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特許7106788ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法及びＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-19
(45)【発行日】2022-07-27
(54)【発明の名称】ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法及びＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20220720BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20220720BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220720BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20220720BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220720BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220720BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20220720BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61P25/14
A61P25/28
A61P25/16
A61P25/00
A61K48/00
A61K31/711
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2018526457
(86)(22)【出願日】2017-07-07
(86)【国際出願番号】 JP2017025014
(87)【国際公開番号】W WO2018008749
(87)【国際公開日】2018-01-11
【審査請求日】2020-06-29
(31)【優先権主張番号】P 2016136401
(32)【優先日】2016-07-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】522209701
【氏名又は名称】ＴＡＫ－Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(74)【代理人】
【識別番号】100131705
【弁理士】
【氏名又は名称】新山 雄一
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106002
【弁理士】
【氏名又は名称】正林 真之
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(74)【代理人】
【識別番号】100131705
【弁理士】
【氏名又は名称】新山 雄一
(72)【発明者】
【氏名】秋山 徹
(72)【発明者】
【氏名】山角 祐介
(72)【発明者】
【氏名】河府 和義
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】特表２００２－５０８９４４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００３－５２０５８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００２／０３１１３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５０７４９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５３２６１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Nucleic Acids Res.，2007年，Vol. 35，p. 1289-1300
【文献】Nucleic Acids Res.，2002年，Vol. 30，p. 1911-1918
【文献】Mol. Ther. Nucleic Acids，2012年，Vol. 1, e47，p. 1-8
【文献】Nat. Commun.，2013年，Vol. 4，p. 1-14
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン中の非翻訳領域中の連続する１２～２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、細胞毒性が低減され、かつＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸。
【請求項2】
細胞毒性の前記低減が、エクソン中の翻訳領域中に含まれる配列番号１における８３８～８５３番目の塩基配列GGCACCAGCTGCCCGCに相補的な配列を有するギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞毒性と比較した低減である、請求項１に記載の核酸。
【請求項3】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、又は、少なくともいずれか一方の末端から４塩基までのヌクレオチドが架橋構造若しくはアルコキシ構造を有するＤＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項4】
前記非翻訳領域が、配列番号１又は２で表されるＭＥＸ３Ｂ遺伝子に含まれる、請求項１に記載の核酸。
【請求項5】
ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における非翻訳領域中の４１１９～４２９３番目の配列中の連続する１２～２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、マウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２における非翻訳領域中の３１３５～３１４９番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤。
【請求項7】
請求項６に記載の剤を対象（ヒトの個体を除く。）に接触させることを含む、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法。
【請求項8】
請求項６に記載の剤を含む、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸、上記核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法及びＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【0002】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子は元来ＴＧＦ－βにより活性化される遺伝子として同定され、その後の解析から、ＭＥＸ３Ｂタンパク質は種々のｍＲＮＡに結合してそれらｍＲＮＡの機能（つまりタンパク質への翻訳）を制御する分子であることが知られている（例えば、非特許文献１）。
また、ＭＥＸ３Ｂタンパク質はアポトーシスを誘導するタンパク質であることが知られている（例えば、特許文献１）。
アポトーシスは、正常な生理学的過程以外にも、神経変性疾患等の重篤な疾患の発症にも関与していることが知られている。例えば、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病など）は、アポトーシスの異常な亢進が原因と考えられている（例えば、非特許文献２）。
また、ＭＥＸ３Ｂタンパク質はアポトーシスを誘導するタンパク質であることが知られている（例えば、特許文献１）。
アポトーシスは、正常な生理学的過程以外にも、神経変性疾患等の重篤な疾患の発症にも関与していることが知られている。例えば、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病など）は、アポトーシスの異常な亢進が原因と考えられている（例えば、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特許第４４２９２６９号公報
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７；３５（４）：１２８９－３００．
【文献】Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１７１０－１７１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
このような背景から、副作用を抑えつつ、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制することができる核酸医薬品の開発が求められている。
【0006】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、副作用として細胞毒性が少なく、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制することができる核酸、上記核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法及びＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン中のアミノ酸をコードする領域（ＣＤＳ）に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＭＥＸ３Ｂ遺伝子のｍＲＮＡ発現を抑制すると細胞毒性が現れやすいことを見出している。
これに対し、エクソン中のアミノ酸をコードしない非翻訳領域（ＵＴＲ）中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いると、驚くべきことに、副作用として細胞毒性が少なく、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のｍＲＮＡ発現が抑制されることを見出した。
副作用として細胞毒性が少ない理由は、ＣＤＳに比べ、ＵＴＲの方が、ＭＥＸ３Ｂホモログとの相同性が低く、オフターゲット効果が生じ難いことに基づくものと推定される。
本発明は上記知見に基づき、完成するに至ったものである。
具体的には、本発明は以下の通りである。
これに対し、エクソン中のアミノ酸をコードしない非翻訳領域（ＵＴＲ）中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いると、驚くべきことに、副作用として細胞毒性が少なく、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のｍＲＮＡ発現が抑制されることを見出した。
副作用として細胞毒性が少ない理由は、ＣＤＳに比べ、ＵＴＲの方が、ＭＥＸ３Ｂホモログとの相同性が低く、オフターゲット効果が生じ難いことに基づくものと推定される。
本発明は上記知見に基づき、完成するに至ったものである。
具体的には、本発明は以下の通りである。
【0008】
本発明の第１の態様は、
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン中の非翻訳領域中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
