特許 7049738 歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-30

(45)【発行日】2022-04-07

(54)【発明の名称】歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20220331BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220331BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20220331BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20220331BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12Q1/02

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2018100314

(22)【出願日】2018-05-25

(65)【公開番号】P2019201603

(43)【公開日】2019-11-28

【審査請求日】2021-01-20

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 日本歯周病会会誌、２０１７年１１月２８日、第５９巻、秋季特別号、第３８頁、第１９７頁で発表

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 平成２９年１２月１５日国立京都国際会館において開催された平成２９年度日本歯周病学会６０周年記念京都大会で発表

(73)【特許権者】

【識別番号】000226437

【氏名又は名称】日光ケミカルズ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】301068114

【氏名又は名称】株式会社コスモステクニカルセンター

(73)【特許権者】

【識別番号】000186588

【氏名又は名称】小林製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000671

【氏名又は名称】八田国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】清水 健司

(72)【発明者】

【氏名】矢作 彰一

(72)【発明者】

【氏名】戸田 雅人

【審査官】竹内 祐樹

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１６－０４９１０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】PLoS One, 2014, 9(9):e106766

【文献】Arch. Oral Biol., 2015, 60(6), pp.845-853

【文献】J. Vis. Exp., 2018 Apr 3, 134:57157

【文献】Biochem. Biophys. Res. Commun., 2018, 495(4), pp.2383-2389, Epub 2017 Dec 24

【文献】J. Periodontol., 2012, 83(2), pp.242-247

【文献】「世界のウェブアーカイブ｜国立国会図書館インターネット資料収集保存事業」、[online]、平成２９年６月３０日、［令和３年１０月２８日検索］，インターネット＜URL: https://web.archive.org/web/20170630002136/https://www.mattek.com/products/epioral-epigingival/#techspecs＞

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

角化組織を有する正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、１０～５００μｇ／ｍＬの病原因子を含み、病原細菌を含まない培地で前記正常状態の三次元歯肉上皮モデルを傷つけることなく培養して、歯周病様状態を誘導する誘導工程を有する、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法。

【請求項2】

前記誘導工程において、前記正常状態の三次元歯肉上皮モデルの角化組織側に前記病原因子を添加して培養する、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記正常状態の三次元歯肉上皮モデルが、正常ヒト歯肉上皮細胞をポリカーボネートフィルター上で気液界面培養することにより構築されたものである、請求項１または２に記載の製造方法。

【請求項4】

前記誘導工程後、炎症性因子の放出量を測定する工程および歯肉細胞の組織学的な変化を測定または観察する工程の少なくとも一方をさらに有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法により製造された、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデル。

【請求項6】

請求項５に記載の歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを用いる、被験物質を評価またはスクリーニングする方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

歯周病は、生活習慣病の一つで、口腔内の細菌の感染によって引き起こされる炎症性疾患である。歯垢中の細菌により歯肉組織に炎症が引き起こされ、近年ではこの歯肉の炎症が、脳梗塞、動脈硬化、糖尿病をはじめとする全身疾患と関係するとされていることから、歯周病を予防する事が全身の生活習慣病を予防することにつながると考えられている。

【0003】

歯周病の予防、治療法を評価するにあたっては、動物の歯周組織を摘出する手法（特許文献１）や、ヒト臨床試験が一般的である。しかし、このような方法では、予防・治療剤のスクリーニングを同時に多検体で行うことは困難であったり、試験費用が非常に高額であったり、さらに動物試験では、個体差によるバラツキが多く、実施施設により実験結果に差が生じやすいといった問題があった。また近年、動物愛護の観点からも動物実験に代わる試験法の開発が望まれている。

【0004】

上記問題に対し、近年、細胞を用いた試験法に関する研究が進められている。歯肉関連細胞を用いた研究として、歯肉組織から採取した細胞を培養し、メカニズム解明や基礎研究がおこなわれている。歯肉上皮細胞の単層培養系においては、細菌内毒素などを培地に添加し、炎症応答を得る評価方法は細胞の取扱いが容易であり、費用も安いことから広く用いられている（非特許文献１～４）。ただしこれらの単層培養系では、細胞の分化形態は一様であり、単層のみからなり角化層を有していないため、１層のみからなる細胞レベルでの応答確認にとどまり、立体的な組織としての応答を評価することが困難であった。さらに培地に浸漬した状態での維持となり口腔内の環境を必ずしも模していないという問題があった。

