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特許7085950早産リスクを判定するための方法、早産リスク判定装置
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-06-09
(45)【発行日】2022-06-17
(54)【発明の名称】早産リスクを判定するための方法、早産リスク判定装置
(51)【国際特許分類】
   G01N 33/68 20060101AFI20220610BHJP
   G01N 33/53 20060101ALI20220610BHJP
   C12M 1/34 20060101ALI20220610BHJP
【FI】
G01N33/68
G01N33/53 D
C12M1/34 F
【請求項の数】 9
(21)【出願番号】P 2018163219
(22)【出願日】2018-08-31
(65)【公開番号】P2020034502
(43)【公開日】2020-03-05
【審査請求日】2021-04-14
(73)【特許権者】
【識別番号】000141897
【氏名又は名称】アークレイ株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100079049
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100084995
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 和詳
(74)【代理人】
【識別番号】100099025
【弁理士】
【氏名又は名称】福田 浩志
(72)【発明者】
【氏名】三上 寿幸
(72)【発明者】
【氏名】高嶋 良樹
(72)【発明者】
【氏名】宮内 睦美
(72)【発明者】
【氏名】高田 隆
(72)【発明者】
【氏名】工藤 美樹
【審査官】三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第2016/024627(WO,A1)
【文献】特表2015-505368(JP,A)
【文献】米国特許出願公開第2015/0377889(US,A1)
【文献】米国特許出願公開第2015/0253314(US,A1)
【文献】米国特許出願公開第2014/0370521(US,A1)
【文献】米国特許出願公開第2010/0055723(US,A1)
【文献】免疫調節物質である Galectin-3 が早産の発症に中心的役割を果たすことを解明,広島大学,2018年02月14日,https://www.hiroshima-u.ac.jp/system/files/93519/%E5%85%8D%E7%96%AB%E8%AA%BF%E7%AF%80%E7%89%A9%E8%B3%AA%E3%81%A7%E3%81%82%E3%82%8BGalectin-3%E3%81%8C%E6%97%A9%E7%94%A3%E3%81%AE%E7%99%BA%E7%97%87%E3%81%AB%E4%B8%AD%E5%BF%83%E7%9A%84%E5%BD%B9%E5%89%B2%E3%82%92%E6%9E%9C%E3%81%9F%E3%81%99%E3%81%93%E3%81%A8%E3%82%92%E8%A7%A3%E6%98%8E.pdf
【文献】Mutsumi Miyauchi,Galectin-3 Plays an Important Role in Preterm Birth Caused by Dental Infection of Porphyromonas gingivalis,SCIENTIFIC REPORTS,2018年02月12日,Vol.8,Page.2867
【文献】Leonardo Pereira,Prediction of preterm birth in twin gestations through analysis of maternal plasma at 24-30 weeks gestation,American Journal of Obstetrics & Gynecology,2012年01月,Vol.206 No.1 Suppl,Page.S227
【文献】M. Demmert,Galectin-3 in cord blood of term and preterm infants,Clinical and Experimental Immunology,2012年,Vol.167 No.2,Page.246-251
【文献】Min Ao,Dental Infection of Porphyromonas gingivalis Induces Preterm Birth in Mice,PLoS ONE,2015年08月31日,Vol.10 No.8,Page.e0137249
