特許 7048940 細胞製造装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-29

(45)【発行日】2022-04-06

(54)【発明の名称】細胞製造装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20220330BHJP

   C12M 1/42 20060101ALI20220330BHJP

   C12N 13/00 20060101ALN20220330BHJP

   C12N 15/02 20060101ALN20220330BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12M1/42

C12N13/00

C12N15/02 Z

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2018068090

(22)【出願日】2018-03-30

(65)【公開番号】P2019176793

(43)【公開日】2019-10-17

【審査請求日】2020-12-15

(73)【特許権者】

【識別番号】000005108

【氏名又は名称】株式会社日立製作所

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000176

【氏名又は名称】一色国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】岡野定 雅弘

(72)【発明者】

【氏名】武田 志津

(72)【発明者】

【氏名】オケヨ ケネディ オモンディ

(72)【発明者】

【氏名】鷲津 正夫

【審査官】西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５０６６７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５３８２８３（ＪＰ，Ａ）

【文献】岡野定雅弘 ほか，細胞初期化に向けた電界集中型細胞融合による細胞核交換，平成２９年電気学会全国大会講演論文集，2017年，pp. 173-174

【文献】山田真澄 ほか，細胞の分離・選抜のためのマイクロ流体デバイス，生物工学，2014年，Vol. 92，pp. 153-156

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０

Ｃ１２Ｎ １５／０２

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造装置であって、
第１の流路及び第２の流路と、
第１の流路の一端に接続する第１の細胞供給部と、
第２の流路の一端に接続する第２の細胞供給部と、
第１の流路の壁と第２の流路の壁との間に設けられ、第１の流路及び第２の流路を貫通させる孔であり、前記第１の細胞の細胞核の径より小さい最大幅、又は最大径を有する前記孔と、
前記孔を挟んで設けられた電極と、
第１の流路及び第２の流路の他端に設けられたポンプと、
前記孔に対して電圧を印加するための直流交流信号発生装置と、
第１の流路内と開口部を通じて連通し、第１の流路に平行な第３の流路と、
第３の流路の前記開口部と逆側の端に接続する細胞回収部と、
第１の流路内及び第２の流路内に設けられたピラーと、
を備え、
複数の前記ピラーが、第１の流路内では、第３の流路側の第１の流路の壁に平行に列をなして並び、第２の流路内では、第３の流路側の第２の流路の壁に平行に列をなして並ぶ、装置。

【請求項2】

第３の流路と連通して前記開口部を越えて延在する第４の流路をさらに備える、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記孔を含み、第１の流路の壁及び第２の流路の壁に設けられた細胞保持部をさらに備える、請求項１または２に記載の装置。

【請求項4】

前記ピラーは、第１の流路内では、第１の流路の当該壁に平行に、第２の流路内では、第２の流路の当該壁に平行に、複数の列をなして並ぶ、請求項１に記載の装置。

【請求項5】

第１の流路の当該壁と、第１の流路の当該壁に最も近い前記ピラーの列との第１の間隔、及び第２の流路の当該壁と、第２の流路の当該壁に最も近い前記ピラーの列との第２の間隔は、前記ピラーの列同士の第３の間隔と同じか、第３の間隔より広い、請求項４に記載の装置。

【請求項6】

前記ピラーの列同士の第２の間隔は、使用する細胞の直径と同一か、前記直径より広い、請求項５に記載の装置。

【請求項7】

前記ピラーの列内におけるピラー同士の第４の間隔がほぼ一定である、請求項1～６に記載の装置。

【請求項8】

第１の流路の第３の流路側の壁に最も近いピラーの列における前記ピラー同士の第４の間隔と、前記開口部の開口幅と、前記細胞保持部の開口幅は同一か、この順で小さくなる、請求項1～６に記載の装置。

【請求項9】

前記ピラーが、前記開口部に対向して設けられている、請求項８に記載の装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞製造装置に関する。

【背景技術】

【0002】

ある細胞の細胞核を別の細胞の細胞質内へ移植する核移植は、細胞の性質を変える方法として、医療や産業に重要な役割を果たしている。

【0003】

例えば、細胞核を除去した受精卵に、別個体の体細胞由来の核を移植した後、受精卵を子宮に戻すことでクローン個体を産出する方法や、子宮に戻さず体外で胚盤胞へ発生させて胚性幹細胞 (Embryonic Stem cells: ES細胞) を樹立する体細胞由来胚性幹細胞 (nuclear transfer Embryonic stem cells: NtES細胞) 樹立方法などがある。こうして得られ
たクローン個体やNtES細胞は、畜産や再生医療に発展する基礎研究に寄与している。

【0004】

細胞の性質を変える技術には、細胞核移植以外にも、センダイウイルス法やプロトプラスト-ポリエチレングリコール法、電気的細胞融合法、電界集中細胞融合法などの細胞融
合技術がある。これは、２つ以上の細胞を融合させ、１つの細胞を形成する技術である。この方法では、細胞融合後の１つの細胞内には２つ以上の細胞に由来する細胞核と細胞質が存在する。この融合細胞は、２つ以上の融合した細胞核を有するため、医療応用が制限される。

