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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-21
(45)【発行日】2022-05-02
(54)【発明の名称】ｐ５３分解誘導分子及び医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 47/54 20170101AFI20220422BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220422BHJP
A61K 38/05 20060101ALI20220422BHJP
C07K 5/062 20060101ALI20220422BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220422BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220422BHJP
【ＦＩ】
A61K47/54
A61K45/00
A61K38/05
C07K5/062
A61P35/00
A61P43/00 107
A61P25/00
A61P9/00
A61P3/10
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2018551619
(86)(22)【出願日】2017-11-13
(86)【国際出願番号】 JP2017040781
(87)【国際公開番号】W WO2018092725
(87)【国際公開日】2018-05-24
【審査請求日】2020-11-06
(31)【優先権主張番号】P 2016222681
(32)【優先日】2016-11-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000125370
【氏名又は名称】学校法人東京理科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(74)【代理人】
【識別番号】100136939
【弁理士】
【氏名又は名称】岸武 弘樹
(72)【発明者】
【氏名】宮本 悦子
(72)【発明者】
【氏名】小沢 正晃
【審査官】伊藤 基章
(56)【参考文献】
【文献】特開２００９－１４９５２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－１７７４４４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／００３２８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００８－０８１５０８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５３３９８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】伊野部智由，プロテアソームによる蛋白質分解の分子機構，公益財団法人アステラス病態代謝研究会 平成２４年度 第４４回助成研究報告集，2012年，全文
【文献】BELL, S. et al.，p53 Contains Large Unstructured Regions in its Native State，J Mol Biol，2002年，Vol.322，p.917-27，ISSN 0022-2836，Abstract、等
【文献】LONG, M.J. et al.，Inhibitor Mediated Protein Degradation，Chem Biol，2012年，Vol.19，p.629-37，ISSN 1074-5521，Abstract、第630頁左欄下から第13-12行、Discussion、Significance等
【文献】SHI, Y. et al.，Boc3Arg-Linked Ligands Induce Degradation by Localizing Target Proteins to the 20S Proteasome，ACS Chem Biol，2016年10月05日，Vol.11，p.3328-37，ISSN 1554-8937，Abstract、Figures、等
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４７／００
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ３１／００
Ｃ０７Ｋ ５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有するｐ５３親和性分子と、プロテアソームに対して親和性を有し、且つ、プロテアソームによるタンパク質の分解を阻害しないタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートであって、前記ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能であり、前記タンパク質分解誘導タグが、下記式（Ｉ）で表される構造を有するか、プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造を有するか、又はプロテアソーム活性化剤の構造を有するｐ５３分解誘導分子。
【化1】
【請求項2】
前記プロテアソーム阻害活性が、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する阻害活性である請求項１に記載のｐ５３分解誘導分子。
【請求項3】
下記式で表される請求項１又は請求項２に記載のｐ５３分解誘導分子。【化2】
【請求項4】
ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有するｐ５３親和性分子と、プロテアソームに対して親和性を有し、且つ、プロテアソームによるタンパク質の分解を阻害しないタンパク質分解誘導タグ（ただし、下記式で表されるタグを除く。）とのコンジュゲート（ただし、融合タンパク質を除く。）を設計することを含む、前記ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能なｐ５３分解誘導分子の設計方法。【化3】
【請求項5】
ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有するｐ５３親和性分子と、プロテアソームに対して親和性を有し、且つ、プロテアソームによるタンパク質の分解を阻害しないタンパク質分解誘導タグ（ただし、ポリユビキチン鎖、ユビキチン様ドメイン、及び下記式で表されるタグを除く。）とのコンジュゲートを設計することを含む、前記ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能なｐ５３分解誘導分子の設計方法。【化4】
【請求項6】
ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有するｐ５３親和性分子と、プロテアソームに対して親和性を有し、且つ、プロテアソームによるタンパク質の分解を阻害しないタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートを設計することを含む、前記ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能なｐ５３分解誘導分子の設計方法であって、前記タンパク質分解誘導タグが、下記式（Ｉ）で表される構造を有するか、プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造を有するか、又はプロテアソーム活性化剤の構造を有する設計方法。
【化5】
【請求項7】
下記式で表される化合物。【化6】
【請求項8】
請求項１～請求項３のいずれか１項に記載のｐ５３分解誘導分子を含む医薬組成物。
【請求項9】
ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状の予防又は治療に用いられる請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状が、癌、細胞老化、神経疾患、神経細胞死、糖尿病、又は心機能障害である請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状が細胞老化である請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ｐ５３分解誘導分子及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ｐ５３タンパク質は、細胞老化、細胞周期の停止、アポトーシスの誘導等に関連するタンパク質であり、ＤＮＡ損傷を引き起こすストレス（活性酸素、放射線等）などに応答して活性化される。
【0003】
従来、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経疾患、又は脳卒中等の虚血性障害において、ｐ５３タンパク質の発現が亢進し、神経細胞死が誘導されることが知られている。また、ｐ５３タンパク質の発現亢進が、心臓における血管新生能を低下させること等により、心機能障害の発症を促進することが知られている。また、ｐ５３タンパク質の発現亢進が、膵β細胞におけるミトコンドリア機能を低下させること等により、インスリン分泌能を低下させ、糖尿病の発症を促進することが知られている。
更に、再生医療において用いられる多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞（induced Pluripotent Stem Cell））の作製において、ｐ５３遺伝子の発現を抑制する必要があることが知られている。
このため、種々の疾患の治療及び再生医療において、ｐ５３タンパク質の量（発現）を減少させる方法論が検討されている。
更に、再生医療において用いられる多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞（induced Pluripotent Stem Cell））の作製において、ｐ５３遺伝子の発現を抑制する必要があることが知られている。
このため、種々の疾患の治療及び再生医療において、ｐ５３タンパク質の量（発現）を減少させる方法論が検討されている。
【0004】
また、ｐ５３タンパク質が活性化することにより、癌化した細胞の増殖抑制及びアポトーシスの誘導が惹起され、癌が抑制されると考えられている。しかし、ヒトの癌においては、５０％以上の割合でｐ５３タンパク質が変異しており、癌細胞の増殖抑制及びアポトーシスの誘導といった機能が低下していることが知られている。
このため、癌治療において、変異型ｐ５３タンパク質の量（発現）を減少させる方法論が検討されている。
このため、癌治療において、変異型ｐ５３タンパク質の量（発現）を減少させる方法論が検討されている。
【0005】
これまで、標的タンパク質の量をＲＮＡレベルで操作する技術として、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）を用いて標的タンパク質のｍＲＮＡを分解するＲＮＡｉ（RNA interference）技術が知られている。
【0006】
また、標的タンパク質の量をタンパク質レベルで操作する技術として、標的タンパク質に結合する分子とユビキチンリガーゼ（Ｅ３）に結合する分子とを連結した複合体を用いる技術が知られている（例えば、特許文献１～２、非特許文献１～３参照）。この技術は、上記複合体を介して標的タンパク質とユビキチンリガーゼとを結び付け、標的タンパク質を特異的にユビキチン化してプロテアソームによる分解へと導くものである。上記複合体は、ＳＮＩＰＥＲ（Specific and Nongenetic IAP-dependent Protein ERaser）、ＰＲＯＴＡＣ（PROteolysis TArgeting Chimera）等と称されることもある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開２０１３－０５６８３７号公報
【文献】米国特許第７２０８１５７号明細書
【非特許文献】
【0008】
【文献】Itoh, Y. et al., "Development of target protein-selective degradation inducer for protein knockdown.", Bioorg. Med. Chem., 2011, 19, 3229-3241
【文献】Demizu, Y. et al., "Design and synthesis of estrogen receptor degradation inducer based on a protein knockdown strategy.", Bioorg. Med. Chem. Lett., 2012, 15, 1793-1796
【文献】Hines, J. et al., "Posttranslational protein knockdown coupled to receptor tyrosine kinase activation with phosphoPROTACs.", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2013, 110(22), 8942-8947
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
しかし、ＲＮＡｉ技術は、オフターゲット効果の問題があり、標的タンパク質の量を特異的にコントロールすることは困難である。また、ＲＮＡｉ技術は、ｓｉＲＮＡのデリバリーが困難であり、医薬への応用には課題が多い。
【0010】
一方、標的タンパク質に結合する分子とユビキチンリガーゼに結合する分子とを連結した複合体を用いる技術は、ＲＮＡｉ技術に比べて医薬への応用が容易である。しかし、標的タンパク質をユビキチン化する方法には、下記のような問題点がある。
（１）ユビキチンリガーゼには多数の種類があり、標的特異性がある。このため、特定の標的タンパク質をユビキチン化するためには、例えば、標的タンパク質に合わせて分子を設計するなど、個々に対応する必要がある。
（２）ユビキチン化シグナルのコントロールが困難である。例えば、タンパク質のユビキチン化は、タンパク質の分解以外に、分化、癌化等のシグナルに関連することが知られている。また、タンパク質のユビキチン化には、組織特異性及び時間特異性があることが知られている。このため、標的タンパク質のユビキチン化が、標的タンパク質の分解ではなく、その他のシグナルとなるケースがあると推定される。
（３）ユビキチン又はユビキチン化酵素に不具合があるケースがある。例えば、変異等により、ユビキチンやユビキチン化酵素が正常に機能しない（マルファンクションとなっている）場合があり、それが疾患の原因である場合も多い。このため、標的タンパク質のユビキチン化が、標的タンパク質の分解を誘導しないケースがあると推定される。
（１）ユビキチンリガーゼには多数の種類があり、標的特異性がある。このため、特定の標的タンパク質をユビキチン化するためには、例えば、標的タンパク質に合わせて分子を設計するなど、個々に対応する必要がある。
（２）ユビキチン化シグナルのコントロールが困難である。例えば、タンパク質のユビキチン化は、タンパク質の分解以外に、分化、癌化等のシグナルに関連することが知られている。また、タンパク質のユビキチン化には、組織特異性及び時間特異性があることが知られている。このため、標的タンパク質のユビキチン化が、標的タンパク質の分解ではなく、その他のシグナルとなるケースがあると推定される。
（３）ユビキチン又はユビキチン化酵素に不具合があるケースがある。例えば、変異等により、ユビキチンやユビキチン化酵素が正常に機能しない（マルファンクションとなっている）場合があり、それが疾患の原因である場合も多い。このため、標的タンパク質のユビキチン化が、標的タンパク質の分解を誘導しないケースがあると推定される。
【0011】
現在、一般的には、医薬品として阻害剤、活性化剤等が設計される。しかし、ｐ５３タンパク質は、アンドラッガブルターゲットとして有名な転写因子であり、未だに創薬に至っていない。
【0012】
本開示は、上記のような事情に鑑み、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能なｐ５３分解誘導分子、及びそのｐ５３分解誘導分子を含む医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0013】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞ ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有するｐ５３親和性分子と、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートであり、前記ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能なｐ５３分解誘導分子。