【0005】

一方、化粧品など皮膚研究の分野では、動物実験に代わる実験方法の１つとして、三次元に構築された人工皮膚モデルを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験が普及しており、様々なタイプの人工皮膚モデルの作製およびこれらを用いた試験方法について研究されている。

【0006】

オーラルケア分野では、動物実験が一般的であった背景もあり、歯肉上皮細胞を立体構築した三次元組織モデルについては十分に研究されていない。しかし、歯肉上皮細胞においても、気層培養することで角化層を有する三次元構築されたモデルを誘導することが可能である。例えば、乾燥羊膜を支持体として培養重層上皮シートを作製する方法（特許文献２）が報告されているが、乾燥羊膜がヒトを含む動物の胎児を包む生羊膜由来であり、大学等での研究に留まり、一般的な評価法としては普及していない。細胞を積層化する培養法は難易度が高く、品質やクオリティコントロールが非常に難しい。そこで、一定のクオリティコントロールのされている三次元歯肉上皮モデルを用いて、安定的に歯周病様の炎症誘導を行うことができれば、歯周病の予防・治療研究に有用であり、動物愛護の観点からも、三次元歯肉上皮モデルの活用が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特開２００６－１０５９６９号公報

【文献】特開２００８－１９９９７２号公報

【非特許文献】

【0008】

【文献】日歯周誌 ５５（４）：２８７－２９３，２０１３

【文献】日歯周誌 ５５（４）：３１５－３２２，２０１３

【文献】ＰＬｏｓ ＯＮＥ ４（６）：５ｅ１８２７８７，２０１１

【文献】Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ ９２（６）：５１８－５２３，２０１３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

上述の通り、従来、口腔ケアの評価方法としては、動物やヒト臨床試験もしくは歯肉上皮の単層培養系にて評価する方法が用いられてきた。動物やヒト臨床試験では、個体値や症例の程度が異なり均一条件での試験の継続的な実施が困難である。また研究費用が非常に高額であるという問題があった。一方、単層培養系では、研究費用は安価であるものの、角化層を含まずかつ１層のみからなる細胞レベルでの応答確認にとどまり、立体的な組織としての応答を評価することが困難であった。さらに培地に浸漬した状態での維持となり口腔内の環境を必ずしも模していないという問題があった。

【0010】

したがって、本発明は、三次元歯肉上皮モデルにおいて歯周病様状態を誘導する手段を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養することで、炎症性因子の放出量の増加および歯肉上皮の細胞接着の脆弱化等の組織学的な変化を誘導し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを構築できることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0012】

すなわち、本発明の一形態によれば、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養して、歯周病様状態を誘導する誘導工程を有する、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法が提供される。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、三次元歯肉上皮モデルにおいて歯周病様状態を誘導する手段を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、実施例における三次元歯肉上皮モデルの組織切片像の顕微鏡写真である。

【図2】図２は、本発明の一実施形態で使用する培養用プレートを示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることはない。

【0016】

＜歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法＞
本発明の一形態は、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養して、歯周病様状態を誘導する誘導工程を有する、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの製造方法である。

【0017】

本発明に係る製造方法は、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養して、歯周病様状態を誘導する誘導工程を有する。

【0018】

三次元歯肉上皮モデルとは、ヒト歯肉上皮にきわめて類似した組織学的形態を有する人工再生組織モデルであり、角化組織を有する。歯周病様状態とは、歯周病様の炎症が誘導された状態であり、後述するように、炎症性因子の放出量の増加、細胞接着の脆弱化や細胞形状の変化などの歯肉細胞の組織学的な変化などによって、判断することができる。一方、正常状態とは、健康なヒト歯肉上皮と類似した組織学的形態の状態であり、少なくとも炎症の症状を有さない状態である。

【0019】

正常状態の三次元歯肉上皮モデルは、正常ヒト歯肉上皮細胞をポリカーボネートフィルター上などで気液界面培養することにより構築されたものであることが好ましい。これにより、健常なヒト歯肉上皮にきわめて類似した組織学的形態を有する三次元歯肉上皮モデルを製造することができる。また、歯肉上皮モデルが三次元の組織モデルであること、すなわち歯肉上皮細胞が積層されていることは、顆粒層でのフィラグリンの発現、基底層上部でのケラチン６、ケラチン１０、ケラチン１３、ケラチン１６の発現などの組織学的な形態を確認することで判断することができる。このような正常状態の三次元歯肉上皮モデルの市販品としては、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（株式会社ニコダームリサーチ）などが挙げられる。

