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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-08-25
(45)【発行日】2022-09-02
(54)【発明の名称】容器及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20220826BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20220826BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20220826BHJP
C08G 65/32 20060101ALI20220826BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 C ZNA
C12N5/071
C12N1/00 B
C08G65/32
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2018006810
(22)【出願日】2018-01-18
(65)【公開番号】P2019122341
(43)【公開日】2019-07-25
【審査請求日】2021-01-12
(73)【特許権者】
【識別番号】504139662
【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構
(73)【特許権者】
【識別番号】301021533
【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100147267
【弁理士】
【氏名又は名称】大槻 真紀子
(74)【代理人】
【識別番号】100140774
【弁理士】
【氏名又は名称】大浪 一徳
(72)【発明者】
【氏名】須賀 英隆
(72)【発明者】
【氏名】有馬 寛
(72)【発明者】
【氏名】榊原 真弓
(72)【発明者】
【氏名】杉浦 慎治
(72)【発明者】
【氏名】田村 磨聖
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 琢
(72)【発明者】
【氏名】長崎 玲子
(72)【発明者】
【氏名】長崎 晃
(72)【発明者】
【氏名】金森 敏幸
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５３１４３３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５２７６６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／１４７８７８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１２９６７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１０４５４１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１５９３８０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０１３６６９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／００
Ｃ１２Ｎ ５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
液体を貯留可能な内部空間が形成された容器本体と、前記内部空間を複数の液体貯留部に区画する隔壁と、を備え、
前記隔壁に、前記複数の液体貯留部のうち第１液体貯留部と第２液体貯留部とを連通させる孔が形成されており、前記孔にはハイドロゲルが保持されており、
前記孔の開口部は、前記隔壁の厚さ方向から見て、前記隔壁の全ての周縁から離れた位置に形成されており、
前記隔壁の厚さ方向の一方の面及び他方の面において、前記隔壁の厚さ方向から見た前記孔の断面積と同じ面積の円を想定したときの円の直径（面積相当径）をｄとし、前記孔が形成された箇所における前記隔壁の厚さをｔとしたとき、ｔ：ｄは、１：０．５～１：５であり、
前記孔の１つあたりの体積は、０．５μＬ～１ｍＬであり、
前記ハイドロゲルは、細胞を包含した状態で、前記孔の全体に充填されており、前記ハイドロゲルは、前記隔壁の厚さ方向の一方の面と面一である第１主面と、前記隔壁の厚さ方向の他方の面と面一である第２主面とを有する、容器。
【請求項2】
前記孔の表面の少なくとも一部に、前記ハイドロゲルを固定するための化合物が積層されている、請求項１に記載の容器。
【請求項3】
前記ハイドロゲルが、下記式（Ａ）で表される化合物、下記式（Ｂ）で表される化合物、培地及び前記細胞を混合することにより得られるものである、請求項１又は２に記載の容器。【化1】
【化2】
【請求項4】
前記アルキニル基が、シクロオクチン環又はアザシクロオクチン環を有する基である、請求項３に記載の容器。
【請求項5】
前記式（Ａ）で表される化合物がＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧであり、前記式（Ｂ）で表される化合物がＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧである、請求項３に記載の容器。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の容器の製造方法であって、前記孔に前記細胞を包含したハイドロゲルを配置する工程を含む、容器の製造方法。
【請求項7】
前記孔に前記細胞を包含したハイドロゲルを配置する工程は、前記ハイドロゲルの材料に前記細胞を混合して調製したプレゲル溶液を前記孔に注入して前記孔を満たす工程と、
前記プレゲル溶液をゲル化させて前記ハイドロゲルを形成させる工程と、
を含む、請求項６に記載の容器の製造方法。
【請求項8】
請求項６又は７に記載の容器の製造方法により、前記容器を製造する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、対象物質の濃度が互いに異なる培地をそれぞれ入れ、その結果、前記細胞を包含した前記ハイドロゲルに前記対象物質の濃度勾配が形成される工程と、
前記細胞を包含した前記ハイドロゲルをインキュベートする工程と、
を含む、細胞培養方法。
【請求項9】
前記細胞が下垂体原基の性質を有する細胞塊であり、前記対象物質が、糖質コルチコイド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及びソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）からなる群より選択される分化誘導因子である、請求項８に記載の細胞培養方法。
【請求項10】
下垂体の製造方法であって、請求項６又は７に記載の容器の製造方法により、前記細胞が、下垂体原基の性質を有する細胞塊である、前記容器を製造する工程と、
前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、糖質コルチコイド、ＢＭＰ、ＦＧＦ及びＳｈｈからなる群より選択される分化誘導因子の濃度が互いに異なる培地をそれぞれ入れ、その結果、前記細胞塊を包含した前記ハイドロゲルに前記分化誘導因子の濃度勾配が形成される工程と、
前記細胞塊を包含した前記ハイドロゲルをインキュベートし、その結果、前記細胞塊から下垂体が形成される工程と、
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、容器及びその使用に関する。より具体的には、容器、キット、対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲルの製造方法、細胞培養方法、及び下垂体の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞から、複雑な組織や器官を分化誘導する場合、細胞を３次元培養（３Ｄ培養）することが適していると考えられている。その要諦は、胎児の発生を試験管内で再現することにあり、３Ｄ培養の方が平面培養よりも胎児発生を再現しやすいことにあると考えられる。
【0003】
下垂体は複雑な器官の１例である。例えば、特許文献１には、ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びＳｈｈシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養（３Ｄ浮遊培養）することを含む、腺性下垂体又はその前駆組織を含むヒト細胞凝集塊の製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第２０１６／０１３６６９号
【文献】国際公開第２０１７／１２６５５１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
下垂体の発生はよく研究され、知見が蓄積している。図１は、下垂体分化の後半ともいうべき、下垂体原基を形成した後のマウスの発生を示す模式図である。図１中、ＢＭＰ，ＦＧＦ，Ｓｈｈ，Ｗｎｔは、分化誘導シグナルを表す。図１に示すように、下垂体原基には、背側の視床下部からのシグナル、及び腹側の口腔表皮からのシグナルが濃度勾配を形成した状態で作用すると考えられている。また、左右方向の周囲には神経堤由来の間葉系細胞が遊走してきており、そこからもシグナルが分泌される。
【0006】
特許文献１の製造方法をさらに発展させたものが特許文献２に記載されている。具体的には、マウス又はヒトのＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を３Ｄ培養することで、下垂体分化に必須な視床下部と口腔外胚葉とを、同時に、１つの３Ｄ細胞塊内に分化誘導させることができる。続いて、下垂体原基が自発的に誘導され、最終的に下垂体ホルモン産生細胞へと分化する。
【0007】
この下垂体ホルモン産生細胞は、生体内と同様に、刺激に反応してホルモンを分泌し、周囲に十分なホルモンがあれば抑制がかかるという、高度な分化を達成している。平面培養ではこのような応答能をもった下垂体ホルモン産生細胞を誘導できないことからも、３Ｄ培養は高いポテンシャルを有していると考えられる。
【0008】
一方で、従来の３Ｄ培養法には限界もある。生体の下垂体には、吻側及び尾側、腹側及び背側で、複数種類の下垂体ホルモン産生細胞が、種類ごとに部位を偏在して存在している。これに対して、従来の３Ｄ培養法では、下垂体ホルモン産生細胞を１種類ごとに誘導することはできるが、複数種類の下垂体ホルモン産生細胞を偏在させて同時に誘導することはできない。
【0009】
発明者らは、この原因として、胎児には存在する誘導因子の濃度勾配が、従来の３Ｄ培養法では再現できず、培養液中の誘導因子の濃度が一定になってしまっていることにあると考えた。そこで、本発明は、対象物質の濃度勾配を形成する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は以下の態様を含む。