＜１＞ ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有するｐ５３親和性分子と、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートであり、前記ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能なｐ５３分解誘導分子。
【0014】
＜２＞ ユビキチン非依存的に前記ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能な＜１＞に記載のｐ５３分解誘導分子。
【0015】
＜３＞ 前記タンパク質分解誘導タグが、プロテアーゼ阻害剤のプロテアーゼ阻害活性を失活させた構造を有する＜１＞又は＜２＞に記載のｐ５３分解誘導分子。
【0016】
＜４＞ 前記プロテアーゼがプロテアソームである＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載のｐ５３分解誘導分子。
【0017】
＜５＞ 前記タンパク質分解誘導タグが、プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造を有する＜４＞に記載のｐ５３分解誘導分子。
【0018】
＜６＞ 前記プロテアソーム阻害活性が、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する阻害活性である＜５＞に記載のｐ５３分解誘導分子。
【0019】
＜７＞ ＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載のｐ５３分解誘導分子を含む医薬組成物。
【0020】
＜８＞ ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状の予防又は治療に用いられる＜７＞に記載の医薬組成物。
【0021】
＜９＞ 前記ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状が、癌、細胞老化、神経疾患、神経細胞死、糖尿病、又は心機能障害である＜８＞に記載の医薬組成物。
【0022】
＜１０＞ 前記ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状が細胞老化である＜９＞に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【0023】
本開示によれば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能なｐ５３分解誘導分子、及びそのｐ５３分解誘導分子を含む医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨＣＴ１１６細胞における内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図2】ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨｅＬａ細胞における内在の野生型ｐ５３タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図3】マウス個体にＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを投与した場合の肝臓における野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図4】ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した老化関連酸性β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）誘導ＴＩＧ３細胞における抗老化作用について、ＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）解析により評価した結果を示す図である。
【図5A】プロテアソームの触媒サブユニットβ１に対する、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びＭＧ－１３２の阻害活性を示す図である。
【図5B】プロテアソームの触媒サブユニットβ２に対する、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びＭＧ－１３２の阻害活性を示す図である。
【図5C】プロテアソームの触媒サブユニットβ５に対する、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びＭＧ－１３２の阻害活性を示す図である。
【図6】ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した結果を示す図である。
【図7A】ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図7B】ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した結果を示す図である。
【図8A】プロテアソームの触媒サブユニットβ１に対する、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ及びＡＬＬＮの阻害活性を示す図である。
【図8B】プロテアソームの触媒サブユニットβ２に対する、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ及びＡＬＬＮの阻害活性を示す図である。
【図8C】プロテアソームの触媒サブユニットβ５に対する、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ及びＡＬＬＮの阻害活性を示す図である。
【図9】ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書においてアミノ酸は、本技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシンであれば「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシンであれば「Ｇｌｙ」）で表記する。
本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書においてアミノ酸は、本技術分野で周知の一文字表記（例えば、グリシンであれば「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシンであれば「Ｇｌｙ」）で表記する。
【0026】
＜ｐ５３分解誘導分子＞
本開示のｐ５３分解誘導分子は、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有するｐ５３親和性分子と、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートであり、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能である。本開示のｐ５３分解誘導分子によれば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体のユビキチン化を介することなく（すなわち、ユビキチン非依存的に）、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能となる。
本開示のｐ５３分解誘導分子は、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有するｐ５３親和性分子と、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートであり、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解を誘導可能である。本開示のｐ５３分解誘導分子によれば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体のユビキチン化を介することなく（すなわち、ユビキチン非依存的に）、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能となる。
【0027】
なお、テトラユビキチン鎖（Ｕｂ４）等のポリユビキチン鎖又はユビキチン様ドメイン（ＵｂＬ）は、タンパク質分解誘導タグとして機能する可能性があるが、ポリユビキチン鎖又はユビキチン様ドメインをタンパク質分解誘導タグとした場合、ｐ５３親和性分子を介してｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体が間接的にユビキチン化されることになる。本明細書では、このようなｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の間接的なユビキチン化も、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体のユビキチン化に含まれるものとする。
【0028】
（ｐ５３親和性分子）
本開示のｐ５３分解誘導分子を構成するｐ５３親和性分子は、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有する分子である。
本開示のｐ５３分解誘導分子を構成するｐ５３親和性分子は、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有する分子である。
【0029】
ｐ５３複合体としては、ｐ５３／ＭＤＭ２複合体（ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との複合体。以下同様）、ｐ５３／Ｅ６複合体、ｐ５３／ＨＤＭ２複合体、ｐ５３／ＡＩＣＤ複合体、ｐ５３／ＲＵＮＸ２複合体、ｐ５３／ＲＵＮＸ３複合体等の、ｐ５３タンパク質と相互作用することが知られている公知の分子との複合体が特に制限なく挙げられる。
【0030】
ここで、ｐ５３複合体に対して親和性を有する分子には、ｐ５３タンパク質と複合体を形成する分子（ＭＤＭ２タンパク質等）に対して親和性を有する分子、及び、形成された複合体に対して親和性を有する分子が含まれる。
【0031】
ｐ５３タンパク質は、野生型であっても変異型であってもよい。変異型としては、例えば、Ｒ１７５Ｈ変異型（Ｎ末端から１７５番目のアミノ酸残基のアルギニン（Ｒ）からヒスチジン（Ｈ）への変異。以下同様）、Ｒ１１０Ｌ及びＲ２４８Ｗ変異型、Ｖ１５７Ｆ変異型、Ｓ１６６Ｙ変異型、Ｌ１９４Ｆ変異型、Ｒ２１３Ｑ及びＭ２３７Ｈ変異型、Ｇ２４５Ｖ変異型、Ｇ２４５Ｓ変異型、Ｒ２４８Ｑ変異型、Ｒ２４８Ｗ変異型、Ｉ２５４Ｄ変異型、Ｌ２６４Ｌ変異型、Ｒ２７３Ｈ及びＰ３０９Ｓ変異型、Ｒ２７３Ｃ変異型、Ｒ２８０Ｋ変異型、Ｒ２８２Ｗ変異型、Ｒ２７３Ｈ変異型、Ｓ１７６Ｙ及びＲ２４８Ｗ変異型、Ｖ１７３Ａ変異型、Ｒ２４９Ｓ変異型、Ｙ２２０Ｃ変異型、Ｖ２７２Ｍ変異型、Ｇ２６６Ｑ変異型、Ｇ１７５Ｅ変異型、Ｓ２４１Ｆ変異型等が挙げられる。
【0032】
従来、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経疾患、又は脳卒中等の虚血性障害において、ｐ５３タンパク質の発現が亢進し、神経細胞死が誘導されることが知られている。
また、心機能障害、糖尿病等の疾患において、心組織、膵臓組織等におけるｐ５３タンパク質の発現量が増加していることが知られており、これらの疾患は、ｐ５３タンパク質に対する阻害剤の投与により改善することが知られている。
また、ｐ５３タンパク質は、老化因子として、生活習慣病に起因する動脈硬化、代謝異常等との関連も指摘されている。
更に、再生医療において用いられる多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）の作製において、ｐ５３遺伝子の発現を抑制する必要があることが知られている。
また、心機能障害、糖尿病等の疾患において、心組織、膵臓組織等におけるｐ５３タンパク質の発現量が増加していることが知られており、これらの疾患は、ｐ５３タンパク質に対する阻害剤の投与により改善することが知られている。
また、ｐ５３タンパク質は、老化因子として、生活習慣病に起因する動脈硬化、代謝異常等との関連も指摘されている。
更に、再生医療において用いられる多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）の作製において、ｐ５３遺伝子の発現を抑制する必要があることが知られている。
【0033】
そこで、好ましいｐ５３親和性分子の一例としては、野生型（正常型）ｐ５３タンパク質又は野生型（正常型）ｐ５３複合体（野生型ｐ５３タンパク質と、野生型ｐ５３タンパク質に親和性を有する分子との複合体）に親和性を有するものが挙げられる。ｐ５３親和性分子が野生型ｐ５３タンパク質又は野生型ｐ５３複合体に親和性を有することにより、この野生型ｐ５３タンパク質又は野生型ｐ５３複合体をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能となる。結果として、野生型ｐ５３タンパク質又は野生型ｐ５３複合体に親和性を有するｐ５３親和性分子を含むｐ５３分解誘導分子は、神経疾患（脳卒中等による神経細胞死を含む）、心機能障害、糖尿病等の種々の疾患の予防又は治療、及び前述の多能性幹細胞の作製に有用であると考えられる。
【0034】
また、ヒトの癌ではｐ５３タンパク質が高頻度に変異しており、変異型ｐ５３タンパク質が野生型ｐ５３タンパク質の働きを阻害し、野生型ｐ５３タンパクによる癌細胞の増殖抑制及びアポトーシスの誘導を阻害することが知られている。
【0035】
そこで、好ましいｐ５３親和性分子の他の例としては、変異型ｐ５３タンパク質又は変異型ｐ５３複合体（変異型ｐ５３タンパク質と、変異型ｐ５３タンパク質に親和性を有する分子との複合体）に親和性を有するものが挙げられる。ｐ５３親和性分子が変異型ｐ５３タンパク質又は変異型ｐ５３複合体に親和性を有することにより、この変異型ｐ５３タンパク質又は変異型ｐ５３複合体をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能となる。結果として、変異型ｐ５３タンパク質又は変異型ｐ５３複合体に親和性を有するｐ５３親和性分子を含むｐ５３分解誘導分子は、癌等の種々の疾患の予防又は治療に有用であると考えられる。
【0036】
なお、前述した標的タンパク質をユビキチン化する方法では、ｐ５３複合体を構成する１つのタンパク質のみがユビキチン化され、ｐ５３複合体が各タンパク質に分かれた後に、ユビキチン化されたタンパク質のみが分解されると考えられる。これに対して、ｐ５３複合体に親和性を有するｐ５３親和性分子を含むｐ５３分解誘導分子は、ｐ５３複合体自体を分解可能である点で非常に有用である。
【0037】
本明細書において「ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有する」とは、例えば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して共有結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力等により結合可能であることを意味する。ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体と相互作用することが知られている他の分子（タンパク質、ペプチド、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、代謝物、低分子化合物等）とｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体との相互作用がある分子によって濃度依存的に影響を受ける場合、その分子は、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有すると判断することができる。
【0038】
ｐ５３親和性分子としては、低分子化合物、天然物、ペプチド、抗体等が挙げられる。なお、本開示において、抗体には、２本のＨ鎖と２本のＬ鎖とを含む、いわゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）以外に、ＩｇのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント等の抗体における可変部位を含むフラグメントなどが含まれる。ｐ５３親和性分子の分子量は、低分子化合物では、例えば、５０～５０００の範囲が好ましい。
