALB/c nu/nuマウス（６週齢雌）の脳に接種し、担がんマウスを作製した。B16-luc細胞の接種から２日後、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを担がんマウスに投与し、IVIS Imaging System（住商ファーマインターナショナル株式会社）でB16-luc細胞が発するルシフェラーゼ蛍光を定量し、ルシフェラーゼ蛍光の平均が均等になるように、Ｘ線を照射するのみの群、２００ｍｇ／ｋｇの５－ＡＬＡの投与から４時間後にＸ線を照射する群、２００ｍｇ／ｋｇの５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄（５－ＡＬＡと鉄のモル比＝１：０．５）の投与から４時間後にＸ線を照射する群に分けた。Ｘ線を、Faxitron CP-160型Ｘ線照射装置（アクロバイオ株式会社）を用いて、１Ｇｙ／分の強度で１日当たり２分間、７日間連続で照射した。B16-luc細胞の接種から２日後、４日後、６日後、９日後に１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを各群の担がんマウスに投与し、上記IVIS Imaging SystemでB16-luc細胞が発するルシフェラーゼ蛍光を測定した。がん組織におけるルミネッセンスの測定結果を図７－Ａに、動態観察の結果を図７－Ｂに示す。
【0043】
Ｘ線を照射するのみの群の担がんマウスの腫瘍は９日間増殖し続けた。５－ＡＬＡとクエン酸第一鉄の投与から４時間後にＸ線を照射した群の担がんマウスの腫瘍の分裂能はB16-luc細胞の接種から５日後から、５－ＡＬＡの投与から４時間後にＸ線を照射する群の担がんマウスの腫瘍の分裂能はB16-luc細胞の接種から７日後から失われていた。
【0044】
以上の結果をまとめると次のとおりである。
（１）５－ＡＬＡと鉄化合物の投与によりがん細胞に蓄積されるＰｐＩＸの量は、５－ＡＬＡの投与によりがん細胞に蓄積されるＰｐＩＸの量より少なくなるが、５－ＡＬＡと鉄化合物の投与によりがん細胞に蓄積される鉄の量は、５－ＡＬＡの投与によりがん細胞に蓄積される鉄の量より多くなる。
（２）放射線照射により、細胞に蓄積されたＰｐＩＸと鉄から活性酸素及びフリーラジカルが発生する。
（３）ＰｐＩＸと鉄は、正常細胞よりもがん細胞等の病変部の細胞に選択的に蓄積される。
（４）５－ＡＬＡと鉄化合物を投与してから放射線を照射する放射線治療の効果は、５－ＡＬＡを投与してから放射線を照射する放射線治療の効果と同等以上である。
（１）５－ＡＬＡと鉄化合物の投与によりがん細胞に蓄積されるＰｐＩＸの量は、５－ＡＬＡの投与によりがん細胞に蓄積されるＰｐＩＸの量より少なくなるが、５－ＡＬＡと鉄化合物の投与によりがん細胞に蓄積される鉄の量は、５－ＡＬＡの投与によりがん細胞に蓄積される鉄の量より多くなる。
（２）放射線照射により、細胞に蓄積されたＰｐＩＸと鉄から活性酸素及びフリーラジカルが発生する。
（３）ＰｐＩＸと鉄は、正常細胞よりもがん細胞等の病変部の細胞に選択的に蓄積される。
（４）５－ＡＬＡと鉄化合物を投与してから放射線を照射する放射線治療の効果は、５－ＡＬＡを投与してから放射線を照射する放射線治療の効果と同等以上である。
【産業上の利用可能性】
【0045】
本発明の放射線治療用増感剤は、放射線照射により、がん細胞等の悪性新生物、がん前駆細胞、ウイルスに感染した細胞、細菌に感染した細胞等の病変部における細胞を選択的に損傷又は死滅させる放射線治療に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-A】
【図5-B】
【図6】
【図7-A】
【図7-B】
