(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-22
(45)【発行日】2022-08-30
(54)【発明の名称】癌を検出する方法及び検出試薬
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20220823BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20220823BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20220823BHJP
C07K 14/475 20060101ALN20220823BHJP
C07K 16/24 20060101ALN20220823BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N33/574 A ZNA
G01N27/62 V
C07K14/475
C07K16/24
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2018153902
(22)【出願日】2018-08-20
(65)【公開番号】P2019045486
(43)【公開日】2019-03-22
【審査請求日】2021-07-14
(31)【優先権主張番号】P 2017165409
(32)【優先日】2017-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000003300
【氏名又は名称】東ソー株式会社
(72)【発明者】
【氏名】明庭 昇平
(72)【発明者】
【氏名】大竹 則久
【審査官】海野 佳子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１１－５０２１０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】BAUSKIN, A R et al.，The Propeptide Mediates Formation of Stromal Stores of PROMIC-1: Role in Determining Prostate Cancer Outcome，Cancer Research，2005年03月15日，Vol.65, No.6，pp.2330-2336
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
検体において、インタクト増殖分化因子（ＧＤＦ１５）プロペプチド量を測定することを含む、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
【請求項2】
検体において、ＧＤＦ１５プロペプチド断片量を測定することを含む、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
【請求項3】
検体において、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド量とＧＤＦ１５プロペプチド断片量との合計量を測定することを含む、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
【請求項4】
請求項１～３の何れか一項に記載の癌を検出する方法において、胃癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、若しくは食道癌を検出する、又は、非小細胞肺癌と小細胞肺癌とを鑑別して検出する方法。
【請求項5】
前記ＧＤＦ１５プロペプチド断片が、以下の（Ａ）及び／又は（Ｂ）に記載のＧＤＦ１５プロペプチド断片を含む、請求項２又は３に記載の方法。（Ａ）以下の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の５８残基目のリジンから少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
（Ｂ）以下の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の７４残基目のグルタミン酸から少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
【請求項6】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を用いて前記測定を行う、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
【請求項7】
質量分析法を用いて前記測定を行う、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
【請求項8】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を含む、癌を検出するための試薬（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血液中の増殖分化因子１５（Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １５、以降「ＧＤＦ１５」とも記す）タンパク質のプロペプチド及びその分解物、並びにそれらを測定対象とする癌の検出方法及び検出試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
癌を検出するための腫瘍マーカーとしては、一般的に表１に示すようなものが挙げられる。しかし、いずれのマーカーも癌の早期における陽性率は低く、良性腫瘍や炎症における偽陽性や悪性度の高い癌では検出できないなど課題のあるものも多い。そのため、これらの癌を高い精度で検出可能な腫瘍マーカーの発見および検査法の開発が望まれている。
【0003】
【表1】
【0004】
増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、マクロファージ阻害サイトカイン１（Ｍａｃｒｏｐｈａｒｇｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １：ＭＩＣ－１）や非ステロイド系抗炎症薬活性化遺伝子１（Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｇｅｎｅ １：ＮＡＧ－１）と同一のタンパク質であり、ＴＧＦ－βファミリーに属する。ＧＤＦ１５は分泌シグナル及びプロペプチドを含むプレプロＧＤＦ１５として発現後、分泌シグナルが切断されプロＧＤＦ１５として細胞外へ分泌される。プロＧＤＦ１５はプロペプチドを介して細胞外マトリックスに貯蔵され、フューリン様プロテアーゼによりプロペプチドから二量体を形成した状態でＧＤＦ１５が切り離され血中へ放出される（非特許文献１）。プロＧＤＦ１５は全長で分子量４０，０００付近、ＧＤＦ１５成熟体は分子量１５，０００付近に分画されることが報告されている（非特許文献２）。
【0005】
ＧＤＦ１５は、膵臓癌や大腸癌等の様々な癌で血中の成熟体量が増加することが報告され、心疾患等の癌以外の疾病においても血中量増加の知見があり（特許文献１～６、非特許文献３～８）、他にも食欲調節や妊娠中の胎児検査への応用が試みられている（特許文献７～８）。
【0006】
しかし、これらの知見はいずれもＧＤＦ１５成熟体に関するものであり、ＧＤＦ１５プロペプチドは細胞外マトリクスに局在するものと考えられていた（非特許文献２）。また、当該タンパク質を測定対象として疾患を検出することもその効果も不明であった。
【0007】
なお、ＧＤＦ１５プロペプチド（以下、「ＧＤＰＰ」とも記す）は、プロＧＤＦ１５のＮ末端側に位置する１６５残基のポリペプチドである。より具体的には、本明細書におけるＧＤＦ１５プロペプチドは、配列番号１に示すヒトＧＤＦ１５のｃＤＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿００４８６４）に基づくアミノ酸配列において、開始メチオニンから２９残基目のアラニンまでのシグナルペプチドに続く、３０残基目のロイシンから１９４残基目のアルギニンまでの配列を少なくとも含む、又は、前記配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特開２０１１－１０２４６１号公報
【文献】特開２００９－５４５７３５号公報
【文献】特開２０１０－５２８２７５号公報
【文献】特開２０１１－５２３０５１号公報
【文献】特開２０１２－５１５３３５号公報
【文献】特開２０１５－１０８０７７号公報
【文献】特開２０１１－１９０２６２号公報
【文献】特開２００３－５３２０７９号公報
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓ． ２０１２；１５（４）：３２０－３２８
【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５；６５（６）：２３３０－２３３６
【文献】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ． ２０１３；８５：５９７－６０６
【文献】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００９；１５（２１）：６６５８－６６６４
【文献】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１１；１７：４８２５－４８３３
