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特許7013015標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物、およびその利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-21
(45)【発行日】2022-02-15
(54)【発明の名称】標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物、およびその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220207BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220207BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220207BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220207BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220207BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20220207BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20220207BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220207BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220207BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220207BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220207BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220207BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N1/15 ZNA
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A01K67/027
C12N9/16 Z
C07K19/00
A61K48/00
A61P3/10
A61P25/00
A61P35/00
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2018041322
(22)【出願日】2018-03-07
(65)【公開番号】P2019154244
(43)【公開日】2019-09-19
【審査請求日】2020-09-10
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、革新的がん医療実用化研究事業に伴う「癌関連遺伝子の発現を多重制御するエピゲノム編集ベクターの開発と応用」委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】山本 卓
(72)【発明者】
【氏名】佐久間 哲史
(72)【発明者】
【氏名】國井 厚志
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１８／００５７８１０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２３３７６２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】医学のあゆみ，2015年，vol.254, no.8, p.527-533
【文献】Nature，2015年，vol.517, p.583-588
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（Ａ）標的遺伝子に、第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｂ）ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｃ）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｄ）上記第１のエフェクタータンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含み、
上記第１のエフェクタータンパク質が、転写活性化因子であり、
上記第１のエフェクタータンパク質が、抗体を備え、当該抗体が、ｓｃＦｖであり、
上記タグとなるペプチドが、当該抗体と結合するための、抗原を４個以上備える、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【請求項2】
（Ａ’）標的遺伝子に第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡ、（Ｂ’）ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質、
（Ｃ’）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体、および
（Ｄ’）複数の上記第１のエフェクタータンパク質、を含み、
上記第１のエフェクタータンパク質が、転写活性化因子であり、
上記第１のエフェクタータンパク質が、抗体を備え、当該抗体が、ｓｃＦｖであり、
上記タグとなるペプチドが、当該抗体と結合するための、抗原を４個以上備える、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【請求項3】
上記ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質が、第２のエフェクタータンパク質と融合している、請求項１または２に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【請求項4】
上記ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質がｄＣａｓ９である、請求項１～３のいずれか１項に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【請求項5】
上記ｄＣａｓ９が、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項４に記載の標的遺伝子の発現を増強するための組成物：（ａ１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ａ２）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｃ）の融合体、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ａ３）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｃ）の融合体、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項6】
上記ガイドＲＮＡの第２の領域が、ステムループ構造を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【請求項7】
上記ガイドＲＮＡの第２の領域が、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項６に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物：（ｂ１）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ２）配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｂ３）配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項8】
上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質である、請求項１～７のいずれか１項に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【請求項9】
上記ＭＳ２コートタンパク質が、下記（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる、請求項８に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物：（ｃ１）配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ２）配列番号３で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｃ３）配列番号３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項10】
上記タグとなるペプチドが備える抗原または抗体同士の間にリンカーを有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【請求項11】
上記リンカーが、５～６０個のアミノ酸残基である、請求項１０に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【請求項12】
上記第２のエフェクタータンパク質がＶＰ６４である、請求項３に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【請求項13】
（Ａ）標的遺伝子に、第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｂ）ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｃ）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｄ）上記第１のエフェクタータンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備え、
上記第１のエフェクタータンパク質が、転写活性化因子であり、
上記第１のエフェクタータンパク質が、抗体を備え、当該抗体が、ｓｃＦｖであり、
上記タグとなるペプチドが、当該抗体と結合するための、抗原を４個以上備える、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するためのキット。
【請求項14】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物、請求項１３に記載のキットが備える前記（Ａ）～（Ｄ）に記載のポリヌクレオチド、または、請求項１３に記載のキットが備える前記（Ａ）～（Ｄ）に記載の発現ベクターを、インビトロで細胞へ導入する工程を含む、標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した細胞の製造方法。
【請求項15】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物、請求項１３に記載のキットが備える前記（Ａ）～（Ｄ）に記載のポリヌクレオチド、または、請求項１３に記載のキットが備える前記（Ａ）～（Ｄ）に記載の発現ベクターを、哺乳動物（ただしヒトを除く）へ導入する工程を含む、標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した哺乳動物（ただしヒトを除く）の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物およびキット、ならびに標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した細胞または哺乳動物の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積させて、標的遺伝子の活性等を改変／修飾する技術が知られている。
【0003】
例えば、遺伝子発現活性化技術の分野では、ゲノム編集に利用されるＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を不活性化させたｄＣａｓ９タンパク質に転写活性化因子を融合させて、部位特異的に転写活性化因子を作用させることで、標的遺伝子の発現を活性化するシステムが開発されている。
【0004】
上述した第１世代の人工遺伝子発現増強システムでは、１つの標的箇所に対して一分子の転写活性化因子のみしか作用されず、十分な遺伝子発現増強効果がないことが多いという問題があった。これに対して、１つの標的箇所に複数の転写活性化因子を作用させられる第２世代の人工遺伝子発現増強システムが開発されている（図１の（ａ）を参照）。
【0005】
例えば、非特許文献１はＳＡＭ（Synergistic Activation Mediator）システム（以下、単にＳＡＭと称する）を報告している。ＳＡＭでは、ｓｇＲＮＡのループ部分に、ＭＳ２コートタンパク質が認識するモチーフを付加することで、ＭＳ２コートタンパク質と融合した転写活性化因子を標的箇所に呼び込む。その結果、標的箇所に呼び込まれた転写活性化因子と、ｄＣａｓ９に直接融合させた転写活性化因子との相乗効果により、第１世代の人工遺伝子発現増強システムと比較して遺伝子発現増強効果が高くなっている（図１の（ｂ）を参照）。
【0006】
非特許文献２は、ＳｕｎＴａｇシステム（以下、単にＳｕｎＴａｇと称する）を報告している。ＳｕｎＴａｇでは、ｄＣａｓ９にＳｕｎＴａｇと称される抗原を複数融合することで、当該抗原を認識する抗体ｓｃＦｖと融合した転写活性化因子を標的箇所に集積させる。その結果、第１世代の人工遺伝子発現増強システムと比較して遺伝子発現増強効果が高くなっている。
【0007】
非特許文献３は、ＳＡＭとＳｕｎＴａｇとを比較すると、ＳＡＭが比較的優位であるものの、顕著な差は存在しなかったことを報告している。また、ＳＡＭとＳｕｎＴａｇとを組み合わせても、それぞれ単独の場合の効果以上のより強い遺伝子発現増強効果はみられていない。
【0008】
上述した遺伝子発現活性化技術の他にも、転写活性化因子の代わりに他のエフェクタータンパク質を用いることにより、目的に応じて、標的遺伝子の発現等を改変／修飾する技術が開発されている。
【0009】
例えば、非特許文献４は、エフェクタータンパク質としてＧＦＰを用いて、特定の染色体領域を効率的にラベリングするシステムを報告している。
【0010】
非特許文献５は、エフェクタータンパク質としてＴＥＴ１を用いて、ＤＮＡの脱メチル化の効率を高めるシステムを報告している。
【0011】
非特許文献６は、エフェクタータンパク質としてデアミナーゼを用いて、塩基置換の効率を高めるシステムを報告している。
【0012】
非特許文献７は、エフェクタータンパク質としてｐ３００ｃｄを用いて、ヒストンのアセチル化の効率を高めるシステムを報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0013】
【文献】Konermann S et al. (2015) "Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex", Nature, 517, pp.583-588
【文献】Tanenbaum ME et al. (2014) "A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging", Cell, 159, pp.635-646
【文献】Chavez A et al. (2016) "Comparison of Cas9 activators in multiple species", Nat Methods, 13, pp.563-567
【文献】Fu Y et al. (2016) "CRISPR-dCas9 and sgRNA scaffolds enable dual-colour live imaging of satellite sequences and repeat-enriched individual loci", Nat Commun, 7, pp.11707
【文献】Morita S et al. (2016) "Targeted DNA demethylation in vivo using dCas9-peptide repeat and scFv-TET1 catalytic domain fusions", Nat Biotechnol,34, pp.1060-1065
【文献】Hess GT et al. (2016) "Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells", Nat Methods, 13, pp.1036-1042
【文献】Liu P et al. (2018) "CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency", Cell Stem Cell, in press
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
しかしながら、従来のシステムでは、標的遺伝子へのエフェクタータンパク質の集積が十分ではなく、さらなる次世代システムの開発が望まれている。
【0015】
本発明の一態様は、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する効果が高い標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0016】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質に、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドを融合した融合体を用いることにより、第２世代のシステムよりも標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する効果の高い第３世代のシステムを構築することに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の一実施形態は以下の構成を包含する。
【0017】
＜１＞（Ａ）標的遺伝子に、第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｃ）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｄ）上記第１のエフェクタータンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｃ）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｄ）上記第１のエフェクタータンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0018】
＜２＞（Ａ’）標的遺伝子に第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡ、
（Ｂ’）Ｃａｓタンパク質、
（Ｃ’）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体、および
（Ｄ’）複数の上記第１のエフェクタータンパク質、
を含む、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
（Ｂ’）Ｃａｓタンパク質、
（Ｃ’）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体、および
（Ｄ’）複数の上記第１のエフェクタータンパク質、
を含む、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0019】
＜３＞上記Ｃａｓタンパク質が、第２のエフェクタータンパク質と融合している、＜１＞または＜２＞に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0020】
＜４＞上記Ｃａｓタンパク質がｄＣａｓ９である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0021】
＜５＞上記ｄＣａｓ９が、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる、＜４＞に記載の標的遺伝子の発現を増強するための組成物：
（ａ１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ａ２）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｃ）の融合体、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ａ３）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｃ）の融合体、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド。
（ａ１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ａ２）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｃ）の融合体、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ａ３）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｃ）の融合体、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【0022】
＜６＞上記ガイドＲＮＡの第２の領域が、ステムループ構造を有する、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0023】
＜７＞上記ガイドＲＮＡの第２の領域が、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる、＜６＞に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物：
（ｂ１）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ２）配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｂ３）配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
（ｂ１）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ２）配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｂ３）配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【0024】
＜８＞上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質が、ＭＳ２コートタンパク質である、＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0025】
＜９＞上記ＭＳ２コートタンパク質が、下記（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる、＜８＞に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物：
（ｃ１）配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ２）配列番号３で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｃ３）配列番号３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
（ｃ１）配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ２）配列番号３で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｃ３）配列番号３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【0026】
＜１０＞上記第１のエフェクタータンパク質が、抗原または抗体を備え、
上記タグとなるペプチドが、当該抗原または抗体と結合するための、抗体または抗原を備える、＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
上記タグとなるペプチドが、当該抗原または抗体と結合するための、抗体または抗原を備える、＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0027】
＜１１＞上記タグとなるペプチドが、４～２４個の抗原を備える、＜１０＞に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0028】
＜１２＞上記第１のエフェクタータンパク質が、抗体を備え、
当該抗体が、ｓｃＦｖである、＜１０＞に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
当該抗体が、ｓｃＦｖである、＜１０＞に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0029】
＜１３＞上記タグとなるペプチドが備える抗原または抗体同士の間にリンカーを有する、＜１０＞に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0030】
＜１４＞上記リンカーが、５～６０個のアミノ酸残基である、＜１３＞に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0031】
＜１５＞上記第２のエフェクタータンパク質がＶＰ６４である、＜３＞に記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0032】
＜１６＞上記第１のエフェクタータンパク質が、転写活性化因子である、＜１＞～＜１５＞のいずれかに記載の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物。
【0033】
＜１７＞（Ａ）標的遺伝子に、第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｃ）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｄ）上記第１のエフェクタータンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備える、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するためのキット。
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
（Ｃ）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および
（Ｄ）上記第１のエフェクタータンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備える、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するためのキット。
【0034】
＜１８＞＜１＞～＜１６＞のいずれかに記載の組成物、＜１７＞に記載のキットが備えるポリヌクレオチド、または、＜１７＞に記載のキットが備える発現ベクターを、インビトロで細胞へ導入する工程を含む、標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した細胞の製造方法。
【0035】
＜１９＞＜１＞～＜１６＞のいずれかに記載の組成物、＜１７＞に記載のキットが備えるポリヌクレオチド、または、＜１７＞に記載のキットが備える発現ベクターを、哺乳動物（ただしヒトを除く）へ導入する工程を含む、標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した哺乳動物（ただしヒトを除く）の製造方法。
【発明の効果】
【0036】
本発明の一態様によれば、標的遺伝子の発現を増強する効果が高い標的遺伝子の発現を増強するための組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】（ａ）は、ｄＣａｓ９にＶＰ６４を融合した、第１世代の人工遺伝子発現増強システムを模式的に示す図である。（ｂ）は、ｄＣａｓ９にＶＰ６４を直接融合し、ｓｇＲＮＡにＭＳ２コートタンパク質が結合するステムループを備え、ＭＳ２コートタンパク質に転写活性化因子を融合した、第２世代の人工遺伝子発現増強システムを模式的に示す図である。（ｃ）は、ｄＣａｓ９にＶＰ６４を直接融合し、ｓｇＲＮＡにＭＳ２が結合するステムループを備え、ＭＳ２コートタンパク質に２２ｓＴａｇを融合し、２２ｓＴａｇに結合する、ｓｃＦｖに第１の転写活性化因子を融合した、本発明の一実施形態に係る第３世代の人工遺伝子発現増強システムを模式的に示す図である。
【図2】（ａ）は、実施例において用いたＭＳ２－４×２２ｓＴａｇの構成を模式的に示す図である。（ｂ）は、実施例において用いたＭＳ２－８×２２ｓＴａｇの構成を模式的に示す図である。（ｃ）は、実施例において用いたＭＳ２－１６×２２ｓＴａｇの構成を模式的に示す図である。（ｄ）は、実施例において用いたＭＳ２－２４×２２ｓＴａｇの構成を模式的に示す図である。
【図3】（ａ）は、実施例において用いたｓｇＲＮＡ２．０およびｄＣａｓ９－ＶＰ６４オールインワン発現ベクターの構成を模式的に示す図である。（ｂ）は、実施例において用いたＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８、１６、２４）の発現ベクターの構成を模式的に示す図である。（ｃ）は、実施例において用いたｓｃＦｖ－Ｅｆｆｅｃｔｏｒの発現ベクターの構成を模式的に示す図である。
【図4】実施例において行った、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８、１６、２４）の発現ベクターをＮｏｔＩで処理したアガロースゲル電気泳動の結果である。
【図5】（ａ）は、実施例において用いた５つのｓｇＲＮＡの、ＣＤＨ１遺伝子のプロモーターに対応する領域を模式的に示す図である。（ｂ）は、実施例において用いたルシフェラーゼレポーターベクターの構成を模式的に示す図である。
【図6】実施例において行った、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ＭＳ２－４×２２ｓＴａｇ、およびｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１の３つのベクターの存在下／非存在下におけるアッセイの結果を示す図である。
【図7】実施例において行った、５つの各ｓｇＲＮＡ、および５つの全ｓｇＲＮＡを用いたときの、第１世代、第２世代、および第３世代の人工遺伝子発現増強システムにおけるアッセイの結果を示す図である。
【図8】実施例において行った、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４と、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８、１６、２４）と、ｐ６５－ＨＳＦ１またはＶＰＲとを用いた、構築したシステムの発現ベクターの全量が１００ｎｇであるときの、ＣＤＨ１遺伝子を標的としたアッセイの結果を示す図である。
【図9】実施例において行った、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４と、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）と、ｐ６５－ＨＳＦ１またはＶＰＲとを用いた、ＣＤＨ１遺伝子に対するｍＲＮＡ発現誘導の評価の結果を示す図である。
【図10】左列は、実施例において行った、免疫染色によるＨＣＴ１１６細胞におけるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの検出の結果を示す図である。中列および右列は、実施例において行った、免疫染色によるＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞におけるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの検出の結果を示す図である。
【図11】実施例において行った、免疫染色によるＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞におけるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの検出の結果を示す図である。
