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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-07-28
(45)【発行日】2022-08-05
(54)【発明の名称】生体組織損傷の修復剤および当該修復剤の製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20220729BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220729BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220729BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220729BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220729BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
A61P1/16
A61P13/12
A61P31/12
A61P29/00
A61P29/00 101
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2018559456
(86)(22)【出願日】2017-12-25
(86)【国際出願番号】 JP2017046427
(87)【国際公開番号】W WO2018123968
(87)【国際公開日】2018-07-05
【審査請求日】2020-10-22
(31)【優先権主張番号】P 2016256779
(32)【優先日】2016-12-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2017187074
(32)【優先日】2017-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】503328193
【氏名又は名称】株式会社ツーセル
(73)【特許権者】
【識別番号】504136568
【氏名又は名称】国立大学法人広島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】加藤 幸夫
(72)【発明者】
【氏名】辻 紘一郎
(72)【発明者】
【氏名】中島 歩
(72)【発明者】
【氏名】正木 崇生
(72)【発明者】
【氏名】土井 盛博
(72)【発明者】
【氏名】吉田 健
【審査官】藤井 美穂
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１１／１１１７８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５２５０９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１１４１８３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／０１６３５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１２－１５７２６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５２５３５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００７／０８０９１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０４６６６３４７（ＣＮ，Ａ）
【文献】現代医学，2013年，Vol.61, No.2，pp.177-184
【文献】Stem cell research & therapy，2015年，Vol.6，p.20(14 pages)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３５／００ － ３５／７６８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
無血清培地中で培養された間葉系幹細胞を含有している、生体組織損傷の修復剤であって、上記生体組織損傷は、慢性腎不全、慢性腎臓病、肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、または、非アルコール性脂肪肝炎に伴う組織損傷であり、
上記無血清培地は、（ｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、および、（ｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地であることを特徴とする修復剤。
【請求項2】
生体組織の線維化を抑制するためのものであることを特徴とする、請求項１に記載の修復剤。
【請求項3】
炎症細胞の浸潤を抑制するためのものであることを特徴とする、請求項１に記載の修復剤。
【請求項4】
マクロファージの活性を制御するためのものであることを特徴とする、請求項１に記載の修復剤。
【請求項5】
上記間葉系幹細胞は、スクリーニングされた造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１～４の何れか１項に記載の修復剤。
【請求項6】
上記間葉系幹細胞は、少なくとも１回継代されたものであることを特徴とする、請求項１～５の何れか１項に記載の修復剤。
【請求項7】
上記継代では、哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することを特徴とする、請求項６に記載の修復剤。
【請求項8】
上記間葉系幹細胞は、当該間葉系幹細胞の培養に適した培養容器を用いて培養されたものであることを特徴とする、請求項１～７の何れか１項に記載の修復剤。
【請求項9】
無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する工程を有する、生体組織損傷の修復剤の製造方法であって、上記生体組織損傷は、慢性腎不全、慢性腎臓病、肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、または、非アルコール性脂肪肝炎に伴う組織損傷であり、
上記無血清培地は、（ｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、および、（ｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地であることを特徴とする修復剤の製造方法。
【請求項10】
上記培養する工程の後に、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングする工程を有することを特徴とする、請求項９に記載の製造方法。
【請求項11】
上記培養する工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代することを特徴とする、請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項12】
上記継代では、哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項13】
上記培養する工程では、上記間葉系幹細胞の培養に適した培養容器を用いて当該間葉系幹細胞を培養することを特徴とする、請求項９～１２の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項14】
ＴＳＧ－６を含有している、生体組織損傷の修復剤であって、上記生体組織損傷は、慢性腎不全、または、慢性腎臓病に伴う組織損傷であり、
上記ＴＳＧ－６は、（ｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、および、（ｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地中で培養された間葉系細胞由来であることを特徴とする修復剤。
【請求項15】
生体組織の線維化を抑制するためのものであることを特徴とする、請求項１４に記載の修復剤。
【請求項16】
炎症細胞の浸潤を抑制するためのものであることを特徴とする、請求項１４に記載の修復剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体組織損傷の修復剤および当該修復剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪、滑膜、歯槽骨、及び歯根膜等の組織からだけでなく、胎盤、臍帯血、及び臍帯等の種々の組織からも単離することができる細胞であって、しかも生体外で培養して増殖させることができる細胞である。さらに、間葉系幹細胞は、間葉系の細胞（例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、及び軟骨細胞）だけでなく、非間葉系の細胞（例えば、神経前駆細胞、及び肝細胞）に分化可能な、多分化能を有することから、再生医療や細胞治療に用いられる細胞を製造するための原料としての利用が期待されている。
【0003】
間葉系幹細胞の培養手段として、例えばウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）を含有する培地を用いる他に、異種動物由来のタンパク質の混入が少ない無血清培地を用いる手法が挙げられる。例えば、特許文献１～３には、間葉系幹細胞の培養に用いられる無血清培養が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２００７／０８０９１９号（２００７年７月１９日公開）
【文献】国際公開第２０１１／１１１７８７号（２０１１年９月１５日公開）
【文献】国際公開第２０１５／０１６３５７号（２０１５年２月 ５日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
間葉系幹細胞が有する機能は多種多様であって、現在利用されている間葉系幹細胞の機能はその一部に過ぎず、未知の機能が多く存在することが期待されている。
【0006】
本発明の一態様は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体の組織損傷を修復するための修復剤および当該修復剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、間葉系幹細胞が生体組織損傷に及ぼす影響について鋭意検討する過程において、（１）特定の成分を含む無血清培地中で培養した間葉系幹細胞は、血清培地中で培養した間葉系幹細胞に比べて著しく高い生体組織損傷の修復効果（例えば、線維化抑制効果、炎症細胞浸潤抑制効果、マクロファージ活性制御効果）を有していること、及び（２）血清培地中において培養された間葉系幹細胞に比べ、無血清培地中において培養された間葉系幹細胞は、より高い量のＴＳＧ－６が発現していること、を見出し、本発明を完成させるに至った。
【0008】
本発明の生体組織損傷の修復剤は、上記課題を解決するために、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞を含有していることを特徴としている。
【0009】
本発明の生体組織損傷の修復剤の製造方法は、上記課題を解決するために、無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する工程を有することを特徴としている。
【0010】
本発明の生体組織損傷の修復剤は、ＴＳＧ－６（ＴＮＦ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含有しており、上記生体組織損傷は、慢性腎不全、慢性腎臓病、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン症、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、または、線維症に伴う組織損傷であることを特徴としている。
【0011】
なお、本発明の生体組織損傷の修復剤を構成する間葉系幹細胞を「無血清培地中で培養された」等の製造工程で特定している。本発明者らは、本発明に用いられる間葉系幹細胞と、従来の間葉系幹細胞（具体的には、血清培地中で培養された間葉系幹細胞）との間で、発現量が異なる遺伝子（換言すれば、遺伝子マーカー）が存在しないか、試験を行った。その結果、膨大な種類の遺伝子の発現量が異なることが明らかになったものの、これらの遺伝子のうち、何れの遺伝子が、本発明に用いられる間葉系幹細胞と従来の間葉系幹細胞とを区別する上で重要であるのか、特定するに至ったものは、ＴＳＧ－６のみであった。何れの遺伝子が、本発明に用いられる間葉系幹細胞と従来の間葉系幹細胞とを区別する上で重要であるのか特定するためには、更に、膨大な時間と労力とが必要である。それ故に、出願時において、本発明の生体組織損傷の修復剤における間葉系幹細胞を構造または特性により直接特定することが不可能である、または、実際的でない事情が存在すると結論づけた。
【発明の効果】
【0012】
