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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-05-10
(45)【発行日】2022-05-19
(54)【発明の名称】多孔膜の透過性の評価方法、細胞の評価方法及び薬剤の評価方法
(51)【国際特許分類】
G01N 15/08 20060101AFI20220511BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220511BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20220511BHJP
【ＦＩ】
G01N15/08 A
C12Q1/02
G01N15/08 C
G01N37/00 101
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021546501
(86)(22)【出願日】2020-05-12
(86)【国際出願番号】 JP2020018941
(87)【国際公開番号】W WO2021053877
(87)【国際公開日】2021-03-25
【審査請求日】2022-03-15
(31)【優先権主張番号】P 2019169806
(32)【優先日】2019-09-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】306037311
【氏名又は名称】富士フイルム株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】特許業務法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】三好 隼人
(72)【発明者】
【氏名】大場 孝浩
(72)【発明者】
【氏名】奥 圭介
【審査官】外川 敬之
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１３－１６７６４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】実開平０１－１３４２４４（ＪＰ，Ｕ）
【文献】特開昭６１－１７５５４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５１２４４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－０９０３８１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ １５／０８
Ｃ１２Ｑ １／０２
Ｇ０１Ｎ ３７／００
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の流路と第２の流路との間に挿入された多孔膜の透過性の評価方法であって、
前記第１の流路に供給圧力を変化させながら液体を供給した場合の、前記第２の流路に収容された液体に生じる変化を前記多孔膜の透過性の評価指標として取得する
評価方法。
【請求項2】
第１の流路と第２の流路とを隔てる多孔膜の透過性の評価方法であって、
前記第１の流路内の液体に圧力を供給し、前記第２の流路に収容された液体に生じる変化を前記多孔膜の透過性の評価指標として取得することを含み、
前記第１の流路に供給される液体に蛍光体を含め、
前記第２の流路を流れる液体に含まれる蛍光体から放射される光量の経時変化を前記評価指標として取得する
評価方法。
【請求項3】
第１の流路と第２の流路とを隔てる多孔膜の透過性の評価方法であって、
前記第１の流路内の液体に圧力を供給し、前記第２の流路に収容された液体に生じる変化を前記多孔膜の透過性の評価指標として取得することを含み、
前記第１の流路に供給される液体に特定成分を含め、
前記第２の流路を流れる液体に含まれる前記特定成分の濃度の経時変化を前記評価指標として取得する
評価方法。
【請求項4】
第１の流路と第２の流路とを隔てる多孔膜の透過性の評価方法を用いた細胞の評価方法であって、
前記第１の流路内の液体に圧力を供給し、前記第２の流路に収容された液体に生じる変化を前記多孔膜の透過性の評価指標として取得することを含み、
前記多孔膜の表面に評価対象の細胞を培養した状態において取得した前記評価指標を、前記評価対象の細胞が、前記第１の流路に供給される液体の前記第２の流路への漏洩を阻止する性能の指標として取得する
評価方法。
【請求項5】
第１の流路と第２の流路とを隔てる多孔膜の透過性の評価方法を用いた薬剤の評価方法であって、
前記第１の流路内の液体に圧力を供給し、前記第２の流路に収容された液体に生じる変化を前記多孔膜の透過性の評価指標として取得することを含み、
前記多孔膜の表面に細胞を培養し、前記細胞を評価対象の薬剤に晒した後に取得した前記評価指標を、前記評価対象の薬剤の前記細胞に対する毒性の指標として取得する
評価方法。
【請求項6】
第１の流路と第２の流路とを隔てる多孔膜の透過性の評価方法であって、
前記第１の流路内の液体に圧力を供給し、前記第２の流路に収容された液体に生じる変化を前記多孔膜の透過性の評価指標として取得することを含み、
前記第１の流路及び前記第２の流路を有するマイクロ流体デバイスを用いる
評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示の技術は、多孔膜の透過性の評価方法、細胞の評価方法及び薬剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【0002】