【0005】

細胞融合技術の内、電界集中型細胞融合法は、２つの細胞を、細胞核の直径以下の幅や径のスリットや孔 (オリフィス) を介して接触させ、スリットやオリフィスでパルス的に電界を集中させることで、２つの細胞膜の接点で電気的に細胞膜が部分的に破壊され、復元する過程で細胞を融合する方法である（例えば、特許文献１、２参照）。この方法では、オリフィスや流路の最大径や最大幅が細胞核径より小さいことにより、細胞核の混合を防ぐことが可能である（例えば、特許文献１、２参照）。近年、Polydimethyl siloxane (PDMS)を使用して作製された様々な流路を用いて細胞融合法が検討されている。例えば、PDMSで製造された２つの平行流路間をオリフィスのみで繋ぎ、各流路末端に細胞供給口と吸引口をそれぞれ設けた流路を用い、オリフィスで細胞対を形成後、細胞融合させる方法がある。例えば、細胞供給口にJurkat細胞または樹状細胞を導入し、吸引口方向へ流路上で細胞を移動させ、オリフィスでJurkat細胞と樹状細胞を融合させ、Jurkat細胞の細胞質を樹状細胞へ移動させた後、界面活性剤を添加し、Jurkat細胞側の流路に流れを生じさせて両細胞を切り
離すことで、細胞質が移動できるようになった（例えば、非特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２００９－１７８１０５号公報

【文献】特開２００７－１７４９０１号公報

【非特許文献】

【0007】

【文献】Cytoplasmic transfer without nuclei mixing between dendritic cells and tumor cells achieved by one to-one electrofusion via micro-orifices in a microfluidic device. 18th International Conference on Miniaturized. Systems for Chemistry and Life Sciences. October 26-30, 2014, San Antonio, Texas, USA

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上述した電界集中型細胞融合法を基に細胞質交換法が開発された。細胞質交換法では、標的体性細胞とｉＰＳ細胞を用いた場合、次の（１）と（２）の手順を経て体性細胞の細胞質をｉＰＳ細胞の細胞質へ交換する。（１） 標的体性細胞と１個目のｉＰＳ細胞を電
界集中型細胞融合(１回目）後、ｉＰＳ細胞のみを切り離すことで、体性細胞の細胞質を
除去する。(２) 新たな２個目のｉＰＳ細胞と、切り離し元の標的体性細胞の電界集中型
細胞融合(２回目）後、体性細胞を切り離すことで、ｉＰＳ細胞の細胞質を体性細胞へ導
入する。

【0009】

この方法では、細胞質交換細胞は、ＰＤＭＳで作製された流路内の第一と第二の２つの細胞供給流路からそれぞれ供給された体性細胞とｉＰＳ細胞を使用して、細胞質交換部で２回の電界集中型細胞融合後に作製される。作製された細胞質交換細胞は、第３の細胞回収流路を経て流路外へ回収可能である。

【0010】

細胞供給流路は、供給される細胞の凝集による流路の閉塞を防ぐため、複数の細胞が流せる広い流路幅を有することが好ましい。一方、細胞回収流路は、核交換細胞以外の未融合の細胞が流入することを抑制するため、核交換細胞のみを流せる程度の狭い流路幅であることが好ましい。

【0011】

このように細胞供給流路と細胞回収流路の幅の差を大きくした場合、細胞を移動させるためにポンプによって流体を移動させる際、圧力損失差が大きくなることで、想定している流体移動の方向とは異なる流体の流れが発生し、細胞を所定の位置に移動させる事が困難となることがある。しかしながら、細胞を所定の位置に移動させるために過度に電圧を上昇させると、細胞にダメージを与えてしまう。

【0012】

そこで、本発明は、細胞供給流路２つと細胞回収流路１つを含む細胞製造装置において、細胞供給流路にピラーを設けることによって、流路内の逆流を抑制し、細胞を所定の位置に移動させ、細胞核を交換することが容易になる細胞製造装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究を行い、以下の発明を完成した。

【0014】

本発明の一実施態様は、第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞の製造装置であって、第１の流路及び第２の流路と、第１の流路及び第２の流路の一端にそれぞれ接続する細胞供給部と、第１の流路の壁と第２の流路の壁との間に設けられ、第１の流路及び第２の流路を貫通させる細胞せん断流路と、孔を挟んで設けられた電極と、第１の流路及び第２の流路の他端に設けられたポンプと、前記孔に対して電圧を印加するための直流交流信号発生装置と、第１の流路内と開口部を通じて連通し、第１の流路に平行な第３の流路と、第３の流路の前記開口部と逆側の端に接続する細胞回収部と、第１の流路内及び第２の流路内に設けられたピラーと、を備える装置である。第３の流路と連通して前記開口部を越えて延在する細胞せん断流路をさらに備えてもよい。また、前記孔を含み、第１の流路の壁及び第２の流路の壁に設けられた細胞保持部をさらに備えてもよい。

【0015】

上記装置において、複数の前記ピラーが、第１の流路内では、第３の流路側の第１の流路の壁に平行に並び、第２の流路内では、第３の流路側の第２の流路の壁に平行に並んでもよい。前記ピラーは、第１の流路内では、第１の流路の当該壁に平行に、第２の流路内では、第２の流路の当該壁に平行に、複数の列をなして並んでもよい。第１の流路の当該壁と、第１の流路の当該壁に最も近い前記ピラーの列との第１の間隔、及び、第２の流路
の当該壁と、第２の流路の当該壁に最も近い前記ピラーの列との第２の間隔、は、前記ピラーの列同士の第３の間隔と同じか、第３の間隔より広くてもよい。前記ピラーの列同士の第３の間隔は、使用する細胞の直径と同一か、前記直径より広くてもよい。前記ピラーの列内におけるピラー同士の第４の間隔がほぼ一定であってもよい。第１の流路の第３の流路側の壁に最も近いピラーの列における前記ピラー同士の第４の間隔と、前記開口部の開口幅と、前記細胞保持部の開口幅は同一か、この順で小さくなってもよい。前記ピラーが、前記開口部に対向して設けられていてもよい。