本発明に用いる間葉系幹細胞は、血清培地中で培養した間葉系幹細胞に比べて著しく高い組織線維化抑制効果、炎症細胞浸潤抑制効果および炎症抑制系のマクロファージを増加させる効果を有する。また、本発明に用いる間葉系幹細胞は、ＴＳＧ－６を高発現することにより、炎症を早期に沈静化させる効果を有する。それ故に、本発明は、血清培地中で培養した間葉系幹細胞を用いた場合には実現できない、著しく高い（換言すれば、臨床現場において利用可能な程度に高い）生体組織損傷の回復効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】ＴＧＦ－β１のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【図2】（Ａ）は、ウエスタンブロット法によるＴＧＦ－β１の検出結果を示す像であり、（Ｂ）は、ＴＧＦ－β１のタンパク質の発現レベルを示すグラフである。
【図3】本発明の一実施例における蛍光免疫染色結果の像である。
【図4】α－ＳＭＡのｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【図5】（Ａ）は、ウエスタンブロット法によるα－ＳＭＡの検出結果を示す像であり、（Ｂ）は、α－ＳＭＡのタンパク質の発現レベルを示すグラフである。
【図6】（Ａ）は、本発明の一実施例における免疫染色結果の像であり、（Ｂ）は、（Ａ）に示す像の単位面積あたりのα－ＳＭＡ陽性細胞の数をカウントした結果を示すグラフである。
【図7】（Ａ）は、ＣＤ３のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフであり、（Ｂ）は、ＣＤ６８のｍＲＮＡ発現レベルを表すグラフである。
【図8】本発明の一実施例における免疫染色の結果を示す像である。
【図9】（Ａ）は、図８に示す像の単位面積あたりのＣＤ３陽性細胞の数をカウントした結果を示すグラフであり、（Ｂ）は、図８に示す像の単位面積あたりのＣＤ６８陽性細胞の数をカウントした結果を示すグラフである。
【図10】Ｍ１型マクロファージからＭ２型マクロファージへの分化誘導を示す図である。
【図11】（Ａ）は、ＣＤ１６３陽性細胞の増加を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＣＤ２０６陽性細胞の増加を示すグラフである。
【図12】（Ａ）は、ＣＤ１６３陽性細胞の増加を示すグラフであり、（Ｂ）は、ＣＤ２０６陽性細胞の増加を示すグラフである。
【図13】ＨＧＦのタンパク質の発現レベルを示すグラフである。
【図14】ＰＧＥ２のタンパク質の発現レベルを示すグラフである。
【図15】ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【図16】ＴＳＧ－６のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【図17】ＴＳＧ－６のｍＲＮＡの発現レベルを示したグラフである。
【図18】ＣＤ１６３陽性細胞の増加を示すグラフである。
【図19】（Ａ）は、ＭＣＰ－１のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフであり、（Ｂ）は、ＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【図20】ＴＳＧ－６のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【図21】（Ａ）は、ウエスタンブロット法によるＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡの検出結果を示す像であり、（Ｂ）は、ＴＧＦ－βおよびα－ＳＭＡの発現レベルを示すグラフである。
【図22】（Ａ）は、ＣＤ６８の免疫染色結果の像であり、（Ｂ）は、ＣＤ６８を発現している細胞の数を示すグラフである。
【図23】本発明の一実施例における、モデルラットの体重の推移を示すグラフである。
【図24】本発明の一実施例における、モデルラットのＬＤＨの値を示すグラフである。
【図25】本発明の一実施例における、モデルラットのγ－ＧＴＰの値を示すグラフである。
【図26】本発明の一実施例における、モデルラットのシリウスレッド染色の像を示す。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【0015】
［１－１．修復剤の製造方法］
本発明の一実施形態にかかる生体組織損傷の修復剤の製造方法（以下、「本実施形態の製造方法」ともいう。）は、無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する工程を有する方法である。
本発明の一実施形態にかかる生体組織損傷の修復剤の製造方法（以下、「本実施形態の製造方法」ともいう。）は、無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する工程を有する方法である。
【0016】
上記無血清培地の組成は、間葉系幹細胞の培養を行い得る無血清培地であれば特に限定されず、公知の無血清培地が適宜使用され得る。公知の無血清培地としては、例えばＳＴＫ１（株式会社ツーセル製）、ＳＴＫ２（株式会社ツーセル製）、ヒト間葉系幹細胞専用完全合成培地キット（ＭＳＣＧＭ－ＣＤ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）（Ｌｏｎｚａ）、間葉系幹細胞増殖培地ＤＸＦ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＤＸＦ （Ｒｅａｄｙ－ｔｏｕｓｅ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ．）、Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ ｆｒｅｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、及び、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）等を用いることができる。
【0017】
上記無血清培地の具体的な組成としては、例えば、（ｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉＶ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地を挙げることができる。
【0018】
なお、上記（ｉ）および（ｉｉｉ）の無血清培地は、ＴＧＦ－β、および／または、ＨＧＦを含有していないものであってもよい。また、上記（ｉｉ）および（ｉｖ）の無血清培地は、ＨＧＦを含有していないものであってもよい。
【0019】
上記リン脂質としては、特に限定されず、例えば、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールなどが挙げられ、これらのリン脂質を単独で用いてもよいし、組み合わせて（例えば、フォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを組み合わせて）用いてもよい。これらのリン脂質は、動物由来のものであっても、植物由来のものであってもよい。
【0020】
上記脂肪酸としては、特に限定されず、例えば、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸などが挙げられ、これらの脂肪酸を単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
【0021】
本実施形態において使用される無血清培地は、任意で、上述した組成以外の成分（例えば、コレステロール、および／または、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）など）を含有していてもよい。後述する基礎培地に対するＨＧＦの含有量は、終濃度で、０．１～５０ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍｌである。勿論、これらの成分は、本願発明にとって必須の成分ではない。
【0022】
以下に、本実施形態の製造方法をより具体的に説明する。
【0023】
（Ａ．第１工程）
本実施形態の製造方法においては、間葉系幹細胞を、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つをさらに含有する無血清培地において間葉系幹細胞を培養する（以下、第１工程と称する）。なお、無血清培地は、ＴＧＦ－β、および／または、ＨＧＦを含有していないものであってもよい。
本実施形態の製造方法においては、間葉系幹細胞を、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つをさらに含有する無血清培地において間葉系幹細胞を培養する（以下、第１工程と称する）。なお、無血清培地は、ＴＧＦ－β、および／または、ＨＧＦを含有していないものであってもよい。
【0024】
なお、無血清培地がデキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つを含有していれば、間葉系幹細胞の生存期間の延長、および間葉系幹細胞の増殖亢進という効果を奏する。
【0025】
第１工程に用いる無血清培地を構成するための基礎培地は、当該分野において周知の動物細胞用培地であれば特に限定されず、好ましい基礎培地としては、例えば、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＣＤＢ培地などが挙げられる。これらの基礎培地は、単独で使用されても、複数を混合して使用されてもよい。一実施形態において、無血清培地を構成するための基礎培地は、ＭＣＤＢとＤＭＥＭとを１：１の比率で混合した培地が好ましい。一実施形態において、上記の基礎培地に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つの脂肪酸を添加した無血清培地を第１工程に用いればよい。
【0026】
基礎培地に対するＦＧＦの含有量は、終濃度で、０．１～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは３ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するＰＤＧＦの含有量は、終濃度で、０．５～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するＥＧＦの含有量は、終濃度で、０．５～２００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは２０ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するリン脂質の総含有量は、終濃度で、０．１～３０μｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌである。基礎培地に対する脂肪酸の総含有量は、基礎培地の重量の１／１０００～１／１０であることが好ましく、さらに好ましくは１／１００である。
【0027】
基礎培地に対するデキサメタゾンの含有量は、終濃度で、１０－１０～１０－５Ｍであることが好ましく、更に好ましくは１０－９～１０－６Ｍである。基礎培地に対するインスリンの含有量は、終濃度で、０．０１～５００μｇ／ｍｌであることが好ましく、更に好ましくは０．１～５０μｇ／ｍｌである。基礎培地に対する血清アルブミンの含有量は、終濃度で、０．０１～５０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、更に好ましくは０．１～５ｍｇ／ｍｌである。
【0028】
このような無血清培地を使用することによって、無血清培地中への異種タンパク質の混入を防ぎつつ、血清含有培地と同等以上の増殖促進効果が得られ、間葉系幹細胞を所望の通り増殖させることができる。
【0029】
無血清培地が含有しているリン脂質、及び脂肪酸は、既に説明した具体的なリン脂質、及び脂肪酸であり得る。
【0030】
本明細書中で使用される場合、ＦＧＦは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＦＧＦ－２（ｂＦＧＦ）であることが好ましいが、ＦＧＦ－１など他のＦＧＦファミリーから選択されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、ＰＤＧＦは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＰＤＧＦ－ＢＢまたはＰＤＧＦ－ＡＢであることが好ましい。
【0031】
ＥＧＦは、上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図される。
【0032】
また、一実施形態において、無血清培地は、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに含有していてもよい。
【0033】
本明細書中で使用される場合、アスコルビン酸化合物は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）もしくはアスコルビン酸２リン酸、またはこれらに類似する化合物が意図される。
【0034】
１つの局面において、無血清培地は、脂質酸化防止剤を含有していることが好ましい。一実施形態において、無血清培地に含有される脂質酸化防止剤は、ＤＬ－α－トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であり得る。無血清培地は、界面活性剤をさらに含有していてもよい。一実施形態において、無血清培地に含有される界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８またはＴｗｅｅｎ ８０であり得る。
【0035】
無血清培地は、インスリン、トランスフェリン、デキサメタゾン、血清アルブミンおよびセレネートをさらに含有していてもよい。本明細書中で使用される場合、インスリンは、インスリン様増殖因子であってもよく、天然の細胞由来であっても、遺伝子組換えによって製造されたものでもよい。