マイクロ流体デバイスを用いた細胞の観察方法として、以下の技術が知られている。例えば、特開２０１０－２０７１４３号公報には、多孔膜を介して隣接する細胞培養室及び薬液室と、細胞培養室に細胞含有液を導入後排出するための導入路及び排出路と、薬液室に薬液を導入後排出するための導入路及び排出路と、薬液室の多孔膜と対向する側に設けられた観察窓とを備える細胞観察用デバイスが記載されている。また、引用文献１には、細胞培養室に細胞含有液を導入すると共に薬液室に薬液を導入し、細胞または細胞による生成物に基づくルミネッセンス光を観察窓から観察する細胞観察方法が記載されている。
【0003】
また、特開平８－１０１２１２号公報には、多孔膜を介して接する試料通液路とキャリア通液路を有するろ過セルにおいて、被測定液中の試料の少なくとも一部が多孔膜を介してキャリア中に移動して得られたキャリアを注入器によって検出器に注入することが記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
第１の流路、第２の流路及びこれらの流路を隔てる多孔膜を有するマイクロ流体デバイスにおいて、多孔膜の透過性の評価方法として、以下の方法が考えられる。例えば、第１の流路に蛍光体を含有した液体を収容し、第２の流路に蛍光体を含まない液体を収容し、液体中を拡散し、多孔膜を透過して第２の流路に漏洩する蛍光体から放射される光の量をモニタする方法が考えられる。しかしながら、この方法によれば、蛍光体の拡散速度が遅いため、評価に多大な時間（例えば６０分程度）を要する。
【0005】
本開示の技術は、上記の点に鑑みてなされたものであり、１つの側面として、多孔膜の透過性の評価を短時間で行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示の技術に係る評価方法は、第１の流路と第２の流路とを隔てる多孔膜の透過性の評価方法であって、第１の流路内の液体に圧力を供給し、第２の流路に収容された液体に生じる変化を前記多孔膜の透過性の評価指標として取得することを含む。
【0007】
本開示の技術に係る評価方法は、第１の流路と第２の流路との間に挿入された多孔膜の透過性の評価方法であって、第１の流路に供給圧力を変化させながら液体を供給した場合の、第２の流路に収容された液体に生じる変化を多孔膜の透過性の評価指標として取得することを含む。
【0008】
本開示の技術の実施形態に係る評価方法によれば、多孔膜の透過性の評価を短時間で行うことが可能となる。
【0009】
第２の流路を通過する液体の流量の経時変化を評価指標として取得してもよい。また、第１の流路に供給される液体に蛍光体を含め、第２の流路を流れる液体に含まれる蛍光体から放射される光量の経時変化を評価指標として取得してもよい。また、第１の流路に供給される液体に特定成分を含め、第２の流路を流れる液体に含まれる特定成分の濃度の経時変化を評価指標として取得してもよい。
【0010】
本開示の技術に係る細胞の評価方法は、上記した多孔膜の透過性の評価方法を用いた細胞の評価方法であって、多孔膜の表面に評価対象の細胞を培養した状態において取得した評価指標を、評価対象の細胞が、第１の流路に供給される液体の第２の流路への漏洩を阻止する性能の指標として取得することを含む。
【0011】
本開示の技術に係る薬剤の評価方法は、上記した多孔膜の透過性の評価方法を用いた薬剤の評価方法であって、多孔膜の表面に細胞を培養し、細胞を評価対象の薬剤に晒した後に取得した評価指標を、評価対象の薬剤の細胞に対する毒性の指標として取得することを含む。
【0012】
本開示の技術に係る評価方法において、第１の流路及び第２の流路を有するマイクロ流体デバイスを用いてもよい。
【発明の効果】
【0013】
本開示の技術によれば、多孔膜の透過性の評価を短時間で行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本開示の技術の実施形態に係るマイクロ流体デバイスの構成の一例を示す斜視図である。
【図2】本開示の技術の実施形態に係るマイクロ流体デバイスの分解斜視図である。
【図4A】本開示の技術の実施形態に係る多孔膜の構成の一例を示す平面図である。
【図5】本開示の技術の実施形態に係る評価システムの構成の一例を示す図である。
【図6】本開示の技術の実施形態に係る評価システムにおける流路構成を模式的に示した図である。
【図7】本開示の技術の実施形態に係る多孔膜の透過性の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【図8】本開示の技術の実施形態に係る流量制御装置における供給圧力の時間推移の一例を示すグラフである。
【図9】本開示の技術の実施形態に係る下側マイクロ流路を流れる液体の流量の時間推移の一例を示すグラフである。
【図10】本開示の技術の実施形態に係る評価方法を用いて、孔径または開口率が異なる複数種の多孔膜の透過性を評価した結果の一例を示す図である。
【図11】本開示の技術の他の実施形態に係る評価システムの構成の一例を示す図である。
【図12】本開示の技術の他の実施形態に係る評価システムの流路構成を模式的に示した図である。
【図13】本開示の技術の他の実施形態に係る多孔膜の透過性の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【図14】供給圧力を時間に対してリニアに変化させた場合の、蛍光光量の時間推移の一例を示すグラフである。
【図15】本開示の技術の他の実施形態に係る評価システムの構成の一例を示す図である。
【図16】本開示の技術の他の実施形態に係る評価システムの流路構成を模式的に示した図である。
【図17】本開示の技術の他の実施形態に係る多孔膜の透過性の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【図18】供給圧力を時間に対してリニアに変化させた場合の、特定成分濃度の時間推移の一例を示すグラフである。