【0020】

本発明に係る製造方法では、上記正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養することを有する。これにより、効果的に歯肉上皮細胞を歯周病様状態へと誘導することができる。

【0021】

病原因子としては、歯周病を誘導できる物質であれば、特に制限されず、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）などの細菌内毒素、膜タンパク（ＯＭＰ）、Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｅ－ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））などの病原細菌の構成成分などが挙げられる。これらの病原因子としては、細菌由来のものを使用できる。病原因子が由来する細菌としては、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、タンネレラ・ファーサイシア（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｉａ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）などの歯周病原細菌；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などが挙げられる。病原因子は、好ましくはＬＰＳ、ＯＭＰおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）から選択される少なくとも一つであり、より好ましくはＬＰＳである。

【0022】

病原因子は、ヒト口腔内から採取された口腔内細菌やヒト体内から採取された病原細菌、これらの細菌由来の成分などを超音波処理により微細化する方法で調製することができる。また、市販品を用いることもでき、例えばＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１（富士フイルム和光純薬株式会社）、ＬＰＳ－ＰＧ（ＬＰＳ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来）（ナカライテスク株式会社）などが挙げられる。

【0023】

培地に含まれる病原因子の量は、歯周病様状態を誘導することができれば特に制限されないが、例えば０．０１～１０００μｇ／ｍＬであり、好ましくは１０～５００μｇ／ｍＬであり、より好ましくは５０～２００μｇ／ｍＬである。

【0024】

病原細菌としては、公知の歯周病状態を誘導できる細菌を使用できる。病原細菌としては、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、トレポネーマ・デンティコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）などが挙げられる。

【0025】

培地に含まれる病原細菌の量は、歯周病様状態を誘導することができれば特に制限されないが、例えば１．０×１０^４～１．０．×１０^９ＣＦＵ／モデルであり、好ましくは１．０×１０^６～１．０×１０^８ＣＦＵ／モデルである。

【0026】

培地としては、三次元歯肉上皮モデルを維持培養できる維持培地であれば、特に制限されない。例えば、三次元歯肉上皮モデルとしてＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（株式会社ニコダームリサーチ）を使用する場合、同モデル専用であるＭＡＩＮＴＥＮＡＮＣＥ ＭＥＤＩＵＭ、必要に応じてＧＲＯＷＴＨ ＭＥＤＩＵＭを維持培地として使用できる。

【0027】

三次元歯肉上皮モデルの培養方法は、特に制限されず、培養する三次元歯肉上皮モデルに応じて適宜選択できる。ヒト歯肉上皮細胞を用いた三次元歯肉上皮モデルの場合、培養温度は、通常、３６～３８℃程度であり、好ましくは約３７℃である。培地のｐＨは、特に制限されないが、通常６～８程度である。培養時間は、特に制限されず、使用する病原因子および病原細菌によって異なるが、歯周病様の炎症が誘導されればよく、例えば１時間～７日間である。細菌内毒素を用いる場合、培養時間は、通常２４時間以上であり、好ましくは２４～９６時間であり、より好ましくは４０～８０時間である。

【0028】

正常状態の三次元歯肉上皮モデルが歯周病様状態に誘導されたことは、炎症性因子の放出量や歯肉細胞の組織学的な変化により確認できる。

【0029】

ヒト口腔内における歯周病状態では、炎症性因子の放出量が増加し炎症状態になることや、細胞接着の脆弱化、細胞形状の変化といった組織学的な変化が知られている。

【0030】

したがって、本発明に係る製造方法において、上記誘導工程後、炎症性因子の放出量を測定する工程および歯肉細胞の組織学的な変化を測定または観察する工程の少なくとも一方をさらに有することが好ましい。