【0036】
第１工程においては、上述した無血清培地に、ヒト等の動物組織から従来公知の方法により単離された間葉系幹細胞を播種し、所望の細胞数に増殖するまで培養する（勿論、第１工程においては、間葉系幹細胞を増殖させることなく、無血清培地中に維持するのみであってもよい）。培養条件として、培地１ｍｌに対して、１～５００ｍｇの組織片（間葉系幹細胞を含む）から分離した間葉系幹細胞を播種することが好ましく、培養温度は３７℃±１℃、かつ５％ＣＯ２下であることが好ましい。なお、培養時間は、間葉系幹細胞が目的とする濃度に達する培養時間であれば、特に限定されない。例えば、培養時間は、１～５時間であってもよいし、１～１０時間であってもよいし、１～２０時間であってもよいし、１時間～１日間であってもよいし、１時間～１０日間であってもよいし、１時間～３０日間であってもよいし、１時間～５０日間であってもよいし、１時間～６０時間であってもよいし、１時間～７０時間であってもよいし、３０時間～７０時間であってもよいし、４０時間～７０時間であってもよいし、５０時間～７０時間であってもよい。
【0037】
第１工程に供される間葉系幹細胞に特に制限はないが、初期の間葉系幹細胞、すなわち、ヒト等の動物組織から採取してから一度も継代培養を経ていない細胞であることが好ましい。
【0038】
また、第１工程において間葉系幹細胞をより効率よく増殖させるために、第１工程において培養させる対象となる間葉系幹細胞（以下、「第１工程対象細胞」ともいう）毎に、培養に適した培養容器を用いて第１工程を行うことが好ましい。第１工程対象細胞の培養に適した培養容器の選択方法としては、例えば、最適な培養容器を第１工程対象細胞に選択させる方法を挙げることができる。具体的に説明すると、複数種類の培養容器を準備し、培養容器の種類が異なる以外は同一の培養条件で第１工程対象細胞を増殖させ、培養開始から２週間後の細胞数を公知の方法によって計測し、細胞数が多いものから順に第１工程対象細胞の培養に適した培養容器であると判断することができる。また、上記第１工程対象細胞の増殖速度が速い場合は、培養開始から２週間経過する前であっても、コンフルエント状態の８０～９０％の細胞数に達する期間が短いものから順に第１工程対象細胞の培養に適した培養容器であると判断することができる。
【0039】
本実施形態の製造方法の第１工程においては、第１工程対象細胞の増殖に適した培養容器が既に明らかになっている場合は、その培養容器を用いればよい。これに対して、第１工程対象細胞の培養に適した培養容器が明らかになっていない等の場合には、本実施形態の製造方法は、第１工程対象細胞の培養に適した培養容器を選択するための「培養容器選択工程」を第１工程の前にさらに包含していてもよい。
【0040】
なお、間葉系幹細胞の増殖には、細胞が培養容器に接着することが必須条件であるので、培養容器に対する間葉系幹細胞の接着が弱い場合は、第１工程において、上記無血清培地に、細胞接着分子をさらに含有させることが好ましい。上記「細胞接着分子」としては、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン等を挙げることができる。これらの細胞接着分子は、一種類を単独で用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。
【0041】
また、第１工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代してもよい。間葉系幹細胞は足場依存的に増殖するので、間葉系幹細胞が局所的に偏って増殖している等の場合に、前第１工程の途中で間葉系幹細胞を継代することによって培養条件を改善することができる。なお、培養第１工程は、初代培養（Ｐ０）～継代３回目（Ｐ３）までの期間行うことが好ましい。
【0042】
間葉系幹細胞の継代方法としては特に限定されず、従来公知の間葉系幹細胞の継代方法を用いて継代することできる。継代後の間葉系幹細胞の状態が良好であることから、上記第１工程では、継代を行う場合に哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することが好ましい。上記「哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤」としては、例えば、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｉｎｃ.）を挙げることができる。
【0043】
ここで、上記「哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤」としてＡＣＣＵＴＡＳＥを用いる場合の継代方法の一例を説明する。（ｉ）～（ｖｉ）の手順によって間葉系幹細胞を剥離し、継代する。なお、以下に説明する継代方法では、培養容器としてＴ－２５フラスコ（ファルコン製）を用いた場合について説明する。
【0044】
（ｉ）フラスコ上の細胞層をＰＢＳ（－）５ｍＬを用いて洗浄する。
【0045】
（ｉｉ）細胞層にＡＣＣＵＴＡＳＥを２ｍＬ添加する。
【0046】
（ｉｉｉ）細胞層を室温にて２分程度静置し、フラスコからの細胞の剥離を確認のうえ、遠心管に剥離した細胞を含むＰＢＳ（－）を移す。
【0047】
（ｉｖ）フラスコにＰＢＳ（－）を７ｍＬ添加し、当該フラスコの底面をリンスする。
【0048】
（ｖ）上記（ｉｉｉ)の遠心管に上記（ｉｖ）の溶液を移し、１５００ｒｐｍ（２００～１０００×ｇ）で５分間遠心する。
【0049】
（ｖｉ）遠心管から上清を除き、５，０００個－細胞／ｃｍ２の播種濃度にて、無血清培地を用いて、細胞を新しいフラスコ上に播種する。
【0050】
（Ｂ．第２工程）
本実施形態の製造方法は、上記第１工程の後に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つをさらに含有する無血清培地において、間葉系幹細胞を培養する第２工程をさらに有していてもよい。なお、無血清培地は、ＨＧＦを含有していないものであってもよい。
本実施形態の製造方法は、上記第１工程の後に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか１つをさらに含有する無血清培地において、間葉系幹細胞を培養する第２工程をさらに有していてもよい。なお、無血清培地は、ＨＧＦを含有していないものであってもよい。
【0051】
ここで、第２工程における「無血清培地」は、ＴＧＦ－βを含有する点で、第１工程の項で説明した無血清培地とは異なる。本明細では第１工程で使用する無血清培地を「無血清培地Ａ」と称し、第２工程で使用する無血清培地を「無血清培地Ｂ」と称する場合がある。ＴＧＦ－β以外の成分（ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つの脂肪酸など）および基礎培地については、上記第１工程の項で無血清培地Ａに関して説明したとおりであるので、ここでは説明を省略する。また、第２工程で使用する無血清培地Ｂに含有されている上記成分の含有量は、無血清培地Ａに関して説明した含有量と同じであり得る。
【0052】
一実施形態において、上記の基礎培地に対するＴＧＦ－βの含有量は、終濃度で、０．５～１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【0053】
第２工程においては、上述した無血清培地Ｂに、第１工程により得られた間葉系幹細胞を播種し、所望の数に増殖するまで培養する（勿論、第２工程においては、間葉系幹細胞を増殖させることなく、無血清培地Ｂ中に維持するのみであってもよい）。培養条件として、培地１ｍｌに対して１～２×１０４個の間葉系幹細胞を播種することが好ましく、培養温度は３７℃±１℃、かつ５％ＣＯ２下であることが好ましい。なお、細胞培養時間は、目的とする細胞の濃度が十分に得られる培養時間であれば、特に限定されない。例えば、培養時間は、１～５時間であってもよいし、１～１０時間であってもよいし、１～２０時間であってもよいし、１時間～１日間であってもよいし、１時間～１０日間であってもよいし、１時間～３０日間であってもよいし、１時間～５０日間であってもよいし、１時間～６０時間であってもよいし、１時間～７０時間であってもよいし、３０時間～７０時間であってもよいし、４０時間～７０時間であってもよいし、５０時間～７０時間であってもよい。このように培養することによって、生体組織損傷の回復能を維持又は向上した間葉系幹細胞を効率よく大量に得ることができる。
【0054】
第２工程では、培養に用いる培養容器は、間葉系幹細胞が増殖し得るものであれば特に限定されない。例えば、ファルコン社製７５ｃｍ２フラスコ、住友ベークライト社製７５ｃｍ２フラスコ等を好適に用いることができる。但し、細胞によっては、用いる培養容器の種類によって細胞の培養が影響を受ける場合がある。このため、間葉系幹細胞をより効率よく培養させるために、培養させる対象となる間葉系幹細胞（以下、「培養対象細胞」ともいう）毎に、培養に適した培養容器を用いて第２工程を行うことが好ましい。第２工程対象細胞の増殖に適した培養容器の選択方法としては、上記「第１工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0055】
また、培養容器に対する間葉系幹細胞の接着が弱い場合には、上記無血清培地Ｂに、細胞接着分子をさらに含有させてもよい。上記細胞接着分子については、上記「第１工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0056】
第２工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代してもよい。第２工程の途中で間葉系幹細胞を継代することによって培養条件を改善することができる。
【0057】
なお、第２工程には、ヒト等の動物組織から採取してから継代１回目（Ｐ１）以降の間葉系幹細胞を供することが好ましい。
【0058】
前第１工程の途中で間葉系幹細胞を継代する方法および第１工程後の細胞を第２工程に供する際の継代方法については、上記「第１工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0059】
本実施の形態の製造方法は、上記第２工程の前（または上記第１工程の前）に、間葉系幹細胞の増殖に適した培養容器を選択する培養容器選択工程をさらに包含していてもよい。間葉系幹細胞の増殖に適した培養容器の選択方法としては、上記「第１工程」の項で説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0060】
上述したように、本実施の形態の製造方法は、第１工程、及び、第２工程を有し得るが、本発明は、これに限定されない。例えば、本実施の形態の製造方法は、第１工程及び第２工程のうちの、第１工程のみを有する方法であってもよいし、第２工程のみを有する方法であってもよい。
【0061】
（Ｃ．スクリーニング工程）
本実施形態の製造方法は、第１工程および／または第２工程の後に、間葉系幹細胞から、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングするスクリーニング工程をさらに包含していてもよい。
本実施形態の製造方法は、第１工程および／または第２工程の後に、間葉系幹細胞から、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングするスクリーニング工程をさらに包含していてもよい。
【0062】
スクリーニング工程にて選別した間葉系幹細胞を修復剤として使用することによって、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞を含有している修復剤を実現することができ、修復剤の安全性を向上させることができる。
【0063】
スクリーニング工程では、間葉系幹細胞の造腫瘍性について、ｉｎ ｖｉｖｏの高感度免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）による造腫瘍性試験法により検討することが可能である。
【0064】
具体的には、上述した無血清培地で培養した間葉系幹細胞（例えば、１,０００,０００個）、および、Ｈｅｌａ細胞（例えば、１,０００個）を、各々、ＮＯＧマウスの皮下１０ヵ所に移植する。このとき、Ｈｅｌａ細胞の造腫瘍性（具体的には、移植箇所における腫瘍の発生）が確認できる条件下（例えば、特定のマウス飼育時間など）において、無血清培地で培養した間葉系幹細胞の造腫瘍性が確認できなければ、当該間葉系幹細胞は、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞であると判定することができる。
【0065】
［１－２．生体組織損傷の修復剤]
本発明の一実施形態にかかる生体組織損傷の修復剤（以下「本実施形態の修復剤」という。）は、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞を含有していることを特徴としている。
本発明の一実施形態にかかる生体組織損傷の修復剤（以下「本実施形態の修復剤」という。）は、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞を含有していることを特徴としている。
【0066】
ここで、本実施形態の修復剤は、生体組織損傷の回復を促進する効果を有する薬剤を意図する。本実施形態の修復剤は、生体組織の線維化を抑制するための薬剤（換言すれば、線維化抑制剤）であるともいえ、また炎症細胞の浸潤を抑制するための薬剤（換言すれば、炎症細胞の浸潤抑制剤）であるともいえ、マクロファージの活性を制御するための薬剤（換言すれば、マクロファージ活性制御剤）であるともいえる。
