特許 7017704 生体膜ホスホイノシタイドの分離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-02-01

(45)【発行日】2022-02-09

(54)【発明の名称】生体膜ホスホイノシタイドの分離方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20220202BHJP

   B01J 20/285 20060101ALI20220202BHJP

   G01N 30/02 20060101ALI20220202BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20220202BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20220202BHJP

【ＦＩ】

G01N30/88 E

B01J20/285 N

G01N30/02 N

G01N30/06 E

G01N30/72 C

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2020545914

(86)(22)【出願日】2019-08-30

(86)【国際出願番号】 JP2019034134

(87)【国際公開番号】W WO2020054462

(87)【国際公開日】2020-03-19

【審査請求日】2020-12-15

(31)【優先権主張番号】P 2018168584

(32)【優先日】2018-09-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】100205981

【弁理士】

【氏名又は名称】野口 大輔

(72)【発明者】

【氏名】松本 恵子

(72)【発明者】

【氏名】嶋中 雄太

(72)【発明者】

【氏名】河野 望

(72)【発明者】

【氏名】新井 洋由

【審査官】高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１５－１９４３６３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０４－１３５４５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】田口 良，脂質メタボロームのための基盤技術の構築とその適用，国立研究開発法人 科学技術振興機構 ＣＲＥＳＴ平成21年度実績報告，日本，[オンライン]，2009年，P1-15,[検索日 2019.11.5]，https://www.jst.go.jp/kisoken/crest/report/heisei18/pdf/pdf08/08_1/002.pdf，インターネット:<URL:https://www.jst.go.jp/kisoken/crest/report/heisei18/pdf/pdf08/08_1/002.pdf>

【文献】高橋政友、その他，超臨界流体クロマトグラフィー／質量分析を用いたメタボリックプロファイリング，日本農薬学会誌，日本，[オンライン]，2016年，[検索日 2011.11.5],41(2)，P260-266，https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjpestics/41/2/41_W16-26/_pdf，インターネット:<URL:https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjpestics/41/2/41_W16-26/_pdf>

【文献】松原惇起,その他，メタボロミクスにおける超臨界クロマトグラフィーの可能性，公益社団法人 日本生物工学会[オンライン]，[検索日 2011.11.05]第10号，日本，2010年，P529-531，https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8810_tokushu_5.pdf，インターネット:<URL:https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8810_tokushu_5.pdf>

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３０／００－３０／９６

Ｂ０１Ｊ ２０／２８５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

β－シクロデキストリンを含む分離媒体が内部に充填された分離カラムを有する超臨界流体クロマトグラフの分析流路中に複数種類の生体膜ホスホイノシタイドを含む試料を注入し、超臨界流体クロマトグラフィーによって前記複数種類の生体膜ホスホイノシタイドを互いに分離する分離ステップを備える生体膜ホスホイノシタイドの分離方法。

【請求項2】

前記複数種類の生体膜ホスホイノシタイドが、生体膜ホスホイノシタイドの複数の異性体を含む、請求項１に記載の分離方法。

【請求項3】

前記複数の異性体が、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩ（３,４）Ｐ_２、ＰＩ（３,５）Ｐ_２、ＰＩ（４,５）Ｐ_２、ＰＩ（３,４,５）Ｐ_３のいずれかである、請求項２に記載の分離方法。

【請求項4】

前記分離ステップの前に、前記複数種類の生体膜ホスホイノシタイドのリン酸基をトリメチルシリル－ジアゾメタンによって誘導体化する誘導体化ステップを備え、
前記分離ステップの後、前記分離カラムで分離された前記複数種類の生体膜ホスホイノシタイドをそれぞれ質量分析計により検出する検出ステップを備えている、請求項１に記載の分離方法。

【請求項5】

前記分離ステップでは、ギ酸メタノール水溶液をモディファイアとして用いる、請求項１に記載の分離方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ホスファチジルイノシトールのイノシトール環の３，４，５位水酸基がリン酸化を受けたリン脂質である生体膜ホスホイノシタイドの分離方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