【文献】Basak Kaya,Maternal serum galectin-1 and galectin-3 levels in pregnancies complicated with preterm prelabor rupture of membranes,THE JOURNAL OF MATERNAL-FETAL & NEONATAL MEDICINE,2019年07月07日,Vol.33 No.5,Page.861-868
【文献】宮内睦美,慢性歯性感染症と早産・低体重児出産,Animus,2018年07月01日,Vol.23 No.3 ,Page.45-50
【文献】占部智,Galectin-3を標的した早産の予測・診断マーカーの開発研究,日本周産期・新生児医学会雑誌,2018年,Vol.54 No.2,Page.686-686
【文献】Urabe S,Development of a prognostic/diagnostic examination system of preterm delivery, targeting serum galectin-3,日産婦誌,2018年05月10日,Vol.70 No.2,Page.542(S-408)
【文献】【研究成果】免疫調節物質であるGalectin-3が早産の発症に中心的役割を果たすことを解明,広島大学,2018年02月14日,https://www.hiroshima-u.ac.jp/news/44011
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
G01N 33/68
G01N 33/53
C12M 1/34
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
CAplus/MEDLINE/BIOSIS(STN)
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト妊婦の早産リスクの判定を行うために、在胎22週0日から33週6日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿又は血清である検体のガレクチン-3濃度を測定することを含む方法であって
前記検体のガレクチン-3濃度が、7ng/ml以上かつ13ng/ml未満の注意範囲に該当することをもって早産要注意と判定するための方法。
【請求項2】
前記検体は、早産及び/又は低体重児出産のリスク因子を有すると判定されたヒト妊婦から採されたものである、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記リスク因子が、多胎妊娠、早産若しくは流産の経験、出生前管理の欠如、低栄養、ストレス、低年齢若しくは高年齢妊娠、喫煙、糖尿病、高血圧、感染症又は子宮若しくは子宮頸の障害である、請求項記載の方法。
【請求項4】
前記リスク因子が、歯周病菌に起因する歯周病の罹患である、請求項記載の方法。
【請求項5】
前記歯周病菌がポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、タネレラ・フォーサイシア(Tannerella forsythia)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)又はアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)である、請求項記載の方法。
【請求項6】
生体特異的親和性に基づく測定法を使用して、前記ガレクチン-3濃度を測定する、請求項1から請求項までのいずれか1項に記載の方法。
【請求項7】
前記測定法は、抗ガレクチン-3抗体を使用して前記ガレクチン-3濃度を測定する、請求項記載の方法。
【請求項8】
血液、血漿又は血清である検体を導入する導入部と、
前記検体のガレクチン-3濃度を測定する測定部と、
前記ガレクチン-3濃度が、下限値7ng/ml以上かつ上限値13ng/ml未満の注意範囲に該当するか否かに基づき早産リスクを判定する判定部と、
を備える、早産リスク判定装置。
【請求項9】
前記測定部は、前記ガレクチン-3濃度を生体特異的親和性に基づく測定法によって測定する、請求項記載の早産リスク判定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、早産及び/又は低体重児出産のリスクを判定するための方法並びにその装置に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、早産及び低体重児出産のリスクを判定する方法が種々検討されてきた。たとえば、従来知られている早産マーカーの中には顆粒球エラスターゼ及び癌胎児性フィブロネクチンがある。
【0003】
顆粒球エラスターゼは、頸管炎の診断に有効であり、早産及びpPROM(preterm premature rupture of membranes、妊娠37週未満の前期破水)の予知及び早期治療によりこれらの予防が可能であるという意義がある一方、測定が容易ではなく、国際的なカットオフ値がないという問題点があった(非特許文献1)。さらに、偽陽性率が高いという問題点も指摘されている(非特許文献2)。
【0004】