【発明の効果】

【0016】

本発明によって、流路間の逆流の発生を抑制することができるようになった。そのため、核交換細胞以外の不要な細胞が第３の流路内へ流入することを抑制でき、電圧を過度に上昇させることなしに誘電泳動力によって細胞を所定の位置に容易に誘導できる細胞製造装置を提供することができるようになった。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明の一実施形態に係る細胞の製造工程を示した模式図である。

【図2】本発明の一実施形態に係る細胞製造装置の全体的な構成を示した模式図である。

【図3】本発明の一実施形態に係る細胞製造装置の流路部分を拡大した模式図である。

【図4】本発明の一実施例において、細胞供給部から細胞を供給し（Ａ）、ポンプで流路内を陰圧にすることで、細胞を流路に引き入れた（Ｂ）ときの写真である。

【図5】本発明の一実施例において、ピラーを有しない装置（Ａ）とピラーを有する装置（Ｂ）において、細胞を細胞供給流路へ移動させた時の細胞の挙動を比較した結果を示す写真である。

【図6】本発明の一実施例において、実際に細胞質の交換を行った実験において、各段階での細胞の様子を示す写真である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下、実施例を挙げながら、本発明の実施形態を詳細に述べる。

【0019】

本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

【0020】

＝＝細胞質の交換方法＝＝
本発明の一実施形態に係る第１の細胞の細胞質の交換方法は、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程を含む、細胞質の交換方法であって、
（１）第１の工程の後で第２の工程が行われる、または
（２）第１の細胞の細胞質の４０％～６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％～６０％とが交換される第１の細胞質交換工程によって、第１の工程と第２の工程が同時に行われる、方法である。

【0021】

（２）の場合、細胞質交換工程後の第１の細胞の細胞質の４０％～６０％と、新たな第２の細胞の細胞質の４０％～６０％とが交換される第２の細胞質交換工程がさらに行われてもよく、この第２の細胞質交換工程がさらに１回以上行われてもよい。この工程を繰り
返すことによって、第１の細胞の細胞質が第２の細胞の細胞質に交換される割合が高くなる。

【0022】

本発明の一実施形態に係る細胞質の交換方法を用いて、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造することができる。

【0023】

こうして製造された細胞において、第１の細胞の細胞膜の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。

【0024】

また、第２の細胞の細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。

【0025】

以下、上記交換方法を用いて、細胞を製造する一実施態様を詳細に説明する。

【0026】

＜実施形態Ｉ＞
ここでは、図１を用いて、上記交換方法（１）を用いて行われる、本発明の一実施形態に係る細胞の製造方法を具体的に説明するが、本発明は本実施形態に限定されない。本実施形態では、第１の流路と第２の流路を備え、第１の流路の壁と第２の流路の壁は孔で連通している流路を用い、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造する。

【0027】

第１の工程として、まず、第１の流路にあって、残したい細胞核１０１０と、除去したい細胞質１０２０と、細胞膜１０２５と、を有する第１の細胞１０３０と、第２の流路にある中間体１０４０を、流路中の溶液の流れ１０５０によって、両方の流路の壁を貫通して設けられた孔１０８０の入り口を構成するそれぞれの孔近傍に誘導する（図１－１）。必要に応じて交流１０６０電界を発生させ、その中で細胞を誘導してもよい。流路の壁１０７０は絶縁体で構成されるのが好ましい。第１の流路内の流れ１０５０と第２の流路内の流れ１０５０の方向は特に限定されないが、実質的に平行であることが好ましい。溶液は、細胞を生きた状態で操作できるものであれば特に限定されず、例えば生理食塩水や細胞培養用培地などを例示できる。中間体は特に限定されず、対になった細胞と融合して細胞の細胞質を受け入れられるものであればよいが、具体的な例としては、細胞やリポソームが例示できる。細胞である場合、第１の細胞または第２の細胞と同じ種類であっても異なる種類であってもよい。孔１０８０の形状は特に限定されず、スリット状、円状、長円状であってもよく、壁の厚みと同じ深さを有するため、厚い壁の場合は流路状であってもよい。

【0028】

第２の工程として、誘電泳動力により、孔１０８０を挟んで第１の細胞１０３０と中間体１０４０の第１の対を形成させる（図１－２）。誘電泳動力は、交流１０６０印加による電界集中により流路の壁で生じる。

【0029】

第３の工程として、第１の対に電圧を印加１０９０することで、第１の細胞１０３０と中間体１０４０とを融合して第１の融合細胞１１００を作製する (図１－３)。この時印
加する電圧は、従来細胞融合に用いられることが知られている強さとすることができるが、０．１～５０Ｖであることが好ましく、０．５Ｖ～２０Ｖであることがより好ましく、１～１０Ｖであることがさらに好ましく、１～３Ｖであることがさらに好ましく、約２Ｖ
であることがさらに好ましい。また印加する時間は、特に限定されないが、１μｓｅｃ～１ｍｓｅｃであることが好ましく、１μｓｅｃ～５００μｓｅｃであることがより好ましく、１μｓｅｃ～１００μｓｅｃであることがさらに好ましいが、可能な限り短い時間であることがより好ましい。中間体１０４０が細胞である場合、本工程では、細胞融合後、第１の細胞１０３０と中間体１０４０の細胞質がお互いに混入する。