【文献】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００３；９：２６４２－２６５０
【文献】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６；１２：４４２－４４６
【文献】ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１４；１４：５７８－５８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、癌を簡便かつ高い精度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意検討した結果、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、食道癌および胃癌において、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いたイムノアッセイにより、血液中のＧＤＦ１５プロペプチドは健常検体と比較してこれらの癌検体で増加を示すこと、並びに、肺癌において非小細胞肺癌に比べて小細胞肺癌でより上昇するという知見を得て、ＧＤＦ１５プロペプチドが癌、特に膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、食道癌若しくは胃癌を検出する、又は肺癌において非小細胞肺癌と小細胞肺がんとを鑑別して検出するマーカーとなり得ることを見出し、本発明を完成させた。
【0012】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］検体において、インタクト増殖分化因子（ＧＤＦ１５）プロペプチド量を測定することを含む、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
［２］検体において、ＧＤＦ１５プロペプチド断片量を測定することを含む、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
［３］検体において、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド量とＧＤＦ１５プロペプチド断片量との合計量を測定することを含む、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
［４］上述の［１］～［３］の何れか一項に記載の癌を検出する方法において、胃癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、若しくは食道癌を検出する、又は、非小細胞肺癌と小細胞肺癌とを鑑別して検出する方法。
［５］前記ＧＤＦ１５プロペプチド断片が、以下の（Ａ）及び／又は（Ｂ）に記載のＧＤＦ１５プロペプチド断片を含む、［２］又は［３］に記載の方法。
［１］検体において、インタクト増殖分化因子（ＧＤＦ１５）プロペプチド量を測定することを含む、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
［２］検体において、ＧＤＦ１５プロペプチド断片量を測定することを含む、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
［３］検体において、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド量とＧＤＦ１５プロペプチド断片量との合計量を測定することを含む、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
［４］上述の［１］～［３］の何れか一項に記載の癌を検出する方法において、胃癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、若しくは食道癌を検出する、又は、非小細胞肺癌と小細胞肺癌とを鑑別して検出する方法。
［５］前記ＧＤＦ１５プロペプチド断片が、以下の（Ａ）及び／又は（Ｂ）に記載のＧＤＦ１５プロペプチド断片を含む、［２］又は［３］に記載の方法。
【0013】
（Ａ）以下の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の５８残基目のリジンから少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の５８残基目のリジンから少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
【0014】
（Ｂ）以下の特徴を有する、ＧＤＦ１５プロペプチド断片。
配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の７４残基目のグルタミン酸から少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
［６］ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を用いて前記測定を行う、［１］～［５］の何れか一項に記載の方法。
［７］質量分析法を用いて前記測定を行う、［１］～［５］の何れか一項に記載の方法。
［８］ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を含む、癌を検出するための試薬（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の７４残基目のグルタミン酸から少なくとも１６７残基目のアスパラギン酸までのアミノ酸配列、又はこれと８０％以上の同一性を有する配列を含む。
［６］ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いた抗原抗体反応を用いて前記測定を行う、［１］～［５］の何れか一項に記載の方法。
［７］質量分析法を用いて前記測定を行う、［１］～［５］の何れか一項に記載の方法。
［８］ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を含む、癌を検出するための試薬（但し、去勢抵抗性前立腺癌を除く）。
【発明の効果】
【0015】
本発明により、癌を簡便かつ高い精度で検出する方法、及び前記方法に利用できる試薬が提供される。
【0016】
また、本発明の試薬はＧＤＦ１５プロペプチドを検出するものであり、ＧＤＦ１５発現制御はｐ５３下流に位置しているため、既存の癌治療薬、特にタキサン系抗癌剤の治療効果を反映することが推測される。したがって、本発明の試薬は、癌の治療におけるコンパニオン診断薬にもなり得る。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】作製した各種組換えＧＤＰＰの構造を示す図である。
【図2】ＥＬＩＳＡ解析の結果を示す図である。
【図3】ウェスタンブロッティング結果を示す図である。
【図4】各種測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ Ｐｌｏｔ）を示す図である。
【図5】受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析の結果を示す図である。
【図6】実施例６で測定、解析した結果を示す図である。
【図7】健常人、食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌におけるｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰ測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ Ｐｌｏｔ）を示す図である。
【図8】食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌におけるＣＥＡ測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ Ｐｌｏｔ）を示す図である。
【図9】非小細胞肺癌と小細胞肺癌におけるｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰ、ＣＥＡ測定値を比較した図である。
【図10】非小細胞肺癌と小細胞肺癌におけるｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰ、ＣＥＡのＲＯＣ曲線解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
＜１＞本発明の癌を検出する方法
本発明の第一の態様は、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌（以下、「ＣＲＰＣ）とも記す）を除く）であり、検体においてＧＤＦ１５プロペプチド量を測定することを含む。これは、健常な検体と比べて、癌の血液等の生体試料中に特徴的にＧＤＦ１５プロペプチドが存在することに基づく方法である。この方法により、後述する実施例が示すように、従来知られた腫瘍マーカー（ＣＡ１９－９、ＣＥＡ）を測定した場合に比べて、癌（但し、ＣＲＰＣを除く）、例えば膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、食道癌、若しくは胃癌を検出する、又は、非小細胞肺癌と小細胞肺がんとを鑑別して検出する際に、高い感度と特異度で検出することができる。