図１に示されているように、ホスホイノシタイド（以下、ＰＩＰｓ）には、リン酸化を受けた数や位置が互いに異なるＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩ（３,４）Ｐ_２、ＰＩ（３,５）Ｐ_２、ＰＩ（４,５）Ｐ_２、ＰＩ（３,４,５）Ｐ_３の７種が存在する。

【0003】

ジアシルグリセロール（ＤＧ）が同一である場合に、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐの３種、ＰＩ（３,４）Ｐ_２、ＰＩ（３,５）Ｐ_２、ＰＩ（４,５）Ｐ_２の３種はそれぞれ異性体であり同一の質量をもつため、７種のＰＩＰｓを個別に定量するためには、上記の異性体をクロマトグラフィーによって分離する必要がある。

【0004】

しかしながら、ＰＩＰｓの異性体をクロマトグラフィーによって分離するメソッドは確立されていない。そのため、これまでは、ＰＩＰｓの異性体を分離せずに一纏めで定量する方法や、ＰＩＰｓのジアシルグリセロールを切断（脱アシル化）し、イノシトール環部分を使って異性体を分離する方法が採られていた（非特許文献１、２を参照。）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】質量分析計を用いたイノシトールりん脂質の一斉定量分析法の開発 中西広樹、佐々木純子、佐々木雄彦ら 脂質生化学研究 Vol.54, P88-89, 2012

【文献】微量脂質成分測定のための質量分析技術の現状 田口良、中西広樹 実験医学 Vol.28, No.20（増刊）, 2010

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＰＩＰｓの異性体を分離せずに一纏めで定量する方法では、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）ＰをＰＩＰ_１として、ＰＩ（３,４）Ｐ_２、ＰＩ（３,５）Ｐ_２、ＰＩ（４,５）Ｐ_２をＰＩＰ_２として、ジアシルグリセロール（ＤＧ）の種類の違いごとの定量がなされる。そのため、異性体ごとの定量を行なうことができない。

【0007】

また、ＰＩＰｓを脱アシル化し、イノシトール環部分を使って異性体を分離する方法では、イノシトール環部分ごとの定量を行なうことができる一方で、ＤＧに関する情報を得ることができない。

【0008】

本発明の目的は、ＰＩＰｓを脱アシル化することなくＰＩＰｓの異性体を分離することが可能な分離方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、担体にβ－シクロデキストリンを結合させた分離媒体が充填された分離カラムを用いた超臨界流体クロマトグラフィーによって、脱アシル化を行なうことなくＰＩＰｓの異性体を分離することができることを見出した。これは、液体クロマトグラフィーに比べて分子形状認識能が高い超臨界クロマトグラフィーにおいて、分離媒体としてβ－シクロデキストリンを含むものを用いることで、図４に示されているように、ＰＩＰｓに対して疎水的相互作用、水素結合、包接、静電気的相互作用など複数種の作用が働き、これまで分離の困難であった非脱アシル化状態のＰＩＰｓの異性体が互いに分離されるものと考えられる。なお、図４のＲ_１はアルキル基と極性基からなるスペーサである。

【0010】

すなわち、本発明に係るＰＩＰｓの分離方法は、β－シクロデキストリンを含む分離媒体が内部に充填された分離カラムを有する超臨界流体クロマトグラフの分析流路中に複数種類のＰＩＰｓを含む試料を注入し、超臨界流体クロマトグラフィーによって前記複数種類のＰＩＰｓを互いに分離する分離ステップを備えているものである。

【0011】

したがって、本発明の分離方法は、ＰＩＰｓの複数の異性体を含む試料の分離に適している。

【0012】

前記複数の異性体とは、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩ（３,４）Ｐ_２、ＰＩ（３,５）Ｐ_２、ＰＩ（４,５）Ｐ_２、ＰＩ（３,４,５）Ｐ_３のいずれかである。