前記非翻訳領域中の連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡである、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸である。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン中の非翻訳領域中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
前記非翻訳領域中の連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡである、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸である。
【0009】
本発明の第２の態様は、
第１の態様に係る核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤である。
本発明の第３の態様は、
第２の態様に係る剤を対象（ヒトの個体を除く。）に接触させることを含む、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法である。
本発明の第４の態様は、
第２の態様に係る剤を含む、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤である。
第１の態様に係る核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤である。
本発明の第３の態様は、
第２の態様に係る剤を対象（ヒトの個体を除く。）に接触させることを含む、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法である。
本発明の第４の態様は、
第２の態様に係る剤を含む、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤である。
【発明の効果】
【0010】
副作用として細胞毒性が少なく、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制することができる核酸、上記核酸を含むＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法及びＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】（ａ）はＭＥＸ３Ｂを抑制しないネガティブコントロールのギャップマー型核酸（タカラバイオ社製）を用いた細胞毒性を受けていない細胞の顕微鏡写真を示す図であり、（ｂ）は比較例のギャップマー型核酸により細胞毒性を受けた細胞の顕微鏡写真を示す図である。
【図2】各ギャップマー型核酸のトランスフェクションによるＭＥＸ３Ｂ ｍＲＮＡの発現レベルの抑制を示す図である。
【図3】ＣＤＳを標的とするギャップマー型核酸により細胞毒性を受けた細胞の顕微鏡写真と、ＵＴＲを標的とするギャップマー型核酸により細胞毒性を受けなかった細胞の顕微鏡写真とを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【0013】
（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子）
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子はエクソン１、イントロン及びエクソン２を含み、この構成はヒト、マウス、その他の哺乳類において高度に保存されている。
エクソン中のアミノ酸をコードしない非翻訳領域（ＵＴＲ）としては、開始コドンより上流に５’ＵＴＲが存在し、終始コドンより下流に３’ＵＴＲが存在する。
ヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡをコードするヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子は後記の配列番号１で表される配列を有する。
配列番号１において、４３７～２１４６番目の塩基配列がＣＤＳであり、１～４３６番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２１４７～３５３２番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
マウスＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡをコードするマウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子は後記の配列番号２で表される配列を有する。
配列番号２において、３１９～２０４９番目の塩基配列がＣＤＳであり、１～３１８番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２０５０～３４１６番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
後記の配列番号３はヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域の８３６塩基を示す。
配列番号１０は、スプライシング前のヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡをコードする塩基配列を示す。配列番号１０で表されるヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡをコードする配列における４３７～６９２番目及び１５２９～２９８２番目の塩基配列がＣＤＳであり、１～４３６番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２９８３～４３６８番目の塩基配列が３’ＵＴＲであり、６９３～１５２８番目の領域が、配列番号３で表されるヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域に相当する。
また、ＭＥＸ３Ｂタンパク質（例えば、後記の配列番号４又は５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする遺伝子は全てＭＥＸ３Ｂ遺伝子に属する。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子はエクソン１、イントロン及びエクソン２を含み、この構成はヒト、マウス、その他の哺乳類において高度に保存されている。
エクソン中のアミノ酸をコードしない非翻訳領域（ＵＴＲ）としては、開始コドンより上流に５’ＵＴＲが存在し、終始コドンより下流に３’ＵＴＲが存在する。
ヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡをコードするヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子は後記の配列番号１で表される配列を有する。
配列番号１において、４３７～２１４６番目の塩基配列がＣＤＳであり、１～４３６番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２１４７～３５３２番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
マウスＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡをコードするマウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子は後記の配列番号２で表される配列を有する。
配列番号２において、３１９～２０４９番目の塩基配列がＣＤＳであり、１～３１８番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２０５０～３４１６番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
後記の配列番号３はヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域の８３６塩基を示す。
配列番号１０は、スプライシング前のヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡをコードする塩基配列を示す。配列番号１０で表されるヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡをコードする配列における４３７～６９２番目及び１５２９～２９８２番目の塩基配列がＣＤＳであり、１～４３６番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２９８３～４３６８番目の塩基配列が３’ＵＴＲであり、６９３～１５２８番目の領域が、配列番号３で表されるヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域に相当する。
また、ＭＥＸ３Ｂタンパク質（例えば、後記の配列番号４又は５で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする遺伝子は全てＭＥＸ３Ｂ遺伝子に属する。
【0014】
（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の取得）
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１、２、４、５及び１０に記載した塩基配列およびアミノ酸配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの）から所望クローンを選択することにより、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子を単離することができる。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１、２、４、５及び１０に記載した塩基配列およびアミノ酸配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの）から所望クローンを選択することにより、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子を単離することができる。
【0015】
＜ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸＞
第１の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸（以下、単に「第１の態様に係る核酸」ともいう。）は、
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン中の非翻訳領域（ＵＴＲ）中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
前記ＵＴＲ中の連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡである。
第１の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸（以下、単に「第１の態様に係る核酸」ともいう。）は、
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン中の非翻訳領域（ＵＴＲ）中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は
前記ＵＴＲ中の連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡである。
【0016】
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
