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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-16
(45)【発行日】2022-02-25
(54)【発明の名称】試薬キット、測定キットおよび測定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/543 20060101AFI20220217BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220217BHJP
G01N 33/545 20060101ALI20220217BHJP
【ＦＩ】
G01N33/543 501M
G01N33/53 D
G01N33/545 A
G01N33/543 575
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2020506679
(86)(22)【出願日】2019-03-15
(86)【国際出願番号】 JP2019010920
(87)【国際公開番号】W WO2019177157
(87)【国際公開日】2019-09-19
【審査請求日】2020-08-17
(31)【優先権主張番号】P 2018049276
(32)【優先日】2018-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2019044833
(32)【優先日】2019-03-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】306037311
【氏名又は名称】富士フイルム株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】大内 亮
(72)【発明者】
【氏名】中村 和浩
【審査官】草川 貴史
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５３７０１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０７０１５００４（ＣＮ，Ａ）
【文献】特開２０１０－１９０８８０（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キットであって、前記非イオン性界面活性剤が、下記式（２）または下記式（３）で表される化合物である、試薬キット。【化1】
式中、Ｒ２１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８のうち少なくとも３つは水素原子である。
【請求項2】
前記第一の粒子が、ラテックス粒子である、請求項１に記載の試薬キット。
【請求項3】
前記第一の粒子の平均粒径が７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、請求項１又は２に記載の試薬キット。
【請求項4】
前記標識が蛍光色素を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項5】
前記第一の結合物質が抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項6】
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項7】
請求項１から６のいずれか一項に記載の試薬キットと、血清アミロイドＡまたは前記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む、血清アミロイドＡのための測定キット。
【請求項8】
前記基板に、血清アミロイドＡと結合性を有さず、前記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、請求項７に記載の測定キット。
【請求項9】
血清アミロイドＡを含む生体試料と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤とを含む混合液を調製する工程；血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、前記混合液を添加する工程；
前記混合液を前記基板上に流下させる工程；および、
前記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む、生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法であって、前記非イオン性界面活性剤が、下記式（２）または下記式（３）で表される化合物である、測定方法。
【化2】
式中、Ｒ２１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８のうち少なくとも３つは水素原子である。
【請求項10】
前記混合液中の前記非イオン性界面活性剤の濃度が０．０１質量％以上１０質量％以下である、請求項９に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
【請求項11】
前記混合液を調製する工程が、前記生体試料に対して５倍以上希釈された混合液を調製する工程である、請求項９または１０に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット、血清アミロイドＡのための測定キットおよび生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、バイオ測定等において、高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。この蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する検出対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射し、そのとき蛍光を検出することによって検出対象物質の存在を確認する方法である。また、検出対象物質が蛍光体ではない場合、蛍光色素で標識された検出対象物質と特異的に結合する物質を試料に接触させ、その後上記と同様にして蛍光を検出することにより、この結合すなわち検出対象物質の存在を確認することも広くなされている。
【0003】
また、このような蛍光検出法において、感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が特許文献１などに提案されている。これは、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを備え、支持体と金属膜との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させ、この励起光の照射により金属層に表面プラズモンを生じさせ、その電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）を向上させるものである。
【0004】
血清アミロイドＡ（Ｓｅｒｕｍ Ａｍｙｌｏｉｄ Ａ：ＳＡＡとも表記する）は、分子量約１１，６００の非常に疎水性の高いタンパク質で、生体に感染、腫瘍および外傷等の種々のストレスが加わり、それに起因して炎症が生じた際に、血中における濃度が鋭敏に増加するという性質をもっている。このため、しばしば炎症の程度を知るための炎症マーカーとして、血中のＳＡＡ濃度が免疫学的測定方法を用いて測定されている。
【0005】
しかし、ＳＡＡは疎水性が高いためか、通常血中ではほとんどが高比重リポタンパク質（ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＨＤＬ）と会合していることが知られている。ＳＡＡの抗原決定基はリポタンパク質の内部の外界と接触していない部分に隠されており、そのままでは抗体と反応できないことがある。したがって、免疫学的な測定に際して、隠れた抗原決定基を露出させるための前処理が必要となることが多い。例えば、特許文献２では免疫学的測定法の一工程である希釈工程における希釈液の成分として親水性アルコールを加えることで、高感度かつ高精度でＳＡＡを測定することを見出している。また、特許文献３には、高比重リポ蛋白質とＳＡＡを含む血清を非変性条件下でゲルろ過により分画して得ることができる分子量１０～４０ｋＤの分画に含まれるＳＡＡに反応する抗体が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２０１０－１９０８８０号公報
【文献】特開平８－１７８９２１号公報
【文献】特開平９－１０４６９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、特許文献２に記載された、親水性アルコールを加えることでＳＡＡを測定する場合には、揮発によりアルコール濃度が容易に変化し、ＳＡＡを正確に定量することができないという問題がある。また、特許文献３においては、特殊な抗体の精製方法が必要という問題がある。本発明は、消防法上の危険物でもあるアルコールを使用することなく、ＳＡＡを正確かつ高感度に免疫学的に測定するための試薬キット、測定キットおよび測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤とを組み合わせて使用することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0009】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］ 血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット。
［２］ 上記界面活性剤が、グルカミン骨格を有する化合物である、［１］に記載の試薬キット。
［３］ 上記界面活性剤が、下記式（１）で表される化合物である、［１］または［２］に記載の試薬キット。
式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうち少なくとも３つは水素原子である。Ｒ７は、置換されていてもよい炭化水素基を示す。
［１］ 血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キット。
［２］ 上記界面活性剤が、グルカミン骨格を有する化合物である、［１］に記載の試薬キット。
［３］ 上記界面活性剤が、下記式（１）で表される化合物である、［１］または［２］に記載の試薬キット。
【化1】
【0010】
［４］ 上記界面活性剤が、疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類である、［１］に記載の試薬キット。
［５］ 上記界面活性剤が、グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物である、［４］に記載の試薬キット。
［６］ 上記界面活性剤が、下記式（２）または下記式（３）で表される化合物である、［１］、［４］および［５］の何れか一に記載の試薬キット。
式中、Ｒ１１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のうち少なくとも３つは水素原子である。
式中、Ｒ２１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８のうち少なくとも３つは水素原子である。
［５］ 上記界面活性剤が、グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物である、［４］に記載の試薬キット。
［６］ 上記界面活性剤が、下記式（２）または下記式（３）で表される化合物である、［１］、［４］および［５］の何れか一に記載の試薬キット。
【化2】
式中、Ｒ２１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８のうち少なくとも３つは水素原子である。
【0011】
［７］ 上記第一の粒子が、ラテックス粒子である、［１］から［６］のいずれか一に記載の試薬キット。
［８］ 上記第一の粒子の平均粒径が７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、［１］から［７］のいずれか一に記載の試薬キット。
［９］ 上記標識が蛍光色素を含む、［１］から［８］のいずれか一に記載の試薬キット。
［１０］ 上記第一の結合物質が抗体である、［１］から［９］のいずれか一に記載の試薬キット。
［１１］ 血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子をさらに含む、［１］から［１０］のいずれか一に記載の試薬キット。
［８］ 上記第一の粒子の平均粒径が７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、［１］から［７］のいずれか一に記載の試薬キット。
［９］ 上記標識が蛍光色素を含む、［１］から［８］のいずれか一に記載の試薬キット。
［１０］ 上記第一の結合物質が抗体である、［１］から［９］のいずれか一に記載の試薬キット。
［１１］ 血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子をさらに含む、［１］から［１０］のいずれか一に記載の試薬キット。
【0012】
［１２］ ［１］から［１１］のいずれか一に記載の試薬キットと、血清アミロイドＡまたは上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む、血清アミロイドＡのための測定キット。
［１３］ 上記基板に、血清アミロイドＡと結合性を有さず、上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、［１２］に記載の測定キット。