一方、癌胎児性フィブロネクチンは、陰性例においては早産率及び検査1週間以内の分娩率が極めて低いという意義がある一方、陽性例に治療を行っても早産を予防できないという問題点があった(非特許文献1)。さらには、臨床症状のない時点で将来の流早産を予知するマーカーとしては不適であるとの指摘もされている(非特許文献2)。
【0005】
なお、非特許文献3では、在胎期間とヒト新生児の臍帯血中のガレクチン-3レベルとに正の相関があり、早産児の臍帯血では正期産児と比較してガレクチン-3レベルが高いことが報告されている。
【0006】
また、特許文献1には、在胎36週6日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿又は血清中のガレクチン-3濃度が13ng/ml以上であれば、早産及び/又は低体重児出産のリスクがあることを判定する発明が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】WO 2016/024627 A1
【非特許文献】
【0008】
【文献】酒井正利、米田哲、斎藤滋、「早産の予知法」、2005年7月、産婦人科治療、第91巻、第1号、p.44-49
【文献】小林正幸、手山知行、平川修、伊東武久、「流早産予知における癌胎児性フィブロネクチンと顆粒球エラスターゼ測定の有用性について」、1998年9月、産婦人科治療、第77巻、第3号、p.348-353
【文献】M.Demmert et al., "Galectin-3 in cord blood of term and preterm infants", Clin. Exp. Immunol., 2012, Vol.167, No.2, p.246-251
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
特許文献1記載の発明では、在胎36週6日までのヒト妊婦から検体を採取している。しかし、正期産となる37週に近い時期に採取された検体から高濃度のガレクチン-3が検出されたとしても、34週以降の胎児は早産であっても形態や機能の異常なく生育できるので、臨床的には早産治療は行われない。また、結果として正期産となるケースが数多く存在する。
【0010】
その一方で、ガレクチン-3濃度が13ng/ml未満であっても、測定時期や早産の原因によっては早産となるケースもあるため、正期産と判定される早産リスク妊婦も多く存在する。
【0011】
以上に鑑み、本発明の実施態様は、特許文献1で開示されているよりも早い時期に、かつ、さらに低いガレクチン-3濃度で早産リスクの判定を可能とすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本開示の第1の態様の早産リスク判定方法では、血液、血漿又は血清中のガレクチン-3濃度の下限値を7ng/mlとし、上限値を13ng/mlとしたときに、在胎22週0日から33週6日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿又は血清である検体のガレクチン-3濃度を測定し、該ガレクチン-3濃度が、前記下限値以上かつ前記上限値未満の注意範囲に該当することをもって早産要注意と判定する。
【0013】
本開示の第2の態様では、第1の態様において、前記下限値を8ng/mlとする。
【0014】
本開示の第3の態様では、第1の態様において、前記下限値を10ng/mlとする。
【0015】
本開示の第4の態様では、第1から第3までのいずれかの態様において、早産及び/又は低体重児出産のリスク因子を有すると判定されたヒト妊婦から、前記検体を採取する。
【0016】
本開示の第5の態様では、第4の態様において、前記リスク因子が、多胎妊娠、早産若しくは流産の経験、出生前管理の欠如、低栄養、ストレス、低年齢若しくは高年齢妊娠、喫煙、糖尿病、高血圧、感染症又は子宮若しくは子宮頸の障害である。
【0017】
本開示の第6の態様では、第4の態様において、前記リスク因子が、歯周病菌に起因する歯周病の罹患である。
【0018】
本開示の第7の態様では、第6の態様において、前記歯周病菌がポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、タネレラ・フォーサイシア(Tannerella forsythia)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)又はアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)である。
【0019】
本開示の第8の態様では、第1から第6までのいずれかの態様において、生体特異的親和性に基づく測定法を使用して、前記ガレクチン-3濃度を測定する。
【0020】
本開示の第9の態様では、第8の態様において、前記測定法は、抗ガレクチン-3抗体を使用して前記ガレクチン-3濃度を測定する。
【0021】