第１の態様に係る核酸の１つの実施態様としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソンにおけるＵＴＲ中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
例えば、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン中のＵＴＲに含まれるオリゴヌクレオチドと、それと相補的な、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとが、細胞に導入した後にハイブリッド形成することにより、生じたハイブリッド二本鎖に特異的なヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）によりヌクレオチド鎖を含むＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡが分解されることが好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、上記エクソン中のＵＴＲに含まれるオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する観点から、ＤＮＡであることが好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが存在するＵＴＲとしては、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのいずれであってもよいが、細胞毒性が低い観点から、３’ＵＴＲであることが好ましい。
第１の態様に係る核酸の１つの実施態様としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソンにおけるＵＴＲ中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
例えば、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン中のＵＴＲに含まれるオリゴヌクレオチドと、それと相補的な、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとが、細胞に導入した後にハイブリッド形成することにより、生じたハイブリッド二本鎖に特異的なヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）によりヌクレオチド鎖を含むＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡが分解されることが好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、上記エクソン中のＵＴＲに含まれるオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する観点から、ＤＮＡであることが好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有する連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが存在するＵＴＲとしては、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのいずれであってもよいが、細胞毒性が低い観点から、３’ＵＴＲであることが好ましい。
【0017】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列（エクソンにおけるＵＴＲ）中の連続する少なくとも１１ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、少なくとも１２ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、少なくとも１３ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、少なくとも１４ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましい。
また、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長の上限値としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列（エクソンにおけるＵＴＲ）中の連続する４０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、連続する３０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、連続する２５ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、連続する２０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、連続する１７ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが最も好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＵＴＲ中の連続する１２～２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における４１１９～４２９３番目の配列中の連続する１２～２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はマウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２におけるＵＴＲ中の３１３５～３１４９番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における４１１９～４１３４番目のオリゴヌクレオチド、４１２９～４１４４番目のオリゴヌクレオチド、４１３４～４１４９番目のオリゴヌクレオチド、４１３９～４１５４番目のオリゴヌクレオチド、４１６３～４１７８番目のオリゴヌクレオチド、４２４８～４２６３番目のオリゴヌクレオチド、４２５８～４２７３番目のオリゴヌクレオチド、４２６３～４２７８番目のオリゴヌクレオチド、４２６８～４２８３番目のオリゴヌクレオチド若しくは４２７８～４２９３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はマウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２におけるＵＴＲ中の３１３５～３１４９番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における４１３４～４１４９番目のオリゴヌクレオチド、４１３９～４１５４番目のオリゴヌクレオチド若しくは４２７８～４２９３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましい。
また、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長の上限値としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列（エクソンにおけるＵＴＲ）中の連続する４０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、連続する３０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、連続する２５ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、連続する２０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、連続する１７ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが最も好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ＵＴＲ中の連続する１２～２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における４１１９～４２９３番目の配列中の連続する１２～２０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はマウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２におけるＵＴＲ中の３１３５～３１４９番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における４１１９～４１３４番目のオリゴヌクレオチド、４１２９～４１４４番目のオリゴヌクレオチド、４１３４～４１４９番目のオリゴヌクレオチド、４１３９～４１５４番目のオリゴヌクレオチド、４１６３～４１７８番目のオリゴヌクレオチド、４２４８～４２６３番目のオリゴヌクレオチド、４２５８～４２７３番目のオリゴヌクレオチド、４２６３～４２７８番目のオリゴヌクレオチド、４２６８～４２８３番目のオリゴヌクレオチド若しくは４２７８～４２９３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はマウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２におけるＵＴＲ中の３１３５～３１４９番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における４１３４～４１４９番目のオリゴヌクレオチド、４１３９～４１５４番目のオリゴヌクレオチド若しくは４２７８～４２９３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましい。
【0018】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有するヌクレオチドを少なくとも１つ含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
例えば、ヌクレオチド同士をつなぐリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性を獲得することができ、また、疎水性が向上することから細胞内又は核内への取り込みも向上することができる。
また、ヌクレオチドの糖部が、２’，４’－ＢＮＡ（２’，４’－Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ；別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ））、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の架橋構造、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化（２’－ＭＯＥ）等のアルコキシ構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性獲得及びｍＲＮＡの結合能を向上することができる。
例えば、ヌクレオチド同士をつなぐリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性を獲得することができ、また、疎水性が向上することから細胞内又は核内への取り込みも向上することができる。