［１３］ 上記基板に、血清アミロイドＡと結合性を有さず、上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されている、［１２］に記載の測定キット。
【0013】
［１４］ 血清アミロイドＡを含む生体試料と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤とを含む混合液を調製する工程；
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、上記混合液を添加する工程；
上記混合液を上記基板上に流下させる工程；および、
上記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む、生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法。
［１５］ 上記混合液中の上記界面活性剤の濃度が０．０１質量％以上１０質量％以下である、［１４］に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
［１６］ 上記混合液を調製する工程が、上記生体試料に対して５倍以上希釈された混合液を調製する工程である、［１４］または［１５］に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、上記混合液を添加する工程；
上記混合液を上記基板上に流下させる工程；および、
上記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む、生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法。
［１５］ 上記混合液中の上記界面活性剤の濃度が０．０１質量％以上１０質量％以下である、［１４］に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
［１６］ 上記混合液を調製する工程が、上記生体試料に対して５倍以上希釈された混合液を調製する工程である、［１４］または［１５］に記載の血清アミロイドＡの測定方法。
【発明の効果】
【0014】
本発明による試薬キット、測定キットおよび測定方法によれば、ＳＡＡを正確かつ高感度に免疫学的に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【発明を実施するための形態】
【0016】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
【0017】
［試薬キット］
本発明の試薬キットは、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キットである。
本発明の試薬キットは、上記の通り、第一の粒子と、非イオン性界面活性剤とを含むが、第一の粒子と非イオン性界面活性剤とは混合物としてキットに含まれていてもよいし、別々にキットに含まれていてもよい。
本発明の試薬キットは、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤とを含む、血清アミロイドＡの測定のための試薬キットである。
本発明の試薬キットは、上記の通り、第一の粒子と、非イオン性界面活性剤とを含むが、第一の粒子と非イオン性界面活性剤とは混合物としてキットに含まれていてもよいし、別々にキットに含まれていてもよい。
【0018】
（血清アミロイドＡ）
本発明における被検物質は、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）である。ＳＡＡは炎症マーカーとして有用である。血清アミロイドＡとしては、例えば、ネコ血清またはネコ血漿中の血清アミロイドＡを挙げることができる。
本発明における被検物質は、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）である。ＳＡＡは炎症マーカーとして有用である。血清アミロイドＡとしては、例えば、ネコ血清またはネコ血漿中の血清アミロイドＡを挙げることができる。
【0019】
（界面活性剤）
血清中ではＳＡＡの大部分が高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）と会合した状態で存在していることが知られている。そのため、血清アミロイドＡと結合性を有する第一の結合物質および第三の結合物質に対する血清アミロイドＡの認識部位がＨＤＬに遮蔽されており、第一の結合物質および第三の結合物質が血清アミロイドＡに結合できないという問題がある。本発明は、このような現象を解決するために、界面活性剤を用いて血清アミロイドＡをＨＤＬから解離させることにより、正確に血清中のＳＡＡを定量することが可能になる。
血清中ではＳＡＡの大部分が高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）と会合した状態で存在していることが知られている。そのため、血清アミロイドＡと結合性を有する第一の結合物質および第三の結合物質に対する血清アミロイドＡの認識部位がＨＤＬに遮蔽されており、第一の結合物質および第三の結合物質が血清アミロイドＡに結合できないという問題がある。本発明は、このような現象を解決するために、界面活性剤を用いて血清アミロイドＡをＨＤＬから解離させることにより、正確に血清中のＳＡＡを定量することが可能になる。
【0020】
本発明において使用する界面活性剤は、分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤の分子量が１０００を超えると、ＨＤＬと同じように検体として認識される部位を遮蔽してしまう場合があり、正確にＳＡＡの測定ができなくなる場合があることから、分子量が１０００以下の非イオン性界面活性剤を使用する。界面活性剤の分子量の下限は、好ましくは２００以上であり、より好ましくは３００以上である。界面活性剤の分子量の上限は、好ましくは９００以下であり、より好ましくは８００以下であり、さらに好ましくは７００以下であり、特に好ましくは６００以下である。
【0021】
本発明においては、結合物質の結合性に比較的影響を及ぼさない非イオン性界面活性剤を用いる。イオン性界面活性剤の場合には、生体試料中の電荷を有する基と相互作用することにより測定に影響を及ぼす場合があり、ＳＡＡを正確に測定することが難しくなることから、本発明においては非イオン性界面活性剤を用いる。非イオン性界面活性剤は、別の呼称として、ノニオン性界面活性剤と表記される場合がある。陰イオン系の界面活性剤はアニオン性界面活性剤、陽イオン系の界面活性剤はカチオン性界面活性剤、両性イオン系の界面活性剤はベタインと記載されることがある。本発明では、ノニオン性、即ち、非イオン性界面活性剤が用いられる。具体的な非イオン性界面活性剤としては、エステル型、エーテル型、エステルエーテル型またはアルカノールアミド型から選ばれる界面活性剤が好ましく、エーテル型またはアルカノールアミド型がより好ましい。
【0022】
界面活性剤としては、グルカミン骨格を有する化合物、特にはグルカミン骨格を有するアルカノールアミド型の界面活性剤が更に好ましい。グルカミン骨格を有するアルカノールアミド型の非イオン性界面活性剤の好ましい例としては、下記式（１）で表される化合物を挙げることができる。
式中、Ｒ１は、置換されていてもよい炭化水素基を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうち少なくとも３つは水素原子である。Ｒ７は、置換されていてもよい炭化水素基を示す。
【化3】
【0023】
式（１）で表される化合物のさらに好ましい例としては、さらに下記式（１Ａ）または下記式（１Ｂ）で表される化合物を挙げることができる。
【化4】
【化5】
【0024】
式中、Ｒ１およびＲ７は、式（１）における定義と同義である。
【0025】
式（１）、式（１Ａ）または式（１Ｂ）で表される化合物としては、以下の界面活性剤を使用することが好ましい。
ｎ－オクタノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（同仁化学社製ＭＥＧＡ－８）
ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（同仁化学社製ＭＥＧＡ－９）
ｎ－オクタノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（同仁化学社製ＭＥＧＡ－８）
ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（同仁化学社製ＭＥＧＡ－９）
【0026】
界面活性剤としては、疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類も好ましい。疎水性基を有する単糖類または疎水性基を有する二糖類としては、より好ましくは、グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物である。グルコース骨格またはマルトース骨格を有する化合物としては、下記式（２）または下記式（３）で表される化合物を挙げることができる。
式中、Ｒ１１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のうち少なくとも３つは水素原子である。
式中、Ｒ２１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８のうち少なくとも３つは水素原子である。
【化6】
式中、Ｒ２１は、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、置換されていてもよいアルキニルオキシ基、置換されていてもよいアルキルチオ基、置換されていてもよいアルケニルチオ基、置換されていてもよいアルキニルチオ基を示し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８はそれぞれ独立に、水素原子、または置換されていてもよい炭化水素基を示す。但し、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８のうち少なくとも３つは水素原子である。
【0027】
式（２）または式（３）で表される化合物のさらに好ましい例としては、さらに下記式（２Ａ）または下記式（３Ａ）で表される化合物を挙げることができる。
【化7】
【0028】
【化8】
【0029】
式（２Ａ）で表される化合物としては、以下の界面活性剤を使用することが好ましい。ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド（同仁化学社製Ｏ００１）。式（２Ａ）におけるＲ１１がオクチルオキシ基である化合物。
【0030】
式（３Ａ）で表される化合物としては、以下の界面活性剤を使用することが好ましい。ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製Ｄ３１６）
ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製Ｄ３８２）
ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製Ｄ３８２）
【0031】
炭化水素基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アルキルチオ基、アルケニルチオ基およびアルキニルチオ基はそれぞれ置換されていてもよいが、置換基としては、下記の置換基群Ａに記載の置換基が挙げられる。置換基群Ａの置換基は、置換基群Ａの置換基によりさらに置換されていてもよい。
置換基群Ａ：
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、およびトリアルキルシリル基（トリメチルシリル基等）。
置換基群Ａ：
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、およびトリアルキルシリル基（トリメチルシリル基等）。
【0032】
炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を挙げることができる。炭化水素基の炭素数は特に限定されないが、一般的には１～２０であり、好ましくは１～１６であり、より好ましくは１～１２である。
アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アルキルチオ基、アルケニルチオ基およびアルキニルチオ基の炭素数は特に限定されないが、一般的には１～２０であり、好ましくは１～１６であり、より好ましくは１～１２である。
アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アルキルチオ基、アルケニルチオ基およびアルキニルチオ基の炭素数は特に限定されないが、一般的には１～２０であり、好ましくは１～１６であり、より好ましくは１～１２である。
【0033】
（第一の結合物質）
本発明で用いる第一の結合物質は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗体を使用できるが、これに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する抗体として、例えば、血清アミロイドＡによって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
本発明で用いる第一の結合物質は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗体を使用できるが、これに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する抗体として、例えば、血清アミロイドＡによって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