【0031】

炎症性因子としては、ＴＮＦα（腫瘍壊死因子、Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α）、インターロイキン類（ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１ｌｒａ、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２）、ケモカイン類（ＩＬ－８、ＭＧＳＡ／Ｇｒｏ、γＩＰ－１０、ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ）、コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ）、増殖因子（ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤ－ＥＣＧＦ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＮＧＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）、プロスタグランジン（ＰＧＥ２）、エンドセリン（ＥＴ）などが挙げられる。炎症性因子は、好ましくはＴＮＦα、およびインターロイキン類である。これらの炎症性因子の放出量の増加は、炎症状態であることを示し、よって三次元歯肉上皮モデルが歯周病様状態に誘導されたことを判断できる。

【0032】

炎症性因子の放出量は、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定することができる。炎症性因子の放出量がコントロールの炎症性因子の放出量と対比して有意に多いときに、正常状態の三次元歯肉上皮モデルが歯周病様状態に誘導されていると判断することができる。「有意」のレベルは、統計的に適宜設定でき、例えば有意水準として５％（０．０５）といった基準を設定できる。

【0033】

細胞接着の脆弱化とは、細胞接着因子の減少により、細胞間の接着力が弱まり、細胞同士の結合が緩くなり、組織として崩れやすくなった状態を指す。このような細胞接着の脆弱化は、細胞凍結切片の組織像観察、ギャップジャンクションやタイトジャンクション（ＺＯ－１、オクルディン、クローディン）およびアドヘレンスジャンクション（カドヘリン、特にＥ－カドヘリン）や接着分子（ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＥＬＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１、インテグリン、フィブロネクチン、ラミニン）など細胞接着因子の測定または組織染色像による観察、バリア機能の評価として一般的な経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）またはそれに代わるイオンインデックス（Ｐ値）の測定により確認できる。

【0034】

組織像観察、組織染色像による観察および経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）は、従来公知の手法を用いることができる。細胞接着因子の測定には、例えばＥＬＩＳＡ法を使用できる。また、イオンインデックス（Ｐ値）とは、高感度角層膜厚・水分計を用いて交流印加により測定され、角層の厚さやバリア機能の指標となる値である。本形態の製造方法において、Ｐ値は、７０以上であり、好ましくは８０以上であり、より好ましくは１００以上であり、さらに好ましくは２００以上である。

【0035】

すなわち、「歯肉細胞の組織学的な変化を測定または観察する工程」とは、細胞凍結切片の組織像観察、細胞接着因子の測定、組織染色像による観察、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の測定およびイオンインデックス（Ｐ値）の測定の少なくとも一つを実施することを意味する。

【0036】

正常状態の三次元歯肉上皮モデルが歯周病様状態に誘導されたことを判断する場合、複数の測定および観察を組み合わせることが好ましい。好ましい組み合わせとしては、組織染色像による観察およびＰ値の測定である。

【0037】

一実施形態では、誘導工程において、正常状態の三次元歯肉上皮モデルの角化組織側に病原因子および病原細菌の少なくとも一方を添加して培養してもよい。角化組織側および培地側の双方に病原因子および病原細菌の少なくとも一方を添加することにより、より顕著な歯周病状態を誘導することができる。

【0038】

図２は、一実施形態で使用する培養用プレートの模式図である。図２に示すように、ウェル（プレート）３には、三次元歯肉上皮モデルのウェル２が配置され、正常状態の三次元上皮モデル（細胞部分）１と接触するように病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地４が充填されている。必要に応じて、正常状態の三次元上皮モデル（細胞部分）１の上部（角化組織側）に病原因子および病原細菌の少なくとも一方を添加してもよい。

【0039】

本発明の一実施形態は、本発明に係る製造方法により製造された、歯周病様状態の三次元上皮モデルである。歯周病様状態の三次元上皮モデルは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの歯周病様状態を再現することができ、ヒトや動物を用いることなく、個体値や歯周病の程度のバラツキが抑えられ、再現性の高い試験評価を行うことができる。また、安定的に複数のモデルに対して歯周病様状態を再現できることから、歯周病に対する予防・治療に関わる成分および／または改善作用のある成分を含む薬剤や組成物がもつ作用の評価や開発を効率よく行うことができる。

【0040】

したがって、本発明の一実施形態は、本発明に係る製造方法により製造された歯周病様状態の三次元上皮モデルを用いる、被験物質を評価またはスクリーニングする方法である。具体的には、前記被験物質の存在下、前記歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを培養する。この際、コントロールとして、被験物質の非存在下で培養した歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを用いることが好ましい。被験物質の存在下および非存在下で培養した歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを比較することにより、被験物質の有用性、安全性などを判断することができる。被験物質の評価およびスクリーニングは、培養後、炎症性因子の放出量を測定したり、細胞接着の脆弱化、細胞形状の変化といった組織学的な変化を調べたりすることにより、行うことができる。コントロールと比較して、炎症性因子の放出量の低下、接着の脆弱化の抑制により、被験物質の有用性を評価できる。