【0067】
ここで「生体組織の線維化を抑制する」とは、結合組織の異常増殖あるいは結合組織でのコラーゲンの異常蓄積による組織硬化を抑制することを意図する。例えば、生体組織が損傷を受けると、治癒の過程において、生体組織を構成する結合組織が異常増殖する場合がある。「生体組織の線維化を抑制する」とは、例えば、生体組織が損傷を受けた後に、生体組織を構成する結合組織が異常増殖、あるいは結合組織でのコラーゲンの異常蓄積による組織硬化を抑制することを意図する。
【0068】
ここで「炎症細胞の浸潤を抑制する」とは、炎症細胞（例えば、マクロファージ、リンパ球、及び好中球など）が、組織を破壊すること、または、組織の中に侵入して増殖することを抑制することを意図する。
【0069】
ここで「マクロファージ活性を制御する」とは、マクロファージの表現型を変化させることを意図する。「マクロファージ活性を制御する」とは、例えば、マクロファージを、組織の炎症を促進するＰｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ１型）マクロファージから、Ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ２型）マクロファージへ変化させることを意図する。マクロファージをＭ１型からＭ２型へ変化させることにより、組織の炎症を鎮静化させることができる。
【0070】
また、上記修復剤には、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞が含まれる。なお、本明細書中において、「無血清培地」とは、血清を含まない培地、換言すれば血清を一切添加されずに調製された培地であることが意図される。また「無血清培養」とは、無血清培地を用いた培養であることが意図される。また、間葉系幹細胞を培養する場合には、単一の無血清培地中でのみ間葉系幹細胞を培養してもよいし、複数の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養してもよい。複数の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する場合には、例えば、所望の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養した後、当該所望の無血清培地を別の無血清培地に置換して、更に、当該別の無血清培地中で間葉系幹細胞を培養してもよい。
【0071】
上記無血清培地の組成は、間葉系幹細胞の培養を行い得る無血清培地であれば特に限定されなく、公知の無血清培地が適宜使用され得る。公知の無血清培地としては、例えばＳＴＫ１（株式会社ツーセル製）、ＳＴＫ２（株式会社ツーセル製）、ヒト間葉系幹細胞専用完全合成培地キット（ＭＳＣＧＭ－ＣＤ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ）（Ｌｏｎｚａ）、間葉系幹細胞増殖培地ＤＸＦ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ＤＸＦ （Ｒｅａｄｙ－ｔｏｕｓｅ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ．）、Ｓｔｅｍ Ｐｒｏ ＭＳＣ ＳＦＭ Ｘｅｎｏ ｆｒｅｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）、及びＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｍｅｄｉｕｍ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）等を用いることができる。
【0072】
上記無血清培地の具体的な組成としては、例えば、（ｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、及び（ｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉｉｉ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地、（ｉＶ）ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、デキサメタゾン、インスリン、血清アルブミン、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地を挙げることができる。
【0073】
上記リン脂質としては、特に限定されず、例えば、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン、及びフォスファチジルグリセロールなどが挙げられ、これらのリン脂質を単独で用いてもよいし、組み合わせて（例えば、フォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを組み合わせて）用いてもよい。これらのリン脂質は、動物由来のものであっても、植物由来のものであってもよい。
【0074】
上記脂肪酸としては、特に限定されず、例えば、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸などが挙げられ、これらの脂肪酸を単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。
【0075】
本実施形態において使用される無血清培地は、任意で、上述した組成以外の成分（例えば、コレステロール、ＨＧＦなど）を含有していてもよい。勿論、これらの成分は、本願発明にとって必須の成分ではない。
【0076】
本実施形態において使用される無血清培地における各種組成の濃度は、上述した［１－１］の項にて説明したので、ここではその説明を省略する。
【0077】
本実施形態の修復剤に用いられる間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、滑膜、歯槽骨、及び歯根膜等の組織から単離された間葉系幹細胞だけでなく、胎盤、臍帯血、及び臍帯等の組織から単離された間葉系幹細胞をも包含する。また、本実施の形態の修復剤に用いられる間葉系幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞（例えば、採取されたヒト間葉系幹細胞）であってもよいし、ラット、及びマウス等の非ヒト動物由来の間葉系幹細胞であってもよい。
【0078】
上記修復剤が治療対象とする生体組織は、特に限定されず、例えば、腎臓、肝臓、肺、皮膚、軟骨、骨、脊髄、歯、関節、血管（動脈、および、静脈）、心臓、脳、顎、口、目、角膜、および、咽頭を挙げることができる。つまり、上記修復剤は、これらの生体組織の損傷を修復するものであり得る。
【0079】
上記修復剤が効能を奏する、生体組織損傷を伴う疾患としては、特に限定されない。疾患として、例えば、慢性腎不全、慢性腎臓病、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン症、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、または、線維症等が挙げられる。
【0080】
本実施形態の修復剤は、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞からなる薬剤であってもよいが、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞の他に薬学的に許容される添加剤（例えば、緩衝剤、酸化防止剤、増粘剤、及び、賦形剤）を含み得る。
【0081】
上記添加剤の量は、特に限定されないが、例えば、本実施形態の修復剤の０．０１～５０重量％、０．０１～４０重量％、０．０１～３０重量％、０．０１～２０重量％、０．０１～１０重量％、または、０．０１～１重量％であり得る。
【0082】
本実施形態の修復剤に含まれる間葉系幹細胞の数は、特に限定されず、投与対象の体重に応じて適宜設定することが可能である。例えば、１服（１投与）あたり、１×１０２細胞～１×１０１０細胞、１×１０３細胞～１×１０１０細胞、１×１０４細胞～１×１０１０細胞、１×１０５細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞であり得る。勿論、１服（投与）あたり、１０１０細胞以上であってもよい。
【0083】
上記修復剤の投与方法として、例えば、静脈注射、動脈注射、及び局所（脊髄（例えば、脊髄腔）、筋肉、関節、脳等）への注射が挙げられる。これらの投与方法のうち、カテーテルを用いた局所近傍の動脈への投与方法であれば、投与に必要な細胞数を減少できるという有利な効果を奏する。
【0084】
本発明の一実施形態に係る生体組織損傷の修復剤の投与対象は、特に限定されない。上記投与対象として、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラットなど）が挙げられる。
【0085】
本実施形態の修復剤の投与量は、特に限定されないが、投与対象の体重１ｋｇあたりに投与される間葉系幹細胞の数が、１×１０２細胞～１×１０１０細胞、１×１０３細胞～１×１０１０細胞、１×１０４細胞～１×１０１０細胞、１×１０５細胞～１×１０１０細胞、１×１０６細胞～１×１０１０細胞になる量であり得る。
【0086】
［１－３．生体組織損傷の修復剤－２]
本実施形態の修復剤は、ＴＮＦ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＧ－６）を有効成分として含有していることを特徴としている。
本実施形態の修復剤は、ＴＮＦ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＧ－６）を有効成分として含有していることを特徴としている。
【0087】
本発明者は、血清培地中において培養された間葉系幹細胞に比べ、無血清培地中において培養された間葉系幹細胞は、より高い量のＴＳＧ－６が発現していることを見出した。さらに、本発明者は、ＴＳＧ－６が様々な疾患（特に腎臓における疾患）において抗炎症作用を有することを新規に見出した。本実施形態の修復剤によれば、例えば、（ｉ）炎症細胞の浸潤を、早期から抑制することができ、（ｉｉ）炎症を早期に鎮静化させることができ、および／または、（ｉｉｉ）生体組織の線維化を抑制することができる。
【0088】
本実施形態の修復剤は、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞由来のＴＳＧ－６（より具体的には、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞自体）を含んでいることが好ましい。なお、間葉系幹細胞由来のＴＳＧ－６を含む修復剤についての詳細な説明は、［１－２．生体組織損傷の修復剤]に説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0089】
本実施形態の修復剤は、生体組織損傷の回復を促進する効果を有する薬剤を意図する。本実施形態の修復剤は、生体組織の線維化を抑制するための薬剤（換言すれば、線維化抑制剤）であってもよいし、炎症細胞の浸潤を抑制するための薬剤（換言すれば、炎症細胞の浸潤抑制剤）であってもよい。
【0090】
ここで、「生体組織の線維化を抑制する」および「炎症細胞の浸潤を抑制する」とは、［１－２．生体組織損傷の修復剤]に説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0091】
本実施形態の修復剤には、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞が含まれ得る。無血清培地の組成および濃度、間葉系幹細胞の種類等については、［１－２．生体組織損傷の修復剤]に説明したとおりであるのでここでは説明を省略する。
【0092】
上記修復剤が治療対象とする生体組織は、特に限定されず、例えば、腎臓、肝臓、肺、皮膚、軟骨、骨、脊髄、歯、関節、血管（動脈、および、静脈）、心臓、脳、顎、口、目、角膜、および、咽頭を挙げることができる。つまり、上記修復剤は、これらの生体組織の損傷を修復するものであり得る。
【0093】
上記修復剤が効能を奏する、生体組織損傷を伴う疾患としては、特に限定されない。疾患として、例えば、慢性腎不全、慢性腎臓病、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン症、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、または、線維症等が挙げられる。
【0094】
本実施形態の修復剤は、ＴＳＧ－６（または、ＴＳＧ－６を高発現している、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞）からなる薬剤であってもよいが、ＴＳＧ－６（または、ＴＳＧ－６を高発現している、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞）の他に、薬学的に許容される添加剤（例えば、緩衝剤、酸化防止剤、増粘剤、及び、賦形剤）を含み得る。
【0095】
本実施の形態の修復剤に含有されている添加剤の量は、特に限定されず、例えば、修復剤を１００重量％とした場合に、０重量％～９９．９９９重量％であってもよく、０重量％～９９．９９重量％であってもよく、０重量％～９９．９重量％であってもよく、５重量％～９９．９重量％であってもよく、１０重量％～９９．９重量％であってもよく、２０重量％～９９．９重量％であってもよく、３０重量％～９９．９重量％であってもよく、４０重量％～９９．９重量％であってもよく、５０重量％～９９．９重量％であってもよく、６０重量％～９９．９重量％であってもよく、７０重量％～９９．９重量％であってもよく、８０重量％～９９．９重量％であってもよく、９０重量％～９９．９重量％であってもよい。