［１］液体を貯留可能な内部空間が形成された容器本体と、前記内部空間を複数の液体貯留部に区画する隔壁と、を備え、前記隔壁に、前記複数の液体貯留部のうち少なくとも２つを連通させる孔であって、ハイドロゲルが保持される孔が形成されている、容器。
［２］前記孔は、前記隔壁の厚さ方向から見て、前記隔壁の周縁から離れた位置に形成されている、［１］記載の容器。
［３］前記孔の表面の少なくとも一部に、前記ハイドロゲルを固定するための化合物が積層されている、［１］又は［２］に記載の容器。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の容器と、前記ハイドロゲルの材料とを含む、キット。
［５］前記ハイドロゲルの材料が、下記式（Ａ）で表される化合物及び下記式（Ｂ）で表される化合物を含む、［４］に記載のキット。
［式（Ａ）中、Ａ１は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立に、水素原子、－Ｌ－Ｚ１、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｌ－Ｚ１又は炭素原子数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表す。ここで、Ｌは、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～２０の２価の基を表し、Ｚ１はアルキニル基を表し、ｎは２０～５００の整数を表す。ｐは０以上の整数を表す。ｐが２以上の整数である場合、複数存在するＲ２及びＲ４はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］
［式（Ｂ）中、Ａ１は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、Ｒ５～Ｒ８は、それぞれ独立に、水素原子、－Ｌ－Ｚ２、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｌ－Ｚ２又は炭素原子数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表す。ここで、Ｌは、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～２０の２価の基を表し、Ｚ２はアジド基を表し、ｎは２０～５００の整数を表す。ｐは０以上の整数を表す。ｐが２以上の整数である場合、複数存在するＲ６及びＲ８はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］
［６］［１］～［３］のいずれかに記載の容器の前記孔にハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、対象物質の濃度が互いに異なる液体をそれぞれ入れ、その結果、前記ハイドロゲルに前記対象物質の濃度勾配が形成される工程と、を含む、対象物質の濃度勾配を有する前記ハイドロゲルの製造方法。
［７］前記ハイドロゲルが、下記式（Ａ）で表される化合物、下記式（Ｂ）で表される化合物及び水系液体を混合することにより得られるものである、［６］に記載の製造方法。
［式（Ａ）中、Ａ１は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立に、水素原子、－Ｌ－Ｚ１、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｌ－Ｚ１又は炭素原子数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表す。ここで、Ｌは、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～２０の２価の基を表し、Ｚ１はアルキニル基を表し、ｎは２０～５００の整数を表す。ｐは０以上の整数を表す。ｐが２以上の整数である場合、複数存在するＲ２及びＲ４はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］
［式（Ｂ）中、Ａ１は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、Ｒ５～Ｒ８は、それぞれ独立に、水素原子、－Ｌ－Ｚ２、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｌ－Ｚ２又は炭素原子数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表す。ここで、Ｌは、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～２０の２価の基を表し、Ｚ２はアジド基を表し、ｎは２０～５００の整数を表す。ｐは０以上の整数を表す。ｐが２以上の整数である場合、複数存在するＲ６及びＲ８はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］
［８］［１］～［３］のいずれかに記載の容器の前記孔に細胞含有ハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、対象物質の濃度が互いに異なる培地をそれぞれ入れ、その結果、前記細胞含有ハイドロゲルに前記対象物質の濃度勾配が形成される工程と、前記細胞含有ハイドロゲルをインキュベートする工程と、を含む、細胞培養方法。
［９］前記細胞含有ハイドロゲルが、下記式（Ａ）で表される化合物、下記式（Ｂ）で表される化合物、培地及び細胞を混合することにより得られるものである、［８］に記載の細胞培養方法。
［式（Ａ）中、Ａ１は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立に、水素原子、－Ｌ－Ｚ１、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｌ－Ｚ１又は炭素原子数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表す。ここで、Ｌは、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～２０の２価の基を表し、Ｚ１はアルキニル基を表し、ｎは２０～５００の整数を表す。ｐは０以上の整数を表す。ｐが２以上の整数である場合、複数存在するＲ２及びＲ４はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］
［式（Ｂ）中、Ａ１は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、Ｒ５～Ｒ８は、それぞれ独立に、水素原子、－Ｌ－Ｚ２、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｌ－Ｚ２又は炭素原子数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表す。ここで、Ｌは、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～２０の２価の基を表し、Ｚ２はアジド基を表し、ｎは２０～５００の整数を表す。ｐは０以上の整数を表す。ｐが２以上の整数である場合、複数存在するＲ６及びＲ８はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］
［１０］前記細胞が下垂体原基の性質を有する細胞塊であり、前記対象物質が、糖質コルチコイド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及びソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）からなる群より選択される分化誘導因子である、［８］又は［９］に記載の細胞培養方法。
［１１］下垂体の製造方法であって、［１］～［３］のいずれかに記載の容器の前記孔に、下垂体原基の性質を有する細胞塊を含有する、細胞塊含有ハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、糖質コルチコイド、ＢＭＰ、ＦＧＦ及びＳｈｈからなる群より選択される分化誘導因子の濃度が互いに異なる培地をそれぞれ入れ、その結果、前記細胞塊含有ハイドロゲルに前記分化誘導因子の濃度勾配が形成される工程と、前記細胞塊含有ハイドロゲルをインキュベートし、その結果、前記細胞塊から下垂体が形成される工程と、を含む、製造方法。
［１２］前記細胞塊含有ハイドロゲルが、下記式（Ａ）で表される化合物、下記式（Ｂ）で表される化合物、培地及び下垂体原基の性質を有する細胞塊を混合することにより得られるものである、［１１］に記載の製造方法。
［式（Ａ）中、Ａ１は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、Ｒ１～Ｒ４は、それぞれ独立に、水素原子、－Ｌ－Ｚ１、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｌ－Ｚ１又は炭素原子数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表す。ここで、Ｌは、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～２０の２価の基を表し、Ｚ１はアルキニル基を表し、ｎは２０～５００の整数を表す。ｐは０以上の整数を表す。ｐが２以上の整数である場合、複数存在するＲ２及びＲ４はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］
［式（Ｂ）中、Ａ１は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、Ｒ５～Ｒ８は、それぞれ独立に、水素原子、－Ｌ－Ｚ２、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｌ－Ｚ２又は炭素原子数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキル基を表す。ここで、Ｌは、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１～２０の２価の基を表し、Ｚ２はアジド基を表し、ｎは２０～５００の整数を表す。ｐは０以上の整数を表す。ｐが２以上の整数である場合、複数存在するＲ６及びＲ８はそれぞれ同一であってもよく異なっていてもよい。］
［１］液体を貯留可能な内部空間が形成された容器本体と、前記内部空間を複数の液体貯留部に区画する隔壁と、を備え、前記隔壁に、前記複数の液体貯留部のうち少なくとも２つを連通させる孔であって、ハイドロゲルが保持される孔が形成されている、容器。
［２］前記孔は、前記隔壁の厚さ方向から見て、前記隔壁の周縁から離れた位置に形成されている、［１］記載の容器。