【図19】本開示の技術の他の実施形態に係る細胞の評価方法の一例を示す流路構成図である。
【図20】本開示の技術の他の実施形態に係る細胞の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【図21】本開示の技術の他の実施形態に係る薬剤の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【図22】本開示の技術の実施形態に係る評価方法を用いて、薬剤の毒性を評価した結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ説明する。尚、各図面において、実質的に同一又は等価な構成要素又は部分には同一の参照符号を付している。
【0016】
図１は、本開示の技術の実施形態に係る多孔膜の透過性の評価に用いるマイクロ流体デバイス１１０の構成の一例を示す斜視図であり、図２は、マイクロ流体デバイス１１０の分解斜視図である。図３は、図１における３－３線に沿った断面の一部を示す模式図である。マイクロ流体デバイス１１０は、厚さ方向に積層された一対のキャビティ部材としての、互いに対向する上側キャビティ部材１２と下側キャビティ部材１４とで構成されたキャビティユニット１６を有している。上側キャビティ部材１２及び下側キャビティ部材１４は、一例としてＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の可撓性を有する材料で構成されている。なお、上側キャビティ部材１２及び下側キャビティ部材１４を構成する材料としては、ＰＤＭＳの他、エポキシ系樹脂、ウレタン系樹脂、スチレン系熱可塑性エラストマー、オレフィン系熱可塑性エラストマー、アクリル系熱可塑性エラストマー、ポリビニルアルコール等を用いることが可能である。
【0017】
図２に示すように、下側キャビティ部材１４の上面、すなわち上側キャビティ部材１２との対向面１４Ａには、下側マイクロ流路２４を画成する凹部２６が形成されている。下側マイクロ流路２４は本開示の技術における第２の流路の一例である。凹部２６は、流入口２６Ａ、流出口２６Ｂ、及び流入口２６Ａと流出口２６Ｂとを連通する流路部２６Ｃを有している。
【0018】
同様に、上側キャビティ部材１２の下面、すなわち下側キャビティ部材１４との対向面１２Ａには、上側マイクロ流路１８を画成する凹部２０が形成されている。上側マイクロ流路１８は本開示の技術における第１の流路の一例である。凹部２０は、流入口２０Ａ、流出口２０Ｂ、及び流入口２０Ａと流出口２０Ｂとを連通する流路部２０Ｃを有している。また、上側キャビティ部材１２には、上側キャビティ部材１２を厚さ方向に貫通する貫通孔２２Ａ、２２Ｂが設けられている。貫通孔２２Ａ、２２Ｂは、それぞれ、下端が流入口２０Ａ及び流出口２０Ｂに連通している。
【0019】
下側キャビティ部材１４の流入口２６Ａ及び流出口２６Ｂは、上側キャビティ部材１２の流入口２０Ａ及び流出口２０Ｂと平面視で重ならない位置に設けられている。一方、下側キャビティ部材１４の流路部２６Ｃは、上側キャビティ部材１２の流路部２０Ｃと平面視で重なる位置に設けられている。
【0020】
上側キャビティ部材１２には、上側キャビティ部材１２を厚さ方向に貫通し、下端が下側キャビティ部材１４の流入口２６Ａ及び流出口２６Ｂに連通する貫通孔２８Ａ、２８Ｂがそれぞれ設けられている。キャビティユニット１６の外周面には、スペーサ４６が配置される位置に凹部２９がそれぞれ設けられている。
【0021】
上側キャビティ部材１２及び下側キャビティ部材１４の対向面１２Ａ、１４Ａ間には、多孔膜３０が配置されている。多孔膜３０の上面３０Ａ及び下面３０Ｂは、上側マイクロ流路１８及び下側マイクロ流路２４の流路部２０Ｃ、２６Ｃを覆い、上側マイクロ流路１８と下側マイクロ流路２４とを隔てている。すなわち、下側マイクロ流路２４及び上側マイクロ流路１８は、多孔膜３０を間に挟んで隣接している。具体的には、多孔膜３０の上面３０Ａが上側キャビティ部材１２の凹部２０とともに上側マイクロ流路１８を画成しており、多孔膜３０の下面３０Ｂが下側キャビティ部材１４の凹部２６とともに下側マイクロ流路２４を画成している。
【0022】
多孔膜３０は、一例として疎水性の有機溶媒に溶解可能な疎水性ポリマーを含んで構成されている。なお、疎水性の有機溶媒は、２５℃の水に対する溶解度が１０（ｇ／１００ｇ水）以下の液体である。疎水性ポリマーとしては、例えば、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート等が挙げられる。
【0023】
図４Ａは、多孔膜３０の構成の一例を示す平面図である。図４Ｂは、図４Ａにおける４Ｂ－４Ｂ線に沿った断面図である。多孔膜３０には、厚さ方向に貫通する複数の膜内空間３２が形成されており、多孔膜３０の上面３０Ａ及び下面３０Ｂの両面には膜内空間３２の開口３２Ａがそれぞれ設けられている。また、開口３２Ａは平面視で円形である。開口３２Ａどうしは互いに離間して設けられており、隣り合う開口３２Ａの間には平坦部３４が延在している。なお、開口３２Ａは円形には限られず、多角形や楕円形であってもよい。
【0024】
複数の開口３２Ａは、図４Ａに示すように、ハニカム状に配置されている。ここで、ハニカム状の配置とは、任意の開口３２Ａ（膜の辺縁にある開口３２Ａを除く）の周囲に６個の開口３２Ａが等配され、その６個の開口３２Ａの中心が正六角形の頂点に位置し、その中心に位置する開口３２Ａの中心が当該正六角形の中心に相当するような配列をいう。なお、ここでいう「等配」とは、中心角６０°で正確に配列されている必要は必ずしもなく、中心に位置する開口３２Ａに対して周囲の６個の開口３２Ａがほぼ等しい間隔で配列されていればよい。なお、「開口３２Ａの中心」とは、開口３２Ａの平面視における中心を意味する。