【0096】
上記修復剤の投与方法として、例えば、静脈注射、動脈注射、及び局所（脊髄（例えば、脊髄腔）、筋肉、関節、脳等）への注射が挙げられる。これらの投与方法のうち、カテーテルを用いた局所近傍の動脈への投与方法であれば、投与に必要な修復剤の量を減少できるという有利な効果を奏する。
【0097】
本実施形態に係る生体組織損傷の修復剤の投与対象は、特に限定されない。上記投与対象として、ヒトおよびヒト以外の哺乳類（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラットなど）が挙げられる。
【0098】
ＴＳＧ－６は、天然のタンパク質であっても良いし、合成されたタンパク質であっても良いし、組み換えタンパク質であってもよい。
【0099】
本実施形態の修復剤に含有されているＴＳＧ－６の量は、特に限定されず、例えば、修復剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％～１００重量％であってもよく、０．０１重量％～１００重量％であってもよく、０．１重量％～１００重量％であってもよく、０．１重量％～９５重量％であってもよく、０．１重量％～９０重量％であってもよく、０．１重量％～８０重量％であってもよく、０．１重量％～７０重量％であってもよく、０．１重量％～６０重量％であってもよく、０．１重量％～５０重量％であってもよく、０．１重量％～４０重量％であってもよく、０．１重量％～３０重量％であってもよく、０．１重量％～２０重量％であってもよく、０．１重量％～１０重量％であってもよい。
【0100】
本発明は、以下のように構成することも可能である。
【0101】
本発明の生体組織損傷の修復剤は、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞を含有していることを特徴としている。
【0102】
本発明の修復剤は、生体組織の線維化を抑制するためのものであることが好ましい。
【0103】
本発明の修復剤は、炎症細胞の浸潤を抑制するためのものであることが好ましい。
【0104】
本発明の修復剤は、マクロファージの活性を制御するためのものであることが好ましい。
【0105】
本発明の修復剤では、上記無血清培地は、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有しているものであることが好ましい。
【0106】
本発明の修復剤では、上記生体組織損傷は、慢性腎不全、慢性腎臓病、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群（ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＲＤＳ）、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＭＳ）、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｄｅｓ、ＳＬＥ）、クローン症、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、または、線維症に伴う組織損傷であることが好ましい。
【0107】
本発明の修復剤では、上記間葉系幹細胞は、スクリーニングされた造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞であることが好ましい。
【0108】
本発明の修復剤では、上記間葉系幹細胞は、少なくとも１回継代されたものであることが好ましい。
【0109】
本発明の修復剤では、上記継代にて、哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することが好ましい。
【0110】
本発明の修復剤では、上記間葉系幹細胞は、当該間葉系幹細胞の培養に適した培養容器を用いて培養されたものであることが好ましい。
【0111】
本発明の生体組織損傷の修復剤の製造方法は、無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する工程を有することを特徴としている。
【0112】
本発明の生体組織損傷の修復剤の製造方法では、上記無血清培地は、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有しているものであることが好ましい。
【0113】
本発明の生体組織損傷の修復剤の製造方法は、上記培養する工程の後に、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングする工程を有することが好ましい。
【0114】
本発明の生体組織損傷の修復剤の製造方法は、上記培養する工程では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代することが好ましい。
【0115】
本発明の生体組織損傷の修復剤の製造方法は、上記継代では、哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することが好ましい。
【0116】
本発明の生体組織損傷の修復剤の製造方法は、上記培養する工程では、上記間葉系幹細胞の培養に適した培養容器を用いて当該間葉系幹細胞を培養することが好ましい。
【0117】
本発明の生体組織損傷の修復剤は、ＴＳＧ－６（ＴＮＦ－ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ６ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含有しており、上記生体組織損傷は、慢性腎不全、慢性腎臓病、肝硬変、肺線維症、熱傷、間質性肺炎、薬剤性肺炎、放射線肺臓炎、慢性閉塞性肺疾患、急性呼吸促進症候群、軟骨損傷、骨欠損、脊髄損傷、歯周病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン症、糖尿病、動脈硬化、心筋梗塞、脳卒中、アルツハイマー病、黄斑変性症、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎、顎骨再建、口蓋裂、骨置換材、骨欠損、骨系統疾患、ドライアイ、角膜障害、咽頭炎、関節炎、癌、または、線維症に伴う組織損傷であることを特徴としている。
【0118】
本発明の生体組織損傷の修復剤は、生体組織の線維化を抑制するためのものであることが好ましい。
【0119】
本発明の生体組織損傷の修復剤は、炎症細胞の浸潤を抑制するためのものであることが好ましい。
【実施例】
【0120】
（実施例１）
無血清培地で培養した間葉系幹細胞の移植による腎臓線維化の抑制効果に係る検討を行った。
無血清培地で培養した間葉系幹細胞の移植による腎臓線維化の抑制効果に係る検討を行った。
【0121】
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（６～７週齢）の大腿骨または脛骨から、周知の方法（例えば、Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｅｓｅｎｃｈｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ＴＧＦ－β ｓｉｇｎａｌｉｎｇ” Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ, ２０１３， ｐ１－１１参照）にしたがって間葉系幹細胞を分離した。
【0122】
分離した間葉系幹細胞を、無血清培地ＳＴＫ１（株式会社ツーセル製：「ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地」に対応）または、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｏｒｉｃｈ社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて、７日間初代培養した。
【0123】
その後、無血清培地ＳＴＫ１で初代培養した間葉系幹細胞は、無血清培地ＳＴＫ２（株式会社ツーセル製：「ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、少なくとも１つのリン脂質、及び、少なくとも１つの脂肪酸を含有している無血清培地に対応」）中で、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地中で初代培養した間葉系幹細胞は、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて、１２日間培養した。また、継代にはＡＣＣＵＴＡＳＥを用いた。
【0124】
次に、腎臓の線維化モデルとして一般的なラットの一側尿管結紮モデルを作製した。作製手段は、公知の手段により行った（例えば、Ｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， “Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＥＲＫ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｅｃｅｄｅｓ ｔｕｂｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｏｂｓｔｒｕｃｔｅｄ ｒａｔ ｋｉｄｎｅｙ” Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｖｏｌ．６３（２００３）， ｐ１２５６－１２６４）。
【0125】
尿管を結紮した日から４日後に、ＳＴＫ２を用いて培養した間葉系幹細胞、または、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて培養した間葉系幹細胞を、それぞれについて５×１０６個を、一側尿管結紮モデルラットの尾静脈へ投与した。このとき、コントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）を上記と同様に一側尿管結紮モデルラットの尾静脈へ投与した。間葉系幹細胞を投与してから３日後、および６日後において、上記一側尿管結紮モデルラットを屠殺後、腎臓を採取した。
【0126】
採取された腎臓細胞において、線維化の指標であるＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡの発現レベルを確認し、線維化抑制効果の評価を行った。
【0127】
ｍＲＮＡの発現レベルは、周知のリアルタイムＰＣＲ法のプロトコールに基づいて確認した。また、タンパク質の発現レベルは、周知のウエスタンブロット法のプロトコールに基づいて確認した。また、蛍光免疫染色は、市販の抗体を用いて、周知のプロトコールに基づいて行った。
【0128】
図１～９中における「ｓｈａｍ」は「偽手術」を、「ＰＢＳ」は「ＰＢＳを投与した場合の試験結果」を、「１０％ＭＳＣｓ」は「１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地において培養した間葉系幹細胞を投与した場合の試験結果」を、「ＳＦ－ＭＳＣｓ」は「無血清培地ＳＴＫ２において培養した間葉系幹細胞を投与した場合の試験結果」を意図する。
【0129】
なお、図１～図３の試験結果は、「ｎ＝５～６」、「＊：Ｐ＜０．０５」、「♯：Ｐ＜０．０１」、及び「観察倍率２００倍」の条件下にて得られたものである。図４～図６の試験結果は、「ｎ＝５～６」、「＊：Ｐ＜０．０５」、「♯：Ｐ＜０．０１」、及び「観察倍率２００倍」の条件下にて得られたものである。図７～図９の試験結果は、「ｎ＝５～６」、「＊：Ｐ＜０．０５」、及び「♯：Ｐ＜０．０１」の条件下にて得られたものである。図１０～図１１の試験結果は、「ｎ＝６」、「＊：Ｐ＜０．０５」、及び「♯：Ｐ＜０．０１」の条件下にて得られたものである。
【0130】
図１は、ラットへの間葉系幹細胞投与３日後（Ｄａｙ３）、および６日後（Ｄａｙ６）におけるＴＧＦ－β１のｍＲＮＡ発現レベルを表すグラフである。Ｄａｙ３のグラフに示される通り、コントロールのＰＢＳを投与した場合に比べ、１０％ＭＳＣｓを投与した場合には、ＴＧＦ－β１のｍＲＮＡ発現レベルが低下した。更に、１０％ＭＳＣｓを投与した場合に比べ、ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した場合には、ＴＧＦ－β１のｍＲＮＡ発現レベルが、著しく低下した。上記結果は、Ｄａｙ６においても同様の結果であった。
【0131】
図２（Ａ）は、ウエスタンブロット法によるＴＧＦ－βに対する試験の結果を示す。１０％ＭＳＣｓを投与した場合に比べ、ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した場合には、ＴＧＦ－β１のタンパク質発現レベルが、より低下した。図２（Ｂ）は、ＴＧＦ－β１のタンパク質発現レベルを示すグラフである。コントロールのＰＢＳを投与した場合に比べ、１０％ＭＳＣｓを投与した場合には、ＴＧＦ－β１のタンパク質発現レベルが低下した。更に、１０％ＭＳＣｓを投与した場合に比べ、ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した場合には、ＴＧＦ－β１のタンパク質発現レベルが、著しく低下した。
【0132】
図３は、本発明の一実施例における蛍光免疫染色結果の像である。ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した場合は、ＴＧＦ－β１の発現が著しく抑制された。