【0041】

被験物質の評価またはスクリーニング方法では、好ましくは被験物質の存在下、必要に応じて非存在下で、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを培養することを有する。

【0042】

被験物質としては、特に制限されないが、鎮痛・消炎・抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ、ステロイドなど）、抗生物質、動植物からの抽出物、生薬、核酸、糖類、糖アルコール、ポリペプチドなどを挙げることができる。被験物質は、新規なものであっても、公知のものでもよい。

【0043】

＜三次元歯肉上皮モデルにおける歯周病様状態を誘導する方法＞
本発明の別の形態は、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養することを有する、三次元歯肉上皮モデルにおける歯周病様状態を誘導する方法である。

【0044】

本発明に係る三次元歯肉上皮モデルにおける歯周病様状態を誘導する方法において、正常状態の三次元歯肉上皮モデルを、病原因子および病原細菌の少なくとも一方を含む培地で培養する方法は、上記本発明に係る製造方法と同じ方法が用いられる。よって、ここでは、詳細な説明を省略する。

【実施例】

【0045】

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれに限定されるものではない。

【0046】

実施例１：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＬＰＳによる歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの作製
１．試験概要
Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＬＰＳを用いて歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを作製して、炎症性因子の放出量と組織学上の変化を確認した。

【0047】

２．試験試料
三次元歯肉上皮モデル：ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（株式会社ニコダームリサーチ）
細菌内毒素：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１（富士フイルム和光純薬株式会社）
ＰＢＳ（－）：リン酸緩衝生理食塩水。

【0048】

３．試験方法
ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（以下、「ＨＧＥ」とも称す）を製造会社のプロトコルに従って、維持培地（ＭＡＩＮＴＥＮＡＮＣＥ ＭＥＤＩＵＭ）を添加したプレートにて一晩馴化した。培地として、維持培地（コントロール）または５０、１００もしくは２００μｇ／ｍＬのＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１（以下、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ」とも称す）を含有する維持培地を別のプレートに１ｍＬ添加して、馴化したＨＧＥを設置した。設置後、ＰＢＳ（－）１５０μＬをＨＧＥ上部に適用して、３７℃にて培養を開始した。４８時間培養後、培地を維持培地に交換した。ＨＧＥ上部のＰＢＳ（－）を除去した後、ＰＢＳ（－）を１５０μＬ適用し、さらに２４時間培養した（７２時間培養）。

【0049】

４８時間培養後の培地および７２時間培養後の培地を回収して、培養上清中の炎症性因子（４８時間培養後：ＴＮＦα、ＩＬ－６およびＩＬ－８、７２時間培養後：ＴＮＦαおよびＩＬ－８）の量を、ＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて測定した。バリア機能は、角層膜厚・水分計ＡＳＡ－ＭＸ１００（日本アッシュ株式会社）を用いて、Ｐ値（イオンインデックス）を測定した。測定後の三次元歯肉上皮モデルから凍結切片を作成して組織像を顕微鏡（カールツァイス社製、倍率：１００）を用いて観察した。有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を行い、コントロールと比較評価した。

【0050】

７２時間培養後のＨＧＥの細胞生存率をアラマブルー法にて評価したところ、細胞生存率は、ほぼ１００％であった（データ示さず）。

【0051】

４．結果
回収した培地中の炎症性因子の測定結果を表１～３に示す。培養４８時間後のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳを含む培地では、ＴＮＦα、ＩＬ－６およびＩＬ－８の有意な増加が認められた（表１～３）。維持培地（Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ未含有培地）に交換して、さらに２４時間培養した培地では、ＴＮＦαおよびＩＬ－８の有意な増加が維持されていることが確認された（表１および３）。７２時間培養終了後のＨＧＥのＰ値は有意に増加し（表４）、組織切片像においても細胞接着の脆弱化を確認した（図１）。これらの変化は歯周病に見られる特徴である。

