特許 7061018 新規プロモーター、および同プロモーターを用いたタンパク質の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-19

(45)【発行日】2022-04-27

(54)【発明の名称】新規プロモーター、および同プロモーターを用いたタンパク質の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20220420BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220420BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20220420BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z ZNA

C12N1/21

C12P21/00 C

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2018103382

(22)【出願日】2018-05-30

(65)【公開番号】P2019205402

(43)【公開日】2019-12-05

【審査請求日】2021-03-09

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、国立研究開発法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「植物等の生物を用いた高機能品生産技術の開発／高生産性微生物創製に資する情報解析システムの開発」の委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(73)【特許権者】

【識別番号】303046299

【氏名又は名称】旭化成ファーマ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】吉田 圭太朗

(72)【発明者】

【氏名】安武 義晃

(72)【発明者】

【氏名】油谷 幸代

(72)【発明者】

【氏名】田村 具博

(72)【発明者】

【氏名】小西 健司

(72)【発明者】

【氏名】酒瀬川 信一

【審査官】高山 敏充

(56)【参考文献】

【文献】特開平０９－３２２７７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０５－２８４９７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－００５３９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2002年，Vol. 68, No. 12，pp.5956-5964

【文献】genome Announcements，2017年，Volume 5, Issue 29，e00636-17

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（ａ）～（ｃ）のいずれか一つのＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１で示される塩基配列において１～２６個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列又は配列番号２で示される塩基配列において１～２７個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、プロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１又は２と少なくとも９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、プロモーター活性を有するＤＮＡ。

【請求項2】

プロモーター活性が構成型の活性である、請求項１に記載のＤＮＡ。

【請求項3】

請求項１又は２に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。

【請求項4】

請求項１又は２に記載のＤＮＡを挿入した挿入配列（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又はトランスポゾンを含む発現ベクター。

【請求項5】

請求項１又は２に記載のＤＮＡの下流に発現標的遺伝子を配置させた、遺伝子発現カセット。

【請求項6】

請求項１又は２に記載のＤＮＡの下流にアンチセンスＲＮＡとして転写されるＤＮＡを配置させた、遺伝子カセット。

【請求項7】

請求項３若しくは４に記載の発現ベクター又は請求項５に記載の遺伝子発現カセットを含む形質転換体。

【請求項8】

宿主がバークホルデリア属に分類される微生物である、請求項７に記載の形質転換体。

【請求項9】

発現標的遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法であって、請求項１又は２に記載のＤＮＡを用いて発現標的遺伝子を発現させる工程を含む、方法。

【請求項10】

請求項７又は８に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属細菌より単離したプロモーター、さらに好ましくは、誘導基質を必要としない構成型プロモーター、それらのプロモーターを含む組換えＤＮＡベクター、該ベクターにより形質転換させた宿主細胞に標的のタンパク質を産生させる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

バークホルデリア属細菌を宿主とした宿主ベクター系の開発が行われており（特許文献１を参照）、外来タンパク質を発現させるための発現ベクターに使用されるプロモーターとしてはアラビノース或いはラムノーズにより誘導される誘導型プロモーター（非特許文献１及び２を参照）などが知られている。一方、遺伝子を恒常的に発現させる構成型プロモーターとしては、例えばリボソームタンパク質遺伝子から取得したプロモーター（非特許文献１を参照）や誘導型プロモーターを構成型に改変したプロモーター（特許文献２を参照）などが知られており、誘導型と組み合わせて利用することにより複雑な発現制御が可能となる。しかしながら、それらのプロモーター活性は誘導型プロモーターと比較して低く、タンパク質の発現量としても低い場合がある。実際、誘導型プロモーターを改変することで得られた構成型プロモーターを利用した発現系でも、誘導型プロモーターに対してタンパク質の発現量が約半分程度であることが確認されている（特許文献３及び非特許文献３を参照）。

【0003】

バークホルデリア属細菌を物質の生産や分解のための触媒反応の系として利用する場合、単に触媒酵素を過剰発現させるだけでは高効率な活性を宿主細胞に付与できない場合がある。特に、代謝系酵素のように触媒反応物によるフィードバック阻害を受けることがある場合、該触媒に関与する遺伝子の発現量の高低を制御する必要がある。発現量を一定の水準となるよう長時間制御するには、誘導型プロモーターの利用は容易ではなく発現量が一定である構成型プロモーターを使う方が望ましい。構成型プロモーターを利用した遺伝子発現量の制御には、トランスポゾンを利用した染色体ＤＮＡへの遺伝子挿入技術（非特許文献４を参照）を利用し、目的とする遺伝子の発現カセットをゲノムに挿入し（非特許文献５を参照）、さらにはそのコピー数をコントロールすることで達成することが可能である（非特許文献６を参照）。

【0004】

上記リボソームタンパク質遺伝子由来の構成型プロモーターとは異なる活性を示す構成型プロモーターが取得できれば、ゲノム挿入型発現カセットへの応用のみならず、細胞内コピー数が同等の複数種の発現ベクターに転写活性の異なる構成型プロモーター支配下に発現標的遺伝子を発現することで発現量を調整することが可能となり、遺伝子の発現量をより多様に制御できる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特許第６０９９６２７号公報

【文献】特許第５６４１２９７号公報

【文献】特許第３９４４５７７号公報

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｌｅｆｅｂｒｅｌ ａｎｄ Ｖａｌｖａｎｏ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６８（１２）， ５９５６－５９５４（２００２）

【文献】Ｃａｒｄｏｎａ ａｎｄ Ｖａｌｖａｎｏ， Ｐｌａｓｍｉｄ， ５４（３）：２１９－２２８（２００５）

【文献】Ｎａｋａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｔａｍｕｒａ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ８６：１３６－１４８（２００４）

【文献】Ｓａｌｌａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．， １２１（１）， １３－２２（２００６）

【文献】Ｓａｌｌａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３８６（１－２）， １７３－１８２（２００７）