【図12】実施例において行った、ウエスタンブロッティングによるＨＣＴ１１６細胞およびＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞におけるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの検出の結果を示す図である。
【図14】実施例において行った、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４と、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８、１６、２４）と、ｐ６５－ＨＳＦ１またはＶＰＲとを用いた、構築したシステムの発現ベクターの全量が５０ｎｇおよび１００ｎｇであるときの、ＣＤＨ１遺伝子を標的としたアッセイの結果を示す図である。
【図15】実施例において行った、ウエスタンブロッティングによるＨＣＴ１１６細胞およびＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞におけるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの検出の結果を示す図である。
【図16】実施例において行った、免疫染色によるＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞におけるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの検出の結果を示す図である。
【図17】実施例において行った、免疫染色によるＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞におけるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの検出の結果を示す図である。
【図18】（ａ）は、実施例において用いた２つのｓｇＲＮＡの、ＲＡＮＫＬ遺伝子のプロモーターに対応する領域を模式的に示す図である。（ｂ）は、実施例において用いたルシフェラーゼレポーターベクターの構成を模式的に示す図である。
【図19】実施例において行った、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４と、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８、１６、２４）と、ｐ６５－ＨＳＦ１またはＶＰＲとを用いた、構築したシステムの発現ベクターの全量が１００ｎｇであるときの、ＲＡＮＫＬ遺伝子を標的としたアッセイの結果を示す図である。
【図20】実施例において行った、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４と、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）と、ｐ６５－ＨＳＦ１またはＶＰＲとを用いたＲＡＮＫＬ遺伝子に対するｍＲＮＡ発現誘導の評価の結果を示す図である。
【図22】実施例において行った、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４と、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８、１６、２４）と、ｐ６５－ＨＳＦ１またはＶＰＲとを用いた、構築したシステムの発現ベクターの全量が５０ｎｇおよび１００ｎｇであるときの、ＲＡＮＫＬ遺伝子を標的としたアッセイの結果を示す図である。
【図23】実施例において行った、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４またはｄＣａｓ９－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）と、ＭＳ２－ＶＰ６４、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１、またはＭＳ２－ＶＰＲと、ｓｃＦｖ－ＶＰ６４、ｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１、またはｓｃＦｖ－ＶＰＲとを用いた、ＲＡＮＫＬ遺伝子を標的としたアッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
以下、本発明の実施の形態の一例について詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されない。
【0039】
本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【0040】
本明細書において、用語「遺伝子」とはヌクレオチドの重合体を意図し、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と同義で使用される。遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）でも存在しうるし、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態でも存在しうる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。遺伝子は化学的に合成してもよい。また、本明細書において「ポリヌクレオチド」と記載した場合、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。
【0041】
本明細書において、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と同義で使用される。
【0042】
本明細書中、塩基およびアミノ酸の表記は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表
記または３文字表記を適宜使用する。
記または３文字表記を適宜使用する。
【0043】
〔１．標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物〕
本発明の一実施の形態に係る標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物（以下、適宜「本発明の一施形態に係る組成物」と称する。）は、（Ａ）標的遺伝子に、第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｃ）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および（Ｄ）上記第１のエフェクタータンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む。
本発明の一実施の形態に係る標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物（以下、適宜「本発明の一施形態に係る組成物」と称する。）は、（Ａ）標的遺伝子に、第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｃ）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および（Ｄ）上記第１のエフェクタータンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む。
【0044】
本明細書において、本発明の一実施形態に係る組成物を用いて人工的に標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積させるシステムを、第３世代のシステムと称することもある。また、本明細書において、本発明の一実施形態に係る組成物を用いて人工的に標的遺伝子の発現を増強させるシステムを、第３世代の人工遺伝子発現増強システムと称することもある。
【0045】
本発明の一実施形態に係る第３世代のシステムは、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡとも称する）、Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体、および第１のエフェクタータンパク質が協同して機能することにより、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積させる効果を奏する。上記の標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積させる機構をより具体的に説明すると、以下の通りである。
１．ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質とが結合して複合体を形成する。
２．上記複合体が、ガイドＲＮＡの第１の領域で、標的遺伝子に結合する。
３．ガイドＲＮＡの第２の領域に、ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体の、当該ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質が結合する。
４．上記融合体のタグとなるペプチドに、第１のエフェクタータンパク質が結合する。標的遺伝子に第１のエフェクタータンパク質が集積される。
１．ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質とが結合して複合体を形成する。
２．上記複合体が、ガイドＲＮＡの第１の領域で、標的遺伝子に結合する。
３．ガイドＲＮＡの第２の領域に、ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体の、当該ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質が結合する。
４．上記融合体のタグとなるペプチドに、第１のエフェクタータンパク質が結合する。標的遺伝子に第１のエフェクタータンパク質が集積される。
【0046】
ガイドＲＮＡが結合する「標的遺伝子」は、標的とする遺伝子のみならず、当該遺伝子の発現を制御する配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列）も含む。
【0047】
ガイドＲＮＡは、標的遺伝子に特異的に結合する第１の領域と、特定のタンパク質が結合する第２の領域とを有する。ガイドＲＮＡは、第１の領域が、結合させたい標的遺伝子の一部の配列に相補的な配列を有し、かつ、第２の領域が、特定のタンパク質が結合する配列を有するように設計される。
【0048】
本発明の一実施形態に係る組成物は、上記ガイドＲＮＡの第２の領域が、ステムループ構造を有する。これにより、当該ステムループ構造を認識するタンパク質がガイドＲＮＡの第２領域に結合することができる。ガイドＲＮＡの第２の領域は、ステムループ構造を少なくとも１つ有していればよいが、複数有していることがより好ましい。ガイドＲＮＡの第２領域が複数のステムループ構造を有していることにより、当該ステムループ構造に結合するタンパク質の数を増やすことができる。これにより、標的遺伝子により多くのエフェクタータンパク質を集積させることができる。
【0049】
ガイドＲＮＡは、１種類であっても複数種類を組み合わせてもよい。本発明の一実施形態に係る第３世代のシステムでは、１種類のガイドＲＮＡであっても、第１世代および第２世代のシステムと比較して、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積させることができる。複数種類のガイドＲＮＡを用いる場合、１種類のガイドＲＮＡを用いる場合と比較して、標的遺伝子により多くのエフェクタータンパク質を集積させることができることから、ガイドＲＮＡは複数種類であることがより好ましい。
【0050】
Ｃａｓタンパク質とは、ゲノム編集技術に用いられるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの構成要素であるタンパク質であり、ガイドＲＮＡと結合して複合体を形成する。当該複合体は、ガイドＲＮＡの第１の領域で標的遺伝子に結合する。
【0051】
Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質であっても、ヌクレアーゼ活性型のＣａｓタンパク質であってもよく、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質であることが好ましい。ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質とは、ガイドＲＮＡとの結合能は維持しつつ、かつ、ヌクレアーゼ活性を不活性化してＤＮＡ切断が起こらないように改変させたＣａｓタンパク質である。
【0052】
Ｃａｓタンパク質としては、例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ９等が挙げられる。また、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質としては、例えば、上記Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ不活性型（すなわち、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓ１２ａ、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓ９（以下、適宜「ｄＣａｓ９」と称する。））等が挙げられる。Ｃａｓタンパク質がヌクレアーゼ活性型のＣａｓタンパク質である場合、ガイドＲＮＡの長さを適宜調節することにより、ヌクレアーゼ不活性型のＣａｓタンパク質と同様の機能を有するＣａｓタンパク質とすることができる。
【0053】
本発明の一実施形態に係る組成物は、Ｃａｓタンパク質がｄＣａｓ９であることが好ましい。
【0054】
本発明の一実施形態に係る組成物は、上記ｄＣａｓタンパク質が、第２のエフェクタータンパク質と融合している。これにより、第１のエフェクタータンパク質に加えて、第２のエフェクタータンパク質も標的遺伝子に集積することができる。
【0055】
上記第２のエフェクタータンパク質は、目的の機能を有するものであれば特に限定されないが、分子量が１～６０ｋＤａであることが好ましく、５～１０ｋＤａであることがより好ましい。
【0056】
本発明の一実施形態に係る組成物は、第２のエフェクタータンパク質が、ＶＰ６４であることが好ましい。ＶＰ６４は分子量が５．５ｋＤａと小さいため、Ｃａｓタンパク質と融合体を形成したときに当該融合体の分子サイズの巨大化を抑えつつ、標的遺伝子に第１のエフェクタータンパク質に加えて標的遺伝子にＶＰ６４を集積することができる。ＶＰ６４は転写活性化因子であるため、より標的遺伝子の発現を増強させることができる。
【0057】
本発明の一実施形態に係る組成物は、上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質は、ガイドＲＮＡの第２領域に結合することができれば特に限定されないが、ＭＳ２コートタンパク質であることが好ましい。ＭＳ２コートタンパク質は、ＲＮＡの第２の領域が有するステムループ構造を認識するため、ＲＮＡの第２領域に結合することができる。
【0058】
第１のエフェクタータンパク質は、目的の機能を有するものであれば特に限定されないが、分子量が１～６０ｋＤａであることが好ましく、３２～５６ｋＤａであることがより好ましい。
【0059】
第１のエフェクタータンパク質と第２のエフェクタータンパク質とは、同様の機能を有するものであることが好ましいが、異なる機能を有するものであってもよい。
【0060】
第１のエフェクタータンパク質と第２のエフェクタータンパク質は、標的遺伝子に集積し、当該標的遺伝子の発現等を改変／修飾するタンパク質であれば、特に限定されない。
上記第１のエフェクタータンパク質としては、例えば、転写活性化因子、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ＤＮＡの脱メチル化因子（例えば、ＴＥＴ１）、ヒストンのアセチル化因子（例えば、ｐ３００ｃｄ）、デアミナーゼ等が挙げられる。
上記第１のエフェクタータンパク質としては、例えば、転写活性化因子、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ＤＮＡの脱メチル化因子（例えば、ＴＥＴ１）、ヒストンのアセチル化因子（例えば、ｐ３００ｃｄ）、デアミナーゼ等が挙げられる。
【0061】
エフェクタータンパク質が転写活性化因子である場合、当該エフェクタータンパク質が集積した標的遺伝子の発現が増強される。したがって、本発明の一実施形態に係る組成物は、標的遺伝子の発現を増強するための組成物であり得る。また、エフェクタータンパク質が蛍光タンパク質である場合、当該エフェクタータンパク質が集積した標的遺伝子の領域がラベリングされる。したがって、本発明の一実施形態に係る組成物は、標的遺伝子の領域をラベリングするための組成物であり得る。また、エフェクタータンパク質がＤＮＡの脱メチル化因子である場合、当該エフェクタータンパク質が集積した標的遺伝子の脱メチル化の効率が高められる。したがって、本発明の一実施形態に係る組成物は、標的遺伝子の脱メチル化を促進するための組成物であり得る。また、エフェクタータンパク質がヒストンのアセチル化因子である場合、当該エフェクタータンパク質が集積した標的遺伝子周辺のヒストンのアセチル化の効率が高められる。したがって、本発明の一実施形態に係る組成物は、標的遺伝子周辺のヒストンのアセチル化を促進するための組成物であり得る。また、エフェクタータンパク質がデアミナーゼである場合、当該エフェクタータンパク質が集積した標的遺伝子周辺の塩基置換の効率が高められる。したがって、本発明の一実施の形態に係る組成物は、標的遺伝子周辺の塩基置換を促進するための組成物であり得る。
【0062】
本発明の一実施形態に係る組成物は、上記第１のエフェクタータンパク質が、転写活性化因子であることが好ましく、ｐ６５－ＨＳＦ１、ＶＰＲ、およびＶＰ６４（いずれも、転写活性因子）からなる群より選択される少なくとも一つであることがより好ましい。
【0063】
本発明の一実施形態に係る組成物は、上記第１のエフェクタータンパク質が、抗原または抗体を備え、上記タグとなるペプチドが、当該抗原または抗体と結合するための、抗体または抗原を備える。好ましくは、上記第１のエフェクタータンパク質が、抗原を備え、上記タグとなるペプチドが、当該抗原と結合するための、抗体を備える。これにより、第１のエフェクタータンパク質がタグとなるペプチドと結合力を有さない場合であっても、第１のエフェクタータンパク質が備える抗原または抗体と、タグとなるペプチドが備える抗体または抗原との結合により、第１のエフェクタータンパク質をタグとなるペプチドに結合することができる。その結果、標的遺伝子に第１のエフェクタータンパク質を集積することができる。
【0064】
上記タグとなるペプチドが抗原を備える場合、当該抗原は、ＧＣＮ４であることが好ましい。ＧＣＮ４のアミノ酸配列がタンデムに並んだアミノ酸配列を有するペプチドをＳｕｎＴａｇと称することもある。
【0065】
本発明の一実施形態に係る組成物は、上記タグとなるペプチドが、４～２４個の抗原を備えることが好ましく、８個の抗原を備えることがより好ましい。これにより、当該抗原に結合する抗体を備える第１のエフェクタータンパク質を、上記個数結合させることができる。
【0066】
本発明の一実施形態に係る組成物は、上記タグとなるペプチドが備える抗原または抗体同士の間にリンカーを有することが好ましい。当該リンカーは、５～６０個のアミノ酸残基であることが好ましく、２２～５１個のアミノ酸残基であることがより好ましく、２２個のアミノ酸残基であることが好ましい。また、上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、抗原または抗体との間にリンカーがあってもよい。上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、タグとなるペプチドとの融合体が当該リンカーを有することにより、結合する第１のエフェクタータンパク質を最適な間隔で抗原に結合させることができる。
【0067】
本発明の一実施形態に係る組成物は、上記第１のエフェクタータンパク質が、抗体を備え、当該抗体が、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）であることが好ましい。
【0068】
〔１－１ ポリヌクレオチド〕
〔ｄＣａｓ９をコードする配列〕
本発明の一実施形態に係る組成物は、好ましくは、上記ｄＣａｓ９が、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる：
（ａ１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ａ２）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｃ）の融合体、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ａ３）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｃ）の融合体、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド。
〔ｄＣａｓ９をコードする配列〕
本発明の一実施形態に係る組成物は、好ましくは、上記ｄＣａｓ９が、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる：
（ａ１）配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ａ２）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｃ）の融合体、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ａ３）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｃ）の融合体、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【0069】
（ａ１）は、
１．野生型のＣａｓ９をコードする塩基配列を人工的に改変することにより、ガイドＲＮＡとの結合能は維持し、かつ、ヌクレアーゼ活性を不活性化してＤＮＡ切断が起こらないようにしたポリヌクレオチド（配列番号１）である。
１．野生型のＣａｓ９をコードする塩基配列を人工的に改変することにより、ガイドＲＮＡとの結合能は維持し、かつ、ヌクレアーゼ活性を不活性化してＤＮＡ切断が起こらないようにしたポリヌクレオチド（配列番号１）である。
【0070】
（ａ２）は、
２．（ａ１）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ａ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。
以下、２および３のそれぞれを説明する。
２．（ａ１）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ａ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。
以下、２および３のそれぞれを説明する。
【0071】
（２について）
塩基配列の配列同一性は、塩基配列全体（またはｄＣａｓ９の機能に必要な部分をコードしている領域）において、少なくともは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）でありうる。
塩基配列の配列同一性は、塩基配列全体（またはｄＣａｓ９の機能に必要な部分をコードしている領域）において、少なくともは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）でありうる。
【0072】
塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴＮなどのプログラムを利用して、決定することができる（［Altschul SF (1990) "Basic local alignment search tool", Journal of Molecular Biology, Vol.215 (Issue 3), pp.403-410］を参照）。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合のパラメータの一例としては、score=100、wordlength=12の設定が挙げられる。ＢＬＡＳＴＮによる解析を行うための具体的な手法は、当業者に知られている。比較対象の塩基配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（ギャップなど）を許容してもよい。
【0073】
（３について）
「（ａ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有する」か否かは、（ａ２）の配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドから発現したタンパク質（ｄＣａｓ９）が、（Ａ）のガイドＲＮＡ、（Ｃ）の融合体、および（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有するか否かを試験することにより判定できる。そのような試験は、当分野における通常の方法を用いて行うことができる。
「（ａ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有する」か否かは、（ａ２）の配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドから発現したタンパク質（ｄＣａｓ９）が、（Ａ）のガイドＲＮＡ、（Ｃ）の融合体、および（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有するか否かを試験することにより判定できる。そのような試験は、当分野における通常の方法を用いて行うことができる。
【0074】
ここで、上述の遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性とは、上述したヌクレオチドを導入した細胞における標的遺伝子に集積したエフェクタータンパク質量が、導入していない細胞における該エフェクタータンパク質量、好ましくは第１世代および第２世代のシステムを適用した細胞における該エフェクタータンパク質量よりも上回っていることを意図する。
【0075】
本発明の一実施形態に係る第３世代のシステムは、第３世代の人工遺伝子発現増強システムであることが好ましい。本発明の一実施形態に係る第３世代の人工遺伝子発現増強システムは、標的遺伝子の発現を増強することが好ましい。標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現量を確認する方法としては、例えば、実施例に記載されているｑＰＣＲが挙げられる。また、標的遺伝子の転写活性化の結果、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現量も増強されるため、当該タンパク質の発現量を確認してもよい。タンパク質の発現量を確認する方法としては、例えば、実施例に記載されているレポーターアッセイ、免疫染色、ウエスタンブロッティングが挙げられる。
【0076】
（ａ３）は、
４．（ａ１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ａ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。以下、４について説明する。５に関する説明は、上記の（３について）と同様であるため、省略する。
４．（ａ１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ａ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。以下、４について説明する。５に関する説明は、上記の（３について）と同様であるため、省略する。
【0077】
（４について）
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、２本のポリヌクレオチド鎖が、塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドを形成するが、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドは形成しない条件をいう。「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、換言すれば、配列同一性が高い核酸同士（例えば完全にマッチしたハイブリッド）の融解温度（Ｔｍ値）から１５℃低い温度、好ましくは１０℃低い温度、より好ましくは５℃低い温度までの温度範囲において、ハイブリダイズできる条件ともいえる。
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、２本のポリヌクレオチド鎖が、塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドを形成するが、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドは形成しない条件をいう。「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、換言すれば、配列同一性が高い核酸同士（例えば完全にマッチしたハイブリッド）の融解温度（Ｔｍ値）から１５℃低い温度、好ましくは１０℃低い温度、より好ましくは５℃低い温度までの温度範囲において、ハイブリダイズできる条件ともいえる。
【0078】
ストリンジェントな条件の一例を示すと、以下の通りである。まず、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液（ｐＨ７．２）中、６０～６８℃（好ましくは６５℃、より好ましくは６８℃）にて、１６～２４時間、２種類のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。その後、２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ７．２）中、６０～６８℃（好ましくは６５℃、より好ましくは６８℃）にて、１５分間の洗浄を２回行う。
【0079】
他の例としては、以下の方法が挙げられる。まず、２５％ホルムアミド（より厳しい条件では５０％ホルムアミド）、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃にて、一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することにより、２種類のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行う。次に、下記の条件のいずれかで洗浄を行う。
（通常の条件）１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを洗浄液として、３７℃程度で洗浄する。
（厳しい条件）０．５×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ洗浄液として、４２℃程度で洗浄する。
（さらに厳しい条件）０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを洗浄液として、６５℃程度で洗浄する。
（通常の条件）１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを洗浄液として、３７℃程度で洗浄する。
（厳しい条件）０．５×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ洗浄液として、４２℃程度で洗浄する。
（さらに厳しい条件）０．２×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳを洗浄液として、６５℃程度で洗浄する。
【0080】
このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。なお、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは、単なる例示に過ぎない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上述の要素、または他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することができる。このことは、例えば、［Joseph Sambrook & David W. Russell, "Molecular cloning: a laboratory manual 3rd Ed.", New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001］などに記載されている。
【0081】
以下、（ａ１）～（ａ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをまとめて（ａ）のポリヌクレオチドとも称する。
【0082】
〔ガイドＲＮＡの第２の領域をコードする配列〕
本発明の一実施形態に係る組成物は、好ましくは、上記ガイドＲＮＡの第２の領域が、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる：