【0025】
図４Ｂに示すように、多孔膜３０の膜内空間３２は球体の上端及び下端を切り取った球台形状とされている。なお、ここでいう球体とは、真球であることを要さず、概ね球と認められる程度のゆがみは許容する。また、互いに隣接する膜内空間３２どうしは、多孔膜３０の内部において連通孔３６によって連通した、横連通構造となっている。なお、横連通構造とは、隣接する膜内空間３２が多孔膜３０の内部で互いに連通する空間構造をいう。ここでいう「横」とは、多孔膜３０の厚さ方向を縦とした場合、この縦の方向と直交する面方向をいう。多孔膜３０では開口３２Ａがハニカム状に配列しているため、任意の膜内空間３２は、その周囲に等配されている６個の膜内空間３２の全てと連通している。なお、膜内空間３２はバレル形状や円柱形状、又は多角柱形状等とされていてもよく、また、連通孔３６は隣接する膜内空間３２どうしを繋ぐ筒状の空隙とされていてもよい。
【0026】
開口３２Ａの平均開口径は、１μｍ以上２００μｍ以下であることが好ましい。開口３２Ａの平均開口径を１μｍ以上とすることで、膜内空間３２の横連通構造を形成することが容易である。また、開口３２Ａの平均開口径を２００μｍ以下とすることで、隣り合う開口３２Ａどうしが融合することなく、ハニカム状の配列を保つことが容易である。なお、平均開口径とは、多孔膜３０の表面における複数の開口３２Ａの直径の平均値をいう。この平均開口径は、例えば、顕微鏡下で多孔膜３０の表面を観察して、相当数の開口３２Ａの直径を測定した値の平均値とすることができる。
【0027】
多孔膜３０の空隙率は４０％以上９０％以下であることが好ましい。多孔膜３０の空隙率を４０％以上とすることで、膜内空間３２の横連通構造を形成することが容易である。多孔膜３０の空隙率を９０％以下とすることで、多孔膜３０としての形状を保つことが容易となり、強度も低下せずに破れにくくなる。なお、空隙率とは、多孔膜３０の体積に占める膜内空間３２の体積の割合をいう。この空隙率は、例えば、顕微鏡下で多孔膜３０の断面を観察して、観察された膜内空間３２を、上下二方及び側面六方が円形に削ぎ落とされた球台形状と推定して求めた複数の膜内空間３２の体積を、それらの膜内空間３２が存在する多孔膜３０の体積で除して得られたパーセンテージとして求めることができる。
【0028】
多孔膜３０の膜厚は０．５μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。ここで、この膜厚の数値は、開口３２Ａの開口径と、膜内空間３２の高さとのアスペクト比（すなわち、開口３２Ａの開口径を、膜内空間３２の高さで除した値）が２を超えることが現実的には不可能なことから導出される数値である。なお、単層の多孔膜３０を使用する場合、膜厚は０．５～１０μｍが望ましい。また、複数の多孔膜３０を積層して用いる場合、多孔膜３０の総膜厚は１０～２００μｍが望ましい。
【0029】
マイクロ流体デバイス１１０は、キャビティユニット１６を厚さ方向に圧縮した状態で保持する保持部材としての一対の保持プレート３８を有している。一対の保持プレート３８は、キャビティユニット１６の厚さ方向における両端、すなわち上側キャビティ部材１２の上側及び下側キャビティ部材１４の下側にキャビティユニット１６と別体に設けられており、上側キャビティ部材１２の上面全体及び下側キャビティ部材１４の下面全体を覆う大きさとされている。
【0030】
図２に示すように、一対の保持プレート３８の互いに対応する位置には、厚さ方向に貫通する複数（本実施形態では８つ）のボルト孔４０がそれぞれ形成されている。また、上側キャビティ部材１２の上側に設けられている保持プレート３８には、上側キャビティ部材１２の貫通孔２２Ａ、２２Ｂ、２８Ａ、２８Ｂにそれぞれ連通する貫通孔４２Ａ、４２Ｂ、４４Ａ、４４Ｂがそれぞれ形成されている。
【0031】
図１に示すように、貫通孔４２Ａ、４４Ａには流入チューブ６２Ａ、６４Ａがそれぞれ接続され、また、貫通孔４２Ｂ、４４Ｂには流出チューブ６２Ｂ、６４Ｂがそれぞれ接続されている。各種処理液及び細胞懸濁液は、流入チューブ６２Ａ、６４Ａを通して上側マイクロ流路１８及び下側マイクロ流路２４に流入する。上側マイクロ流路１８及び下側マイクロ流路２４を通過した各種溶液及び細胞懸濁液は、流出チューブ６２Ｂ、６４Ｂから流出する。
【0032】
一対の保持プレート３８間におけるキャビティユニット１６の凹部２９の外側には、保持プレート３８の間隔を規定する複数（本実施形態では８つ）のスペーサ４６がそれぞれ設けられている。スペーサ４６は、内径がボルト孔４０の内径と略同じ大きさとされた円筒形状の部材であり、ボルト孔４０に対応する位置にそれぞれ配置されている。
【0033】
一対の保持プレート３８は、ボルト孔４０及びスペーサ４６に挿通されてナット４８で固定された複数のボルト５０によって互いに接合される。このとき、上側キャビティ部材１２及び下側キャビティ部材１４は、間に多孔膜３０を挟んだ状態で一対の保持プレート３８によって圧縮されて保持される。
【0034】
図５は、本開示の技術の実施形態に係る多孔膜の透過性の評価に用いる評価システム２００の構成の一例を示す図である。評価システム２００は、マイクロ流体デバイス１１０に加え、流量制御装置１２０、貯留部１３０及び流量センサ１４０を含んで構成されている。
【0035】
貯留部１３０には、マイクロ流体デバイス１１０の上側マイクロ流路１８に供給される液体１３１を貯留する。上側マイクロ流路１８に接続された流入チューブ６２Ａの先端部は、貯留部１３０に貯留された液体１３１内に挿入されている。
【0036】