［３］前記孔の表面の少なくとも一部に、前記ハイドロゲルを固定するための化合物が積層されている、［１］又は［２］に記載の容器。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の容器と、前記ハイドロゲルの材料とを含む、キット。
［５］前記ハイドロゲルの材料が、下記式（Ａ）で表される化合物及び下記式（Ｂ）で表される化合物を含む、［４］に記載のキット。
【化1】
【化2】
［６］［１］～［３］のいずれかに記載の容器の前記孔にハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、対象物質の濃度が互いに異なる液体をそれぞれ入れ、その結果、前記ハイドロゲルに前記対象物質の濃度勾配が形成される工程と、を含む、対象物質の濃度勾配を有する前記ハイドロゲルの製造方法。
［７］前記ハイドロゲルが、下記式（Ａ）で表される化合物、下記式（Ｂ）で表される化合物及び水系液体を混合することにより得られるものである、［６］に記載の製造方法。
【化3】
【化4】
［８］［１］～［３］のいずれかに記載の容器の前記孔に細胞含有ハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、対象物質の濃度が互いに異なる培地をそれぞれ入れ、その結果、前記細胞含有ハイドロゲルに前記対象物質の濃度勾配が形成される工程と、前記細胞含有ハイドロゲルをインキュベートする工程と、を含む、細胞培養方法。
［９］前記細胞含有ハイドロゲルが、下記式（Ａ）で表される化合物、下記式（Ｂ）で表される化合物、培地及び細胞を混合することにより得られるものである、［８］に記載の細胞培養方法。
【化5】
【化6】
［１０］前記細胞が下垂体原基の性質を有する細胞塊であり、前記対象物質が、糖質コルチコイド、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）及びソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）からなる群より選択される分化誘導因子である、［８］又は［９］に記載の細胞培養方法。
［１１］下垂体の製造方法であって、［１］～［３］のいずれかに記載の容器の前記孔に、下垂体原基の性質を有する細胞塊を含有する、細胞塊含有ハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、糖質コルチコイド、ＢＭＰ、ＦＧＦ及びＳｈｈからなる群より選択される分化誘導因子の濃度が互いに異なる培地をそれぞれ入れ、その結果、前記細胞塊含有ハイドロゲルに前記分化誘導因子の濃度勾配が形成される工程と、前記細胞塊含有ハイドロゲルをインキュベートし、その結果、前記細胞塊から下垂体が形成される工程と、を含む、製造方法。
［１２］前記細胞塊含有ハイドロゲルが、下記式（Ａ）で表される化合物、下記式（Ｂ）で表される化合物、培地及び下垂体原基の性質を有する細胞塊を混合することにより得られるものである、［１１］に記載の製造方法。
【化7】
【化8】
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、対象物質の濃度勾配を形成する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】下垂体原基を形成した後の発生を示す模式図である。
【図2】１実施形態に係る容器の斜視図である。
【図8】３つの液体貯留部を有する容器の一例を示す上面図である。
【図9】１実施形態に係る容器の成形型を示す模式図である。
【図10】１実施形態に係る容器の成形型を示す斜視図である。
【図11】１実施形態に係る容器の製造方法を説明する模式図である。
【図12】１実施形態に係る容器の製造方法を説明する模式図である。
【図13】１実施形態に係る容器の製造方法を説明する模式図である。
【図14】２つの液体貯留部を有する容器の一例を示す上面図である。
【図15】実験例で用いた容器の平面図である。
【図18】（ａ）は、実験例３において、図３～５に示す容器の孔にプレゲル溶液を導入した様子を示す写真である。（ｂ）は、実験例３において、図１５～１７に示す容器の孔にプレゲル溶液を導入した様子を示す写真である。
【図19】（ａ）及び（ｂ）は、孔にハイドロゲルを導入した容器の第１液体貯留部及び第２液体貯留部にそれぞれ液体を導入した状態を示す写真である。
【図20】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４において対象物質としてフルオレセインを使用した場合のハイドロゲルの写真である。（ｃ）は実験例４において対象物質としてフルオレセインを使用した場合の結果を示すグラフである。
【図21】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４において対象物質としてＦＩＴＣデキストランを使用した場合のハイドロゲルの写真である。（ｃ）は実験例４において対象物質としてＦＩＴＣデキストランを使用した場合の結果を示すグラフである。
【図22】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４において対象物質としてＹＦＰ－ＣＦＰ融合タンパク質を使用した場合のハイドロゲルの写真である。（ｃ）は実験例４において対象物質としてＹＦＰ－ＣＦＰ融合タンパク質を使用した場合の結果を示すグラフである。
【図23】（ａ）及び（ｂ）は実験例５における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図24】実験例６における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。また、図には、場合によりＸ－Ｙ－Ｚ座標系を示した。以下、必要に応じて各座標系に基づいて各方向の説明を行う。
【0014】
［容器］
１実施形態において、本発明は、液体を貯留可能な内部空間が形成された容器本体と、前記内部空間を複数の液体貯留部に区画する隔壁と、を備え、前記隔壁に、前記複数の液体貯留部のうち少なくとも２つを連通させる孔であって、ハイドロゲルが保持される孔が形成されている、容器を提供する。後述するように、本実施形態の容器を用いることにより、対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲルを製造することができる。
１実施形態において、本発明は、液体を貯留可能な内部空間が形成された容器本体と、前記内部空間を複数の液体貯留部に区画する隔壁と、を備え、前記隔壁に、前記複数の液体貯留部のうち少なくとも２つを連通させる孔であって、ハイドロゲルが保持される孔が形成されている、容器を提供する。後述するように、本実施形態の容器を用いることにより、対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲルを製造することができる。
【0015】
【0016】
図２～図５において、Ｘ方向は、容器本体１の底板１１の長さ方向である。Ｙ方向は、底板１１に沿う面内でＸ方向に直交する方向である。Ｚ方向は、Ｘ方向およびＹ方向と直交する方向であり、底板１１の厚さ方向である。Ｚ方向を上下方向または高さ方向ともいう。一対の側板１２Ａ，１２Ｂ、及び一対の端板１３Ａ，１３Ｂは、底板１１に対して上方に延出している。平面視とはＺ方向から見ることをいう。
【0017】
図２に示すように、容器１０は、容器本体１と、隔壁２とを備える。容器本体１は、底板１１と、一対の側板１２Ａ，１２Ｂと、一対の端板１３Ａ，１３Ｂと、を備えている。側板１２Ａ，１２Ｂと、端板１３Ａ，１３Ｂと、隔壁２とは、容器１０の主部１４を構成する。主部１４は、一体に形成されていてよい。
【0018】
底板１１は、平面視において矩形状である。側板１２Ａ，１２Ｂは、底板１１の第１主面１１ａに立設されている。側板１２Ａ，１２ＢはＸＺ平面に沿って形成されている。側板１２Ａ，１２Ｂは、例えば、厚さ方向（Ｙ方向）から見て矩形状である。２つの側板１２Ａ，１２ＢはＹ方向に離れて形成されている。
【0019】
端板１３Ａ，１３Ｂは、底板１１の第１主面１１ａに立設されている。端板１３Ａ，１３ＢはＹＺ平面に沿って形成されている。端板１３Ａ，１３Ｂは、厚さ方向（Ｘ方向）から見て矩形状である。２つの端板１３Ａ，１３ＢはＸ方向に離れて形成されている。
【0020】
底板１１と、側板１２Ａ，１２Ｂと、端板１３Ａ，１３Ｂとにより囲まれた空間を内部空間１５という。側板１２Ａ，１２Ｂの下縁及び端板１３Ａ，１３Ｂの下縁と、底板１１とは液密に接合されている。そのため、容器１０は、内部空間１５に液体を貯留可能である。底板１１は、液体貯留部１７Ａ，１７Ｂ（後述）の下部開口を閉止している。
【0021】
隔壁２は、底板１１の第１主面１１ａに立設されている。隔壁２はＸＺ平面に沿って形成されている。隔壁２は、厚さ方向（Ｙ方向）から見て矩形状である。隔壁２は、側板１２Ａ，１２Ｂと平行である。隔壁２は、側板１２Ａ，１２Ｂの間に、側板１２Ａ，１２Ｂから間隔をおいて形成されている。隔壁２は一定の厚さを有する。
【0022】
隔壁２の下縁２ｄは、底板１１の第１主面１１ａに液密に接合されている。隔壁２の側縁２ｆａ，２ｆｂは、それぞれ端板１３Ａ，１３Ｂの内面１３Ａａ，１３Ｂａに達している。隔壁２の上縁２ｅは、側板１２Ａ，１２Ｂの上縁１２Ａｂ，１２Ｂｂ、及び端板１３Ａ，１３Ｂの上縁１３Ａｂ，１３Ｂｂと同じ高さ位置にある。
【0023】
隔壁２は、容器本体１内において、内部空間１５を２つの液体貯留部１７Ａ，１７Ｂに区画している。隔壁２は、２つの液体貯留部１７Ａ，１７Ｂを隔てている。第１液体貯留部１７Ａは、隔壁２の一方の面２ａ（第１主面２ａ）と、第１側板１２Ａとの間に形成された空間である。第２液体貯留部１７Ｂは、隔壁２の他方の面２ｂ（第２主面２ｂ）と、第２側板１２Ｂとの間に形成された空間である。
【0024】
【0025】
図５に示すように、隔壁２の厚さ方向（Ｙ方向）から見た孔２１の形状は、矩形である。孔２１の下縁２１ａ及び上縁２１ｃはＸ方向に沿う。孔２１の側縁２１ｂａ，２１ｂｂはＺ方向に沿う。
【0026】
図５に示すように、孔２１の底面２３ａと天面２３ｃとはＸＹ平面に沿う。底面２３ａと天面２３ｃとは互いに平行である。図５に示すように、孔２１の一対の側面２３ｂａ，２３ｂｂはＹＺ平面に沿う。側面２３ｂａ，２３ｂｂは互いに平行である。底面２３ａは、隔壁２の厚さ方向（Ｙ方向）から見て下縁２１ａと一致する。側面２３ｂａ，２３ｂｂは、Ｙ方向から見て、それぞれ側縁２１ｂａ，２１ｂｂと一致する。天面２３ｃは、Ｙ方向から見て上縁２１ｃと一致する。
【0027】
孔２１は、隔壁２の周縁（下縁２ｄ、上縁２ｅ、および側縁２ｆａ，２ｆｂ）から離れた位置に形成されている。すなわち、孔２１の下縁２１ａは隔壁２の下縁２ｄより高い位置にある。孔２１の側縁２１ｂａ，２１ｂｂは隔壁２の側縁２ｆａ，２ｆｂよりも内方（側縁２ｆａ，２ｆｂが互いに近づく方向）寄りの位置にある。孔２１の上縁２１ｃは、隔壁２の上縁２ｅより低い位置にある。