【文献】Ｓａｌｌａｍ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ７６（８）， ２５３１－３５３９（２０１０）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の課題は、バークホルデリア属細菌において発現ベクターやゲノム挿入型発現カセットを利用するにあたって、多様な発現制御ができるように、新たなプロモーターを提供することである。また本発明の別の課題としては、新たな構成型プロモーターを提供することである。さらにまた、これらのプロモーターの活性を利用した遺伝子発現系および、標的のタンパク質を製造する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、新たに取得した配列番号１および配列番号２で表される配列が、その下流に配置した発現標的タンパク質を高レベルに発現させていることから、プロモーター活性を有する有用なプロモーターであることを確認した。またさらにそれが発現誘導剤非添加でも発現標的タンパク質を高レベルに発現させていることから、さらに好ましい性質を持つ構成型プロモーター活性を有する構成型プロモーターであることを見出した。

【0009】

即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］ 以下の（ａ）～（ｄ）の何れかのプロモーター活性をもつことを特徴とするＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることができるＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列から１または数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号１又は２と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ。
［２］ 構成型のプロモーター、好ましくはバークホルデリア属細菌宿主の形質転換用の構成型プロモーターである、［１］に記載のＤＮＡ。
［３］ シグナル配列を含んでも良いタンパク質をコードする遺伝子が下流、好ましくは３０塩基又はそれ未満の下流に配置される、［１］又は［２］に記載のＤＮＡ。
［４］ タンパク質をコードする遺伝子が、酵素、好ましくはエステラーゼ（より好ましくはコレステロールエステラーゼ、又はリパーゼ）、又はペルオキシダーゼ（より好ましくは配列番号３のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼ）である、［３］に記載のＤＮＡ。
［５］ 前記遺伝子がバークホルデリア属細菌由来の酵素をコードする遺伝子である、［４］に記載のＤＮＡ。
［６］ バークホルデリア属細菌のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼをコードする遺伝子と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子の開始コドンより上流にある非翻訳領域の一部からなる、［５］に記載のＤＮＡ。
［７］ バークホルデリア属細菌のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼが配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる、［６］に記載のＤＮＡ。
［８］ ターミネーター配列が下流に配置される、［１］～［７］のいずれかに記載のＤＮＡ。
［９］ ターミネーター配列が配列番号１７、１８又は１９で示される塩基配列からなる、［８］に記載のＤＮＡ。
［１０］ 第二のターミネーター配列が上流に配置される、［９］に記載のＤＮＡ。
［１１］ 下流に配置されるターミネーター配列と、上流に配置される第二のターミネーター配列とが互いに異なる、［１０］に記載のＤＮＡ。
［１２］ 下流に配置されるターミネーター配列と、上流に配置される第二のターミネーター配列とが、配列番号１７又は配列番号１８で示される塩基配列からなる、［１１］に記載のＤＮＡ。
［１３］ タンパク質をコードする遺伝子の下流に、当該タンパク質の発現に必要なシャペロンをコードする遺伝子が配置される、［６］～［１２］のいずれかに記載のＤＮＡ。
［１４］ シャペロンがターミネーター配列の前に配置される、［１３］に記載のＤＮＡ。
［１５］ シャペロンがシグナル配列を含む、［１３］又は［１４］に記載のＤＮＡ。
［１６］ シグナル配列を含むシャペロンが配列番号１５で示される塩基配列からなる、［１５］に記載のＤＮＡ。
［１７］ ［１］～［１６］に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
［１８］ ［１］～［１６］に記載のＤＮＡを挿入した挿入配列（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又はトランスポゾンを含む発現ベクター。
［１９］ ［１］～［１６］に記載のＤＮＡの下流に発現標的遺伝子を配置させた、遺伝子発現カセット。
［２０］ ［１］～［１６］に記載のＤＮＡ、［１７］又は［１８］に記載の発現ベクター、あるいは［１９］に記載の発現カセットを含む形質転換体。
［２１］ ［１］～［１６］に記載のＤＮＡ、［１７］又は［１８］に記載の発現ベクター、あるいは［１９］に記載の発現カセットを宿主に移入して調製された形質転換体。
［２２］ 宿主がバークホルデリア属に分類される微生物である、［２１］に記載の形質転換体。
［２３］ ［１］～［１６］に記載のＤＮＡの下流にアンチセンスＲＮＡとして転写されるＤＮＡが配置される、［２０］～［２２］のいずれかに記載の形質転換体。
［２４］ ［２０］～［２２］のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程を含む、発現標的遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法。
［２５］ 発現標的遺伝子がエステラーゼをコードする、［２４］に記載の方法。
［２６］［２３］に記載の形質転換体を用いて宿主細胞における遺伝子発現を抑制する方法。

【発明の効果】

【0010】

本発明により新規のプロモーターが提供される。特に、本発明の構成型プロモーターを使用することで、タンパク質の恒常的な高生産が期待できる他、異なる転写活性を持つプロモーターと組み合わせることで生体触媒を使用した高効率な物質変換システムを構築出来ると期待される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】構成型プロモーターと予想された配列の活性を確かめるための発現ベクターを示す図である。Ｔ１（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ１）、Ｔ２（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ２）はターミネーターを示し、Ｔ１は配列番号２７、Ｔ２は配列番号２６をそれぞれ表す。

【図2】構成型プロモーターの下流にコレステロールエステラーゼとそのシャペロンをコードする遺伝子を導入した発現ベクターを示す図である。なお、Ｔ１、Ｔ２は上述の通りである。

【図3】コレステロールエステラーゼ発現ベクターを形質転換したバークホルデリア・スタビリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ）が示すコレステロールエステラーゼ活性を示す図である。

【図4】コレステロールエステラーゼ発現ベクターを形質転換したバークホルデリア・スタビリスにより生産されたコレステロールエステラーゼを示す図である。

【図5】異なる培地で培養した際のコレステロールエステラーゼ活性を示す図である。

【図6】バークホルデリア・スタビリス野生株のコレステロールエステラーゼが誘導発現であることを示す図である。

【図7】各プロモーターの下流にバークホルデリア・プランタリイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ）のリパーゼ遺伝子を配置した場合のリパーゼ活性を示す図である。

【図8】バークホルデリア・マルティボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）で各プロモーターにより生産されたコレステロールエステラーゼ活性を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下、本発明を実施例等に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定して解釈されない。遺伝子操作技術は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２年、１９８９年）、基礎から学ぶ遺伝子工学（第２版、田村隆明、２０１７年、羊土社）、遺伝子工学（野島博、２０１３年、東京化学同人）、蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版、堀尾武一、１９９４年南光堂）、ＷＯ２０１３０６５７７２Ａ１、又は、市販の各種酵素、キット類に添付された手順書等に従えば実施できるものである。また、プロモーター配列と挿入遺伝子の開始コドンまでの間には、適切な間隔をあけて（通常開始コドンの数塩基上流）、リボソーム結合部位であるＲＢＳ（ｒｉｂｏｓｏｍｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）が存在しても良い。これにより、ＲＢＳをコンセンサス配列にして翻訳開始を促進させることもできる。