本発明の第一の態様は、癌を検出する方法（但し、去勢抵抗性前立腺癌（以下、「ＣＲＰＣ）とも記す）を除く）であり、検体においてＧＤＦ１５プロペプチド量を測定することを含む。これは、健常な検体と比べて、癌の血液等の生体試料中に特徴的にＧＤＦ１５プロペプチドが存在することに基づく方法である。この方法により、後述する実施例が示すように、従来知られた腫瘍マーカー（ＣＡ１９－９、ＣＥＡ）を測定した場合に比べて、癌（但し、ＣＲＰＣを除く）、例えば膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、食道癌、若しくは胃癌を検出する、又は、非小細胞肺癌と小細胞肺がんとを鑑別して検出する際に、高い感度と特異度で検出することができる。
【0019】
本態様において測定対象であるＧＤＦ１５プロペプチドには、配列番号２に示すＧＤＦ１５アミノ酸配列の３０残基目のロイシンから１９４残基目のアルギニンまでのアミノ酸配列からなるインタクトＧＤＦ１５プロペプチド（以下、「ｉＧＤＰＰ」とも記す）及び／又はＧＤＦ１５プロペプチド断片が含まれ、ＧＤＦ１５プロペプチド断片には、ｄＮＴ５７－ＧＤＰＰ（配列番号２のアミノ酸配列の５８残基目から１６７残基目に相当）、ｄＮＴ７３－ＧＤＰＰ（配列番号２のアミノ酸配列の７４残基目から１６７残基目に相当）、及びその他のペプチド断片が含まれる。なお、インタクトＧＤＦ１５プロペプチドは、分解されていないＧＤＦ１５プロペプチドを指す。本発明の検出方法において、ＧＤＦ１５プロペプチド量を測定する方法は特に制限されない。例えば、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した方法や、質量分析法を利用した方法が例示できる。
【0020】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）標識した測定対象及び測定対象を認識する抗体を用い、標識した測定対象及び検体に含まれる測定対象が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
（ｂ）測定対象を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
（ｃ）蛍光標識した測定対象を認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
（ｄ）エピトープの異なる２種類の、測定対象を認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体と測定対象との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
（ｅ）前処理として測定対象を認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その結合タンパクのポリペプチドを質量分析装置等により検出する方法。
（ａ）標識した測定対象及び測定対象を認識する抗体を用い、標識した測定対象及び検体に含まれる測定対象が、前記抗体に競合的に結合することを利用した競合法。
（ｂ）測定対象を認識する抗体を固定化したチップに検体を接触させ、当該抗体と測定対象との結合に依存したシグナルを検出する表面プラズモン共鳴を用いた方法。
（ｃ）蛍光標識した測定対象を認識する抗体を用い、当該抗体と測定対象とが結合することで蛍光偏光度が上昇することを利用した蛍光偏光免疫測定法。
（ｄ）エピトープの異なる２種類の、測定対象を認識する抗体（うち１つは標識した抗体）を用い、当該２つの抗体と測定対象との３者の複合体を形成させるサンドイッチ法。
（ｅ）前処理として測定対象を認識する抗体により検体中の測定対象を濃縮後、その結合タンパクのポリペプチドを質量分析装置等により検出する方法。
【0021】
（ｄ）、（ｅ）の方法が簡便かつ汎用性が高いが、多検体を処理する上では（ｄ）の方法が試薬及び装置に関する技術が十分確立されている点でより好ましい。
【0022】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体としては、ＧＤＦ１５プロペプチドのＮ末端領域を認識する、例えば配列番号２の３０残基目のロイシンから５７残基目のアルギニンまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体が、ｉＧＤＰＰ量の測定に好ましく用いることができる。また、ＧＤＦプロペプチドのＣ末端領域を認識する、例えば配列番号２の７４残基目のグルタミン酸から１９６残基目のアルギニンまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体が、ｉＧＤＰＰ量とＧＤＰＰ断片量との合計量（総ＧＤＰＰ、以降「ｔＧＤＰＰ」とも記す）の測定に好ましく用いることができる。
【0023】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体は、ＧＤＦ１５プロペプチドそのもの、ＧＤＦ１５プロペプチドの部分領域からなるオリゴペプチド、プロＧＤＦ１５タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドなどを免疫原として、動物に免疫することで得ることができる。
【0024】
免疫に用いる動物は、抗体産生能を有するものであれば特に限定はなく、マウス、ラット、ウサギなど通常免疫に用いる哺乳動物でもよいし、ニワトリなど鳥類を用いてもよい。
【0025】
なお、免疫原として、ＧＤＦ１５プロペプチドそのもの、またはＧＤＦ１５プロペプチドの部分領域からなるオリゴペプチドを用いると、前記タンパク質または前記オリゴペプチドを調製する過程でその構造が変化する可能性がある。そのため、得られた抗体が、所望の抗原に対して高い特異性や結合力を有さない可能性があり、結果として検体中に含まれるＧＤＦ１５プロペプチド量を正確に定量できなくなる可能性がある。一方、免疫原として、プロＧＤＦ１５タンパク質のインタクトまたは部分領域をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いると、免疫された動物の体内で構造変化を受けずに導入した通りのＧＤＦ１５プロペプチドタンパク質のインタクトまたは部分領域が発現されるため、検体中のＧＤＦ１５プロペプチドに対し、高い特異性及び結合力（すなわち高親和性）を有した抗体が得られるため好ましい。
【0026】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。
【0027】
ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の樹立は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で免疫した動物からＢ細胞を採取し、前記Ｂ細胞とミエローマ細胞とを電気的にまたはポリエチレングリコール存在下で融合させ、ＨＡＴ培地により所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行ない、選択したハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりモノクローン化を行なうことで、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を樹立することができる。
【0028】
本発明の癌を検出する方法で用いる、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体、例えば、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識するモノクローナル抗体の選定は、宿主発現系に由来する、ＧＰＩ（ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型ＧＤＦ１５プロペプチドまたは分泌型ＧＤＦ１５プロペプチドに対する親和性に基づいて行えばよい。
【0029】
なお、前記宿主としては特に限定はなく、当業者がタンパク質の発現に通常用いる、大腸菌や酵母などの微生物細胞、昆虫細胞、動物細胞の中から適宜選択すればよいが、ジスルフィド結合もしくは糖鎖付加といった翻訳後修飾により、天然型のＧＤＦ１５プロペプチドに近い構造を有するタンパク質の発現が可能な、哺乳細胞を宿主として用いると好ましい。哺乳細胞の一例としては、従来用いられている、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株、サル腎臓細胞ＣＯＳ７株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはヒトから単離された癌細胞などが挙げられる。
【0030】
本発明の癌検出方法で用いる抗体の精製は、技術が確立された方法の中から適宜選択して行えばよい。一例として、前述した方法で樹立した、抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養後、その培養上清を回収し、必要に応じ硫酸アンモニウム沈殿による抗体濃縮後、プロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＬなどを固定化した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体の精製が可能である。
【0031】
なお、前述したサンドイッチ法で抗原抗体反応を行なう際に用いる標識した抗体は、前述した方法で精製した抗体をペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの酵素等で標識すればよく、その標識も技術が十分確立された方法を用いて行なえばよい。