【0030】

第４の工程として、第１の細胞１０３０の細胞質１０２０を中間体１０４０へ移動させる（図１－４）。この細胞質１０２０の移動は、例えば、第２の流路内の流れ１１２０の速度を、第１の流路内の流れ１１１０の速度より大きくし、その流速差を利用することにより行うことができる。このとき、第１の流路内の流れ１１１０の流速は０、つまり第１の流路内に流れのない状態であってもよい。第１の流路内の流れ１１１０と第２の流路内の流れ１１２０の方向は特に限定されないが、実質的に平行であることが好ましい。ここで、孔１０８０の最大幅または最大径を、第１の細胞の核の径より小さくしておくことにより、第１の細胞１０３０の細胞核１０１０は、孔１０８０を通過できずに第１の流路内に残る。具体的には、孔１０８０の最大幅または最大径は、第１の細胞１０３０の種類によって適宜調整すればよいが、２０μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以下であることがより好ましく、６μｍ以下であることがさらに好ましい。なお、移動させる細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。

【0031】

第５の工程として、第１の細胞１０３０と中間体１０４０を切り離す（図１－５）。第１の細胞１０３０を孔１０８０の入り口で保持しながら、細胞質１０２０を受け取った中間体１０４０を切り離すのが好ましい。この切り離しは、例えば、第２の流路内の流れ１１２０の速度を、第１の流路内の流れ１１１０の速度より大きくし、その流速差を利用することにより行うことができる。第１の流路内の流れ１１１０の流速は０、つまり第１の流路内に流れのない状態であってもよい。

【0032】

このように、本実施形態では、第１の工程から第５の工程までの工程において、中間体を用いることにより、第１の細胞の細胞質を除去することができる。

【0033】

第６の工程として、第１の細胞１０３０に移植したい細胞質１１３０と、必要のない細胞核１１４０を有する第２の細胞１１５０を、流れ１０５０により、孔１０８０の入り口を構成する、第２の流路側の孔近傍に誘導する (図１－６)。必要に応じて交流１０６０
電界を発生させ、その中で細胞を誘導してもよい。

【0034】

第７の工程として、誘電泳動力により、孔１０８０を挟んで第１の細胞１０３０と第２の細胞１１５０の第２の対を形成させる (図１－７)。誘電泳動力は、交流１０６０印加
による電界集中により流路の壁で生じる。

【0035】

第８の工程として、第２の対に電圧を印加１０９０することで第１の細胞１０３０と第２の細胞１１５０を融合して第２の融合細胞１１６０を作製する (図１－８)。この時印
加する電圧は、従来細胞融合に用いられることが知られている強さであればよいが、１～１０Ｖであることが好ましく、２Ｖであることがさらに好ましい。また印加する時間は、１００μｓｅｃであることが好ましく、１００μｓｅｃ以下で可能な限り短い時間であることがさらに好ましい。

【0036】

第９の工程として、第２の細胞１１５０の細胞質１１３０を第１の細胞１０３０へ移動させる (図１－９)。この移動は、例えば、第１の流路内の流れ１１１０の速度を、第２
の流路内の流れ１１２０の速度より大きくし、その流速差を利用することにより行うことができる。第２の流路内の流れ１１２０の流速は０、つまり第２の流路内に流れのない状態であってもよい。ここで、孔１０８０の最大幅または最大径を、第２の細胞の核の径より小さくしておくことにより、第２の細胞１１５０の細胞核１１４０は、孔１０８０を通過できずに第２の流路内に残る。具体的には、孔１０８０の最大幅または最大径は、第２の細胞１１５０の種類によって適宜調整すればよいが、２０μｍ以下であることが好ましく、１０μｍ以下であることがより好ましく、６μｍ以下であることがさらに好ましい。なお、移動させる細胞質の割合は特に限定されないが、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。

【0037】

第１０の工程として、第１の細胞１０３０を、第２の細胞１１５０から切り離す (図１－１０)。こうして、第１の細胞１０３０の細胞質１０２０を、第２の細胞１１５０の細
胞質１１３０に交換することによって、第１の細胞１０３０の細胞核１０１０を有し、第２の細胞１１５０の細胞核１１４０を有さず、第１の細胞１０３０の細胞膜１０２５と第２の細胞１１５０の細胞質１１３０とを含む細胞１１７０の製造が完了する。

【0038】

このように、第６の工程から第１０の工程までの工程によって、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入することができる。

【0039】

本方法において、第１の細胞１０３０と第２の細胞１１５０の細胞種は特に限定されないが、第１の細胞１０３０は体細胞であることが好ましく、線維芽細胞または血球細胞であることがさらに好ましい。また、第２の細胞１１５０は幹細胞であることが好ましく、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、骨格筋幹細胞からなる群から選択されるのがさらに好ましい。第１の細胞１０３０は体細胞とし、第２の細胞１１５０を幹細胞とすることにより、例えば、幹細胞の細胞核を体細胞の細胞核に交換したことと同様の効果が得られる。

【0040】

＜実施形態ＩＩ＞
ここでは、上記交換方法（２）を用いて行われる、本発明の一実施形態に係る細胞の製造方法を具体的に説明するが、本発明は本実施形態に限定されない。本実施形態では、第１の流路と第２の流路を備え、第１の流路の壁と第２の流路の壁は孔で連通している流路を用い、第１の細胞の細胞核を有し、第２の細胞の細胞核を有さず、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞を製造する。第１の工程から第３の工程は、実施形態Ｉに準じるが、中間体として、第２の細胞を用いる。第３の工程終了後、第１の細胞と第２の細胞の細胞質がお互いに混入する。このように、本実施形態では、第１の細胞の細胞質を除去する第１の工程と、第２の細胞の細胞質を第１の細胞へ導入する第２の工程が同時に行われる。この際に、第１の対を融合させたままで、長時間放置すると、第１の細胞と第２の細胞の間で細胞質が均一になるが、交換される細胞質の割合は特に限定されず、第１の細胞の細胞質の１０％～２５％と、第２の細胞の細胞質の１０％～２５％とが交換されることが好ましく、第１の細胞の細胞質の２５％～４０％と、第２の細胞の細胞質の２５％～４０％とが交換されることがより好ましく、第１の細胞の細胞質の４０％～６０％と、第２の細胞の細胞質の４０％～６０％とが交換されることがさらに好ましい。そして、その後、第１の細胞と中間体とを切り離す第５の工程を行う。第５の工程の詳細は、実施形態Ｉに準じる。