【0013】

第一の実施形態において、本発明は、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれか一つのＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることができ、プロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列において１または数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、プロモーター活性を有するＤＮＡ；
（ｄ）配列表の配列番号１又は２と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、プロモーター活性を有するＤＮＡ、
を提供する。

【0014】

本発明のＤＮＡは、プロモーター活性を有する限り、配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列からなっても良い。本明細書においては、配列番号１及び２に対応するプロモーターを区別のためにそれぞれプロモーター１及びプロモーター２ともいう。本発明の「プロモーター活性」により、プロモーターの下流に位置する遺伝子がｍＲＮＡへと転写される。

【0015】

本発明においてプロモーター活性としては、タンパク質の発現が認められるか否かで判断することが好ましい。すなわち、適当なレポーター遺伝子を用いることにより確認することが好ましい。例えば、プロモーター配列の下流にレポーター遺伝子を作動可能に連結したＤＮＡを細胞内へ導入し、発現したタンパク質の量を免疫学的手法や生化学的手法により定量することができる。レポーター遺伝子としては、β－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ラクタマーゼ遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子等の蛍光タンパク質遺伝子、コレステロールエステラーゼ遺伝子等を用いることができる。

【0016】

さらに具体的には、本件実施例に示す通り、プロモーター候補（変異させた配列）の下流に直結させてコレステロールエステラーゼ遺伝子を繋げ、その下流にシャペロン、およびターミネーター配列をおいたＤＮＡを、バークホルデリア・スタビリスに移入して得た形質転換体で、実際にコレステロールエステラーゼの発現量が、プロモーター候補（変異させた配列）を欠落させたＤＮＡの移入された形質転換体に比較して増加することを確認することにより、プロモーター活性が増大したと判断できる。プロモーター活性は、発現誘導剤非添加でも発現標的タンパク質を高レベルに発現させることができる構成型プロモーター活性が好ましい。構成型プロモーター活性の有無は、上述の形質転換体を例に説明すると、当該形質転換体を培養した場合に、誘導物質を除いた培地でも、該当のプロモーターが発現標的タンパク質を実質的なレベルとして生産できるか否かで判断すればよい。本発明の配列番号１又は２で示される塩基配列が有するプロモーター活性は構成型プロモーター活性である点で好ましい。

【0017】

本発明のプロモーターは、宿主を培養する培地等の種類やその他の条件によって活性が異なる。コレステロールエステラーゼを産生する場合を例に説明すると、例えば、ＹＳ（酵母エキス、ソルビトール）培地では配列２のプロモーターの方が配列１よりも生産量が多いことがあり、ＬＢ（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ）培地とＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ）培地においては、配列１のプロモーターの方が配列２よりも生産量が多いことがある。

【0018】

本発明のＤＮＡは、プロモーターによる発現の標的となるタンパク質（以下、「発現標的タンパク質」という）をコードする遺伝子（以下、「発現標的遺伝子」という）の上流に配置することで、発現標的タンパク質を発現させることができればその由来は限定されない。発現標的タンパク質は、本発明のプロモーターにより発現可能なタンパク質であれば特に限定されない。このようなタンパク質として酵素があり、例えば、エステラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、キチナーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、リアーゼ、ペクチナーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼが挙げられる。エステラーゼの中でも、コレステロールエステラーゼが好ましい。発現標的タンパク質は、シグナル配列を含んでもよいし、含んでいなくてもよい。通常は、発現標的タンパク質にはシグナル配列を含むことが好ましい。

【0019】

実質的に同一の塩基配列を有するＤＮＡとして、配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、プロモーター活性を有するＤＮＡが挙げられる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性、好ましくは高い同一性を有するＤＮＡの単離を期待しうる。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳ及び温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

【0020】

本発明のＤＮＡは、配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列において、１または複数個、好ましくは数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異が生じた塩基配列を含有するＤＮＡであり、プロモーター活性を有するＤＮＡが含まれる。例えば、配列表の配列番号１で示される塩基配列中においては、１～５２塩基核酸、好ましくは１～２６塩基核酸、より好ましくは１～１３塩基核酸、さらに好ましくは１～５塩基核酸が欠失、置換、付加した塩基配列からなるＤＮＡ等、配列番号２で示される塩基配列中においては、１～５４塩基核酸、好ましくは１～２７塩基核酸、より好ましくは１～１３塩基核酸、さらに好ましくは１～５塩基核酸が欠失、置換、付加した塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。

【0021】

本発明のＤＮＡはその全長塩基配列が配列表の配列番号１又は２で示されるプロモーターの塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルト即ち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算した時に、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列相同性、好ましくは配列同一性を有する塩基配列からなるプロモーターである。

【0022】

本発明のプロモーターの塩基配列は、例えばチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７４：５４６３－５４６７（１９７７））により決定することが出来る。

【0023】

第二の実施形態において、本発明は、上記ＤＮＡを含む発現ベクターを提供する。

【0024】

発現ベクターは、上記ＤＮＡを、バークホルデリア属細菌で自律複製するプラスミドベクターの任意の場所に組み込み、プロモーター配列の下流に発現標的遺伝子の導入を容易にするマルチクローニングサイトや転写を終結させるためのターミネーターを配置することにより構築することが出来る。また既存の発現ベクターのプロモーター領域を、配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡ、或いは、配列番号１又は２で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列からなり、プロモーター活性を有するＤＮＡ、と置換することにより、本発明の発現ベクターを調製することも出来る。

【0025】

プラスミドベクターは宿主内にて複製起点より複製される。そのため、宿主にて複製可能な複製起点を持つプラスミドベクターを使用することが好ましい。バークホルデリア属細菌などのグラム陰性細菌では、グラム陰性細菌で複製可能な複製起点を持つプラスミドベクターが好ましい。グラム陰性細菌で複製可能な複製起点を持つプラスミドベクターとしてｐＢＢＲ１２２ベクターが挙げられる。