また、ヌクレオチドの糖部が、２’，４’－ＢＮＡ（２’，４’－Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ；別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ））、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の架橋構造、２’－Ｏ－メチル化、２’－Ｏ－メトキシエチル化（２’－ＭＯＥ）等のアルコキシ構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性獲得及びｍＲＮＡの結合能を向上することができる。
【0019】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド同士をつなぐ少なくとも１つのリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することが好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの５０％以上がホスホロチオエート構造を有することがより好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの７０％以上がホスホロチオエート構造を有することが更に好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの９０％以上がホスホロチオエート構造を有することが特に好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート構造を有することが最も好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、少なくともいずれか一方の末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することがより好ましく（いわゆるギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）型アンチセンスオリゴヌクレオチド）、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端において、独立して、末端から４塩基までが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが更に好ましく、末端から２又は３塩基が架橋構造又はアルコキシ構造を有することが特に好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、少なくともいずれか一方の末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することがより好ましく（いわゆるギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）型アンチセンスオリゴヌクレオチド）、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端において、独立して、末端から４塩基までが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが更に好ましく、末端から２又は３塩基が架橋構造又はアルコキシ構造を有することが特に好ましい。
【0020】
（ｓｉＲＮＡ）
第１の態様に係る核酸のもう１つの実施態様としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＵＴＲの連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ））又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡである。
上記二本鎖ＲＮＡに含まれる連続する少なくとも２０ヌクレオチドが存在するＵＴＲとしては、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのいずれであってもよいが、３’ＵＴＲであることが好ましい。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＵＴＲの連続する少なくとも２１ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましい。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＵＴＲの連続する３０ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましく、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＵＴＲの連続する２５ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることがより好ましい。
上記二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０におけるＵＴＲ中の４１１９～４２９３番目の連続する少なくとも２１ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、マウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２におけるＵＴＲ中の３１３５～３１４９番目のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ等が挙げられ、ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０におけるＵＴＲ中の４１１９～４１３４番目のオリゴヌクレオチド、４１２９～４１４４番目のオリゴヌクレオチド、４１３４～４１４９番目のオリゴヌクレオチド、４１３９～４１５４番目のオリゴヌクレオチド、４１６３～４１７８番目のオリゴヌクレオチド、４２４８～４２６３番目のオリゴヌクレオチド、４２５８～４２７３番目のオリゴヌクレオチド、４２６３～４２７８番目のオリゴヌクレオチド、４２６８～４２８３番目のオリゴヌクレオチド若しくは４２７８～４２９３番目のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、又はマウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２におけるＵＴＲ中の３１３５～３１４９番目のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましい。
第１の態様に係る核酸のもう１つの実施態様としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＵＴＲの連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ））又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡである。
上記二本鎖ＲＮＡに含まれる連続する少なくとも２０ヌクレオチドが存在するＵＴＲとしては、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのいずれであってもよいが、３’ＵＴＲであることが好ましい。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＵＴＲの連続する少なくとも２１ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましい。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＵＴＲの連続する３０ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましく、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＵＴＲの連続する２５ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることがより好ましい。
上記二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０におけるＵＴＲ中の４１１９～４２９３番目の連続する少なくとも２１ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、マウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２におけるＵＴＲ中の３１３５～３１４９番目のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ等が挙げられ、ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０におけるＵＴＲ中の４１１９～４１３４番目のオリゴヌクレオチド、４１２９～４１４４番目のオリゴヌクレオチド、４１３４～４１４９番目のオリゴヌクレオチド、４１３９～４１５４番目のオリゴヌクレオチド、４１６３～４１７８番目のオリゴヌクレオチド、４２４８～４２６３番目のオリゴヌクレオチド、４２５８～４２７３番目のオリゴヌクレオチド、４２６３～４２７８番目のオリゴヌクレオチド、４２６８～４２８３番目のオリゴヌクレオチド若しくは４２７８～４２９３番目のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ、又はマウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２におけるＵＴＲ中の３１３５～３１４９番目のオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ若しくは前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましい。
【0021】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、ある標的遺伝子の一部をコードするｍＲＮＡの一部を二本鎖にしたＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を細胞へ導入すると、標的遺伝子の発現が抑制される現象を言う。
二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＭＥＸ３Ｂの部分配列の逆向き反復配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
このような逆向き反復配列を有するＤＮＡを哺乳動物の細胞に導入することにより、細胞内で標的遺伝子（ＭＥＸ３Ｂ）の逆向き反復配列を発現させることができ、これによりＲＮＡｉ効果により標的遺伝子（ＭＥＸ３Ｂ）の発現を抑制することが可能になる。
逆向き反復配列とは、標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介して並列している配列を言う。具体的には、標的遺伝子が、以下に示すｎ個の塩基配列から成る２本鎖を有する場合、
５’－Ｘ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ－１Ｘｎ－３’
３’－Ｙ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ－１Ｙｎ－５’
その逆向き配列は以下の配列を有する。
５’－ＹｎＹｎ－１．．．．．．Ｙ２Ｙ１－３’
３’－ＸｎＸｎ－１．．．．．．Ｘ２Ｘ１－５’
（ここで、Ｘで表される塩基とＹで表される塩基において、添え字の数字が同じものは互いに相補的な塩基である）