【0039】
ｐ５３親和性分子の構造は、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に対して親和性を有する限り、特に制限されない。ｐ５３親和性分子としては、ｐ５３タンパク質に対して親和性を有するｐ５３阻害剤又はｐ５３活性化剤、ｐ５３／ＭＤＭ２複合体に対して親和性を有するＭＤＭ２阻害剤、ｐ５３／ＭＤＭ２複合体のＰＰＩ（タンパク質間相互作用）阻害剤等を使用することができる。また、ｐ５３親和性分子は、候補分子の中からスクリーニングによって得ることもできる。
【0040】
ｐ５３親和性分子の一例を以下の表１～表７に示す。ただし、本開示のｐ５３分解誘導分子に使用可能なｐ５３親和性分子がこれらの例に限定されるものではない。ｐ５３親和性分子については、必要に応じて、既存のデータベース（Binding DB（https://www.bindingdb.org/bind/index.jsp）、PCI DB（http://www.tanpaku.org/pci/pci_home.html）、ProtChemSI（http://pcidb.russelllab.org/）等）の情報を参照することができる。
【0041】
【表1】
【0042】
【表2】
【0043】
【表3】
【0044】
【表4】
【0045】
【表5】
【0046】
【表6】
【0047】
【表7】
【0048】
（タンパク質分解誘導タグ）
本開示のｐ５３分解誘導分子を構成するタンパク質分解誘導タグは、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子である。以下では、このタンパク質分解誘導タグをＣｉＫＤ（Chemical interactions and KnockDown）タグ又はＣＡＮＤＤＹ（Chemical AffiNities and Degradation DYnamics）タグとも称する。
本開示のｐ５３分解誘導分子を構成するタンパク質分解誘導タグは、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない分子である。以下では、このタンパク質分解誘導タグをＣｉＫＤ（Chemical interactions and KnockDown）タグ又はＣＡＮＤＤＹ（Chemical AffiNities and Degradation DYnamics）タグとも称する。
【0049】
プロテアーゼとしては特に制限されず、プロテアーゼ活性を有するあらゆる分子が挙げられる。例えば、プロテアソームのような複合体型プロテアーゼであってもよく、プロテアソーム以外のプロテアーゼであってもよい。また、プロテアーゼ活性を有する限り、プロテアソームの一部分であってもよい。
【0050】
プロテアソームとしては、例えば、２６Ｓプロテアソーム、免疫プロテアソーム、及び胸腺プロテアソームが挙げられる。
２６Ｓプロテアソームは、２０Ｓプロテアソームに１９Ｓプロテアソームが２つ結合したものである。２０Ｓプロテアソームは、α１～α７の７つのサブユニットから構成されるαリングと、β１～β７の７つのサブユニットから構成されるβリングとが、αββαの順に積み重なった筒状構造をしており、β１、β２、及びβ５がそれぞれカスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性という触媒活性を発揮する。
免疫プロテアソームは、触媒サブユニットβ１、β２、及びβ５がそれぞれβ１ｉ、β２ｉ、及びβ５ｉに置き換わったものである（Science, 1994, 265, 1234-1237）。
胸腺プロテアソームは、β１ｉ及びβ２ｉとともに、胸腺皮質上皮細胞（ｃＴＥＣ）特異的に発現するβ５ｔが組み込まれたものである（Science, 2007, 316, 1349-1353）。
２６Ｓプロテアソームは、２０Ｓプロテアソームに１９Ｓプロテアソームが２つ結合したものである。２０Ｓプロテアソームは、α１～α７の７つのサブユニットから構成されるαリングと、β１～β７の７つのサブユニットから構成されるβリングとが、αββαの順に積み重なった筒状構造をしており、β１、β２、及びβ５がそれぞれカスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性という触媒活性を発揮する。
免疫プロテアソームは、触媒サブユニットβ１、β２、及びβ５がそれぞれβ１ｉ、β２ｉ、及びβ５ｉに置き換わったものである（Science, 1994, 265, 1234-1237）。
胸腺プロテアソームは、β１ｉ及びβ２ｉとともに、胸腺皮質上皮細胞（ｃＴＥＣ）特異的に発現するβ５ｔが組み込まれたものである（Science, 2007, 316, 1349-1353）。
【0051】
また、プロテアソーム以外のプロテアーゼとしては、β－セクレターゼ、γ－セクレターゼ、アミノペプチダーゼ、アンジオテンシン変換酵素、ブロメライン、カルパインＩ、カルパインＩＩ、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＹ、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１３、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＧ、カテプシンＬ、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、補体Ｃ１ｒ、補体Ｃ１ｓ、補体Ｂ因子、補体Ｄ因子、ジペプチジルペプチダーゼＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ、ディスパーゼ、エラスターゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ、フィシン、グランザイムＢ、カリクレイン、ロイシンアミノペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、パパイン、ペプシン、プラスミン、プロカスパーゼ３、プロナーゼＥ、プロテイナーゼＫ、レニン、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、細胞質アラニルアミノペプチダーゼ、エンケファリナーゼ、ネプリライシン等が挙げられる。
【0052】
本明細書において「プロテアーゼに対して親和性を有する」とは、例えば、プロテアーゼに対して共有結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力等により結合可能であることを意味する。ある分子の存在下においてプロテアーゼの熱安定性が変化する場合、その分子は、プロテアーゼに対して親和性を有すると判断することができる。
【0053】
また、本明細書において「プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しない」とは、例えば、プロテアーゼの分解活性サイトに共有結合しないことを意味する。ある分子の存在下においてもプロテアーゼによってタンパク質が分解され、更にプロテアーゼ阻害剤を共存させるとタンパク質の分解が阻害される場合、その分子は、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないと判断することができる。
【0054】
タンパク質分解誘導タグとしては、低分子化合物、天然物、ペプチド、抗体等が挙げられる。タンパク質分解誘導タグの分子量は、例えば、５０～２０００００の範囲が好ましい。タンパク質分解誘導タグが低分子化合物である場合、タンパク質分解誘導タグの分子量は、例えば、５０～５０００の範囲が好ましい。
【0055】
タンパク質分解誘導タグの構造は、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないものである限り、特に制限されない。タンパク質分解誘導タグは、例えば、候補分子の中からスクリーニングによって得ることができる。また、プロテアーゼ阻害剤（例えば、プロテアソーム阻害剤）のプロテアーゼ阻害活性（例えば、プロテアソーム阻害活性）を失活させることにより製造することもできる。
【0056】
ある態様では、タンパク質分解誘導タグは、例えば、下記式（Ｉ）で表される構造とすることができる。下記式（Ｉ）で表される化合物は、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害しないことが確認されている（例えば、後述する参考例１～４を参照）。
【0057】
【化1】
【0058】
式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数１～２０の炭化水素基、炭素数１～２０のアルコキシ基、炭素数６～２０のアリールオキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、又はハロゲノ基を示す。
【0059】
炭化水素基としては、アルキル基、アルケニル基、アリール基、これらの組み合わせ等が挙げられる。具体的には、メチル基、エチル基等の炭素数１～２０のアルキル基；ビニル基、アリル基等の炭素数２～２０のアルケニル基；フェニル基、ナフチル基等の炭素数６～２０のアリール基；ベンジル基、フェネチル基等の炭素数７～２０のアリールアルキル基；トリル基、キシリル基等の炭素数７～２０のアルキルアリール基；等が挙げられる。
ハロゲノ基としては、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等が挙げられる。
ハロゲノ基としては、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基等が挙げられる。
【0060】
別の態様では、タンパク質分解誘導タグは、プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造とすることができる。プロテアソーム阻害活性としては、より具体的には、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する阻害活性が挙げられる。
【0061】
ここで、「プロテアソーム阻害活性を失活させた構造」には、プロテアソーム阻害活性を完全に消失させた構造に加え、プロテアソーム阻害活性を減弱させた構造も含まれる。ある態様では、タンパク質分解誘導タグは、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性、及びキモトリプシン様活性から選ばれる少なくとも１種に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、元のプロテアソーム阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の２倍以上である。
【0062】
プロテアソーム阻害剤としては、プロテアソーム阻害活性を有するあらゆる化合物を使用することができる。プロテアソーム阻害剤は、プロテアソーム（複合体型プロテアーゼ）に対して親和性を有し、且つ、プロテアソームによるタンパク質の分解を阻害する化合物である。したがって、プロテアソーム阻害剤の活性部位を他の構造部分に置き換えてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
プロテアソーム阻害剤は、抗癌剤等として研究が進んでおり、医薬品として認可済みの化合物及び臨床試験中の化合物が数多く存在する。また、プロテアソーム阻害剤は、分子量が比較的小さく、疎水性が低いものが多く、細胞膜透過性、細胞毒性等の問題も生じ難い。このため、プロテアソーム阻害剤を基にタンパク質分解誘導タグを合成することは、非常に合理的且つ効率的である。
プロテアソーム阻害剤は、抗癌剤等として研究が進んでおり、医薬品として認可済みの化合物及び臨床試験中の化合物が数多く存在する。また、プロテアソーム阻害剤は、分子量が比較的小さく、疎水性が低いものが多く、細胞膜透過性、細胞毒性等の問題も生じ難い。このため、プロテアソーム阻害剤を基にタンパク質分解誘導タグを合成することは、非常に合理的且つ効率的である。
【0063】
プロテアソーム阻害剤の一例を以下の表８及び表９に示す。表８及び表９に示すプロテアソーム阻害剤は、いずれも２０Ｓプロテアソームの活性中心部に対して親和性を有する２０Ｓプロテアソーム阻害剤である。また、表８及び表９に示すプロテアソーム阻害剤は、当然に２６Ｓプロテアソームに対しても親和性を有する。ただし、タンパク質分解誘導タグの製造に使用可能なプロテアソーム阻害剤がこれらの例に限定されるものではない。
【0064】
【表8】
【0065】
【表9】
【0066】
例えば、ボロン酸型プロテアソーム阻害剤であるボルテゾミブ（Bortezomib）は、下記式に示すように、活性部位であるボロニル基が２０Ｓプロテアソームの分解活性サイトと共有結合することで、プロテアソーム活性を阻害することが知られている（Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115）。
【0067】
【化2】
【0068】
また、ボロン酸型プロテアソーム阻害剤であるＭＬＮ９７０８及びＭＬＮ２２３８は、下記式に示すように、活性部位であるボロン酸エステル部位又はボロニル基が２０Ｓプロテアソームの分解活性サイトと共有結合することで、プロテアソーム活性を阻害することが知られている（Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115）。
【0069】
【化3】
【0070】
このため、ボルテゾミブ、ＭＬＮ９７０８、及びＭＬＮ２２３８の活性部位であるボロニル基又はボロン酸エステル部位を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【0071】
なお、ＣＥＰ－１８７７０等の他のボロン酸型プロテアソーム阻害剤についても、活性部位を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【0072】
また、アルデヒド型プロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮは、下記式に示すように、活性部位であるホルミル基が２０Ｓプロテアソームの分解活性サイトと共有結合することで、プロテアソーム活性を阻害することが知られている（Kisselev, A.F. et al., Chemistry & Biology, 2012, 19, 99-115）。
【0073】
【化4】
【0074】
このため、ＡＬＬＮの活性部位であるホルミル基を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【0075】
なお、ＭＧ－１３２、ＢＳｃ－２１１８、ＰＳＩ等の他のアルデヒド型プロテアソーム阻害剤についても、活性部位であるホルミル基を他の構造部分（カルボキシ基、アルキル基、アリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等）に置き換えることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【0076】
プロテアソーム阻害剤のプロテアソーム阻害活性を失活させた構造を有するタンパク質分解誘導タグの一例を以下の表１０及び表１１に示す。表中のＲで表される１価の基としては、カルボキシ基、炭素数１～２０のアルキル基、炭素数６～２０のアリール基、アミノ基、ヒドロキシ基等が挙げられる。
【0077】
【表10】
【0078】
【表11】
【0079】
プロテアソーム阻害剤の他の例を以下の表１２～表１７に示す。これらのプロテアソーム阻害剤についても、上記と同様にしてプロテアソーム阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【0080】
【表12】
【0081】
【表13】
【0082】
【表14】
【0083】
【表15】
【0084】
【表16】
【0085】
【表17】
【0086】
別の態様では、タンパク質分解誘導タグは、プロテアーゼ阻害剤（前述したプロテアソーム阻害剤を除く）のプロテアーゼ阻害活性を失活させた構造とすることができる。
【0087】
ここで、「プロテアーゼ阻害活性を失活させた構造」には、プロテアーゼ阻害活性を完全に消失させた構造に加え、プロテアーゼ阻害活性を減弱させた構造も含まれる。ある態様では、タンパク質分解誘導タグは、プロテアーゼ阻害剤の阻害対象となるプロテアーゼに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、元のプロテアーゼ阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の２倍以上である。
【0088】