本開示の第10の態様の早産リスク判定装置では、血液、血漿又は血清である検体を導入する導入部と、前記検体のガレクチン-3濃度を測定する測定部と、前記ガレクチン-3濃度が、下限値7ng/ml以上かつ上限値13ng/ml未満の注意範囲に該当するか否かに基づき早産リスクを判定する判定部と、を備える。
【0022】
本開示の第11の態様では、第10の態様において、前記測定部は、前記ガレクチン-3濃度を生体特異的親和性に基づく測定法によって測定する。
【発明の効果】
【0023】
本発明の実施態様では、早産及び/又は低体重児出産のリスクを、精度よく判定することができる。特に、本方法を使用することにより、早産リスクのある妊婦を早期に発見することができる他、早産の可能性のある妊婦を高い的中率で見出すことが可能となる。
【0024】
この判定結果は、早産及び/又は低体重児出産に対する予防処置を必要とする妊婦の選別に使用でき、効果的かつ効率的な周産期医療が促進され得る。
【図面の簡単な説明】
【0025】
図1】本発明のある実施態様に係る早産リスク判定装置の外観を斜視図で示す。
図2】測定器の機能ブロック図である。
図3】制御部のハードウェア構成をブロック図で示す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
特に具体的な定めのない限り、本開示で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本開示で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本開示において、一般的な理解に優先する。
【0027】
本開示に関して、「早産」は、正期産より短い在胎期間での出産を意味し、ヒトの場合、在胎22週0日から在胎36週6日まででの出産を意味する。ヒトの正期産は、在胎37週0日から在胎41週6日まででの出産を意味する。ヒトの在胎週数は、性周期が一定していて28日前後である場合、妊娠前の最後の月経開始日を0週0日として起算する。性周期が不定である場合、妊娠初期の胎児の大きさから在胎週数を推定する。性周期が安定していた場合でも、胎児の大きさに基づいて在胎週数を補正してもよい。高い確度で排卵時期の特定が可能な場合は、推定排卵日を2週0日とみなして起算してもよい。
【0028】
本発明に関して、「低体重児出産」は、その種について標準的な出産時の体重より低い体重での出産を意味し、ヒトの場合、2500gよりも低い体重での出産を意味する。
【0029】
本開示のある実施態様の早産リスク判定方法においては、血液、血漿又は血清中のガレクチン-3濃度の下限値を7ng/mlとし、上限値を13ng/mlとしたときに、在胎22週0日から33週6日までのヒト妊婦から採取された血液、血漿又は血清である検体のガレクチン-3濃度を測定し、該ガレクチン-3濃度が、前記下限値以上かつ前記上限値未満の注意範囲に該当することをもって早産要注意と判定する。
【0030】
ここで、検体を採取する対象となるヒト妊婦の在胎週数を22週0日から33週6日までとしたことについては、この在胎週数の間に早産要注意と判定されれば、正期産となる在胎37週0日までの間に早産治療を開始することができる、という意義を有する。ちなみに、この在胎週数の下限である22週0日は、「流産」とされる在胎週数の21週6日を経過して早産の在胎週数に入ったヒト妊婦が対象となる、という意義を有する。
【0031】
なお、本態様でいう「早産要注意」とは、当該ヒト妊婦が、早産及び/又は低体重児出産のリスクを有する、ということを意味する。以下、本開示では早産及び/又は低体重児出産のリスクを「早産リスク」と称する。
【0032】
ここで、この早産要注意となるガレクチン-3濃度の注意範囲における下限値を7ng/mlとしたのは、早産例の見落としを避けるためのカットオフ値としての意義を有する。
【0033】
なお、この下限値を、8ng/mlとしてもよく、あるいは、10ng/mlとしてもよい。下限値としてどの値を採用するかについては、検査対象のヒト妊婦の状態を勘案して決定することとしてもよい。たとえば、後述するようなリスク因子を有するヒト妊婦の場合にはより低い値を下限値として採用することで、早産リスクの見落としをできるだけ避けるようにすることができる。一方、そのようなリスク因子がないヒト妊婦の場合にはより高い値を下限値として採用することで、偽陽性の可能性を低減させることができる。
【0034】
また、この早産要注意となるガレクチン-3濃度の注意範囲における上限値を13ng/mlとしたのは、従来の早産リスク判定方法で見落とされていた早産リスクを掬い上げるための意義を有する。ただし、この上限値以上となる場合には当然早産リスクはより高いため、実際の早産リスク判定においてはガレクチン-3濃度がこの上限値以上となるケースを含めても差し支えない。あるいは、ガレクチン-3濃度がこの上限値以上となるケースについては、「早産要注意」よりも高いレベルの早産リスクカテゴリー(たとえば「早産要警戒」)に属するものとして判定することとしてもよい。このとき、ガレクチン-3濃度が上限値以上となる範囲をたとえば「警戒範囲」と称することとしてもよい。
【0035】