二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＭＥＸ３Ｂの部分配列の逆向き反復配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
このような逆向き反復配列を有するＤＮＡを哺乳動物の細胞に導入することにより、細胞内で標的遺伝子（ＭＥＸ３Ｂ）の逆向き反復配列を発現させることができ、これによりＲＮＡｉ効果により標的遺伝子（ＭＥＸ３Ｂ）の発現を抑制することが可能になる。
逆向き反復配列とは、標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介して並列している配列を言う。具体的には、標的遺伝子が、以下に示すｎ個の塩基配列から成る２本鎖を有する場合、
５’－Ｘ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ－１Ｘｎ－３’
３’－Ｙ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ－１Ｙｎ－５’
その逆向き配列は以下の配列を有する。
５’－ＹｎＹｎ－１．．．．．．Ｙ２Ｙ１－３’
３’－ＸｎＸｎ－１．．．．．．Ｘ２Ｘ１－５’
（ここで、Ｘで表される塩基とＹで表される塩基において、添え字の数字が同じものは互いに相補的な塩基である）
【0022】
逆向き反復配列は上記２種の配列が適当な配列を介した配列である。逆向き反復配列としては、標的遺伝子の配列が逆向き配列の上流にある場合と、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流にある場合の２つの場合が考えられる。本発明で用いる逆向き反復配列は上記の何れでもよいが、好ましくは、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流に存在する。
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、ＲＮＡに転写された際にヘアピンループを形成する領域である（ｓｈＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）。この領域の長さは、ヘアピンループを形成できる限り特には限定されないが、好ましくは０～３００ｂｐ程度、より好ましくは０～１００ｂｐ程度である。この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよい。
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、ＲＮＡに転写された際にヘアピンループを形成する領域である（ｓｈＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）。この領域の長さは、ヘアピンループを形成できる限り特には限定されないが、好ましくは０～３００ｂｐ程度、より好ましくは０～１００ｂｐ程度である。この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよい。
【0023】
本発明では、哺乳動物で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を組み込むことにより、哺乳動物の細胞内において標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができる。本発明で用いるプロモーター配列は、哺乳動物で作動可能であれば特に限定されない。
第１の態様に係る核酸は、ＤＮＡ合成機及び公知の有機合成技術を用いて常法により製造することができる。
第１の態様に係る核酸は、ＤＮＡ合成機及び公知の有機合成技術を用いて常法により製造することができる。
【0024】
インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）又はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、細胞内への取り込みは、第１の態様に係る核酸を細胞に接触させること、例えば、任意の細胞を培養する培地中に、第１の態様に係る核酸を添加することにより達成することができるが、第１の態様に係る核酸が、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有することにより、細胞内への取り込みを更に向上させることができる。
第１の態様に係る核酸は、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有することと、後述するリポフェクション用担体とを組み合わせて用いることにより細胞内への取り込みを更に向上させることができる。
第１の態様に係る核酸は、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有することと、後述するリポフェクション用担体とを組み合わせて用いることにより細胞内への取り込みを更に向上させることができる。
【0025】
第１の態様に係る核酸の細胞への導入方法としては、適当なベクター中に挿入し、更に適当な宿主細胞に導入する方法であってもよい。
上記適当なベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えば、プラスミド等）でもよいが、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであることが好ましい。
上記適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファージやレトロウイルスやワクシニアウイルス等の動物ウイルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。
上記適当なベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えば、プラスミド等）でもよいが、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであることが好ましい。
上記適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファージやレトロウイルスやワクシニアウイルス等の動物ウイルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。
【0026】
また、第１の態様に係る核酸は、必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネーター又は真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネーター若しくはＡＤＨ３ターミネーターのような適切なターミネーターに機能的に結合されていてもよい。組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）及び翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルスＶＡＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
【0027】
第１の態様に係る核酸又はそれを含むベクターを導入される宿主細胞は、高等真核細胞、細菌、酵母、真菌等が挙げられるが、哺乳類細胞であることが好ましい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ－７細胞など）、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／ｃマウス細胞（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス胎児繊維芽細胞）等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された遺伝子を発現させる方法も公知であり、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ－７細胞など）、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／ｃマウス細胞（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス胎児繊維芽細胞）等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された遺伝子を発現させる方法も公知であり、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【0028】
第１の態様に係る核酸によるＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現の抑制は、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列情報を基にすれば、インビボ、インビトロでも、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を有するプローブまたはプライマーを利用することにより検出することができる。
特に、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定は、ＲＴ－ＰＣＲ、ノザンブロット等の常法により行うことができる。
特に、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定は、ＲＴ－ＰＣＲ、ノザンブロット等の常法により行うことができる。
【0029】
ＰＣＲを行なう場合、プライマーは、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のみを特異的に増幅できるものであれば特に限定されず、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の配列情報に基づき適宜設定することができる。例えば、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして使用することができる。より具体的には、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子中の連続した１０～６０残基、好ましくは１０～４０残基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【0030】
またＭＥＸ３Ｂタンパク質レベルでの発現量の測定は、ウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の通常の免疫分析により行なうことができる。具体的には、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
【0031】
＜ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤＞
第２の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤（以下、単に「第２の態様に係る剤」ともいう。）は、第１の態様に係る核酸を含む。
第２の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤は、細胞内への取り込みを向上させる観点から、リポフェクション用担体を更に含んでいてもよいが含まなくてもよい。
リポフェクション用担体としては、細胞膜との親和性の高い担体（例えばリポソームやコレステロール等）が挙げられ、リポフェクトアミン又はリポフェクチンが好ましく、リポフェクトアミンがより好ましい。
第１の態様に係る核酸がホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有することと、リポフェクション用担体とを組み合わせて用いることにより細胞内への取り込みを更に向上させることができる。