【0026】

構築した発現ベクターのプロモーターの下流に発現標的遺伝子を導入したプラスミドベクターを宿主細胞に形質転換し、ベクターの持つ選択マーカーに従って選択した形質転換体において標的タンパク質が恒常的に発現されることが期待できる。ここで使用されるシャトルベクターやマルチクローニングサイト、そしてターミネーターは特に限定されるものではない。本発明は、このような発現標的遺伝子を導入したベクターも包含する。発現標的遺伝子は本発明のプロモーターを利用して発現させようとするタンパク質をコードする遺伝子であり、本発明のプロモーターの下流に作動可能に配置すればよい。本発明は発現標的遺伝子を上記プロモーターの下流に配置したプラスミドベクターも含む。

【0027】

発現標的遺伝子は、配列番号１又は２から３０塩基以下、好ましくは１５塩基以下、より好ましくは６塩基以下、特に好ましくは直結にて、その下流に配置され得る。発現標的遺伝子は、例えば、コードするタンパク質が分泌型である場合、シグナル配列を有していてもよい。

【0028】

発現標的遺伝子の下流には、例えば（第一の）ターミネーター配列を配置することが好ましい。ターミネーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡから乖離させ、転写を終結させる配列であり、通常、遺伝子の下流に配置され得る。本件のターミネーター配列としては、特に限定されずに公知の各種のターミネーター配列が使用できるが、例えば本件明細書の配列表にて開示する配列番号１７、１８又は１９のいずれを使用しても良い。発現標的遺伝子がコレステロールエステラーゼをコードする場合（配列番号４）、その遺伝子に元から付いている天然のターミネーター配列である配列番号１９を使うことも簡便であって好ましい。

【0029】

第一のターミネーター配列に加え、プロモーターの上流に第二のターミネーター配列を置くことも好ましい。これにより、上流の他の遺伝子の転写を終結させ、その影響を回避することが期待される。この場合に、上述の第一のターミネーター配列と第二のターミネーター配列とは同一であってもよいが、通常は別の配列のターミネーター配列を選択することがより好ましい。

【0030】

本発明のプロモーターが対象とするタンパク質によっては、その発現等のためにシャペロンが同時に発現され得る。これにより、正しい立体構造のポリペプチド鎖が形成され、延いては正しい機能を持つタンパク質が生成される。タンパク質を生産させる場合において、シャペロンが必要である場合は、タンパク質とシャペロンを同時に発現させることが好ましい。

【0031】

シャペロンと発現標的遺伝子がコードするタンパク質は、同時に発現するのであれば、配列上離れた場所に配置されていてもよい。ただし、転写を開始するために必要なプロモーター、転写を終結させるターミネーターは必要であるため、シャペロンは、プロモーターとターミネーターとの間に配置する必要がある。

【0032】

シャペロンを発現標的遺伝子と同時に発現させるために、シャペロン配列を、発現標的遺伝子とターミネーターとの間に挿入し、シャペロンを発現標的遺伝子のプロモーターで発現させてもよい。

【0033】

シャペロンが特定の場所で機能する場合、シャペロン配列はシグナル配列を含むことが好ましい。

【0034】

より具体的には、配列番号５のアミノ酸配列を有するコレステロールエステラーゼの場合、シャペロンの配列としては、特に限定されないが、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列が挙げられる。このシャペロンは、配列番号１４のシグナル配列を含んでもよい。

【0035】

配列番号４０のアミノ酸配列を有するリパーゼの場合、シャペロンの配列としては、特に限定されないが、例えば、配列番号４７のアミノ酸配列が挙げられる。このシャペロンは、配列番号４９のシグナル配列を含んでもよい。

【0036】

第三の実施形態において、本発明は、上記ＤＮＡを含む遺伝子発現カセットを提供する。

【0037】

配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡ、或いは、配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列からなり、プロモーター活性を有するＤＮＡ、と発現標的遺伝子とを含む発現カセットを調製すれば、発現プラスミドベクターを構築せずとも本発明のプロモーターを含む宿主細胞での組換えタンパク質発現系を構築できる。本発明はこのような、プロモーターの下流に発現標的遺伝子を配置した発現カセットを包含する。

【0038】

バークホルデリア属細菌を含むいくつかの細菌においては、遺伝子組換え実験において相同組み換えの効率が低く、非特異部位での組換えが起こりやすい事が知られる。実際、例えば、バークホルデリア属細菌において、相同組換えによる遺伝子組換えを意図して構築したベクターや直線上のＤＮＡをバークホルデリア属細菌細胞に形質転換するとそれらＤＮＡは該宿主細胞のゲノムに非特異的に組み込まれることが高頻度で起こりうる。このことから、例えば、配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡ、或いは、配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列と実質的に同等の塩基配列からなり、プロモーター活性を有するＤＮＡ、の下流に発現標的遺伝子を配置し、さらにターミネーターや抗生剤耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子を配置した直鎖状のＤＮＡを発現カセットとして構築し、該構築物を宿主細胞に形質転換することでゲノムの非特異部位に挿入することにより本発明のプロモーターを利用して該宿主細胞で発現標的遺伝子を発現させることができる。この場合、直鎖ＤＮＡは一般的な大腸菌用クローニングベクター上で構築後、ＰＣＲにより増幅することができる。また、ベクターから必要な部分を切り出して調製することも出来る。

【0039】

発現標的遺伝子の発現系をゲノムに挿入する方法として、公知の遺伝子導入方法を用いて行うことができるが、好適にはトランスポゾンベクターを利用して挿入する方法が挙げられる。トランスポゾンベクターは、配列の転移に必要な酵素をコードするトランスポゼース遺伝子及び、トランスポゼースが認識する２つの反復配列を含む構成となっている。この認識配列の間に遺伝子発現システムを組み込めば、ゲノム挿入型の構成型発現系を構築できるベクターとして利用することができる。