【0028】
孔２１はハイドロゲルを保持するものである。後述するように、孔２１にハイドロゲルの材料であるプレゲル溶液を注入して孔２１を満たし、続いて、プレゲル溶液をゲル化させてハイドロゲルを形成させることにより、孔２１にハイドロゲルを保持させることができる。ハイドロゲルについては後述する。
【0029】
ここで、実施例において後述するように、容器１０の孔２１の一部が隔壁２の周縁に接している場合、孔２１にプレゲル溶液を注入すると、プレゲル溶液が孔２１から漏れ出てしまう。このような形状のプレゲル溶液をゲル化させると表面が球形のゲルが形成され、その場合、周囲の培地からの対象物質の濃度勾配が乱れてしまう。
【0030】
これに対し、発明者らは、容器１０の孔２１を、隔壁２の周縁から離れた位置に形成することにより、プレゲル溶液を孔２１に注入した場合に、プレゲル溶液を孔２１の内部に保持させることができることを見出した。この状態でプレゲル溶液をゲル化すると、培地と接する面が平面なゲルを得ることができる。その結果、培地を充填した場合に周囲の培地からの対象物質の濃度勾配を、例えば実施例に示すように直線的に形成できる。このように、ゲルの培地と接する面が平面であることが重要であるため、容器１０の孔２１を、隔壁２の周縁から離れた位置に形成することが重要なのである。
【0031】
したがって、容器１０の孔２１が、隔壁２の周縁から離れた位置に形成されていることにより、孔２１の内部に孔２１を満たす形状（孔２１を塞ぐ形状、孔２１と略同一の形状）のハイドロゲルを形成することができる。容器１０の孔２１を満たした状態でハイドロゲルを形成した場合、液体貯留部１７Ａに入れた液体がそのまま液体貯留部１７Ｂへと流出することはない。
【0032】
後述するように、ハイドロゲルには細胞を含ませてもよい。細胞は特に限定されず、ヒト由来の細胞であってもよいし、非ヒト動物由来の細胞であってもよいし、植物由来の細胞であってもよいし、昆虫由来の細胞であってもよい。細胞は、１個ずつばらばらに解離した単一細胞であってもよいし、細胞塊であってもよい。細胞塊を構成する細胞の数は特に限定されず、例えば２～１０８個が例示できる。
【0033】
本実施形態の容器は、例えば細胞の培養に好適に用いることができる。すなわち、本実施形態の容器は培養容器であるということができる。
【0034】
容器１０において、孔２１の表面の少なくとも一部には、ハイドロゲルを固定するための化合物が積層されていることが好ましい。
【0035】
本明細書において、孔２１の表面に化合物を積層するとは、物理吸着、共有結合等により、孔２１の表面に化合物を付着させることを意味する。
【0036】
後述するように、ハイドロゲルとしては、例えば、アジド基を有する化合物とアルキニル基を有する化合物を反応させて形成するハイドロゲルを好適に用いることができる。そこで、このようなハイドロゲルを用いる場合には、ハイドロゲルを固定するための化合物として、アジド基又はアルキニル基を有する化合物を用いることができる。より具体的には、例えば、実施例において後述するアジド化ポリ－Ｌ－リジン等が挙げられる。また、アルキニル基としては、例えば、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）基等が挙げられる。
【0037】
ハイドロゲルを固定するための化合物は、必ずしもハイドロゲルの構成物質と共有結合を形成する必要はない。このような観点から、ハイドロゲルを固定するための化合物としては、上述したものの他にも、例えば、ポリ－Ｌ－リジン、アガロース、ゼラチン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート等を用いることができる。
【0038】
ハイドロゲルを固定するための化合物を孔２１の表面に積層することにより、ハイドロゲルを孔２１に固定し、ハイドロゲルが孔２１から外れるのを防ぐことができる。以下、ハイドロゲルを固定するための化合物を孔２１の表面に積層する操作を、「表面コート処理」という場合がある。
【0039】
孔２１にハイドロゲルが充填された容器１０は培養装置であるということができる。図６は、容器１０の孔２１にハイドロゲルが充填された、培養装置３０を示すＹＺ断面図である。図７は、培養装置３０のＸＺ断面図である。図６および図７に示すように、培養装置３０は、容器本体１と、隔壁２と、ハイドロゲル３を備える。すなわち、培養装置３０は、容器１０の孔２１にハイドロゲル３を設けた構成である。
【0040】
ハイドロゲル３は、細胞４を包含した状態で、孔２１の全体に充填されている。図６に示すように、ハイドロゲル３は、孔２１に、隔壁２の厚さ方向の全体にわたって形成されている。ハイドロゲル３の第１主面３ａは、第１液体貯留部１７Ａに面している。ハイドロゲル３の第１主面３ａはＸＺ平面に沿う面であり、隔壁２の第１主面２ａと面一である。ハイドロゲル３の第２主面３ｂは、第２液体貯留部１７Ｂに面している。ハイドロゲル３の第２主面３ｂはＸＺ平面に沿う面であり、隔壁２の第２主面２ｂと面一である。
【0041】
ゲル３は、孔２１の底面２３ａ、側面２１ｂａ，２１ｂｂ（図６参照）及び天面２３ｃに、その全面にわたって接している。実施例において後述するように、培養装置３０を用いて、対象物質の密度勾配の影響下で細胞を培養することができる。
【0042】
（変形例）
本実施形態の容器は容器１０に限られない。例えば、容器１０の底板１１は、平面視において矩形状であるが、底板１１の形状はこれに限られない。底板１１の形状は、例えば円形、楕円形等であってもよく、３角形、５角形、６角形等の多角形であってもよい。
本実施形態の容器は容器１０に限られない。例えば、容器１０の底板１１は、平面視において矩形状であるが、底板１１の形状はこれに限られない。底板１１の形状は、例えば円形、楕円形等であってもよく、３角形、５角形、６角形等の多角形であってもよい。
【0043】
また、容器１０の外面は略立方体形状であるが、これに限られない。容器の外面は、例えば、直方体形状であってもよいし、例えば球形、楕円体形状等であってもよい。
【0044】
また、容器１０は隔壁２を１つ有しているが、隔壁の数は２以上であってもよい。いいかえると、容器１０は、１７Ａ，１７Ｂの２つの液体貯留部を有しているが、液体貯留部の数は３以上であってもよい。図８は、３つの液体貯留部を有する容器の一例を示す上面図である。
【0045】
容器が隔壁を複数有する場合、各隔壁の厚さは同じであってもよいし、図８に示すように、互いに異なっていてもよい。
【0046】
また、容器が隔壁を複数有する場合、孔２１は、複数の隔壁が接する位置に形成されていることが好ましい。これにより、孔２１の内部に形成したハイドロゲルにおいて、複数の対象物質の濃度勾配を形成することが可能になる。
【0047】
例えば、図８に示す容器においては、液体貯留部１７Ａ１，１７Ａ２に異なる対象物質を導入することにより、１つのハイドロゲル内に複数の対象物質の濃度勾配を形成することができる。
【0048】
【0049】
また、図２～図５に示す容器１０の孔２１の数は１つであるが、孔２１の数は、少なくとも２つの液体貯留部を連通するものである限り２個以上であってもよい。また、孔２１が複数存在する場合においても、複数の孔２１はいずれも隔壁２の周縁から離れた位置に形成されていることが好ましい。
【0050】
また、Ｙ方向から見た孔２１の形状は、矩形に限らず、円形、楕円形、３角形、５角形、６角形等の多角形等であってもよい。
【0051】
また、孔２１の第１液体貯留部１７Ａへの開口部の大きさと、第２液体貯留部１７Ｂへの開口部の大きさは、同一であってもよく、異なっていてもよい。孔２１の開口部の大きさを変化させることにより、ハイドロゲルに形成される対象物質の濃度勾配を変化させることができる。
【0052】
また、隔壁２の厚さと孔２１のＸＺ平面における断面積の大きさの好ましい関係は次のとおりである。
【0053】
まず、孔２１のＸＺ平面における断面積が、隔壁２の厚さ方向（Ｙ方向）に一定である場合、隔壁２の厚さ方向（Ｙ方向）から見た孔２１の断面積と同じ面積の円２２（面積相当円）を想定し、円２２の直径（面積相当径）を「ｄ」とする。また、孔２１が形成された箇所（孔２１のＸＺ平面における断面の重心）における隔壁２の厚さをｔとする。
【0054】
このとき、ｔ：ｄは、１：０．５～１：５であることが好ましく、１：０．５～１：２であることがより好ましく、１：０．５～１：１．５であることが更に好ましく、約１：１であることが特に好ましい。
【0055】
また、孔２１のＸＺ平面における断面積が、隔壁２の厚さ方向（Ｙ方向）で異なっている場合には、孔２１のＸＺ平面における断面積の最小値と同じ面積の円２２（面積相当円）を想定し、円２２の直径（面積相当径）を「ｄ」とする。また、面積相当円を想定した孔２１の断面の重心における隔壁２の厚さをｔとする。
【0056】
このとき、ｔ：ｄは、１：０．５～１：５であることが好ましく、１：０．５～１：２であることがより好ましく、１：０．５～１：１．５であることが更に好ましく、約１：１であることが特に好ましい。
【0057】
ｔ：ｄが上記の範囲にあることにより、例えばハイドロゲル内に細胞塊を配置した場合に、細胞塊に接触する対象物質の密度勾配を大きくすることが容易になる。いいかえると、細胞塊に接触する対象物質の濃度を細胞塊の位置毎に大きく変えることが容易になる。
【0058】
また、孔２１ １つあたりの体積は、例えば０．５μＬ～１ｍＬであることが好ましく、１μＬ～５００μＬであることがより好ましく、１μＬ～１００μＬであることが更に好ましい。孔２１ １つあたりの体積が上記の範囲であると、ハイドロゲルを孔２１に注入しやすい。
【0059】
（容器の製造方法）
図９～１３を参照しながら容器１０の製造方法を説明する。容器１０は、例えば、図９に示す成形型１００を用いて成形することができる。成形型１００は、第１型１０１と、第２型１０２と、孔形成用駒１０３と、下部駒１０４，１０５と、底板１０６とを備える。
図９～１３を参照しながら容器１０の製造方法を説明する。容器１０は、例えば、図９に示す成形型１００を用いて成形することができる。成形型１００は、第１型１０１と、第２型１０２と、孔形成用駒１０３と、下部駒１０４，１０５と、底板１０６とを備える。
【0060】
図９、図１０に示すように、第１型１０１は、第１液体貯留部１７Ａに即した形状の第１形成部１１１と、第２液体貯留部１７Ｂに即した形状の第２形成部１１２とを有する。第１形成部１１１と第２形成部１１２とは互いに離間している。
【0061】
孔形成用駒１０３は、第１形成部１１１と第２形成部１１２との間に架け渡されている。形成用駒１０３は、第１形成部１１１及び第２形成部１１２に対して取り付け、取り外し可能である。下部駒１０４，１０５は、それぞれ第１形成部１１１及び第２形成部１１２の先端部に設けられている。下部駒１０４，１０５は、それぞれ第１形成部１１１及び第２形成部１１２に対して取り付け、取り外し可能である。
【0062】