【0041】

さらに、第２の流路において新たな第２の細胞を、前記孔に誘導する第１１の工程と、誘電泳動力により、前記孔を介して、第１の細胞と第２の細胞との新たな第１の対を形成させる第１２の工程と、第１の細胞と第２の細胞とを融合する第１３の工程と、第１の細
胞と第２の細胞とを切り離す第１４の工程と、を行ってもよい。第１１～１４の工程の詳細は、実施形態Ｉの第１～３、５の工程に準じる。

【0042】

この後、第１１～１４の工程をさらに１回以上、繰り返してもよいが、１回繰り返すことが好ましく、２回以上繰り返すことがより好ましく、５回以上繰り返すことがさらに好ましい。それによって、交換される細胞質の割合を高めることができるようになる。

【0043】

＝＝細胞質を交換するための装置＝＝
以下、上記の方法を実行することができる本発明の装置の一実施態様を、図２を用いて詳細に説明する。本発明の装置は、細胞の細胞質を交換するための装置であって、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０と、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０のそれぞれ接続する、第１の細胞の細胞供給部である第１の細胞供給部２０１０と第２の細胞及び中間体の細胞供給部である第２の細胞供給部２０２０と、第１の流路の壁と第２の流路の壁との間に設けられた孔２０５０と、孔２０５０を挟んで設けられた電極２０８０と、第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０の流速を調節するポンプ２０１１と、直流交流信号発生装置２０９０と、備える。装置の一要素として、顕微鏡（図示せず）を備えても良い。第１の流路２０３０及び第２の流路２０４０は、細胞質を交換する孔２０５０の近傍において実質的に平行に走っていることが好ましい。

【0044】

細胞の選別を容易にするための追加の第３の流路を設けてもよい。第３の流路は、第１の流路に開口部を有し、その開口部で、第１の流路と連通する。第３の流路は、開口部の反対側の端に細胞回収部を備える。以下、第３の流路を有する実施形態を具体的に説明するが、本発明は、この実施形態に限られないことは言うまでもない。

【0045】

図２に示すように、孔２０５０の近傍に開口部２３３０を有する第３の流路２３１０を、第１の流路２０３０に沿って設けることができる。開口部２３３０は第１の細胞の細胞核を有し、第１の細胞の細胞膜と第２の細胞の細胞質とを含む細胞（以下、細胞質交換細胞と称する）が通過できる大きさであって、その最小幅または最小径は、細胞質交換細胞の大きさによって適宜調整すればよいが、例えば、６μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上であることがより好ましく、２０μｍ以上であることがさらに好ましい。開口部２３３０の最小幅または最小径は、細胞質交換細胞が通過できるのであれば、細胞質交換細胞の直径よりも小さくてもよい。実際、開口部２３３０の最小幅また
は最小径を細胞質交換細胞の直径よりも若干小さくしておき、第３の流路２３１０内の溶液の流速を早くすることによって、細胞を歪ませて第３の流路２３１０内へ細胞を導入するようにすると、一旦第３の流路２３１０に入った細胞質交換細胞は流路外に逆流しにくくなる。第３の流路２３１０は、もう一端で細胞回収部２３４０に接続されており、孔２０５０を通じて作製された細胞質交換細胞を、第３の流路２３１０に送り込んで、細胞回収部２３４０で回収することにより、細胞質の交換処理をされていない細胞や処理途中の細胞から、細胞質交換細胞を分離して回収することが容易になる。

【0046】

第１の流路内及び第２の流路内に、ピラーを設けてもよい。図３を参考にしながら、ピラーを設けた装置の実施形態を詳細に説明する。

【0047】

図３に示すように、本実施形態の装置には、第１の流路３０６０と、第２の流路３１４０内に、それぞれピラー３１００を設ける。それによって、流路間の逆流の発生を抑制することができる。また、本実施形態の装置は、第３の流路としての細胞回収流路３０２０と、それに連通して開口部３１２０を越えて延在する第４の流路としての細胞せん断流路３０１０をさらに備える。

【0048】

ピラー３１００は複数存在し、第１の流路３０６０内では、細胞回収流路３０２０側の
第１の流路３０６０の壁に平行に複数の列をなして並び、第２の流路３１４０内では、細胞回収流路３０２０側の第２の流路３１４０の壁に平行に複数の列をなして並ぶ。これらのピラーの構成により、第１の流路３０６０または第２の流路３１４０と、細胞回収流路３０２０との間の、流体の移動に伴う圧力損失の差は小さくなり、第１の流路３０６０または第２の流路３１４０と細胞回収流路３０２０間で生じる不要な逆流の発生を抑制できるので、安定して、効率よく、細胞を孔３０７０に誘導できる。