【0040】

バークホルデリア属細菌において利用可能なトランスポゾンベクターはいくつか公知のものがあり、例えばｐＵＴｍｉｎｉＴｎ５ベクター（ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７２（１１），６５６８－６５７２（１９９０））が挙げられる。したがって、配列表の配列番号１又は２で示されるＤＮＡ、或いは、配列番号１又は２で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列からなり、プロモーター活性を有するＤＮＡ、を導入した発現ベクターに発現標的遺伝子の下流にあるターミネーターまでを含んだＤＮＡをトランスポゾンベクターに組み込んで、宿主細胞のゲノムへ転移させることにより、１コピーから多コピーまでの発現カセットコピー数を持つ組換え細胞を構築することが可能である。そしてゲノム挿入型発現系は、発現カセットのコピー数という点ではマルチコピーの発現ベクターに対して発現量という点では及ばないものの、ゲノム内に安定に保持されるため、ベクターを選択・保持するための抗生剤を培地に添加する必要がないという利点がある。

【0041】

このような遺伝子発現系の利用はタンパク質生産とは逆のタンパク質発現抑制へ応用することも可能である。宿主内発現標的遺伝子の開始コドンを含むアンチセンスＲＮＡを細胞内に過剰に発現すると、細胞内では発現標的遺伝子のｍＲＮＡに発現したアンチセンスｍＲＮＡがハイブリダイズし、ｍＲＮＡも翻訳が妨げられると共に分解が促進され、結果として発現標的遺伝子由来タンパク質の生産を抑制することが可能である（Ｎａｋａｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３４：ｅ１３８（２００６）； Ｎａｋａｓｈｉｍａ ａｎｄ Ｔａｍｕｒａ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３７：ｅ１０３（２００９））。従って、配列表の配列番号１又は２で示される塩基配列からなるＤＮＡ、或いは、配列表の塩基配列１又は２で示される塩基配列と実質的に同一の塩基配列からなり、プロモーター活性を有するＤＮＡ、の下流に発現標的遺伝子のアンチセンスＲＮＡを細胞内に蓄積させて発現標的遺伝子由来タンパク質の生産を抑制することができる。このようなアンチセンスＲＮＡ等の利用技術は、遺伝子破壊とともに宿主細胞の機能改変に有効な方法であり、宿主細胞の代謝経路を人為的に改変する代謝工学が可能になる。

【0042】

第四の実施形態において、本発明は、上記発現ベクター又は上記遺伝子発現カセットを含む形質転換体を提供する。

【0043】

本発明のプロモーターを含むベクターや発現カセットを導入する宿主は限定されないが、例えば、バークホルデリア属に分類される微生物が挙げられる。バークホルデリア属細菌は地圏や水圏、植物表層などの多様な自然生態系に常在するβプロテオバクテリアである。工業生産に適したリパーゼ生産能を有する菌株や植物病原性糸状菌駆除能を有する菌株がいる一方、病原因子生産能を有するために日和見感染を引き起こす菌株やペクチナーゼなどの産生による植物病原菌株など、様々な菌株が含まれる（大坪嘉行ら著、化学と生物、Ｖｏｌ．４７ Ｎｏ．１、３５－４２頁（２００９年））。

【0044】

バークホルデリア属に分類される微生物としては、バークホルデリア・スタビリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｓｔａｂｉｌｉｓ）、バークホルデリア・マルティボランス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂ． ｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、バークホルデリア・グルマエ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ）、バークホルデリア・アンビファリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ａｍｂｉｆａｒｉａ）、バークホルデリア・ドロサ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｄｏｌｏｓａ）、バークホルデリア・グラディオリ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ）、バークホルデリア・プランタリイ（ＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ）（ＡＺＥＧＡＭＩ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ３７（２）： １４４－１５２（１９８７）；Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．， ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １６：３４６（２０１５））等が挙げられる。

【0045】

バークホルデリア・プランタリイＤＳＭ ９５０９は、バイオリソースセンターであるＤＳＭＺから購入可能である。

【0046】

バークホルデリア属細菌は様々な自然生態系に存在することから、バークホルデリア属細菌を培養する培地や条件はさまざまである。例えばバークホルデリア・セパシアを培養するためには、ＰＹ培地（５％ポリペプトン、５％酵母エキス）にて２８℃で培養すればよい（特開平９－３２２７７６）。また、ＤＳＭＺにて購入可能な菌株については、ＤＳＭＺが推奨する培地と条件をＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓとして公開しており、それを参照すればよい。

【0047】

第五の実施形態において、本発明は、上記形質転換体を培養する工程を含む、上記プロモーターの下流に位置する発現標的遺伝子がコードするタンパク質を生産する方法、を提供する。

【0048】

より具体的には、上記形質転換体を培養し、培養物から発現標的遺伝子がコードするタンパク質を単離、精製することにより、標的タンパク質を生産することができる。ここで、培養物とは、菌を培養して得た菌体及び培養液の混合物を意味し、形質転換体は、使用する宿主に適した培地を用い、静置培養法、ローラーボトルによる培養法などにより培養することができる。培養は、公知の方法で行うことができ、用いる宿主細胞の種類により、適宜用いる培地や培養条件を決定することができる。

【0049】

標的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、宿主細胞を破砕することによりタンパク質を採取することができる。また、標的タンパク質が宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により宿主細胞を除去する。その後、タンパク質の単離生成に用いられる各種クロマトグラフィーを用いた一般的な生化学的方法を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記の培養物中から標的タンパク質を単離精製することができる。

【実施例】

【0050】

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。

【0051】

実施例１ プロモーター活性を測定するための発現ベクターの作製
バークホルデリア・スタビリス（受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０２７０４）をＬＢ培地（１％ Ｂａｃｔｏ（商標）Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％ Ｂａｃｔｏ（商標）Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％塩化ナトリウム）にて３０℃で振とう培養して定常期まで増殖した菌液５００μＬを１０ｍＬのＬＢ培地にそれぞれ添加し、３０℃で１２時間培養した。

【0052】

培養後、菌を遠心分離（３，０００ｘｇ、１０分、室温）で回収し、５００μＬのトリス－ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーで再懸濁し、５０μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）と２５μＬの１０％ＳＤＳを添加し、５５℃、３０分間インキュベートした。反応後、６００μＬのフェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール混合溶液（５０：４９：１）を添加し、撹拌したのち遠心分離（２０，８１７ｘｇ、１０分、室温）を行なった。得られた上清を別のチューブに移し、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール混合液で再抽出した後、得られた上清に５０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムと３５０μＬのイソプロパノールを添加しＤＮＡを沈殿させ、回収したＤＮＡに対して５００μＬの７０％エタノールで２回洗浄した。ＤＮＡは室温で１０分間風乾し、２００μＬのＴＥに溶解し、４℃に保管した。