培養容器１０を成形するには、第１型１０１と第２型１０２との間の空隙部に樹脂Ｐを充てんし、硬化させる。これによって、主部１４（図２～５参照）が形成される。第１形成部１１１と第２形成部１１２との間に充てんされた樹脂Ｐは隔壁２（図２～５参照）となる。隔壁２には、孔形成用駒１０３によって孔２１が形成される。
【0063】
次いで、図１１に示すように、底板１０６を第２型１０２から外すとともに、下部駒１０４，１０５を、第１形成部１１１および第２形成部１１２から外す。これにより、孔形成用駒１０３が形成部１１１，１１２に対して容易に取り外しできるようになる。
【0064】
次いで、図１２に示すように、第１型１０１を第２型１０２から抜き出す。次いで、図１３に示すように、成形された主部１４を第２型１０２から外し、主部１４から孔形成用駒１０３を外す。次いで、別途用意した底板１１（図２～５参照）を主部１４の下部に接合させる。
【0065】
主部１４と底板１１との接合は、例えば、シリコーン系の接着剤等を用いて行ってもよいし、超音波融着等により行ってもよい。以上の方法により、図２～５に示す容器１０を製造することができる。
【0066】
容器１０を形成する樹脂Ｐとしては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン樹脂、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、シクロオレフィン系樹脂等の熱可塑性樹脂等が挙げられる。
【0067】
［対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲルの製造方法］
１実施形態において、本発明は、上述した容器の前記孔にハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、対象物質の濃度が互いに異なる液体をそれぞれ入れ、その結果、前記ハイドロゲルに前記対象物質の濃度勾配が形成される工程と、を含む、対象物質の濃度勾配を有する前記ハイドロゲルの製造方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、上述した容器の前記孔にハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、対象物質の濃度が互いに異なる液体をそれぞれ入れ、その結果、前記ハイドロゲルに前記対象物質の濃度勾配が形成される工程と、を含む、対象物質の濃度勾配を有する前記ハイドロゲルの製造方法を提供する。
【0068】
図１４は、２つの液体貯留部を有する容器１０を示す上面図である。図１４において、容器１０の孔２１にはハイドロゲル３が配置されている。そして、第１液体貯留部１７Ａ及び第２液体貯留部１７Ｂに、対象物質の濃度が互いに異なる液体がそれぞれ導入されている。図１４の例では、対象物質は第１液体貯留部１７Ａに導入される液体のみに溶解されており、第２液体貯留部１７Ｂに導入される液体は対象物質を含まない。
【0069】
その結果、図１４に示すように、対象物質がハイドロゲル３の第１液体貯留部１７Ａ側から拡散していき、ハイドロゲル３に対象物質の濃度勾配が形成される。
【0070】
（ハイドロゲル）
ハイドロゲルとは、ポリマーの網目構造の内部に水が取り込まれているゲルを意味する。本実施形態の製造方法において、ハイドロゲルとしては特に限定されず、例えば、アガロースゲル、低融点アガロースゲル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、キトサンゲル、コラーゲンゲル、フィブリンゲル、メチルセルロースゲル、ヒドロキシプロピルセルロースゲル、カルボキシメチルセルロースゲル、ポリ乳酸とポリエチレングリコールの共重合体、アクリル酸系合成ゲル、クリック架橋型ゲル等が挙げられる。
ハイドロゲルとは、ポリマーの網目構造の内部に水が取り込まれているゲルを意味する。本実施形態の製造方法において、ハイドロゲルとしては特に限定されず、例えば、アガロースゲル、低融点アガロースゲル、アルギン酸ゲル、カラギーナンゲル、キトサンゲル、コラーゲンゲル、フィブリンゲル、メチルセルロースゲル、ヒドロキシプロピルセルロースゲル、カルボキシメチルセルロースゲル、ポリ乳酸とポリエチレングリコールの共重合体、アクリル酸系合成ゲル、クリック架橋型ゲル等が挙げられる。
【0071】
クリック架橋型ゲルとしては、例えば、下記式（Ａ）で表される化合物、下記式（Ｂ）で表される化合物及び水系液体を混合することにより得られるハイドロゲルが挙げられる。
【0072】
【化9】
【0073】
【化10】
【0074】
《式（Ａ）で表される化合物》
上記式（Ａ）で表される化合物は、水溶性の基本骨格を有し、アジド基とクリック架橋反応する基を有するものである。
上記式（Ａ）で表される化合物は、水溶性の基本骨格を有し、アジド基とクリック架橋反応する基を有するものである。
【0075】
ここで、基本骨格が水溶性であるとは、基本骨格となる化合物又は基本骨格を含む、上記式（Ａ）で表される化合物が、常温から０度の温度において水又は略中性の緩衝液に１０質量％以上溶解することを意味する。具体的な水溶性は、基本骨格となる化合物又は基本骨格を含む、上記式（Ａ）で表される化合物を、１～１００ｍｇ／ｍＬ程度の濃度でＨＥＰＥＳバッファー等の緩衝液（ｐＨ７．０～７．６）中に分散させ、溶解するか否かを目視で観察すること等により評価することができる。
【0076】
アジド基とクリック架橋反応する基とは、アジド基と容易かつ特異的に架橋反応を起こす基である。このような基としては、アルキニル基が挙げられる。より具体的には、シクロオクチン環又はアザシクロオクチン環を有する基が挙げられる。
【0077】
式（Ａ）中、複数のＡ１が炭素数１～２０の直鎖状若しくは分岐鎖状のアルキレン基である場合、前記アルキレン基中の１個又は非隣接の２個以上の－ＣＨ２－はそれぞれ独立して－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｏ－、－ＣＯ－、－ＣＯＯ－、－ＯＣＯ－、又はシクロヘキシレン基によって置換されていてもよい。また、ｐは０～５０であってもよい。
【0078】
また、Ｒ１～Ｒ４のうちの少なくとも２つ、好ましくは３つ以上が－Ｌ－Ｚ１であり、２つ以上が－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｌ－Ｚ１であることが好ましい。－Ｌ－Ｚ１を３つ以上含むことで、式（Ｂ）で表される化合物との間に形成される架橋点が十分に多くなり、形成したハイドロゲルの強度を高めることができる。
【0079】
また、Ｌは、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、チオエステル結合、カルバメート結合、カルボニル基、アルキレン基、これらの組み合わせ等であってよい。
【0080】
式（Ａ）中、ｎはエチレングリコールの平均繰返し数である。ｎは２０～５００であり、３０～２５０であることが好ましく、４０～１２５であることがより好ましい。エチレングリコールの平均繰返し数を上記範囲に設定することで、式（Ａ）で表される化合物の水系液体に対する溶解度を高めることができ、製造時及び使用時において取扱いが容易になる。
【0081】
エチレングリコールの平均繰り返し数ｎは、ゲル濾過クロマトグラフィーや質量分析によって分子量を測定し、ＮＭＲによってＲ１～Ｒ４基の数を推定すること等により推定することができる。
【0082】
式（Ａ）中、Ｚ１はアルキニル基を表し、具体的には、シクロオクチン環又はアザシクロオクチン環を有する基が挙げられる。シクロオクチン環及びアザシクロオクチン環中のアルキニル基はアジド基に対する反応性が高く、銅触媒等の触媒を用いることなく、アジド基とクリック反応することができる。シクロオクチン環又はアザシクロオクチン環を有する基としては、下記式（１）～（４）のいずれかで表される基が好ましい。
【0083】
【化11】
【0084】
上記式（Ａ）で表される化合物として、より具体的には、下記式（５）～（７）で表される化合物が好適に用いられる。下記式（５）～（７）において、Ｌ、Ｚ１、ｎ、ｐは、式（Ａ）について上述したものと同様である。下記式（５）～（７）において、ｐは１～３であることが好ましい。
【0085】
【化12】
【0086】
《式（Ｂ）で表される化合物》
上記式（Ｂ）で表される化合物は、水溶性の基本骨格を有し、アジド基（－Ｎ３）を有するものである。水溶性の基本骨格については、上記式（Ａ）で表される化合物について上述したものと同様である。式（Ｂ）中、Ａ１、Ｌ、ｎ、ｐは、式（Ａ）について上述したものと同様である。
上記式（Ｂ）で表される化合物は、水溶性の基本骨格を有し、アジド基（－Ｎ３）を有するものである。水溶性の基本骨格については、上記式（Ａ）で表される化合物について上述したものと同様である。式（Ｂ）中、Ａ１、Ｌ、ｎ、ｐは、式（Ａ）について上述したものと同様である。
【0087】
また、Ｒ５～Ｒ８のうちの少なくとも２つ、好ましくは３つ以上が－Ｌ－Ｚ２であり、２つ以上が－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｌ－Ｚ２であることが好ましい。－Ｌ－Ｚ２を３つ以上含むことで、式（Ａ）で表される化合物との間に形成される架橋点が十分に多くなり、形成したハイドロゲルの強度を高めることができる。
【0088】
上記式（Ｂ）で表される化合物として、より具体的には、下記式（８）～（１０）で表される化合物が好適に用いられる。下記式（８）～（１０）において、Ｌ、ｎ、ｐは、式（Ａ）について上述したものと同様である。下記式（８）～（１０）において、ｐは１～３であることが好ましい。
【0089】
【化13】
【0090】
《水系液体》
上記式（Ａ）で表される化合物、上記式（Ｂ）で表される化合物及び水系液体を混合することによりハイドロゲルを得ることができる。ここで、水系液体とは、水を主成分とする液体をいう。また、水を主成分とするとは、水系液体が含む水の割合が５０質量％以上、好ましくは６０質量％以上、更に好ましくは７０質量％以上であることを意味する。
上記式（Ａ）で表される化合物、上記式（Ｂ）で表される化合物及び水系液体を混合することによりハイドロゲルを得ることができる。ここで、水系液体とは、水を主成分とする液体をいう。また、水を主成分とするとは、水系液体が含む水の割合が５０質量％以上、好ましくは６０質量％以上、更に好ましくは７０質量％以上であることを意味する。
【0091】
水系液体としては、例えば、水、細胞培養用培地、ｐＨ緩衝液等が挙げられる。細胞培養用培地は、ウシ胎児血清等の血清、抗生物質、分化誘導因子等を含有していてもよい。
【0092】
《対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲル》
本実施形態の製造方法により、対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲルを製造することができる。ハイドロゲルが対象物質の濃度勾配を有するとは、ハイドロゲル上の位置により、ハイドロゲルに含まれる対象物質の量が変化することを意味する。