ここで、本態様においては、早産及び/又は低体重児出産のリスク因子を有すると判定されたヒト妊婦から、前記検体を採取することが望ましい。
【0036】
上記のようなリスク因子は、たとえば、多胎妊娠、早産若しくは流産の経験、出生前管理の欠如、低栄養、ストレス、低年齢若しくは高年齢妊娠、喫煙、糖尿病、高血圧、感染症又は子宮若しくは子宮頸の障害である。
【0037】
あるいは、上記のようなリスク因子は、歯周病菌に起因する歯周病の罹患である。このような歯周病菌としては、たとえば、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、タネレラ・フォーサイシア(Tannerella forsythia)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、プレボテラ・インターメディア(Prevotella intermedia)又はアグレガチバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)が挙げられる。
【0038】
本態様においては、当分野で知られているいかなる方法を用いてガレクチン-3濃度を測定してもよい。たとえば、生体特異的親和性に基づく測定法(親和性リガンドを用いた測定法ともいう)によってガレクチン-3濃度を測定し得る。生体特異的親和性に基づく検査の方法は当業者に周知であり、特に限定されないが、イムノアッセイなどの免疫測定法、アプタマー等を用いたガレクチン-3の特異反応物質を利用した方法、液体クロマトグラフィー法、キャピラリー電気泳動法などが挙げられる。イムノアッセイなどの免疫測定法には、たとえば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay。サンドイッチイムノ法、競合法、直接吸着法などを含む)、イムノクロマト法、免疫沈降法、沈降反応、免疫拡散法、免疫凝集測定、補体結合反応分析、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系が含まれる。
【0039】
たとえば、上記したイムノアッセイによってガレクチン-3濃度を測定する場合、抗ガレクチン-3抗体を使用することができる。ガレクチン-3と抗ガレクチン-3抗体とが免疫複合体を形成し得る条件のもと、妊婦から採取された検体を抗ガレクチン-3抗体に接触させることにより、当該検体中のガレクチン-3濃度を測定する。当業者は、抗ガレクチン-3抗体を適宜作成ないし選択し得る。
【0040】
上記の抗ガレクチン-3抗体は、ガレクチン-3に結合する抗体であってもよいし、その断片であってもよいし、あるいはその誘導体、すなわち、免疫グロブリン骨格をベースとする親和性リガンドであってもよい。抗体は、任意の起源のモノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。そのような抗体の起源としては、ネズミ、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒト又は他の動物由来であってもよいし、複数の動物種に由来する配列を含むキメラ抗体であってもよい。このようなキメラ抗体としては、たとえば、部分的にヒト化された抗体、たとえば、部分的にヒト化されたマウス抗体が挙げられる。ポリクローナル抗体は、動物を抗原で免疫化することにより産生し得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して産生できる。抗体の断片及び誘導体は、ガレクチン-3と選択的に相互作用できるものである。抗体の断片及び誘導体は、たとえば、完全な免疫グロブリンタンパク質の重鎖第1定常ドメイン(CH1)、軽鎖定常ドメイン(C)、重鎖可変ドメイン(V)及び軽鎖可変ドメイン(V)からなるFab断片、2個の可変抗体ドメインV及びVからなるF断片、可動性ペプチドリンカーにより連結された2個のV及びVドメインからなる一本鎖F断片(scF)、ラクダ科の重鎖二量体及び単一可変領域、並びに、テンジクザメの新規抗原受容体などの単一ドメイン骨格及び可変重鎖ドメインに基づくミニボディー(minibody)のうちのいずれであってもよい。
【0041】
抗ガレクチン-3抗体は、標識されていてもよい。標識は、当業者が適宜選択し得る。標識の例には、蛍光染料又は金属(たとえば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン、ユーロピウム)、発色団の染料(たとえば、ロドプシン)、化学発光化合物(たとえば、ルミナール、イミダゾール)及び生物発光タンパク質(たとえば、ルシフェリン、ルシフェラーゼ)、ハプテン(たとえば、ビオチン)、酵素(たとえば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータラクタマーゼ)、放射性同位元素(たとえば、H、14C、32P、35S又は125I)、粒子(たとえば、金などの金属粒子)、蛍光性半導体ナノ結晶(量子ドット)が含まれる。たとえば、標識は、蛍光化合物、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びβ-ガラクトシダーゼからなる群から選択され得る。各種標識を、当業者に周知の様々な化学反応、たとえば、アミン反応又はチオール反応を使用して、抗ガレクチン-3抗体に結合させることができる。アミン及びチオール以外の反応基、たとえば、アルデヒド、カルボン酸及びグルタミンも使用できる。