【0053】

該精製ＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２０と２１、２２と２３、２４と２５に記載の合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（以下、プライマーと略記）を用いて、ポリメラーゼチェーンリアクション法（以下、ＰＣＲと略記：Ｓａｉｋｉ ｅt ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９ ４８７－４９１（１９８８））によるＤＮＡの増幅を行なった。なお、用いたＰＣＲ用酵素はＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）である。その結果、二種類のターミネーター（配列番号２６及び２７）、マルチクローニングサイト（ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＮｄｅＩ）断片（配列番号２８）を得た。上記方法と同様にｐＢＢＲ１２２プラスミド（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）をテンプレートとして配列表中の配列番号２９、３０に記載のプライマーを用いてＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲ反応によって増幅されたこれらのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから切り出してＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。この精製済みのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換後、２００μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。２８度で２４時間培養後、得られたコロニーを２００μｇ／ｍＬのカナマイシン硫酸塩を含むＬＢ培地に植え継ぎ、２８度で１２時間培養後、培養液からＷｉｚａｒｄ（登録商標） Ｐｌｕｓ ＭｉｎｉＰｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドを抽出した。このプラスミドをプロモーター活性測定用の発現ベクターとした（図１）。

【0054】

実施例２ コレステロールエステラーゼ発現ベクターの作製
実施例１にて精製したバークホルデリア・スタビリスのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列表中の配列番号３１～３６に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅を行なった。その結果、コレステロールエステラーゼとそのシャペロンをコードする遺伝子のＤＮＡ断片、及びプロモーター領域のＤＮＡ断片が得られた（配列表番号１、２）。実施例１にて作製した発現ベクターをテンプレートとして、配列表中の配列番号３７、３８に記載のプライマーを用いてＤＮＡの増幅を行い、発現ベクターのＤＮＡ断片を増幅した。これらのＰＣＲ反応によって増幅されたプロモーター、コレステロールエステラーゼとシャペロン、発現ベクターのＤＮＡ断片を実施例１に記載の方法と同様に精製して連結し、コレステロールエステラーゼの発現ベクターを作製した（図２）。

【0055】

実施例３ コレステロールエステラーゼ遺伝子を用いたプロモーター活性の測定
バークホルデリア・スタビリスに実施例２で作製したコレステロールエステラーゼの発現ベクターを導入するため、該菌株をＬＢ培地１００ｍＬにて対数増殖期に至るまで３０℃で振とう培養した後、遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体に１００ｍＬの氷冷滅菌水を加え、懸濁後再び遠心分離し菌体を回収した。この操作をもう一度繰り返した後、回収した菌体に５ｍＬ冷却１０％グリセリン溶液を加え、よく懸濁し、遠心分離により菌体を回収した。

【0056】

回収した菌体に５ｍＬの氷冷１０％グリセリン溶液を加え、懸濁し、４０μＬずつ分注し、液体窒素で瞬間冷凍し－８０℃にて保存した。冷凍保存した菌体を氷上にて融解し、実施例２にて作製した２種の発現ベクターをそれぞれ約１ｎｇずつ加え、混合した。この混合液を０．２ｃｍ幅エレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）に移し、遺伝子導入装置ジーンパルサーＩＩを用いて電場強度１２．５ｋＶ／ｃｍ、キャパシタンス２５μＦ、外部抵抗２００Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体とＤＮＡの混合液を１ｍＬのＬＢ培地に混合し、３０℃にて１時間培養した後、２００μＬの菌液を２００μｇ／ｍＬのカナマイシン硫酸塩を含むＬＢ培地に塗布し、３０℃にて1日間培養し、各発現ベクターの形質転換体を得た。

【0057】

発現ベクターを導入したバークホルデリア・スタビリスを５ｍＬの３％酵母エキス、３％ソルビトール培地（１００μｇ／ｍＬカナマイシン硫酸塩を含む）に植菌し、１２時間２８℃にて培養した。この菌液を５０ｍＬの３％酵母エキス、３％ソルビトール培地（１００μｇ／ｍＬカナマイシン硫酸塩を含む）に菌体濁度ＯＤ＝０．２となるように添加し、バッフル付きフラスコを用いて２８℃で３６時間培養した。一方、発現ベクターを導入していないバークホルデリア・スタビリス野生株も同様に、５ｍＬの３％酵母エキス、３％ソルビトール培地に植菌し、１２時間２８℃にて培養した。この菌液を５０ｍＬの３％酵母エキス、３％ソルビトール培地に菌体濁度ＯＤ＝０．２となるように添加し、バッフル付きフラスコを用いて２８℃で３６時間培養した。培養後、各株が生産したコレステロールエステラーゼの量を評価するため、ラウリン酸ｐ－ニトロフェニルに対するコレステロールエステラーゼ活性を測定した。

【0058】

培養後に培養液を適宜希釈し、１ｍＭのラウリン酸ｐ－ニトロフェニルと３７℃で反応させ、加水分解反応によって生じるｐ－ニトロフェノールを波長４００ｎｍの吸光度によって測定した。その結果、発現ベクターを導入していないバークホルデリア・スタビリス野生株ではコレステロールエステラーゼ活性がほとんど確認されなかったが、配列番号１又は２の塩基配列で表されるプロモーターを導入した形質転換体において高いコレステロールエステラーゼ活性が観察された（図３）。さらに培養液を３％酵母エキス、３％ソルビトール培地（ＹＳ培地）で３倍に希釈して混合し、遠心分離によって上清を回収して粗タンパク質抽出液とした。この粗タンパク質抽出液を１０－２０％グラジエントゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、クマシー・ブリリアントブルーＧ２５０を使用して染色した。コレステロールエステラーゼの分子量は３３．２ｋＤａであり、予想される大きさにコレステロールエステラーゼ活性に対応する濃さのバンドが観察された（図４）。このように、培地中に脂肪酸を添加していない条件においても、コレステロールエステラーゼが生産されたことから、配列番号１又は２の塩基配列で表されるプロモーターは構成型プロモーターであることが分かった。