【0034】
抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルのどちらも使用可能である。
【0035】
特に、静電相互作用により血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質としては、抗血清アミロイドＡ抗体が好ましく用いられる。本発明ではサンドイッチ方式を選択することが好ましく、この場合には、ペアとなる抗体を基板に被覆する必要があるが、基板および第一の粒子上の両方に、これらの抗ＳＡＡモノクローナル抗体を用いることが可能である。
【0036】
（第一の粒子）
本発明で用いる第一の粒子は、上記した第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する粒子である。
第一の粒子は、乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定はされない。第一の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第一の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
本発明で用いる第一の粒子は、上記した第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する粒子である。
第一の粒子は、乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定はされない。第一の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第一の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
【0037】
ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸またはメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
【0038】
第一の粒子は標識を有する。標識は、蛍光を発することが好ましい。重合により得られたラテックス自体が蛍光性である場合には、そのまま蛍光ラテックス粒子として使用することができる。重合により得られたラテックスが非蛍光性の場合には、ラテックスに蛍光物質（蛍光色素など）を添加することによって、蛍光ラテックス粒子を作製することができる。即ち、蛍光ラテックス粒子は、水および水溶性有機溶剤を含むラテックス粒子の溶液に蛍光色素を添加して攪拌することなどにより、蛍光色素をラテックス粒子の内部に含浸させることにより製造することが可能である。
【0039】
標識を有する第一の粒子としては、蛍光色素を含有したリポゾ－ムやマイクロカプセル等を蛍光粒子として使用することもできる。蛍光発色は、紫外光等を吸収して励起し、基底状態に戻る際に放出されるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、黄緑（励起波長５０５ｎｍ／放出波長５１５ｎｍ、以下同じ）、青（３５０～３５６ｎｍ／４１５～４４０ｎｍ）、赤（５３５～５８０ｎｍ／５７５～６０５ｎｍ）、オレンジ（５４０ｎｍ／５６０ｎｍ）、レッド・オレンジ（５６５ｎｍ／５８０ｎｍ）、クリムゾン（６２５ｎｍ／６４５ｎｍ）、ダークレッド（６６０ｎｍ／６８０ｎｍ）などの蛍光発色が用いられ得る。これらの蛍光を発する蛍光粒子は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能であり、同社においてＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）の商品名で市販されている。
【0040】
標識を有する第一の粒子の粒径は、平均粒径として定義される。第一の粒子の平均粒径は、特に限定されず、好ましい範囲は、粒子の材質や血清アミロイドＡを定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、７０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることがより好ましく、８０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下であることがさらに好ましく、９０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが特に好ましい。
【0041】
本発明に用いられる粒子の平均粒径は、市販の粒度分布計等で計測することが可能である。粒度分布の測定法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されているが、これらの測定法の中で、動的光散乱法で計測することが好ましく、本発明では、平均粒径は、２５℃にて、粘度０．８８７２ＣＰ（０．８８７２ｍＰａ・ｓ）、水の屈折率１．３３０の条件で測定したメジアン径（５０％径、ｄ５０）として求めるものとする。
【0042】
本発明で用いる第一の粒子は、上記した第一の結合物質により修飾されている。標識を有する第一の粒子に、第一の結合物質を結合するための方法は特に限定されない。例えば、特開２０００－２０６１１５号公報やモレキュラープローブ社ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアＦ８８１３に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、抗体などの結合物質を粒子に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、および共有結合による化学結合を用いた方法、のいずれの方法も採用可能である。抗体などの結合物質を粒子に固定させた後に結合物質が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
【0043】
（第二の結合物質）
本発明の試薬キットはさらに、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子を含んでいてもよい。
血清アミロイドＡを含む陽性となる被検試料だけでなく、血清アミロイドＡを含まない陰性の被検試料に対しても反応して陽性となる被検試料が存在しており、擬陽性の解決が課題として認識されている。このような擬陽性を示す原因は明確にはなっていないが、血清中に含まれる何らかの因子が存在して非特異反応を起こすことが原因の一つではないかと考えられている。本発明では、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子を併用することで、このような問題を解決することが好ましい。
本発明の試薬キットはさらに、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子を含んでいてもよい。
血清アミロイドＡを含む陽性となる被検試料だけでなく、血清アミロイドＡを含まない陰性の被検試料に対しても反応して陽性となる被検試料が存在しており、擬陽性の解決が課題として認識されている。このような擬陽性を示す原因は明確にはなっていないが、血清中に含まれる何らかの因子が存在して非特異反応を起こすことが原因の一つではないかと考えられている。本発明では、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾され、かつ標識を有しない第二の粒子を併用することで、このような問題を解決することが好ましい。
【0044】
第二の結合物質としては、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有さない物質を使用することができ、上記したような擬陽性を示す原因物質に結合する可能性のある物質を使用することが好ましく、さらに第一の結合物質に対して親和性を有しない化合物を使用することが好ましい。第二の結合物質としては、抗体、あるいは抗体に対して結合するタンパク質（Protein A、Protein G）などを使用することができ、抗体が好ましい。例えば、第二の結合物質が抗体である場合には、その抗原によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることが可能である。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体も使用可能である。本発明では、第二の結合物質として、特に抗ＣＲＰ抗体を使用する態様が好ましい。
【0045】
（第二の粒子）
第二の粒子は、標識を有しない。また第二の粒子は乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定されない。
第二の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第二の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
第二の粒子は、標識を有しない。また第二の粒子は乾燥粒子であることが好ましいが、特に限定されない。
第二の粒子としては、免疫測定に通常用いられ得る粒子として、例えば、ポリスチレンビーズなどの高分子粒子、ガラスビーズ等のガラス粒子を用いることができる。第二の粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子、または２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。
【0046】
ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン－アクリル酸共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸またはメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、抗体標識の際に界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。
【0047】
第二の結合物質で結合された第二の粒子の粒径は、平均粒径として定義される。第二の粒子の平均粒径は、粒子の材質や血清アミロイドＡを定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、７０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、１００ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがより好ましく、１２０ｎｍ以上１８０ｎｍ以下であることがさらに好ましく、１３０ｎｍ以上１７０ｎｍ以下であることが特に好ましい。
第一の粒子と第二の粒子の使用比率については、第一の粒子に対する第二の粒子の質量比が１～１０であることが好ましく、１～６であることがより好ましく、２～６であることが更に好ましい。
第一の粒子と第二の粒子の使用比率については、第一の粒子に対する第二の粒子の質量比が１～１０であることが好ましく、１～６であることがより好ましく、２～６であることが更に好ましい。
【0048】
［測定キット］
本発明の測定キットは、上記した本発明の試薬キットと、血清アミロイドＡまたは上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質（即ち、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質、または上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質）が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む。上記基板には、血清アミロイドＡと結合性を有さず、第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されていてもよい。
本発明の測定キットは、上記した本発明の試薬キットと、血清アミロイドＡまたは上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質（即ち、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質、または上記第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質）が固定されている第一の金属膜が形成された基板とを含む。上記基板には、血清アミロイドＡと結合性を有さず、第一の結合物質と特異的な結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜がさらに形成されていてもよい。
【0049】
（第三の結合物質）
第三の結合物質は、血清アミロイドＡまたは第一の結合物質と特異的な結合性を有する物質である限り特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられ、抗体を用いることが好ましい。第三の結合物質が抗体である場合は、血清アミロイドＡに対して特異性を有する抗体として、例えば、血清アミロイドＡによって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
第三の結合物質は、血清アミロイドＡまたは第一の結合物質と特異的な結合性を有する物質である限り特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられ、抗体を用いることが好ましい。第三の結合物質が抗体である場合は、血清アミロイドＡに対して特異性を有する抗体として、例えば、血清アミロイドＡによって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、血清アミロイドＡによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