【0133】
図４は、α－ＳＭＡのｍＲＮＡ量を示すグラフである。ＴＧＦ－β１の結果と同様に、ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した場合において、Ｄａｙ３において、α－ＳＭＡの発現が著しく抑制されていた。Ｄａｙ６においても、上記と同様の結果であった。
【0134】
図５は、ウエスタンブロット法によるα－ＳＭＡに対する試験の結果を示す。Ｄａｙ３およびＤａｙ６において、ＳＦ－ＭＳＣｓをラットへ投与した場合に、α－ＳＭＡのタンパク質発現レベルが最も低かった。図５（Ｂ）は、α－ＳＭＡのタンパク質量を定量化したグラフである。Ｄａｙ３、Ｄａｙ６の双方において、ＳＦ－ＭＳＣｓをラットへ投与した場合に、α－ＳＭＡ量が著しく減少していた。
【0135】
図６（Ａ）は、本発明の一実施例における免疫染色結果の像である。
【0136】
図６（Ｂ）は、図６（Ａ）に示す像の単位面積あたりのα－ＳＭＡ陽性細胞の数をカウントした結果である。図６（Ａ）及び図６（Ｂ）から明らかなように、α－ＳＭＡ陽性細胞の数はＳＦ－ＭＳＣｓをラットに投与した場合に、著しく少なかった。
【0137】
図１～図６の結果から、血清培地に比べて、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、著しく高い線維化の抑制効果を奏することが示された。つまり、血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、線維化の抑制効果が低く、薬剤として用いるには不十分であった。一方、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、線維化の抑制効果が著しく高く、薬剤として用いるに十分であった。
【0138】
（実施例２）
無血清培地で培養した間葉系幹細胞移植による炎症細胞浸潤の抑制効果を調べた。細胞培養条件、及び手法等は、実施例１に記載した通りに行った。Ｔリンパ球の指標であるＣＤ３およびマクロファージの指標であるＣＤ６８を用いて、尿管を結紮したラットの腎臓における炎症細胞浸潤の評価を行った。
無血清培地で培養した間葉系幹細胞移植による炎症細胞浸潤の抑制効果を調べた。細胞培養条件、及び手法等は、実施例１に記載した通りに行った。Ｔリンパ球の指標であるＣＤ３およびマクロファージの指標であるＣＤ６８を用いて、尿管を結紮したラットの腎臓における炎症細胞浸潤の評価を行った。
【0139】
図７（Ａ）は、ラットへの間葉系幹細胞投与３日後（Ｄａｙ３）、および６日後（Ｄａｙ６）における、ＣＤ３およびＣＤ６８のｍＲＮＡ発現レベルを表すグラフである。Ｄａｙ３のグラフに示される通り、コントロールのＰＢＳを投与した場合に比べ、１０％ＭＳＣｓを投与した場合には、ＣＤ３のｍＲＮＡ発現レベルが低下した。更に、１０％ＭＳＣｓを投与した場合に比べ、ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した場合には、ＣＤ３のｍＲＮＡ発現レベルが著しく低下した。
【0140】
図７（Ｂ）は、ラットへの間葉系幹細胞投与３日後（Ｄａｙ３）、および６日後（Ｄａｙ６）における、ＣＤ６８のｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。Ｄａｙ３、及びＤａｙ６の何れにおいても、コントロールのＰＢＳを投与した場合に比べ、１０％ＭＳＣｓを投与した場合には、ＣＤ６８のｍＲＮＡ発現レベルが低下した。更に、１０％ＭＳＣｓを投与した場合に比べ、ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した場合には、ＣＤ６８のｍＲＮＡ発現レベルが著しく抑制されていた。
【0141】
図８は、本発明の一実施例における免疫染色の結果を示す像である。当該像の中に見られる黒い点が、ＣＤ３およびＣＤ６８が発現している箇所を示している。ＣＤ３およびＣＤ６８の何れにおいても、ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した場合には、他を投与した場合に比べ、ＣＤ３およびＣＤ６８の発現が著しく抑制されていた。
【0142】
図９は、図８に示す像の単位面積あたりのＣＤ３およびＣＤ６８陽性細胞の数をカウントした結果を示す。図８の結果同様、ＣＤ３およびＣＤ６８における陽性細胞の数はＳＦ－ＭＳＣｓをラットに投与した場合に、著しく少なかった。
【0143】
図７～図９の結果より、血清培地に比べて、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、著しく高い炎症細胞の浸潤抑制効果を奏することが示された。つまり、血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、炎症細胞の浸潤抑制効果が低く、薬剤として用いるには不十分であった。一方、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、炎症細胞の浸潤抑制効果が著しく高く、薬剤として用いるに十分であった。
【0144】
（実施例３）
無血清培地で培養した骨髄由来間葉系幹細胞による、マクロファージの活性制御能を評価した。
無血清培地で培養した骨髄由来間葉系幹細胞による、マクロファージの活性制御能を評価した。
【0145】
ヒト単芽球様細胞（ＴＨＰ－１）を培養後、当該細胞をＰＭＡ１６０ｎＭで４８時間刺激し、Ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ１）マクロファージへ分化させた。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ：Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ））を、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地（１０％ＭＳＣｓ）、または無血清培地ＳＴＫ２（ＳＦ－ｈＭＳＣｓ）で培養し、ＴＨＰ－１との共培養実験（トランスウェル実験)に使用した。
【0146】
＜共培養条件＞
１０％ＭＳＣｓおよびＳＦ－ｈＭＳＣｓを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍを用いてＴＨＰ－１と共培養した。共培養７２時間後にＴＨＰ－１を回収し、Ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ２）マクロファージのマーカーであるＣＤ１６３およびＣＤ２０６の発現をＦＡＣＳ法にて定量した。
１０％ＭＳＣｓおよびＳＦ－ｈＭＳＣｓを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍを用いてＴＨＰ－１と共培養した。共培養７２時間後にＴＨＰ－１を回収し、Ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ２）マクロファージのマーカーであるＣＤ１６３およびＣＤ２０６の発現をＦＡＣＳ法にて定量した。
【0147】
図１０は、Ｍ１型マクロファージからＭ２型マクロファージへの分化を誘導することを示す図である。Ｍ１型マクロファージを１０％ｈＭＳＣｓと共培養した場合に比べ、Ｍ１型マクロファージをＳＦ－ｈＭＳＣｓと共培養した場合には、Ｍ１型からＭ２型へのマクロファージの分化が、著しく誘導されていた。
【0148】
【0149】
ＳＦ－ＭＳＣｓと共培養したＭ１型マクロファージは、１０％ｈＭＳＣｓと共培養したＭ１型マクロファージに比べ、ＣＤ１６３陽性細胞およびＣＤ２０６陽性細胞の割合が、著しく多かった。
【0150】
図１０～図１１の結果から、無血清培地で培養した間葉系幹細胞は、マクロファージをＭ１型からＭ２型へ、著しく変化させることが確認された。つまり、血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、炎症抑制系のマクロファージを増加させる効果が低く、薬剤として用いるには不十分であった。一方、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、炎症抑制系のマクロファージを増加させる効果が著しく高く、薬剤として用いるに十分であった。
【0151】
（実施例４）
無血清培地で培養した脂肪由来間葉系幹細胞による、マクロファージの活性制御能を評価した。
無血清培地で培養した脂肪由来間葉系幹細胞による、マクロファージの活性制御能を評価した。
【0152】
ヒト単芽球様細胞（ＴＨＰ－１）を培養後、当該細胞をＰＭＡ１６０ｎＭで４８時間刺激し、Ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ１）マクロファージへ分化させた。ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＭＳＣｓ：ヒト成体幹細胞（皮下脂肪組織由来（Ｃａｔ＃：ＢＢＡＳＣＦ）））を、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地（１０％ｈＡＭＳＣｓ）、または無血清培地ＳＴＫ２（ＳＦ－ｈＡＭＳＣｓ）で培養し、ＴＨＰ－１との共培養実験（トランスウェル実験)に使用した。
【0153】
＜共培養条件＞
１０％ｈＡＭＳＣｓおよびＳＦ－ｈＡＭＳＣｓを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍを用いてＴＨＰ－１と共培養した。共培養７２時間後にＴＨＰ－１を回収し、Ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ２）マクロファージのマーカーであるＣＤ１６３およびＣＤ２０６の発現をＦＡＣＳ法にて定量した。
１０％ｈＡＭＳＣｓおよびＳＦ－ｈＡＭＳＣｓを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍを用いてＴＨＰ－１と共培養した。共培養７２時間後にＴＨＰ－１を回収し、Ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ２）マクロファージのマーカーであるＣＤ１６３およびＣＤ２０６の発現をＦＡＣＳ法にて定量した。
【0154】
【0155】
ＳＦ－ｈＡＭＳＣｓと共培養したＭ１型マクロファージは、１０％ｈＡＭＳＣｓと共培養した場合に比べ、ＣＤ１６３陽性細胞およびＣＤ２０６陽性細胞の割合が著しく多かった。
【0156】
この結果から、骨髄由来間葉系幹細胞のみならず、脂肪由来間葉系幹細胞においても、無血清培地で培養された間葉系幹細胞は、マクロファージをＭ１型からＭ２型へ、著しく変化させることが確認された。つまり、骨髄由来間葉系幹細胞のみならず脂肪由来間葉系幹細胞においても、血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、炎症を抑制する作用が低く、薬剤として用いるには不十分であった。一方、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、炎症を抑制する作用が著しく高く、薬剤として用いるに十分であった。
【0157】
（実施例５）
無血清培地で培養した骨髄由来間葉系幹細胞の炎症抑制効果を評価した。線維化の指標であるＨＧＦ、腎障害の指標であるＰＧＥ２、炎症の指標であるＩＬ－６、および炎症効果抑制作用の指標であるＴＳＧ－６を用いて、細胞の炎症抑制効果を確認した。
無血清培地で培養した骨髄由来間葉系幹細胞の炎症抑制効果を評価した。線維化の指標であるＨＧＦ、腎障害の指標であるＰＧＥ２、炎症の指標であるＩＬ－６、および炎症効果抑制作用の指標であるＴＳＧ－６を用いて、細胞の炎症抑制効果を確認した。
【0158】
１０％ＦＢＳ培地で培養したＨｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ－２（ＨＫ－２）細胞、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養したヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣｓ）、および、ＳＴＫ２で培養したｈＭＳＣｓの各々に対し、培養する培地をＦＢＳ無添加のＤＭＥＭ培地に交換した後、４８時間培養した。その後、各培地を採取した。次に、Ｅｌｉｓａ法によって、採取した培地に含まれるＨＧＦ、およびＰＧＥ２のタンパク質レベルを定量した。
【0159】
また、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で培養したｈＭＳＣｓ、および、ＳＴＫ２で培養したｈＭＳＣｓの各々よりｍＲＮＡを採取し、ＲＴ－ＰＣＲによって、ＩＬ－６、およびＴＳＧ－６のｍＲＮＡ発現を定量した。
【0160】
図１３～１６における「ＨＫ－２」は「１０％ＦＢＳ培地で培養したＨＫ－２の試験結果」を、「１０％ＭＳＣｓ」は「１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ培地において培養した間葉系幹細胞の試験結果」を、「ＳＦ－ＭＳＣｓ」は「無血清培地ＳＴＫ２において培養した間葉系幹細胞の試験結果」を意図する。
【0161】
図１３は、ＨＧＦのタンパク質の発現レベルを示すグラフである。また図１４は、ＰＧＥ２のタンパク質の発現レベルを示すグラフである。ＳＦ－ＭＳＣｓにおけるＨＧＦおよびＰＧＥ２のタンパク質の発現レベルは、ＨＫ－２に比べて多いものの、１０％ＭＳＣｓに比べて有意に低かった。
【0162】