プロテアーゼ阻害剤としては、プロテアーゼ阻害活性を有するあらゆる化合物を使用することができる。プロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼに対して親和性を有し、且つ、プロテアーゼによるタンパク質の分解を阻害する化合物である。したがって、プロテアーゼ阻害剤の活性部位を他の構造部分に置き換えてプロテアーゼ阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【0089】
プロテアーゼ阻害剤の一例を以下の表１８～表８５に示す。これらのプロテアーゼ阻害剤の活性部位を他の構造部分に置き換えてプロテアーゼ阻害活性を失活させることで、タンパク質分解誘導タグを得ることができる。ただし、タンパク質分解誘導タグの製造に使用可能なプロテアーゼ阻害剤がこれらの例に限定されるものではない。プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤については、必要に応じて、既存のデータベース（MEROPS-the peptidase database（http://merops.sanger.ac.uk/index.shtml）等）の情報を参照することができる。
【0090】
【表18】
【0091】
【表19】
【0092】
【表20】
【0093】
【表21】
【0094】
【表22】
【0095】
【表23】
【0096】
【表24】
【0097】
【表25】
【0098】
【表26】
【0099】
【表27】
【0100】
【表28】
【0101】
【表29】
【0102】
【表30】
【0103】
【表31】
【0104】
【表32】
【0105】
【表33】
【0106】
【表34】
【0107】
【表35】
【0108】
【表36】
【0109】
【表37】
【0110】
【表38】
【0111】
【表39】
【0112】
【表40】
【0113】
【表41】
【0114】
【表42】
【0115】
【表43】
【0116】
【表44】
【0117】
【表45】
【0118】
【表46】
【0119】
【表47】
【0120】
【表48】
【0121】
【表49】
【0122】
【表50】
【0123】
【表51】
【0124】
【表52】
【0125】
【表53】
【0126】
【表54】
【0127】
【表55】
【0128】
【表56】
【0129】
【表57】
【0130】
【表58】
【0131】
【表59】
【0132】
【表60】
【0133】
【表61】
【0134】
【表62】
【0135】
【表63】
【0136】
【表64】
【0137】
【表65】
【0138】
【表66】
【0139】
【表67】
【0140】
【表68】
【0141】
【表69】
【0142】
【表70】
【0143】
【表71】
【0144】
【表72】
【0145】
【表73】
【0146】
【表74】
【0147】
【表75】
【0148】
【表76】
【0149】
【表77】
【0150】
【表78】
【0151】
【表79】
【0152】
【表80】
【0153】
【表81】
【0154】
【表82】
【0155】
【表83】
【0156】
【表84】
【0157】
【表85】
【0158】
なお、以上の説明では、便宜上、プロテアソーム阻害剤とプロテアソーム阻害剤以外のプロテアーゼ阻害剤とを区別したが、プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者の活性を阻害可能な化合物も知られている。したがって、このような化合物を用いることで、プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者に対して親和性を有するタンパク質分解誘導タグを得ることができる。
【0159】
プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者の活性を阻害可能な化合物の一例を以下の表８６に示す。ただし、プロテアソームとプロテアソーム以外のプロテアーゼとの両者の活性を阻害可能な化合物がこれらの例に限定されるものではない。
【0160】
【表86】
【0161】
別の態様では、タンパク質分解誘導タグとして、プロテアソーム活性化剤を使用することができる。プロテアソーム活性化剤は、プロテアソーム（複合体型プロテアーゼ）に対して親和性を有し、且つ、プロテアソームによるタンパク質の分解を阻害しない化合物であり、タンパク質分解誘導タグとして使用することができる。
【0162】
プロテアソーム活性化剤の一例を以下の表８７～表８９に示す。ただし、タンパク質分解誘導タグの製造に使用可能なプロテアソーム活性化剤がこれらの例に限定されるものではない。
【0163】
【表87】
【0164】
【表88】
【0165】
【表89】
【0166】
以上のとおり例示したタンパク質分解誘導タグの中でも、特に、２６Ｓプロテアソームに親和性を有するものが好ましい。細胞内のプロテアソームは、通常、２０Ｓプロテアソームに１９Ｓプロテアソームが２つ結合した２６Ｓプロテアソームの状態で存在する。このため、２６Ｓプロテアソームに親和性を有するタンパク質分解誘導タグを用いることで、細胞内のｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体をより効率的に分解へと導くことが可能となる。
【0167】
（ｐ５３親和性分子とタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートの様式）
ｐ５３親和性分子とタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートの様式は、ｐ５３親和性分子のｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体との親和性、及びタンパク質分解誘導タグのプロテアーゼとの親和性が維持される限り、特に制限されない。なお、ｐ５３親和性分子及びタンパク質分解誘導タグがいずれもタンパク質である場合、両者を融合した融合タンパク質を合成することが可能であるが、このような融合タンパク質は「コンジュゲート」には含まれない。
ｐ５３親和性分子とタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートの様式は、ｐ５３親和性分子のｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体との親和性、及びタンパク質分解誘導タグのプロテアーゼとの親和性が維持される限り、特に制限されない。なお、ｐ５３親和性分子及びタンパク質分解誘導タグがいずれもタンパク質である場合、両者を融合した融合タンパク質を合成することが可能であるが、このような融合タンパク質は「コンジュゲート」には含まれない。
【0168】
ｐ５３分解誘導分子は、例えば、少なくとも１つのｐ５３親和性分子と少なくとも１つのタンパク質分解誘導タグとが連結された構造とすることができる。ｐ５３分解誘導分子は、１つのｐ５３親和性分子と１つのタンパク質分解誘導タグとが連結された構造であってもよく、１つのｐ５３親和性分子と複数のタンパク質分解誘導タグとが連結された構造であってもよく、複数のｐ５３親和性分子と１つのタンパク質分解誘導タグとが連結された構造であってもよく、複数のｐ５３親和性分子と複数のタンパク質分解誘導タグとが連結された構造であってもよい。ある態様では、ｐ５３分解誘導分子は、１つのｐ５３親和性分子と１つのタンパク質分解誘導タグとが連結された構造である。
【0169】
ｐ５３親和性分子におけるタンパク質分解誘導タグとの連結位置は、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体との親和性が維持される限り、特に制限されない。
一方、タンパク質分解誘導タグにおけるｐ５３親和性分子との連結位置は、プロテアーゼとの親和性が維持される限り、特に制限されない。例えば、タンパク質分解誘導タグが、前述のように、プロテアーゼ阻害剤（例えば、プロテアソーム阻害剤）の活性部位を他の構造部分に置き換えた構造である場合、この置き換えた他の構造部分においてｐ５３親和性分子と連結することができる。具体的に、プロテアーゼ阻害剤の活性部位をカルボキシ基に置き換えた場合、カルボキシ基を介してｐ５３親和性分子と連結することができる。
一方、タンパク質分解誘導タグにおけるｐ５３親和性分子との連結位置は、プロテアーゼとの親和性が維持される限り、特に制限されない。例えば、タンパク質分解誘導タグが、前述のように、プロテアーゼ阻害剤（例えば、プロテアソーム阻害剤）の活性部位を他の構造部分に置き換えた構造である場合、この置き換えた他の構造部分においてｐ５３親和性分子と連結することができる。具体的に、プロテアーゼ阻害剤の活性部位をカルボキシ基に置き換えた場合、カルボキシ基を介してｐ５３親和性分子と連結することができる。
【0170】
なお、ｐ５３親和性分子及びタンパク質分解誘導タグは、相互に連結可能な構造であってもよい。ｐ５３親和性分子とタンパク質分解誘導タグとを直接連結することが困難な場合には、相互に連結可能とする構造を、ｐ５３親和性分子及びタンパク質分解誘導タグの少なくとも一方に導入することも考えられる。
例えば、ｐ５３親和性分子としては、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に親和性を有する既知の分子を使用することができるが、この既知の分子とタンパク質分解誘導タグとを直接連結することが困難な場合も想定される。このような場合には、タンパク質分解誘導タグと連結可能な構造を当該既知の分子に導入し、ｐ５３親和性分子として使用してもよい。
例えば、ｐ５３親和性分子としては、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体に親和性を有する既知の分子を使用することができるが、この既知の分子とタンパク質分解誘導タグとを直接連結することが困難な場合も想定される。このような場合には、タンパク質分解誘導タグと連結可能な構造を当該既知の分子に導入し、ｐ５３親和性分子として使用してもよい。
【0171】
＜医薬組成物＞
本開示の医薬組成物は、本開示のｐ５３分解誘導分子を含むものである。前述したとおり、本開示のｐ５３分解誘導分子によれば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体のユビキチン化を介することなく（すなわち、ユビキチン非依存的に）、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能となる。したがって、ｐ５３分解誘導分子を含む本開示の医薬組成物は、ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状の予防又は治療に用いることができる。本開示によれば、ｐ５３分解誘導分子を含む医薬組成物を投与することを含む、ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状の予防又は治療方法もまた提供される。
本開示の医薬組成物は、本開示のｐ５３分解誘導分子を含むものである。前述したとおり、本開示のｐ５３分解誘導分子によれば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体のユビキチン化を介することなく（すなわち、ユビキチン非依存的に）、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体をプロテアーゼ（例えば、プロテアソーム）による分解（ノックダウン）へと導くことが可能となる。したがって、ｐ５３分解誘導分子を含む本開示の医薬組成物は、ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状の予防又は治療に用いることができる。本開示によれば、ｐ５３分解誘導分子を含む医薬組成物を投与することを含む、ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状の予防又は治療方法もまた提供される。
【0172】
なお、複合体を標的とした薬剤の設計は困難である場合が多いが、本開示の医薬組成物は、ｐ５３複合体を標的として分解することもできる点で非常に有用である。
【0173】
ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状としては、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体の分解により予防効果又は治療効果を期待し得るものであれば特に制限されない。ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状の一例を以下の表９０に示す。ただし、ｐ５３タンパク質が仲介する疾患又は症状がこれらの例に限定されるものではない。
【0174】
【表90】
【0175】
ある態様では、本開示の医薬組成物は、細胞老化、脂肪老化、神経疾患（神経細胞死）、糖尿病、心機能障害等の予防又は治療に用いられる。
【0176】
従来、テロメア短縮又はＤＮＡ損傷により、細胞増殖が抑制され細胞老化が起こることが知られている。その一方で、早老症候群のマウスモデル（Zmpste24プロテアーゼ欠損マウス）においてｐ５３遺伝子を欠失させたところ、β－ガラクトシダーゼアッセイ等により老化形質の改善が確認され、寿命の延長も認められた旨の報告がある（Nature, 2005, 437, 564-568）。本開示の医薬組成物によれば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体を分解することにより、同様に細胞老化の予防又は改善及び寿命の延長が可能になると推測される。
【0177】
なお、細胞老化は、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患等の種々の疾患の原因ともなることが知られている（Nature, 2017, 16, 718-735）。本開示の医薬組成物によれば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体を分解することにより、細胞老化が関係する疾患又は症状の予防又は治療が可能になると推測される。
【0178】
また、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Angelman症候群等の神経疾患においては、ｐ５３タンパク質が高発現しており、神経細胞死を誘導する主要な因子となっていることが報告されている（Biochemical and Biophysical Research Communications, 1997, 17, 418-21; The FASEB Journal, 2005, 19, 255-257; The Journal of Neuroscience, 2006, 26, 6377-6385; The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277, 50980-58984; Journal of Neurochemistry, 2007, 100, 1626-1635; Nature Cell Biology, 2009, 11, 1370-1375; Neurobiology of Disease, 2000, 7, 613-622; Neuron, 1998, 21, 799-811）。また、脳卒中等の虚血性障害においては、再灌流後の酸化ストレスにより、ミトコンドリアマトリックスにｐ５３タンパク質が蓄積し、そのｐ５３タンパク質がシクロフィリンＤと複合体を形成することにより、ミトコンドリア膜透過性遷移孔が開口し、神経細胞死が誘導されることが報告されている（Cell, 2012, 149, 1536-1548）。本開示の医薬組成物によれば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体を分解することにより、神経疾患（神経細胞死）の予防又は治療が可能になると推測される。
【0179】
また、心不全の非代償期（症状が進行している時期）においては、ＤＮＡ損傷、テロメア短縮、低酸素等によりｐ５３遺伝子が活性化する。ｐ５３遺伝子が活性化すると、ＨＩＦ－１（血管新生因子の誘導に重要な転写因子）活性及び血管新生因子の発現が低下し、心機能不全が誘導される。その一方で、ｐ５３ノックアウトマウスにおいては、横大動脈狭窄（ＴＡＣ）により作製した心臓圧付加モデルにおいて、血管数が増加し、心機能が保たれたという報告がある（Nature, 2007, 446, 444-448）。本開示の医薬組成物によれば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体を分解することにより、同様に心機能障害の予防又は治療が可能になると推測される。
【0180】