【0013】

前記分離ステップの前に、試料中に含まれる前記複数種類のＰＩＰｓのリン酸基をトリメチルシリル－ジアゾメタンによって誘導体化する誘導体化ステップを備え、前記分離ステップの後、前記分離カラムで分離された前記複数種類のＰＩＰｓをそれぞれ質量分析計により検出する検出ステップを備えていることが好ましい。そうすれば、β－シクロデキストリンを含む分離媒体が内部に充填された分離カラムを経て分離された異性体を含む各ＰＩＰｓを質量分析計によって定量分析することができるので、試料中に含まれる複数種類のＰＩＰｓの個別定量を実現することができる。

【0014】

前記分離ステップでは、ギ酸メタノール水溶液をモディファイアとして用いることができる。

【発明の効果】

【0015】

本発明に係るＰＩＰｓの分離方法は、β－シクロデキストリンを含む分離媒体が内部に充填された分離カラムを有する超臨界流体クロマトグラフの分析流路中に複数種類のＰＩＰｓを含む試料を注入し、超臨界流体クロマトグラフィーによって前記複数種類のＰＩＰｓを互いに分離する分離ステップを備えているので、脱アシル化を行なうことなくＰＩＰｓの異性体を分離することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ホスファチジルイノシトール及び各ＰＩＰｓの構造を示す構造式である。

【図2】超臨界流体クロマトグラフの構成を示す流路構成図である。

【図3】ＰＩＰｓの分離方法の一実施例を示すフローチャートである。

【図4】β－シクロデキストリンを含む分離媒体とＰＩＰｓとの間の相互作用を説明するための図である。

【図5】同実施例の分離方法によって得られた質量分析計の信号に基づくクロマトグラムの一例である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、図面を参照しながら、本発明に係るＰＩＰｓの分離方法の一実施例について説明する。

【0018】

この実施例の分離方法は超臨界流体クロマトグラフ（以下、ＳＦＣ）を用いて実施する。この実施例で用いるＳＦＣは、図２に示されているように、分析流路２中において二酸化炭素とモディファイアを送液するための送液ポンプ４、６と、二酸化炭素とモディファイアの混合流体が流れる分析流路２中に試料を注入するための試料注入部８と、試料注入部８により注入された試料を分離するための分離カラム１０と、少なくとも分離カラム１０を流れる二酸化炭素が超臨界状態となるように分析流路２内の圧力を所定圧力に制御する背圧制御器（ＢＰＲ）１２と、感度良く検出するためのメイクアップを送液するポンプ１５と、ＢＰＲ１２の後段側に設けられた質量分析計（ＭＳ）１４と、を備えている。

【0019】

図示は省略されているが、分離カラム１０はカラムオーブン内に収容されており、設定された温度に一定に制御される。分離カラム１０は、有機物を包接し得るシクロデキストリンがシリカ担体に結合されている分離媒体が充填されたものであり、例えば、信和化工株式会社製のＵＬＴＲＯＮ ＡＦ－ＨＩＬＩＣ－ＣＤを用いることができる。

【0020】

上記のＳＦＣで複数種類のＰＩＰｓを含む試料の分離分析を可能にするために、試料中のＰＩＰｓのリン酸基を誘導体化し、ＭＳ１４によって各ＰＩＰｓを検出可能な状態にする。

【0021】

誘導体化の処理は、例えば以下の（１）～（５）の手順により行なうことができる。
（１）ＰＩＰｓを含む試料溶液に２Ｍ トリメチルシリル－ジアゾメタンヘキサン溶液を添加する。
（２）２Ｍ トリメチルシリル－ジアゾメタンヘキサン溶液の添加された試料溶液を室温で一定時間（例えば１０分間）放置し、誘導体化反応を行なう。
（３）窒素雰囲気下で試料溶液に氷酢酸を添加し、誘導体化反応を停止させる。
（４）所定の洗浄液（例えば、クロロホルム：メタノール：水＝８：４：３の混合液）を試料溶液に添加して混合した後、遠心分離して下層を回収する。同様の洗浄を複数回繰り返してもよい。最後に試料溶液にメタノール：水＝９：１の溶液を添加する。
（５）窒素雰囲気下で試料溶液を乾固する。その後、試料に所定量のメタノールを添加し、超音波で溶解させる。さらに所定量の水を試料に添加する。