【0032】
本発明の検出方法において、質量分析法を利用してＧＤＦ１５プロペプチドを検出する方法について、以下に具体的に説明する。
【0033】
検体が血液である場合は、前処理工程として血液に多く含まれるアルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン等のタンパク質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｕｍａｎ １４等で除去した後、イオン交換、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣ等でさらに分画することが好ましい。
【0034】
測定は、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、液体クロマトグラフィ・タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔ－ｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ）、表面増強レーザーイオン化質量分析（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＳＥＬＤＩ－ＭＳ）等により行うことができる。
【0035】
本発明の検出方法では、測定により得たＧＤＦ１５プロペプチド量が、対照から算出した基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を超えた場合に、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、胃癌又は食道癌が検出されたと判定することが好ましい。また本発明の非小細胞肺癌と小細胞肺癌とを鑑別して検出する方法としては、非小細胞肺癌から算出した基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）を超えた場合に、小細胞肺癌が検出されたと判定することが好ましい。
【0036】
判定に用いるＧＤＦ１５プロペプチド量は、測定値もしくは換算濃度値の何れでもよい。なお、換算濃度値は、ＧＤＦ１５プロペプチドを標準試料として作成された検量線に基づいて測定値から換算される値をいう。標準試料の濃度決定は、質量分析を用いた標準ペプチドの検量線に基づいて測定値から換算される値としてもよい。
【0037】
基準値（Ｃｕｔｏｆｆ値）は、健常人と膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、食道癌、若しくは胃癌、または、非小細胞肺癌と小細胞肺癌とをそれぞれ測定し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析により最適な感度と特異度を示す測定値に適宜設定することができる。
【0038】
＜２＞本発明の癌を検出するための試薬
本発明の第二の態様は、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を含む、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、食道癌、若しくは胃癌を検出する、又は、非小細胞肺癌と小細胞肺癌とを鑑別して検出するための試薬である。前記抗体は、通常は、配列番号２で表されるプロＧＤＦ１５の３０残基目のロイシンから１９６残基目のアルギニンまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体である。
本発明の第二の態様は、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する抗体を含む、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、食道癌、若しくは胃癌を検出する、又は、非小細胞肺癌と小細胞肺癌とを鑑別して検出するための試薬である。前記抗体は、通常は、配列番号２で表されるプロＧＤＦ１５の３０残基目のロイシンから１９６残基目のアルギニンまでの領域内の抗原決定基に結合する抗体である。
【0039】
本態様において検出対象であるＧＤＦ１５プロペプチドには、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド及び／又はＧＤＦ１５プロペプチド断片が含まれ、ＧＤＦ１５プロペプチド断片には、ｄＮＴ５７－ＧＤＰＰ、ｄＮＴ７３－ＧＤＰＰ、及びその他のペプチド断片が含まれる。
【0040】
本発明の試薬を前述したサンドイッチ法に利用する場合は、前記抗体としてエピトープの異なる２種類の抗体を含むことが必要である。
【0041】
本発明の検出試薬は、さらに、癌の腫瘍マーカーを認識する抗体を含む、癌の腫瘍マーカーの検出試薬を含んでいてもよい。癌の腫瘍マーカーとしては、例えば表１に示すものが挙げられる。
【0042】
本発明の試薬に含まれる抗体は、抗体そのものであってもよく、標識されていてもよく、固相に固定化されていてもよい。
【0043】
本発明の試薬のうち、前述したサンドイッチ法の一態様である２ステップサンドイッチ法に利用する場合について、以下に具体的に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
【0044】
まず、本発明の試薬は、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）に示す方法で作製することができる。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する、エピトープの異なる２種類の抗体（以下、「抗体１」及び「抗体２」とする）のうち、抗体１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
（ＩＩ）担体に前記抗体１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行ない１次試薬とする。
（ＩＩＩ）他方の抗体２を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、又はビオチンに対するアビジンなど特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等が好ましい。
（Ｉ）まず、サンドイッチ法で用いる、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識する、エピトープの異なる２種類の抗体（以下、「抗体１」及び「抗体２」とする）のうち、抗体１をイムノプレートや磁性粒子等のＢ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離可能な担体に結合させる。結合方法は、疎水結合を利用した物理的結合であってもよいし、２物質間を架橋可能なリンカー試薬などを用いた化学的結合であってもよい。
（ＩＩ）担体に前記抗体１を結合させた後、非特異的結合を避けるため、担体表面を牛血清アルブミン、スキムミルク、市販のイムノアッセイ用ブロッキング剤などでブロッキング処理を行ない１次試薬とする。
（ＩＩＩ）他方の抗体２を標識し、得られた標識抗体を含む溶液を２次試薬として準備する。抗体２に標識する物質としては、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼといった酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープなどの検出装置で検出可能な物質、又はビオチンに対するアビジンなど特異的に結合する相手が存在する物質等が好ましい。また、２次試薬の溶液としては、抗原抗体反応が良好に行える緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等が好ましい。
【0045】
このようにして作製した本発明の試薬は必要に応じ凍結乾燥させてもよい。
【0046】
なお、１ステップサンドイッチ法の場合は、前述した（Ｉ）～（ＩＩ）同様に担体に抗体１を結合させブロッキング処理を行なったものを作製し、前記抗体固定化担体に、標識した抗体２を含む緩衝液をさらに添加して試薬を作製すればよい。
【0047】
次に、前述した方法で得られた試薬を用いて、２ステップサンドイッチ法でＧＤＦ１５プロペプチドを検出し測定するには、以下の（ＩＶ）から（ＶＩ）に示す方法で行なえばよい。
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＧＤＦ１５プロペプチド溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＧＤＦ１５プロペプチド濃度を定量する。
（ＩＶ）（ＩＩ）で作製した１次試薬と検体とを一定時間、一定温度のもと接触させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（Ｖ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、続いて（ＩＩＩ）で作製した２次試薬と一定時間、一定温度のもと接触させ、サンドイッチ複合体を形成させる。反応条件は、温度４℃から４０℃の範囲で、５分から１８０分間反応させればよい。
（ＶＩ）未反応物質をＢ／Ｆ分離により除去し、標識抗体の標識物質を定量し、既知濃度のＧＤＦ１５プロペプチド溶液を標準とし作成した検量線により、検体中のヒトＧＤＦ１５プロペプチド濃度を定量する。
【0048】