本実施形態の製造方法により、対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲルを製造することができる。ハイドロゲルが対象物質の濃度勾配を有するとは、ハイドロゲル上の位置により、ハイドロゲルに含まれる対象物質の量が変化することを意味する。
【0093】
［細胞培養方法］
１実施形態において、本発明は、上述した容器の前記孔に細胞含有ハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、対象物質の濃度が互いに異なる培地をそれぞれ入れ、その結果、前記細胞含有ハイドロゲルに前記対象物質の濃度勾配が形成される工程と、前記細胞含有ハイドロゲルをインキュベートする工程と、を含む、細胞培養方法を提供する。本実施形態の細胞培養方法により、対象物質の濃度勾配中で細胞を培養することができる。細胞は上述したものと同様であってよい。
１実施形態において、本発明は、上述した容器の前記孔に細胞含有ハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、対象物質の濃度が互いに異なる培地をそれぞれ入れ、その結果、前記細胞含有ハイドロゲルに前記対象物質の濃度勾配が形成される工程と、前記細胞含有ハイドロゲルをインキュベートする工程と、を含む、細胞培養方法を提供する。本実施形態の細胞培養方法により、対象物質の濃度勾配中で細胞を培養することができる。細胞は上述したものと同様であってよい。
【0094】
本実施形態の細胞培養方法は、例えば分化誘導因子の濃度勾配中で培養することが必要な、複雑な組織や器官の分化誘導に好適に利用することができる。このような組織や器官としては、例えば、下垂体、脳、眼、肝臓、腎臓、肺、消化管、膵臓等が挙げられる。
【0095】
本実施形態の細胞培養方法により、例えば、患者にＨＬＡ適合性を有する多能性幹細胞を分化誘導して複雑な組織や器官を分化誘導し、患者に移植する再生医療等に利用することができる。あるいは、分化誘導した組織や器官を用いて、医薬候補化合物のスクリーニングや、化合物の安全性試験等に利用することができる。
【0096】
本実施形態の細胞培養方法において、ハイドロゲルとしては、上述したものと同様のものを使用することができる。中でも、上記式（Ａ）で表される化合物、上記式（Ｂ）で表される化合物及び水系液体を混合することにより得られるハイドロゲルを好適に用いることができる。
【0097】
細胞含有ハイドロゲルは、ハイドロゲルに細胞を含有させることにより調製することができる。例えば、ハイドロゲルが低融点アガロースである場合、培地等の水系液体に低融点アガロースを混合し、加熱して溶解させた後、低融点アガロースがゲル化せず、細胞が死なない程度の温度にまで冷却する。続いて、細胞を混合して容器１０の孔２１に導入し、そこでゲル化させる。これにより、容器１０の孔２１に細胞含有ハイドロゲルを配置することができる。
【0098】
あるいは、ハイドロゲルがクリック架橋型ゲルである場合、例えば、上記式（Ａ）で表される化合物、上記式（Ｂ）で表される化合物及び培地を混合してプレゲル溶液を調製し、プレゲル溶液に細胞を混合することにより、細胞含有プレゲル溶液を調製することができる。
【0099】
続いて、細胞含有プレゲル溶液を容器１０の孔２１に導入し、そこでゲル化させる。ゲル化は室温で放置するだけで行うことができる。これにより、容器１０の孔２１に細胞含有ハイドロゲルを配置することができる。クリック架橋型ゲルは室温でゲル化させることができ、細胞に対する毒性も低いため、容易に細胞含有ハイドロゲルを孔２１に配置することができる。
【0100】
本実施形態の細胞培養方法において、例えば、細胞が下垂体原基の性質を有する細胞塊であり、対象物質が、糖質コルチコイド、ＢＭＰ、ＦＧＦ及びＳｈｈからなる群より選択される分化誘導因子であってもよい。これにより、下垂体原基に分化誘導因子の濃度勾配を作用させ、従来不可能であった下垂体の分化誘導を行うことができる。
【0101】
下垂体原基の性質を有する細胞塊としては、例えば、ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、ＢＭＰ及びＳｈｈを含む培地中で浮遊培養（３Ｄ浮遊培養）することにより得られる、ＬＩＭ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３（ＬＨＸ３）陽性の細胞塊が挙げられる。
【0102】
［下垂体の製造方法］
１実施形態において、本発明は、下垂体の製造方法であって、上述した容器の前記孔に、下垂体原基の性質を有する細胞塊を含有する、細胞塊含有ハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、糖質コルチコイド、ＢＭＰ、ＦＧＦ及びＳｈｈからなる群より選択される分化誘導因子の濃度が互いに異なる培地をそれぞれ入れ、その結果、前記細胞塊含有ハイドロゲルに前記分化誘導因子の濃度勾配が形成される工程と、前記細胞塊含有ハイドロゲルをインキュベートし、その結果、前記細胞塊から下垂体が形成される工程と、を含む、製造方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、下垂体の製造方法であって、上述した容器の前記孔に、下垂体原基の性質を有する細胞塊を含有する、細胞塊含有ハイドロゲルを配置する工程と、前記複数の液体貯留部の少なくとも２つに、糖質コルチコイド、ＢＭＰ、ＦＧＦ及びＳｈｈからなる群より選択される分化誘導因子の濃度が互いに異なる培地をそれぞれ入れ、その結果、前記細胞塊含有ハイドロゲルに前記分化誘導因子の濃度勾配が形成される工程と、前記細胞塊含有ハイドロゲルをインキュベートし、その結果、前記細胞塊から下垂体が形成される工程と、を含む、製造方法を提供する。
【0103】
実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、複数種類の下垂体ホルモン産生細胞を偏在させて同時に誘導し、機能的な下垂体を製造することができる。
【0104】
本実施形態の製造方法において、細胞塊含有ハイドロゲルは、上記式（Ａ）で表される化合物、上記式（Ｂ）で表される化合物、培地及び下垂体原基の性質を有する細胞塊を混合することにより得られるものであってもよい。
【0105】
［キット］
１実施形態において、本発明は、上述した容器と、上述したハイドロゲルの材料とを含む、キットを提供する。本実施形態のキットは、例えば、対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲルの製造用キット、細胞培養用キット、下垂体の製造用キット等であるということができる。
１実施形態において、本発明は、上述した容器と、上述したハイドロゲルの材料とを含む、キットを提供する。本実施形態のキットは、例えば、対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲルの製造用キット、細胞培養用キット、下垂体の製造用キット等であるということができる。
【0106】
本実施形態のキットにおいて、ハイドロゲルの材料は、上記式（Ａ）で表される化合物及び上記式（Ｂ）で表される化合物を含んでいてもよい。ここで、上記式（Ａ）で表される化合物及び上記式（Ｂ）で表される化合物は、それぞれ別々に容器に収容されていてもよいし、混合されて同一の容器に収容されていてもよい。上記式（Ａ）で表される化合物、上記式（Ｂ）で表される化合物及び水系液体を混合すると、クリック架橋反応が進行し、ハイドロゲルを形成することができる。
【実施例】
【0107】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0108】
［実験例１］
（ハイドロゲル調製用試薬の合成）
ハイドロゲル調製用試薬として、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧを合成した。
（ハイドロゲル調製用試薬の合成）
ハイドロゲル調製用試薬として、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧを合成した。
【0109】
《ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧの合成》
まず、ペンタエリトリトールテトラ（アミノプロピル）ポリオキシエチレン（型式「ＰＴＥ－４００ＰＡ」、日油株式会社製、本明細書中、「４ａｒｍＰＥＧ」という場合がある。）１ｇに２０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、４０℃で撹拌して溶解させた。
まず、ペンタエリトリトールテトラ（アミノプロピル）ポリオキシエチレン（型式「ＰＴＥ－４００ＰＡ」、日油株式会社製、本明細書中、「４ａｒｍＰＥＧ」という場合がある。）１ｇに２０ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、４０℃で撹拌して溶解させた。
【0110】
また、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）－ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ（型式「Ａ１２４」、Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｏｏｌｓ社）５２ｍｇを１０ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。
【0111】
続いて、上記の４ａｒｍＰＥＧ溶液に上記のＤＢＣＯ－ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ溶液を加え、４０℃で３時間撹拌しながら反応させた。この結果、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧが得られた。
【0112】
続いて、上記の反応液にフルオレスカミンを反応させて、４ａｒｍＰＥＧへのＤＢＣＯ基の導入率を測定した。具体的には、まず、フルオレスカミンをＤＭＳＯに溶解し、３ｍｇ／ｍＬ溶液を作製した。続いて、上記のＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液の１００倍希釈液９０μＬとフルオレスカミン溶液３０μＬを混合し、暗所で３０分間、室温で反応させた。
【0113】
続いて、励起波長３６０ｎｍを照射し、波長４６５ｎｍの蛍光をマイクロプレートリーダー（型式「ＧＥＮｉｏｓ」、テカン社）を用いて測定し、４ａｒｍＰＥＧへのＤＢＣＯ基の導入率を測定した。
【0114】
続いて、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧを透析した。透析は、分画分子量６，０００～８，０００の透析膜を用い、外液として水（ミリＱ水）を用いて行った。透析開始から１時間後、１７時間後、２１時間後、２５時間後、３日後に外液を交換した。
【0115】