また、テロメレース欠損マウスの脂肪組織においては、脂肪の老化（β－ガラクトシダーゼ陽性）、ｐ５３遺伝子の活性化、悪玉アディポカイン（ＴＮＦα等）産生の増加が起こる。悪玉アディポカインが増加するとインスリン抵抗性となり、血糖値が下がりにくくなることにより、糖尿病が発症する。その一方で、脂肪組織のｐ５３遺伝子の欠失により、悪玉アディポカインの産生が低下し、インスリン抵抗性が改善したという報告がある（Nature Medicine, 2009, 15, 996-997; Nature Medicine, 2009, 15, 1082-1088）。本開示の医薬組成物によれば、ｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体を分解することにより、同様に糖尿病の予防又は治療が可能になると推測される。
【0181】
更に、ＭＤＭ２欠損マウスは胎生致死を示すが、ｐ５３遺伝子の欠損によりレスキューできることが知られている。例えば、ｐ５３遺伝子及びＭＤＭ２遺伝子のダブルノックアウトマウスは正常に発生する（Nature, 1995, 378, 203-206; Nature, 1995, 378, 206-208）。本開示の医薬組成物を母体に与えてｐ５３タンパク質又はｐ５３複合体を分解することにより、ＭＤＭ２が欠損した胎児の胎生致死を回避できると推測される。
【0182】
これらの用途に用いるための本開示の医薬組成物としては、野生型（正常型）ｐ５３タンパク質又は野生型（正常型）ｐ５３複合体に対して親和性を有するｐ５３親和性分子とタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートであるｐ５３分解誘導分子を含む医薬組成物が好ましい。
【0183】
別の態様では、本開示の医薬組成物は、癌の予防又は治療に用いられる。
【0184】
従来、ｐ５３タンパク質が変異型である癌は、化学療法及び放射線治療に対して抵抗性を示すことが知られている。また、多くの癌でｐ５３タンパク質の変異が知られている。ｐ５３遺伝子は癌抑制遺伝子であるため、これまで、野生型ｐ５３遺伝子を活性化する薬剤の設計がなされてきた。しかし、ｐ５３遺伝子が変異すると、癌抑制遺伝子であるはずのｐ５３遺伝子が癌化に有利となる。よって、変異型ｐ５３タンパク質を分解することは、次世代の癌の治療に寄与することが期待できる。
また、癌の放射線治療時に野生型ｐ５３タンパク質の機能を回復することにより、治療効果が改善することが知られている。放射線治療と本開示の医薬組成物を用いた治療とを併用することにより、変異型ｐ５３タンパク質を有する癌における放射線治療の効果が改善することも期待できる。
また、癌の放射線治療時に野生型ｐ５３タンパク質の機能を回復することにより、治療効果が改善することが知られている。放射線治療と本開示の医薬組成物を用いた治療とを併用することにより、変異型ｐ５３タンパク質を有する癌における放射線治療の効果が改善することも期待できる。
【0185】
これらの用途に用いるための本開示の医薬組成物としては、変異型ｐ５３タンパク質又は変異型ｐ５３複合体に対して親和性を有するｐ５３親和性分子とタンパク質分解誘導タグとのコンジュゲートであるｐ５３分解誘導分子を含む医薬組成物が好ましい。なお、ｐ５３親和性分子としては、野生型ｐ５３タンパク質又は野生型ｐ５３複合体よりも変異型ｐ５３タンパク質又は変異型ｐ５３複合体に対する親和性が高いものを用いてもよい。
【0186】
医薬組成物は、ｐ５３分解誘導分子以外の成分を含んでいてもよい。例えば、医薬組成物は、製剤素材として慣用の有機又は無機の担体を含んでいてもよい。この担体は、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等として、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合される。また、医薬組成物は、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を含んでいてもよい。
【0187】
医薬組成物の剤形は特に制限されない。医薬組成物の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤等の経口剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤；などが挙げられる。
【0188】
医薬組成物の投与量は、投与対象、投与経路、対象疾患、症状等に応じて適宜決定される。
【実施例】
【0189】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の実施例及び参考例において、室温とは２０℃～３０℃の範囲を示す。
【0190】
以下の実施例及び参考例で使用される化合物等の略称は以下のとおりである。
H-Gly-OtBu・HCl：L-Glycine t-butyl ester hydrochloride
ＤＭＦ：N,N-Dimethylformamide
ＤＩＰＥＡ：N,N-Diisopropylethylamine
ＰｙＢＯＰ：1H-Benzotriazol-1-yloxy-tri(pyrrolidino)phosphonium hexafluorophosphate
ＴＦＡ：Trifluoroacetic acid
H-Leu-OtBu・HCl：L-Leucine t-butyl ester hydrochloride
Ｄ－ＭＥＭ：Dulbecco's modified eagle's medium
ＤＭＳＯ：Dimethyl sulfoxide
ＰＢＳ：Phosphate buffered saline
ＥＤＴＡ：Ethylenediamine tetraacetic acid
ＳＤＳ：Sodium dodecyl sulfate
ＰＡＧＥ：Polyacrylamide gel ectrophoresis
ＢＰＢ：Bromophenol blue
ＰＶＤＦ：Polyvinylidene difluoride
ＴＢＳ：Tris buffered saline
ＧＡＰＤＨ：Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
ＰＭＳＦ：Phenylmethylsulfonyl fluoride
ＤＴＴ：Dithiothreitol
ＤＥＰＣ：Diethylpyrocarbonate
ＳＡ－β－ｇａｌ：Senescence-associated beta-galactosidase
ＦＩＴＣ：Fluorescein isothiocyanate
ｅｃ：Escherichia coli
ＤＨＦＲ：Dihydrofolate reductase
ＴＭＰ：Trimethoprim
ＤＭＴ－ＭＭ：4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate
ＡＭＣ：7-Amino-4-methylcoumarin
ＨＡ：Hemagglutinin
ＧＦＰ：Green fluorescent protein
ＤｓＲｅｄ：Discosoma sp. red fluorescent protein
ＦＢＳ：Fetal bovine serum
H-Gly-OtBu・HCl：L-Glycine t-butyl ester hydrochloride
ＤＭＦ：N,N-Dimethylformamide
ＤＩＰＥＡ：N,N-Diisopropylethylamine
ＰｙＢＯＰ：1H-Benzotriazol-1-yloxy-tri(pyrrolidino)phosphonium hexafluorophosphate
ＴＦＡ：Trifluoroacetic acid
H-Leu-OtBu・HCl：L-Leucine t-butyl ester hydrochloride
Ｄ－ＭＥＭ：Dulbecco's modified eagle's medium
ＤＭＳＯ：Dimethyl sulfoxide
ＰＢＳ：Phosphate buffered saline
ＥＤＴＡ：Ethylenediamine tetraacetic acid
ＳＤＳ：Sodium dodecyl sulfate
ＰＡＧＥ：Polyacrylamide gel ectrophoresis
ＢＰＢ：Bromophenol blue
ＰＶＤＦ：Polyvinylidene difluoride
ＴＢＳ：Tris buffered saline
ＧＡＰＤＨ：Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
ＰＭＳＦ：Phenylmethylsulfonyl fluoride
ＤＴＴ：Dithiothreitol
ＤＥＰＣ：Diethylpyrocarbonate
ＳＡ－β－ｇａｌ：Senescence-associated beta-galactosidase
ＦＩＴＣ：Fluorescein isothiocyanate
ｅｃ：Escherichia coli
ＤＨＦＲ：Dihydrofolate reductase
ＴＭＰ：Trimethoprim
ＤＭＴ－ＭＭ：4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate
ＡＭＣ：7-Amino-4-methylcoumarin
ＨＡ：Hemagglutinin
ＧＦＰ：Green fluorescent protein
ＤｓＲｅｄ：Discosoma sp. red fluorescent protein
ＦＢＳ：Fetal bovine serum
【0191】
＜実施例１＞
実施例１では、ｐ５３親和性分子とタンパク質分解誘導タグとを連結することにより、ｐ５３分解誘導分子であるＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを合成した。
実施例１では、ｐ５３親和性分子とタンパク質分解誘導タグとを連結することにより、ｐ５３分解誘導分子であるＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを合成した。
【0192】
ｐ５３親和性分子としては、下式で表されるＴＩＢＣ－ＮＨ２を用いた。ＴＩＢＣ－ＮＨ２は、下式で表されるＴＩＢＣに、Ｈ２Ｎ－（ＣＨ２）６－ＣＯＯＨを付加させた化合物である。ＴＩＢＣは、ｐ５３／ＭＤＭ２複合体に対して親和性を有する。
【0193】
【化5】
【0194】
タンパク質分解誘導タグとしては、プロテアソーム阻害剤であるＭＬＮ９７０８及びＭＬＮ２２３８の活性部位（ボロン酸エステル部位又はボロニル基）をカルボキシ基に置き換えた化合物（ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ）を用いた。
【0195】
ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの合成方法の詳細は以下のとおりである。
【0196】
（ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの合成）
下記合成スキームに従ってＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを合成した。
下記合成スキームに従ってＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを合成した。
【0197】
【化6】
【0198】
まず、枝付きナスフラスコにH-Gly-OtBu・HCl（286.8 mg, 1.69 mmol, 1 eq）を仕込み、窒素置換した。窒素気流下で脱水ＤＭＦ１０ｍＬとＤＩＰＥＡ５ｍＬとを加え、室温にて撹拌した。２，５－ジクロロ安息香酸（309.3 mg, 1.62 mmol, 1 eq）を１ｍＬの脱水ＤＭＦ及び１ｍＬのＤＩＰＥＡに溶解した後、反応溶液に加え、室温にて２０分間撹拌した。ＰｙＢＯＰ（1.02 g, 1.96 mmol, 1.2 eq）を１ｍＬの脱水ＤＭＦに溶解した後、反応溶液に加え、室温にて３時間撹拌した。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、酢酸エチル／ヘキサン（＝４／１）で２回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／クロロホルム＝１／１～０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、化合物Ｓ１（531.0 mg, 1.75 mmol, 103%）を得た。
【0199】
次いで、ナスフラスコに化合物Ｓ１（212.4 mg, 0.70 mmol）を仕込み、ジクロロメタンを５ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＴＦＡを５ｍＬ加え、室温にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、真空乾燥し、化合物Ｓ２（190.7 mg, quant.）を得た。
【0200】
次いで、枝付きナスフラスコに化合物Ｓ２（190.7 mg, 0.77 mmol, 1 eq）及びH-Leu-OtBu・HCl（175.8 mg, 0.79 mmol, 1 eq）を仕込み、窒素置換した。窒素気流下で脱水ＤＭＦ５ｍＬとＤＩＰＥＡ５ｍＬとを加え、室温にて２０分間撹拌した。ＰｙＢＯＰ（886.7 mg, 1.70 mmol, 2.2 eq）を１．５ｍＬの脱水ＤＭＦに溶解した後、反応溶液に加え、室温にて３時間撹拌した。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、酢酸エチル／ヘキサン（＝４／１）で２回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／クロロホルム＝１／１～０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、化合物Ｓ３（244.2 mg, 0.58 mmol, 76%）を得た。
【0201】
次いで、ナスフラスコに化合物Ｓ３（240.8 mg, 0.58 mmol）を仕込み、ジクロロメタンを５ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＴＦＡを５ｍＬ加え、室温にて１時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、真空乾燥し、ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ（214.7 mg, 0.59 mmol, 100%）を得た。
【0202】
（ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの合成）
下記合成スキームに従ってＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを合成した。
下記合成スキームに従ってＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを合成した。
【0203】
【化7】
【0204】
ナスフラスコにＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ（21.7 mg, 0.06 mmol, 1 eq）及び別途合成したＴＩＢＣ－ＮＨ２（29.3 mg, 0.06 mmol, 1 eq）を仕込み、脱水ＤＭＦを５ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡを５ｍＬ加え、溶液を中性にした。室温にて２０分間撹拌した後、ＰｙＢＯＰ（46.8 mg, 0.09 mmol, 1.5 eq）を反応溶液に直接加え、室温にて１６時間撹拌した。冷却下で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、有機層を分離した後、水層を酢酸エチルで抽出した。有機層を集め、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１～４／１, gradient）を用いた分離精製処理により、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ（10.8 mg, 0.013 mmol, 22%, isolated yield）を得た。得られたＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮは、分取用薄層クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝１０／１）を用いて、更に精製処理を行った。
ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの物性データを以下に示す。
HRMS-FAB (m/z): [M+H]+ calcd for C37H42Cl2N4O5I, 819.1577; found, 819.1577.
ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの物性データを以下に示す。
HRMS-FAB (m/z): [M+H]+ calcd for C37H42Cl2N4O5I, 819.1577; found, 819.1577.
【0205】
＜実施例２＞
実施例２では、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨＣＴ１１６細胞（ヒト大腸癌細胞）における内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。
実施例２では、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨＣＴ１１６細胞（ヒト大腸癌細胞）における内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。
【0206】
（細胞播種）
ＨＣＴ１１６細胞を８×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。
ＨＣＴ１１６細胞を８×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。
【0207】
（ＨＣＴ１１６細胞へのＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣの添加）
細胞播種から１６時間後に、以下のようにして、ＨＣＴ１１６細胞にＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。
細胞播種から１６時間後に、以下のようにして、ＨＣＴ１１６細胞にＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。
【0208】
（ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを介した内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析））
ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣの添加４８時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり２７μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。融解後、遠心分離（１３８００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＴＩＢＣの添加４８時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり２７μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。融解後、遠心分離（１３８００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
【0209】
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２－メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。電気泳動は１６０Ｖで６５分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
【0210】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、２時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ｐ５３抗体（DO-1, SantaCruz, １５００倍希釈）、抗ＭＤＭ２抗体（SMP14, SantaCruz, ５００倍希釈）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（6C5, SantaCruz, ２００００倍希釈）を用いた。４℃にて一晩振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, Bethyl, ２００００倍希釈）を用いた。室温にて４５分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。
【0211】
ウェスタンブロット解析結果を図１に示す。図１に示すとおり、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した場合には、内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の量が減少した。一方、ＴＩＢＣを添加した場合には、内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の量は減少しなかった。
【0212】
＜実施例３＞
実施例３では、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）における内在の野生型ｐ５３タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。同時に、プロテアソーム阻害剤（ＭＬＮ２２３８）によるｐ５３タンパク質分解のレスキューを評価した。
実施例３では、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加したＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）における内在の野生型ｐ５３タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。同時に、プロテアソーム阻害剤（ＭＬＮ２２３８）によるｐ５３タンパク質分解のレスキューを評価した。
【0213】
（細胞播種）
ＨｅＬａ細胞を４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。
ＨｅＬａ細胞を４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。
【0214】
（ＨｅＬａ細胞へのＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの添加）
細胞播種から１６時間後に、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。また、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群のほかに、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ及びＭＬＮ２２３８の両方、又はＭＬＮ２２３８を含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群も準備した。
細胞播種から１６時間後に、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。また、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群のほかに、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ及びＭＬＮ２２３８の両方、又はＭＬＮ２２３８を含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群も準備した。
【0215】
（ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを介した内在の野生型ｐ５３タンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析））
ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＭＬＮ２２３８の添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり２７μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。融解後、遠心分離（１３８００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ又はＭＬＮ２２３８の添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり２７μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。融解後、遠心分離（１３８００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
【0216】
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２－メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。電気泳動は１６０Ｖで６５分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
【0217】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、２時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ｐ５３抗体（DO-1, SantaCruz, １０００倍希釈）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（6C5, SantaCruz, １００００倍希釈）を用いた。４℃にて一晩振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, Bethyl, １００００倍希釈）を用いた。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。
【0218】
ウェスタンブロット解析結果を図２に示す。図２に示すとおり、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した場合には、内在の野生型ｐ５３タンパク質の量が減少した。また、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ及びＭＬＮ２２３８の両方を添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）よりも野生型ｐ５３タンパク質の量が増加した。この結果は、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮによって、野生型ｐ５３タンパク質がプロテアソームによる分解へと導かれていることを裏付けるものである。
【0219】
＜実施例４＞
実施例４では、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを投与したマウス個体における内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。
実施例４では、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを投与したマウス個体における内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。
【0220】
（マウスへのＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの投与）
投与の直前に、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをＤＭＳＯに溶解した後、ＤＭＳＯの濃度が１０体積％となるようにトウモロコシ油（Code No. 25606-55, Nacalai Tesque）に溶解し、５０ｍｇ／ｋｇ体重又は１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス（７～８週齢、雄）（日本クレア(株)）に腹腔内投与した（ｎ＝３）。コントロールとしては、注射液の担体（１０体積％ ＤＭＳＯを含有するトウモロコシ油）を用いた。マウスは、餌及び水が自由摂取できる環境下で飼育した。投与４８時間後に、ソムノペンチル（共立製薬(株)）による深麻酔下でマウスを解剖した。開腹してから肝臓を摘出し、液体窒素で瞬間凍結させた。液体窒素で凍結後の組織は、－８０℃のディープフリーザーにて保管した。
投与の直前に、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮをＤＭＳＯに溶解した後、ＤＭＳＯの濃度が１０体積％となるようにトウモロコシ油（Code No. 25606-55, Nacalai Tesque）に溶解し、５０ｍｇ／ｋｇ体重又は１００ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウス（７～８週齢、雄）（日本クレア(株)）に腹腔内投与した（ｎ＝３）。コントロールとしては、注射液の担体（１０体積％ ＤＭＳＯを含有するトウモロコシ油）を用いた。マウスは、餌及び水が自由摂取できる環境下で飼育した。投与４８時間後に、ソムノペンチル（共立製薬(株)）による深麻酔下でマウスを解剖した。開腹してから肝臓を摘出し、液体窒素で瞬間凍結させた。液体窒素で凍結後の組織は、－８０℃のディープフリーザーにて保管した。
【0221】
（マウス組織のウェスタンブロット解析）
凍結した組織（０．０４ｇ）を粉砕した後、９８０μＬの１×ＴＫＭ組織溶解バッファー（50 mM トリエタノールアミン（pH 7.8）, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.25 M sucrose, 1 mM PMSF, protein inhibitors cocktail-EDTA free（Code No.03969-21, Nacalai Tesque), 1 mM DTT，Recombinant RNase inhibitor 5ul/ml (40 U/μl, Cat No. 2313A, Lot No. K8402DA, TAKARA Bio)）を加え、１５分間回転（１ｒｐｍ、２５℃）して溶解させた。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１５分間、４℃）し、上清（組織抽出物）を回収した。組織抽出物をＤＥＰＣ処理水により２０倍希釈したものを用いて、分光光度計で組織抽出物におけるタンパク質濃度を定量した。
凍結した組織（０．０４ｇ）を粉砕した後、９８０μＬの１×ＴＫＭ組織溶解バッファー（50 mM トリエタノールアミン（pH 7.8）, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0.25 M sucrose, 1 mM PMSF, protein inhibitors cocktail-EDTA free（Code No.03969-21, Nacalai Tesque), 1 mM DTT，Recombinant RNase inhibitor 5ul/ml (40 U/μl, Cat No. 2313A, Lot No. K8402DA, TAKARA Bio)）を加え、１５分間回転（１ｒｐｍ、２５℃）して溶解させた。その後、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１５分間、４℃）し、上清（組織抽出物）を回収した。組織抽出物をＤＥＰＣ処理水により２０倍希釈したものを用いて、分光光度計で組織抽出物におけるタンパク質濃度を定量した。
【0222】
回収した組織抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２－メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で５分間ヒートブロックした。調製した泳動サンプルは、ＧＡＰＤＨの検出用においては５０μｇ／ウェルずつアプライし、それ以外の検出用においては１００μｇ／ウェルずつアプライした。電気泳動は１６０Ｖで６０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
【0223】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、１．５時間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ｐ５３抗体（MAB1355, R&D Systems, Inc., ５００倍希釈）、抗ＭＤＭ２抗体（sc-965, SantaCruz, ５００倍希釈）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（sc-32233, SantaCruz, ２００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、１％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ中で二次抗体反応を行った。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で１０分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。
【0224】
ウェスタンブロット解析結果を図３に示す。図３に示すとおり、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを５０ｍｇ／ｋｇ体重又は１００ｍｇ／ｋｇ体重でマウスに投与した場合には、投与４８時間後の肝臓における内在の野生型ｐ５３タンパク質及びＭＤＭ２タンパク質の量が減少した。
【0225】
＜実施例５＞
実施例５では、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した老化関連酸性β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）誘導ＴＩＧ３細胞（ヒト胎児繊維芽細胞）における抗老化作用について、ＦＡＣＳ解析により評価した。
実施例５では、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した老化関連酸性β－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－β－ｇａｌ）誘導ＴＩＧ３細胞（ヒト胎児繊維芽細胞）における抗老化作用について、ＦＡＣＳ解析により評価した。
【0226】
（細胞播種）
正常細胞であるＴＩＧ３細胞を８×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。
正常細胞であるＴＩＧ３細胞を８×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１６時間培養した。
【0227】
（ＴＩＧ３細胞へのドキソルビシンの添加によるＳＡ－β－ｇａｌの誘導）
細胞播種から１６時間後に、ドキソルビシンを各ウェル当たり１５０ｎＭとなるように添加し、細胞老化を誘導した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ドキソルビシンの添加後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
細胞播種から１６時間後に、ドキソルビシンを各ウェル当たり１５０ｎＭとなるように添加し、細胞老化を誘導した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ドキソルビシンの添加後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
【0228】
（老化誘導したＴＩＧ３細胞へのＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの添加）
老化誘導から２４時間後に、以下のようにして、ＴＩＧ３細胞にＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４８時間培養した。コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。
老化誘導から２４時間後に、以下のようにして、ＴＩＧ３細胞にＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり５００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４８時間培養した。コントロールとしてはＤＭＳＯを用いた。
【0229】
（ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮによる老化抑制作用の評価（ＦＡＣＳ解析））
老化マーカーであるＳＡ－β－ｇａｌの定量には、市販のキット（Cellular Senescence Detection Kit-SPiDER-βGal（(株)同仁化学研究所））を用いた。