検出試薬に含まれる抗体等の試薬成分の量は、検体量、検体の種類、試薬の種類、検出の手法等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。具体的には、例えば、後述するように検体として２．５倍希釈した血清や血漿を５０μＬ使用して、サンドイッチ法によりＧＤＦ１５プロペプチド量の測定を行う場合、当該検体５０μＬを抗体と反応させる反応系当たり、担体へ結合させる抗体量が１００ｎｇから１０００μｇであってよく、標識抗体量が２ｎｇから２０μｇであってよい。
【0049】
本発明の癌検出試薬は、用手法での検出にも利用可能であり、自動免疫診断装置を用いた検出にも利用可能である。特に自動免疫診断装置を用いた検出は、検体中に含まれる内在性の測定妨害因子や競合酵素の影響を受けることなく検出が可能で、かつ短時間に検体中のＧＤＦ１５プロペプチド並びに癌の腫瘍マーカーの濃度が定量可能であるため、好ましい。
【0050】
本発明の癌を検出する方法及び本発明の検出試薬の対象となる検体（被検試料）は、全血、血球、血清、血漿などの血液成分、細胞または組織の抽出液、尿、脳脊髄液などが挙げられる。血液成分や尿などの体液を検体として用いると、癌を簡便かつ非侵襲的に検出できるため好ましく、検体採取の容易性、他の検査項目への汎用性を考慮すると、血液成分を検体として用いるのが特に好ましい。検体の希釈倍率は無希釈から１００倍希釈の中から使用する検体の種類や状態に応じて適宜選択すればよく、例えば、血清や血漿の場合は、２．５倍希釈した検体を５０μＬ用いればよい。
【実施例】
【0051】
以下に本発明を具体的に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【0052】
＜実施例１＞ モノクローナル抗体作製
既知の方法（ＤＮＡ免疫：特開２０１３－０６１３２１号公報）により、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識するモノクローナル抗体を５種類作製した。
既知の方法（ＤＮＡ免疫：特開２０１３－０６１３２１号公報）により、ＧＤＦ１５プロペプチドを認識するモノクローナル抗体を５種類作製した。
【0053】
＜実施例２＞ 各種モノクローナル抗体のエピトープ解析
実施例１で作製した各抗体の抗原認識部位を、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド（ｉＧＤＰＰ）及びＮ末端欠損型ＧＤＦ１５プロペプチド断片（ｄＮＴ－ＧＤＰＰ）のバリアント発現細胞培養上清により同定した。
実施例１で作製した各抗体の抗原認識部位を、インタクトＧＤＦ１５プロペプチド（ｉＧＤＰＰ）及びＮ末端欠損型ＧＤＦ１５プロペプチド断片（ｄＮＴ－ＧＤＰＰ）のバリアント発現細胞培養上清により同定した。
【0054】
各種組換えＧＤＰＰの発現評価及び精製工程のため、５’末端にＦＬＡＧタグ及びＳｔｒｅｐＩＩ－ｔａｇを、３’末端にＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）のＣ末端側７アミノ酸からなるＢＮＣペプチド（特開２００９－２４０３００号公報）をコードするオリゴヌクレオチドをさらに挿入した、分泌型ｉＧＤＰＰ及び４種のｄＮＴ－ＧＤＰＰを発現可能なプラスミドを調製した。作製した各種組換えＧＤＰＰの構造を図１に、具体的な調製方法を以下に示す。
【0055】
なお、図１に示すように、配列番号２のアミノ酸配列において、ｉＧＤＰＰは３０残基目～１９６残基目に、ｄＮＴ３７－ＧＤＰＰは３８残基目～１９６残基目に、ｄＮＴ５９－ＧＤＰＰは６０残基目～１９６残基目に、ｄＮＴ７７－ＧＤＰＰは７８残基目～１９６残基目に、ｄＮＴ９４－ＧＤＰＰは９５残基目～１９６残基目に、それぞれ相当するものである。
【0056】
（１）ヒトＧＤＦ１５のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｅｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＭ＿００４８６４）から設計したプライマーを表２に示す組み合わせで用いて、ｉＧＤＰＰ、ｄＮＴ３７－ＧＤＰＰ、ｄＮＴ５９－ＧＤＰＰ、ｄＮＴ－７７ＧＤＰＰ及びｄＮＴ９４－ＧＤＰＰに相当する各ポリヌクレオチドを、常法に従いＲＴ－ＰＣＲ法により増幅した。
【0057】
【表2】
【0058】
（２）Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅのＧＰＩアンカー領域を含むプラスミドｐＦＬＡＧ１（ＳＩＧＭＡ社製）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩ部位に、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を用いて、プロトコルに従い、（１）のＲＴ－ＰＣＲ増幅産物を挿入し、各種分泌型ＧＤＰＰ発現プラスミドを構築した。
（３）プラスミドｐＦＬＡＧ１に挿入したポリヌクレオチドにより発現される各種分泌型ＧＤＰＰにおいて、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端側にＢＮＣタグが付加されていることを確認するために、一過性発現細胞である２９３Ｔ細胞株を用い、下記の方法で検証した。
（４）常法に従い、（２）で構築した各種分泌型ＧＤＰＰ発現プラスミドを２９３Ｔ細胞株へ導入して各種分泌型ＧＤＰＰを一過性発現させ、培養７２時間後の培養液を遠心分離し、上清を各種分泌型ＧＤＰＰ溶液として回収した。
（３）プラスミドｐＦＬＡＧ１に挿入したポリヌクレオチドにより発現される各種分泌型ＧＤＰＰにおいて、Ｎ末端側にＦＬＡＧタグ、Ｃ末端側にＢＮＣタグが付加されていることを確認するために、一過性発現細胞である２９３Ｔ細胞株を用い、下記の方法で検証した。
（４）常法に従い、（２）で構築した各種分泌型ＧＤＰＰ発現プラスミドを２９３Ｔ細胞株へ導入して各種分泌型ＧＤＰＰを一過性発現させ、培養７２時間後の培養液を遠心分離し、上清を各種分泌型ＧＤＰＰ溶液として回収した。
【0059】
（５）各種分泌型ＧＤＰＰ溶液を試料として用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）を以下の通り実施した。
（５－１）ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を１００ｎｇ／ウェルになるようカーボネート緩衝液（ｐＨ９．８）で希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製）に固相化した。
（５－２）４℃にて一晩反応後、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）により３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＴＢＳ溶液を２５０μＬ／ウェルにて各ウェルに添加し、室温で２時間放置した。
（５－３）ＴＢＳにより３回洗浄を行ない、各種分泌型ＧＤＰＰ溶液、及び、陰性対照として発現プラスミドを導入していない２９３Ｔ細胞株の培養上清を、５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（５－１）ウサギ抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社製）を１００ｎｇ／ウェルになるようカーボネート緩衝液（ｐＨ９．８）で希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ９６穴プレート（ＮＵＮＣ社製）に固相化した。
（５－２）４℃にて一晩反応後、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）により３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＴＢＳ溶液を２５０μＬ／ウェルにて各ウェルに添加し、室温で２時間放置した。
（５－３）ＴＢＳにより３回洗浄を行ない、各種分泌型ＧＤＰＰ溶液、及び、陰性対照として発現プラスミドを導入していない２９３Ｔ細胞株の培養上清を、５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
【0060】
（５－４）０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ－Ｔ）により３回洗浄を行なった後、１％ＢＳＡを含むＴＢＳ－Ｔ（１％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔ）で１μｇ／ｍＬになるよう希釈したマウス抗ＢＮＣモノクローナル抗体溶液、または、各モノクローナル抗体を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間放置した。
（５－５）ＴＢＳ－Ｔにより３回洗浄を行なった後、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔで１００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ－Ｆｃ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（５－６）ＴＢＳ－Ｔにより４回洗浄を行ない、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光値を測定した。
（５－７）ＥＬＩＳＡ解析の結果を図２に、各抗体の抗原認識部位を表３に示す。