流量制御装置１２０は、マイクロ流体デバイス１１０の上側マイクロ流路１８に供給される液体１３１の流量（単位時間あたりの体積）を制御する機能を有する。流量制御装置１２０の排気口１２１には送気チューブ１２２の一端が接続され、送気チューブ１２２の他端は、貯留部１３０の気体導入口１３２に接続されている。流量制御装置１２０の排気口１２１から気体が排出されることで、貯留部１３０の内部の圧力が上昇し、貯留部１３０に貯留された液体１３１が、上側マイクロ流路１８に供給される。流量制御装置１２０は、排気口１２１から排出する気体の圧力（以下、供給圧力という）を制御することで、上側マイクロ流路１８に供給される液体１３１の流量を制御する。供給圧力は、貯留部１３０に貯留された液体１３１の液面に対する押圧である。供給圧力は、ユーザが任意に設定することが可能であり、供給圧力を連続的に変化させることも可能である。流量制御装置１２０として、例えば、ＥＬＶＥＳＹＳ社製ＥＬＶＥＦＬＯＷ（登録商標）を用いることが可能である。
【0037】
下側マイクロ流路２４に接続された流出チューブ６４Ｂは、流量センサ１４０が接続されている。流量センサ１４０は、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量を検出し、検出した流量を出力する。
【0038】
上側マイクロ流路１８に接続された流出チューブ６２Ｂ及び下側マイクロ流路２４に接続された流入チューブ６４Ａは、それぞれ、閉塞状態とされている。
【0039】
以下に、評価システム２００を用いた本開示の技術の実施形態に係る多孔膜３０の透過性の評価方法について説明する。図６は、評価システム２００における流路構成を模式的に示した図である。図７は、本開示の技術の実施形態に係る多孔膜３０の透過性の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【0040】
はじめに、上側マイクロ流路１８及び下側マイクロ流路２４にそれぞれ、液体を充填する（ステップＳ１）。その後、流量制御装置１２０を稼働させる。流量制御装置１２０の供給圧力は、これが時間とともに変化するように設定される。すなわち、上側マイクロ流路１８に供給圧力を変化させながら液体１３１を供給する（ステップＳ２）。供給圧力が時間とともに変化することで、貯留部１３０から上側マイクロ流路１８に供給される液体１３１の流量が変化する。予め液体が充填された上側マイクロ流路１８に更に液体１３１が供給されることで、上側マイクロ流路１８に収容された液体は、多孔膜３０を透過して下側マイクロ流路２４に流出する。これにより下側マイクロ流路２４において液流が発生する。下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量は、流量制御装置１２０における供給圧力に応じて変化し、且つ、多孔膜３０の透過性に応じたものとなる。次に、流量センサ１４０によって、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の経時変化を評価指標として取得する（ステップＳ３）。
【0041】
図８は、流量制御装置１２０における供給圧力の時間推移の一例を示すグラフである。図８に示すように、供給圧力は、時間に対してリニアに変化するように設定されてもよい。図９は、供給圧力を時間に対してリニアに変化させた場合の下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の時間推移の一例を示すグラフである。図９において、実線は多孔膜３０の透過性が相対的に高い場合に対応し、点線は多孔膜３０の透過性が相対的に低い場合に対応する。多孔膜３０の透過性が相対的に高い場合には、多孔膜３０の透過性が相対的に低い場合と比較して、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の変化率（傾き）は大きくなる。従って、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量をモニタすることで、多孔膜３０の透過性の評価を行うことが可能である。
【0042】
ステップＳ３において取得される、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の経時変化として、図９に示されるような、流量の時間推移を示すグラフを取得してもよい。また、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の経時変化として、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の変化率（傾き）を取得してもよい。具体的には、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の期間ΔＴにおける変化量をΔＱとしたとき、ΔＱ／Δｔを上記変化率（傾き）として取得してもよい。また、供給圧力をＰ１とした場合の下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量をＱ１としたとき、Ｑ１／Ｐ１を、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の経時変化として取得してもよい。また、互いに異なる供給圧力Ｐ１、Ｐ２、・・・、Ｐｎにおける下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量をそれぞれＱ１、Ｑ２、・・・、Ｑｎとしたとき、Ｑ１／Ｐ１、Ｑ２／Ｐ２、・・・、Ｑｎ／Ｐｎの平均値を、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の経時変化として取得してもよい。
【0043】