（ｂ１）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ２）配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｂ３）配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
本発明の一実施形態に係る組成物は、好ましくは、上記ガイドＲＮＡの第２の領域が、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる：
（ｂ１）配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ２）配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｂ３）配列番号２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【0083】
（ｂ１）は、
１．例えば、ＭＳ２コートタンパク質が結合するステムループ構造を２つ備えるＲＮＡをコードするポリヌクレオチド（配列番号２）である。
１．例えば、ＭＳ２コートタンパク質が結合するステムループ構造を２つ備えるＲＮＡをコードするポリヌクレオチド（配列番号２）である。
【0084】
（ｂ２）は、
２．（ｂ１）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ｂ１）がコードするガイドＲＮＡの第２の領域と同等の機能を有するガイドＲＮＡの第２の領域をコードする。
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。２については（ａ２）と同様である。以下、３を説明する。
２．（ｂ１）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ｂ１）がコードするガイドＲＮＡの第２の領域と同等の機能を有するガイドＲＮＡの第２の領域をコードする。
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。２については（ａ２）と同様である。以下、３を説明する。
【0085】
（３について）
「（ｂ１）がコードするガイドＲＮＡの第２の領域と同等の機能を有する」か否かは、（ｂ２）の配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有するか否かを試験することにより判定できる。そのような試験は、当分野における通常の方法を用いて行うことができる。
「（ｂ１）がコードするガイドＲＮＡの第２の領域と同等の機能を有する」か否かは、（ｂ２）の配列番号２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドから転写したＲＮＡが、上記（Ｃ）の融合体に結合する活性を有するか否かを試験することにより判定できる。そのような試験は、当分野における通常の方法を用いて行うことができる。
【0086】
（ｂ３）は、
４．（ｂ１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ｂ１）がコードするガイドＲＮＡの第２の領域と同等の機能を有するガイドＲＮＡの第２の領域をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。４に関する説明は、（ａ３）の（４について）と同様であり、５に関する説明は、上記の（３について）と同様であるため、省略する。
４．（ｂ１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ｂ１）がコードするガイドＲＮＡの第２の領域と同等の機能を有するガイドＲＮＡの第２の領域をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。４に関する説明は、（ａ３）の（４について）と同様であり、５に関する説明は、上記の（３について）と同様であるため、省略する。
【0087】
以下、（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをまとめて（ｂ）のポリヌクレオチドとも称する。
【0088】
〔ＭＳ２コートタンパク質をコードする配列〕
本発明の一実施形態に係る組成物は、好ましくは、上記ＭＳ２コートタンパク質が、下記（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる：
（ｃ１）配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ２）配列番号３で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｃ３）配列番号３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
本発明の一実施形態に係る組成物は、好ましくは、上記ＭＳ２コートタンパク質が、下記（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる：
（ｃ１）配列番号３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｃ２）配列番号３で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｃ３）配列番号３で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【0089】
（ｃ１）は、
１．ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質の一例であるＭＳ２コートタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号３）である。
１．ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質の一例であるＭＳ２コートタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号３）である。
【0090】
（ｃ２）は、
２．（ｃ１）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ｃ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。２については（ａ２）と同様である。以下、３を説明する。
２．（ｃ１）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ｃ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。２については（ａ２）と同様である。以下、３を説明する。
【0091】
（３について）
「（ｃ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有する」か否かは、（ｃ２）の配列番号３で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有するか否かを試験することにより判定できる。そのような試験は、当分野における通常の方法を用いて行うことができる。
「（ｃ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有する」か否かは、（ｃ２）の配列番号３で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡの第２の領域に結合する活性を有するか否かを試験することにより判定できる。そのような試験は、当分野における通常の方法を用いて行うことができる。
【0092】
（ｃ３）は、
４．（ｃ１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ｃ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。４に関する説明は、（ａ３）の（４について）と同様であり、５に関する説明は、上記の（３について）と同様であるため、省略する。
４．（ｃ１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ｃ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。４に関する説明は、（ａ３）の（４について）と同様であり、５に関する説明は、上記の（３について）と同様であるため、省略する。
【0093】
以下、（ｃ１）～（ｃ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをまとめて（ｃ）のポリヌクレオチドとも称する。
【0094】
〔ＧＣＮ４をコードする配列〕
本発明の一実施形態に係る組成物は、好ましくは、上記ＧＣＮ４が、下記（ｄ１）～（ｄ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる：
（ｄ１）配列番号４～７のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｄ２）配列番号４～７のいずれかで示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したペプチドを含む上記（Ｃ）の融合体が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｂ）のＣａｓタンパク質、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｄ３）配列番号４～７のいずれかで示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したペプチドを含む上記（Ｃ）の融合体が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｂ）のＣａｓタンパク質、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド。
本発明の一実施形態に係る組成物は、好ましくは、上記ＧＣＮ４が、下記（ｄ１）～（ｄ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる：
（ｄ１）配列番号４～７のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｄ２）配列番号４～７のいずれかで示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したペプチドを含む上記（Ｃ）の融合体が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｂ）のＣａｓタンパク質、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｄ３）配列番号４～７のいずれかで示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したペプチドを含む上記（Ｃ）の融合体が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｂ）のＣａｓタンパク質、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【0095】
なお、配列番号４～７のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから翻訳されるタンパク質（ＧＣＮ４）は、全て同一のアミノ酸配列を有する。
【0096】
（ｄ１）は、
１．タグとなるペプチドに備えられた抗原の一例であるＧＣＮ４をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号４～７のいずれか）である。
１．タグとなるペプチドに備えられた抗原の一例であるＧＣＮ４をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号４～７のいずれか）である。
【0097】
（ｄ２）は、
２．（ｄ１）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ｄ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。２については（ａ２）と同様である。以下、３を説明する。
２．（ｄ１）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ｄ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。２については（ａ２）と同様である。以下、３を説明する。
【0098】
「（ｄ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有する」か否かは、（ｄ２）の配列番号４～７のいずれかで示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドから発現したペプチドを含む上記（Ｃ）の融合体が、上記（Ａ）のガイドＲＮＡ、上記（Ｂ）のＣａｓタンパク質、および上記（Ｄ）の第１のエフェクタータンパク質と協同して標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する活性を有するか否かを試験することにより判定できる。そのような試験は、当分野における通常の方法を用いて行うことができる。
【0099】
（ｄ３）は、
４．（ｄ１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ｄ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。以下、４に関する説明は、（ａ３）の（４について）と同様であり、５に関する説明は、上記の（３について）と同様であるため、省略する。
４．（ｄ１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ｄ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。以下、４に関する説明は、（ａ３）の（４について）と同様であり、５に関する説明は、上記の（３について）と同様であるため、省略する。
【0100】
以下、（ｄ１）～（ｄ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをまとめて（ｄ）のポリヌクレオチドとも称する。
【0101】
〔タグとなるペプチドのリンカーの配列〕
タグとなるペプチドのリンカーの配列は、タグとなるペプチドの抗原または抗体が、第１のエフェクタータンパク質が備える抗体または抗原と結合する機能を妨げない配列であれば、特に限定されない。
タグとなるペプチドのリンカーの配列は、タグとなるペプチドの抗原または抗体が、第１のエフェクタータンパク質が備える抗体または抗原と結合する機能を妨げない配列であれば、特に限定されない。
【0102】
本発明の一実施形態に係る組成物は、好ましくは、上記リンカーが、下記（ｅ１）～（ｅ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる：
（ｅ１）配列番号８～１１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ２）配列番号８～１１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、および
（ｅ３）配列番号８～１１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ｅ１）配列番号８～１１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｅ２）配列番号８～１１で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド、および
（ｅ３）配列番号８～１１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【0103】
以下、（ｅ１）～（ｅ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをまとめて（ｅ）のポリヌクレオチドとも称する。
【0104】
なお、配列番号８～１１のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから翻訳されるリンカーは、全て同一のアミノ酸配列を有する。
【0105】
〔ｓｃＦｖをコードする配列〕
抗体は、タグとなるペプチドが備える抗原に結合するものであれば特に限定されない。
抗体は、タグとなるペプチドが備える抗原に結合するものであれば特に限定されない。
【0106】
本発明の一実施形態に係る組成物は、例えばタグとなるペプチドが備える抗原がＧＣＮ４である場合、好ましくは、上記ｓｃＦｖが、下記（ｆ１）～（ｆ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる：
（ｆ１）配列番号１２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｆ２）配列番号１２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、タグとなるペプチドが備える抗原に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｆ３）配列番号１２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、タグとなるペプチドが備える抗原に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
（ｆ１）配列番号１２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｆ２）配列番号１２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、タグとなるペプチドが備える抗原に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド、および
（ｆ３）配列番号１２で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、かつ、該ポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、タグとなるペプチドが備える抗原に結合する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【0107】
（ｆ１）は、
１．ＧＣＮ４に結合するように設計されたｓｃＦｖをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１２）である。
１．ＧＣＮ４に結合するように設計されたｓｃＦｖをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１２）である。
【0108】
（ｆ２）は、
２．（ｆ１）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ｆ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。２については（ａ２）と同様である。以下、３を説明する。
２．（ｆ１）と一定以上の配列同一性を有する。
３．（ｆ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする
の両条件を満たしているポリヌクレオチドである。２については（ａ２）と同様である。以下、３を説明する。
【0109】
（３について）
「（ｆ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有する」か否かは、（ｆ２）の配列番号１２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、タグとなるペプチドが備える抗原に結合する活性を有するか否かを試験することにより判定できる。そのような試験は、当分野における通常の方法を用いて行うことができる。
「（ｆ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有する」か否かは、（ｆ２）の配列番号１２で示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドから発現したタンパク質が、タグとなるペプチドが備える抗原に結合する活性を有するか否かを試験することにより判定できる。そのような試験は、当分野における通常の方法を用いて行うことができる。
【0110】
（ｆ３）は、
４．（ｆ１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ｆ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。以下、４に関する説明は、（ａ３）の（４について）と同様であり、５に関する説明は、上記の（３について）と同様であるため、省略する。
４．（ｆ１）と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
５．（ｆ１）がコードするタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードする。
の両条件を満たすポリヌクレオチドである。以下、４に関する説明は、（ａ３）の（４について）と同様であり、５に関する説明は、上記の（３について）と同様であるため、省略する。
【0111】
以下、（ｆ１）～（ｆ３）のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをまとめて（ｆ）のポリヌクレオチドとも称する。
【0112】
〔１－２ ポリヌクレオチドを含む発現ベクター〕
本発明の一実施形態に係る組成物は、上述したヌクレオチドを含んだものであってもよいし、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含んだものであってもよい。すなわち、本発明の一実施形態に係る組成物は、上述したポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
本発明の一実施形態に係る組成物は、上述したヌクレオチドを含んだものであってもよいし、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含んだものであってもよい。すなわち、本発明の一実施形態に係る組成物は、上述したポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【0113】
本発明の一実施形態に係る組成物において、発現ベクターに含まれるポリヌクレオチドは、〔１－１〕で示したものと同様である。
【0114】
本発明の一実施形態に係る組成物に含まれる発現ベクターは、基材ベクターとして、一般的に使用される種々のベクターを用いることができ、導入される細胞または導入方法に応じて適宜選択されうる。具体的には、プラスミド、ファージ、コスミドなどを用いることができる。ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。
【0115】
上述した発現ベクターの例としては、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクター（細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソームなど）、酵母染色体エレメントおよびウイルス（バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスなど）、および、それらの組み合わせに由来するベクター（コスミド、ファージミドなど）を挙げられる。
【0116】
本発明の一実施形態に係る組成物に含まれる発現ベクターは、さらに、転写開始および転写終結のための部位を含んでおり、かつ、転写領域中にリボソーム結合部位を含んでいることが好ましい。ベクター中の成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始コドンＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含むことになる。
【0117】
ＲＮＡまたはタンパク質を発現させるために、本発明の一実施形態に係る組成物に含まれる発現ベクターは、プロモーター配列を含んでいてよい。上記プロモーター配列は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択すればよい。
【0118】
本発明の一実施形態に係る組成物に含まれる発現ベクターは、ＤＮＡからの転写を亢進させるための配列を含んでいてよい。一実施形態において、上記ＤＮＡからの転写を亢進させるための配列は、エンハンサー配列である。上記エンハンサーとしては、例えば、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の下流の１００～２７０ｂｐに配置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の下流に配置されるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【0119】
本発明の一実施形態に係る組成物に含まれる発現ベクターは、転写されたＲＮＡを安定化させるための配列を含んでいてよい。一実施形態において、上記転写されたＲＮＡを安定化させるための配列は、ポリＡ付加配列（ポリアデニル化配列、ｐｏｌｙＡ）である。ポリＡ付加配列の例としては、成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリＡ付加配列、ヒト成長ホルモン遺伝子由来ポリＡ付加配列、ＳＶ４０ウイルス由来ポリＡ付加配列、ヒトまたはウサギのβグロビン遺伝子由来のポリＡ付加配列が挙げられる。
【0120】
本発明の一実施形態に係る組成物に含まれる発現ベクターの構造は、適宜設定されうる。例えば、「基材ベクター中のどこにＲＮＡまたはタンパク質をコードする塩基配列を配置するか」「ＲＮＡまたはタンパク質をコードする塩基配列の前後に、どのような機能を有する配列を配置するか」などの事項は、目的により、適宜設定しうる。
【0121】
また、同一のベクター内に組み込まれるＲＮＡまたはタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの数は、発現ベクターを導入した宿主細胞内で第３世代の人工遺伝子発現増強システムの機能を発揮しうる限りにおいて、特に限定されない。例えば、「上記（ａ）～（ｆ）のポリヌクレオチドを１種類の（同一の）ベクターに搭載する」という設計が可能である。また、「上記（ａ）～（ｅ）のポリヌクレオチドを１種類の（同一の）ベクターに搭載し、上記（ｆ）のポリヌクレオチドを別のベクターに搭載する」という設計が可能である。ただし、（ｃ）および（ｄ）のポリヌクレオチドは連続的に１種類の（同一の）ベクターに搭載し、（ｅ）のポリヌクレオチドが含まれる場合、（ｄ）および（ｅ）のポリヌクレオチドは連続的に１種類の（同一の）ベクターに搭載する。なお、「連続的に」とは、別々のタンパク質として発現させずに、融合体として発現させることを意図し、融合体を発現することができれば両者の間に更なるリンカーを形成するための配列有するポリヌクレオチドを搭載してもよい。さらに、「各ポリヌクレオチドを別々の４種類のベクターに搭載する」という設計が可能である。ガイドＲＮＡの安定化の観点から、（ａ）および（ｂ）のポリヌクレオチドは１種類の（同一の）ベクターに搭載することが好ましい。発現効率等の観点から、（ａ）および（ｂ）のポリヌクレオチドを含むベクターと、（ｃ）および（ｄ）（および（ｅ））のポリぺプチドを含むベクターと、（ｆ）のポリぺプチドを含むベクターとは、別々の３種類のベクターに搭載する方法が用いられる。
【0122】
その他、発現量を調節するなどの目的のために、同一のベクター中に、同じＲＮＡまたはタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを複数搭載してもよい。例えば、「上記（ａ）のポリヌクレオチドを１種類の（同一の）ベクター内の２箇所に配置する」という設計が可能である。
【0123】
なお、上記したポリペプチドのベクターへの搭載方法は、あくまでも例示であり、目的等に応じて、当業者により適宜設計・変更され得る。
【0124】
上述した、本発明の一実施形態に係る組成物に含まれる発現ベクターは、公知の手法によって作製することができる。このような手法としては、ベクターを作製用のキットに付属する実施マニュアルに記載の手法に加え、種々の手引書に記載の手法が挙げられる。
【0125】
〔１－３ ＲＮＡおよびタンパク質〕
本発明の一実施形態に係る組成物は、（Ａ’）標的遺伝子に第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡ、（Ｂ’）Ｃａｓタンパク質、（Ｃ’）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体、および（Ｄ’）複数の上記第１のエフェクタータンパク質、を含む。
本発明の一実施形態に係る組成物は、（Ａ’）標的遺伝子に第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡ、（Ｂ’）Ｃａｓタンパク質、（Ｃ’）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体、および（Ｄ’）複数の上記第１のエフェクタータンパク質、を含む。
【0126】
本発明の一実施形態に係る組成物は、上記〔１－１〕に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＲＮＡおよびタンパク質を含むものであってもよい。
【0127】
〔２．標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するためのキット〕
本発明の一実施形態に係る標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するためのキット（以下、適宜「本発明の一施形態に係るキット」と称する。）は、（Ａ）標的遺伝子に、第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｃ）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および（Ｄ）上記第１のエフェクタータンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備える。
本発明の一実施形態に係る標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するためのキット（以下、適宜「本発明の一施形態に係るキット」と称する。）は、（Ａ）標的遺伝子に、第１の領域で特異的に結合するガイドＲＮＡをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｂ）Ｃａｓタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、（Ｃ）上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および（Ｄ）上記第１のエフェクタータンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を備える。
【0128】
本態様において、〔１．標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物〕で説明した事項は、同じ説明を繰り返さない。
【0129】
本発明の一実施形態に係る「キット」とは、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュ等）を備えた包装物が意図される。本発明の一実施形態に係るキットは、そこに含まれる各々の材料が独立して存在している形態であってもよく、複数の材料が混在している形態（例えば、組成物の形態）であってもよい。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましい。
【0130】
〔３．標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した細胞および哺乳動物（ヒトを除く）の製造方法〕
本発明の一実施形態に係る標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した細胞の製造方法は、上述した組成物、上述したキットが備えるポリヌクレオチド、または、上述したキットが備える発現ベクターを、インビトロで細胞へ導入する工程を含む。また、本発明の一実施形態に係る標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した哺乳動物（ただしヒトを除く）の製造方法は、上述した組成物、上述したキットが備えるポリヌクレオチド、または、上述したキットが備える発現ベクターを、哺乳動物（ただしヒトを除く）へ導入する工程を含む。