（５－５）ＴＢＳ－Ｔにより３回洗浄を行なった後、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔで１００００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスイムノグロブリンＧ－Ｆｃ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を５０μＬ／ウェルにて添加し、室温で１時間放置した。
（５－６）ＴＢＳ－Ｔにより４回洗浄を行ない、ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加後、１ｍｏｌ／Ｌリン酸溶液で反応停止し、吸光測定プレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光値を測定した。
（５－７）ＥＬＩＳＡ解析の結果を図２に、各抗体の抗原認識部位を表３に示す。
【0061】
【表3】
【0062】
＜実施例３＞ ＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬の調製
実施例１で作製した抗ＧＤＰＰモノクローナル抗体を用い、抗体の組み合わせを変えて２種類のＧＤＰＰ測定試薬を作製した。１つはＧＤＰＰのＮ末端領域を認識する抗体（ＴＳ－ＧＤＰＰ０２）とＣ末端領域を認識する抗体（ＴＳ－ＧＤＰＰ０４）の組み合わせで、インタクトＧＤＰＰ（ｉＧＤＰＰ）を検出する。もう一方は、Ｃ末端領域を認識する抗体どうしの組み合わせ（ＴＳ－ＧＤＰＰ０４とＴＳ－ＧＤＰＰ０８）で、ｉＧＤＰＰとｄＮＴ－ＧＤＰＰの両方を検出する。後者で検出される値を、総ＧＤＰＰ（ｔＧＤＰＰ）とする。以下に、具体的な調製方法を記載する。
実施例１で作製した抗ＧＤＰＰモノクローナル抗体を用い、抗体の組み合わせを変えて２種類のＧＤＰＰ測定試薬を作製した。１つはＧＤＰＰのＮ末端領域を認識する抗体（ＴＳ－ＧＤＰＰ０２）とＣ末端領域を認識する抗体（ＴＳ－ＧＤＰＰ０４）の組み合わせで、インタクトＧＤＰＰ（ｉＧＤＰＰ）を検出する。もう一方は、Ｃ末端領域を認識する抗体どうしの組み合わせ（ＴＳ－ＧＤＰＰ０４とＴＳ－ＧＤＰＰ０８）で、ｉＧＤＰＰとｄＮＴ－ＧＤＰＰの両方を検出する。後者で検出される値を、総ＧＤＰＰ（ｔＧＤＰＰ）とする。以下に、具体的な調製方法を記載する。
【0063】
（１）水不溶性フェライト担体に抗ＧＤＦ１５プロペプチドモノクローナル抗体（ＴＳ－ＧＤＰＰ０２及び０８）を１００ｎｇ／担体になるように室温にて一昼夜物理的に吸着させ、その後１％ＢＳＡを含む１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）にて４０℃・４時間ブロッキングを行なうことで、抗ＧＤＦ１５プロペプチド抗体固定化担体を調製した。
（２）抗ＧＤＦ１５プロペプチドモノクローナル抗体（ＴＳ－ＧＤＰＰ０４）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて、抗ＧＤＦ１５プロペプチド標識抗体を調製した。
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に、（１）で調製した１２個の抗体固定化担体を入れた後、（２）で調製した標識抗体を０．５μｇ／ｍＬ含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）５０μＬを添加し、凍結乾燥を実施することで、ＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬を作製した。なお、作製したＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで４℃で保管した。
（２）抗ＧＤＦ１５プロペプチドモノクローナル抗体（ＴＳ－ＧＤＰＰ０４）をアルカリフォスファターゼ標識キット（同仁化学社製）にて、抗ＧＤＦ１５プロペプチド標識抗体を調製した。
（３）磁力透過性の容器（容量１．２ｍＬ）に、（１）で調製した１２個の抗体固定化担体を入れた後、（２）で調製した標識抗体を０．５μｇ／ｍＬ含む緩衝液（３％ＢＳＡを含むトリス緩衝液、ｐＨ８．０）５０μＬを添加し、凍結乾燥を実施することで、ＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬を作製した。なお、作製したＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬は窒素充填下にて密閉封印シールを施し、測定まで４℃で保管した。
【0064】
＜実施例４＞ ＧＤＦ１５プロペプチド標準品の調製
実施例３で調製した分泌型ｉＧＤＰＰ培養上清中には分解物が混在しているため、組換えｉＧＤＰＰのＮ末端側にあるＳｔｒｅｐ－ＩＩタグ（ＩＢＡ社製）を利用し、市販の精製キット（ＩＢＡ社製）で全長ＧＤＦ１５プロペプチドのみを精製した。精製後の分泌型ｉＧＤＰＰを、ウェスタンブロッティング法により評価した。各種精製サンプルを常法に従いＳＤＳ－ＰＡＧＥで展開し、ＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に転写した。ブロッキングワン溶液（ナカライテスク社製）にてブロッキング後、当該ブロッキング溶液に添加しアルカリフォスファターゼ標識抗ＢＮＣ抗体を１μｇ／シートにて添加し、４℃で一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔで洗浄後、ＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用い、得られた化学発光をＬＡＳ ４０００画像解析装置（ＧＥヘルスケア社製）により検出した。
実施例３で調製した分泌型ｉＧＤＰＰ培養上清中には分解物が混在しているため、組換えｉＧＤＰＰのＮ末端側にあるＳｔｒｅｐ－ＩＩタグ（ＩＢＡ社製）を利用し、市販の精製キット（ＩＢＡ社製）で全長ＧＤＦ１５プロペプチドのみを精製した。精製後の分泌型ｉＧＤＰＰを、ウェスタンブロッティング法により評価した。各種精製サンプルを常法に従いＳＤＳ－ＰＡＧＥで展開し、ＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に転写した。ブロッキングワン溶液（ナカライテスク社製）にてブロッキング後、当該ブロッキング溶液に添加しアルカリフォスファターゼ標識抗ＢＮＣ抗体を１μｇ／シートにて添加し、４℃で一晩反応させた。ＴＢＳ－Ｔで洗浄後、ＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ試薬（ＧＥヘルスケア社製）を用い、得られた化学発光をＬＡＳ ４０００画像解析装置（ＧＥヘルスケア社製）により検出した。
【0065】
ＧＤＰＰ精製品のウェスタンブロッティング結果を図３に示す。タグペプチドのために分子量が大きくなっているが、Ｎ末及びＣ末どちらのタグ抗体を用いても、全長ＧＤＦ１５プロペプチドのバンドが１本のみ検出された。
【0066】
＜実施例５＞ ＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬の性能評価
ＧＤＦ１５プロペプチドを含むサンプルとして実施例４で作製した組換えＧＤＰＰ上清、及び前立腺癌細胞株ＬｎＣａｐの培養上清をそれぞれＦＢＳで１０倍希釈し、ＧＤＦ１５プロペプチドを含まないサンプルとしてＦＢＳのみの計３種の擬似検体サンプルをそれぞれ調製した。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００（東ソー社製：製造販売届出番号１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００９）を用いて実施例４で作製した２種のＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬の性能評価を実施した。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００による測定は、
（１）希釈サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例３で作製したＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４－メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加する、
ことで行い、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４－メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。ＡＩＡ測定の結果、ＦＢＳを除くいずれの擬似検体サンプルも５点測定の変動係数が３％以下を示し、実施例３で作製したＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬にて得られる結果が信頼し得る結果であることが証明された。
ＧＤＦ１５プロペプチドを含むサンプルとして実施例４で作製した組換えＧＤＰＰ上清、及び前立腺癌細胞株ＬｎＣａｐの培養上清をそれぞれＦＢＳで１０倍希釈し、ＧＤＦ１５プロペプチドを含まないサンプルとしてＦＢＳのみの計３種の擬似検体サンプルをそれぞれ調製した。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００（東ソー社製：製造販売届出番号１３Ｂ３Ｘ９０００２０００００９）を用いて実施例４で作製した２種のＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬の性能評価を実施した。全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００による測定は、