老化マーカーであるＳＡ－β－ｇａｌの定量には、市販のキット（Cellular Senescence Detection Kit-SPiDER-βGal（(株)同仁化学研究所））を用いた。
【0230】
ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの添加４８時間後、培地を除去し、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）を１ｍＬ添加して細胞を洗浄した。キットに付属のBafilomycin A1 working solutionを各ウェル当たり２００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１時間培養した。次いで、キットに付属のSPiDER-βGal working solutionを各ウェル当たり２００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で３０分間培養した。溶液の除去後、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）を１ｍＬ添加して細胞を洗浄した。培地を除去し、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり２００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ－ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり３００μＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。
【0231】
フローサイトメトリーにはBD FACSCanto II（BD Biosciences）を用い、ＦＩＴＣ標識されたＳＡ－β－ｇａｌを検出した。ＦＡＣＳ解析の直前に、細胞溶液を孔径３２μｍのメッシュに通し、ＦＡＣＳチューブへと移した。解析ソフトFlowJo（トミーデジタルバイオロジー(株)）によりＦＩＴＣ強度のヒストグラムを作成し、ヒストグラムのシフトから、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮによる老化抑制作用を評価した。
【0232】
ＦＡＣＳ解析結果を図４に示す。図４に示すとおり、ドキソルビシン（１５０ｎＭ）を添加した場合には、ドキソルビシンを添加しない場合と比較して、ＳＡ－β－ｇａｌ（老化マーカー）陽性へのシフトが観察された。一方、ドキソルビシン（１５０ｎＭ）を添加した後、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮ（５０μＭ）を添加した場合には、ＳＡ－β－ｇａｌ（老化マーカー）陽性へのシフトがほぼ観察されなかった。この結果から、ＴＩＢＣ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＭＬＮの細胞老化抑制作用（約８０％）が確認できた。
【0233】
＜参考例１＞
参考例１では、タンパク質親和性分子とタンパク質分解誘導タグとを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを合成した。
参考例１では、タンパク質親和性分子とタンパク質分解誘導タグとを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを合成した。
【0234】
タンパク質親和性分子としては、ｅｃＤＨＦＲタンパク質と結合するジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤であるＴＭＰにアミノ基を含む官能基を導入したＴＭＰ誘導体（ＴＭＰ－ＮＨ２）を用いた。
また、タンパク質分解誘導タグとしては、前述した式（Ｉ）においてＲ１及びＲ２をいずれもメトキシ基とした化合物（ＤＭＴ）を用いた。ＤＭＴは、プロテアソーム阻害剤に由来しないものの、プロテアソームに対して親和性を有する化合物である。
また、タンパク質分解誘導タグとしては、前述した式（Ｉ）においてＲ１及びＲ２をいずれもメトキシ基とした化合物（ＤＭＴ）を用いた。ＤＭＴは、プロテアソーム阻害剤に由来しないものの、プロテアソームに対して親和性を有する化合物である。
【0235】
ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの合成方法の詳細は下記合成スキームのとおりである。
【0236】
【化8】
【0237】
ナスフラスコにＴＭＰ－ＮＨ２（Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）（31.7 mg, 0.073 mmol）を仕込み、脱水ＤＭＦを０．３ｍＬ加えた。室温で１０分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡを０．１ｍＬ加え、室温で１０分間撹拌した。ＤＭＴ－ＭＭ（33.6 mg, 0.12 mmol, 1.6 eq, 和光純薬工業(株)）を反応溶液に直接加え、室温にて１８時間撹拌した。反応溶液を水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、クロロホルムで５回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９２／８）を用いた分離精製処理により、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ（25.8 mg, 0.045 mmol, 62%, isolated yield）を得た。
【0238】
＜参考例２＞
参考例２では、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴのプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性を評価した。ポジティブコントロールとしては、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ－１３２を用いた。
参考例２では、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴのプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性を評価した。ポジティブコントロールとしては、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ－１３２を用いた。
【0239】
評価には、20S Proteasome StressXpress Assay Kit Gold（Bioscience）を用い、２０Ｓプロテアソームのβ５（キモトリプシン様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ１（カスパーゼ様活性）の各βサブユニットに特異的なＡＭＣ結合プロテアソーム蛍光基質のＣ末端が切断されることにより生成するＡＭＣをMulti-Detection Microplate Reader（Synergy HT, BIO-TEK）により測定した。測定波長は、励起光（Ex.）を３６０ｎｍ、蛍光（Em.）を４６０ｎｍとした。
【0240】
β１（カスパーゼ様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ５（キモトリプシン様活性）の各プロテアソーム活性を図５Ａ～図５Ｃに示す。
図５Ａ～図５Ｃに示すとおり、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴは、ＭＧ－１３２と比較して、プロテアソーム阻害活性が著しく低いことが確認できた。また、β１、β２、及びβ５のいずれに対しても、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの濃度依存的に阻害活性が高まることから、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴがプロテアソームと穏やかな親和性を有していることが示唆された。すなわち、ＤＭＴは、プロテアソームと親和性を有するものの、分解を阻害しないと評価された。
図５Ａ～図５Ｃに示すとおり、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴは、ＭＧ－１３２と比較して、プロテアソーム阻害活性が著しく低いことが確認できた。また、β１、β２、及びβ５のいずれに対しても、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの濃度依存的に阻害活性が高まることから、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴがプロテアソームと穏やかな親和性を有していることが示唆された。すなわち、ＤＭＴは、プロテアソームと親和性を有するものの、分解を阻害しないと評価された。
【0241】
＜参考例３＞
参考例３では、ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。
参考例３では、ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。
【0242】
（プラスミドの準備）
ｅｃＤＨＦＲタンパク質を発現するプラスミド（pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を大腸菌で増幅した後、Miniprep Kit（QIAGEN）で精製した。
ｅｃＤＨＦＲタンパク質を発現するプラスミド（pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を大腸菌で増幅した後、Miniprep Kit（QIAGEN）で精製した。
【0243】
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内に標的タンパク質であるｅｃＤＨＦＲタンパク質（詳細には、ＨＡタグを介したｅｃＤＨＦＲタンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質）又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。
ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内に標的タンパク質であるｅｃＤＨＦＲタンパク質（詳細には、ＨＡタグを介したｅｃＤＨＦＲタンパク質とＧＦＰとの融合タンパク質）又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。
【0244】
ＨｅＬａ細胞へのプラスミド導入は、トランスフェクション試薬であるScreenFectA（和光純薬工業(株)）を用いて常法により行った。プラスミド導入後のＨｅＬａ細胞を６×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。
【0245】
（ＨｅＬａ細胞へのＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用い、各ウェル当たり２９７μＬ添加した。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを含有するＤＭＳＯ溶液を各ウェル当たり３μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしては、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用い、各ウェル当たり２９７μＬ添加した。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを含有するＤＭＳＯ溶液を各ウェル当たり３μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしては、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
【0246】
（ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介したｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ＦＡＣＳ解析））
ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり３００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ－ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり５００μＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。
ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり３００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ－ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり５００μＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。
【0247】
回収した細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、２ｍＬのＰＢＳ（３７℃）により懸濁した。懸濁後の細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、４℃のＦＡＣＳバッファー（１質量％ ＦＢＳ／ＰＢＳ）を５００μＬ添加し、氷上に静置した。
【0248】
フローサイトメトリーにはBD FACSCanto II（BD Biosciences）を用い、細胞中におけるＧＦＰ及びＤｓＲｅｄタンパク質の発現を定量した。ＦＡＣＳ解析の直前に、細胞溶液を孔径３２μｍのメッシュに通し、ＦＡＣＳチューブへと移した。解析ソフトFlowJo（トミーデジタルバイオロジー(株)）により細胞１個当たりのＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ比を算出し、グラフのシフトから、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴによるｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）を確認した。
【0249】
ＦＡＣＳ解析結果を図６に示す。図６に示すとおり、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した場合には、濃度依存的にグラフが左にシフトしており、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴによってｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解が誘導されていることが確認できた。一方、ＴＭＰを添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）とグラフが重なっており、ｅｃＤＨＦＲタンパク質が分解されていないことが確認できた。
【0250】
＜参考例４＞
参考例４では、ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。
参考例４では、ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介した分解（ノックダウン）について、ウェスタンブロット解析により評価した。
【0251】
（プラスミドの準備）
参考例３と同様にして、ｅｃＤＨＦＲタンパク質を発現するプラスミドを作製した。
参考例３と同様にして、ｅｃＤＨＦＲタンパク質を発現するプラスミドを作製した。
【0252】
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
参考例３と同様にして、ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内にｅｃＤＨＦＲタンパク質又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。プラスミド導入後のＨｅＬａ細胞は、４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。
参考例３と同様にして、ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内にｅｃＤＨＦＲタンパク質又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。プラスミド導入後のＨｅＬａ細胞は、４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。
【0253】
（ＨｅＬａ細胞へのＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり３００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。また、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群のほかに、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びボルテゾミブ（Bortezomib）を含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群も準備した。ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加１２時間後に、タンパク質合成阻害剤であるシクロへキシミドを５０μｇ／ｍＬの濃度となるように培地中に添加した。なお、コントロールとしては、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用いた。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを含有するＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ濃度が１体積％となるように培地と混合し、各ウェル当たり３００μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。また、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群のほかに、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びボルテゾミブ（Bortezomib）を含有するＤＭＳＯ溶液を添加する実験群も準備した。ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加１２時間後に、タンパク質合成阻害剤であるシクロへキシミドを５０μｇ／ｍＬの濃度となるように培地中に添加した。なお、コントロールとしては、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
【0254】
（ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを介したｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ウェスタンブロット解析））
ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり５５μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。凍結融解を３回繰り返した後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴの添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、細胞溶解バッファー（CelLytic M, Sigma）とプロテアーゼ阻害剤（cOmplete Mini, EDTA-free, Roche）との混合溶液を各ウェル当たり５５μＬ添加した。４℃にて１５分間静置した後、ピペットチップを用いて氷上で細胞を剥がした。細胞溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、液体窒素で瞬間凍結した後、氷上で融解させた。凍結融解を３回繰り返した後、遠心分離（１３０００ｒｐｍ×２０分間、４℃）し、上清（細胞抽出物）を回収した。
【0255】
回収した細胞抽出物について、ウェスタンブロット解析を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルは、TGX FastCast Acrylamide Kit, 12%（Bio-Rad）を用いて作製した。泳動サンプルは、６×SDS-PAGE sample buffer（62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 5% ２－メルカプトエタノール, 10% グリセロール, 0.25% BPB）により調製し、９５℃で４分間ヒートブロックした。電気泳動は１５０Ｖで５０分間行った（泳動バッファー；195 mM グリシン, 25 mM Tris）。