図１５は、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。１０％ＭＳＣｓにおけるＩＬ－６のｍＲＮＡの発現レベルは、ＨＫ－２におけるＩＬ－６のｍＲＮＡの発現レベルに比べて有意に低かった。一方、ＳＦ－ＭＳＣｓにおけるＩＬ－６のｍＲＮＡの発現レベルは、１０％ＭＳＣｓにおけるＩＬ－６のｍＲＮＡの発現レベルに比べてさらに低かった。
【0163】
図１６は、ＴＳＧ－６のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。ＳＦ－ＭＳＣｓにおけるＴＳＧ－６ ｍＲＮＡの発現レベルは、１０％ＭＳＣｓにおけるＴＳＧ－６ ｍＲＮＡの発現レベルに比べて約４．５倍であった。また、ＨＫ－２では、ＴＳＧ－６ ｍＲＮＡの発現がほとんど認められなかった。
【0164】
次に、ＳＴＫ２で培養したｈＭＳＣｓ（３×１０５ ｃｅｌｌｓ／１０ｃｍ ｄｉｓｈで播種し、ＳＴＫ２で３０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｔまで培養）にＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をトランスフェクションしたｈＭＳＣｓを作製した。同様に、ＳＴＫ２で培養したｈＭＳＣｓにＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をトランスフェクションしたｈＭＳＣｓを作製した。ここで、ｓｉＲＮＡは各々２０ｎＭを各細胞へトランスフェクションし、トランスフェクションにはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。トランスフェクションしてから２４時間後に、培地をＳＴＫ２に交換し、各細胞を、サブコンフルエントになるまで培養した。トランスフェクション効率を調べるため、上記の細胞からｍＲＮＡを採取し、ＴＳＧ－６のｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ－ＰＣＲ法で定量した。
【0165】
図１７は、ＴＳＧ－６のｍＲＮＡ発現レベルを示したグラフである。ここで、「ＮＣｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ｈＭＳＣｓ」は「ＳＴＫ２で培養したｈＭＳＣｓにＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合の試験結果」を示す。一方、「ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓ」は、「ＳＴＫ２で培養したｈＭＳＣｓにＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合の試験結果」を示す。ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓにおけるＴＳＧ－６のｍＲＮＡ発現レベルが、ＮＣｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ｈＭＳＣｓにおけるＴＳＧ－６のｍＲＮＡ発現レベルと比べて有意に減弱していることから、ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡが、有効なノックダウン効果を有していることが確認された。
【0166】
次に、ヒト単芽球様細胞（ＴＨＰ－１）を培養後、１６０ｎＭのＰＭＡによって４８時間刺激した。同様に、２０ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－γをＴＨＰ－１へ添加し、２４時間刺激し、Ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ （Ｍ１）マクロファージへ分化させた。上記のＮＣ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ｈＭＳＣｓおよびＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍを用いてＴＨＰ－１と共培養した。７２時間後にＴＨＰ－１を回収し、ＴＨＰ－１における、Ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（Ｍ２）マクロファージのマーカーであるＣＤ１６３の発現をＦＡＣＳ法にて定量した。
【0167】
図１８は、ＣＤ１６３陽性細胞の増加を示すグラフである。ここで、「ＮＣ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ｈＭＳＣｓ／ＴＷ」は、「ＳＴＫ２で培養したｈＭＳＣｓにＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合の試験結果」を示す。「ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓ／ＴＷ」は、「ＳＴＫ２で培養したｈＭＳＣｓにＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合の試験結果」を示す。ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓ／ＴＷは、ＮＣ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ｈＭＳＣｓ／ＴＷと比較して、有意な差は認められなかった。つまり、ＳＴＫ２を用いて培養したＭＳＣｓは、マクロファージをＰｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ （Ｍ１） からＩｍｍｕｎｅ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ （Ｍ２）に変化させる。しかし、ＳＴＫ２により発現レベルが上昇するＴＳＧ－６は、この変化に関与していないことが示唆された。
【0168】
上述の方法と同様に、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを施行したｈＭＳＣｓ、およびＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ を施行したｈＭＳＣｓを培養している培地を、ＦＢＳ無添加のＤＭＥＭ培地に交換した後、４８時間培養したもの（以下、コンディションメディウムと称する）を、以下の実験に用いた。
【0169】
ＨＫ－２細胞を６ｗｅｌｌ ｄｉｓｈに１×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１８時間後サブコンフルエントとなったことを確認し、培地を上記のコンディションメディウムに交換した。２４時間後に１０ｎｇ／ｍＬ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を添加し１２時間後にｍＲＮＡを採取した。その後、ＴＧＦ－β１により誘導される炎症性サイトカインであるＭＣＰ－１、およびＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現を、ＲＴ－ＰＣＲを用いて検討した。
【0170】
図１９（Ａ）は、ＭＣＰ－１のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。また、図１９（Ｂ）は、ＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。ＴＧＦ－β１により、ＨＫ－２ ｃｅｌｌｓのＭＣＰ－１およびＴＮＦ－αのｍＲＮＡ発現レベルは上昇した。ここで、「ＤＭＥＭ」は「ＴＧＦ－β１を添加したＤＭＥＭ中で培養された場合の試験結果」を示す。また、「ＮＣｓｉＲＮＡ ＳＦ－ｈＨＭＣｓ－ＣＭ」は、「Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを施行したｈＭＳＣｓを含む培養液で培養した場合の試験結果」を示す。さらに、「ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ ＳＦ ｈＭＳＣｓ－ＣＭ」は、「ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ を施行したｈＭＳＣｓを含む培養液で培養した場合の試験結果」を示す。ＮＣｓｉＲＮＡ ＳＦ－ｈＨＭＣｓ－ＣＭ群では、ＭＣＰ－１およびＴＮＦ－αのｍＲＮＡレベルが有意に抑制されていた。一方、ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ ＳＦ ｈＭＳＣｓ－ＣＭ群では、ＭＣＰ－１およびＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現抑制効果が有意に減弱していた。つまり、ＳＴＫ２で培養したＭＳＣｓで高発現するＴＳＧ－６をノックダウンすると、ＴＧＦ－β１の添加によって誘導する炎症性サイトカインの抑制効果が減弱することが示唆された。本実施例の結果から、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞は、ＴＳＧ－６の発現により、炎症を抑制する作用が著しく高く、薬剤として用いるに十分であることが明らかになった。
【0171】
（実施例６）
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（６～７週齢）の大腿骨または脛骨の骨髄から採取したＭＳＣｓを、無血清培地（ＳＴＫ１またはＳＴＫ２）にて単離し、培養して増殖させ、無血清培地培養ＭＳＣｓ（以降ＳＦ－ＭＳＣｓとも称する）を得た。該ＭＣＳｓに、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ、またはＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ（各２０ｎＭ）をトランスフェクションした。トランスフェクション後の細胞を、作製４日後のラット一側性尿細管結紮モデルの尾静脈へ投与した。ここで、上記Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＳＦ－ＭＳＣｓを投与した群、ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＳＦ－ＭＳＣｓを投与した群、またはＰＢＳのみを投与した群、尿細管の結紮を行わなかったコントロールの群を各５群ずつ用意した。一側性尿細管結紮術から１０日後に各群のラットを屠殺し、腎臓を摘出し、ＴＳＧ－６の抗炎症効果について確認した。
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（６～７週齢）の大腿骨または脛骨の骨髄から採取したＭＳＣｓを、無血清培地（ＳＴＫ１またはＳＴＫ２）にて単離し、培養して増殖させ、無血清培地培養ＭＳＣｓ（以降ＳＦ－ＭＳＣｓとも称する）を得た。該ＭＣＳｓに、Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ、またはＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ（各２０ｎＭ）をトランスフェクションした。トランスフェクション後の細胞を、作製４日後のラット一側性尿細管結紮モデルの尾静脈へ投与した。ここで、上記Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＳＦ－ＭＳＣｓを投与した群、ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＳＦ－ＭＳＣｓを投与した群、またはＰＢＳのみを投与した群、尿細管の結紮を行わなかったコントロールの群を各５群ずつ用意した。一側性尿細管結紮術から１０日後に各群のラットを屠殺し、腎臓を摘出し、ＴＳＧ－６の抗炎症効果について確認した。
【0172】
図２０は、ＴＳＧ－６のｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。ラットＭＳＣｓにおいてもヒトＭＳＣｓと同様に、血清含有培地で培養したＭＳＣｓ（１０％ＭＳＣｓ）と比較して、ＳＦ－ＭＳＣｓにおけるＴＳＧ－６のｍＲＮＡレベルは有意に上昇していた。Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡを施行したＳＦ－ＭＳＣｓと比較して、ＴＳＧ－６ｓｉＲＮＡを施行したＳＦ－ＭＳＣｓでは、ＴＳＧ－６のｍＲＮＡレベルは有意に減弱していることから、ＴＳＧ－６ｓｉＲＮＡのノックダウン効果が確認された。
【0173】
図２１（Ａ）は、ウエスタンブロット法によるＴＧＦ－β１またはα－ＳＭＡの検出結果を示す像である。また、（Ｂ）は、ＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡの発現レベルを示すグラフである。なお、（Ｂ）の試験結果は、「ｎ＝５、＊：Ｐ＜０．０５、♯Ｐ＜０．０１」の条件下にて得られたものである。ＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡタンパク質の発現レベルは、ＰＢＳ群で最も高かった。また、ＮＣ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した群では、ＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡタンパク質の発現レベルが有意に低下していた。一方、ＮＣ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した群に比べ、ＴＳＧ－６をノックダウンしたＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓを投与した群では、ＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡタンパク質の発現レベルは高かった。つまり、ＴＳＧ－６をノックダウンした場合、ＴＧＦ－β１およびα－ＳＭＡタンパク質の発現抑制効果が有意に減弱することがわかった。