図１０は、本開示の技術の実施形態に係る評価方法を用いて、孔径または開口率が異なる複数種の多孔膜の透過性を評価した結果の一例を示す図である。すなわち、図１０には、供給圧力を時間に対してリニアに変化させた場合における、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の時間推移が複数種の多孔膜Ａ～Iのそれぞれについて示されている。多孔膜Ａ～Ｉの概要を下記の表１に示す。
【表1】
【0044】
図１０に示すように、多孔膜の孔径が大きい程、また、多孔膜の開口率が大きい程、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の変化率（傾き）は大きくなる結果となった。なお、多孔膜Ｆ及び多孔膜Ｇにおいて、時間変化に対する流量の変化が非線形となっているのは、流路内に意図しないリークが生じたためである。
【0045】
以上のように、本開示の技術の実施形態に係る多孔膜の透過性の評価方法は、上側マイクロ流路１８に供給圧力を変化させながら、液体を供給した場合の、下側マイクロ流路２４に収容された液体に生じる変化を多孔膜の透過性の評価指標として取得するものである。本実施形態においては、「下側マイクロ流路２４に収容された液体に生じる変化」として、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の経時変化が取得される。
【0046】
本開示の技術の実施形態に係る評価方法によれば、例えば、上側マイクロ流路１８に蛍光体を含有した液体を収容し、下側マイクロ流路２４に蛍光体を含まない液体を収容し、液体中を拡散し、多孔膜を透過して下側マイクロ流路２４に漏洩する蛍光体から放射される光の量をモニタする方法と比較して、多孔膜の透過性の評価を短時間で行うことが可能となる。
【0047】
［第２の実施形態］
図１１は、本開示の技術の第２の実施形態に係る評価システム２００Ａの構成の一例を示す図である。図１２は、評価システム２００Ａの流路構成を模式的に示した図である。評価システム２００Ａは、第１の実施形態に係る評価システム２００における流量センサ１４０に代えて光量センサ１４１を備えている。
図１１は、本開示の技術の第２の実施形態に係る評価システム２００Ａの構成の一例を示す図である。図１２は、評価システム２００Ａの流路構成を模式的に示した図である。評価システム２００Ａは、第１の実施形態に係る評価システム２００における流量センサ１４０に代えて光量センサ１４１を備えている。
【0048】
以下に、評価システム２００Ａを用いた本開示の技術の第２の実施形態に係る多孔膜３０の透過性の評価方法について説明する。図１３は、本開示の技術の第２の実施形態に係る多孔膜３０の透過性の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【0049】
はじめに、上側マイクロ流路１８に蛍光体を含む液体を充填する（ステップＳ１１）。次に、下側マイクロ流路２４に蛍光体を含まない液体を充填する（ステップＳ１２）。その後、流量制御装置１２０を稼働させる。流量制御装置１２０の供給圧力は、これが時間とともに変化するように設定される。貯留部１３０には、蛍光体を含む液体１３１が収容されている。すなわち、上側マイクロ流路１８に供給圧力を変化させながら蛍光体を含む液体１３１を供給する（ステップＳ１３）。供給圧力が変化することで、貯留部１３０から上側マイクロ流路１８に供給される液体１３１の流量が変化する。予め蛍光体を含む液体が充填された上側マイクロ流路１８に更に蛍光体を含む液体１３１が供給されることで、上側マイクロ流路１８に収容された蛍光体を含む液体は、多孔膜３０を透過して下側マイクロ流路２４に流出する。これにより下側マイクロ流路２４において蛍光体を含む液体による液流が発生する。下側マイクロ流路２４を流れる液体に対して、図示しない光源から励起光が照射される。これにより、下側マイクロ流路２４を流れる液体に含まれる蛍光体から光が放射される。下側マイクロ流路２４を流れる液体に含まれる蛍光体から放射される光の量（以下、蛍光光量という）の変化率は、流量制御装置１２０における供給圧力に応じて変化し、且つ、多孔膜３０の透過性に応じたものとなる。次に、光量センサ１４１によって、蛍光光量の経時変化を評価指標として取得する（ステップＳ１４）。
【0050】
図１４は、供給圧力を時間に対してリニアに変化させた場合の、蛍光光量の時間推移の一例を示すグラフである。図１４において、実線は多孔膜３０の透過性が相対的に高い場合に対応し、点線は多孔膜３０の透過性が相対的に低い場合に対応する。多孔膜３０の透過性が相対的に高い場合には、多孔膜３０の透過性が相対的に低い場合と比較して、蛍光光量の変化率（傾き）は大きくなる。従って、蛍光光量をモニタすることで、多孔膜３０の透過性の評価を行うことが可能である。
【0051】
ステップＳ１４において取得される蛍光光量の経時変化として、図１４に示されるような、蛍光光量の時間推移を示すグラフを取得してもよい。また、蛍光光量の経時変化として、蛍光光量の変化率（傾き）を取得してもよい。具体的には、蛍光光量の、期間ΔＴにおける変化量をΔＬとしたとき、ΔＬ／Δｔを上記変化率（傾き）として取得してもよい。また、供給圧力をＰ１とした場合の、蛍光光量をＬ１としたとき、Ｌ１／Ｐ１を蛍光光量の経時変化として取得してもよい。また、互いに異なる供給圧力Ｐ１、Ｐ２、・・・、Ｐｎにおける蛍光光量をそれぞれＬ１、Ｌ２、・・・、Ｌｎとしたとき、Ｌ１／Ｐ１、Ｌ２／Ｐ２、・・・、Ｌｎ／Ｐｎの平均値を、蛍光光量の経時変化として取得してもよい。
【0052】
以上のように、本実施形態においては、「下側マイクロ流路２４に収容された液体に生じる変化」として、下側マイクロ流路２４に含まれる蛍光体から放射される光の量の経時変化が取得される。本実施形態に係る評価方法によれば、第１の実施形態に係る評価方法と同様、多孔膜の透過性の評価を短時間で行うことが可能となる。
【0053】
［第３の実施形態］