【0050】
抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、ラットＩｇＧ、ラットＩｇＭ、ハムスターＩｇＧ、ハムスターＩｇＭ、ウサギＩｇＧ、ウサギＩｇＭ、ヤギＩｇＧ、ヤギＩｇＭ、ヒツジＩｇＧ、ヒツジＩｇＭ、ウシＩｇＧ、ウシＩｇＭ、トリＩｇＹ等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルのどちらも使用可能である。断片化抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
【0051】
第一の結合物質と特異的な結合性を有する第三の結合物質としては、特に限定されないが、好ましい例としては、抗原、抗体、またはこれらの複合体が挙げられる。抗体の調製方法および抗体の種類は、上記した内容と同様である。
【0052】
（第四の結合物質）
第四の結合物質は、血清アミロイドＡと結合性を有さず、第一の結合物質と特異的な結合性を有する物質である。第四の結合物質としては、例えば、第一の結合物質（抗体）に対する抗体、結合物質（抗体）に対して結合するタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）など、第一の結合物質に対して親和性を持つ化合物を使用することが好ましく、中でも更に好ましくは、抗体を使用することができる。抗体の調製方法および抗体の種類は、第三の結合物質について記載した内容と同様である。また、標識を有する第一の粒子に結合した第一の結合物質の一部が、第四の結合物質とリガンド－非リガンドの関係となる化合物を好ましく用いることができる。
第四の結合物質は、血清アミロイドＡと結合性を有さず、第一の結合物質と特異的な結合性を有する物質である。第四の結合物質としては、例えば、第一の結合物質（抗体）に対する抗体、結合物質（抗体）に対して結合するタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ）など、第一の結合物質に対して親和性を持つ化合物を使用することが好ましく、中でも更に好ましくは、抗体を使用することができる。抗体の調製方法および抗体の種類は、第三の結合物質について記載した内容と同様である。また、標識を有する第一の粒子に結合した第一の結合物質の一部が、第四の結合物質とリガンド－非リガンドの関係となる化合物を好ましく用いることができる。
【0053】
（結合物質を基板に固定化する方法）
抗体などの第三の結合物質および第四の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ Ｎｏｔｅｓ Ｖｏｌ．２－１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）などを配することによる表面修飾を施しても良く、結合物質としての抗体を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、および共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。抗体を基板に固定させた後に抗体が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
抗体などの第三の結合物質および第四の結合物質を基板に固定化する方法は、例えば、Ｎｕｎｃ社の提供するＴｅｃｈ Ｎｏｔｅｓ Ｖｏｌ．２－１２などに記載されており、一般的なＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）などを配することによる表面修飾を施しても良く、結合物質としての抗体を基板に固定化する方法としては、物理吸着を用いた方法、および共有結合による化学結合を用いた方法のいずれの方法も採用可能である。抗体を基板に固定させた後に抗体が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。
【0054】
（基板）
本発明で用いる基板は、金属膜が形成された基板であり、その形態は特に限定されないが、後述する表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行う場合には、後述する流路、および表面に反応部位である金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るような物質を用いることができる。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の金属が挙げられ、特に金が好ましい。上記の金属は単独または組み合わせて使用することも可能である。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は特に制限はないが、例えば、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるものが好ましく、更には、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるものが好ましく、特に１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるものが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
本発明で用いる基板は、金属膜が形成された基板であり、その形態は特に限定されないが、後述する表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行う場合には、後述する流路、および表面に反応部位である金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るような物質を用いることができる。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の金属が挙げられ、特に金が好ましい。上記の金属は単独または組み合わせて使用することも可能である。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は特に制限はないが、例えば、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるものが好ましく、更には、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるものが好ましく、特に１ｎｍ以上１００ｎｍ以下であるものが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【0055】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタリング法、マグネトロンスパッタリング法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができるが、基板への金属膜の良好な付着性を実現するために、スパッタリング法により金属膜を形成することが好ましい。
【0056】
金属膜は、好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置されている」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるＢＫ７（ホウ珪酸ガラス）等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。ＳＰＦ法による蛍光検出のための基板の一例としては、ポリメチルメタクリレート上に、金膜をスパッタリング法で作製した基板などを挙げることができる。
【0057】
［血清アミロイドＡの測定方法］
本発明による生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法は、
血清アミロイドＡを含む生体試料と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤とを含む混合液を調製する工程；
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、上記混合液を添加する工程；
上記混合液を上記基板上に流下させる工程；および、
上記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む。
本発明による生体試料中の血清アミロイドＡの測定方法は、
血清アミロイドＡを含む生体試料と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質により修飾され、かつ標識を有する第一の粒子と、少なくとも一種の分子量１０００以下の非イオン性界面活性剤とを含む混合液を調製する工程；
血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質が固定されている第一の金属膜が形成された基板の一端の注入口に、上記混合液を添加する工程；
上記混合液を上記基板上に流下させる工程；および、
上記第一の金属膜上の標識の情報を取得する工程、
を含む。
【0058】
生体試料としては、被検物質である血清アミロイドＡを含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特に、ネコ、イヌ、またはヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、または喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
【0059】
非イオン性界面活性剤は、ＳＡＡを含む生体試料の前処理に使用される。前処理液としては、事前に界面活性剤を含む液を準備し、検体液に混合して使用する使用方法や、生体試料液そのものに、乾燥した固形分の界面活性剤を添加して、検体液に溶かしこむ使用方法が用いられる。この場合、生体試料液と界面活性剤を混合した混合液中の界面活性剤の濃度としては、０．０１質量％以上１０質量％以下が好ましく、０．０５質量％以上５質量％以下がより好ましく、０．１質量％以上３質量％以下が更に好ましく、０．１質量％以上２質量％以下が特に好ましい。濃度が、０．０１質量％以上であると有効にＳＡＡをＨＤＬから分離することが可能となり、濃度が１０質量％以下であると、界面活性剤の影響を受けにくい状態で、標識を有する第一の粒子上の第一の結合物質や、あるいは基板上の第一の金属膜上に固定された第三の結合物質と、ＳＡＡとが反応することが可能となる。
【0060】
上記混合液は、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質により修飾された第二の粒子をさらに含んでいてもよい。
また本発明による血清アミロイドＡの測定方法は、上記混合液を、血清アミロイドＡと結合性を有さず、上記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜に接触させる工程と、上記第二の金属膜から上記標識に応じたシグナルを検出する工程と、上記第二の金属膜から検出したシグナルを用いて上記第一の金属膜から検出したシグナルを補正する工程とをさらに含んでいてもよい。
また本発明による血清アミロイドＡの測定方法は、上記混合液を、血清アミロイドＡと結合性を有さず、上記第一の結合物質に対して結合性を有する第四の結合物質が固定された第二の金属膜に接触させる工程と、上記第二の金属膜から上記標識に応じたシグナルを検出する工程と、上記第二の金属膜から検出したシグナルを用いて上記第一の金属膜から検出したシグナルを補正する工程とをさらに含んでいてもよい。
【0061】
上記生体試料と界面活性剤の混合液は、生体試料を希釈した状態の混合液を使用することができる。希釈に用いる液としては、本発明の効果を発現する限り特に制限はないが、生体試料の組成に近い生理食塩水を用いること好ましい。生理食塩水で希釈する生体試料に対する倍率はいずれの倍率での希釈が可能であるが、本発明の課題であるＳＡＡを正確かつ高感度に免疫学的に測定するための試薬キット、測定キットおよび測定方法を提供するためには、５倍以上に希釈した状態で血清アミロイドＡの測定をすることが好ましい。生体試料の希釈によりＳＡＡを正確かつ高感度に測定することが可能となるが、生体試料を希釈する倍率が非常に高くなると、血清アミロイドＡ濃度に対するシグナルそのものが低下するため、希釈倍率は２００倍以下に抑えることが好ましい。
【0062】
（測定方法）
本発明の測定方法は、血清アミロイドＡの存在の有無の検出や血清アミロイドＡの量の測定（すなわち、定量）などを含む、最も広い概念として解釈される。本発明の測定方法の具体的な実施態様としてはサンドイッチ法または競合法が挙げられ、サンドイッチ法が好ましい。
本発明の測定方法は、血清アミロイドＡの存在の有無の検出や血清アミロイドＡの量の測定（すなわち、定量）などを含む、最も広い概念として解釈される。本発明の測定方法の具体的な実施態様としてはサンドイッチ法または競合法が挙げられ、サンドイッチ法が好ましい。
【0063】
＜サンドイッチ法＞