本発明の一実施形態に係る標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した細胞の製造方法は、上述した組成物、上述したキットが備えるポリヌクレオチド、または、上述したキットが備える発現ベクターを、インビトロで細胞へ導入する工程を含む。また、本発明の一実施形態に係る標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した哺乳動物（ただしヒトを除く）の製造方法は、上述した組成物、上述したキットが備えるポリヌクレオチド、または、上述したキットが備える発現ベクターを、哺乳動物（ただしヒトを除く）へ導入する工程を含む。
【0131】
本発明の一実施形態に係る製造方法により得られた細胞または哺乳動物は、当該細胞内または哺乳動物体内で標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した結果、当該標的遺伝子の発現等が改変／修飾されている。すなわち、本発明の一実施形態において、エフェクタータンパク質を目的に応じて選択することにより、標的遺伝子の発現等を、適宜、改変／修飾することができる。なお、エフェクタータンパク質については、上述した通りである。
【0132】
本態様において、〔１．標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積するための組成物〕で説明した事項は、同じ説明を繰り返さない。
【0133】
〔３－１．標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した細胞の製造方法〕
本発明の一実施形態に係る細胞は、特に限定されず、例えば、細菌、酵母、昆虫、動物、植物等の細胞が挙げられる。本発明の一実施形態に係る細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞であり、特に好ましくはヒト細胞である。
本発明の一実施形態に係る細胞は、特に限定されず、例えば、細菌、酵母、昆虫、動物、植物等の細胞が挙げられる。本発明の一実施形態に係る細胞は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞であり、特に好ましくはヒト細胞である。
【0134】
本発明の一実施形態に係る組成物、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞に導入する方法は、特に限定されない。例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、ウイルベクターを用いた感染などの方法が挙げられる。このような方法は、［Leonard G. Davis et al., "Basic methods in molecular biology", New York: Elsevier, 1986］など、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。また、導入する細胞の種類により、適宜、導入方法を選択可能である。
【0135】
本発明の一実施形態において、上記ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターの細胞への導入は、インビトロで行われる工程である。この場合、上述した導入方法の中では、エレクトロポレーション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、ウイルスベクターを用いた感染を採用することが好ましい。
【0136】
本発明の一実施形態に係るガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体、および複数の上記第１のエフェクタータンパク質を、細胞に導入する方法は、特に限定されない。例えば、エレクトロポレーション、カチオン性脂質媒介トランスフェクションなどが挙げられる。
【0137】
〔３－２．標的遺伝子にエフェクタータンパク質が集積した哺乳動物（ヒトを除く）の製造方法〕
本発明の一実施形態に係る組成物、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、またはガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体、および複数の上記第１のエフェクタータンパク質を哺乳動物（ヒトを除く）に導入する方法は、〔３－１〕に記載した通りである。
本発明の一実施形態に係る組成物、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、またはガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、上記ガイドＲＮＡの第２の領域に結合するタンパク質と、第１のエフェクタータンパク質を複数結合するためのタグとなるペプチドとの融合体、および複数の上記第１のエフェクタータンパク質を哺乳動物（ヒトを除く）に導入する方法は、〔３－１〕に記載した通りである。
【0138】
〔４．第３世代のシステムを用いた疾患の処置方法〕
本発明の別の一実施形態において、本発明の一実施形態に係る組成物、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、当該対象の疾患の処置方法を提供する。上記組成物、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを対象に投与することにより、当該対象の体内で標的遺伝子にエフェクタータンパク質の集積が生じ、その結果、当該対象の疾患を処置することができる。
本発明の別の一実施形態において、本発明の一実施形態に係る組成物、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを対象に投与することを含む、当該対象の疾患の処置方法を提供する。上記組成物、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを対象に投与することにより、当該対象の体内で標的遺伝子にエフェクタータンパク質の集積が生じ、その結果、当該対象の疾患を処置することができる。
【0139】
本発明の一実施形態において「処置」とは、処置を必要とする対象に対して処置効果をもたらす行為を意味する。処置効果とは、予防効果および治療効果を包含する概念であり得る。
【0140】
本発明の一実施形態において、処置の対象となる疾患は、第３世代のシステムにより遺伝子発現が増強した結果、処置効果が生じる疾患であれば特に限定されない。処置の対象となる疾患は、例えば、癌、神経疾患、糖尿病等が挙げられる。例えば、処置の対象となる疾患が癌の場合には、細胞接着に関与するＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＣＤＨ１遺伝子によりコード）を標的としてその発現を増強することにより、癌化した細胞の移動および浸潤を防ぐことができる。
【0141】
本発明の一実施形態において、上記組成物、ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの対象への投与は、遺伝子治療等の分野で用いられる任意の方法が使用できる。
【0142】
本発明の一実施形態において、処置の対象となる疾患は、特に限定されないが、例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
【0143】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【0144】
以下、本発明の第３世代のシステムの一例として、エフェクタータンパク質として転写活性化因子を用いた第３世代の人工遺伝子発現増強システムの実施例を説明するが、本発明はこれに限定されない。すなわち、上述したように、エフェクタータンパク質は目的に応じて選択可能であるため、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積する機能を有する第３世代のシステムであれば、遺伝子発現増強効果以外の目的の効果を示す第３世代のシステムも本発明の技術範囲に含まれる。
【0145】
［１ 細胞の培養に関する基本操作］
［１．１ 細胞の培養］
本実施例では、ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＣＴ１１６細胞を使用した。培養細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。ｅ－Ｍｙｃｏ（商標） Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（iNtRON Biotechnology製）を用いて、培養中の細胞がマイコプラズマに汚染されていないことを試験した。さらに、ＳＴＲ分析（ＴａＫａＲａによる受託解析）により、細胞株の認証を行った。
［１．１ 細胞の培養］
本実施例では、ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＣＴ１１６細胞を使用した。培養細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。ｅ－Ｍｙｃｏ（商標） Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（iNtRON Biotechnology製）を用いて、培養中の細胞がマイコプラズマに汚染されていないことを試験した。さらに、ＳＴＲ分析（ＴａＫａＲａによる受託解析）により、細胞株の認証を行った。
【0146】
［１．１．１ 完全培地の作製］
［１．１．１．１ ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞用の完全培地の作製］
培地の総体積に対して、Ｌ－グルタミンおよびフェノールレッドを含むＤ－ＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｗａｋｏ製）が８６．５体積％、ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Thermo Fisher Scientific製）が１０体積％、Ｈｏｒｓｅ Ｓｅｒｕｍ（馬血清、Thermo Fisher Scientific製）が２．５体積％、ＳＴ－ＰＮ（ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｗａｋｏ製）が１体積％となるように混合して、ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞用の完全培地を作製した。
［１．１．１．１ ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞用の完全培地の作製］
培地の総体積に対して、Ｌ－グルタミンおよびフェノールレッドを含むＤ－ＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｗａｋｏ製）が８６．５体積％、ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Thermo Fisher Scientific製）が１０体積％、Ｈｏｒｓｅ Ｓｅｒｕｍ（馬血清、Thermo Fisher Scientific製）が２．５体積％、ＳＴ－ＰＮ（ペニシリン－ストレプトマイシン、Ｗａｋｏ製）が１体積％となるように混合して、ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞用の完全培地を作製した。
【0147】
［１．１．１．２ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＣＴ１１６細胞用の完全培地の作製］
培地の総体積に対して、Ｄ－ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）が８８体積％、ＦＢＳが１０体積％、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸、Thermo Fisher Scientific製）が１体積％、ＳＴ－ＰＮが１体積％となるように混合して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＣＴ１１６細胞用の完全培地を作製した。
培地の総体積に対して、Ｄ－ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ）が８８体積％、ＦＢＳが１０体積％、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸、Thermo Fisher Scientific製）が１体積％、ＳＴ－ＰＮが１体積％となるように混合して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＣＴ１１６細胞用の完全培地を作製した。
【0148】
［１．１．２ 細胞の継代］
［１．１．２．１ ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞およびＨＣＴ１１６細胞の継代］
培養中の培地をアスピレータ―で吸引し、０．２５％トリプシンを含むＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）を３ｍｌ加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに入れ、３～４分間反応させた。完全培地を９ｍｌ加え、液を電動ピペッターで吸ってディッシュの底に吹きつけることを繰り返し、細胞を剥がした。剥がした細胞の懸濁液を電動ピペッターで吸い、ピペットの先をディッシュの底に軽く当てて吹き出すことを繰り返して細胞の塊を細かくした。懸濁液を５０ｍｌチューブに入れ、２０℃、１，０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清をアスピレータで吸引し、完全培地を１０ｍｌ加えて懸濁した。細胞懸濁液の一部を、あらかじめ完全培地を計１２ｍｌになるように入れた新しいディッシュに移した。移す量は、次の継代を翌日行う場合は３ｍｌ、２日後に行う場合は１．５ｍｌ、３日後に行う場合は７００μｌを目安とし、細胞の増殖の度合いによって調整した。細胞が均一になるように振盪し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。
［１．１．２．１ ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞およびＨＣＴ１１６細胞の継代］
培養中の培地をアスピレータ―で吸引し、０．２５％トリプシンを含むＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）を３ｍｌ加えた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータに入れ、３～４分間反応させた。完全培地を９ｍｌ加え、液を電動ピペッターで吸ってディッシュの底に吹きつけることを繰り返し、細胞を剥がした。剥がした細胞の懸濁液を電動ピペッターで吸い、ピペットの先をディッシュの底に軽く当てて吹き出すことを繰り返して細胞の塊を細かくした。懸濁液を５０ｍｌチューブに入れ、２０℃、１，０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清をアスピレータで吸引し、完全培地を１０ｍｌ加えて懸濁した。細胞懸濁液の一部を、あらかじめ完全培地を計１２ｍｌになるように入れた新しいディッシュに移した。移す量は、次の継代を翌日行う場合は３ｍｌ、２日後に行う場合は１．５ｍｌ、３日後に行う場合は７００μｌを目安とし、細胞の増殖の度合いによって調整した。細胞が均一になるように振盪し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。
【0149】
［１．１．２．２ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の継代］
培養中の培地を電動ピペッターで吸い、ディッシュの底に吹きつけることを繰り返して細胞を剥がした。剥がした細胞の懸濁液を電動ピペッターで吸い、ピペットの先をディッシュの底に軽く当てて吹き出すことを繰り返して細胞の塊を細かくした。細胞懸濁液の一部を、あらかじめ完全培地を計１２ｍｌになるように入れた新しいディッシュに移した。移す量は、次の継代を翌日行う場合は３．６ｍｌ、２日後に行う場合は１．２ｍｌ、３日後に行う場合は５００μｌを目安とし、細胞の増殖の度合いによって調整した。細胞が均一になるように振盪し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。なお、細胞数を計測する必要がある場合は、ＭＩＡ－ＰａＣａ２の継代と同様の操作で行ったが、トリプシンの処理時間は１分間とした。
培養中の培地を電動ピペッターで吸い、ディッシュの底に吹きつけることを繰り返して細胞を剥がした。剥がした細胞の懸濁液を電動ピペッターで吸い、ピペットの先をディッシュの底に軽く当てて吹き出すことを繰り返して細胞の塊を細かくした。細胞懸濁液の一部を、あらかじめ完全培地を計１２ｍｌになるように入れた新しいディッシュに移した。移す量は、次の継代を翌日行う場合は３．６ｍｌ、２日後に行う場合は１．２ｍｌ、３日後に行う場合は５００μｌを目安とし、細胞の増殖の度合いによって調整した。細胞が均一になるように振盪し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。なお、細胞数を計測する必要がある場合は、ＭＩＡ－ＰａＣａ２の継代と同様の操作で行ったが、トリプシンの処理時間は１分間とした。
【0150】
［１．２ リポフェクションによる、培養細胞へのプラスミドの導入］
９６ウェルプレートの使用するウェルに、何も加えていないＤ－ＭＥＭ（以下、「無血清Ｄ－ＭＥＭ」と称する）を２５μｌ入れた。導入するプラスミド混合液を全量が６μｌになるようにあらかじめ調整しておき、無血清Ｄ－ＭＥＭに加えた。１ウェルあたり、２５μｌの無血清Ｄ－ＭＥＭと０．７μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸ（Thermo Fisher Scientific製）とを混合したものを２５μｌ加え、室温で３０分間静置した。この間に、継代操作の項目に記載した手法で細胞の懸濁液を作製し、細胞計測スライドに１０μｌアプライしてＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（LUNA製）で細胞の濃度を測定した。細胞が目的の濃度になるように、懸濁液と完全培地を混合した。静置終了後、濃度を調製した懸濁液を各ウェルに１００μｌずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。
９６ウェルプレートの使用するウェルに、何も加えていないＤ－ＭＥＭ（以下、「無血清Ｄ－ＭＥＭ」と称する）を２５μｌ入れた。導入するプラスミド混合液を全量が６μｌになるようにあらかじめ調整しておき、無血清Ｄ－ＭＥＭに加えた。１ウェルあたり、２５μｌの無血清Ｄ－ＭＥＭと０．７μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸ（Thermo Fisher Scientific製）とを混合したものを２５μｌ加え、室温で３０分間静置した。この間に、継代操作の項目に記載した手法で細胞の懸濁液を作製し、細胞計測スライドに１０μｌアプライしてＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ（LUNA製）で細胞の濃度を測定した。細胞が目的の濃度になるように、懸濁液と完全培地を混合した。静置終了後、濃度を調製した懸濁液を各ウェルに１００μｌずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養した。
【0151】
［２ プラスミド構築に関する基本操作］
［２．１ ＰＣＲ増幅］
［２．１．１ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ（TaKaRa製）を用いたＰＣＲ］
テンプレート溶液０．２μｌ、２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Max Premix（TaKaRa製）５．０μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．５μｌ、オートクレーブしたＭｉｌｌｉ－Ｑ水（以下、「滅菌水」と称する）３．８μｌを混合した。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、適切な温度で５秒間のアニーリング、７２℃で１ｋｂあたり５秒間に予備時間として３０秒間を加えた時間の伸長反応、を２５～３５サイクル行った後、７２℃で２分間のポストヒートを経て、４℃で保存した。
［２．１ ＰＣＲ増幅］
［２．１．１ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ（TaKaRa製）を用いたＰＣＲ］
テンプレート溶液０．２μｌ、２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） Max Premix（TaKaRa製）５．０μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．５μｌ、オートクレーブしたＭｉｌｌｉ－Ｑ水（以下、「滅菌水」と称する）３．８μｌを混合した。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、適切な温度で５秒間のアニーリング、７２℃で１ｋｂあたり５秒間に予備時間として３０秒間を加えた時間の伸長反応、を２５～３５サイクル行った後、７２℃で２分間のポストヒートを経て、４℃で保存した。
【0152】
［２．１．２ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ（TaKaRa製）を用いたＰＣＲ］
テンプレート溶液１．０μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（TaKaRa製）０．２μｌ、２．５ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（TaKaRa製）０．８μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．３μｌ、滅菌水５．４μｌを混合した。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、適切な温度で３０秒間のアニーリング、６８℃で１ｋｂあたり２０秒間に予備時間として３０秒間を加えた時間の伸長反応、を２５～３５サイクル行った後、７２℃で２分間のポストヒートを経て、４℃で保存した。
テンプレート溶液１．０μｌ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（TaKaRa製）０．２μｌ、２．５ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（TaKaRa製）０．８μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．３μｌ、滅菌水５．４μｌを混合した。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、適切な温度で３０秒間のアニーリング、６８℃で１ｋｂあたり２０秒間に予備時間として３０秒間を加えた時間の伸長反応、を２５～３５サイクル行った後、７２℃で２分間のポストヒートを経て、４℃で保存した。
【0153】
［２．１．３ ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡製）を用いたＰＣＲ］
テンプレート溶液１．０μｌ、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡製）０．２μｌ、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏのための２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡製）５．０μｌ、２ｍＭ各ｄＮＴＰ Ｍｉｘ２．０μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．３μｌ、滅菌水１．２μｌを混合した。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、適切な温度で３０秒間のアニーリング、６８℃で１ｋｂあたり３０秒間に予備時間として３０秒間を加えた時間の伸長反応、を２５～３５サイクル行った後、４℃で保存した。
テンプレート溶液１．０μｌ、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（東洋紡製）０．２μｌ、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏのための２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡製）５．０μｌ、２ｍＭ各ｄＮＴＰ Ｍｉｘ２．０μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．３μｌ、滅菌水１．２μｌを混合した。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、適切な温度で３０秒間のアニーリング、６８℃で１ｋｂあたり３０秒間に予備時間として３０秒間を加えた時間の伸長反応、を２５～３５サイクル行った後、４℃で保存した。
【0154】
［２．２ 制限酵素処理］
ＤＮＡ溶液（プラスミドの場合は４００ｎｇ）、制限酵素原液０．３μｌ、１０×バッファー１．０μｌ、必要であれば１０×ＢＳＡ１．０μｌ、全量１０μｌとなるように滅菌水を混合し、３７℃インキュベータで（制限酵素としてＢｓｓＨＩＩを用いる場合はサーマルサイクラーまたはハイブリオーブンを用いて５０℃で）、１時間～一晩、インキュベートした。必要な場合は、反応後の液にｒＡＰｉｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Roche Life Science製）０．５μｌを加え、３７℃でさらに１時間インキュベートした。
ＤＮＡ溶液（プラスミドの場合は４００ｎｇ）、制限酵素原液０．３μｌ、１０×バッファー１．０μｌ、必要であれば１０×ＢＳＡ１．０μｌ、全量１０μｌとなるように滅菌水を混合し、３７℃インキュベータで（制限酵素としてＢｓｓＨＩＩを用いる場合はサーマルサイクラーまたはハイブリオーブンを用いて５０℃で）、１時間～一晩、インキュベートした。必要な場合は、反応後の液にｒＡＰｉｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Roche Life Science製）０．５μｌを加え、３７℃でさらに１時間インキュベートした。
【0155】
［２．３ アガロースゲル電気泳動］
電子レンジで加熱しながら、１×ＴＡＥバッファーに１～３％（ｗ／ｖ）のＡｇａｒｏｓｅ Ｓ（ニッポンジーン製）を溶解させ、ゲルメーカーに流し込み、コームを挿入した。室温で３０分間程度静置してゲルを固め、泳動槽に固めたゲルと１×ＴＡＥバッファーを入れた。サンプル溶液およびＤＮＡサイズマーカーにローディングバッファーを終濃度が１×以上になる量加えてウェルにアプライし、後にゲルからＤＮＡを抽出する必要がある場合は５０Ｖで１時間程度、ない場合は１００Ｖで３０分間程度泳動した。タッパーにゲルが浸る程度の脱イオン水を張って臭化エチジウムを２μｌ加え、泳動を終えたゲルを入れて２０分間程度振盪した。ゲルをＵＶトランスイルミネータで撮影してバンドを確認し、ＤＮＡ抽出が必要な場合は目的のバンドを剃刀で切り出した。
電子レンジで加熱しながら、１×ＴＡＥバッファーに１～３％（ｗ／ｖ）のＡｇａｒｏｓｅ Ｓ（ニッポンジーン製）を溶解させ、ゲルメーカーに流し込み、コームを挿入した。室温で３０分間程度静置してゲルを固め、泳動槽に固めたゲルと１×ＴＡＥバッファーを入れた。サンプル溶液およびＤＮＡサイズマーカーにローディングバッファーを終濃度が１×以上になる量加えてウェルにアプライし、後にゲルからＤＮＡを抽出する必要がある場合は５０Ｖで１時間程度、ない場合は１００Ｖで３０分間程度泳動した。タッパーにゲルが浸る程度の脱イオン水を張って臭化エチジウムを２μｌ加え、泳動を終えたゲルを入れて２０分間程度振盪した。ゲルをＵＶトランスイルミネータで撮影してバンドを確認し、ＤＮＡ抽出が必要な場合は目的のバンドを剃刀で切り出した。
【0156】
［２．４ ゲル片からのＤＮＡの抽出］
［２．４．１ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（TaKaRa製）を用いた方法］
切り出したアガロースゲルの質量を測定し、ゲル片１００ｍｇあたり２００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＮＴＩ（TaKaRa製）を加えた。切り出したサンプルが複数ある場合は、加えるＢｕｆｆｅｒ ＮＴＩ（TaKaRa製）の量を最も重いゲル片に合わせた。２～３分間おきにボルテックスしながら、ヒートブロックを用いて５０℃で１０分間インキュベートし、ゲル片を溶解させた。カラム（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｃｏｌｕｍｎ、TaKaRa製）を２ｍｌのコレクションチューブにセットし、ゲル片の溶液をアプライした。２０℃、１１，０００×ｇで３０秒間遠心し、濾液を捨てた。Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＮＴ３（TaKaRa製）７００μｌをカラムにアプライし、２０℃、１１，０００×ｇで３０秒間遠心し、濾液を捨てた。カラムに何もアプライせずに２０℃、１１，０００×ｇで３０秒間遠心してメンブレンを乾燥させ、濾液を捨てた。カラムを回収用の新しい１．５ｍｌチューブに移し、滅菌水１５μｌをアプライした。室温で１分間インキュベートし、２０℃、１１，０００×ｇで３０秒間遠心した。濾液をカラムの上に戻し、２０℃、１１，０００×ｇで３０秒間遠心した。濾液を－２０℃で保存した。
［２．４．１ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（TaKaRa製）を用いた方法］
切り出したアガロースゲルの質量を測定し、ゲル片１００ｍｇあたり２００μｌのＢｕｆｆｅｒ ＮＴＩ（TaKaRa製）を加えた。切り出したサンプルが複数ある場合は、加えるＢｕｆｆｅｒ ＮＴＩ（TaKaRa製）の量を最も重いゲル片に合わせた。２～３分間おきにボルテックスしながら、ヒートブロックを用いて５０℃で１０分間インキュベートし、ゲル片を溶解させた。カラム（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｃｏｌｕｍｎ、TaKaRa製）を２ｍｌのコレクションチューブにセットし、ゲル片の溶液をアプライした。２０℃、１１，０００×ｇで３０秒間遠心し、濾液を捨てた。Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ＮＴ３（TaKaRa製）７００μｌをカラムにアプライし、２０℃、１１，０００×ｇで３０秒間遠心し、濾液を捨てた。カラムに何もアプライせずに２０℃、１１，０００×ｇで３０秒間遠心してメンブレンを乾燥させ、濾液を捨てた。カラムを回収用の新しい１．５ｍｌチューブに移し、滅菌水１５μｌをアプライした。室温で１分間インキュベートし、２０℃、１１，０００×ｇで３０秒間遠心した。濾液をカラムの上に戻し、２０℃、１１，０００×ｇで３０秒間遠心した。濾液を－２０℃で保存した。
【0157】
［２．４．２ Ｗｉｚｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Promega製）を用いた方法］
切り出したアガロースゲルの質量を測定し、ゲル片１００ｍｇあたり１００μｌのＭｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｕｌｔｉｏｎ（Promega製）を加えた。切り出したサンプルが複数ある場合は、加えるＭｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｕｌｔｉｏｎの体積を最も重いゲル片に合わせた。２～３分間おきにボルテックスしながら、ヒートブロックを用いて５５℃で１０分間インキュベートし、ゲル片を溶解させた。カラム（ＳＶ Ｃｏｌｕｍｎ、Promega製）をコレクションチューブにセットし、ゲル片の溶液をアプライした。室温で５分間インキュベートし、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心して濾液を捨てた。Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｕｌｔｉｏｎ（ＥｔＯＨ中）７００μｌをカラムにアプライし、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心して濾液を捨てた。Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｕｌｔｉｏｎ（ＥｔＯＨ中）５００μｌをカラムにアプライし、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心して濾液を捨てた。カラムを回収用の新しい１．５ｍｌチューブに移し、滅菌水１５μｌをカラムにアプライして室温で１分間インキュベートした。４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液をカラムに戻し、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液を－２０℃で保存した。