図１５は、本開示の技術の第３の実施形態に係る評価システム２００Ｂの構成の一例を示す図である。図１６は、評価システム２００Ｂの流路構成を模式的に示した図である。評価システム２００Ｂは、第１の実施形態に係る評価システム２００における流量センサ１４０に代えて濃度センサ１４２を備えている。
図１５は、本開示の技術の第３の実施形態に係る評価システム２００Ｂの構成の一例を示す図である。図１６は、評価システム２００Ｂの流路構成を模式的に示した図である。評価システム２００Ｂは、第１の実施形態に係る評価システム２００における流量センサ１４０に代えて濃度センサ１４２を備えている。
【0054】
以下に、評価システム２００Ｂを用いた本開示の技術の第３の実施形態に係る多孔膜３０の透過性の評価方法について説明する。図１７は、本開示の技術の第３の実施形態に係る多孔膜３０の透過性の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【0055】
はじめに、上側マイクロ流路１８に特定成分を含む液体を充填する（ステップＳ２１）。次に、下側マイクロ流路２４に特定成分を含まない液体を充填する（ステップＳ２２）。その後、流量制御装置１２０を稼働させる。流量制御装置１２０の供給圧力は、これが時間とともに変化するように設定される。貯留部１３０には、特定成分を含む液体１３１が収容されている。すなわち、上側マイクロ流路１８に供給圧力を変化させながら特定成分を含む液体１３１を供給する（ステップＳ２３）。供給圧力が変化することで、貯留部１３０から上側マイクロ流路１８に供給される液体１３１の流量が変化する。予め特定成分を含む液体が充填された上側マイクロ流路１８に更に特定成分を含む液体１３１が供給されることで、上側マイクロ流路１８に収容された特定成分を含む液体は、多孔膜３０を透過して下側マイクロ流路２４に流出する。これにより下側マイクロ流路２４において特定成分を含む液体による液流が発生する。下側マイクロ流路２４を流れる液体における特定成分の濃度（以下、特定成分濃度という）の変化率は、流量制御装置１２０における供給圧力に応じて変化し、且つ、多孔膜３０の透過性に応じたものとなる。次に、濃度センサ１４２によって、特定成分濃度の経時変化を評価指標として取得する（ステップＳ２４）。なお、特定成分としては、定量可能な物質なら何でも良く、例えば、色素、導電性物質、酵素、ナノ粒子、放射性同位体を含む物質、核酸、糖鎖などが挙げられる。液体クロマトグラフィ等の手法を用いることで、殆どの物質は定量可能である。
【0056】
図１８は、供給圧力を時間に対してリニアに変化させた場合の、特定成分濃度の時間推移の一例を示すグラフである。図１８において、実線は多孔膜３０の透過性が相対的に高い場合に対応し、点線は多孔膜３０の透過性が相対的に低い場合に対応する。多孔膜３０の透過性が相対的に高い場合には、多孔膜３０の透過性が相対的に低い場合と比較して、特定成分濃度の変化率（傾き）は大きくなる。従って、特定成分濃度をモニタすることで、多孔膜３０の透過性の評価を行うことが可能である。
【0057】
ステップＳ２４において取得される特定成分濃度の経時変化として、図１８に示されるような、特定成分濃度の時間推移を示すグラフを取得してもよい。また、特定成分濃度の経時変化として、特定成分濃度の変化率（傾き）を取得してもよい。具体的には、特定成分濃度の、期間ΔＴにおける変化量をΔＣとした場合、ΔＣ／Δｔを上記変化率（傾き）として取得してもよい。また、供給圧力をＰ１とした場合の、特定成分濃度をＣ１としたとき、Ｃ１／Ｐ１を特定成分濃度の経時変化として取得してもよい。また、互いに異なる供給圧力Ｐ１、Ｐ２、・・・、Ｐｎにおける特定成分濃度をそれぞれＣ１、Ｃ２、・・・、Ｃｎとしたとき、Ｃ１／Ｐ１、Ｃ２／Ｐ２、・・・、Ｃｎ／Ｐｎの平均値を特定成分濃度の経時変化として取得してもよい。
【0058】
本実施形態に係る評価方法によれば、第１の実施形態に係る評価方法と同様、多孔膜の透過性の評価を短時間で行うことが可能となる。
【0059】
【0060】
本実施形態に係る細胞の評価方法は、マイクロ流体デバイス１１０の多孔膜３０の表面に、評価対象の細胞を培養することを含む（ステップＳ３１）。例えば、多孔膜３０の上側マイクロ流路１８側の表面に内皮細胞３０１を培養し、多孔膜３０の下側マイクロ流路２４側の表面に平滑筋細胞３０２を培養してもよい。これにより、マイクロ流体デバイス１１０内において、血管（動脈）を模擬した構造体を形成することができる。内皮細胞３０１及び平滑筋細胞３０２は、上側マイクロ流路１８及び下側マイクロ流路２４に収容された培養液に浸漬された状態で培養される。なお、多孔膜３０の一方の表面にのみ評価対象の細胞を培養してもよい。
【0061】
本実施形態に係る細胞の評価方法は、上記した第１乃至第３の実施形態のいずれかに係る多孔膜３０の透過性の評価指標を、多孔膜３０の表面に培養された評価対象の細胞のバリア性の指標として取得することを含む。すなわち、上側マイクロ流路１８に供給圧力を変化させながら液体を供給した場合の、下側マイクロ流路２４に収容された液体に生じる変化を、評価対象の細胞のバリア性の指標として取得する（ステップＳ３２）。ここで、細胞のバリア性とは、多孔膜３０の表面に培養された評価対象の細胞が上側マイクロ流路１８に供給される液体の下側マイクロ流路２４への漏洩を阻止する性能を意味する。
【0062】
多孔膜３０の表面に培養された細胞が健全である場合、当該細胞のバリア性によって、上側マイクロ流路１８から下側マイクロ流路２４への液体の流出が抑制される。一方、多孔膜３０の表面に培養された細胞に異常が生じ、当該細胞のバリア性が低下すると、上側マイクロ流路１８から下側マイクロ流路２４への液体の流出量が増加する。従って、上記した第１乃至第３の実施形態に係る多孔膜３０の透過性の評価指標を、多孔膜３０の表面に培養された評価対象の細胞のバリア性の指標として用いることが可能である。