【0049】

ここで、ピラーのうち、細胞回収流路３０２０側の第１の流路３０６０の壁及び細胞回収流路３０２０側の第２の流路３１４０の壁に最も近いピラー３０８０だけ、他のピラー３１００と異なる形態で設けてもよい。それによって、細胞回収流路３０２０側に細胞回廊３０９０を構築することができる。細胞回廊３０９０内で、他のピラー３１００間より流体を流れやすくすることで、細胞は主に細胞回廊３０９０を通過する。その結果として、細胞を孔３０７０へ集めやすくなる。例えば、図２-２に示すように、ピラー３０８０
の第１の流路３０６０及び第２の流路３１４０の長手方向の幅をピラー３１００より長くしてもよい。また、細胞回収流路３０２０側の第１の流路３０６０の壁と、当該壁に最も近いピラー３０８０の列との第１の間隔（すなわち、第１の流路３０６０内の細胞回廊３０９０の幅）、及び細胞回収流路３０２０側の第２の流路３１４０の壁と、当該壁に最も近いピラー３０８０の列との第２の間隔（すなわち、第２の流路３１４０内の細胞回廊３０９０の幅）は、ピラー３０８０、３１００の列同士の第３の間隔と同じか、第３の間隔より広くしてもよい。列内のピラー３０８０、３１００同士の間隔は限定されないが、ピラー３０８０同士、およびピラー３１００同士でほぼ等しいことが好ましい。

【0050】

細胞回収流路３０２０の幅は、細胞せん断流路３０１０の幅と同一が望ましく、それによって、細胞質を交換する際に細胞を細胞回収流路３０２０と細胞せん断流路３０１０間で均等な流れで導入することが容易になる。すなわち、細胞回収流路３０２０から細胞せん断流路３０１０、または、細胞せん断流路３０１０から細胞回収流路３０２０の流れは、両流路の縦幅が同じである事から、均一な流れを生じやすく、細胞回収の際、細胞回収流路以外への不要な逆流が発生しにくくなる。

【0051】

細胞せん断流路３０１０は、細胞回収流路３０２０と反対の端で、第１の流路３０６０に対して開口部を有し、その開口部で第１の流路３０６０に連通する。この開口部に、隔壁３０４０を設けてもよい。この隔壁３０４０によって、圧力緩衝部３０３０に滞留した２種類以上の細胞が、細胞せん断流路３０１０へ流入することを抑制する。また、隔壁３０４０近傍の細胞せん断流路３０１０は、細胞維持部３０５０の役割を有する。上述した第５の工程で、第１の流路３０６０側の孔３０７０で作製した細胞質を除いた細胞は、孔３０７０から離れた後、均等な流れに乗って、細胞せん断流路３０１０を通り、細胞維持部３０５０に捕捉され、再び均等な流れに乗って、細胞せん断流路３０１０を通ることで、孔３０７０へ戻ることができる。また細胞せん断流路３０１の壁には、第１の流路３０５０に開口し、細胞せん断流路３０１が第１の流路３０６０に連通するための圧損緩衝部３００３を設けてもよい。この圧損緩衝部３００３を設けることで、第１の流路３０６０から細胞せん断流路３０１０に流れを生じさせることができる。

【0052】

図３－４に示すように、細胞せん断流路３０１０は、細胞回収流路３０２０が開口部３１２０を越えて延在することで構成される。開口部３１２０の近傍の、第１の流路３０５０と第２の流路３１４０を隔てる壁には孔３０７０が存在するが、孔３０７０を挟んで細胞保持部３１１０を設けてもよい。細胞保持部３１１０は、第１の流路３０５０と第２の流路３１４０のそれぞれの壁に設けられた窪みであって、孔３０７０を通じて二つの細胞が融合する際、細胞が安定して存在するためのものである。窪みの形状は特に限定されず、例えば、孔３０７０の位置での横断面がおわん型であってもよいが、孔３０７０から壁表面までの傾斜は、シグモイド状であることが好ましい。

【0053】

ここで、細胞保持部３１１０の開口の幅（すなわち、前記断面における開口の幅）と、開口部３１２０の開口の幅と、列内のピラー３０８０同士の間隔は、同一か、または、列内のピラー３０８０同士の間隔＞開口部３１２０の開口の幅＞細胞保持部３１１０の開口の幅の順で狭くなる方が望ましい。横幅が狭いほど、電界集中が生じやすく、結果として同じ電圧印加の下で誘電泳動力が強くなる。従って、細胞回廊３０９０を通る細胞は、ピラー３０８０間よりも、開口部３１２０へ移動しやすく、開口部３１２０内へ移動した細胞は、細胞保持部３１１０へ移動して、孔３０７０へ吸引されやすい。

【0054】

また、細胞回廊３０９０の幅と、列内のピラー３０８０同士の間隔は、同じか、列内のピラー３０８０同士の間隔＞細胞回廊３０９０の幅の順で狭いほうが望ましい。それによって、細胞回廊３０９０を通過する細胞は、列内のピラー３０８０同士の間隔の近傍を通過する際に、誘電泳動力の強い細胞回廊３０９０を通過しやすくなる。

【0055】

＝＝細胞質を交換するための装置の使用方法＝＝
以下、図１（細胞質交換の際の孔の近傍の図）と図２（装置の全体構成図）と図３（細胞流路の詳細図）を参照しながら、上述の装置を用いた具体的な細胞質の交換方法について、さらに詳しく説明する。

【0056】

まず、図２で示すように、ポンプ２０１１を用いて、第１の細胞供給部２０１０内の第１の細胞１０３０と、第２の細胞供給部２０２０内の中間細胞１０４０を、第１の流路２０３０と第２の流路２０４０内へ移動させる。