切り出したアガロースゲルの質量を測定し、ゲル片１００ｍｇあたり１００μｌのＭｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｕｌｔｉｏｎ（Promega製）を加えた。切り出したサンプルが複数ある場合は、加えるＭｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｏｕｌｔｉｏｎの体積を最も重いゲル片に合わせた。２～３分間おきにボルテックスしながら、ヒートブロックを用いて５５℃で１０分間インキュベートし、ゲル片を溶解させた。カラム（ＳＶ Ｃｏｌｕｍｎ、Promega製）をコレクションチューブにセットし、ゲル片の溶液をアプライした。室温で５分間インキュベートし、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心して濾液を捨てた。Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｕｌｔｉｏｎ（ＥｔＯＨ中）７００μｌをカラムにアプライし、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心して濾液を捨てた。Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｗａｓｈ Ｓｏｕｌｔｉｏｎ（ＥｔＯＨ中）５００μｌをカラムにアプライし、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心して濾液を捨てた。カラムを回収用の新しい１．５ｍｌチューブに移し、滅菌水１５μｌをカラムにアプライして室温で１分間インキュベートした。４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液をカラムに戻し、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液を－２０℃で保存した。
【0158】
［２．５ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）反応による線状ＤＮＡの連結］
ゲルから抽出したベクター側のＤＮＡ溶液およびインサート側のＤＮＡ溶液をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）反応させた。反応液の組成は５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｉｘ（TaKaRa製）０．４μｌ、ベクター側のＤＮＡ溶液０．８μｌ、インサート側のＤＮＡ溶液０．８μｌを基本としたが、コロニーの形成が少なく再度行う場合は、スケールを大きくしたりインサート側のＤＮＡ溶液の割合を大きくしたりした。サーマルサイクラーまたは恒温槽を用いて、５０℃で１５分間インキュベートした。
ゲルから抽出したベクター側のＤＮＡ溶液およびインサート側のＤＮＡ溶液をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）反応させた。反応液の組成は５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｉｘ（TaKaRa製）０．４μｌ、ベクター側のＤＮＡ溶液０．８μｌ、インサート側のＤＮＡ溶液０．８μｌを基本としたが、コロニーの形成が少なく再度行う場合は、スケールを大きくしたりインサート側のＤＮＡ溶液の割合を大きくしたりした。サーマルサイクラーまたは恒温槽を用いて、５０℃で１５分間インキュベートした。
【0159】
［２．６ ライゲーション反応による線状ＤＮＡの連結］
アガロースゲルから抽出したベクター側のＤＮＡ（末端を脱リン酸化済み）溶液０．４μｌ、インサート側のＤＮＡ溶液０．６μｌ、２×Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（NIPPON GENE製）１．０μｌを混合し、１６℃インキュベータで１時間インキュベートした。
アガロースゲルから抽出したベクター側のＤＮＡ（末端を脱リン酸化済み）溶液０．４μｌ、インサート側のＤＮＡ溶液０．６μｌ、２×Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（NIPPON GENE製）１．０μｌを混合し、１６℃インキュベータで１時間インキュベートした。
【0160】
［２．７ 大腸菌へ形質転換］
１．５ ｍｌチューブ内で、サンプル溶液と１０倍量以上のコンピテントセル（ＸＬ１０－Ｇｏｌｄ（Agilent Technologies製）またはＳｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（New England Biolabs製））とを混合した。氷上で１０分間以上静置し、ヒートブロックまたは恒温槽を用いて４２℃で３０秒間インキュベートし、２分間以上氷冷した。ＳＯＣ回復培養を行う場合は、菌液にＳＯＣ培地を４００μｌ～１ｍｌ加え、１．５ｍｌチューブごと５０ｍｌチューブに入れ、３７℃で１時間以上振盪培養した。培養液を２０℃、３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を一部残して捨て、残りは懸濁した。サンプルがアンピシリン耐性遺伝子を持つ場合はアンピシリンを含むＬＢプレート（以下、「ＬＢ＋アンピシリンプレート」と称する）に、スペクチノマイシン耐性遺伝子を持つ場合はスペクチノマイシンを含むＬＢプレート（以下、「ＬＢ＋スペクチノマイシンプレート」と称する）に菌液を塗り広げ、３７℃インキュベータで１４～１６時間培養した。
１．５ ｍｌチューブ内で、サンプル溶液と１０倍量以上のコンピテントセル（ＸＬ１０－Ｇｏｌｄ（Agilent Technologies製）またはＳｔａｂｌｅ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（New England Biolabs製））とを混合した。氷上で１０分間以上静置し、ヒートブロックまたは恒温槽を用いて４２℃で３０秒間インキュベートし、２分間以上氷冷した。ＳＯＣ回復培養を行う場合は、菌液にＳＯＣ培地を４００μｌ～１ｍｌ加え、１．５ｍｌチューブごと５０ｍｌチューブに入れ、３７℃で１時間以上振盪培養した。培養液を２０℃、３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を一部残して捨て、残りは懸濁した。サンプルがアンピシリン耐性遺伝子を持つ場合はアンピシリンを含むＬＢプレート（以下、「ＬＢ＋アンピシリンプレート」と称する）に、スペクチノマイシン耐性遺伝子を持つ場合はスペクチノマイシンを含むＬＢプレート（以下、「ＬＢ＋スペクチノマイシンプレート」と称する）に菌液を塗り広げ、３７℃インキュベータで１４～１６時間培養した。
【0161】
［２．８ コロニーＰＣＲ］
［２．８．１ ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏを用いたコロニーＰＣＲ］
ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ０．１６μｌ、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏのための２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ４．０μｌ、２ｍＭ各ｄＮＴＰ Ｍｉｘ１．６μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．２４μｌ、滅菌水１．７６μｌを混合して反応液を作製した。チップで大腸菌のコロニーをつつき、レプリカプレート（ＬＢ＋アンピシリンプレート）に触れた後、チップを反応液にしばらく浸けておいた。１つのコロニーから複数のコロニーＰＣＲを行う場合は、コロニーをつついたチップを一度５μｌの滅菌水にしばらく浸けて置き、その液を２本のチップで触れ、それぞれのＰＣＲ反応液にしばらく浸けた。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、適切な温度で３０秒間のアニーリング、６８℃で１ｋｂあたり３０秒間に予備時間として３０秒間を加えた時間の伸長反応、を２７サイクル行った後、６８℃で２分間のポストヒートを経て、４℃で保存した。産物の全量または一部をアガロースゲルで電気泳動し、目的の長さのバンドが出ていることを確認した。
［２．８．１ ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏを用いたコロニーＰＣＲ］
ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ０．１６μｌ、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏのための２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ４．０μｌ、２ｍＭ各ｄＮＴＰ Ｍｉｘ１．６μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．２４μｌ、滅菌水１．７６μｌを混合して反応液を作製した。チップで大腸菌のコロニーをつつき、レプリカプレート（ＬＢ＋アンピシリンプレート）に触れた後、チップを反応液にしばらく浸けておいた。１つのコロニーから複数のコロニーＰＣＲを行う場合は、コロニーをつついたチップを一度５μｌの滅菌水にしばらく浸けて置き、その液を２本のチップで触れ、それぞれのＰＣＲ反応液にしばらく浸けた。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、適切な温度で３０秒間のアニーリング、６８℃で１ｋｂあたり３０秒間に予備時間として３０秒間を加えた時間の伸長反応、を２７サイクル行った後、６８℃で２分間のポストヒートを経て、４℃で保存した。産物の全量または一部をアガロースゲルで電気泳動し、目的の長さのバンドが出ていることを確認した。
【0162】
［２．８．２ ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（TaKaRa製）を用いたコロニーＰＣＲ］
２×ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（TaKaRa製）４．０μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．１６μｌ、滅菌水３．６８μｌを混合した。ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏを用いる場合と同様の操作で、大腸菌のコロニーを添加し、レプリカプレートでクローンを生育させた。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、６０～６６℃（プライマーにより異なる）で５秒間のアニーリング、７２℃での1ｋｂあたり１０秒間に予備時間として３０秒間を加えた時間の伸長反応、を２７サイクル行った後、７２℃で２分間のポストヒートを経て、４℃で保存した。産物の全量または一部をアガロースゲルで電気泳動し、目的の長さのバンドが出ていることを確認した。
２×ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ（登録商標）Ｆａｓｔ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（TaKaRa製）４．０μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．１６μｌ、滅菌水３．６８μｌを混合した。ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏを用いる場合と同様の操作で、大腸菌のコロニーを添加し、レプリカプレートでクローンを生育させた。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、６０～６６℃（プライマーにより異なる）で５秒間のアニーリング、７２℃での1ｋｂあたり１０秒間に予備時間として３０秒間を加えた時間の伸長反応、を２７サイクル行った後、７２℃で２分間のポストヒートを経て、４℃で保存した。産物の全量または一部をアガロースゲルで電気泳動し、目的の長さのバンドが出ていることを確認した。
【0163】
［２．９ 大腸菌の少量培養］
試験管に入ったＬＢ液体培地３ｍｌに、サンプルがアンピシリン耐性遺伝子を持つ場合は２５ｍｇ／ｍｌアンピシリン１２～３０μｌまたは１０ｍｇ／ｍｌカルベニシリン３０μｌ、スペクチノマイシン耐性遺伝子を持つ場合は１０ｍｇ／ｍｌスペクチノマイシン２０μｌを加えた。コロニーＰＣＲによって目的のバンドが得られたクローンの、レプリカプレートのコロニーをチップでつつき、チップごと試験管内の培地に落とした。既存のプラスミドを再増幅する場合は、複数のコロニーをチップでかき集め、チップごと試験管内の培地に落とした。試験管を３７℃で１４～１６時間振盪培養した。
試験管に入ったＬＢ液体培地３ｍｌに、サンプルがアンピシリン耐性遺伝子を持つ場合は２５ｍｇ／ｍｌアンピシリン１２～３０μｌまたは１０ｍｇ／ｍｌカルベニシリン３０μｌ、スペクチノマイシン耐性遺伝子を持つ場合は１０ｍｇ／ｍｌスペクチノマイシン２０μｌを加えた。コロニーＰＣＲによって目的のバンドが得られたクローンの、レプリカプレートのコロニーをチップでつつき、チップごと試験管内の培地に落とした。既存のプラスミドを再増幅する場合は、複数のコロニーをチップでかき集め、チップごと試験管内の培地に落とした。試験管を３７℃で１４～１６時間振盪培養した。
【0164】
［２．１０ 大腸菌からのプラスミドの少量調製］
［２．１０．１ 少量培養からの大腸菌ペレットの作製］
少量培養の培養液（３ｍｌ）を、１．５ｍｌチューブに入るだけ入れ、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を捨て、培養液の残りをチューブに入れ、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を捨て、次の処理に進むか、－２０℃で一時的に保存した。
［２．１０．１ 少量培養からの大腸菌ペレットの作製］
少量培養の培養液（３ｍｌ）を、１．５ｍｌチューブに入るだけ入れ、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を捨て、培養液の残りをチューブに入れ、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を捨て、次の処理に進むか、－２０℃で一時的に保存した。
【0165】
［２．１０．２ ＧｅｎＥｌｕｔｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Sigma-Aldrich製）によるプラスミドの少量調製］
４℃で冷却した、ＲＮａｓｅ Ａを含むＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Sigma-Aldrich製）２００μｌを加え、ボルテックスで沈殿を懸濁した。Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Sigma-Aldrich製）２００μｌを加えて転倒混和し、室温で３分間静置した。Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Sigma-Aldrich製）３５０μｌを加えて転倒混和し、４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。ライセートの遠心中に、カラムを準備するため、コレクションチューブにカラムをセットし、Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Sigma-Aldrich製）５００μｌをカラムにアプライして４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液を捨て、遠心したライセートの上清をカラムにアプライして４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濾液を捨てた。Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（Sigma-Aldrich製）５００μｌをカラムにアプライして４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濾液を捨てた。ＥｔＯＨを含むＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（Sigma-Aldrich製）７５０μｌをカラムにアプライして４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濾液を捨てた。カラムに何もアプライせずに、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、メンブレンを乾燥させた。カラムを回収用の１．５ｍｌチューブに移し、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Sigma-Aldrich製）４０μｌをアプライして４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液をカラムに戻し、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液を保存した。
４℃で冷却した、ＲＮａｓｅ Ａを含むＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Sigma-Aldrich製）２００μｌを加え、ボルテックスで沈殿を懸濁した。Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Sigma-Aldrich製）２００μｌを加えて転倒混和し、室温で３分間静置した。Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ／Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Sigma-Aldrich製）３５０μｌを加えて転倒混和し、４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。ライセートの遠心中に、カラムを準備するため、コレクションチューブにカラムをセットし、Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Sigma-Aldrich製）５００μｌをカラムにアプライして４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液を捨て、遠心したライセートの上清をカラムにアプライして４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濾液を捨てた。Ｗａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（Sigma-Aldrich製）５００μｌをカラムにアプライして４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濾液を捨てた。ＥｔＯＨを含むＷａｓｈ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（Sigma-Aldrich製）７５０μｌをカラムにアプライして４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、濾液を捨てた。カラムに何もアプライせずに、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心し、メンブレンを乾燥させた。カラムを回収用の１．５ｍｌチューブに移し、Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Sigma-Aldrich製）４０μｌをアプライして４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液をカラムに戻し、４℃、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液を保存した。
【0166】
［２．１０．３ プラスミドの濃度・体積の測定と調整］
少量調製したプラスミド溶液をＮａｎｏＤｒｏｐ（NanoDrop Technologies製）に１μｌアプライし、ＤＮＡ濃度を測定した。残りの溶液を２００μｌピペットマンで全量吸い、ダイヤルを回して空気を抜くことで、体積を測定した。これらの結果をもとに、ＤＮＡ濃度が２００ｎｇ／μｌ（測定結果が２００ｎｇ／μｌ以下の場合は１００ｎｇ／μｌ）にするために必要な滅菌水の量を計算して加え、希釈した。
少量調製したプラスミド溶液をＮａｎｏＤｒｏｐ（NanoDrop Technologies製）に１μｌアプライし、ＤＮＡ濃度を測定した。残りの溶液を２００μｌピペットマンで全量吸い、ダイヤルを回して空気を抜くことで、体積を測定した。これらの結果をもとに、ＤＮＡ濃度が２００ｎｇ／μｌ（測定結果が２００ｎｇ／μｌ以下の場合は１００ｎｇ／μｌ）にするために必要な滅菌水の量を計算して加え、希釈した。
【0167】
［２．１１ シーケンス解析］
［２．１１．１ ＡＢＩシーケンスによる解析］
［２．１１．１．１ サイクルシーケンス反応］
プラスミド４００ｎｇ、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Applied Biosystems製）１．０μｌ、５×Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Applied Biosystems製）１．５μｌ、３．２μＭプライマー１．０μｌ、全量が１０μｌとなるように滅菌水を混合した。サーマルサイクラーを用いて、９６℃で１分間のプレヒートの後、９６℃で１０秒間の熱変性、５０℃で５秒間のアニーリング、６０℃で４分間の伸長反応、を２５サイクル行い、４℃で保存した。
［２．１１．１ ＡＢＩシーケンスによる解析］
［２．１１．１．１ サイクルシーケンス反応］
プラスミド４００ｎｇ、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Applied Biosystems製）１．０μｌ、５×Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Applied Biosystems製）１．５μｌ、３．２μＭプライマー１．０μｌ、全量が１０μｌとなるように滅菌水を混合した。サーマルサイクラーを用いて、９６℃で１分間のプレヒートの後、９６℃で１０秒間の熱変性、５０℃で５秒間のアニーリング、６０℃で４分間の伸長反応、を２５サイクル行い、４℃で保存した。
【0168】
［２．１１．１．２ サイクルシーケンス反応物の精製］
この操作は、なるべく遮光しながら行った。操作の直前に３ｍＭ酢酸ナトリウムと５００ｍＭＥＤＴＡとを混合し、１．５ｍＭ酢酸ナトリウム／２５０ｍＭＥＤＴＡを作製した。サイクルシーケンス反応物（１０μｌ）と、１．５ｍＭ酢酸ナトリウム／２５０ｍＭＥＤＴＡ１．０μｌを混合した。１００％エタノール４０μｌ加え、ボルテックスで懸濁した。室温で１５分間静置し、２０℃、１４，５００ｒｐｍで１５分間遠心した。デカントで上清を捨て、７０％エタノール１００μｌを加えて転倒混和し、２０℃、１４，５００ｒｐｍで５分間遠心した。デカントで上清を捨て、再び７０％エタノール１００μｌを加えて転倒混和し、２０℃、１４，５００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を丁寧に取り除き、１０分間程度真空乾燥させた。
この操作は、なるべく遮光しながら行った。操作の直前に３ｍＭ酢酸ナトリウムと５００ｍＭＥＤＴＡとを混合し、１．５ｍＭ酢酸ナトリウム／２５０ｍＭＥＤＴＡを作製した。サイクルシーケンス反応物（１０μｌ）と、１．５ｍＭ酢酸ナトリウム／２５０ｍＭＥＤＴＡ１．０μｌを混合した。１００％エタノール４０μｌ加え、ボルテックスで懸濁した。室温で１５分間静置し、２０℃、１４，５００ｒｐｍで１５分間遠心した。デカントで上清を捨て、７０％エタノール１００μｌを加えて転倒混和し、２０℃、１４，５００ｒｐｍで５分間遠心した。デカントで上清を捨て、再び７０％エタノール１００μｌを加えて転倒混和し、２０℃、１４，５００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を丁寧に取り除き、１０分間程度真空乾燥させた。
【0169】
［２．１１．１．３ ホルムアミド処理とＡＢＩシーケンス解析］
精製して真空乾燥させたサイクルシーケンス反応物に、Ｈｉ－Ｄｉホルムアミド２０μｌを加えた。そのうちの１０μｌを９６ウェル－プレートに分注し、サーマルサイクラーを用いてプレートごと９５℃で２分間インキュベートして氷冷した。尚、ヒートブロックを用いて先に熱処理を行ってからプレートに分注した場合がある。プレートを氷冷・遮光しながら遺伝子実験施設に運び、ジェネティックアナライザ３１３０×１（Applied Biosystems製）にかけ、シーケンス解析を行った。
精製して真空乾燥させたサイクルシーケンス反応物に、Ｈｉ－Ｄｉホルムアミド２０μｌを加えた。そのうちの１０μｌを９６ウェル－プレートに分注し、サーマルサイクラーを用いてプレートごと９５℃で２分間インキュベートして氷冷した。尚、ヒートブロックを用いて先に熱処理を行ってからプレートに分注した場合がある。プレートを氷冷・遮光しながら遺伝子実験施設に運び、ジェネティックアナライザ３１３０×１（Applied Biosystems製）にかけ、シーケンス解析を行った。
【0170】
［２．１１．２ 外注によるシーケンス解析］
プラスミド４００ ｎｇ、３．２μＭプライマー２．０μｌ、滅菌水１０μｌを９６ウェルプレートで混合し、ＦＡＳＭＡＣにシーケンス解析を依頼し、シーケンス解析を行った。
プラスミド４００ ｎｇ、３．２μＭプライマー２．０μｌ、滅菌水１０μｌを９６ウェルプレートで混合し、ＦＡＳＭＡＣにシーケンス解析を依頼し、シーケンス解析を行った。
【0171】
［３ ｓｇＲＮＡ２．０およびｄＣａｓ９、ならびに、ｓｇＲＮＡ２．０およびｄＣａｓ９－ＶＰ６４オールインワン発現ベクターの作製］
ｓｃａｆｆｏｌｄの領域にＭＳ２ステムループを有する複数のｓｇＲＮＡ発現カセットと－ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ９と転写活性化因子との融合体の発現カセットとが統合されたオールインワン発現ベクターを作製した（図３の（ａ））。
ｓｃａｆｆｏｌｄの領域にＭＳ２ステムループを有する複数のｓｇＲＮＡ発現カセットと－ｄＣａｓ９またはｄＣａｓ９と転写活性化因子との融合体の発現カセットとが統合されたオールインワン発現ベクターを作製した（図３の（ａ））。
【0172】
［３．１ ＳＴＥＰ１用 ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４およびｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－２～７の作製］
〔３．１．１ ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎの作製〕
通常のｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および２を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－１×２、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５８７６６）から、インバースＰＣＲにより増幅した、Ｃａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および２を有するベクター側のテンプレートと、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡの発現カセットを有するプラスミド（ｓｇＲＮＡ（ＭＳ２） ｃｌｏｎｉｎｇ ｂａｃｋｂｏｎｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６１４２４））から、ＰＣＲにより増幅した、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡの発現カセットを有するインサート側のテンプレートを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）により連結し、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および２を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×２）を作製した。上記で作製したｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×２から、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩにより切り出した、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡの発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１を有するベクター側のテンプレートと、通常のｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および３、４、５、６、または７を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－１×３～７、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５８７６７～５８７７１）から、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩにより切り出した、Ｃａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列３、４、５、６、または７を有するインサート側のテンプレートを、ライゲーションにより連結し、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および３、４、５、６、または７を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×３～７）を作製した。
〔３．１．１ ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎの作製〕
通常のｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および２を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－１×２、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５８７６６）から、インバースＰＣＲにより増幅した、Ｃａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および２を有するベクター側のテンプレートと、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡの発現カセットを有するプラスミド（ｓｇＲＮＡ（ＭＳ２） ｃｌｏｎｉｎｇ ｂａｃｋｂｏｎｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６１４２４））から、ＰＣＲにより増幅した、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡの発現カセットを有するインサート側のテンプレートを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）により連結し、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および２を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×２）を作製した。上記で作製したｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×２から、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩにより切り出した、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡの発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１を有するベクター側のテンプレートと、通常のｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および３、４、５、６、または７を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－１×３～７、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５８７６７～５８７７１）から、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩにより切り出した、Ｃａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列３、４、５、６、または７を有するインサート側のテンプレートを、ライゲーションにより連結し、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および３、４、５、６、または７を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×３～７）を作製した。