【0063】
例えば、第１の実施形態に係る多孔膜３０の透過性の評価指標を、評価対象の細胞のバリア性の指標として用いる場合、上側マイクロ流路１８に供給圧力を変化させながら液体を供給した場合の、下側マイクロ流路を流れる液体の流量の経時変化が、評価対象の細胞のバリア性の指標として用いられる。
【0064】
本実施形態に係る細胞の評価方法によれば、例えば、上側マイクロ流路１８に蛍光体を含有した液体を収容し、下側マイクロ流路２４に蛍光体を含まない液体を収容し、液体中を拡散し、多孔膜を透過して下側マイクロ流路２４に漏洩する蛍光体から放射される光の量をモニタする方法と比較して、細胞のバリア性の評価を短時間で行うことが可能となる。
【0065】
［第５の実施形態］
図２１は、本開示の技術の第５の実施形態に係る薬剤の評価方法の一例を示すフローチャートである。
図２１は、本開示の技術の第５の実施形態に係る薬剤の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【0066】
本実施形態に係る薬剤の評価方法は、マイクロ流体デバイス１１０の多孔膜３０の表面に、細胞を培養することを含む（ステップＳ４１）。例えば、図１９に示すように、多孔膜３０の上側マイクロ流路１８側の表面に内皮細胞３０１を培養し、多孔膜３０の下側マイクロ流路２４側の表面に平滑筋細胞３０２を培養してもよい。これにより、マイクロ流体デバイス１１０内において、血管（動脈）を模擬した構造体を形成することができる。なお、多孔膜３０の一方の表面にのみ評価対象の細胞を培養してもよい。
【0067】
本実施形態に係る薬剤の評価方法は、多孔膜３０の表面に培養された細胞を評価対象の薬剤に晒すことを含む（ステップＳ４２）。すなわち、上側マイクロ流路１８及び下側マイクロ流路２４の各々に、評価対象の薬剤を含む液体が供給される。
【0068】
本実施形態に係る薬剤の評価方法は、上記した第１乃至第３の実施形態のいずれかに係る多孔膜３０の透過性の評価指標を、評価対象の薬剤の細胞に対する毒性の指標として取得することを含む。すなわち、上側マイクロ流路１８に供給圧力を変化させながら液体を供給した場合の、下側マイクロ流路２４に収容された液体に生じる変化を、評価対象の薬剤の細胞に対する毒性の指標として取得する（ステップＳ４３）。
【0069】
多孔膜３０の表面に培養された細胞が健全である場合、これらの細胞のバリア性によって、上側マイクロ流路１８から下側マイクロ流路２４への液体の流出が抑制される。評価対象の薬剤が多孔膜３０の表面に培養された細胞に対する毒性を有する場合、当該細胞に異常が生じ、当該細胞のバリア性が低下すると、上側マイクロ流路１８から下側マイクロ流路２４への液体の流出量が増加する。従って、上記した第１乃至第３の実施形態に係る多孔膜３０の透過性の評価指標を、評価対象の薬剤の細胞に対する毒性の指標として用いることが可能である。
【0070】
例えば、第１の実施形態に係る多孔膜３０の透過性の評価指標を、評価対象の薬剤の細胞に対する毒性の指標として取得する場合、上側マイクロ流路１８に供給圧力を変化させながら液体を供給した場合の、下側マイクロ流路を流れる液体の流量の経時変化が、評価対象の薬剤の細胞に対する毒性の指標として取得される。
【0071】
図２２は、本実施形態に係る評価方法を用いて、薬剤の毒性を評価した結果の一例を示す図である。すなわち、図２２には、供給圧力を時間に対してリニアに変化させた場合における、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の時間推移が、評価対象の液体Ａ～Ｅのそれぞれについて示されている。液体Ａ～Ｅの概要を下記の表２に示す。液体Ａ及び液体Ｂは、基本培地に、溶剤としてのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を加えたものに、評価対象の薬剤である濃度５０μｇ／ｍｌのcytochalasinを含有させたものである。液体Ｃ及び液体Ｄは、基本培地に、溶剤としてのＤＭＳＯを加えたものであり、評価対象の薬剤を含まない。液体Ｅは、基本培地を含み、ＤＭＳＯ及び評価対象の薬剤を含まない。なお、多孔膜３０の上側マイクロ流路１８側の表面に内皮細胞３０１を培養し、多孔膜３０の下側マイクロ流路２４側の表面に平滑筋細胞３０２を培養した。多孔膜３０として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ０．４μｍ（孔径０．４μｍ）を使用した。
【表2】
【0072】
薬剤としてcytochalasinを含む液体Ａ及び液体Ｂに細胞を晒した場合の、下側マイクロ流路２４を流れる液体の流量の変化率（傾き）は、Vehicle（液体Ｃ、液体Ｄ）及びControl（液体Ｅ）よりも顕著に大きくなった。このことは、液体Ａ及び液体Ｂに含まれるcytochalasinが、内皮細胞３０１及び平滑筋細胞３０２に対して毒性を有することを示している。
【0073】
本実施形態に係る薬剤の評価方法によれば、例えば、上側マイクロ流路１８に蛍光体を含有した液体を収容し、下側マイクロ流路２４に蛍光体を含まない液体を収容し、液体中を拡散し、多孔膜を透過して下側マイクロ流路２４に漏洩する蛍光体から放射される光の量をモニタする方法と比較して、薬剤の細胞に対する毒性の評価を短時間で行うことが可能となる。
【0074】
なお、２０１９年９月１８日に出願された日本国特許出願２０１９－１６９８０６の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。また、本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