（１）希釈サンプル２０μＬと界面活性剤を含む希釈液８０μＬを、実施例３で作製したＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬を収容した容器に自動で分注し、
（２）３７℃恒温下で１０分間の抗原抗体反応を行ない、
（３）界面活性剤を含む緩衝液にて８回の洗浄を行ない、
（４）４－メチルウンベリフェリルリン酸塩を添加する、
ことで行い、単位時間当たりのアルカリフォスファターゼによる４－メチルウンベリフェロン生成濃度をもって測定値（ｎｍｏｌ／（Ｌ・ｓ））とした。ＡＩＡ測定の結果、ＦＢＳを除くいずれの擬似検体サンプルも５点測定の変動係数が３％以下を示し、実施例３で作製したＧＤＦ１５プロペプチド測定試薬にて得られる結果が信頼し得る結果であることが証明された。
【0067】
＜実施例６＞ 臨床検体の測定
本実施例で使用した血清検体パネル（総計１２３症例）の内訳を表４に示す。健常人血清検体はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社より、各種癌血清検体はＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入し、各社の製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。
本実施例で使用した血清検体パネル（総計１２３症例）の内訳を表４に示す。健常人血清検体はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社より、各種癌血清検体はＰＲＯＭＥＤＤＸ社から購入し、各社の製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。
【0068】
【表4】
【0069】
全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００（東ソー社製）を評価用装置とし、実施例３で作製したｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰ測定試薬を用いて臨床検体を測定した。各種測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ Ｐｌｏｔ）を図４に、各検体群のｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰ測定値の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５％パーセンタイル、最大値および９５％信頼区間における測定値範囲を表５に示す。
ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰ測定値は、健常群と比較していずれの癌種群においても明瞭に高値を示し、特に消化器系の主要な癌種である膵癌および大腸癌で測定値が高い傾向が認められた。
ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰ測定値は、健常群と比較していずれの癌種群においても明瞭に高値を示し、特に消化器系の主要な癌種である膵癌および大腸癌で測定値が高い傾向が認められた。
【0070】
【表5】
【0071】
次に、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰの健常人群と各種癌検体群間における受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析の結果を図５に、ＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ、ＲＯＣ曲線下面積）および有意差検定におけるＰ値を表６に示す。ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは、いずれの癌種においても健常人と統計的な有意差が認められ、優れた癌検出性能を有することが明らかとなった。特に、肺癌、膵癌および大腸癌ではＡＵＣが０．９以上となり、健常と癌の鑑別に極めて有用であることが示された。
【0072】
【表6】
【0073】
＜実施例７＞ ＣＡ１９－９との性能比較
消化器癌の代表的なマーカーであるＣＡ１９－９とｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰの消化器癌検出性能を比較した。ＣＡ１９－９（東ソー社製：製造販売届出番号２０４００ＡＭＺ００９１３０００）測定試薬により、実施例６で測定した健常、膵癌および大腸癌血清検体を解析した結果を図６に、健常と膵癌または大腸癌のＲＯＣ解析から求めたＡＵＣおよび有意差検定におけるＰ値を表７に示す。ＣＡ１９－９は健常群と比較して膵癌群または大腸癌群で高値傾向を示し、ＲＯＣ解析からも優れた消化器系腫瘍マーカーであることが示された。一方、ｉＧＤＰＰまたはｔＧＤＰＰはＣＡ１９－９に比べて膵癌および大腸癌検出性能が優れていることが示された。
消化器癌の代表的なマーカーであるＣＡ１９－９とｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰの消化器癌検出性能を比較した。ＣＡ１９－９（東ソー社製：製造販売届出番号２０４００ＡＭＺ００９１３０００）測定試薬により、実施例６で測定した健常、膵癌および大腸癌血清検体を解析した結果を図６に、健常と膵癌または大腸癌のＲＯＣ解析から求めたＡＵＣおよび有意差検定におけるＰ値を表７に示す。ＣＡ１９－９は健常群と比較して膵癌群または大腸癌群で高値傾向を示し、ＲＯＣ解析からも優れた消化器系腫瘍マーカーであることが示された。一方、ｉＧＤＰＰまたはｔＧＤＰＰはＣＡ１９－９に比べて膵癌および大腸癌検出性能が優れていることが示された。
【0074】
【表7】
【0075】
＜実施例８＞ ｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＣＡ１９－９の感度および特異度の算出
実施例６および７に示すｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＣＡ１９－９のＲＯＣ解析結果を用いて、各種マーカーの感度および特異度を算出した。Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ（感度－（１００－特異度））の最大値から導き出された感度および特異度、並びにカットオフ値を表８に示す。ｉＧＤＰＰ並びにｔＧＤＰＰは肺癌、膵癌および大腸癌で感度および特異度がいずれも８５％以上となり、優れた癌検出性能を有することが明らかとなった。また、ｉＧＤＰＰ並びにｔＧＤＰＰはＣＡ１９－９に比べて膵癌並びに大腸癌の検出性能が優れていることが示された。さらに、ｉＧＤＰＰ並びにｔＧＤＰＰはＣＡ１９－９陰性膵癌検体３例中３例、ＣＡ１９－９陰性大腸癌検体８例中６例を陽性と検出できることが示された。
実施例６および７に示すｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＣＡ１９－９のＲＯＣ解析結果を用いて、各種マーカーの感度および特異度を算出した。Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ（感度－（１００－特異度））の最大値から導き出された感度および特異度、並びにカットオフ値を表８に示す。ｉＧＤＰＰ並びにｔＧＤＰＰは肺癌、膵癌および大腸癌で感度および特異度がいずれも８５％以上となり、優れた癌検出性能を有することが明らかとなった。また、ｉＧＤＰＰ並びにｔＧＤＰＰはＣＡ１９－９に比べて膵癌並びに大腸癌の検出性能が優れていることが示された。さらに、ｉＧＤＰＰ並びにｔＧＤＰＰはＣＡ１９－９陰性膵癌検体３例中３例、ＣＡ１９－９陰性大腸癌検体８例中６例を陽性と検出できることが示された。
【0076】
【表8】
【0077】
＜実施例９＞ 臨床検体の測定（食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌）
本実施例で使用した血清検体パネル（総計１２０症例）の内訳を表９に示す。健常人血清検体はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社より、各種癌血清検体はＰＲＯＭＥＤＤＸ社またはＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社から購入し、各社の製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。
本実施例で使用した血清検体パネル（総計１２０症例）の内訳を表９に示す。健常人血清検体はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社より、各種癌血清検体はＰＲＯＭＥＤＤＸ社またはＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ社から購入し、各社の製品添付書類に倫理委員会承認済のプロトコルで収集されたことが明記されている。
【0078】
【表9】
【0079】