【0174】
図２２（Ａ）は、ＣＤ６８の免疫染色結果の像である。また、図２２（Ｂ）は、ＣＤ６８を発現している細胞の数を示すグラフである。各群のＣＤ６８陽性細胞数は、ＰＢＳ群で最も多かった。また、ＮＣｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓ群では、ＣＤ６８陽性細胞数に有意な減少が認められた。ＮＣｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓ群と比べて、ＴＳＧ－６ ｓｉＲＮＡ／ＳＦ－ＭＳＣｓ群では、ＣＤ６８陽性細胞の有意な増加が認められた。
【0175】
無血清培地中で培養された間葉系幹細胞の抗炎症作用および抗線維化作用に、炎症を早期に沈静化させることができるＴＳＧ－６が関与していることが明らかになった。
【0176】
（実施例７）
肝臓の線維化が進むにつれて、肝組織中にはコラーゲンを主成分とする細胞外マトリックスが過剰に沈着し、その終末像として肝臓の繊維化（例えば、肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎）に至る。本実施例においては、無血清培地で培養した間葉系幹細胞の移植による肝臓の線維化(例えば、肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎)の抑制効果に係る検討を行った。
肝臓の線維化が進むにつれて、肝組織中にはコラーゲンを主成分とする細胞外マトリックスが過剰に沈着し、その終末像として肝臓の繊維化（例えば、肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎）に至る。本実施例においては、無血清培地で培養した間葉系幹細胞の移植による肝臓の線維化(例えば、肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎)の抑制効果に係る検討を行った。
【0177】
＜方法：細胞の採取および培養＞
本試験において、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（７週齢、オス）の大腿骨または脛骨から、実施例１の記載と同様の方法で、間葉系幹細胞を採取し、当該間葉系幹細胞を培養および継代した。
本試験において、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（７週齢、オス）の大腿骨または脛骨から、実施例１の記載と同様の方法で、間葉系幹細胞を採取し、当該間葉系幹細胞を培養および継代した。
【0178】
＜方法：疾患のモデルの作製＞
肝臓の線維化のモデルとして、一般的な、四塩化炭素を用いたモデルラットを作製した。
肝臓の線維化のモデルとして、一般的な、四塩化炭素を用いたモデルラットを作製した。
【0179】
本試験においては、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（５週齢、オス）を１週間馴化した後に、６週齢目から、当該ラットに対して、疾患誘導剤（疾患誘導物質:四塩化炭素（４０ ｗ/ｗ％）、溶媒:コーンオイル）を５週間に渡り、計１０回腹腔内投与した。
【0180】
それぞれの週における疾患誘導剤の投与のタイミングは、一定の間隔を開けて毎週２回ずつ行った（例えば、第１週目においてはＤａｙ０およびＤａｙ２の２回、第５週目においてはＤａｙ２８およびＤａｙ３１の２回）。
【0181】
各回の疾患誘導剤の投与量は、各個体の体重に基づいて規格化した量（２ｍｌ／ｋｇ）とした。尚、日数起算の起点となる日（即ち、Ｄａｙ０）は、疾患誘導剤の初回投与日とした。前記の疾患誘導を行った群を、以下では「疾患誘導群」と称す。また、前記肝臓の線維化モデルの陰性対照として、前記と同様のタイムコース、および、投与量で疾患誘導物質を含まない溶媒のみをＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへ投与した「健常群」を別途設けた。
【0182】
＜方法：薬剤の投与＞
前記の疾患モデルである「疾患誘導群」に対し、疾患誘導剤の最終投与を行った日（Ｄａｙ３１）の翌日（Ｄａｙ３２）に、部分採血を行った。
前記の疾患モデルである「疾患誘導群」に対し、疾患誘導剤の最終投与を行った日（Ｄａｙ３１）の翌日（Ｄａｙ３２）に、部分採血を行った。
【0183】
その際に、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の値、及び、体重の値が均一になるようにラットを抽出し、当該ラットを「疾患誘導群」とした。
【0184】
前記の「疾患誘導群」に属する動物らを「ＳＴＫ群」(ｎ＝５)、「有血清群」（ｎ＝８）、および、「偽薬群」（ｎ＝１１）の３群に分けた。以降、「ＳＴＫ群」、および、「有血清群」を総称して「細胞投与群」と称す。
【0185】
Ｄａｙ３３に、「ＳＴＫ群」の動物に対してはＳＴＫ１、およびＳＴＫ２を用いて実施例１の方法で培養した間葉系幹細胞を、一方、「有血清群」の動物に対しては実施例１の方法で１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地を用いて培養した間葉系幹細胞を、尾静脈へ静注した。
【0186】
「細胞投与群」に対しては、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ， ＰＢＳ）中に２×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で懸濁し、当該懸濁液を５００μＬ／ラットにて投与（従って、各ラットへ投与された細胞数は、１×１０６ ｃｅｌｌｓである）した。
【0187】
「偽薬群」の動物に対しては、偽薬（ＰＢＳのみ）を５００μＬ／ラットにて同様に投与した。何れの投与も、通常の方法にて、ラットを保定した状態で数秒以内に行われた。尚、「健常群」においては、細胞、および、偽薬の何れも投与しなかった。
【0188】
＜方法：屠殺および採材＞
薬剤の投与後、２週間の観察期間を経た後のＤａｙ４７に、全群に対して、イソフルラン麻酔下で屠殺（放血安楽死）及び採材を行った。採材においては、組織学的評価に供する肝臓の内側葉および外側左葉に加え、生化学的検査に供する血液検体を採取(全採血)した。採取した肝臓の内側葉および外側左葉を、ホルマリンによって固定した後、パラフィンブロックに包埋した。その後、パラフィンブロックを薄切し、シリウスレッド染色標本を作製した。
薬剤の投与後、２週間の観察期間を経た後のＤａｙ４７に、全群に対して、イソフルラン麻酔下で屠殺（放血安楽死）及び採材を行った。採材においては、組織学的評価に供する肝臓の内側葉および外側左葉に加え、生化学的検査に供する血液検体を採取(全採血)した。採取した肝臓の内側葉および外側左葉を、ホルマリンによって固定した後、パラフィンブロックに包埋した。その後、パラフィンブロックを薄切し、シリウスレッド染色標本を作製した。
【0189】
＜結果：行動観察＞
「疾患誘導群」においては、Ｄａｙ０からＤａｙ３１までの疾患誘導剤の投与期間に渡って、疾患誘導剤投与直後には、毎回うずくまりが全個体に見られる等、本疾患誘導剤の投与に伴い想定されうる観察所見が見られた。「健常群」においては、そのような観察所見は認められなかった。「細胞投与群」においては、細胞投与後２週間に渡った評価期間において、細胞治療で考慮すべき如何なる異常所見（例えば、拒絶反応等）も認められなかった。
「疾患誘導群」においては、Ｄａｙ０からＤａｙ３１までの疾患誘導剤の投与期間に渡って、疾患誘導剤投与直後には、毎回うずくまりが全個体に見られる等、本疾患誘導剤の投与に伴い想定されうる観察所見が見られた。「健常群」においては、そのような観察所見は認められなかった。「細胞投与群」においては、細胞投与後２週間に渡った評価期間において、細胞治療で考慮すべき如何なる異常所見（例えば、拒絶反応等）も認められなかった。
【0190】
＜結果：体重の推移＞
初回投与日（Ｄａｙ０）から、屠殺を行った日（Ｄａｙ４７）に至るまでの、各群の体重の推移は、図２３に示す通りである。なお、図２３、および、後述する図２４～図２６において、（ａ）は「健常群」の試験結果であり、（ｂ）は「偽薬群」の試験結果であり、（ｃ）は「有血清群」の試験結果であり、（ｄ）は「ＳＴＫ群」の試験結果である。
初回投与日（Ｄａｙ０）から、屠殺を行った日（Ｄａｙ４７）に至るまでの、各群の体重の推移は、図２３に示す通りである。なお、図２３、および、後述する図２４～図２６において、（ａ）は「健常群」の試験結果であり、（ｂ）は「偽薬群」の試験結果であり、（ｃ）は「有血清群」の試験結果であり、（ｄ）は「ＳＴＫ群」の試験結果である。
【0191】
疾患誘導剤の初回投与日（Ｄａｙ０）において、健常群も含め各群の平均体重は同一であった。Ｄａｙ３３においては、「健常群」以外の各群の体重が同一となるように群分けされている。細胞投与後の２週間の観察期間において、各群の体重は「ＳＴＫ群」＝「健常群」＞「有血清群」＝「偽薬群」となった。
【0192】
一般的に、四塩化炭素を用いたモデルラットにおいては、通常飼育に比べて、体重が減少する傾向を示す。「ＳＴＫ群」の体重と「健常群」の体重とが略同一であることは、「細胞投与群」（特に、「ＳＴＫ群」）において、全身的な健康状態の回復が強いことを示している。
【0193】
＜結果：生化学的検査＞
Ｄａｙ４７の血液検体から、血清を分離した。以下において、「ＡＳＴ」はアスパラギン酸アミノ基転移酵を、「ＬＤＨ」は乳酸脱水素酵素を、「γ－ＧＴＰ」はγグルタミルトランスペプチダーゼを示す。
Ｄａｙ４７の血液検体から、血清を分離した。以下において、「ＡＳＴ」はアスパラギン酸アミノ基転移酵を、「ＬＤＨ」は乳酸脱水素酵素を、「γ－ＧＴＰ」はγグルタミルトランスペプチダーゼを示す。
【0194】
「ＬＤＨ」および「γ－ＧＴＰ」については、「細胞投与群」（特に「ＳＴＫ群」）において、「健常群」と同等あるいはそれ以下の値に改善していた。尚、「健常群」においては、溶媒（即ち、コーンオイル）の投与によって、同酵素活性値が正常値よりも増加傾向を示していた。
【0195】
ＡＳＴ：「ＳＴＫ群」（ｎ＝５）、「有血清群」（ｎ＝８）、および、「偽薬群」（ｎ＝１１）の何れも、群分け時（Ｄａｙ３２）の値と比較して、「ＡＳＴ」の値が、有意に低下した（Ｐ＜０．０１）。「疾患誘導群」の全群にて、Ｄａｙ４７の血液検体における「ＡＳＴ」の値は、「健常群」と差が認められず、正常値の範囲まで低下していた。
【0196】
ＬＤＨ：Ｄａｙ４７における「ＬＤＨ」の値のみ測定した。各群における「ＬＤＨ」の平均値は、「ＳＴＫ群」（９４６．２Ｕ／Ｌ）、「有血清群」（１０８６．４Ｕ／Ｌ）、「偽薬群」（１０２７．９Ｕ／Ｌ）、「健常群」（８５２．７Ｕ／Ｌ）であり（図２４参照）、「ＳＴＫ群」では、「有血清群」および「偽薬群」よりも、「ＬＤＨ」の値が低下した。
【0197】
γ－ＧＴＰ：Ｄａｙ４７における「γ－ＧＴＰ」の値のみ測定した。各群における「γ－ＧＴＰ」の平均値は、「ＳＴＫ群」（０．９Ｕ／Ｌ）、「有血清群」（１．０９Ｕ／Ｌ）、「偽薬群」（１．２６Ｕ／Ｌ）、「健常群」（１．１６Ｕ／Ｌ）であり、「ＳＴＫ群」では、「有血清群」および「偽薬群」よりも、「γ－ＧＴＰ」の値が低下した（図２５参照）。
【0198】
＜結果：組織学的評価＞
シリウスレッド染色標本において、各個体の各葉（内側葉および外側左葉の各々）について、中心静脈を中心として、３視野（各個体毎に６視野（＝２葉×３視野））の顕微画像を撮像し（対物レンズ１０倍）、画像解析装置にて線維化面積を算出した。
シリウスレッド染色標本において、各個体の各葉（内側葉および外側左葉の各々）について、中心静脈を中心として、３視野（各個体毎に６視野（＝２葉×３視野））の顕微画像を撮像し（対物レンズ１０倍）、画像解析装置にて線維化面積を算出した。
【0199】
シリウスレッド染色像において、線維性のコラーゲンが沈着した部位は、赤色に着色される（図２６の（ａ）～（ｄ）の白黒画像においては、黒い線状の部位が、赤色に着色された部位に相当する）。これらの画像に対して、各視野の線維化率（（線維化面積／視野の面積）×１００）を求めた。
【0200】
図２６の（ａ）に「健常群」、図２６の（ｂ）に「偽薬群」、図２６の（ｃ）に「有血清群」、図２６の（ｄ）に「ＳＴＫ群」のシリウスレッド染色の像を示す。それぞれの画像において、線維化率は、それぞれ「健常群」（１．１％）、「偽薬群」（４．４％）、「ＳＴＫ群」（１．１％）、「有血清群」（２．４％）であり、「ＳＴＫ群」は、「偽薬群」および「有血清群」よりも、線維化率が低かった（図２６参照）。
【0201】
＜総括＞
本実施例において、「ＳＴＫ群」では、細胞の投与後に、拒絶反応等の細胞治療で考慮すべき異常所見は認められなかった。それ故に、本発明の修復剤は、安全性が高いと考えられる。
本実施例において、「ＳＴＫ群」では、細胞の投与後に、拒絶反応等の細胞治療で考慮すべき異常所見は認められなかった。それ故に、本発明の修復剤は、安全性が高いと考えられる。
【0202】
本実施例では全体的に炎症が低かったにもかかわらず、「ＳＴＫ群」では、「ＬＤＨ」および「γ－ＧＴＰ」の値が低下していた。また、各群の体重は、「ＳＴＫ群」＝「健常群」＞「有血清群」＝「偽薬群」であり、「ＳＴＫ群」は「健常群」に近い体重にまで回復した。これらのことから「ＳＴＫ群」においては、肝臓の炎症が抑制され、全身的な健康状態が回復したことが示された。
【産業上の利用可能性】
【0203】
本発明は、生体組織損傷の回復を目的とする再生医療に好適に利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