例えば、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有する第１の態様に係る核酸を、リポフェクション用担体共存下において、後述の対象と接触させることが好ましい。
第２の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤（以下、単に「第２の態様に係る剤」ともいう。）は、第１の態様に係る核酸を含む。
第２の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤は、細胞内への取り込みを向上させる観点から、リポフェクション用担体を更に含んでいてもよいが含まなくてもよい。
リポフェクション用担体としては、細胞膜との親和性の高い担体（例えばリポソームやコレステロール等）が挙げられ、リポフェクトアミン又はリポフェクチンが好ましく、リポフェクトアミンがより好ましい。
第１の態様に係る核酸がホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有することと、リポフェクション用担体とを組み合わせて用いることにより細胞内への取り込みを更に向上させることができる。
例えば、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有する第１の態様に係る核酸を、リポフェクション用担体共存下において、後述の対象と接触させることが好ましい。
【0032】
第２の態様に係る剤は、第１の態様に係る核酸、上記リポフェクション用担体及びその他任意成分（例えば、水、緩衝液等）を混合して含む形態であってもよいが、第１の態様に係る核酸及びその他任意成分と、上記リポフェクション用担体及びその他任意成分とが個別の容器内に包装されたキットの形態であってもよい。
第２の態様に係る剤の形態としては、特に限定されるものではないが、液体、顆粒、錠剤、カプセル剤、貼り薬等の形態で使用することができる。インビボの場合には、第２の態様に係る剤を組織に直接暴露してもよい。より好ましくは生体に暴露（液体等）又は経口投与、あるいは、静脈又は動脈等の血管内、経口内、舌下、直腸内、腹膣内、皮膚、皮下、皮内、膀胱内、気管（気管支）、眼、鼻、耳内等への注入、噴霧、又は塗布等の手段により生体内に投与すればよい。
第２の態様に係る剤の形態としては、特に限定されるものではないが、液体、顆粒、錠剤、カプセル剤、貼り薬等の形態で使用することができる。インビボの場合には、第２の態様に係る剤を組織に直接暴露してもよい。より好ましくは生体に暴露（液体等）又は経口投与、あるいは、静脈又は動脈等の血管内、経口内、舌下、直腸内、腹膣内、皮膚、皮下、皮内、膀胱内、気管（気管支）、眼、鼻、耳内等への注入、噴霧、又は塗布等の手段により生体内に投与すればよい。
【0033】
＜ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法＞
第３の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法は、第２の態様に係る剤を対象に接触させることを含む。
対象としては、生物個体、微生物、原虫、生物組織、生物組織切片、ヒト細胞、動物細胞等が挙げられる。
接触させる形態としては特に制限はないが、例えば、第２の態様に係る剤を、対象を含む媒体に添加するか又は第２の態様に係る剤を予め含有する前記媒体を準備してもよい。接触させる際の温度、時間等は、特に制限はないが、対象の種類等に応じて適宜設定される。
第３の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現を抑制する方法は、第２の態様に係る剤を対象に接触させることを含む。
対象としては、生物個体、微生物、原虫、生物組織、生物組織切片、ヒト細胞、動物細胞等が挙げられる。
接触させる形態としては特に制限はないが、例えば、第２の態様に係る剤を、対象を含む媒体に添加するか又は第２の態様に係る剤を予め含有する前記媒体を準備してもよい。接触させる際の温度、時間等は、特に制限はないが、対象の種類等に応じて適宜設定される。
【0034】
＜ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤＞
第４の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤は、第２の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤を含む。
インターロイキン６（ＩＬ－６）は、炎症、造血、骨代謝、腫瘍増悪などに関与する重要なサイトカインであり、その活性は主に急性炎症から獲得免疫反応への移行や慢性炎症性疾患の発症に寄与することが知られている（例えば、Ｊ Ａｓｔｈｍａ．２００８；４５ Ｓｕｐｐｌ １：４１－４．）。
インターロイキン１３（ＩＬ－１３）は、炎症性サイトカインとして末梢組織でのアレルギー性炎症をより増強する役割を担うことが知られており、アレルギー性喘息の主な要因であるアレルギー反応を促進するという側面のみならず、ステロイド剤が効かなくなるという喘息の難治化に関与することが知られている。またＩＬ－１３は、喘息のみならず、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎においてもその病態形成に関与している（例えば、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ （Ｃａｉｒｏ）．２０１２；２０１２：３１６０４９、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１１；３６５：１０８８－１０９８）。
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子：Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）、中でも、ＴＮＦ－αは、炎症反応を誘発するシグナル因子であり、感染防御の観点では重要な因子であるが、一方で炎症が亢進することによる障害にも同時に関与することが知られている。すなわち様々な疾患でＴＮＦは病態の悪化に関与しており、主に関節疾患（関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎）、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、がん（卵巣がん、乳がん）、精神疾患（うつ、双極性障害、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症）、心血管疾患（心不全、動脈硬化）、呼吸器疾患（気管支喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害）、二型糖尿病、腎疾患（虚血性腎障害、移植後拒絶反応、糸球体腎炎）などに関与することが知られている（例えば、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｊａｎ；１２１（１）：５－１０、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００８ Ｊａｎ；２１４（２）：１４９－６０．）。
また、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子：Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）は顆粒球産出の促進、好中球の機能を高める作用があることが知られている。
また、ＩＬ－１３、ＴＮＦ、Ｇ－ＣＳＦも、喘息の重症化に関与することが知られている（例えば、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；２５（６）：７５５－６０．）。
第４の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現に起因する疾病の予防又は治療剤は、第２の態様に係るＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現抑制剤を含む。
インターロイキン６（ＩＬ－６）は、炎症、造血、骨代謝、腫瘍増悪などに関与する重要なサイトカインであり、その活性は主に急性炎症から獲得免疫反応への移行や慢性炎症性疾患の発症に寄与することが知られている（例えば、Ｊ Ａｓｔｈｍａ．２００８；４５ Ｓｕｐｐｌ １：４１－４．）。
インターロイキン１３（ＩＬ－１３）は、炎症性サイトカインとして末梢組織でのアレルギー性炎症をより増強する役割を担うことが知られており、アレルギー性喘息の主な要因であるアレルギー反応を促進するという側面のみならず、ステロイド剤が効かなくなるという喘息の難治化に関与することが知られている。またＩＬ－１３は、喘息のみならず、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎においてもその病態形成に関与している（例えば、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ （Ｃａｉｒｏ）．２０１２；２０１２：３１６０４９、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１１；３６５：１０８８－１０９８）。
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子：Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）、中でも、ＴＮＦ－αは、炎症反応を誘発するシグナル因子であり、感染防御の観点では重要な因子であるが、一方で炎症が亢進することによる障害にも同時に関与することが知られている。すなわち様々な疾患でＴＮＦは病態の悪化に関与しており、主に関節疾患（関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎）、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、がん（卵巣がん、乳がん）、精神疾患（うつ、双極性障害、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症）、心血管疾患（心不全、動脈硬化）、呼吸器疾患（気管支喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害）、二型糖尿病、腎疾患（虚血性腎障害、移植後拒絶反応、糸球体腎炎）などに関与することが知られている（例えば、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｊａｎ；１２１（１）：５－１０、Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００８ Ｊａｎ；２１４（２）：１４９－６０．）。
また、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子：Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）は顆粒球産出の促進、好中球の機能を高める作用があることが知られている。
また、ＩＬ－１３、ＴＮＦ、Ｇ－ＣＳＦも、喘息の重症化に関与することが知られている（例えば、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；２５（６）：７５５－６０．）。
【0035】
また、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５は炎症性ケモカインＣＸＣサブファミリーに属する。