続いて、透析後のＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧを凍結乾燥し、使用するまで－２０℃で保管した。４ａｒｍＰＥＧへのＤＢＣＯ基の導入率は９３．４％であり、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧの収量は７７６．３ｍｇであった。また、合成したＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧの分子量は４３，１６８であった。
【0116】
《Ａｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧの合成》
上記のＤＢＣＯ－ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ溶液の代わりに、Ａｚｉｄｅ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ（型式「ＡＺ１０３」、Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｏｏｌｓ社）３８ｍｇを１０ｍＬのＤＭＳＯに溶解させたＡｚｉｄｅ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ溶液を使用した点以外は上記と同様にして、Ａｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧを合成、透析、凍結乾燥し、使用するまで－２０℃で保管した。
上記のＤＢＣＯ－ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ溶液の代わりに、Ａｚｉｄｅ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ（型式「ＡＺ１０３」、Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｏｏｌｓ社）３８ｍｇを１０ｍＬのＤＭＳＯに溶解させたＡｚｉｄｅ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ溶液を使用した点以外は上記と同様にして、Ａｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧを合成、透析、凍結乾燥し、使用するまで－２０℃で保管した。
【0117】
４ａｒｍＰＥＧへのＡｚｉｄｅ基の導入率は９９．４％であり、Ａｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧの収量は１．０７４３ｇであった。また、合成したＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧの分子量は４２，００６であった。
【0118】
［実験例２］
（ハイドロゲルの形成条件の検討）
実験例１で合成したＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ（綿状）及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ（綿状）を用いてハイドロゲルを調製した。ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧの溶媒として１０ｖ／ｖ％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｖ／ｖ％のペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＭＥＭ培地を使用した。
（ハイドロゲルの形成条件の検討）
実験例１で合成したＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ（綿状）及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ（綿状）を用いてハイドロゲルを調製した。ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧの溶媒として１０ｖ／ｖ％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｖ／ｖ％のペニシリン・ストレプトマイシンを添加したＭＥＭ培地を使用した。
【0119】
まず、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ ４１．３ｍｇに上記の溶媒１ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで撹拌して溶解させた。この結果、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧの１ｍＭ溶液が得られた。
【0120】
続いて、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧの１ｍＭ溶液を上記の溶媒で希釈し、０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７，０．８，０．９ｍＭ溶液をそれぞれ調製した。
【0121】
また、Ａｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ ４１．２ｍｇに上記の溶媒１ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで撹拌して溶解させた。この結果、Ａｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧの１ｍＭ溶液が得られた。続いて、Ａｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧの１ｍＭ溶液を上記の溶媒で希釈し、０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７，０．８，０．９ｍＭ溶液をそれぞれ調製した。
【0122】
続いて、それぞれ同じモル濃度に調製したＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液を１０μＬずつ混合し、プレゲル溶液を調製した。続いて、各プレゲル溶液を３０分間室温で静置してゲル化の反応を進めた後に、ゲル化の状態を目視で観察した。反応後のプレゲル溶液が、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を添加及び除去しても溶解しない場合には、ゾル化又はゲル化したと評価した。このうち、ピペット先端で軽く触れても形状を維持するものをゲル化したと評価した。ゲル化の状態は以下の評価基準により評価した。下記表１に評価結果を示す。
【0123】
（評価基準）
×…ゾル・ゲル化しなかった。
△…ゾル化した。
○…ゲル化した。
×…ゾル・ゲル化しなかった。
△…ゾル化した。
○…ゲル化した。
【0124】
【表1】
【0125】
その結果、プレゲル溶液の濃度が０．１５ｍＭ以上の場合にハイドロゲルが形成される傾向が認められた。以降の実験では、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液をそれぞれ０．５ｍＭで調製し、等容量混合することにより０．２５ｍＭのプレゲル溶液を調製してハイドロゲルを形成させた。
【0126】
［実験例３］
（容器の検討）
図１５～１７に示す形状の容器１０’を用いて、ハイドロゲルを形成させた。図１５は、容器１０’の平面図である。図１６は、図１５に示すＩＩＩ－ＩＩＩ線に沿うＹＺ断面図である。図１７は、図１５に示すＩＶ－ＩＶ線に沿うＸＺ断面図である。
（容器の検討）
図１５～１７に示す形状の容器１０’を用いて、ハイドロゲルを形成させた。図１５は、容器１０’の平面図である。図１６は、図１５に示すＩＩＩ－ＩＩＩ線に沿うＹＺ断面図である。図１７は、図１５に示すＩＶ－ＩＶ線に沿うＸＺ断面図である。
【0127】
容器１０’は、図２～５に示した容器１０と比較して、孔２１の一部が隔壁２の周縁に接している点が主に異なる。図１６、図１７に示すように、容器１０’の孔２１の下縁２１ａは、隔壁２の下縁２ｄと一致している。容器１０’の孔２１は、縦×横×高さが３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの立方体の形状であった。
【0128】
《ハイドロゲルの形成》
ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液をそれぞれ０．５ｍＭで調製した。溶媒には５％ＫＳＲ（インビトロジェン社）を含むｇｆＣＤＭ培地を使用した。続いて、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液を等容量混合することにより０．２５ｍＭのプレゲル溶液を調製した。続いて、容器１０’の孔２１にプレゲル溶液３０μＬを注入した。
ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液をそれぞれ０．５ｍＭで調製した。溶媒には５％ＫＳＲ（インビトロジェン社）を含むｇｆＣＤＭ培地を使用した。続いて、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液を等容量混合することにより０．２５ｍＭのプレゲル溶液を調製した。続いて、容器１０’の孔２１にプレゲル溶液３０μＬを注入した。
【0129】
図１８（ａ）は、容器１０の孔２１にプレゲル溶液を導入した様子を示す写真である。図１８（ａ）に示すように、容器１０を使用した場合、プレゲル溶液が孔２１から漏れ出すことなく保持されることが明らかとなった。また、図１８（ｂ）は、容器１０’の孔２１にプレゲル溶液を導入した様子を示す写真である。図１８（ｂ）に示すように、容器１０’を使用した場合、プレゲル溶液が孔２１から漏れ出てしまうことが明らかとなった。
【0130】
［実験例４］
（対象物質の濃度勾配の形成）
図２～５に示したものと同様の容器１０を用いて、対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲルを作製した。容器１０の孔２１は、縦×横×高さが３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの立方体の形状であった。
（対象物質の濃度勾配の形成）
図２～５に示したものと同様の容器１０を用いて、対象物質の濃度勾配を有するハイドロゲルを作製した。容器１０の孔２１は、縦×横×高さが３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの立方体の形状であった。
【0131】
《対象物質》