【0042】
標識の検出方法には、蛍光定量的、発光定量的及び酵素的技法が含まれ得るが、これらに限定されない。蛍光標識は、蛍光標識を特定の波長の光に曝し、その後、特定の波長領域で発せられる光を検出及び/又は定量することにより、検出及び/又は定量する。発光標識は、化学反応中に生じる発光を検出及び/又は定量することにより、検出及び/又は定量する。酵素標識は、化学反応から生じるサンプル中の色の変化を検出及び/又は定量することにより、検出及び/又は定量する。ELISAは、酵素的反応を基礎とする方法の一例である。当業者は、適切な検出及び/又は定量のためにプロトコルを改変することができる。
【0043】
イムノアッセイの方法は、当業者に周知であり、一例を挙げると、以下のとおりである。プラスチックチューブ、マイクロプレート、ガラスビーズ、基板などの固相に、捕獲抗体を吸着させる。捕獲抗体としては、たとえば、上記の標識された抗ガレクチン-3抗体のエピトープとは異なるガレクチン-3タンパク質中のエピトープを認識する、ガレクチン-3に結合する抗体、その断片及び誘導体、たとえば、ガレクチン-3のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が用いられ得る。吸着に用いる捕獲抗体溶液の濃度は、当業者が適宜決定し得る。たとえば、捕獲抗体溶液の濃度は、1~10μg/mLの範囲で決定することができ、たとえば、2μg/mL又は5μg/mLとすることができる。
【0044】
抗原抗体反応及び酵素反応に関与しないタンパク質により、捕獲抗体を吸着させた固相をブロッキングする。ブロッキングに適するタンパク質としては、スキムミルク、アルブミン、フィッシュゼラチン、カゼインなどが挙げられる。たとえば、ブロッキング用のタンパク質の濃度は、0.1~5%又は0.5%~2%の範囲で決定することができ、たとえば、1%とすることができる。
【0045】
固相上の捕獲抗体に、妊婦から採取された検体を加え、捕獲抗体とこの検体中のガレクチン-3とが免疫複合体を形成し得る条件下に置く。検体を、必要に応じて適宜希釈した後に、上述の処理を行うことができる。検体の希釈率は、当業者が適宜決定し得る。たとえば、測定するサンプルの種類や他の条件に基づいて、1~20倍又は5~10倍の範囲で決定することができ、たとえば、5倍又は10倍とすることができる。あるいは、検体を希釈せずに、上述の処理を行うことができる。
【0046】
固相を洗浄し、その後、上記の標識された抗ガレクチン-3抗体を加え、捕獲抗体に結合したガレクチン-3と標識された抗ガレクチン-3抗体とが免疫複合体を形成し得る条件下に置く。加えられる標識された抗ガレクチン-3抗体の濃度は、測定するサンプルの種類や他の条件等を考慮して、当業者が適宜決定し得る。たとえば、標識された抗ガレクチン-3抗体の濃度は、0.1~10μg/mL又は0.1~2μg/mLの範囲で決定することができ、たとえば、0.1μg/mLとすることができる。
【0047】
さらに固相を洗浄し、ガレクチン-3に結合した、標識された抗ガレクチン-3抗体に由来するシグナルを、上記の蛍光定量的技法、発光定量的技法、酵素的技法などにより、検出及び定量する。このシグナルの測定値は、使用した血液、血漿又は血清中のガレクチン-3の濃度に相関する。
【0048】
あるいは、捕獲抗体に結合したガレクチン-3を検出するために、標識されていない抗ガレクチン-3抗体を使用することもできる。この場合は、検出用の抗ガレクチン-3抗体を認識する、標識された二次抗体をさらに使用する。二次抗体の標識及びその検出方法は、上記の標識された抗ガレクチン-3抗体のものと同様であり得る。
【0049】
本開示のある実施態様の早産リスク判定装置は、血液、血漿又は血清である検体を導入する導入部と、前記検体のガレクチン-3濃度を測定する測定部と、前記ガレクチン-3濃度が、下限値7ng/ml以上かつ上限値13ng/ml未満の注意範囲に該当するか否かに基づき早産リスクを判定する判定部と、を備える。
【0050】
ここで、前記測定部は、前記ガレクチン-3濃度を生体特異的親和性に基づく測定法によって測定することが望ましい。
【0051】
本態様の早産リスク判定装置で導入される検体を、在胎22週0日から33週6日までのヒト妊婦から採取されたものとすれば、前記したような本開示の早産リスク判定方法が本態様の早産リスク判定装置で実施される。
【0052】
<早産リスク判定装置>