【0059】

バークホルデリア・スタビリス野生株において、コレステロールエステラーゼは或る種の脂肪酸によって誘導発現するため（以下の参考例を参照のこと）、コレステロールエステラーゼの工業的製造ではバークホルデリア・スタビリスにコレステロールエステラーゼを生産させるために、それらの脂肪酸を含む培地で培養しなければならない。そのため、非水溶性の脂肪酸を含む培地からコレステロールエステラーゼを分離精製しなければならず、安定製造の妨げとなっている。脂肪酸を含まない簡易な培地からコレステロールエステラーゼを分離・精製できる可能性を得たことは、高純度で安定した品質の酵素を製造するためには極めて大きな成果といえる。

【0060】

実施例４ 異なる培地での発現確認
実施例３で構成型プロモーターであると確認されたプロモーターを導入した形質転換体をそれぞれ５ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬカナマイシン硫酸塩を含む）に植菌し、７２時間２８℃にて培養した。一方、発現ベクターを導入していないバークホルデリア・スタビリス野生株も同様に、５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、７２時間２８℃にて培養した。また、本発明のプロモーターを導入した形質転換体をそれぞれ５ｍＬのＤｉｆｃｏ（登録商標） Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）（以下ＮＢ培地と略することがある）（１００μｇ／ｍＬカナマイシン硫酸塩を含む）に植菌し、７２時間２８℃にて培養した。一方、発現ベクターを導入していないバークホルデリア・スタビリス野生株も同様に、５ｍＬのＮＢ培地に植菌し、７２時間２８℃にて培養した。培養後、各株が生産したコレステロールエステラーゼの量を評価するため、ラウリン酸ｐ－ニトロフェニルに対するコレステロールエステラーゼ活性を測定した。培養後に培養液を適宜希釈し、１ｍＭのラウリン酸ｐ－ニトロフェニルと３７℃で反応させ、加水分解反応によって生じるｐ－ニトロフェノールを波長４００ｎｍの吸光度によって測定した（図５）。その結果、発現ベクターを導入していないバークホルデリア・スタビリス野生株ではコレステロールエステラーゼ活性がほとんど確認されなかったが、本発明のプロモーターを導入した形質転換体においてコレステロールエステラーゼ活性が確認された。この結果より、本発明のプロモーターは培地に関わらず構成発現させることができることが確認された。

【0061】

参考例 バークホルデリア・スタビリス野生株でのコレステロールエステラーゼ誘導発現確認
バークホルデリア・スタビリスを１００ｍＬの前培養培地（０．１％ リン酸水素二カリウム、１％ ミルクカゼイン、０．５％ 酵母エキス、０．２％塩化カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウムを含む液体培地（ｐＨ７．０））にて２８℃、２００ｒｐｍで２４時間、前培養した。得られた培養液２ｍＬを２Ｌジャーファーメンターにて滅菌した本培養培地（１．６Ｌの０．１％ リン酸水素二カリウム、１．５％ ミルクカゼイン、０．５％ 酵母エキス、０．２％塩化カリウム、０．０５％ 硫酸マグネシウム、１％ 大豆粉、３％ オレイン酸を含む液体培地（ｐＨ６．５））に添加し、２８℃、６５０ｒｐｍで４８時間培養した。

【0062】

４８時間後に培養液を回収し、オレイン酸添加培地の培養液とした。上記と全く同じ前培養培地にて同条件にて前培養を行ったあと、本培養培地のオレイン酸のみをパルミチン酸に置換した培地にて同条件で培養を行って得られた培養液をパルミチン酸添加培地の培養液、本培養培地のオレイン酸のみをミリスチン酸に置換した培地にて同条件で培養を行って得られた培養液をミリスチン酸添加培地の培養液、本培養培地のオレイン酸を除いた培地にて同条件で培養を行って得られた培養液を脂肪酸未添加培地の培養液とした。

【0063】

得られた各培養液について、特開２００８－８６２７７号公報に記載の方法によりコレステロールエステラーゼ活性の測定を行った。その結果、未添加培地ではコレステロールエステラーゼが発現しなかったが、培地中にオレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸などの脂肪酸を加えるとコレステロールエステラーゼが発現することが分かった（図６）。このことから、コレステロールエステラーゼはこれらの脂肪酸の添加によって誘導発現することが確認される。

【0064】

実施例５ 他のターゲット遺伝子に対するプロモーター活性の測定
配列番号４５に記載のバークホルデリア・プランタリイ（ＤＳＭ ９５０９）に由来するリパーゼ遺伝子とシャペロン遺伝子を含む配列を全合成した。全合成したリパーゼ遺伝子とシャペロン遺伝子を含む配列を、実施例２で作製した発現ベクターのコレステロールエステラーゼ遺伝子とシャペロン遺伝子を含む配列と置き換え、配列番号１または配列番号２をプロモーターとして有するリパーゼ発現ベクターを得た。これらのプラスミドを用い、実施例３と同様にバークホルデリア・スタビリスを形質転換し、形質転換体を得た。この形質転換体を３％酵母エキス、３％ソルビトール培地で前培養し、前培養液を菌体濁度ＯＤ＝０．２となるように同培地で希釈して４０ｍＬの培地で本培養した。培養後、菌液を遠心分離し、上清中に含まれるリパーゼのジアシルグリセロールに対する活性を測定した（図７）。その結果、バークホルデリア・スタビリス野生株では、リパーゼの活性がほとんど確認されなかったが、本発明のプロモーターを導入した形質転換体においては高いリパーゼ活性が観察された。この結果より、本発明のプロモーターは、バークホルデリア・スタビリス以外の細菌に由来する遺伝子の発現にも利用できることが確認された。

【0065】

実施例６ 他のバークホルデリア属でのプロモーター活性の確認
実施例３で作製した本発明のプロモーターを有するコレステロールエステラーゼ発現ベクターをバークホルデリア・マルティボランス（ＮＢＲＣ１０２０８６）に導入するため、該菌株をＬＢ培地１００ｍＬにて対数増殖期に至るまで３０℃で振とう培養した後、遠心分離にて菌体を回収した。回収した菌体に１００ｍＬの氷冷滅菌水を加え、懸濁後再び遠心分離し菌体を回収した。この操作を２回繰り返した後、回収した菌体に５ｍＬ冷却１０％グリセリン溶液を加え、よく懸濁し、遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体に５ｍＬの氷冷１０％グリセリン溶液を加え、懸濁し、１００μＬずつ分注し、－８０℃にて保存した。冷凍保存した菌体を氷上にて融解し、実施例３で作製した本発明のプロモーターを有するコレステロールエステラーゼ発現ベクターをそれぞれ約１ｎｇずつ加え、混合した。この混合液を０．１ｃｍ幅エレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）に移し、遺伝子導入装置ジーンパルサーＩＩを用いて電場強度１２．５ｋＶ／ｃｍ、キャパシタンス２５μＦ、外部抵抗２００Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体とＤＮＡの混合液を１ｍＬのＬＢ培地に混合し、３０℃にて１時間培養した後、２００μＬの菌液を３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に塗布し、３０℃にて1日間培養し、各発現ベクターの形質転換体を得た。