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により血清アミロイドＡを測定することができる。まず、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質、および血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質を予め用意しておく。第一の結合物質を、標識を有する第一の粒子に結合させて、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された第一の粒子を作製する。次いで第三の結合物質を用意し、基板上に固定して反応部位（テストエリア）とする。また、第四の結合物質を用意し、基板上に固定してコントロールエリアとする。別途、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質を用意し、標識を有さない第二の粒子に結合させて、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された標識を有しない第二の粒子を作製する。上記の第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、第一の粒子と第二の粒子の混合物と、界面活性剤とを混合し、この混合した液を基板に適用し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に血清アミロイドＡが存在する場合には、反応部位で、血清アミロイドＡと、第一の粒子に結合した第一の結合物質との間、および血清アミロイドＡと反応部位上の第三の結合物質との間で反応（抗原および抗体を用いた場合には、抗原抗体反応）が起こり、血清アミロイドＡの量に応じた第一の粒子が反応部位上に固定される。サンドイッチ法では、反応部位上に固定した第三の結合物質と、血清アミロイドＡとの反応、および血清アミロイドＡと第一の粒子に結合している第一の結合物質との反応が終了した後、基板上のテストエリアおよびコントロールエリアで結合しなかった第一の粒子を除去する目的で、洗浄を行うこともできる。次いで反応部位に結合した第一の粒子からのシグナル強度を検出することで、正確な血清アミロイドＡの濃度を測定することができる。なお、蛍光強度と血清アミロイドＡの濃度は、正の相関関係がある。
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により血清アミロイドＡを測定することができる。まず、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質、および血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第三の結合物質を予め用意しておく。第一の結合物質を、標識を有する第一の粒子に結合させて、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された第一の粒子を作製する。次いで第三の結合物質を用意し、基板上に固定して反応部位（テストエリア）とする。また、第四の結合物質を用意し、基板上に固定してコントロールエリアとする。別途、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質を用意し、標識を有さない第二の粒子に結合させて、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された標識を有しない第二の粒子を作製する。上記の第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、第一の粒子と第二の粒子の混合物と、界面活性剤とを混合し、この混合した液を基板に適用し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に血清アミロイドＡが存在する場合には、反応部位で、血清アミロイドＡと、第一の粒子に結合した第一の結合物質との間、および血清アミロイドＡと反応部位上の第三の結合物質との間で反応（抗原および抗体を用いた場合には、抗原抗体反応）が起こり、血清アミロイドＡの量に応じた第一の粒子が反応部位上に固定される。サンドイッチ法では、反応部位上に固定した第三の結合物質と、血清アミロイドＡとの反応、および血清アミロイドＡと第一の粒子に結合している第一の結合物質との反応が終了した後、基板上のテストエリアおよびコントロールエリアで結合しなかった第一の粒子を除去する目的で、洗浄を行うこともできる。次いで反応部位に結合した第一の粒子からのシグナル強度を検出することで、正確な血清アミロイドＡの濃度を測定することができる。なお、蛍光強度と血清アミロイドＡの濃度は、正の相関関係がある。
【0064】
＜競合法＞
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により血清アミロイドＡを測定することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として当業界においてよく知られている。まず、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質を予め調製する。次いで第一の結合物質を第一の粒子に結合させ、第二の結合物質を第二の粒子に結合させる。また、第一の結合物質に対して結合性を有する、血清アミロイドＡそのもの、または血清アミロイドＡと類似な部位を持ち血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質に対するエピトープを持つ化合物を基板上に固定し反応部位とする。次に、第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、第一の粒子と第二の粒子の混合物と、界面活性剤を混合し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に血清アミロイドＡが存在しない場合には、第一の粒子に結合した第一の結合物質と、反応部位上に固定した第一の結合物質に対して結合性を有する血清アミロイドＡそのものまたは血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ類似化合物とにより、基板上で反応が起こる。一方、血清アミロイドＡが存在する場合には、第一の結合物質に血清アミロイドＡが結合するため、第一の結合物質に対して結合性を有する、血清アミロイドＡそのもの、または血清アミロイドＡと類似な部位を持ち血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ化合物との、反応部位上における反応が阻害され、標識を有する第一の粒子が反応部位上へ固定されることが阻害される。競合法では、予め、血清アミロイドＡの濃度が異なる血清アミロイドＡの量が既知である試料を複数用意し、この試料および結合物質標識蛍光粒子を反応部位上に接触させつつ、反応部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各血清アミロイドＡ濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、血清アミロイドＡ濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する血清アミロイドＡの濃度の検量線を取得する。このように取得した検量線に基づき、目的とする被検試料を用いた蛍光量の時間変化の結果から、被検試料に含まれる血清アミロイドＡの量を定量することができる。
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により血清アミロイドＡを測定することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として当業界においてよく知られている。まず、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有する第一の結合物質と、血清アミロイドＡと特異的な結合性を有しない第二の結合物質を予め調製する。次いで第一の結合物質を第一の粒子に結合させ、第二の結合物質を第二の粒子に結合させる。また、第一の結合物質に対して結合性を有する、血清アミロイドＡそのもの、または血清アミロイドＡと類似な部位を持ち血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質に対するエピトープを持つ化合物を基板上に固定し反応部位とする。次に、第一の粒子と、第二の粒子を混合して容器に収納し、乾燥させる。血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、第一の粒子と第二の粒子の混合物と、界面活性剤を混合し、基板上の流路上を展開させて反応部位に接触させる。被検試料中に血清アミロイドＡが存在しない場合には、第一の粒子に結合した第一の結合物質と、反応部位上に固定した第一の結合物質に対して結合性を有する血清アミロイドＡそのものまたは血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ類似化合物とにより、基板上で反応が起こる。一方、血清アミロイドＡが存在する場合には、第一の結合物質に血清アミロイドＡが結合するため、第一の結合物質に対して結合性を有する、血清アミロイドＡそのもの、または血清アミロイドＡと類似な部位を持ち血清アミロイドＡと同様の第一の結合物質抗体に対するエピトープを持つ化合物との、反応部位上における反応が阻害され、標識を有する第一の粒子が反応部位上へ固定されることが阻害される。競合法では、予め、血清アミロイドＡの濃度が異なる血清アミロイドＡの量が既知である試料を複数用意し、この試料および結合物質標識蛍光粒子を反応部位上に接触させつつ、反応部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各血清アミロイドＡ濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、血清アミロイドＡ濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する血清アミロイドＡの濃度の検量線を取得する。このように取得した検量線に基づき、目的とする被検試料を用いた蛍光量の時間変化の結果から、被検試料に含まれる血清アミロイドＡの量を定量することができる。
【0065】
（流路）
本発明の好ましい態様においては、血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、標識を有する第一の粒子と、界面活性剤と、さらに所望により第二の粒子とを混合した混合物を調製する。この混合物を基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、被検試料と、標識を有する第一の粒子（および所望により第二の粒子）とを反応部位まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、標識を有する第一の粒子（および所望により第二の粒子）を含む被検試料液を点着する点着口、第三の結合物質が固定化された反応部位としての金属薄膜、および金属薄膜を越えて流路が存在し、被検試料が、金属薄膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属薄膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
本発明の好ましい態様においては、血清アミロイドＡを含む可能性のある被検試料（またはその抽出液）と、標識を有する第一の粒子と、界面活性剤と、さらに所望により第二の粒子とを混合した混合物を調製する。この混合物を基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、被検試料と、標識を有する第一の粒子（および所望により第二の粒子）とを反応部位まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、標識を有する第一の粒子（および所望により第二の粒子）を含む被検試料液を点着する点着口、第三の結合物質が固定化された反応部位としての金属薄膜、および金属薄膜を越えて流路が存在し、被検試料が、金属薄膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属薄膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
【0066】
（標識に応じたシグナルを検出する方法）
本発明においては、標識に応じたシグナルを検出する。上記の通り標識は蛍光を発することが好ましく、この場合には、蛍光を検出することにより、標識に応じたシグナルを検出することができる。蛍光の検出方法としては、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、または表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。蛍光強度の検出は、通常、抗原抗体反応後一定時間、例えば、数分～数時間後に終了する。免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、蛍光強度と血清アミロイドＡの濃度の関係から、血清アミロイドＡの濃度を定量することができる。なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。なお、ＳＰＦ法は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法）よりも高感度に測定することができる。
本発明においては、標識に応じたシグナルを検出する。上記の通り標識は蛍光を発することが好ましく、この場合には、蛍光を検出することにより、標識に応じたシグナルを検出することができる。蛍光の検出方法としては、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、または表面プラズモン励起による蛍光検出法（ＳＰＦ法）を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。蛍光強度の検出は、通常、抗原抗体反応後一定時間、例えば、数分～数時間後に終了する。免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、蛍光強度と血清アミロイドＡの濃度の関係から、血清アミロイドＡの濃度を定量することができる。なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。なお、ＳＰＦ法は、落射励起による蛍光検出法（落射蛍光法）よりも高感度に測定することができる。