【0173】
〔３．１．２ ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４の作製〕
通常のｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および５を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－ｄＣａｓ９－１×５、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６３５９９）をインバースＰＣＲすることにより、ｄＣａｓ９の下流側を開いたベクター側のテンプレートに、ＶＰ６４配列をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）によって連結し、通常のｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および５を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－１×５－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）を作製した。上記で作製したｐＸ３３０Ａ－１×５－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４を、ＢｓａＩの切断配列２、３、４、６、または７を有する配列を５’側に付加したプライマーを用いて、ＢｓａＩの切断配列５を除くようなインバースＰＣＲによって開き、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）により自己閉環させ、通常のｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および２、３、４、６、または７を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－１×２～４、６、７－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）を作製した。上記で作製したｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１ｘ２から、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより切り出した、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡの発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１を有するベクター側のテンプレートと、上記で作製したｐＸ３３０Ａ－１×２～７－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４から、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより切り出した、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列２、３、４、５、６、または７を有するインサート側のテンプレートを、ライゲーションによって連結し、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および２、３、４、５、６、または７を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×２～７－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）を作製した。
通常のｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および５を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－ｄＣａｓ９－１×５、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６３５９９）をインバースＰＣＲすることにより、ｄＣａｓ９の下流側を開いたベクター側のテンプレートに、ＶＰ６４配列をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）によって連結し、通常のｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および５を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－１×５－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）を作製した。上記で作製したｐＸ３３０Ａ－１×５－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４を、ＢｓａＩの切断配列２、３、４、６、または７を有する配列を５’側に付加したプライマーを用いて、ＢｓａＩの切断配列５を除くようなインバースＰＣＲによって開き、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）により自己閉環させ、通常のｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および２、３、４、６、または７を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－１×２～４、６、７－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）を作製した。上記で作製したｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１ｘ２から、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより切り出した、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡの発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１を有するベクター側のテンプレートと、上記で作製したｐＸ３３０Ａ－１×２～７－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４から、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより切り出した、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列２、３、４、５、６、または７を有するインサート側のテンプレートを、ライゲーションによって連結し、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列１および２、３、４、５、６、または７を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×２～７－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４）を作製した。
【0174】
〔３．１．３ ｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－２～７の作製〕
通常のｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列２を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ｓ－２、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５８７７８）からＰＣＲ増幅した、Ｃａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列を有するベクター側のテンプレートと、ｓｇＲＮＡ（ＭＳ２） ｃｌｏｎｉｎｇ ｂａｃｋｂｏｎｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６１４２４）からＰＣＲ増幅した、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡの発現カセットを有するインサート側のテンプレートを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）によって連結し、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列２を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－２）を作製した。上記で作製したｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－２を、ＢｓａＩの切断配列３、４、５、６、または７を有する配列を５’側に付加したプライマーを用いて、ＢｓａＩの切断配列２を除くようなインバースＰＣＲによって開き、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）により自己閉環させ、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列３、４、５、６、または７を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－３～７）を作製した。
通常のｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列２を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ｓ－２、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５８７７８）からＰＣＲ増幅した、Ｃａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列を有するベクター側のテンプレートと、ｓｇＲＮＡ（ＭＳ２） ｃｌｏｎｉｎｇ ｂａｃｋｂｏｎｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６１４２４）からＰＣＲ増幅した、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡの発現カセットを有するインサート側のテンプレートを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）によって連結し、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列２を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－２）を作製した。上記で作製したｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－２を、ＢｓａＩの切断配列３、４、５、６、または７を有する配列を５’側に付加したプライマーを用いて、ＢｓａＩの切断配列２を除くようなインバースＰＣＲによって開き、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）により自己閉環させ、ＳｃａｆｆｏｌｄにＭＳ２ステムループを有するｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９－ＶＰ６４の発現カセットおよびＢｓａＩの切断配列３、４、５、６、または７を有するプラスミド（ｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－３～７）を作製した。
【0175】
［３．２ Ｗｅｂツールを活用したｓｇＲＮＡの設計］
ｓｇＲＮＡの設計を所望する範囲の塩基配列をＣＲＩＳＰＲ－Ｄｉｒｅｃｔ（https://crispr.dbcls.jp/）に入力し、候補となるｓｇＲＮＡを出力させた。それらがゲノム上のどの配列にどの程度作用しやすいかを、ＣＯＳＭＩＤ（https://crispr.bme.gatech.edu/）によって調べた。オフターゲット効果を回避するために、小さい値ほど作用しやすいことを示すパラメータが、標的以外の配列で０．５以上のものを採用した。
ｓｇＲＮＡの設計を所望する範囲の塩基配列をＣＲＩＳＰＲ－Ｄｉｒｅｃｔ（https://crispr.dbcls.jp/）に入力し、候補となるｓｇＲＮＡを出力させた。それらがゲノム上のどの配列にどの程度作用しやすいかを、ＣＯＳＭＩＤ（https://crispr.bme.gatech.edu/）によって調べた。オフターゲット効果を回避するために、小さい値ほど作用しやすいことを示すパラメータが、標的以外の配列で０．５以上のものを採用した。
【0176】
［３．３ ＳＴＥＰ１：各ｓｇＲＮＡ発現カセットの作製］
オールインワン発現ベクターに統合する各ｓｇＲＮＡ発現カセットを、まずは別々のベクター上で作製した。ｎ個のｓｇＲＮＡ発現カセットを連結させる場合、１個目のテンプレートを、上記の項目で作製したｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９、ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９－ＶＰＲおよび本発明者の研究室に既存のｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４に、２～ｎ個目のテンプレートを本発明者の研究室に既存のｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－２～ｎにそれぞれ挿入した。
オールインワン発現ベクターに統合する各ｓｇＲＮＡ発現カセットを、まずは別々のベクター上で作製した。ｎ個のｓｇＲＮＡ発現カセットを連結させる場合、１個目のテンプレートを、上記の項目で作製したｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９、ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９－ＶＰＲおよび本発明者の研究室に既存のｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４に、２～ｎ個目のテンプレートを本発明者の研究室に既存のｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－２～ｎにそれぞれ挿入した。
【0177】
［３．３．１ 標的配列のテンプレート用オリゴＤＮＡのアニーリング］
ｓｇＲＮＡの標的配列のテンプレート用に注文した、センス鎖とアンチセンス鎖のオリゴＤＮＡ（１００μＭ）各０．５μｌ、１０×アニーリングバッファー１．０μｌ、滅菌水８．０μｌを混合した。サーマルサイクラーを用いて、９５℃で５分間インキュベートした後、スロープ機能によって９０分かけて２５℃まで温度を下げ、２つのオリゴＤＮＡをアニーリングさせた。使用したオリゴＤＮＡの配列を表１に示す。
ｓｇＲＮＡの標的配列のテンプレート用に注文した、センス鎖とアンチセンス鎖のオリゴＤＮＡ（１００μＭ）各０．５μｌ、１０×アニーリングバッファー１．０μｌ、滅菌水８．０μｌを混合した。サーマルサイクラーを用いて、９５℃で５分間インキュベートした後、スロープ機能によって９０分かけて２５℃まで温度を下げ、２つのオリゴＤＮＡをアニーリングさせた。使用したオリゴＤＮＡの配列を表１に示す。
【0178】
【表1】
【0179】
［３．３．２ ｓｇＲＮＡ発現カセットへのテンプレートの挿入］
５０ｎｇ／μｌベクター０．３μｌ、アニーリングさせたオリゴＤＮＡ０．５μｌ、ＢｐｉＩ０．１μｌ、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ０．１μｌ、１０×Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ０．２μｌ、滅菌水０．８μｌを混合した。３７℃で５分間の制限酵素反応後、１６℃で１０分間のライゲーション反応を１サイクルとして、サーマルサイクラーを用いて３サイクル行い、４℃で保存した。反応液（２．０μｌ）に、ＢｐｉＩ０．１μｌ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ Ｇ０．２μｌを加え、サーマルサイクラーを用いて３７℃で６０分間インキュベートしてライゲーションが起こらなかったベクターを切断した。その後、８０℃で５分間インキュベートして酵素を失活させ、４℃で保存した。反応液を大腸菌に形質転換し、1つ目のテンプレートのものはＬＢ＋アンピシリンプレート上、２～ｎ個目のテンプレートのものはＬＢ＋スペクチノマイシンプレート上にコロニーを形成させた。コロニーをＬＢ培地に移してプラスミドを抽出した。
５０ｎｇ／μｌベクター０．３μｌ、アニーリングさせたオリゴＤＮＡ０．５μｌ、ＢｐｉＩ０．１μｌ、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ０．１μｌ、１０×Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ０．２μｌ、滅菌水０．８μｌを混合した。３７℃で５分間の制限酵素反応後、１６℃で１０分間のライゲーション反応を１サイクルとして、サーマルサイクラーを用いて３サイクル行い、４℃で保存した。反応液（２．０μｌ）に、ＢｐｉＩ０．１μｌ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ Ｇ０．２μｌを加え、サーマルサイクラーを用いて３７℃で６０分間インキュベートしてライゲーションが起こらなかったベクターを切断した。その後、８０℃で５分間インキュベートして酵素を失活させ、４℃で保存した。反応液を大腸菌に形質転換し、1つ目のテンプレートのものはＬＢ＋アンピシリンプレート上、２～ｎ個目のテンプレートのものはＬＢ＋スペクチノマイシンプレート上にコロニーを形成させた。コロニーをＬＢ培地に移してプラスミドを抽出した。
【0180】
［３．３．３ ＢｐｉＩ処理によるテンプレートの挿入の確認］
テンプレートを挿入したプラスミドまたは挿入前のプラスミドをＢｐｉＩで１時間処理し、反応液を１％のアガロースゲルで電気泳動した。ＢｐｉＩは、ＤＮＡの認識配列と切断箇所が異なり、テンプレート挿入後は、ＢｐｉＩの認識配列が失われるように設計されている。したがって、ＢｐｉＩによる切断が起こらないことで、テンプレートが挿入されたことを確認した。また、テンプレートを挿入する前のプラスミドがＢｐｉＩで切断されることで、制限酵素処理を正しく行えたことを確認した。
テンプレートを挿入したプラスミドまたは挿入前のプラスミドをＢｐｉＩで１時間処理し、反応液を１％のアガロースゲルで電気泳動した。ＢｐｉＩは、ＤＮＡの認識配列と切断箇所が異なり、テンプレート挿入後は、ＢｐｉＩの認識配列が失われるように設計されている。したがって、ＢｐｉＩによる切断が起こらないことで、テンプレートが挿入されたことを確認した。また、テンプレートを挿入する前のプラスミドがＢｐｉＩで切断されることで、制限酵素処理を正しく行えたことを確認した。
【0181】
［３．４ Ｇｏｌｄｅｎ－Ｇａｔｅ ＡｓｓｅｍｂｌｙによるｓｇＲＮＡ発現カセットの連結］
２個目以降のｓｇＲＮＡ発現カセットを、１個目のｓｇＲＮＡ発現カセットとｄＣａｓ９発現カセットとを有するベクター、および１個目のｓｇＲＮＡ発現カセットとｄＣａｓ９－Ｅｆｆｅｃｔｏｒ発現カセットとを有するベクターに挿入・統合した。
２個目以降のｓｇＲＮＡ発現カセットを、１個目のｓｇＲＮＡ発現カセットとｄＣａｓ９発現カセットとを有するベクター、および１個目のｓｇＲＮＡ発現カセットとｄＣａｓ９－Ｅｆｆｅｃｔｏｒ発現カセットとを有するベクターに挿入・統合した。
【0182】
［３．４．１ Ｇｏｌｄｅｎ－Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙおよび形質転換］
テンプレートを挿入した５ｎｇ／μｌのｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９（またはｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９ＶＰＲ）０．３μｌ、テンプレートを挿入した１００ｎｇ／μｌのｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－２～ｎ各０．３μｌ、ＢｓａＩ－ＨＦ０．２μｌ、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ０．２μｌ、１０×Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ０．４μｌ、全量が４．０μｌとなるように滅菌水を混合した。３７℃で５分間の制限酵素反応後、１６℃で１０分間のライゲーション反応を１サイクルとして、サーマルサイクラーを用いて、ｓｇＲＮＡ発現カセットを２個連結させる場合は６サイクル、４個連結させる場合は２５～３５サイクル行い、４℃で保存した。反応液を大腸菌に形質転換し、ＳＯＣ培地７５μｌ、ＩＰＴＧ５．０μｌ、ｘ－ｇａｌ２０μｌをあらかじめ塗り広げたＬＢ＋アンピシリンプレートに塗り広げ、３７℃で１６時間インキュベートした。
テンプレートを挿入した５ｎｇ／μｌのｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９（またはｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９ＶＰＲ）０．３μｌ、テンプレートを挿入した１００ｎｇ／μｌのｐＸ３３０Ｓ－ＭＳ２－２～ｎ各０．３μｌ、ＢｓａＩ－ＨＦ０．２μｌ、Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｓｅ０．２μｌ、１０×Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ０．４μｌ、全量が４．０μｌとなるように滅菌水を混合した。３７℃で５分間の制限酵素反応後、１６℃で１０分間のライゲーション反応を１サイクルとして、サーマルサイクラーを用いて、ｓｇＲＮＡ発現カセットを２個連結させる場合は６サイクル、４個連結させる場合は２５～３５サイクル行い、４℃で保存した。反応液を大腸菌に形質転換し、ＳＯＣ培地７５μｌ、ＩＰＴＧ５．０μｌ、ｘ－ｇａｌ２０μｌをあらかじめ塗り広げたＬＢ＋アンピシリンプレートに塗り広げ、３７℃で１６時間インキュベートした。
【0183】
［３．４．２ コロニーＰＣＲによる、ｓｇＲＮＡ発現カセットの連結の確認］
ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ＶＰＲ）は、大腸菌内でＬａｃＺ遺伝子を発現し、Ｘ－ｇａｌを含む培地からは青色のコロニーが形成される。一方、これにｓｇＲＮＡ発現カセットが挿入されると、ＬａｃＺ遺伝子が分断されて機能しなくなり、白色のコロニーが形成される。白色のコロニーに対し、ｓｇＲＮＡ発現カセットが並ぶ領域を挟むようなプライマーペアを用いて、アニーリング温度６６℃でコロニーＰＣＲを行い、１～１．８％のアガロースゲルで電気泳動した。そのバンドの長さから、目的の個数のｓｇＲＮＡ発現カセットが入っていることを確認した。確認できたクローンからプラスミドを抽出した。
ｐＸ３３０Ａ－ＭＳ２－１×ｎ－ｄＣａｓ９（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ＶＰＲ）は、大腸菌内でＬａｃＺ遺伝子を発現し、Ｘ－ｇａｌを含む培地からは青色のコロニーが形成される。一方、これにｓｇＲＮＡ発現カセットが挿入されると、ＬａｃＺ遺伝子が分断されて機能しなくなり、白色のコロニーが形成される。白色のコロニーに対し、ｓｇＲＮＡ発現カセットが並ぶ領域を挟むようなプライマーペアを用いて、アニーリング温度６６℃でコロニーＰＣＲを行い、１～１．８％のアガロースゲルで電気泳動した。そのバンドの長さから、目的の個数のｓｇＲＮＡ発現カセットが入っていることを確認した。確認できたクローンからプラスミドを抽出した。
【0184】
［４ ＭＳ２－２２ｓＴａｇ発現ベクターの作製］
［４．１ ＭＳ２－４×および８×２２ｓＴａｇ発現ベクターの作製］
まず、ＭＳ２に従来型のＳｕｎＴａｇが連結したものを発現するベクター（ＭＳ２－１０×ＳｕｎＴａｇ）を作製した。ＭＳ２－１０×ＳｕｎＴａｇベクターは、ＣＭＶプロモーターとｐｏｌｙＡ付加配列を有するベクター（ｐｔＣＭＶ－１３６／６３－ＶＲ－ＮＧ、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５０７００）に、コード配列としてＭＳ２部分をＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１＿ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６１４２３）より、１０×ＳｕｎＴａｇ部分をｐＨＲｄＳＶ４０－ｄＣａｓ９－１０ｘＧＣＮ４＿ｖ４－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６０９０３）よりそれぞれ増幅してＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）によって挿入することで作製した。その後、１０×ＳｕｎＴａｇの配列を、４×および８×２２ｓＴａｇの配列にそれぞれ置換した（図３の（ｂ））。
［４．１ ＭＳ２－４×および８×２２ｓＴａｇ発現ベクターの作製］
まず、ＭＳ２に従来型のＳｕｎＴａｇが連結したものを発現するベクター（ＭＳ２－１０×ＳｕｎＴａｇ）を作製した。ＭＳ２－１０×ＳｕｎＴａｇベクターは、ＣＭＶプロモーターとｐｏｌｙＡ付加配列を有するベクター（ｐｔＣＭＶ－１３６／６３－ＶＲ－ＮＧ、Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５０７００）に、コード配列としてＭＳ２部分をＭＳ２－Ｐ６５－ＨＳＦ１＿ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６１４２３）より、１０×ＳｕｎＴａｇ部分をｐＨＲｄＳＶ４０－ｄＣａｓ９－１０ｘＧＣＮ４＿ｖ４－Ｐ２Ａ－ＢＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６０９０３）よりそれぞれ増幅してＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）によって挿入することで作製した。その後、１０×ＳｕｎＴａｇの配列を、４×および８×２２ｓＴａｇの配列にそれぞれ置換した（図３の（ｂ））。
【0185】
［４．１．１ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）による、１０×ＳｕｎＴａｇ配列から４×２２ｓＴａｇおよび８×２２ｓＴａｇへの置換］
ＭＳ２－１０×ＳｕｎＴａｇから１０×ＳｕｎＴａｇの領域を除くようなプライマーを設計し、アニーリング温度６７℃、３５サイクルでインバースＰＣＲを行い、ベクター側の配列を増幅した。また、異なるプライマーの組み合わせにより、ＭＳ２－４×２２ｓＴａｇ用、ＭＳ２－８×２２ｓＴａｇの１～４番目用およびＭＳ２－８×２２ｓＴａｇの５～８番目用の計３種類のインサート配列を人工合成（ＩＤＴ、ｇＢｌｏｃｋ（登録商標））した４×２２ｓＴａｇから、アニーリング温度６３℃、２５サイクルでＰＣＲ増幅した。ＭＳ２－４×２２ｓＴａｇについては、５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｉｘ１．０μｌ、ベクター側ＤＮＡ溶液１．６μｌ、インサート側ＤＮＡ溶液１．６μｌを混合した。各反応液を電気泳動してバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出した。ＭＳ２－８×２２ｓＴａｇについては、５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｉｘ１．０μｌ、ベクター０．５μｌ、１～４番目のＴａｇのインサート３．０μｌ（バンドのシグナルが弱かったため、増量）、５～８番目のＴａｇのインサート０．５μｌを混合した。それぞれＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）反応を行い、大腸菌に形質転換した。使用したプライマーを表２に示す。
ＭＳ２－１０×ＳｕｎＴａｇから１０×ＳｕｎＴａｇの領域を除くようなプライマーを設計し、アニーリング温度６７℃、３５サイクルでインバースＰＣＲを行い、ベクター側の配列を増幅した。また、異なるプライマーの組み合わせにより、ＭＳ２－４×２２ｓＴａｇ用、ＭＳ２－８×２２ｓＴａｇの１～４番目用およびＭＳ２－８×２２ｓＴａｇの５～８番目用の計３種類のインサート配列を人工合成（ＩＤＴ、ｇＢｌｏｃｋ（登録商標））した４×２２ｓＴａｇから、アニーリング温度６３℃、２５サイクルでＰＣＲ増幅した。ＭＳ２－４×２２ｓＴａｇについては、５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｉｘ１．０μｌ、ベクター側ＤＮＡ溶液１．６μｌ、インサート側ＤＮＡ溶液１．６μｌを混合した。各反応液を電気泳動してバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出した。ＭＳ２－８×２２ｓＴａｇについては、５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｍｉｘ１．０μｌ、ベクター０．５μｌ、１～４番目のＴａｇのインサート３．０μｌ（バンドのシグナルが弱かったため、増量）、５～８番目のＴａｇのインサート０．５μｌを混合した。それぞれＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）反応を行い、大腸菌に形質転換した。使用したプライマーを表２に示す。
【0186】
【表2】
【0187】
［４．１．２ コロニーＰＣＲによるスクリーニング］
インサートの４×および８×２２ｓＴａｇは、似たような配列の繰り返しになっているため、組み換えによってＴａｇの数が変わる可能性がある。そのため、インサート領域を挟むようにベクター側に設計したプライマーペアを用い、アニーリング温度６０℃でコロニーＰＣＲを行った。２％のアガロースゲルで産物を電気泳動し、目的の長さとみられるバンドが得られたクローンからプラスミドを抽出した。
インサートの４×および８×２２ｓＴａｇは、似たような配列の繰り返しになっているため、組み換えによってＴａｇの数が変わる可能性がある。そのため、インサート領域を挟むようにベクター側に設計したプライマーペアを用い、アニーリング温度６０℃でコロニーＰＣＲを行った。２％のアガロースゲルで産物を電気泳動し、目的の長さとみられるバンドが得られたクローンからプラスミドを抽出した。
【0188】
［４．１．３ 制限酵素処理によるスクリーニング］
抽出したプラスミドをＳａｃＩ（ベクター側とインサート側の両方を切断）で一晩処理し、１．６％アガロースゲルで電気泳動して目的のバンドが出ていることを確認した。結果を図４に示す。
抽出したプラスミドをＳａｃＩ（ベクター側とインサート側の両方を切断）で一晩処理し、１．６％アガロースゲルで電気泳動して目的のバンドが出ていることを確認した。結果を図４に示す。
【0189】
［４．１．４ シーケンス解析によるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域およびインサートの配列の確認］
２箇所のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域からそれぞれ２００ｂｐ程度離れたベクター側の領域に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域に向かう方向のプライマーを設計し、シーケンス解析を行った。解析の結果、全てのサンプルにおいて、最後のＴａｇとＮＬＳ配列を繋ぐリンカーに５１ｂｐの挿入が入っていた。後に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）のプライマー設計を誤っていたことがわかり、これが原因と考えられた。しかし、５１ｂｐ内に終止コドンはなく、フレームシフトも起こらないため、機能性には影響しないと判断し、そのまま使用することにした。実際に使用したところ、機能性は確認できた。