【0057】

細胞質交換へ使用できる細胞は、第一の流路２０３０と第二の流路２０４０間に設けられた孔２０５０近傍にいる細胞である。従って、細胞は、第一の流路２０３０と第二の流路２０４０間の壁に沿って流れることが好ましく、例えば、細胞が流れるときの壁からの距離としては、１２０μｍ程度以内が好ましく、４０μｍ以内が最も望ましい。

【0058】

図３－１で示すように、ピラーを設けた装置では、第１の細胞３１５０と中間細胞３０１６は、第１の流路３０６０と第２の流路３１４０内で全面に広がって移動せず、相対的に圧力損失が小さい細胞回廊３０９０内を概ね移動する。一方で、各ピラーの列同士の間隔と、細胞回収流路の幅及び細胞せん断流路の幅との差は、ピラーを設けていない場合の第１の流路の幅及び第２の流路の幅と、細胞回収流路の幅及び細胞せん断流路の幅との差と比べて、圧倒的に小さいため、逆流による意図しない細胞の移動は抑制される。

【0059】

図３－４で示すように、逆流が抑制された条件で、電圧を印加すると、ピラー３０８０間＜細胞回廊３０９０＜開口部３１２０＜細胞保持部３１１０＜孔３０７０の順序で誘電泳動力が強くなるため、第１の細胞３１５０は、細胞回廊３０９０から細胞誘導路３１２０を経て細胞保持部３１１０へ移り孔３０７０に吸引される。中間細胞３０１６は細胞回廊３０９０から細胞保持部３１１０へ移り孔３０７０に吸引される。この工程は、図１－１で示す第１の工程に準ずる。

【0060】

第２の工程と第３の工程は、図１-２と図１-３の説明に準ずる。

【0061】

第４の工程では、第１の細胞融合に関わらない第１の細胞と、中間細胞は、細胞回廊３０９０を経て、細胞誘導部３１２０へ入らず、圧力緩衝部３０３０へ抜ける。

【0062】

第５の工程～第８の工程は、図１-５～図１-８の説明に準じる。図１－５で示す第５の工程の途中で、第１の細胞１０３０が孔１０８０から抜けて、中間細胞１０４０と共に移動しても、図３－１で示すように、第１の細胞は、細胞せん断流路３０１０を経て、細胞
維持部３０５０で捕捉されるため、再び、細胞せん断流路３０１０を経て孔３０７０へ戻すことができる。

【0063】

第９の工程中で、第１の細胞は、細胞せん断流路３０１０からの流れにより、細胞回収流路３０２０へ導入される。この工程の途中で、圧力緩衝部３０３０の第２の細胞融合に関わらない第１の細胞と中間細胞は、隔壁３０４０により細胞せん断流路３０５０へ直接流入することが抑制され、流路幅が相対的に広い細胞回廊３０９０を通り、圧損緩衝部３００３や細胞誘導部３１２０内へ入る事無く、第１の細胞供給部や、第２の細胞供給部へ戻る。

【0064】

第１０の工程で、第１の細胞は、細胞回収流路３０２０へ入り、細胞回収流路３０２０を通って、図２で示すように、細胞回収部２３４０へ達し、流路外へ回収可能になる。

【実施例】

【0065】

本実施例では、ピラーを有する装置を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞質を、細胞質を除去した別のｉＰＳ細胞内へ移植する。用いた装置は、以下の通りである。

【0066】

・ファンクションジェネレーター
交流印加条件：周波数１ＭＨｚ、電圧５Ｖ
パルス印加条件：時間１００μｓ、電圧１０Ｖ
・デジタルオシロスコープ
・バイポーラ電力増幅装置
・位相差・蛍光顕微鏡
また、蛍光染色試薬は、以下のものを用いた。

【0067】

・使用蛍光染色試薬：
・Calcein, AM - Special Packaging (Excitation/Emission (nm): 494/514 C3100MP、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、マサチューセッツ・米国)、細胞質を緑色染
色する
・CellTrace^TM Calcein Red-Orange, AM - Special Packaging (Excitation/Emission (nm): 577/590、C34851、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)、細胞質を赤色染色する
・Cellstain^R Hoechst 33342 solution (Excitation/Emission (nm): 350/461、346-07951、(株)同仁化学研究所、東京・日本)、細胞核を青色染色する
Ｊｕｒｋａｔ細胞懸濁液（１ｘ１０^６個／ｍＬ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）とｉＰＳ細胞懸濁液（１ｘ１０^６個／ｍＬ、ｍＴｅＳＲＴＭ１）を１ｍＬずつ２本の１５ｍＬ遠心管に加え、一方の遠心管ＡにCalcein AM １μＬ、もう一方の遠心管ＢにはCalcein red-orange １μＬとHoechst33342 １μＬを加えて、３７℃で３分間インキュベーションして細胞質と細胞核を染色した。余分な染色試薬を除くため、遠心管をそれぞれ６００ｒｐｍと１０００ｒｐｍで２分間遠心した後、上清を除去した。

【0068】

沈殿した細胞に対して、細胞融合用緩衝液（２００ｍＭソルビトール、１ｍＭ酢酸カルシウム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍｇ／ｍＬ牛血清アルブミン）１ｍＬを加えて混合した。再び遠心管を上記と同条件で遠心して、生細胞を沈殿させ、上清を１ｍＬ除去した。この細胞洗浄工程をさらに２回繰り返した。最後に、細胞融合緩衝液を１５０μＬ加えて混合して、細胞融合用細胞懸濁液とした。以下、図６の写真を参考にしながら、各工程を説明する。