全自動エンザイムイムノアッセイ装置ＡＩＡ－２０００（東ソー社製）を評価用装置とし、実施例３で作製したｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰ測定試薬を用いて上記臨床検体を測定した。各種測定値のボックスプロット（Ｂｏｘ Ｐｌｏｔ）を図７に、各検体群のｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰ測定値の最小値、２５パーセンタイル、中央値、７５％パーセンタイル、最大値および９５％信頼区間における測定値範囲を表１０に示す。
ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰ測定値は、健常群と比較して食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌のいずれの癌種群においても明瞭に高値を示した。
ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰ測定値は、健常群と比較して食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌のいずれの癌種群においても明瞭に高値を示した。
【0080】
【表10】
【0081】
次に、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰの健常人群と食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌群間におけるＲＯＣ曲線解析から算出したＡＵＣおよび有意差検定におけるＰ値を表１１に示す。ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは、いずれの癌種においてもＡＵＣが０．９以上であり、統計的な有意差が認められたことから、優れた癌検出性能を有することが明らかとなった。
【0082】
【表11】
【0083】
＜実施例１０＞ 食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌におけるｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰの感度および特異度の算出
実施例９に示すｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰのＲＯＣ曲線解析結果を用いて、各種マーカーの感度および特異度を算出した。Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ（感度－（１００－特異度））の最大値から導き出された感度および特異度、並びにカットオフ値を表１２に示す。ｉＧＤＰＰ並びにｔＧＤＰＰは食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌群で感度および特異度がいずれも８５％以上となり（胃癌のｉＧＤＰＰによる感度を除く）、優れた癌検出性能を有することが明らかとなった。
実施例９に示すｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰのＲＯＣ曲線解析結果を用いて、各種マーカーの感度および特異度を算出した。Ｙｏｕｄｅｎ Ｉｎｄｅｘ（感度－（１００－特異度））の最大値から導き出された感度および特異度、並びにカットオフ値を表１２に示す。ｉＧＤＰＰ並びにｔＧＤＰＰは食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌群で感度および特異度がいずれも８５％以上となり（胃癌のｉＧＤＰＰによる感度を除く）、優れた癌検出性能を有することが明らかとなった。
【0084】
【表12】
【0085】
＜実施例１１＞食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌におけるｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＣＥＡの陽性率の比較
癌全般の代表的なマーカーであるＣＥＡとｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰの食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌における陽性率を比較した。ＣＥＡ測定試薬（東ソー社製：製造販売届出番号２０１００ＥＺＺ００１１２０００）により、実施例９記載の食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌検体を解析した。ＣＥＡはカットオフ値５ｎｇ／ｍＬ以上、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは実施例１０記載のカットオフ値で陽性率を算出した。ＣＥＡ測定値のボックスプロットを図８に、陽性率一覧を表１３に示す。ＣＥＡは様々な癌種で上昇傾向が認められたものの、ｉＧＤＰＰ並びにｔＧＤＰＰは食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌群でいずれもＣＥＡに比べて陽性率が２倍程度高く、優れた癌検出性能を有することが明らかとなった。
癌全般の代表的なマーカーであるＣＥＡとｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰの食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌における陽性率を比較した。ＣＥＡ測定試薬（東ソー社製：製造販売届出番号２０１００ＥＺＺ００１１２０００）により、実施例９記載の食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌検体を解析した。ＣＥＡはカットオフ値５ｎｇ／ｍＬ以上、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは実施例１０記載のカットオフ値で陽性率を算出した。ＣＥＡ測定値のボックスプロットを図８に、陽性率一覧を表１３に示す。ＣＥＡは様々な癌種で上昇傾向が認められたものの、ｉＧＤＰＰ並びにｔＧＤＰＰは食道癌、胃癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌群でいずれもＣＥＡに比べて陽性率が２倍程度高く、優れた癌検出性能を有することが明らかとなった。
【0086】
【表13】
【0087】
＜実施例１２＞肺癌におけるｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＣＥＡの組織型鑑別性能の比較
肺癌の組織型は主に非小細胞（約８５％）と小細胞（約１５％）に大別されるが、組織型毎に治療方針が異なるため、組織型の鑑別が重要とされている。そこで、ｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＣＥＡの非小細胞肺癌と小細胞肺癌の組織型鑑別性能を比較した。ＣＥＡ、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰの非小細胞肺癌又は小細胞肺癌検体群の比較解析結果を図９に、ＲＯＣ曲線解析結果を図１０に示す。ＣＥＡは非小細胞肺癌で高値傾向を示したものの、有意差は認められなかった（マン＝ホイットニーのＵ検定、ｐ＝０．９７４７）。一方、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは小細胞肺癌で高値傾向を示し、ｉＧＤＰＰは有意差が認められた（マン＝ホイットニーのＵ検定、ｐ＝０．０４５２）。ＲＯＣ曲線解析においても、ＣＥＡはＡＵＣが０．５であり鑑別性能を有しないことが示された一方、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰはＡＵＣが０．７程度であり、良好な鑑別性能を有することが示された。
肺癌の組織型は主に非小細胞（約８５％）と小細胞（約１５％）に大別されるが、組織型毎に治療方針が異なるため、組織型の鑑別が重要とされている。そこで、ｉＧＤＰＰ、ｔＧＤＰＰおよびＣＥＡの非小細胞肺癌と小細胞肺癌の組織型鑑別性能を比較した。ＣＥＡ、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰの非小細胞肺癌又は小細胞肺癌検体群の比較解析結果を図９に、ＲＯＣ曲線解析結果を図１０に示す。ＣＥＡは非小細胞肺癌で高値傾向を示したものの、有意差は認められなかった（マン＝ホイットニーのＵ検定、ｐ＝０．９７４７）。一方、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰは小細胞肺癌で高値傾向を示し、ｉＧＤＰＰは有意差が認められた（マン＝ホイットニーのＵ検定、ｐ＝０．０４５２）。ＲＯＣ曲線解析においても、ＣＥＡはＡＵＣが０．５であり鑑別性能を有しないことが示された一方、ｉＧＤＰＰおよびｔＧＤＰＰはＡＵＣが０．７程度であり、良好な鑑別性能を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【0088】
本発明により、肺癌、膵癌、大腸癌、乳癌、食道癌、若しくは胃癌を検出する、又は、非小細胞肺癌と小細胞肺癌とを鑑別して検出することができる、ＧＤＦ１５プロペプチドを検出する方法及び試薬が提供される。これにより、従来のマーカーでは判別の難しい様々な癌を血液診断等で簡便かつ精度高く検出することができる。その結果、癌の検出を簡便にし、治療法の選択ならびに治療効果判定が可能となるため、産業上非常に有用である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】