【0066】

発現ベクターを導入したバークホルデリア・マルティボランスを５ｍＬの３％酵母エキス、３％ソルビトール培地（３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む）に植菌し、４８時間２８℃にて培養した。一方、バークホルデリア・マルティボランス野生株も同様に、５ｍＬの３％酵母エキス、３％ソルビトール培地に植菌し、４８時間２８℃にて培養した。培養後、各株が生産したコレステロールエステラーゼの量を評価するため、ラウリン酸ｐ－ニトロフェニルに対するコレステロールエステラーゼ活性を測定した。培養後に培養液を適宜希釈し、１ｍＭのラウリン酸ｐ－ニトロフェニルと３７℃で反応させ、加水分解反応によって生じるｐ－ニトロフェノールを波長４００ｎｍの吸光度によって測定した（図８）その結果、発現ベクターを導入していないバークホルデリア・マルティボランス野生株ではコレステロールエステラーゼ活性がほとんど確認されなかったが、本発明のプロモーターを有するコレステロールエステラーゼ発現ベクターを導入した形質転換体ではコレステロールエステラーゼ活性が確認された。この結果から、本発明のプロモーターは他のバークホルデリア属でも構成型プロモーターとして働くことが示された。

【産業上の利用可能性】

【0067】

本発明によれば、本発明のプロモーターＤＮＡを用いることにより、タンパク質の高生産が可能になり、さらに好ましくは構成的なプロモーターＤＮＡを用いることにより、タンパク質の恒常的な高生産が可能になり、高効率なタンパク質の製造方法の提供が可能になる。

【配列表フリーテキスト】

【0068】

配列番号１：プロモーター１の塩基配列
配列番号２：プロモーター２の塩基配列
配列番号３：バークホルデリア・スタビリス由来のアルキルヒドロペルオキシドレダクターゼのアミノ酸配列
配列番号４：マチュアなコレステロールエステラーゼの塩基配列
配列番号５：マチュアなコレステロールエステラーゼのアミノ酸配列
配列番号６：コレステロールエステラーゼのシグナル配列の塩基配列
配列番号７：コレステロールエステラーゼのシグナルのアミノ酸配列
配列番号８：シグナル配列とマチュアなコレステロールエステラーゼとが直結した、その塩基配列
配列番号９：シグナル配列とマチュアなコレステロールエステラーゼとが直結した、そのアミノ酸配列
配列番号１０：シグナル配列とマチュアなコレステロールエステラーゼとその発現に必要なシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１１：配列番号１０に部分配列として含まれるシャペロンの塩基配列
配列番号１２：配列番号１１のアミノ酸配列
配列番号１３：配列番号１１のシグナル配列の塩基配列
配列番号１４：配列番号１３のアミノ酸配列
配列番号１５：シャペロンのシグナル配列とマチュアなシャペロンとが直結した塩基配列
配列番号１６：シャペロンのシグナル配列とマチュアなシャペロンとが直結したアミノ酸配列
配列番号１７：ターミネーター配列の塩基配列
配列番号１８：ターミネーター配列の塩基配列
配列番号１９：コレステロールエステラーゼの下流に天然状態で配置されているターミネーター配列の塩基配列
配列番号２０：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ１－ｐＢＢＲ－Ｆ）
配列番号２１：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ１－ＭＣＳ－Ｒ）
配列番号２２：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（ＭＣＳ－Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ１－Ｆ）
配列番号２３：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（ＭＣＳ－Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ２－Ｒ）
配列番号２４：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ２－ＭＣＳ－Ｆ）
配列番号２５：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ２－ｐＢＢＲ－Ｒ）
配列番号２６：ターミネーター配列（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ２）
配列番号２７：ターミネーター配列（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ１）
配列番号２８：マルチクローニングサイト
配列番号２９：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（ｐＢＢＲ－Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ２－Ｆ）
配列番号３０：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（ｐＢＢＲ－Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ１－Ｒ）
配列番号３１：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（ＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＥｓｔｅｒａｓｅ－Ｆ）
配列番号３２：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（ＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌＥｓｔｅｒａｓｅ－Ｒ）
配列番号３３：配列番号１のプロモーターを増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ１－Ｆ）
配列番号３４：配列番号１のプロモーターを増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ１－Ｒ）
配列番号３５：配列番号２のプロモーターを増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ２－Ｆ）
配列番号３６：配列番号１のプロモーターを増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ２－Ｒ）
配列番号３７：発現ベクターを増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ２－ｃｈａｐｅｒｏｎ－Ｆ）
配列番号３８：発現ベクターを増幅するための合成オリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ１－Ｒ）
配列番号３９：マチュアなバークホルデリア・プランタリイ由来のリパーゼの塩基配列
配列番号４０：マチュアなバークホルデリア・プランタリイ由来のリパーゼのアミノ酸配列
配列番号４１：バークホルデリア・プランタリイ由来のリパーゼのシグナル配列の塩基配列
配列番号４２：バークホルデリア・プランタリイ由来のリパーゼのシグナルのアミノ酸配列
配列番号４３：バークホルデリア・プランタリイ由来のリパーゼのシグナル配列とマチュアなリパーゼとが直結した塩基配列
配列番号４４：バークホルデリア・プランタリイ由来のリパーゼのシグナル配列とマチュアなリパーゼとが直結したそのアミノ酸配列
配列番号４５：シグナル配列と、マチュアなコレステロールエステラーゼと、シャペロンとが直結した塩基配列
配列番号４６：配列番号４５に含まれるシャペロンの塩基配列
配列番号４７：配列番号４６のアミノ酸配列
配列番号４８：配列番号４５に含まれるシグナル配列の塩基配列
配列番号４９：配列番号４８のアミノ酸配列

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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