【0069】

＜細胞融合１回目＞
図２に示したようなＰＤＭＳデバイスであって、図３に示したようなピラーを有する装
置上の細胞供給口Ａへ遠心管Ａの細胞懸濁液（細胞Ａ含有）を加え、細胞供給口であるサンプリングポートＢへ遠心管Ｂの細胞懸濁液（細胞Ｂ含有）を加えた。ポンプとしてピペットマンで流路を陰圧にし、細胞懸濁液を細胞供給口から細胞供給流路へ移動させると、図４Ａに示したような液体の流れが生じ、細胞が流路内を流れるようになる。

【0070】

図５は、ピラーを有しない装置（Ａ）とピラーを有する本発明の装置（Ｂ）において、細胞を細胞供給流路へ移動させた時の細胞の挙動を比較した結果である。ピラーを有しない装置（Ａ）では、細胞供給口から導入された細胞は流路全体に広がってしまう。しかし、実際には、４００μｍの流路幅に対して、壁から４０μｍ以内の細胞しか使用できないため、細胞供給口から供給された細胞のうち多くとも１０％程度の細胞しか孔へ誘導できない。望ましい距離から離れた細胞を利用するためには、交流電圧を高くする必要があり、その場合、細胞へ高い電圧負荷が掛かって細胞が破裂したり、細胞の形が保たれていても、細胞膜が健康に維持されている細胞が少なくなったりするので、核交換の成功率が減少する。また、流路内へ大量の細胞を供給することによって、流路の壁近傍に、数多くの細胞を供給すると、細胞が流路内で凝集し、流路を閉塞することがあり、こうした場合、核交換の成功率が下がるだけでなく、流路自体の使用ができなくなることがある。

【0071】

一方、ピラーを有する本発明の装置（Ｂ）では、細胞供給口から供給した細胞の８０％程度が細胞回廊を移動するため、利用できる細胞の割合が著しく高くなった。そのため、また流路内へ多量の細胞を供給する必要がなくなり、細胞の凝集による流路の閉塞の危険性が著しく減少した。

【0072】

この後、交流印加による誘電泳動力により細胞Ａを細胞回廊から細胞保持部へ導き、また、細胞Ｂを細胞保持部へ導き、細胞保持部間の細胞融合のための孔を挟んで細胞ＡとＢの対を形成させた（図６－１：位相差；図６－２：蛍光視野）。パルスを１回以上印加しながら、パルス印加過程を位相差と蛍光視野で観察して、細胞融合による蛍光色素の移動を確認した（図６－３）。

【0073】

＜細胞核の回収＞
交流印加を停止して、ピペットマンで流路を陰圧にすることで、細胞Ａの細胞質を細胞Ｂへ移動させた（図６－４）。引き続きピペットマンで流路を陰圧にすることで細胞Ａから細胞Ｂを分離する一方、再び交流を印加することで、細胞Ａの核を孔に維持した（図６－５）。

【0074】

＜細胞融合２回目＞
再びピペットマン１で細胞懸濁液を吸引し、別の細胞Ｂを細胞保持部近傍へ導いた。交流印加による誘電泳動力により細胞Ｂを細胞保持部内へ導いて、孔を挟んで細胞ＡとＢの対を形成させた（図６－６：位相差；図６－７：蛍光視野）。パルスを１回以上印加しながら、パルス印加過程を位相差と蛍光視野で観察し、細胞融合による蛍光色素の移動を確認した（図６－８：蛍光視野；図６－９：位相差）。

【0075】

＜細胞質の移植＞
交流印加を停止して、ピペットマンで流路を陽圧にして、細胞Ａへ細胞Ｂの細胞質を移動させた（図６－１０）。引き続きピペットマンで流路を陽圧にして、細胞Ａを細胞Ｂから分離した。分離した細胞Ａは、細胞回収流路を経て細胞回収口へは移動し、細胞Ａは細胞回収口から流路外へ回収可能となった。これにより、細胞Ａの細胞核は、細胞質との関係において、細胞Ｂの細胞質内へ移植したのと同様の効果が得られた。

【0076】

なお、ピラーを有しない装置と比較し、ピラーを有する装置における核交換の成功率は、全体として３倍以上改善された。

【符号の説明】

【0077】

１０１０ 第１の細胞の細胞核
１０２０ 第１の細胞の細胞質
１０２５ 第１の細胞の細胞膜
１０３０ 第１の細胞
１０４０ 中間体
１０５０ 溶液の流れ（第１の流路と第２の流路で流速が同じ場合）
１０６０ 交流
１０７０ 壁
１０８０ 孔
１０９０ 電圧印加
１１００ 第１の融合細胞
１１１０ 第１の流路における溶液の流れ
１１２０ 第２の流路における溶液の流れ
１１３０ 第２の細胞の細胞質
１１４０ 第２の細胞の細胞核
１１５０ 第２の細胞
１１６０ 第２の融合細胞
１１７０ 細胞質を交換した細胞（細胞質交換細胞）
２０１０ 第１の細胞供給部
２０１１ ポンプ
２０２０ 第２の細胞供給部
２０３０ 第１の流路
２０４０ 第２の流路
２０５０ 孔
２０８０ 電極
２０９０ 直流交流信号発生制御装置
２３１０ 第３の流路
２３３０ 開口部
２３４０ 細胞回収部
３００３ 圧損緩衝部
３０１０ 細胞せん断流路
３０１６ 中間細胞
３０２０ 細胞回収流路
３０３０ 圧力緩衝部
３０４０ 隔壁
３０５０ 細胞維持部
３０６０ 第１の流路
３０７０ 孔
３０８０ 壁に最も近いピラー
３０９０ 細胞回廊
３１００ ピラー
３１１０ 細胞保持部
３１２０ 開口部
３１４０ 第２の流路
３１５０ 第１の細胞

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】