【0067】
表面プラズモン蛍光（ＳＰＦ）バイオセンサーとしては、例えば、特開２００８－２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。
【0068】
（血清アミロイドＡの量の測定方法）
本発明におけるＳＰＦ法での血清アミロイドＡの定量方法の一例としては、以下の方法により血清アミロイドＡを定量することができる。具体的には、各濃度既知の血清アミロイドＡを含む試料を準備し、蛍光を検出する部位を流下させつつ、蛍光検出部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各血清アミロイドＡ濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、血清アミロイドＡ濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する血清アミロイドＡ濃度の検量線を取得する。光シグナルシステムとしては、血清アミロイドＡごとに対応する検量線に基づき、目的とする被検試料の血清アミロイドＡ量を特定することができる。
本発明におけるＳＰＦ法での血清アミロイドＡの定量方法の一例としては、以下の方法により血清アミロイドＡを定量することができる。具体的には、各濃度既知の血清アミロイドＡを含む試料を準備し、蛍光を検出する部位を流下させつつ、蛍光検出部位からの蛍光シグナルを異なる複数の時刻で測定する。この複数の測定結果から、各血清アミロイドＡ濃度において、蛍光量の時間変化（傾き）を求める。この時間変化をＹ軸、血清アミロイドＡ濃度をＸ軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対する血清アミロイドＡ濃度の検量線を取得する。光シグナルシステムとしては、血清アミロイドＡごとに対応する検量線に基づき、目的とする被検試料の血清アミロイドＡ量を特定することができる。
【0069】
本発明における表面プラズモン励起による蛍光検出（ＳＰＦ）系は、基板上の金属薄膜上に固定化された血清アミロイドＡの量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を、例えば濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法では、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと検体中の抗原が、抗体反応により結合し、凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方式が、ラテックス凝集法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便な血清アミロイドＡの検出方法を提供できる。
【0070】
以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。以下の化学式においてＥｔはエチルを示す。
【実施例】
【0071】
以下の界面活性剤を使用した。
Ｄ３１６：ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製）、下記式（Ａ）においてＲがドデシルオキシ基である化合物
Ｄ３８２：ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製）、下記式（Ａ）においてＲがデシルオキシ基である化合物
Ｄ３１６：ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製）、下記式（Ａ）においてＲがドデシルオキシ基である化合物
Ｄ３８２：ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学社製）、下記式（Ａ）においてＲがデシルオキシ基である化合物
【化9】
【0072】
ＭＥＧＡ－９：ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン（同仁化学社製）
【化10】
【0073】
Ｏ００１：ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド（同仁化学社製）
【化11】
【0074】
ラウレス９：ＰＯＥ（９）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）７０９）
ラウレス１５：ＰＯＥ（１５）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）７１５）
ラウレス１５：ＰＯＥ（１５）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）７１５）
【0075】
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（イオン性界面活性剤、和光純薬製）
ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド〈イオン性界面活性剤、和光純薬製〉
ラウレス２０：ＰＯＥ（２０）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）７２０）
ジメチルジステアリルアンモニウムクロリド〈イオン性界面活性剤、和光純薬製〉
ラウレス２０：ＰＯＥ（２０）ラウリルエーテル（日本エマルジョン社製ＥＭＡＬＥＸ（登録商標）７２０）
【0076】
＜実施例１＞
（１）平均粒子径１５０ｎｍラテックス粒子の製造
スチレン（和光純薬社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬社製）３ｇ（４２ｍｍｏｌ）を超純水４４０ｍＬに懸濁させ、９５℃に昇温し、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（和光純薬社製）１ｇを超純水１０ｍＬに溶解させた水溶液を添加し、９５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍで６時間遠心分離を３回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が１質量％となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は１５０ｎｍであった。
（１）平均粒子径１５０ｎｍラテックス粒子の製造
スチレン（和光純薬社製）３０ｇ（２８８ｍｍｏｌ）とアクリル酸（和光純薬社製）３ｇ（４２ｍｍｏｌ）を超純水４４０ｍＬに懸濁させ、９５℃に昇温し、過硫酸カリウム（ＫＰＳ）（和光純薬社製）１ｇを超純水１０ｍＬに溶解させた水溶液を添加し、９５℃、２５０ｒｐｍで６時間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍで６時間遠心分離を３回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が１質量％となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーＦＰＡＲ－１０００（大塚電子（株））を用いて、温度２５℃で測定したメジアン径（ｄ＝５０）として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は１５０ｎｍであった。
【0077】
（２）蛍光ラテックス粒子の作製
上記のように作製した平均粒子径１５０ｎｍのラテックス粒子の固形分濃度２質量％の水分散液１００ｍＬにメタノール１００ｍＬを加え、１０分間、室温で攪拌した。一方、別途用意したＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬ、ＣＨＣｌ３ ９ｍＬおよびエタノール１６ｍＬに溶解させた蛍光色素（ＮＫ１３６、林原生物化学研究所製）１２ｍｇを６０分間かけてゆっくりラテックス溶液に滴下した。滴下完了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）水溶液への再分散を３回繰り返し、精製を行うことで、蛍光ラテックス粒子を調製した。
上記のように作製した平均粒子径１５０ｎｍのラテックス粒子の固形分濃度２質量％の水分散液１００ｍＬにメタノール１００ｍＬを加え、１０分間、室温で攪拌した。一方、別途用意したＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１ｍＬ、ＣＨＣｌ３ ９ｍＬおよびエタノール１６ｍＬに溶解させた蛍光色素（ＮＫ１３６、林原生物化学研究所製）１２ｍｇを６０分間かけてゆっくりラテックス溶液に滴下した。滴下完了後、エパポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）水溶液への再分散を３回繰り返し、精製を行うことで、蛍光ラテックス粒子を調製した。
【0078】
（３）モノクローナル抗体の作製
抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）および抗ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）モノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）は、マウス腹水法を用いて、以下のように作製した。
Ｈｙｔｅｓｔ社より購入したＳＡＡを用いて、マウスに免疫した後に脾臓細胞を抽出し、ミエローマ（製品名Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ１、コスボバイオ社製）と混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法にて細胞融合を実施した。使用細胞としては、最終免疫してから３日後に採取した脾臓細胞を使用した。細胞比は、脾臓細胞：ミエローマ＝１０：１とした。細胞播種は、脾臓細胞として０．５～１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。使用した培地は、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清：Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、およびＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｍｅｄｉｕｍ）を適宜使用した。最終的に増殖した融合細胞（ハイブリドーマ）をマウス腹腔内に注射し、一定期間の経時後に腹水を取り出し、遠心分離、精製工程を経て得られたものを抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）として採取した。また、抗ＳＡＡモノクローナル抗体の作製と同様にして、大腸菌の培養液から精製したＣＲＰ（オリエンタル酵母工業（株）社製）を用いて、抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）を作製した。
抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）および抗ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）モノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）は、マウス腹水法を用いて、以下のように作製した。
Ｈｙｔｅｓｔ社より購入したＳＡＡを用いて、マウスに免疫した後に脾臓細胞を抽出し、ミエローマ（製品名Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ１、コスボバイオ社製）と混合し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法にて細胞融合を実施した。使用細胞としては、最終免疫してから３日後に採取した脾臓細胞を使用した。細胞比は、脾臓細胞：ミエローマ＝１０：１とした。細胞播種は、脾臓細胞として０．５～１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。使用した培地は、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清：Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、およびＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ－ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ－ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｍｅｄｉｕｍ）を適宜使用した。最終的に増殖した融合細胞（ハイブリドーマ）をマウス腹腔内に注射し、一定期間の経時後に腹水を取り出し、遠心分離、精製工程を経て得られたものを抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）として採取した。また、抗ＳＡＡモノクローナル抗体の作製と同様にして、大腸菌の培養液から精製したＣＲＰ（オリエンタル酵母工業（株）社製）を用いて、抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）を作製した。
【0079】
（４）抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子の調製
抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）２７５μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）バッファー（ｐＨ６．６）溶液８８μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）１７６μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、和光純薬社製）水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液を８．８μＬ添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５００μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５００μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗ＳＡＡ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
２質量％（固形分濃度）蛍光ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）２７５μＬに、５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）バッファー（ｐＨ６．６）溶液８８μＬを加え、５ｍｇ／ｍＬの抗ＳＡＡモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ－ＳＡＡ）１７６μＬを添加し、室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、和光純薬社製）水溶液を５μＬ加え、室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／ＬのＧｌｙｃｉｎｅ（和光純薬社製）水溶液を８．８μＬ添加して１５分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を５００μＬ加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液５００μＬを加えて、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗ＳＡＡ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
【0080】
（５）蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子の作製
２質量％（固形分濃度）ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）３００μＬに、２５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．６）溶液９６μＬおよび超純水２５ｍＬを加え、さらに５ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）１８２μＬを添加した。得られた混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）水溶液９．６μＬを加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／Ｌのグリシン（和光純薬（株）社製）水溶液を３０μＬ添加して、得られた混合物を３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、ラテックス粒子を沈降させた。上清を取り除き、沈殿物にＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を６００μＬ加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、沈殿物に１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液６００μＬを加えて、ラテックス粒子を再分散させた。このようにして抗ＣＲＰ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
２質量％（固形分濃度）ラテックス粒子水溶液（平均粒子径１５０ｎｍ）３００μＬに、２５０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳバッファー（ｐＨ５．６）溶液９６μＬおよび超純水２５ｍＬを加え、さらに５ｍｇ／ｍＬの抗ＣＲＰモノクローナル抗体（ＭＭ５０１７５）１８２μＬを添加した。得られた混合物を室温で１５分間攪拌した。その後、１０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）水溶液９．６μＬを加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。２ｍｏｌ／Ｌのグリシン（和光純薬（株）社製）水溶液を３０μＬ添加して、得られた混合物を３０分間撹拌した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行い、ラテックス粒子を沈降させた。上清を取り除き、沈殿物にＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を６００μＬ加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）を行って上清を除いた後、沈殿物に１質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液６００μＬを加えて、ラテックス粒子を再分散させた。このようにして抗ＣＲＰ抗体結合蛍光ラテックス粒子の１質量％溶液を調製した。
【0081】
（６）乾燥粒子の作製
超純水２４０μＬ、２０質量％スクロース水溶液４１７μＬ、２０質量％ＢＳＡ水溶液２２９μＬ、１質量％抗ＳＡＡ抗体修飾蛍光ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）１２５μＬを混合した。ポリプロピレン（プライムポリマー社製、プライムポリプロ ランダムＰＰグレード）を基体としたカップを準備し、上記の混合液２０μＬを点着した。その後、スーパードライ乾燥機（ＴＯＹＯリビング社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、１２時間かけて含水量を２５％以下となるまで乾燥させ、その後、２５℃５０％ＲＨ（相対湿度）の環境で１５日間保存することで、実施例１で使用した乾燥粒子を作製した。
超純水２４０μＬ、２０質量％スクロース水溶液４１７μＬ、２０質量％ＢＳＡ水溶液２２９μＬ、１質量％抗ＳＡＡ抗体修飾蛍光ラテックス粒子（平均粒子径１５０ｎｍ）１２５μＬを混合した。ポリプロピレン（プライムポリマー社製、プライムポリプロ ランダムＰＰグレード）を基体としたカップを準備し、上記の混合液２０μＬを点着した。その後、スーパードライ乾燥機（ＴＯＹＯリビング社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、１２時間かけて含水量を２５％以下となるまで乾燥させ、その後、２５℃５０％ＲＨ（相対湿度）の環境で１５日間保存することで、実施例１で使用した乾燥粒子を作製した。
【0082】
また、下記の実施例２、比較例４に使用した乾燥粒子の作製においては、上記で調製した蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子を、抗ＳＡＡ抗体修飾蛍光ラテックス粒子の質量に対して５倍量混合し、他は同様に乾燥粒子を調製した。
【0083】
（７）基板の作製
ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、三菱レイヨン社製、アクリペットＶＨ－００１）を基体とした基板の片面に、テストエリアおよびコントロールエリア共に幅４ｍｍ、厚さが３６ｎｍとなるように、テストエリアに用いる金膜と、その隣に、コントロールエリアに用いる金膜とを、マグネトロンスパッタリング法により作製した。この基板を幅５ｍｍとなるように裁断して基板を作製した。この基板のテストエリアの金膜上には、抗ＳＡＡモノクローナル抗体を含む液（濃度：１０μｇ／ｍＬ ｉｎ１５０ｍｍｏｌ ＮａＣｌ）を点着し、１時間、２５℃にてインキュベートし、物理吸着させて固定化を行った。
ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ、三菱レイヨン社製、アクリペットＶＨ－００１）を基体とした基板の片面に、テストエリアおよびコントロールエリア共に幅４ｍｍ、厚さが３６ｎｍとなるように、テストエリアに用いる金膜と、その隣に、コントロールエリアに用いる金膜とを、マグネトロンスパッタリング法により作製した。この基板を幅５ｍｍとなるように裁断して基板を作製した。この基板のテストエリアの金膜上には、抗ＳＡＡモノクローナル抗体を含む液（濃度：１０μｇ／ｍＬ ｉｎ１５０ｍｍｏｌ ＮａＣｌ）を点着し、１時間、２５℃にてインキュベートし、物理吸着させて固定化を行った。
【0084】
（８）基板の洗浄およびブロッキング
このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を３００μＬ用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（ＡＢＩ社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４））を３００μＬ用いて３回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、１質量％カゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を３００μＬ添加し、１時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ（ＡＢＩ社製）３００μＬを添加し、室温で３０分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
【0085】
（９）センサチップの作製
特開２０１０－１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。その概略図を図１および図２に示した。図１は、センサチップ１の概略図であり、図２は、センサチップ１の分解図である。センサチップ１は、上部部材２、中間部材３および基板４から構成されている。上部部材２には、第一の容器５および第二の容器６が設けられている。なお、第一の容器５および第二の容器６を併せて、容器群７と称する。基板４には、流路１０が形成されており、流路１０の上には、検出領域８および参照領域９が形成されている。
特開２０１０－１９０８８０号公報の第２の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。その概略図を図１および図２に示した。図１は、センサチップ１の概略図であり、図２は、センサチップ１の分解図である。センサチップ１は、上部部材２、中間部材３および基板４から構成されている。上部部材２には、第一の容器５および第二の容器６が設けられている。なお、第一の容器５および第二の容器６を併せて、容器群７と称する。基板４には、流路１０が形成されており、流路１０の上には、検出領域８および参照領域９が形成されている。
【0086】
（１０）被検試料の準備
ネコの血清は、北山ラベスから購入した交雑種の血清を使用し、被検物質である血清アミロイドＡの濃度が異なる被検試料（検体）Ｎｏ．１およびＮｏ．２を用意した。
ネコの血清は、北山ラベスから購入した交雑種の血清を使用し、被検物質である血清アミロイドＡの濃度が異なる被検試料（検体）Ｎｏ．１およびＮｏ．２を用意した。
【0087】
（１１）蛍光粒子を用いたＳＡＡの免疫測定
（１０）で準備した被検試料（ネコの血清）１０μＬと、非イオン性界面活性剤であるＤ３１６（同仁化学製）の生理食塩水溶液９０μＬを充分に混合して、被検試料の混合液１を作製した。この混合液の界面活性剤Ｄ３１６の濃度は、０．２５質量％であった。次に、（４）で調製した、抗ＳＡＡ抗体標識蛍光粒子を点着し乾燥させたカップに、作製した混合液１を添加し、１０分間、十分に攪拌した。次に、上記で作製した基板を封入した流路型センサチップの注入口に蛍光粒子と混合した混合液１を点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液１を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流路を流下させ、ＳＡＡ抗体を固定した金膜面上の蛍光強度を１．５分間継続して測定した。各基板において得られた蛍光強度の単位時間における蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１、２に対してそれぞれ求めた。
（１０）で準備した被検試料（ネコの血清）１０μＬと、非イオン性界面活性剤であるＤ３１６（同仁化学製）の生理食塩水溶液９０μＬを充分に混合して、被検試料の混合液１を作製した。この混合液の界面活性剤Ｄ３１６の濃度は、０．２５質量％であった。次に、（４）で調製した、抗ＳＡＡ抗体標識蛍光粒子を点着し乾燥させたカップに、作製した混合液１を添加し、１０分間、十分に攪拌した。次に、上記で作製した基板を封入した流路型センサチップの注入口に蛍光粒子と混合した混合液１を点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液１を１０μＬ／ｍｉｎの速度で流路を流下させ、ＳＡＡ抗体を固定した金膜面上の蛍光強度を１．５分間継続して測定した。各基板において得られた蛍光強度の単位時間における蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１、２に対してそれぞれ求めた。
【0088】
＜実施例２＞