【0052】

【表1】

【0053】

【表2】

【0054】

【表3】

【0055】

【表4】

【0056】

実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ＬＰＳによる歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを用いた薬剤の有用性評価
１．試験概要
歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを用いた抗炎症剤の有用性を評価した。

【0057】

２．試験試料
三次元歯肉上皮モデル：ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（株式会社ニコダームリサーチ）
細菌内毒素（ＬＰＳ）：Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１（富士フイルム和光純薬株式会社）
抗炎症剤：グリチルリチン酸ジカリウム
ＰＢＳ（－）：リン酸緩衝生理食塩水。

【0058】

３．試験方法
ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（以下、「ＨＧＥ」とも称す）を製造会社のプロトコルに従って、維持培地（ＭＡＩＮＴＥＮＡＮＣＥ ＭＥＤＩＵＭ）を添加したプレートにて一晩馴化した。培地として、維持培地（コントロール）または５０、１００もしくは２００μｇ／ｍＬのＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ， ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１（以下、「Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ」とも称す）を含有する維持培地を別のプレートに１ｍＬ添加して、馴化したＨＧＥを設置した。設置後、ＰＢＳ（－）１５０μＬをＨＧＥ上部に適用して、３７℃にて培養を開始した。４８時間培養後、培地を維持培地に交換した。ＨＧＥ上部のＰＢＳ（－）を除去した後、０．０１質量％のグリチルリチン酸ジカリウムを含有する薬剤溶液またはＰＢＳ（－）を１５０μＬ適用して、さらに２４時間培養した。培養上清中の炎症性因子（ＴＮＦαおよびＩＬ－８）の量を、ＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて測定した。有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を行い、コントロールと比較評価した。

【0059】

４．結果
回収した培地中の炎症性因子の測定結果を表５および６に示す。歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルでは、ＴＮＦαおよびＩＬ－８が増加したのに対し、歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルに薬剤を２４時間適用することで炎症性因子の放出量を抑える作用が確認された。

【0060】

【表5】

【0061】

【表6】

【0062】

実施例３：ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）由来ＬＰＳによる歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルの作製
１．試験概要
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来ＬＰＳを用いて歯周病様状態の三次元歯肉上皮モデルを作製して、炎症性因子の放出量と組織学上の変化を確認した。

【0063】

２．試験試料
三次元歯肉上皮モデル：ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（株式会社ニコダームリサーチ）
細菌内毒素：ＬＰＳ－ＰＧ（ＬＰＳ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来）（ナカライテスク株式会社）
ＰＢＳ（－）：リン酸緩衝生理食塩水。

【0064】

３．試験方法
ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（登録商標） ＨＧＥ（以下、「ＨＧＥ」とも称す）を製造会社のプロトコルに従って、維持培地（ＭＡＩＮＴＥＮＡＮＣＥ ＭＥＤＩＵＭ）を添加したプレートにて一晩馴化した。培地として、維持培地（コントロール）または２００μｇ／ｍＬのＬＰＳ－ＰＧ（ＬＰＳ Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来）（以下、「Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳ」とも称す）を含有する維持培地を別のプレートに１ｍＬ添加して、馴化したＨＧＥを設置した。設置後、ＰＢＳ（－）１５０μＬをＨＧＥ上部に適用して、３７℃にて４８時間培養した。

【0065】

４８時間培養後の培地を回収して、培養上清中の炎症性因子（ＴＮＦα、ＩＬ－８）の量を、ＥＬＩＳＡ法（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて測定した。バリア機能は、角層膜厚・水分計ＡＳＡ－ＭＸ１００（日本アッシュ株式会社）を用いて、Ｐ値（イオンインデックス）を測定した。４８時間培養後のＨＧＥの細胞生存率をアラマブルー法にて評価したところ、細胞生存率は、ほぼ１００％であった（データ示さず）。

【0066】

４．結果
回収した培地中の炎症性因子の測定結果を表７～９に示す。培養４８時間後のＰ.ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＬＰＳを含む培地では、ＴＮＦαおよびＩＬ－８の有意な増加が認められた（表７および８）。培養４８時間後のＨＧＥのＰ値は有意に増加した（表９）。

【0067】

【表7】

【0068】

【表8】

【0069】

【表9】

【符号の説明】

【0070】

１ 正常状態の三次元歯肉上皮モデル（細胞部分）
２ 三次元歯肉上皮モデルのウェル
３ ウェル（プレート）
４ 培地

【図1】

【図2】