気道粘膜における過剰な炎症の亢進により肺組織内でＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５が分泌された場合には、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５の受容体であるＣＸＣＲ２を高発現する好中球の浸潤が促される。結果的にはステロイド耐性の好中球浸潤が重症喘息を引き起こすことにより気道の不可逆的なリモデリングを誘導する慢性炎症を誘発する。
本発明者らは、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子がＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＴＮＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の発症に関わることを見出している。
したがって、第４の態様に係る予防又は治療剤は、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＴＮＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５発現増加に起因する疾病（例えば、重症喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、大腸炎、クローン病、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん等の中でもＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＴＮＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する重症喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、大腸炎、クローン病、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん等（Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５ Ｊａｎ；２７（１）：２１－９、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１６ Ｊａｎ；６（１）：８０－９５．））の予防又は治療剤として有効であると考えられる。
気道粘膜における過剰な炎症の亢進により肺組織内でＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５が分泌された場合には、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５の受容体であるＣＸＣＲ２を高発現する好中球の浸潤が促される。結果的にはステロイド耐性の好中球浸潤が重症喘息を引き起こすことにより気道の不可逆的なリモデリングを誘導する慢性炎症を誘発する。
本発明者らは、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子がＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＴＮＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の発症に関わることを見出している。
したがって、第４の態様に係る予防又は治療剤は、ＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＴＮＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５発現増加に起因する疾病（例えば、重症喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、大腸炎、クローン病、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん等の中でもＩＬ－６、ＩＬ－１３、ＴＮＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する重症喘息、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、大腸炎、クローン病、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん等（Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５ Ｊａｎ；２７（１）：２１－９、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１６ Ｊａｎ；６（１）：８０－９５．））の予防又は治療剤として有効であると考えられる。
【0036】
また、ＭＥＸ３Ｂタンパク質はアポトーシスを誘導するタンパク質であることが知られている（例えば、特許第４４２９２６９号公報）。
アポトーシスは、正常な生理学的過程以外にも、神経変性疾患等の重篤な疾患の発症にも関与していることが知られている。例えば、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病など）は、アポトーシスの異常な亢進が原因と考えられている（Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１７１０－１７１３）。
したがって、第４の態様に係る予防又は治療剤は、神経変性疾患の予防又は治療剤として有効であると考えられる。
アポトーシスは、正常な生理学的過程以外にも、神経変性疾患等の重篤な疾患の発症にも関与していることが知られている。例えば、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン舞踏病など）は、アポトーシスの異常な亢進が原因と考えられている（Ｗｏｌｏｚｉｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１７１０－１７１３）。
したがって、第４の態様に係る予防又は治療剤は、神経変性疾患の予防又は治療剤として有効であると考えられる。
【0037】
第４の態様に係る予防又は治療剤は、経口または非経口的に全身又は局所的に投与することができる。非経口的な投与方法としては、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などを挙げることができる。患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。その投与量は、年齢、投与経路、投与回数により異なり、当業者であれば適宜選択できる。
非経口投与に適した製剤形態として、例えば安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、さらに薬学的に許容される担体や添加物を含むものでもよい。このような担体及び添加物の例として、水、有機溶剤、高分子化合物（コラーゲン、ポリビニルアルコールなど）、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ツルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
非経口投与に適した製剤形態として、例えば安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、さらに薬学的に許容される担体や添加物を含むものでもよい。このような担体及び添加物の例として、水、有機溶剤、高分子化合物（コラーゲン、ポリビニルアルコールなど）、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ツルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0038】
有効成分である第１の態様に係る核酸の投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ～１００ｍｇ程度の範囲である。
【実施例】
【0039】
以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。
【0040】
≪実施例１≫
＜ギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）型核酸の調製＞
（比較例）
比較例のギャップマー型核酸として、ヒトＭＥＸ３Ｂ ｍＲＮＡ配列内のアミノ酸をコードする領域（ＣＤＳ）に含まれる、配列番号１における８３８～８５３番目の塩基配列に相補的なギャップマー型核酸（全長１６塩基）を調製した。
（実施例）
実施例のギャップマー型核酸として、マウスＭｅｘ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２中の３’ＵＴＲに含まれる３１３５～３１４９番目の塩基配列に相補的なギャップマー型核酸（全長１５塩基）を調製した。
比較例及び実施例のギャップマー型核酸の両末端には２又は３塩基のＬＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）を配置し、それ以外の間を埋める塩基は通常のＤＮＡとし、各ヌクレオチドを結ぶリン酸ジエステル結合はホスホロチオエート化した。
＜ギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）型核酸の調製＞
（比較例）
比較例のギャップマー型核酸として、ヒトＭＥＸ３Ｂ ｍＲＮＡ配列内のアミノ酸をコードする領域（ＣＤＳ）に含まれる、配列番号１における８３８～８５３番目の塩基配列に相補的なギャップマー型核酸（全長１６塩基）を調製した。
（実施例）
実施例のギャップマー型核酸として、マウスＭｅｘ３Ｂ遺伝子を表す配列番号２中の３’ＵＴＲに含まれる３１３５～３１４９番目の塩基配列に相補的なギャップマー型核酸（全長１５塩基）を調製した。
比較例及び実施例のギャップマー型核酸の両末端には２又は３塩基のＬＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）を配置し、それ以外の間を埋める塩基は通常のＤＮＡとし、各ヌクレオチドを結ぶリン酸ジエステル結合はホスホロチオエート化した。
【0041】
＜ギャップマー型核酸によるトランスフェクション＞
比較例のギャップマー型核酸及び実施例のギャップマー型核酸を用いてトランスフェクション（細胞導入）した。
ギャップマー型核酸のトランスフェクションに用いた細胞はマウス肺上皮細胞ＭＬＥ１５細胞であり、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とその推奨プロトコルを採用して最終濃度２０ｎＭにて細胞に導入した。
＜ＲＴ定量的ＰＣＲ試験＞
トランスフェクション４８時間後に顕微鏡下にて細胞の状態を観察した後に細胞を回収して溶解バッファーＴＲＩｓｕｒｅ（ＢＩＯＬＩＮＥ社製）を用いて全ＲＮＡを回収した。Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）により逆転写反応を行いｃＤＮＡを得た。
その後、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０（ＲＯＣＨＥ社製）を用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。
比較例のギャップマー型核酸及び実施例のギャップマー型核酸を用いてトランスフェクション（細胞導入）した。
ギャップマー型核酸のトランスフェクションに用いた細胞はマウス肺上皮細胞ＭＬＥ１５細胞であり、リポフェクトアミンＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とその推奨プロトコルを採用して最終濃度２０ｎＭにて細胞に導入した。