【0256】
電気泳動後、タンク式ブロット装置及び転写バッファー（25 mM Tris-HCl, 195 mM グリシン, 0.01% SDS, 15% メタノール）を用いて、１００Ｖ、４０分間の条件でＰＶＤＦメンブレン（Immobion-P, Millipore）にタンパク質を転写した。転写後のメンブレンは、５％スキムミルク／High-salt TBS-T（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.2% Tween-20, pH 7.6）中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tでリンスし、１％スキムミルク／High-salt TBS-T中で抗体反応を行った。抗体としては、Anti-HA-Peroxidase, High-Affinity（3F10）Rat monoclonal antibody（25 U/mL）（Roche）を１０００倍希釈して用いた。室温にて１時間振盪させた後、メンブレンをHigh-salt TBS-Tで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをHigh-salt TBS（100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。
【0257】
次に、同一のメンブレンを用いて、コントロールであるＧＡＰＤＨの検出反応を行った。メンブレンをＴＢＳ－Ｔ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20, pH 7.6）で洗浄し、５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ中、室温にて３０分間振盪することによりブロッキングした。ブロッキング後、５％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ中で一次抗体反応を行った。一次抗体としては、抗ＧＡＰＤＨ抗体（6C5, SantaCruz, ２００００倍希釈）を用いた。室温にて６０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。一次抗体反応後、２％スキムミルク／ＴＢＳ－Ｔ中で二次抗体反応を行った。二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（A90-116P-33, Bethyl）を２００００倍希釈して用いた。室温にて３０分間振盪させた後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで５分間洗浄した。なお、洗浄は３回行った。更に、メンブレンをＴＢＳ（100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.6）で５分間洗浄した。そして、メンブレンを化学発光試薬Immobilon Western（Millipore）で処理した後、化学発光をルミノイメージアナライザLAS-3000（富士フイルム(株)）を用いて検出した。検出されたバンドの定量には、画像処理ソフトウェアImageJ（NIH）を用いた。
【0258】
ウェスタンブロット解析結果を図７Ａ及び図７Ｂに示す。図７Ａ及び図７Ｂに示すとおり、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した場合には、ｅｃＤＨＦＲタンパク質の量が減少したが、ＴＭＰを添加した場合には、ｅｃＤＨＦＲタンパク質の量が減少しなかった。また、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴ及びボルテゾミブの両方を添加した場合には、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴを添加した場合と比較してｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解が阻害された。この結果は、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＤＭＴによって、ｅｃＤＨＦＲタンパク質がプロテアソームによる分解へと導かれていることを裏付けるものである。
【0259】
＜参考例５＞
参考例５では、タンパク質親和性分子とタンパク質分解誘導タグとを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを合成した。
参考例５では、タンパク質親和性分子とタンパク質分解誘導タグとを連結することにより、タンパク質分解誘導分子であるＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを合成した。
【0260】
タンパク質親和性分子としては、参考例１と同様にＴＭＰ－ＮＨ２を用いた。
また、タンパク質分解誘導タグとしては、プロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮの活性部位（ホルミル基）をカルボキシ基に置き換えた化合物（ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ）を用いた。
また、タンパク質分解誘導タグとしては、プロテアソーム阻害剤であるＡＬＬＮの活性部位（ホルミル基）をカルボキシ基に置き換えた化合物（ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ）を用いた。
【0261】
ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの合成方法の詳細は下記合成スキームのとおりである。
【0262】
【化9】
【0263】
（ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの合成）
ナスフラスコにＡＬＬＮ（87.2 mg, 0.23 mmol, 1 eq, Code No. 07036-24, ナカライテスク(株)）を仕込み、脱水ＤＭＦを２ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、Oxone（212.1 mg, 0.69 mmol, 3 eq, Code No. 228036, Sigma-Aldrich）を反応溶液に直接加え、室温にて５時間撹拌した。反応溶液を水で希釈した後、クロロホルムで３回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝２０／１～１０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ（27.0 mg, 0.068 mmol, 30%）を得た。
ナスフラスコにＡＬＬＮ（87.2 mg, 0.23 mmol, 1 eq, Code No. 07036-24, ナカライテスク(株)）を仕込み、脱水ＤＭＦを２ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、Oxone（212.1 mg, 0.69 mmol, 3 eq, Code No. 228036, Sigma-Aldrich）を反応溶液に直接加え、室温にて５時間撹拌した。反応溶液を水で希釈した後、クロロホルムで３回抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝２０／１～１０／１, gradient）を用いた分離精製処理により、ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ（27.0 mg, 0.068 mmol, 30%）を得た。
【0264】
（ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの合成）
ナスフラスコにＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ（26.8 mg, 0.067 mmol, 1 eq）及び別途合成したＴＭＰ－ＮＨ２（Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）（26.0 mg, 0.060 mmol, 0.9 eq）を仕込み、脱水ＤＭＦを２ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡを０．１ｍＬ加え、溶液を中性にした。室温にて５分間撹拌した後、ＤＭＴ－ＭＭ（30.0 mg, 0.11 mmol, 1.6 eq, Code No. 329-53751, 和光純薬工業(株)）を反応溶液に直接加え、室温にて２時間撹拌した。冷却下で１０ｍＬの１０質量％食塩水／０．１Ｎ 塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出した。０．５Ｎ 塩酸水溶液、次いで食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝１０／１）を用いた分離精製処理により、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ（8.2 mg, 0.010 mmol, 15%, isolated yield）を得た。
ナスフラスコにＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ（26.8 mg, 0.067 mmol, 1 eq）及び別途合成したＴＭＰ－ＮＨ２（Long, M.J. et al., Chem. Biol., 2012, 19(5), 629-637）（26.0 mg, 0.060 mmol, 0.9 eq）を仕込み、脱水ＤＭＦを２ｍＬ加えた。室温にて５分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡを０．１ｍＬ加え、溶液を中性にした。室温にて５分間撹拌した後、ＤＭＴ－ＭＭ（30.0 mg, 0.11 mmol, 1.6 eq, Code No. 329-53751, 和光純薬工業(株)）を反応溶液に直接加え、室温にて２時間撹拌した。冷却下で１０ｍＬの１０質量％食塩水／０．１Ｎ 塩酸水溶液を加え、酢酸エチルで３回抽出した。０．５Ｎ 塩酸水溶液、次いで食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去した後、シリカゲルクロマトグラフィー（Code No. 30511-35, ナカライテスク(株)）（クロロホルム／メタノール＝１０／１）を用いた分離精製処理により、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮ（8.2 mg, 0.010 mmol, 15%, isolated yield）を得た。
【0265】
＜参考例６＞
参考例６では、参考例２と同様にして、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮのプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性を評価した。
参考例６では、参考例２と同様にして、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮのプロテアソーム阻害活性及びプロテアソームとの親和性を評価した。
【0266】
β１（カスパーゼ様活性）、β２（トリプシン様活性）、及びβ５（キモトリプシン様活性）の各プロテアソーム活性を図８Ａ～図８Ｃに示す。
図８Ａ～図８Ｃに示すとおり、β２及びβ５の活性に対して、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮでは、ＡＬＬＮ単独と比較して阻害活性が弱まり、ＡＬＬＮの阻害活性が失活していることが確認できた。β１については、ＡＬＬＮではあまり阻害されないことが報告されており（Kaiser, M. et al., Chem. Bio. Chem., 2004, 5, 1256-1266）、この報告と矛盾しない結果であった。
また、β１、β２、及びβ５のいずれに対しても、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの濃度依存的に阻害活性が高まることから、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮとプロテアソームとの親和性が確認された。
図８Ａ～図８Ｃに示すとおり、β２及びβ５の活性に対して、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮでは、ＡＬＬＮ単独と比較して阻害活性が弱まり、ＡＬＬＮの阻害活性が失活していることが確認できた。β１については、ＡＬＬＮではあまり阻害されないことが報告されており（Kaiser, M. et al., Chem. Bio. Chem., 2004, 5, 1256-1266）、この報告と矛盾しない結果であった。
また、β１、β２、及びβ５のいずれに対しても、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの濃度依存的に阻害活性が高まることから、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮとプロテアソームとの親和性が確認された。
【0267】
＜参考例７＞
参考例７では、ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。
参考例７では、ＨｅＬａ細胞において強制発現させたｅｃＤＨＦＲタンパク質のＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを介した分解（ノックダウン）について、ＦＡＣＳ解析により評価した。
【0268】
（プラスミドの準備）
参考例３と同様にして、ｅｃＤＨＦＲタンパク質を発現するプラスミド（pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を準備した。
参考例３と同様にして、ｅｃＤＨＦＲタンパク質を発現するプラスミド（pMIR-DsRed-IRES-ecDHFR-HA-GFP）を準備した。
【0269】
（ＨｅＬａ細胞へのプラスミドの導入及び細胞播種）
参考例３と同様にして、ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内にｅｃＤＨＦＲタンパク質又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。プラスミド導入後のＨｅＬａ細胞は、４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。
参考例３と同様にして、ＨｅＬａ細胞にプラスミドを導入することにより、細胞内にｅｃＤＨＦＲタンパク質又は比較用のＤｓＲｅｄタンパク質を一過的に過剰発現させた。プラスミド導入後のＨｅＬａ細胞は、４×１０４個／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートに播種した後、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で４０時間培養した。
【0270】
（ＨｅＬａ細胞へのＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの添加）
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用い、各ウェル当たり３００μＬ添加した。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液を各ウェル当たり３μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしては、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
プラスミドを導入してから４０時間培養した後、以下のようにして、ＨｅＬａ細胞にＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを添加した。培地としては、Ｄ－ＭＥＭ（High D-Glucose, Phenol Red, Sodium Pyruvate）（和光純薬工業(株)）に１質量％ Ｌ－グルタミン溶液（Sigma-Aldrich）を添加した無血清培地（３７℃）を用い、各ウェル当たり３００μＬ添加した。なお、Ｌ－グルタミン溶液は使用直前に添加した。ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを含有するＤＭＳＯ溶液を各ウェル当たり３μＬ添加して、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしては、ＴＭＰを含有するＤＭＳＯ溶液又はＤＭＳＯを用いた。
【0271】
（ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを介したｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）の評価（ＦＡＣＳ解析））
ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり２００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ－ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり３００μＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。
ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮの添加２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳを添加して細胞を洗浄した。ＰＢＳの除去後、３７℃のトリプシン（0.25 w/v% Trypsin-1 mmol/L EDTA・4Na Solution with Phenol Red）（和光純薬工業(株)）を各ウェル当たり２００μＬ添加し、３７℃、５体積％ ＣＯ２の条件下で１分間培養した。培養後、Ｄ－ＭＥＭ（Low D-Glucose, L-Glutamine, Phenol Red）（和光純薬工業(株)）に１０質量％ ＦＢＳ及び１質量％ PenStrep（100 U/mL Sodium Penicillin G and 100 μg/mL Streptomycin Sulfate）（和光純薬工業(株)）を添加した培地を各ウェル当たり３００μＬ添加して懸濁し、１５ｍＬチューブに細胞溶液を回収した。
【0272】
回収した細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、２ｍＬのＰＢＳ（３７℃）により懸濁した。懸濁後の細胞溶液を遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分間、４℃）し、上清を除去した後、４℃のＦＡＣＳバッファー（１質量％ ＦＢＳ／ＰＢＳ）を５００μＬ添加し、氷上に静置した。
【0273】
フローサイトメトリーにはBD FACSCanto II（BD Biosciences）を用い、細胞中におけるＧＦＰ及びＤｓＲｅｄタンパク質の発現を定量した。ＦＡＣＳ解析の直前に、細胞溶液を孔径３２μｍのメッシュに通し、ＦＡＣＳチューブへと移した。解析ソフトFlowJo（トミーデジタルバイオロジー(株)）により細胞１個当たりのＧＦＰ／ＤｓＲｅｄ比を算出し、グラフのシフトから、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮによるｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解（ノックダウン）を確認した。
【0274】
ＦＡＣＳ解析結果を図９に示す。図９に示すとおり、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮを添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）と比較してグラフが大きく左にシフトしており、ＴＭＰ－ＣＡＮＤＤＹ＿ＡＬＬＮによってｅｃＤＨＦＲタンパク質の分解が誘導されていることが確認できた。一方、ＴＭＰを添加した場合には、コントロール（ＤＭＳＯ）とグラフが重なっており、ｅｃＤＨＦＲタンパク質が分解されていないことが確認できた。
【0275】
２０１６年１１月１５日に出願された日本出願２０１６－２２２６８１の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的且つ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的且つ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】