本開示のある実施態様の早産リスク判定装置10は、図1に示すように、測定器20と、導入部40とを組み合わせたものである。導入部40は、上述した検体が導入される部分であるとともにその検体中のガレクチン-3を前記したような生体特異的親和性に基づいて捕捉する部分でもあり、たとえば、図示するようなマイクロプレートをこの導入部40として用いることができる。そして、たとえば図示するようなマイクロプレートリーダを測定器20として用いることができる。この測定器20には、導入部40を載置した状態で出退可能なトレイ22と、操作手順や測定結果等を表示可能なディスプレイ21とが設けられている。この早産リスク判定装置10では、前記したような生体特異的親和性に基づく測定法として、たとえばELISAによるガレクチン-3濃度の測定が行われる。
【0053】
マイクロプレートとしての導入部40には複数のウェルが設けられている。固相としてのウェル底部には、前記した捕獲抗体としての抗ガレクチン-3抗体が吸着されている。この捕獲抗体を吸着した固相を前記したようにブロッキングした後、妊婦から採取された検体を適宜希釈して加え、捕獲抗体とこの検体中のガレクチン-3とが免疫複合体を形成し得る条件下に置く。固相を洗浄した後、捕獲抗体とは別のエピトープを認識する、標識した抗ガレクチン-3抗体を加え、捕獲抗体に結合したガレクチン-3と標識された抗ガレクチン-3抗体とが免疫複合体を形成し得る条件下に置く。そして再度洗浄した後、基質溶液を加え発色させる。この導入部40は、図1に示すように測定器20にセットされて、光学的な測定に供される。すなわち、測定器20では、上記した免疫複合体の標識の発色を光学的に測定することで、ガレクチン-3濃度を定量的に測定することができる。
【0054】
この測定器20の機能ブロック図を図2に示す。制御部30は、この測定器20の各部を制御するものである。制御部30は、後述するハードウェア構成によって、導入部40からガレクチン-3濃度を定量的に測定する測定部30A、及び、この測定されたガレクチン-3濃度が注意範囲に該当するか否かに基づき早産リスクを判定する判定部30Bとして機能する。発光部23は、内部に収納されたトレイ22に載置された導入部40に所定波長の光線を照射する。受光部24は、この導入部40における発色を光学的に検出する。ディスプレイ21は、この光学的な検出に基づく判定結果を表示する。
【0055】
制御部30は、図3のハードウェア構成に示すように、CPU(Central Processing Unit)31、ROM(Read Only Memory)32、RAM(Random Access Memory)33及びストレージ34を有する。各構成は、バス39を介して相互に通信可能に接続されている。
【0056】
CPU31は、中央演算処理ユニットであり、各種プログラムを実行したり、各部を制御したりする。すなわち、CPU31は、ROM32又はストレージ34からプログラムを読み出し、RAM33を作業領域としてプログラムを実行する。CPU31は、ROM32又はストレージ34に記録されているプログラムに従って、上記各構成の制御及び各種の演算処理を行う。
【0057】
ROM32は、各種プログラム及び各種データを格納する。RAM33は、作業領域として一時的にプログラム又はデータを記憶する。ストレージ34は、HDD(Hard Disk Drive)、SSD(Solid State Drive)又はフラッシュメモリにより構成され、オペレーティングシステムを含む各種プログラム、及び各種データを格納する。本態様では、ROM32又はストレージ34には、測定や判定に関するプログラムや各種データが格納されている。また、ストレージ34には、測定データを保存しておくこともできる。
【0058】
制御部30は、上記ハードウェア構成のうちCPU31が、前記したプログラムを実行することによって、測定器20において図2に示すような測定部30Aや判定部30Bとして機能する。すなわち、測定部30Aは、発光部23及び受光部24を制御し、導入部40における発色を光学的に測定し、定量的な測定値を得る。判定部30Bはこの測定値からガレクチン-3濃度を算出し、この算出したガレクチン-3濃度が注意範囲に該当するか否かに基づき早産リスクを判定し、さらにこの判定結果をディスプレイ21に表示する。
【0059】
なお、早産リスク判定装置10に用いられる測定器20としては、図1に示すようなマイクロプレートのように測定器20とは分離した導入部40を要する態様のみならず、生体特異的親和性に基づく測定法に適した任意の装置を用いることができる。たとえば、測定器20に一体に設けられた導入部40から検体を導入させ、内部で前記したような生体特異的親和性に基づく測定法を実行するような装置を用いることもできる。また、たとえば、測定器20に一体に設けられた導入部40から検体と抗ガレクチン-3抗体と反応させた反応液を導入させ、内部で前記したような生体特異的親和性に基づく測定法を実行するような装置を用いることもできる。
【実施例
【0060】
以下、実際のヒト妊婦の例によって、本態様の早産リスク判定方法の有用性を示す。
【0061】