＜ＲＴ定量的ＰＣＲ試験＞
トランスフェクション４８時間後に顕微鏡下にて細胞の状態を観察した後に細胞を回収して溶解バッファーＴＲＩｓｕｒｅ（ＢＩＯＬＩＮＥ社製）を用いて全ＲＮＡを回収した。Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）により逆転写反応を行いｃＤＮＡを得た。
その後、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０（ＲＯＣＨＥ社製）を用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。
【0042】
定量的ＲＴ－ＰＣＲ試験に用いたプライマー配列は以下である。
マウスＭＥＸ３ＢプライマーＦｏｒｗａｒｄ：５’－ＣＧＴＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＧＴＧ－３’（配列番号６）
マウスＭＥＸ３ＢプライマーＲｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣ－３’（配列番号７）
マウスＧＡＰＤＨプライマーＦｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴ－３’（配列番号８）
マウスＧＡＰＤＨプライマーＲｅｖｅｒｓｅ：５’－ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧ－３’（配列番号９）
マウスＭＥＸ３ＢプライマーＦｏｒｗａｒｄ：５’－ＣＧＴＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＧＴＧ－３’（配列番号６）
マウスＭＥＸ３ＢプライマーＲｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣ－３’（配列番号７）
マウスＧＡＰＤＨプライマーＦｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴ－３’（配列番号８）
マウスＧＡＰＤＨプライマーＲｅｖｅｒｓｅ：５’－ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧ－３’（配列番号９）
【0043】
上記ＲＴ定量的ＰＣＲの結果、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のＣＤＳに含まれる塩基配列に相補的な比較例のギャップマー型核酸によるＭＥＸ３Ｂ遺伝子のｍＲＮＡ発現抑制効果は約５０％程度であった。しかし、図１（ｂ）に示したように、細胞毒性が強く多くの細胞が培養皿の底から剥がれて浮いており、多くの細胞が死滅することが観察された。
一方、実施例のギャップマー型核酸は、上記比較例のギャップマー型核酸と同等のｍＲＮＡ発現抑制効果が得られ、かつ細胞毒性などの副作用も見られなかった。
一方、実施例のギャップマー型核酸は、上記比較例のギャップマー型核酸と同等のｍＲＮＡ発現抑制効果が得られ、かつ細胞毒性などの副作用も見られなかった。
【0044】
≪実施例２≫
＜ギャップマー型核酸の調製＞
３’ＵＴＲの表１に示した各標的配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－１７６（配列番号１１）、ｈｍｒＧＤ－１７８（配列番号１２）、ｈｍｒＧＤ－１７９（配列番号１３）、ｈｍｒＧＤ－１８０（配列番号１４）、ｈｍｒＧＤ－１８２（配列番号１５）、ｈｍｒＧＤ－１９９（配列番号１６）、ｈｍｒＧＤ－２０１（配列番号１７）、ｈｍｒＧＤ－２０２（配列番号１８）、ｈｍｒＧＤ－２０３（配列番号１９）又はｈｍｒＧＤ－２０５（配列番号２０）、ネガティブコントロールとしてのギャップマー型核酸（配列番号２１）、及びポジティブコントロールとしてＣＤＳ領域の表１に示した標的配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－６８（配列番号２２）を調製した。
なお、各ギャップマー型核酸の両末端には２塩基のＬＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）を配置し、それ以外の間を埋める塩基は通常のＤＮＡとし、各ヌクレオチドを結ぶリン酸ジエステル結合はホスホロチオエート化し、ネガティブコントロールのギャップマー型核酸の全長は１５塩基とし、それ以外のギャップマー型核酸の全長は１６塩基とした。
＜ギャップマー型核酸の調製＞
３’ＵＴＲの表１に示した各標的配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－１７６（配列番号１１）、ｈｍｒＧＤ－１７８（配列番号１２）、ｈｍｒＧＤ－１７９（配列番号１３）、ｈｍｒＧＤ－１８０（配列番号１４）、ｈｍｒＧＤ－１８２（配列番号１５）、ｈｍｒＧＤ－１９９（配列番号１６）、ｈｍｒＧＤ－２０１（配列番号１７）、ｈｍｒＧＤ－２０２（配列番号１８）、ｈｍｒＧＤ－２０３（配列番号１９）又はｈｍｒＧＤ－２０５（配列番号２０）、ネガティブコントロールとしてのギャップマー型核酸（配列番号２１）、及びポジティブコントロールとしてＣＤＳ領域の表１に示した標的配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－６８（配列番号２２）を調製した。
なお、各ギャップマー型核酸の両末端には２塩基のＬＮＡ（２’，４’－ＢＮＡ）を配置し、それ以外の間を埋める塩基は通常のＤＮＡとし、各ヌクレオチドを結ぶリン酸ジエステル結合はホスホロチオエート化し、ネガティブコントロールのギャップマー型核酸の全長は１５塩基とし、それ以外のギャップマー型核酸の全長は１６塩基とした。
【0045】
【表1】
【0046】
＜ギャップマー型核酸のトランスフェクション＞
上記調製した各ギャップマー型核酸を用いること以外は実施例１と同様にしてトランスフェクションを行った。
＜ＲＴ定量的ＰＣＲ試験＞
ＰＣＲプライマーとして以下のプライマーを用いること以外は実施例１と同様にして定量的ＲＴ－ＰＣＲ試験を行った。
ヒトＭＥＸ３ＢプライマーＦｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＣＣＣＡＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＣＧ－３’（配列番号２３）
ヒトＭＥＸ３ＢプライマーＲｅｖｅｒｓｅ：５’－ＣＧＡＡＣＴＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡ－３’（配列番号２４）
ヒトＧＡＰＤＨプライマーＦｏｒｗａｒｄ：５’－ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ－３’（配列番号２５）
ヒトＧＡＰＤＨプライマーＲｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ－３’（配列番号２６）
上記調製した各ギャップマー型核酸を用いること以外は実施例１と同様にしてトランスフェクションを行った。
＜ＲＴ定量的ＰＣＲ試験＞
ＰＣＲプライマーとして以下のプライマーを用いること以外は実施例１と同様にして定量的ＲＴ－ＰＣＲ試験を行った。
ヒトＭＥＸ３ＢプライマーＦｏｒｗａｒｄ：５’－ＡＣＣＣＡＧＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＧＴＣＧ－３’（配列番号２３）
ヒトＭＥＸ３ＢプライマーＲｅｖｅｒｓｅ：５’－ＣＧＡＡＣＴＧＧＧＧＴＣＴＴＧＡＴＧＴＡＡ－３’（配列番号２４）
ヒトＧＡＰＤＨプライマーＦｏｒｗａｒｄ：５’－ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ－３’（配列番号２５）
ヒトＧＡＰＤＨプライマーＲｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ－３’（配列番号２６）
【0047】
図２に示した定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果から明らかなように、コントロールのギャップマー型核酸をトランスフェクションした細胞に対し、３’ＵＴＲを標的領域とする各ギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－１７６、ｈｍｒＧＤ－１７８、ｈｍｒＧＤ－１７９、ｈｍｒＧＤ－１８０、ｈｍｒＧＤ－１８２、ｈｍｒＧＤ－１９９、ｈｍｒＧＤ－２０１、ｈｍｒＧＤ－２０２、ｈｍｒＧＤ－２０３又はｈｍｒＧＤ－２０５を用いてトランスフェクションを行った細胞ではヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡ発現を抑制する効果が検出された。
ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における４１３４～４１４９番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－１７９、４１３９～４１５４番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－１８０、４２７８～４２９３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－２０５は、ヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡ発現を抑制する効果が特に強く検出された。
ヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡを表す配列番号１０における４１３４～４１４９番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－１７９、４１３９～４１５４番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－１８０、４２７８～４２９３番目のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－２０５は、ヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡ発現を抑制する効果が特に強く検出された。
【0048】
図３に示したように、ＣＤＳ領域の配列に相補的なギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－６８を用いてトランスフェクションを行った細胞では、細胞毒性が著しく高く、多くの細胞が培養皿の底から剥がれて丸くなって浮いており、多くの細胞が死滅することが確認された。
一方、図３に示したように、ＵＴＲ領域の配列に相補的なギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－１７６、ｈｍｒＧＤ－１７８、ｈｍｒＧＤ－１７９、ｈｍｒＧＤ－１８０、ｈｍｒＧＤ－１８２、ｈｍｒＧＤ－１９９、ｈｍｒＧＤ－２０１、ｈｍｒＧＤ－２０２、ｈｍｒＧＤ－２０３又はｈｍｒＧＤ－２０５を用いてトランスフェクションを行った細胞は、ネガティブコントロールと同様に、細胞毒性などの副作用は見られなかった。
一方、図３に示したように、ＵＴＲ領域の配列に相補的なギャップマー型核酸ｈｍｒＧＤ－１７６、ｈｍｒＧＤ－１７８、ｈｍｒＧＤ－１７９、ｈｍｒＧＤ－１８０、ｈｍｒＧＤ－１８２、ｈｍｒＧＤ－１９９、ｈｍｒＧＤ－２０１、ｈｍｒＧＤ－２０２、ｈｍｒＧＤ－２０３又はｈｍｒＧＤ－２０５を用いてトランスフェクションを行った細胞は、ネガティブコントロールと同様に、細胞毒性などの副作用は見られなかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】