【0022】

上記のようなＰＩＰｓの誘導体化は、論文「Quantification of PtdInsP3 molecular species in cells and tissues by mass spectrometry Jonathan Clark, Karen E Anderson, Veronique Juvin, Trevor S Smith, Fredrik Karpe, Michael J O Wakelam, Len R Stephens & Phillip T Hawkins」に開示されている。

【0023】

超臨界流体クロマトグラフィーのモディファイアとしては、０．１％ギ酸メタノールと水の混合液（例えば、ギ酸メタノール：水＝９７．５：２．５）を用いることができる。また、モディファイアとしてギ酸又はギ酸アンモニウムを含むメタノール（例えば、０．１％ギ酸メタノール）を用いることができる。

【0024】

すなわち、この実施例のＰＩＰｓの分離方法は、図３のフローチャートに示されているように、上述の誘導体化処理を実施した後（ステップＳ１）、試料注入部８によって試料をＳＦＣの分析流路２中に注入し（ステップＳ２）、シクロデキストリンがシリカ担体に結合されている分離媒体が充填された分離カラム１０によってＰＩＰｓの異性体を分離する（ステップＳ３）。さらに、分離カラム１０で分離された各ＰＩＰｓを順次、ＭＳ１４に導入して検出する（ステップＳ４）。

【0025】

図５は、ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐ、ＰＩ（３,４）Ｐ_２、ＰＩ（３,５）Ｐ_２、ＰＩ（４,５）Ｐ_２、ＰＩ（３,４,５）Ｐ_３の７種のＰＩＰｓを含む試料を、上記実施例の方法を用いて分析して得られたクロマトグラムであり、横軸は時間、縦軸は信号強度である。この分析では、分離カラム１０として信和化工株式会社製のＵＬＴＲＯＮ ＡＦ－ＨＩＬＩＣ－ＣＤ（内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）を用い、分離カラム１０の設定温度を４℃とした。また、モディファイアとして０．１％ギ酸メタノールと水の混合液（例えば、ギ酸メタノール：水＝９７．５：２．５）を用い、移動相中におけるモディファイア濃度を、０－７分の時間帯で５％、７．０１－１０分の時間帯で３０％、１０．０１－１６分までの時間帯で５％と時間ごとに変化させた。移動相の流量を３ｍＬ／ｍｉｎ、メイクアップの流量を０．１ｍＬ／ｍｉｎとし、ＢＰＲ１２の設定圧力を１０ＭＰａとした。

【0026】

図５のクロマトグラムから、互いに異性体であるＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐの３種、ＰＩ（３,４）Ｐ_２、ＰＩ（３,５）Ｐ_２、ＰＩ（４,５）Ｐ_２の３種がそれぞれ分離していることがわかる。ＰＩ（３）Ｐ、ＰＩ（４）Ｐ、ＰＩ（５）Ｐの３種、ＰＩ（３,４）Ｐ_２、ＰＩ（３,５）Ｐ_２、ＰＩ（４,５）Ｐ_２の３種はそれぞれ同じ質量をもっているが、ＳＦＣによって分離されているため、各異性体をＭＳ１４によって個別に検出して定量することが可能である。

【0027】

以上のことから、シクロデキストリンがシリカ担体に結合されている分離媒体が充填された分離カラムをもつＳＦＣとＭＳとの組合せにより、７種のＰＩＰｓの個別定量が可能であることがわかる。

【符号の説明】

【0028】

２ 分析流路
４，６，１５ 送液ポンプ
８ 試料注入部
１０ 分離カラム
１２ 背圧制御器（ＢＰＲ）
１４ 質量分析計（ＭＳ）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】