正期産妊婦32例及び早産妊婦23例について、在胎22週0日から33週6日までに採取した血清から、ガレクチン-3測定キット(Human Galectin-3 Quantikine ELISA Kit, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)を用法どおりに使用してガレクチン-3濃度を測定した。なお、この測定キットは、抗ガレクチン-3抗体を用いたELISAによってガレクチン-3濃度を測定するものである。下記表1にて、その測定結果をガレクチン-3濃度の高い順に示す。
【0062】
【表1】
【0063】
上記表1のデータを、カットオフ値を7.0ng/mlとして2×2分割表に示したものが下記表2である。
【0064】
【表2】
【0065】
上記表2で示した値をカイ二乗検定に供したところ、
χ=4.94 (自由度=1)
P=0.0263
となり、危険率5%未満で測定値が7.0以上であった割合に有意差がある、という結果となった。
【0066】
上記表1のデータを、カットオフ値を8.0ng/mlとして2×2分割表に示したものが下記表3である。
【0067】
【表3】
【0068】
上記表3で示した値をカイ二乗検定に供したところ、
χ=11.83 (自由度=1)
P=0.0006
となり、危険率0.1%未満で測定値が8.0以上であった割合に有意差がある、という結果となった。
【0069】
上記表1のデータを、カットオフ値を10.0ng/mlとして2×2分割表に示したものが下記表4である。
【0070】
【表4】
【0071】
上記表4で示した値をカイ二乗検定に供したところ、
χ=21.97 (自由度=1)
P=0.00000304
となり、危険率0.001%未満で測定値が10.0以上であった割合に有意差がある、という結果となった。
【0072】
以上より、早産リスク判定における注意範囲の下限値としては、7.0ng/ml、8.0ng/ml及び10.0ng/mlのいずれも、統計的に意味がある、という結果となった。
【0073】
下限値を7.0ng/mlとした場合、上記表2から、早産例でこの下限値以上となったのは23例中20例(87.0%)と極めて高い割合となった。一方、正期産例でこの下限値以上であったのは32例中19例(59.4%)であった。よって、この値をカットオフ値とした場合には、偽陽性も半数以上で認められる、ということとなった。
【0074】
下限値を10.0ng/mlとした場合、上記表4から、正期産でこの下限値以上であったのは32例中2例(6.3%)に過ぎなかった。一方で、早産例では23例中8例(34.8%)でこの下限値を下回った。よって、この値をカットオフ値とした場合には、偽陽性となる確率は低くなるものの、約3分の1の確率で早産例を見落とす可能性があることになる。
【0075】
なお、下限値をこれらの間に当たる8.0ng/mlとした場合、上記表3から、正期産この下限値以上であったのは32例中10例(31.3%)であったのに対し、早産例では23例中18例(78.3%)であった。
【0076】
以上から、早産リスクを見落としたくない場合には、注意範囲の下限値をなるべく低い値、たとえば、7.0ng/mlとすることが望ましい。このような場合とは、たとえば、ヒト妊婦が早産リスク因子を有する場合、特に前記したようなリスク因子が複数該当するような場合が挙げられる。早産リスク因子には該当するものの、比較的軽度の場合には、注意範囲の下限値は8.0ng/mlとしてもよい。
【0077】
一方で、早産リスク因子に全く該当しないヒト妊婦の場合には、注意範囲の下限値を10ng/mlとして、無用の早産治療を受ける可能性を低減させることとしてもよい。
【0078】
なお、上記表1から、注意範囲の上限値とされる13.0ng/mlを上回った例は、早産例で8例(37.8%)であったのに対し、正期産例では0であった。早産リスクを判定する上では、この上限値を上回る例を除外する意味はない。しかし、この13.0ng/mlを下限値としていた場合、今回の例ではこの下限値を下回る15例(=23-8、表1参照)の早産例が見落とされていたことになる。このような見落とされる可能性のあった早産例を、上記表2~表4を基に算出したのが下記表5である。
【0079】
【表5】
【0080】
上記表5からは、ガレクチン-3濃度が13.0ng/ml未満の早産例において、カットオフ値としての下限値を7.0ng/mlとした注意範囲を設けた場合では、15例中12例(80.0%)を要注意妊婦とすることができる。同様に、下限値を8.0ng/mlとした場合では15例中10例(66.7%)、下限値を10ng/mlとした場合でも15例中7例(46.7%)を要注意妊婦として掬い上げることができる。この点で、本態様の早産リスク判定方法において上限値と下限値とを有する注意範囲を設けることには意義がある。
【産業上の利用可能性】
【0081】
本発明は、早産及び/又は低体重児出産のリスクを判定する方法並びにその装置に利用可能である。
【符号の説明】
【0082】
10 早産リスク判定装置
20 測定器
21 ディスプレイ
22 トレイ
23 発光部
24 受光部
30 制御部
30A 測定部
30B 判定部
31 CPU
32 ROM
33 RAM
34 ストレージ
39 バス
40 導入部
図1
図2
図3