２箇所のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域からそれぞれ２００ｂｐ程度離れたベクター側の領域に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域に向かう方向のプライマーを設計し、シーケンス解析を行った。解析の結果、全てのサンプルにおいて、最後のＴａｇとＮＬＳ配列を繋ぐリンカーに５１ｂｐの挿入が入っていた。後に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）のプライマー設計を誤っていたことがわかり、これが原因と考えられた。しかし、５１ｂｐ内に終止コドンはなく、フレームシフトも起こらないため、機能性には影響しないと判断し、そのまま使用することにした。実際に使用したところ、機能性は確認できた。
【0190】
［４．２ ＭＳ２－１６×および２４×２２ｓＴａｇ発現ベクターの作製］
上記項目のＭＳ２－８×２２ｓＴａｇに８×２２ｓＴａｇの配列を１個または２個挿入し、ＭＳ２－１６×および２４×２２ｓＴａｇを発現するベクターを作製した（図３（ｂ））。
上記項目のＭＳ２－８×２２ｓＴａｇに８×２２ｓＴａｇの配列を１個または２個挿入し、ＭＳ２－１６×および２４×２２ｓＴａｇを発現するベクターを作製した（図３（ｂ））。
【0191】
［４．２．１ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）による配列の挿入］
ベクター側の増幅には、ＭＳ２－８×２２ｓＴａｇの下流を開くようなプライマーを設計した。また、インサート側の増幅には、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）用の付加配列をつけて、ＭＳ２－８×２２ｓＴａｇから８×２２ｓＴａｇを増幅するためのプライマーを、ＭＳ２－１６×２２ｓＴａｇ用、ＭＳ２－２４×２２ｓＴａｇの９～１６番目用およびＭＳ２－２４×２２ｓＴａｇの１７～２４番目用にそれぞれ設計した。これらを用いて、アニーリング温度６７℃、２５サイクルでＰＣＲ増幅した。各反応液を電気泳動してバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出した。ＭＳ２－１６×２２ｓＴａｇについては、ベクター側溶液とインサート側溶液を体積比１：１、ＭＳ２－２４×２２ｓＴａｇについては、ベクター側溶液と２種類のインサート側溶液を２：１：１で混合し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）反応を行って大腸菌に形質転換した。
ベクター側の増幅には、ＭＳ２－８×２２ｓＴａｇの下流を開くようなプライマーを設計した。また、インサート側の増幅には、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）用の付加配列をつけて、ＭＳ２－８×２２ｓＴａｇから８×２２ｓＴａｇを増幅するためのプライマーを、ＭＳ２－１６×２２ｓＴａｇ用、ＭＳ２－２４×２２ｓＴａｇの９～１６番目用およびＭＳ２－２４×２２ｓＴａｇの１７～２４番目用にそれぞれ設計した。これらを用いて、アニーリング温度６７℃、２５サイクルでＰＣＲ増幅した。各反応液を電気泳動してバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出した。ＭＳ２－１６×２２ｓＴａｇについては、ベクター側溶液とインサート側溶液を体積比１：１、ＭＳ２－２４×２２ｓＴａｇについては、ベクター側溶液と２種類のインサート側溶液を２：１：１で混合し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）反応を行って大腸菌に形質転換した。
【0192】
［４．２．２ コロニーＰＣＲによるスクリーニング］
ＭＳ２－４×および８×２２ｓＴａｇと同様の手法で、コロニーＰＣＲを行った。１％のアガロースゲルで産物を電気泳動した。バンドが不明瞭であったため、目的の長さのバンドが出ている可能性のあるクローンからプラスミドを抽出した。
ＭＳ２－４×および８×２２ｓＴａｇと同様の手法で、コロニーＰＣＲを行った。１％のアガロースゲルで産物を電気泳動した。バンドが不明瞭であったため、目的の長さのバンドが出ている可能性のあるクローンからプラスミドを抽出した。
【0193】
［４．２．３ 制限酵素処理によるスクリーニング］
抽出したプラスミドをＮｏｔＩ（ｎ×２２ｓＴａｇの両側を切断）で一晩処理して１％のアガロースゲルで電気泳動し、目的のTagの数に一致する長さのバンドが出ていることを確認した（図４）。
抽出したプラスミドをＮｏｔＩ（ｎ×２２ｓＴａｇの両側を切断）で一晩処理して１％のアガロースゲルで電気泳動し、目的のTagの数に一致する長さのバンドが出ていることを確認した（図４）。
【0194】
［４．２．４ シーケンス解析によるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域の配列の確認］
最も３’側のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）配列は、ベクター側のプライマーを用いたシーケンス解析によって確認した。残り１箇所または２箇所のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域は、２２ｓＴａｇの繰り返し配列の中に存在する。そこで、８×２２ｓＴａｇ１個あたり２箇所で切断するＢｓｓＨＩＩで一晩処理して電気泳動し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域を含む長さのバンドを切り出してＤＮＡを抽出した。その中にはベクター内の複数箇所の断片が入っているが、すべて同じ配列であるため、まとめてシーケンス解析を行い、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）配列に変異がないことを確認した。また、読める範囲でその他の領域の配列も確認した。
最も３’側のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）配列は、ベクター側のプライマーを用いたシーケンス解析によって確認した。残り１箇所または２箇所のＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域は、２２ｓＴａｇの繰り返し配列の中に存在する。そこで、８×２２ｓＴａｇ１個あたり２箇所で切断するＢｓｓＨＩＩで一晩処理して電気泳動し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域を含む長さのバンドを切り出してＤＮＡを抽出した。その中にはベクター内の複数箇所の断片が入っているが、すべて同じ配列であるため、まとめてシーケンス解析を行い、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）配列に変異がないことを確認した。また、読める範囲でその他の領域の配列も確認した。
【0195】
［５ ＭＳ－ＥｆｆｅｃｔｏｒおよびｓｃＦｖ－Ｅｆｆｅｃｔｏｒ発現ベクターの作製］
ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１（Addgene #61423）をＣＭＶ発現ベクターにクローニングしてＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１の発現ベクターを作製した。ＣＭＶ発現ベクターにクローニングしたＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１のｐ６５－ＨＳＦ１を、ＶＰＲ（ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ）（Addgene #63798）に置換して、ＭＳ２－ＶＰＲの発現ベクターを作製した。ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＶＰ６４－ＧＢ１（Addgene #60904）をＣＭＶ発現ベクターにクローニングしてｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＶＰ６４－ＧＢ１の発現ベクターを作製した。ＣＭＶ発現ベクターにクローニングしたｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＶＰ６４－ＧＢ１のＶＰ６４を、ｐ６５－ＨＳＦ１およびＶＰＲにそれぞれ置換し、ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１－ＧＢ１およびｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＶＰＲ－ＧＢ１の発現ベクターを作製した（図３の（ｃ））。
ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１（Addgene #61423）をＣＭＶ発現ベクターにクローニングしてＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１の発現ベクターを作製した。ＣＭＶ発現ベクターにクローニングしたＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１のｐ６５－ＨＳＦ１を、ＶＰＲ（ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ）（Addgene #63798）に置換して、ＭＳ２－ＶＰＲの発現ベクターを作製した。ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＶＰ６４－ＧＢ１（Addgene #60904）をＣＭＶ発現ベクターにクローニングしてｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＶＰ６４－ＧＢ１の発現ベクターを作製した。ＣＭＶ発現ベクターにクローニングしたｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＶＰ６４－ＧＢ１のＶＰ６４を、ｐ６５－ＨＳＦ１およびＶＰＲにそれぞれ置換し、ｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１－ＧＢ１およびｓｃＦｖ－ｓｆＧＦＰ－ＶＰＲ－ＧＢ１の発現ベクターを作製した（図３の（ｃ））。
【0196】
【0197】
［６．１ 培養細胞からのゲノムの抽出］
［６．１．１ 細胞の回収］
上記のＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞の継代と同様の操作を遠心後の懸濁まで行った。懸濁液１０μｌを細胞計測スライドにアプライし、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒで細胞の濃度を測定した。後述のキットで処理の限界とされている５×１０６cells以下になるように、懸濁液を１．５ｍｌチューブにとり、２０℃、１，０００ｒｐｍで３分間遠心して上清を捨てた。ＰＢＳ（－）１ｍｌを加えて懸濁し、２０℃、１，０００ｒｐｍで３分間遠心して上清を捨てた。沈殿をＰＢＳ（－）２００μｌに懸濁した。
［６．１．１ 細胞の回収］
上記のＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞の継代と同様の操作を遠心後の懸濁まで行った。懸濁液１０μｌを細胞計測スライドにアプライし、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒで細胞の濃度を測定した。後述のキットで処理の限界とされている５×１０６cells以下になるように、懸濁液を１．５ｍｌチューブにとり、２０℃、１，０００ｒｐｍで３分間遠心して上清を捨てた。ＰＢＳ（－）１ｍｌを加えて懸濁し、２０℃、１，０００ｒｐｍで３分間遠心して上清を捨てた。沈殿をＰＢＳ（－）２００μｌに懸濁した。
【0198】
［６．１．２ ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Quiagen製）による、細胞からのゲノムの抽出］
細胞懸濁液にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Quiagen製）２０μｌとＢｕｆｆｅｒ ＡＬ（Quiagen製）２００μｌとを加え、ボルテックスで懸濁した。恒温槽を用いて、５６℃で１０分間インキュベートした。１００％ ＥｔＯＨ２００μｌを加えてボルテックスで懸濁し、２ｍｌコレクションチューブにセットされたカラム（ＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ、Quiagen製）にアプライした。２０℃、８，０００ｒｐｍで １分間遠心し、溶出液を捨てた。ＥｔＯＨを含むＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１（Quiagen製）５００μｌをカラムにアプライし、２０℃、８，０００ｒｐｍで１分間遠心して濾液を捨てた。ＥｔＯＨを含むＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２（Quiagen製）５００μlをカラムにアプライし、２０℃、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心し、濾液を捨てた。カラムに何もアプライせずに２０℃、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心し、メンブレンを乾燥させた。カラムを回収用の１．５ｍｌチューブに移してＢｕｆｆｅｒ ＡＥ（Quiagen製）５０μｌをアプライし、２０℃、８，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液をカラムに戻し、２０℃、８，０００ｒｐｍで１分間遠心した。上記のプラスミドの濃度調整と同様の手法でＤＮＡの濃度と体積の測定を行い、１００ｎｇ／μｌになるように滅菌水を加えて希釈した。
細胞懸濁液にＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Quiagen製）２０μｌとＢｕｆｆｅｒ ＡＬ（Quiagen製）２００μｌとを加え、ボルテックスで懸濁した。恒温槽を用いて、５６℃で１０分間インキュベートした。１００％ ＥｔＯＨ２００μｌを加えてボルテックスで懸濁し、２ｍｌコレクションチューブにセットされたカラム（ＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ、Quiagen製）にアプライした。２０℃、８，０００ｒｐｍで １分間遠心し、溶出液を捨てた。ＥｔＯＨを含むＢｕｆｆｅｒ ＡＷ１（Quiagen製）５００μｌをカラムにアプライし、２０℃、８，０００ｒｐｍで１分間遠心して濾液を捨てた。ＥｔＯＨを含むＢｕｆｆｅｒ ＡＷ２（Quiagen製）５００μlをカラムにアプライし、２０℃、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心し、濾液を捨てた。カラムに何もアプライせずに２０℃、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心し、メンブレンを乾燥させた。カラムを回収用の１．５ｍｌチューブに移してＢｕｆｆｅｒ ＡＥ（Quiagen製）５０μｌをアプライし、２０℃、８，０００ｒｐｍで１分間遠心した。濾液をカラムに戻し、２０℃、８，０００ｒｐｍで１分間遠心した。上記のプラスミドの濃度調整と同様の手法でＤＮＡの濃度と体積の測定を行い、１００ｎｇ／μｌになるように滅菌水を加えて希釈した。
【0199】
［６．２ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）による配列の置換］
ｐｍｉｎＣＭＶ－Ｌｕｃ２からｐｍｉｎＣＭＶの配列を除くようなプライマーにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）用の付加配列をつけたものを用い、アニーリング温度６２℃、３５サイクルでインバースＰＣＲを行い、ベクター側の配列を増幅した。また、標的遺伝子のプロモーター配列（最上流の標的配列から開始コドンの直上流まで）を増幅するプライマーを設計し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したゲノムから、アニーリング温度６８℃、３５サイクルでＰＣＲを行い、インサート側の配列を増幅した。各反応液を電気泳動してバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出した。ベクター側とインサート側のＤＮＡ溶液を混合してＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） 反応を行い、大腸菌に形質転換した。
ｐｍｉｎＣＭＶ－Ｌｕｃ２からｐｍｉｎＣＭＶの配列を除くようなプライマーにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）用の付加配列をつけたものを用い、アニーリング温度６２℃、３５サイクルでインバースＰＣＲを行い、ベクター側の配列を増幅した。また、標的遺伝子のプロモーター配列（最上流の標的配列から開始コドンの直上流まで）を増幅するプライマーを設計し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出したゲノムから、アニーリング温度６８℃、３５サイクルでＰＣＲを行い、インサート側の配列を増幅した。各反応液を電気泳動してバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出した。ベクター側とインサート側のＤＮＡ溶液を混合してＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） 反応を行い、大腸菌に形質転換した。
【0200】
［６．３ コロニーＰＣＲ によるスクリーニング］
ベクター側とインサート側に片方ずつ設計したプライマーペアを用いてコロニーＰＣＲを行った。産物を電気泳動し、目的の長さのバンドが出ていることを確認した。確認できたクローンからプラスミドを抽出した。
ベクター側とインサート側に片方ずつ設計したプライマーペアを用いてコロニーＰＣＲを行った。産物を電気泳動し、目的の長さのバンドが出ていることを確認した。確認できたクローンからプラスミドを抽出した。
【0201】
［６．４ 制限酵素処理によるスクリーニング］
pＣＤＨ１－Ｌｕｃ２はＥｃｏＴ１４Ｉ、ｐＲＡＮＫＬ－Ｌｕｃ２はＳａｃＩで処理し（いずれもベクター領域とインサート領域をそれぞれ１箇所以上切断）、反応液を電気泳動して目的の長さのバンドが出ていることを確認した。
pＣＤＨ１－Ｌｕｃ２はＥｃｏＴ１４Ｉ、ｐＲＡＮＫＬ－Ｌｕｃ２はＳａｃＩで処理し（いずれもベクター領域とインサート領域をそれぞれ１箇所以上切断）、反応液を電気泳動して目的の長さのバンドが出ていることを確認した。
【0202】
［６．５ シーケンス解析による配列の確認］
インサート領域を挟むようにベクター側に設計したプライマーから配列を読み、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域およびインサートの配列が正しいことを確認した。１塩基単位でデータベースと異なる配列が複数箇所見られたが、標的とする場所ではないため、そのまま用いることにした。
インサート領域を挟むようにベクター側に設計したプライマーから配列を読み、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）領域およびインサートの配列が正しいことを確認した。１塩基単位でデータベースと異なる配列が複数箇所見られたが、標的とする場所ではないため、そのまま用いることにした。
【0203】
［７ ルシフェラーゼレポーターアッセイ］
上記で構築したシステムが機能しているかどうかをルシフェラーゼレポーターアッセイによって調べた。
上記で構築したシステムが機能しているかどうかをルシフェラーゼレポーターアッセイによって調べた。
【0204】
［７．１ 細胞へのトランスフェクション］
６で作製したルシフェラーゼレポーターベクター１００ｎｇ、補正用のＲ－Ｌｕｃ発現ベクター２０ｎｇと、構築したシステムの発現ベクターの全量１００ｎｇとを、１．２の手法で、６．０×１０４細胞に導入した。
６で作製したルシフェラーゼレポーターベクター１００ｎｇ、補正用のＲ－Ｌｕｃ発現ベクター２０ｎｇと、構築したシステムの発現ベクターの全量１００ｎｇとを、１．２の手法で、６．０×１０４細胞に導入した。
【0205】
［７．２ Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Promega製）による活性の測定］
培養プレートの各ウェルの培地１５０μｌのうち７５μｌを除去し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（Promega製）中）７５μｌを加えた。遮光して１０分間以上静置し、ＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ９４１ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｋｒｏｐｌａｔｔｅｎｌｅｓｅｒ（Berthold Technologies製）を用いてルシフェラーゼの活性を測定した。続いてＲ－Ｌｕｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ ％ Ｇｌｏ（登録商標）ｂｕｆｆｅｒ（Promega製）中）を７５μｌ加えて遮光しながら１０分間以上静置した。その後、ＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ９４１でＲ－Ｌｕｃの活性を測定し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの活性を補正した。
培養プレートの各ウェルの培地１５０μｌのうち７５μｌを除去し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（Promega製）中）７５μｌを加えた。遮光して１０分間以上静置し、ＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ９４１ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｍｉｋｒｏｐｌａｔｔｅｎｌｅｓｅｒ（Berthold Technologies製）を用いてルシフェラーゼの活性を測定した。続いてＲ－Ｌｕｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｓｔｏｐ ％ Ｇｌｏ（登録商標）ｂｕｆｆｅｒ（Promega製）中）を７５μｌ加えて遮光しながら１０分間以上静置した。その後、ＴｒｉＳｔａｒ ＬＢ９４１でＲ－Ｌｕｃの活性を測定し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの活性を補正した。
【0206】
［８ 内在遺伝子に対するｍＲＮＡ発現誘導の評価］
上記で構築したシステムの内在遺伝子座に対してのｍＲＮＡレベルでの転写誘導活性について、リアルタイムＰＣＲによる評価を行った。
上記で構築したシステムの内在遺伝子座に対してのｍＲＮＡレベルでの転写誘導活性について、リアルタイムＰＣＲによる評価を行った。
【0207】
［８．１ 細胞へのトランスフェクション］
上記で構築したシステムの発現ベクターの全量２００ｎｇを、１．２の手法で３．０×１０４細胞に導入した。
上記で構築したシステムの発現ベクターの全量２００ｎｇを、１．２の手法で３．０×１０４細胞に導入した。
【0208】
［８．２ ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（東洋紡製）による、細胞からのｃＤＮＡの合成］
［８．２．１ 細胞ライセートの作製］
９６ウェルプレートで培養中の細胞の培地を除き、ＰＢＳ１００μｌを入れた。ＰＢＳを吸引し、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（東洋紡製）４９．７μｌとｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡製）０．３μｌの混合液を加えて室温で５分間インキュベートし、細胞の破砕とゲノムＤＮＡの分解を行った。Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（東洋紡製）９．５μｌとＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡製）０．５μｌとの混合液を加えて溶解反応を止め、室温で２分間以上インキュベートし、氷上に置いた。
［８．２．１ 細胞ライセートの作製］
９６ウェルプレートで培養中の細胞の培地を除き、ＰＢＳ１００μｌを入れた。ＰＢＳを吸引し、Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（東洋紡製）４９．７μｌとｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡製）０．３μｌの混合液を加えて室温で５分間インキュベートし、細胞の破砕とゲノムＤＮＡの分解を行った。Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（東洋紡製）９．５μｌとＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡製）０．５μｌとの混合液を加えて溶解反応を止め、室温で２分間以上インキュベートし、氷上に置いた。
【0209】
［８．２．２ ＲＴ－ＰＣＲ］
５×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡製）８．０μｌ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ２４μｌ、ライセート８．０μｌを混合した。ｎｏ－ＲＴ Ｃｏｎｔｒｏｌをとる場合は、５×ｎｏ－ＲＴ８．０ μｌ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ２４μｌ、ライセート８．０μｌを混合した。サーマルサイクラーを用いて、３７℃で１５分間、５０℃で５分間、９８℃で５分間反応させ、４℃で保存した。その後、－２０℃に移した。
５×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡製）８．０μｌ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ２４μｌ、ライセート８．０μｌを混合した。ｎｏ－ＲＴ Ｃｏｎｔｒｏｌをとる場合は、５×ｎｏ－ＲＴ８．０ μｌ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ２４μｌ、ライセート８．０μｌを混合した。サーマルサイクラーを用いて、３７℃で１５分間、５０℃で５分間、９８℃で５分間反応させ、４℃で保存した。その後、－２０℃に移した。
【0210】
［８．３ リアルタイムＰＣＲ］
［８．３．１ 反応液の調製］
テンプレートは、Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｍｐｌｅ（検量線）、Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｓａｍｐｌｅ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌの３つに分けられる。Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｍｐｌｅには、その遺伝子がある程度発現している細胞のｃＤＮＡを用い、ない場合は最も発現が上昇すると期待されるサンプルのｃＤＮＡを用いた。２～１０分の１ずつ段階的に希釈し、６点プロットして検量線を作製した。Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｓａｍｐｌｅは、測定したいサンプルのｃＤＮＡを、ＣＴ値が検量線のプロットの中に収まるように、適宜ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを希釈して用いた。Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＣｏｎｔｒｏｌにはＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒおよびｎｏ－ＲＴ Ｃｏｎｔｒｏｌを用い、ｎｏ－ＲＴ ＣｏｎｔｒｏｌはＵｎｋｎｏｗｎ Ｓａｍｐｌｅと同じ倍率で希釈した。２×ＫＯＤ ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡製）１０μｌ、５０×Ｒｏｘ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（東洋紡製）０．４μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．２μｌ、テンプレート１．０μｌ、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ８．２μｌを混合した。使用したプライマーを表３に示す。
［８．３．１ 反応液の調製］
テンプレートは、Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｍｐｌｅ（検量線）、Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｓａｍｐｌｅ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌの３つに分けられる。Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｍｐｌｅには、その遺伝子がある程度発現している細胞のｃＤＮＡを用い、ない場合は最も発現が上昇すると期待されるサンプルのｃＤＮＡを用いた。２～１０分の１ずつ段階的に希釈し、６点プロットして検量線を作製した。Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｓａｍｐｌｅは、測定したいサンプルのｃＤＮＡを、ＣＴ値が検量線のプロットの中に収まるように、適宜ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを希釈して用いた。Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＣｏｎｔｒｏｌにはＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒおよびｎｏ－ＲＴ Ｃｏｎｔｒｏｌを用い、ｎｏ－ＲＴ ＣｏｎｔｒｏｌはＵｎｋｎｏｗｎ Ｓａｍｐｌｅと同じ倍率で希釈した。２×ＫＯＤ ＳＹＢＲ（登録商標）ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡製）１０μｌ、５０×Ｒｏｘ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ（東洋紡製）０．４μｌ、１０μＭフォワードおよびリバースプライマー各０．２μｌ、テンプレート１．０μｌ、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ８．２μｌを混合した。使用したプライマーを表３に示す。
【0211】
【表3】
【0212】
［８．３．２ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Applied Biosystems製）によるリアルタイムＰＣＲ］
９８℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、検討した温度で１０秒間のアニーリング、６８℃で３０秒間の伸長反応を４０サイクル行った。各サイクルにおいて、伸長反応時にインターカレーターの蛍光強度を測定した。４０サイクルの後、融解曲線分析を、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、９５℃で１５秒間の条件で行った。６０℃から９５℃へ温度を上げる過程で蛍光強度を段階的に測定することで、目的以外の配列が増幅されていないことを確認した。測定終了後、標的遺伝子の発現量をＩｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌのＲＰＬ８の発現量で割り、補正した。
９８℃で２分間のプレヒートの後、９８℃で１０秒間の熱変性、検討した温度で１０秒間のアニーリング、６８℃で３０秒間の伸長反応を４０サイクル行った。各サイクルにおいて、伸長反応時にインターカレーターの蛍光強度を測定した。４０サイクルの後、融解曲線分析を、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、９５℃で１５秒間の条件で行った。６０℃から９５℃へ温度を上げる過程で蛍光強度を段階的に測定することで、目的以外の配列が増幅されていないことを確認した。測定終了後、標的遺伝子の発現量をＩｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌのＲＰＬ８の発現量で割り、補正した。
【0213】
［９ 免疫染色］
ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞でのＣＤＨ１遺伝子について、上記で構築したシステムによってタンパク質（Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Abcam製（ab40772））が発現したかどうかを、免疫染色によって評価した。
ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞でのＣＤＨ１遺伝子について、上記で構築したシステムによってタンパク質（Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Abcam製（ab40772））が発現したかどうかを、免疫染色によって評価した。
【0214】
［９．１ 細胞へのトランスフェクション］
上記で構築したシステムの発現ベクターの全量２００ｎｇを、１．２の手法で６．０×１０４細胞に導入した。
上記で構築したシステムの発現ベクターの全量２００ｎｇを、１．２の手法で６．０×１０４細胞に導入した。
【0215】
［９．２ ９６ウェルプレートから２４ウェルプレートへの移動］
トランスフェクションから２４時間経過後、ウェルから培地を除き、０．２５％トリプシンを含むＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）５０μｌを加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで３分間反応させた。完全培地を１５０μｌ加えて反応を止め、あらかじめ３００μｌの完全培地を入れておいた２４ウェルプレートに全量を加えた。３７℃インキュベータに入れて培養した。また、２４時間経過後に培地を交換した。
トランスフェクションから２４時間経過後、ウェルから培地を除き、０．２５％トリプシンを含むＥＤＴＡ－ＰＢＳ（－）５０μｌを加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで３分間反応させた。完全培地を１５０μｌ加えて反応を止め、あらかじめ３００μｌの完全培地を入れておいた２４ウェルプレートに全量を加えた。３７℃インキュベータに入れて培養した。また、２４時間経過後に培地を交換した。
【0216】
［９．３ 免疫染色］
トランスフェクションから７２時間経過後、ウェルから培地を除去し、１×ＰＢＳ（－）１ｍｌで細胞を２回洗浄した。４％パラホルムアルデヒド２５０μｌを入れて１５分間静置し、細胞を固定した。１×ＰＢＳ（－）１ｍｌで３回洗浄し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ（－）２５０μｌを入れて２０分間静置し、細胞を透過処理した。１％ ＰＢＳ（－）で５回洗浄し、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ２５０μｌを入れて１時間静置し、ブロッキングした。一次抗体反応液（１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：１００）２００μｌを入れ、４℃で一晩反応させた。１×ＰＢＳ（－）で５分間×３回洗浄し、蛍光物質がコンジュゲートされた二次抗体の反応液（Ａｌｅｘａ６４７－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Thermo Fisher Scientific製）、ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：１，０００）２００μｌを入れ、室温で１時間反応させた。１×ＰＢＳ（－）で３回洗浄し、ＤＡＰＩ（１×ＰＢＳ（－）中、１：１００）２００μｌを入れ、室温で１５分間反応させた。１×ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。ＰＢＳが入っている状態で、ＯＬＹＭＰＵＳ ＦＶ－１０００共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
トランスフェクションから７２時間経過後、ウェルから培地を除去し、１×ＰＢＳ（－）１ｍｌで細胞を２回洗浄した。４％パラホルムアルデヒド２５０μｌを入れて１５分間静置し、細胞を固定した。１×ＰＢＳ（－）１ｍｌで３回洗浄し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ（－）２５０μｌを入れて２０分間静置し、細胞を透過処理した。１％ ＰＢＳ（－）で５回洗浄し、１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ２５０μｌを入れて１時間静置し、ブロッキングした。一次抗体反応液（１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：１００）２００μｌを入れ、４℃で一晩反応させた。１×ＰＢＳ（－）で５分間×３回洗浄し、蛍光物質がコンジュゲートされた二次抗体の反応液（Ａｌｅｘａ６４７－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Thermo Fisher Scientific製）、ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：１，０００）２００μｌを入れ、室温で１時間反応させた。１×ＰＢＳ（－）で３回洗浄し、ＤＡＰＩ（１×ＰＢＳ（－）中、１：１００）２００μｌを入れ、室温で１５分間反応させた。１×ＰＢＳ（－）で２回洗浄した。ＰＢＳが入っている状態で、ＯＬＹＭＰＵＳ ＦＶ－１０００共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【0217】
［１０ ウエスタンブロッティング］
上記で構築したシステムによって標的の遺伝子がタンパク質レベルで発現したかどうかを、ウエスタンブロッティングによって評価した。
上記で構築したシステムによって標的の遺伝子がタンパク質レベルで発現したかどうかを、ウエスタンブロッティングによって評価した。
【0218】
［１０．１ 細胞へのトランスフェクション］
９６ウェルプレートの４ウェル分を１つのサンプルの単位とした。１ウェルあたり、構築したシステムの発現ベクターの全量２００ｎｇを、１．２の手法で６．０×１０４細胞に導入した。
９６ウェルプレートの４ウェル分を１つのサンプルの単位とした。１ウェルあたり、構築したシステムの発現ベクターの全量２００ｎｇを、１．２の手法で６．０×１０４細胞に導入した。
【0219】
［１０．２ ９６ウェルプレートから６ウェルプレートへの移動］
トランスフェクションから２４時間経過後、８．２と同様の手法でウェルから細胞を剥がした。６ウェルプレートに完全培地を１．２ｍｌ入れ、９６ウェルプレートの４ウェル分の細胞懸濁液を加えた。３７℃インキュベータに入れて培養した。また、２４時間後に培地を交換した。
トランスフェクションから２４時間経過後、８．２と同様の手法でウェルから細胞を剥がした。６ウェルプレートに完全培地を１．２ｍｌ入れ、９６ウェルプレートの４ウェル分の細胞懸濁液を加えた。３７℃インキュベータに入れて培養した。また、２４時間後に培地を交換した。
【0220】
［１０．３ タンパク質サンプルの調製］
［１０．３．１ 細胞からのタンパク質の抽出］
トランスフェクションから７２時間経過後、ウェルから培地を除き、１×ＰＢＳ（－）１ｍｌで２回洗浄した。Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Roche製））６０μｌを入れ、セルスクレーパーで細胞を剥がし、１．５ｍｌチューブに回収した。チューブを氷冷しながら超音波を１０回フラッシュし、４℃、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を新しい１．５ｍｌチューブに回収し、－７０℃で保存した。
［１０．３．１ 細胞からのタンパク質の抽出］
トランスフェクションから７２時間経過後、ウェルから培地を除き、１×ＰＢＳ（－）１ｍｌで２回洗浄した。Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１×Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Roche製））６０μｌを入れ、セルスクレーパーで細胞を剥がし、１．５ｍｌチューブに回収した。チューブを氷冷しながら超音波を１０回フラッシュし、４℃、１２，０００ｒｐｍで１分間遠心した。上清を新しい１．５ｍｌチューブに回収し、－７０℃で保存した。
【0221】
［１０．３．２ タンパク質濃度の測定］
Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ溶液と５倍量のＭｉｌｌｉ－Ｑ水とを混合し、４℃、３，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清５００μｌとタンパク質溶液５μｌを混合して室温で５分間静置し、分光光度計で５９５ｎｍの吸光度を測定した。このとき、０．５μｇ／ｍｌまでの様々な濃度のＢＳＡを含むＰＢＳの吸光度も測定して検量線を作成した。また、タンパク質サンプルは検量線のプロットの範囲に収まるように適宜１×ＰＢＳ（－）で希釈して測定した。
Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ溶液と５倍量のＭｉｌｌｉ－Ｑ水とを混合し、４℃、３，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清５００μｌとタンパク質溶液５μｌを混合して室温で５分間静置し、分光光度計で５９５ｎｍの吸光度を測定した。このとき、０．５μｇ／ｍｌまでの様々な濃度のＢＳＡを含むＰＢＳの吸光度も測定して検量線を作成した。また、タンパク質サンプルは検量線のプロットの範囲に収まるように適宜１×ＰＢＳ（－）で希釈して測定した。
【0222】
［１０．４ ウエスタンブロッティング］
［１０．４．１ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ］
Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｇｅｌ ｂｕｆｆｅｒ（１０％ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、３８０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ＡＰＳ）を作製し、ＴＥＭＥＤ６．０μｌを加えてガラス板に流し込んだ。上から滅菌水１ｍｌを注いで空気との接触による重合阻害を防ぎ、室温で１時間または３７℃で１５分間静置し、４℃で一晩保存した。滅菌水を除いてＳｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ ｂｕｆｆｅｒ（４．９％ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ＡＰＳ）を作製し、ＴＥＭＥＤ８．０μｌを加えてＳｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌの上に流した。コームを挿入し、室温で１時間または３７℃で３０分間静置した。その間に、濃度を調製したタンパク質溶液に１／３倍量の４×サンプルバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８％ ＳＤＳ、４０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０２％ ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）、４０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール））を加え、ヒートブロックを用いて９８℃で５分間熱処理した。完成したゲルを、下層に１×ランニングバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％ ＳＤＳ）を適量入れた泳動装置に設置し、上層にも１×ランニングバッファーを入れた。コームを外してウェルを清掃し、目的に応じた量のタンパク質サンプルまたはタンパク質サイズマーカー２．５μｌをアプライした。また、空のレーンには４×サンプルバッファー２．５μｌをアプライした。泳動装置を電源装置に繋ぎ、定電流１０ｍＡ／ｇｅｌで１８０分間泳動した。
［１０．４．１ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ］
Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｇｅｌ ｂｕｆｆｅｒ（１０％ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、３８０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ＡＰＳ）を作製し、ＴＥＭＥＤ６．０μｌを加えてガラス板に流し込んだ。上から滅菌水１ｍｌを注いで空気との接触による重合阻害を防ぎ、室温で１時間または３７℃で１５分間静置し、４℃で一晩保存した。滅菌水を除いてＳｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ ｂｕｆｆｅｒ（４．９％ Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．１％ ＳＤＳ、０．１％ ＡＰＳ）を作製し、ＴＥＭＥＤ８．０μｌを加えてＳｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌの上に流した。コームを挿入し、室温で１時間または３７℃で３０分間静置した。その間に、濃度を調製したタンパク質溶液に１／３倍量の４×サンプルバッファー（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、８％ ＳＤＳ、４０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．０２％ ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）、４０ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール））を加え、ヒートブロックを用いて９８℃で５分間熱処理した。完成したゲルを、下層に１×ランニングバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１％ ＳＤＳ）を適量入れた泳動装置に設置し、上層にも１×ランニングバッファーを入れた。コームを外してウェルを清掃し、目的に応じた量のタンパク質サンプルまたはタンパク質サイズマーカー２．５μｌをアプライした。また、空のレーンには４×サンプルバッファー２．５μｌをアプライした。泳動装置を電源装置に繋ぎ、定電流１０ｍＡ／ｇｅｌで１８０分間泳動した。
【0223】
［１０．４．２ ＰＶＤＦメンブレンへのブロッティング］
ＰＶＤＦメンブレンを１００％メタノールに５分間浸し、続いて１×ブロッティングバッファー（４８ｍＭ Ｔｒｉｓ、３９ｍＭ グリシン、０．０３７％ ＳＤＳ、２７％ メタノール）に１０分間浸して活性化した。負電極の上に、１×ブロッティングバッファーで湿らせた濾紙３枚、活性化したＰＶＤＦメンブレン、泳動を終えたＳｅｐａｒａｔｉｏｎ ｇｅｌ、１×ブロッティングバッファーで湿らせた濾紙３枚の順にのせ、上から正電極をのせた。電極を電源装置に繋ぎ、定電流１５０ｍＡ／ｇｅｌで９０分間通電した。
ＰＶＤＦメンブレンを１００％メタノールに５分間浸し、続いて１×ブロッティングバッファー（４８ｍＭ Ｔｒｉｓ、３９ｍＭ グリシン、０．０３７％ ＳＤＳ、２７％ メタノール）に１０分間浸して活性化した。負電極の上に、１×ブロッティングバッファーで湿らせた濾紙３枚、活性化したＰＶＤＦメンブレン、泳動を終えたＳｅｐａｒａｔｉｏｎ ｇｅｌ、１×ブロッティングバッファーで湿らせた濾紙３枚の順にのせ、上から正電極をのせた。電極を電源装置に繋ぎ、定電流１５０ｍＡ／ｇｅｌで９０分間通電した。
【0224】
［１０．４．３ 抗体反応］
ブロッティングを終えたメンブレンを、５％のスキムミルクを含むＰＢＳに浸し、１時間振盪し、ブロッキングした。メンブレンを１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で２回リンスし、さらに１５分間×１回、５分間×２回振盪洗浄した。ハイブリバッグにメンブレンを挟み、一次抗体反応液（Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（東洋紡製）中、１：１０００）３ｍｌとともに封入した。４℃で一晩反応させた。翌日、メンブレンを１×ＰＢＳＴで５分間×３回振盪洗浄し、ハイブリバッグに挟んで二次抗体反応液（Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（東洋紡製）中、１：２５０）３ｍｌとともに封入した。室温で１時間反応させた。
ブロッティングを終えたメンブレンを、５％のスキムミルクを含むＰＢＳに浸し、１時間振盪し、ブロッキングした。メンブレンを１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）で２回リンスし、さらに１５分間×１回、５分間×２回振盪洗浄した。ハイブリバッグにメンブレンを挟み、一次抗体反応液（Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １（東洋紡製）中、１：１０００）３ｍｌとともに封入した。４℃で一晩反応させた。翌日、メンブレンを１×ＰＢＳＴで５分間×３回振盪洗浄し、ハイブリバッグに挟んで二次抗体反応液（Ｃａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２（東洋紡製）中、１：２５０）３ｍｌとともに封入した。室温で１時間反応させた。
【0225】
［１０．４．４ バンドの検出］
二次抗体反応を終えたメンブレンを１×ＰＢＳＴで５分間×３回振盪洗浄してパラフィルムの上に置き、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Thermo Scientific製）の反応混合液（Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＝１：１）２ｍｌをのせて５分間静置した。メンブレンをハイブリバッグに挟み、暗室でＸ線フィルム（富士フィルム製）に感光させ、現像液に浸した。バンドが見えてきたところで定着液に移し、フィルムが青くなったところで停止液に移した。感光する時間を変えながら、比較可能な強さのバンドになるまで何度か繰り返した。現像したフィルムをスキャナで読み込み、Ｉｍａｇｅ Ｊ（http://imagej.nih.gov/ij/）でバンドの強度を測定した。
二次抗体反応を終えたメンブレンを１×ＰＢＳＴで５分間×３回振盪洗浄してパラフィルムの上に置き、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Thermo Scientific製）の反応混合液（Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ＝１：１）２ｍｌをのせて５分間静置した。メンブレンをハイブリバッグに挟み、暗室でＸ線フィルム（富士フィルム製）に感光させ、現像液に浸した。バンドが見えてきたところで定着液に移し、フィルムが青くなったところで停止液に移した。感光する時間を変えながら、比較可能な強さのバンドになるまで何度か繰り返した。現像したフィルムをスキャナで読み込み、Ｉｍａｇｅ Ｊ（http://imagej.nih.gov/ij/）でバンドの強度を測定した。
【0226】
［１１ ＣＤＨ１遺伝子を標的とした第３世代の人工遺伝子発現増強システムの機能性検証］
本項の検証において、特別の断りがない限りは、上記１～９の項目において記載した方法により行った。
本項の検証において、特別の断りがない限りは、上記１～９の項目において記載した方法により行った。
【0227】
［１１．１ 検証－１］
本発明の一実施形態における第３世代システムの機能性検証のために、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ＭＳ２－４×２２ｓＴａｇ、およびｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１の３つのベクターの存在下／非存在下におけるアッセイを行った。また、ＣＤＨ１遺伝子のプロモーター領域を標的とし、図５の（ａ）および図１３に示すように５種類のｓｇＲＮＡを設計した。設計した５種類のｓｇＲＮＡを用いて、プラスミドベースのレポーターアッセイによる第１世代および第２世代の人工遺伝子発現増強システムとの機能性の比較を行った。細胞は、ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を用いた。結果を図６および図７に示す。
本発明の一実施形態における第３世代システムの機能性検証のために、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ＭＳ２－４×２２ｓＴａｇ、およびｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１の３つのベクターの存在下／非存在下におけるアッセイを行った。また、ＣＤＨ１遺伝子のプロモーター領域を標的とし、図５の（ａ）および図１３に示すように５種類のｓｇＲＮＡを設計した。設計した５種類のｓｇＲＮＡを用いて、プラスミドベースのレポーターアッセイによる第１世代および第２世代の人工遺伝子発現増強システムとの機能性の比較を行った。細胞は、ＭＩＡ－ＰａＣａ２細胞を用いた。結果を図６および図７に示す。
【0228】
ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ＭＳ２－４×２２ｓＴａｇ、およびｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１を全て含む第３世代の人工遺伝子発現増強システム（図１の（ｃ））は、ＭＳ２－４×２２ｓＴａｇおよびｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１を含む第１世代の人工遺伝子発現増強システム（図１の（ａ））ならびにＭＳ２－４×２２ｓＴａｇおよびｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１の替わりにＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１を含む第２世代の人工遺伝子発現増強システム（図１の（ｂ））と比較して、ルシフェラーゼの活性が高くなることが明らかとなった。すなわち、５つのｓｇＲＮＡであっても単一のｓｇＲＮＡのみであっても、第１世代および第２世代の人工遺伝子発現増強システムと比較して、遺伝子の発現を増強する効果が高くなることが明らかとなった。
【0229】
［１１．２ 検証－２］
続いて、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４と、２２ｓＴａｇの数を４、８、１６、２４にしたＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８、１６、２４）（図２の（ａ）～（ｄ））と、ｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１またはｓｃＦｖ－ＶＰＲとを用いて、１０．１と同様の方法で、レポーターアッセイを行った。構築したシステムの発現ベクターの全量を５０ｎｇおよび１００ｎｇとした。結果を図８および図１４に示す。
続いて、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４と、２２ｓＴａｇの数を４、８、１６、２４にしたＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８、１６、２４）（図２の（ａ）～（ｄ））と、ｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１またはｓｃＦｖ－ＶＰＲとを用いて、１０．１と同様の方法で、レポーターアッセイを行った。構築したシステムの発現ベクターの全量を５０ｎｇおよび１００ｎｇとした。結果を図８および図１４に示す。
【0230】
４種類のＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇの中で、ＭＳ２－８×２２ｓＴａｇが最もルシフェラーゼの活性が高かったため、遺伝子の発現を増強する効果が高くなることが明らかとなった。また、発現ベクターの量に関して、用量依存的に、遺伝子の発現増強効果が高まることが分かった。
【0231】
［１１．３ 検証－３］
ＣＤＨ１遺伝子の発現を、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によってｍＲＮＡレベルで確認した。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４と、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）またはＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１と、ｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１またはｓｃＦｖ－ＶＰＲとを用いた。ｓｇＲＮＡは、５種類全て用いた。結果を図９に示す。
ＣＤＨ１遺伝子の発現を、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によってｍＲＮＡレベルで確認した。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４と、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）またはＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１と、ｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１またはｓｃＦｖ－ＶＰＲとを用いた。ｓｇＲＮＡは、５種類全て用いた。結果を図９に示す。
【0232】
ｄＣａｓ９－ＶＰ６４のみを含む第１世代の人工遺伝子発現増強システムでは、ｍＲＮＡが殆ど発現していなかった。第１の転写活性化因子としてｐ６５－ＨＳＦ１を用いた場合、第２世代の人工遺伝子発現増強システムでは、構築した発現ベクターをトランスフェクションしていないポジティブコントロールと比較して、１．６倍程度のｍＲＮＡが発現していた。第３世代の人工遺伝子発現増強システムでは、ポジティブコントロールと比較して、２．７～３．７倍程度のｍＲＮＡが発現していた。第１の転写活性化因子としてＶＰＲを用いた場合、第２世代の人工遺伝子発現増強システムでは、ポジティブコントロールと比較して０．５倍程度のｍＲＮＡが発現していた。第３世代の人工遺伝子発現増強システムでは、ポジティブコントロールと比較して、１．７～２．２倍程度のｍＲＮＡが発現していた。したがって、ｍＲＮＡレベルからも、第３世代の人工遺伝子発現増強システムが、第１世代および第２世代の人工遺伝子発現増強システムと比較して、遺伝子の発現を増強する効果が高くなることが明らかとなった。
【0233】
【0234】
１０．３と同様のサンプルにおいて、免疫染色により、ＣＤＨ１遺伝子にコードされるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現状態を確認した。その結果、第３世代の人工遺伝子発現増強システムにおいて、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現が確認できた。
【0235】
また、１０．３と同様のサンプル（ＶＰＲを含むサンプル以外）において、ウエスタンブロッティングにより、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現状態を確認した（図１２および図１５）。その結果、第３世代の人工遺伝子発現増強システムにおいて、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現が確認できた。
【0236】
［１２ ＲＡＮＫＬ遺伝子を標的とした第３世代の人工遺伝子発現増強システムの機能性検証］
本項の検証において、特別の断りがない限りは、上記１～９の項目において記載した方法により行った。
本項の検証において、特別の断りがない限りは、上記１～９の項目において記載した方法により行った。
【0237】
［１２．１ 検証－５］
本発明の一実施形態における第３世代の人工遺伝子発現増強システムの優位性が、異なる標的遺伝子でもみられるかどうか、および、より少ない数のｓｇＲＮＡで内在遺伝子の発現を効率的に活性化させられるかを検証した。そのために、ＲＡＮＫＬ遺伝子のプロモーター領域を標的とし、図１８の（ａ）および図２１に示すように２種類のｓｇＲＮＡを設計した。設計した２種類のｓｇＲＮＡを用いて、プラスミドベースのレポーターアッセイによる第１世代および第２世代の人工遺伝子発現増強システムとの機能性の比較を行った。細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。標的とした遺伝子、ｓｇＲＮＡ、細胞を変更した以外は１０．２と同様にしてレポーターアッセイを行った。結果を図１９に示す。
本発明の一実施形態における第３世代の人工遺伝子発現増強システムの優位性が、異なる標的遺伝子でもみられるかどうか、および、より少ない数のｓｇＲＮＡで内在遺伝子の発現を効率的に活性化させられるかを検証した。そのために、ＲＡＮＫＬ遺伝子のプロモーター領域を標的とし、図１８の（ａ）および図２１に示すように２種類のｓｇＲＮＡを設計した。設計した２種類のｓｇＲＮＡを用いて、プラスミドベースのレポーターアッセイによる第１世代および第２世代の人工遺伝子発現増強システムとの機能性の比較を行った。細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いた。標的とした遺伝子、ｓｇＲＮＡ、細胞を変更した以外は１０．２と同様にしてレポーターアッセイを行った。結果を図１９に示す。
【0238】
また、標的とした遺伝子、ｓｇＲＮＡ、細胞を変更した以外は１０．３と同様にして定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によってｍＲＮＡの発現量を確認した。構築したシステムの発現ベクターの全量を５０ｎｇおよび１００ｎｇとした。結果を図２０および図２２に示す。
【0239】
ＲＡＮＫＬ遺伝子を標的とした場合であっても、ＣＤＨ１遺伝子を標的とした場合と同様に、第３世代の人工遺伝子発現増強システムが、第１世代および第２世代の人工遺伝子発現増強システムと比較して、遺伝子の発現を増強する効果が高くなることが明らかとなった。
【0240】
また、２種類のｓｇＲＮＡを用いた場合であっても、第３世代の人工遺伝子発現増強システムが、第１世代および第２世代の人工遺伝子発現増強システムと比較して、遺伝子の発現を増強する効果が高くなることが明らかとなった。
【0241】
さらに、発現ベクターの量に関して、用量依存的に、遺伝子の発現増強効果が高まることが分かった。
【0242】
［１２．２ 検証－６］
ｄＣａｓ９に２２ｓＴａｇを融合させた第２世代の他の人工遺伝子発現増強システムとの比較を行った。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４またはｄＣａｓ９－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）と、ＭＳ２－ＶＰ６４、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１またはＭＳ２－ＶＰＲと、ｓｃＦｖ－ＶＰ６４、ｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１またはｓｃＦｖ－ＶＰＲとを用いて、１１．１と同様にしてレポーターアッセイを行った。結果を図２３に示す。
ｄＣａｓ９に２２ｓＴａｇを融合させた第２世代の他の人工遺伝子発現増強システムとの比較を行った。ｄＣａｓ９－ＶＰ６４またはｄＣａｓ９－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）と、ＭＳ２－ＶＰ６４、ＭＳ２－ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）、ＭＳ２－ｐ６５－ＨＳＦ１またはＭＳ２－ＶＰＲと、ｓｃＦｖ－ＶＰ６４、ｓｃＦｖ－ｐ６５－ＨＳＦ１またはｓｃＦｖ－ＶＰＲとを用いて、１１．１と同様にしてレポーターアッセイを行った。結果を図２３に示す。
【0243】
ＶＰ６４、ｐ６５－ＨＳＦ１－ＶＰＲの３種類を用いて検討した結果、いずれの場合においても、ｄＣａｓ９に直接ｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）を融合させた場合よりも、ＭＳ２コートタンパク質を介してｎ×２２ｓＴａｇ（ｎ＝４、８）を融合した場合の方が高い活性を示した。したがって、第３世代の人工遺伝子発現増強システムがｄＣａｓ９に２２ｓＴａｇを融合させた第２世代の他の人工遺伝子発現増強システムと比較しても、遺伝子の発現を増強する効果が高くなることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0244】
本発明の第３世代のシステムは、標的遺伝子にエフェクタータンパク質を集積することができるため、医薬、農林水産、生命科学、生命工学、遺伝子治療などの分野に広く利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】