実施例１で使用した抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子に対して、蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子を、質量比で５倍量、追加で加えた乾燥粒子を調製し、使用したこと以外は、実施例１と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。
実施例１で使用した抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子に対して、蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子を、質量比で５倍量、追加で加えた乾燥粒子を調製し、使用したこと以外は、実施例１と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。
【0089】
＜実施例３～９＞
実施例１において、界面活性剤Ｄ３１６の代わりに、表１に示した界面活性剤および濃度に変更したこと以外は実施例１と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。
実施例１において、界面活性剤Ｄ３１６の代わりに、表１に示した界面活性剤および濃度に変更したこと以外は実施例１と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。
【0090】
＜比較例１～３＞
界面活性剤を実施例１のものから以下の表に記載したものに変更すること以外の作業は実施例１と同様に行い、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。
界面活性剤を実施例１のものから以下の表に記載したものに変更すること以外の作業は実施例１と同様に行い、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。
【0091】
＜比較例４＞
比較例３において使用した抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子に対して、蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子を、質量比で５倍量、追加で加えた乾燥粒子を調製し、使用したこと以外は、比較例３と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。
比較例３において使用した抗ＳＡＡ抗体で修飾した蛍光ラテックス粒子に対して、蛍光標識をしない抗ＣＲＰ抗体で修飾したラテックス粒子を、質量比で５倍量、追加で加えた乾燥粒子を調製し、使用したこと以外は、比較例３と同様にして、蛍光シグナル値の増加速度を被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２に対してそれぞれ求めた。
【0092】
（１２）対照キットによる測定
免疫測定で、当業者により使用されているＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｓｅ ＳＡＡ Ａｓｓａｙ（ｃａｔ．ｎｏ．ＴＰ－８０２）：Ｔｒｉｄｅｌｔａ社製対照キット）を用い、取り扱い説明書に従い、被検試料中の血清アミロイドＡの測定を行い被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のＳＡＡ濃度を測定した。被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のＳＡＡ濃度は、４３．８μｇ／ｍＬと４．１μｇ／ｍＬであった。測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして求め、Ｎｏ．１およびＮｏ．２のシグナル傾きの平均値を求めた。
免疫測定で、当業者により使用されているＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｓｅ ＳＡＡ Ａｓｓａｙ（ｃａｔ．ｎｏ．ＴＰ－８０２）：Ｔｒｉｄｅｌｔａ社製対照キット）を用い、取り扱い説明書に従い、被検試料中の血清アミロイドＡの測定を行い被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のＳＡＡ濃度を測定した。被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のＳＡＡ濃度は、４３．８μｇ／ｍＬと４．１μｇ／ｍＬであった。測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして求め、Ｎｏ．１およびＮｏ．２のシグナル傾きの平均値を求めた。
【0093】
結果を表１に示した。シグナル傾きが、２．０以上であれば、被検試料中のＳＡＡ濃度を実用的に検出することが可能であり、９．５以上であれば、より精度良く検出することが可能となる。
【0094】
【表1】
【0095】
表１の結果から、非イオン系の界面活性剤（ノニオン）で分子量１０００以下の界面活性剤を用いることで、本発明の効果が発現することが確認された。
【0096】
＜実施例１０＞
（１３）乾燥粒子の作製
実施例２において、乾燥粒子の作製を終了した乾燥粒子を含むカップに、実施例２の（１１）での被検試料の混合液の作製において使用したＤ３１６を、予め乾燥粒子に加えるため、３．０重量パーセント濃度のＤ３１６水溶液１０μＬを加えて十分に混合し、その後、スーパードライ乾燥機（ＴＯＹＯリビング社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、１２時間かけて含水量を２５％以下となるまで乾燥させ、引き続き、２５℃５０％ＲＨ（相対湿度）の環境で１５日間保存することで、乾燥粒子を作製した。
（１３）乾燥粒子の作製
実施例２において、乾燥粒子の作製を終了した乾燥粒子を含むカップに、実施例２の（１１）での被検試料の混合液の作製において使用したＤ３１６を、予め乾燥粒子に加えるため、３．０重量パーセント濃度のＤ３１６水溶液１０μＬを加えて十分に混合し、その後、スーパードライ乾燥機（ＴＯＹＯリビング社、ウルトラスーパードライ００シリーズ）を用いて、１２時間かけて含水量を２５％以下となるまで乾燥させ、引き続き、２５℃５０％ＲＨ（相対湿度）の環境で１５日間保存することで、乾燥粒子を作製した。
【0097】
（１４）蛍光粒子を用いたＳＡＡ粒子の免疫測定
上記の（１０）で準備した被検試料（ネコの血清）１０μＬと、上記（１１）で使用したＤ３１６の生理食塩水溶液９０μＬの代わりに、Ｄ３１６を除いた生理食塩水９０μＬを十分に混合した以外は実施例２と同様にして、被検試料の混合液１４を調製した。この混合液１４の界面活性剤Ｄ３１６の濃度は、０．３０質量％であった。次に、（１３）で調製した抗ＳＡＡ抗体標識蛍光粒子を点着し乾燥させたカップに混合液１４を添加し、１０分間、十分に攪拌した。次いで、実施例２と同様にして、流路型センサチップの注入口に蛍光粒子を含有する混合液１４を点着し、測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして求め、被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のシグナル傾きの平均値を求めた。結果を表２に示した。
上記の（１０）で準備した被検試料（ネコの血清）１０μＬと、上記（１１）で使用したＤ３１６の生理食塩水溶液９０μＬの代わりに、Ｄ３１６を除いた生理食塩水９０μＬを十分に混合した以外は実施例２と同様にして、被検試料の混合液１４を調製した。この混合液１４の界面活性剤Ｄ３１６の濃度は、０．３０質量％であった。次に、（１３）で調製した抗ＳＡＡ抗体標識蛍光粒子を点着し乾燥させたカップに混合液１４を添加し、１０分間、十分に攪拌した。次いで、実施例２と同様にして、流路型センサチップの注入口に蛍光粒子を含有する混合液１４を点着し、測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして求め、被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のシグナル傾きの平均値を求めた。結果を表２に示した。
【0098】
＜実施例１１～１３＞
実施例１０の（１３）で調製した乾燥粒子を用いて、（１４）に記載した混合液１４の調製において、生理食塩水による希釈なし（倍率１倍；実施例１１）、生理食塩水による希釈が５倍（実施例１２）、生理食塩水による希釈が１００倍（実施例１３）となるように、被検試料（ネコの血清）に対する生理食塩水の混合比を適宜変更して被検試料の混合液１５～１７を調製し、実施例１０と同様にして、測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして求め、被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のシグナル傾きの平均値を求めた。結果を表２に示した。
実施例１０の（１３）で調製した乾燥粒子を用いて、（１４）に記載した混合液１４の調製において、生理食塩水による希釈なし（倍率１倍；実施例１１）、生理食塩水による希釈が５倍（実施例１２）、生理食塩水による希釈が１００倍（実施例１３）となるように、被検試料（ネコの血清）に対する生理食塩水の混合比を適宜変更して被検試料の混合液１５～１７を調製し、実施例１０と同様にして、測定開始のシグナル値に対する１．５分間測定を継続した後のシグナル値の比をシグナル傾きとして求め、被検試料Ｎｏ．１およびＮｏ．２のシグナル傾きの平均値を求めた。結果を表２に示した。
【0099】
（１５）検量線の作成
続いて、北山ラベスから購入した交雑種の血清を使用し、被検物質の濃度が異なる被検試料（検体）Ｎｏ．３～７を用意した。上記（１２）に記載の対照キットによる測定を行ってＳＡＡ濃度を測定したところ、それぞれ２．９μｇ／ｍＬ、５．５μｇ／ｍＬ、６０．８μｇ／ｍＬ、１１１．０μｇ／ｍＬ、１５９．１μｇ／ｍＬであった。この被検試料（検体）Ｎｏ．３～７を用いて、実施例１で使用したチップと同じ流路型センサチップを用いてそれぞれ、被検試料（検体）Ｎｏ．３～７のシグナルを測定し、実施例１０～１３に対する検量線をそれぞれ作成した。
続いて、北山ラベスから購入した交雑種の血清を使用し、被検物質の濃度が異なる被検試料（検体）Ｎｏ．３～７を用意した。上記（１２）に記載の対照キットによる測定を行ってＳＡＡ濃度を測定したところ、それぞれ２．９μｇ／ｍＬ、５．５μｇ／ｍＬ、６０．８μｇ／ｍＬ、１１１．０μｇ／ｍＬ、１５９．１μｇ／ｍＬであった。この被検試料（検体）Ｎｏ．３～７を用いて、実施例１で使用したチップと同じ流路型センサチップを用いてそれぞれ、被検試料（検体）Ｎｏ．３～７のシグナルを測定し、実施例１０～１３に対する検量線をそれぞれ作成した。
【0100】
（１６）多検体相関の測定
動物病院にて採血された様々な種類のネコ血清５００検体について、実施例２と同様に被検試料である検体の混合液を調製してそれぞれシグナルを測定し、（１５）で作成した検量線からＳＡＡ濃度をそれぞれ算出し、（１２）で記載した対照キットにより測定した既知濃度との相関を評価した結果を「多検体相関」の結果として表２に示した。
動物病院にて採血された様々な種類のネコ血清５００検体について、実施例２と同様に被検試料である検体の混合液を調製してそれぞれシグナルを測定し、（１５）で作成した検量線からＳＡＡ濃度をそれぞれ算出し、（１２）で記載した対照キットにより測定した既知濃度との相関を評価した結果を「多検体相関」の結果として表２に示した。
【0101】
＜多検体相関の評価基準＞
Ａ：良好（５００検体の本発明によるＳＡＡ測定値と対照キットの測定によるＳＡＡ測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Ｒが０．９０以上）
Ｂ：比較的良好（５００検体の本発明によるＳＡＡ測定値と対照キットの測定によるＳＡＡ測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Ｒが０．８０以上０．９０未満）
Ｃ：不十分（５００検体の本発明によるＳＡＡ測定値と対照キットの測定によるＳＡＡ測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Ｒが０．８０未満）
結果を表２に示した。
Ａ：良好（５００検体の本発明によるＳＡＡ測定値と対照キットの測定によるＳＡＡ測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Ｒが０．９０以上）
Ｂ：比較的良好（５００検体の本発明によるＳＡＡ測定値と対照キットの測定によるＳＡＡ測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Ｒが０．８０以上０．９０未満）
Ｃ：不十分（５００検体の本発明によるＳＡＡ測定値と対照キットの測定によるＳＡＡ測定値との相関プロットの線形近似線の相関係数Ｒが０．８０未満）
結果を表２に示した。
【0102】
【表2】
【0103】
表２の結果から、被検試料の生理食塩水による希釈倍率が１倍から１００倍の間では、シグナルの傾きがいずれも９．５以上であり、より精度良くＳＡＡを検出することが可能であることが分かった。その中で、界面活性剤Ｄ３１６を用いた本発明において、多検体相関の結果から、希釈倍率が１倍から１００倍の間で比較的良好な相関が得られているが、その中でも希釈倍率が５倍から１００倍の実施例では、多くの試料を測定してもＳＡＡをより正確に測定できることが確認された。
【符号の説明】
【0104】
１ センサチップ
２ 上部部材
３ 中間部材
４ 基板
５ 第一の容器
６ 第二の容器
７ 容器群
８ 検出領域
９ 参照領域
１０ 流路
２ 上部部材
３ 中間部材
４ 基板
５ 第一の容器
６ 第二の容器
７ 容器群
８ 検出領域
９ 参照領域
１０ 流路
【図1】
【図2】