対象物質として、フルオレセイン（分子量３３２．３１）、ＦＩＴＣデキストラン（分子量１０，０００）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）の融合タンパク質（分子量５６，０００Ｄａ、以下「ＹＦＰ－ＣＦＰ」という。）を使用した。ＹＦＰ－ＣＦＰは、ＥＹＦＰのＣ末端側にリンカーペプチド（ＧＧＮＳＳＶＤＧＧ：配列番号１）を介してＥＣＦＰが融合した融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現ベクターであるｐＥＴ２１（ｂ）に導入し、大腸菌で発現させて調製した。発現したＹＦＰ－ＣＦＰは、ＹＦＰ－ＣＦＰのＣ末端側に付加したヒスチジンタグを用いてニッケルカラムを用いて精製した。
対象物質として、フルオレセイン（分子量３３２．３１）、ＦＩＴＣデキストラン（分子量１０，０００）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）及びシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）の融合タンパク質（分子量５６，０００Ｄａ、以下「ＹＦＰ－ＣＦＰ」という。）を使用した。ＹＦＰ－ＣＦＰは、ＥＹＦＰのＣ末端側にリンカーペプチド（ＧＧＮＳＳＶＤＧＧ：配列番号１）を介してＥＣＦＰが融合した融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現ベクターであるｐＥＴ２１（ｂ）に導入し、大腸菌で発現させて調製した。発現したＹＦＰ－ＣＦＰは、ＹＦＰ－ＣＦＰのＣ末端側に付加したヒスチジンタグを用いてニッケルカラムを用いて精製した。
【0132】
《ハイドロゲルの形成》
ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液をそれぞれ０．５ｍＭで調製した。溶媒には水を使用した。続いて、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液を等容量混合することにより０．２５ｍＭのプレゲル溶液を調製した。続いて、容器１０の孔２１にプレゲル溶液３０μＬを注入した。プレゲル溶液は、孔２１から漏れ出ることなく、孔２１の内部に保持させることができた。続いて、３０分間室温で静置してハイドロゲルを形成させた。この結果、孔２１がハイドロゲルで塞がれた状態になった。
ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液をそれぞれ０．５ｍＭで調製した。溶媒には水を使用した。続いて、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液を等容量混合することにより０．２５ｍＭのプレゲル溶液を調製した。続いて、容器１０の孔２１にプレゲル溶液３０μＬを注入した。プレゲル溶液は、孔２１から漏れ出ることなく、孔２１の内部に保持させることができた。続いて、３０分間室温で静置してハイドロゲルを形成させた。この結果、孔２１がハイドロゲルで塞がれた状態になった。
【0133】
《濃度勾配の形成》
孔２１にハイドロゲルを形成した容器１０を複数用意し、各容器１０の第１液体貯留部１７Ａに、フルオレセイン（終濃度１０μＭ）、ＦＩＴＣデキストラン（終濃度１０μＭ）又はＹＦＰ－ＣＦＰ（終濃度６００μｇ／ｍＬ）の水溶液１．５ｍＬをそれぞれ導入した。また、各容器１０の第２液体貯留部１７Ｂに水１．５ｍＬを導入した。
孔２１にハイドロゲルを形成した容器１０を複数用意し、各容器１０の第１液体貯留部１７Ａに、フルオレセイン（終濃度１０μＭ）、ＦＩＴＣデキストラン（終濃度１０μＭ）又はＹＦＰ－ＣＦＰ（終濃度６００μｇ／ｍＬ）の水溶液１．５ｍＬをそれぞれ導入した。また、各容器１０の第２液体貯留部１７Ｂに水１．５ｍＬを導入した。
【0134】
図１９（ａ）及び（ｂ）は、孔２１にハイドロゲルを導入した容器１０の第１液体貯留部１７Ａ及び第２液体貯留部１７Ｂにそれぞれ液体を導入した状態を示す写真である。図１９（ｂ）は、液体貯留部の開口部側から撮影した写真である。図１９（ｂ）中、点線はハイドロゲルの位置を示す。
【0135】
その後、９日間にわたり、各容器のハイドロゲルを蛍光顕微鏡で観察した。ここで、２～３日毎に第１液体貯留部１７Ａ及び第２液体貯留部１７Ｂ内の液体を新しいものに交換した群と、９日間液体を交換しなかった群をそれぞれ用意し、両者の比較も行った。蛍光顕微鏡画像における、フルオレセイン、ＦＩＴＣ及びＹＦＰ－ＣＦＰの蛍光強度をＩｍａｇｅ Ｊソフトウエアを用いて解析しグラフ化した。
【0136】
図２０（ａ）～（ｃ）は、対象物質としてフルオレセイン（分子量３３２．３１）を使用し、２～３日毎に第１液体貯留部１７Ａ及び第２液体貯留部１７Ｂ内の液体を新しいものに交換した場合の結果である。図２０（ａ）は、実験開始から１日後のハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真である。図２０（ｂ）は、実験開始から９日後のハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真である。図２０（ｃ）は、実験開始から１、４、７、９日後のハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真を数値化したグラフである。図２０（ｃ）中、横軸はハイドロゲルの第１液体貯留部側の端部からの距離（ｍｍ）を示し、縦軸はフルオレセインの蛍光強度（相対値）を示す。
【0137】
図２１（ａ）～（ｃ）は、対象物質としてＦＩＴＣデキストラン（分子量１０，０００）を使用した場合の結果である。第１液体貯留部１７Ａ及び第２液体貯留部１７Ｂ内の液体は９日間交換しなかった。図２１（ａ）は、実験開始から１日後のハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真である。図２１（ｂ）は、実験開始から９日後のハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真である。図２１（ｃ）は、実験開始から１、２、４、７、９日後のハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真を数値化したグラフである。図２１（ｃ）中、横軸はハイドロゲルの第１液体貯留部側の端部からの距離（ｍｍ）を示し、縦軸はＦＩＴＣの蛍光強度（相対値）を示す。
【0138】
図２２（ａ）～（ｃ）は、対象物質としてＹＦＰ－ＣＦＰ（分子量５６，０００Ｄａ）を使用した場合の結果である。第１液体貯留部１７Ａ及び第２液体貯留部１７Ｂ内の液体は９日間交換しなかった。図２２（ａ）は、実験開始から１日後のハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真である。図２２（ｂ）は、実験開始から９日後のハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真である。図２２（ｃ）は、実験開始から１、２、３、６、８日後のハイドロゲルの蛍光顕微鏡写真を数値化したグラフである。図２２（ｃ）中、横軸はハイドロゲルの第１液体貯留部側の端部からの距離（ｍｍ）を示し、縦軸はＹＦＰ－ＣＦＰの蛍光強度（相対値）を示す。
【0139】
その結果、いずれの対象物質についても、ハイドロゲル中に濃度勾配を形成できたことが明らかとなった。また、形成された濃度勾配は９日以上安定に維持することができた。また、低分子化合物（フルオレセイン）については、液交換を行わないと数日で濃度勾配が平坦化することが明らかとなった。また、分子量１０，０００程度以上の分子（ＦＩＴＣデキストラン、ＹＦＰ－ＣＦＰ）では、液交換を行うか否かに関わらず、少なくとも８日間は濃度勾配を維持できることが明らかとなった。
【0140】
［実験例５］
（細胞への毒性の検討）
図２～５に示したものと同様の容器１０を用いて、下垂体原基の性質を備えた細胞塊（ＬＩＭ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３（ＬＨＸ３）陽性細胞塊）を培養し、細胞塊への毒性を検討した。ハイドロゲルの毒性、ハイドロゲルの酸素透過性、ハイドロゲルによる栄養成分の透過性等が細胞に影響すると考えられた。容器１０の孔２１は、縦×横×高さが３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの立方体の形状であった。
（細胞への毒性の検討）
図２～５に示したものと同様の容器１０を用いて、下垂体原基の性質を備えた細胞塊（ＬＩＭ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ３（ＬＨＸ３）陽性細胞塊）を培養し、細胞塊への毒性を検討した。ハイドロゲルの毒性、ハイドロゲルの酸素透過性、ハイドロゲルによる栄養成分の透過性等が細胞に影響すると考えられた。容器１０の孔２１は、縦×横×高さが３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの立方体の形状であった。
【0141】
《ＬＨＸ３陽性細胞塊の調製》
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１）を酵素処理して単一細胞に分散させた。続いて低細胞接着性のＶ底９６ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）を用いて再凝集させた。１ウェルあたり５，０００個の細胞を播種し、５％ＫＳＲ（インビトロジェン社）を含むｇｆＣＤＭ培地中で培養した。
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ－１）を酵素処理して単一細胞に分散させた。続いて低細胞接着性のＶ底９６ウェルプレート（住友ベークライト株式会社）を用いて再凝集させた。１ウェルあたり５，０００個の細胞を播種し、５％ＫＳＲ（インビトロジェン社）を含むｇｆＣＤＭ培地中で培養した。
【0142】
播種日を分化培養０日として、０～３日目まで終濃度２０μＭのＹ－２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を添加した。培養３日目及び６日目に、Ｙ－２７６３２を含まない培地で半量培地交換を行った。
【0143】
培養６日目から１８日目まで、終濃度５ｎＭのＢｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ４（ＢＭＰ４）を培地に添加した。培養６日目以降は、終濃度２μＭの３－Ｃｈｌｏｒｏ－Ｎ－［ｔｒａｎｓ－４－（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ］－Ｎ－［［３－（４－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ－２－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ（ＳＡＧ）を培地に添加し続けた。培養１８日目以降は、培養時の酸素分圧を４０％に設定した。培養３０日目以降は、ｇｆＣＤＭ培地中に含むＫＳＲ（インビトロジェン社）を５％から１０％に変更した。培養５０日目以降は、ｇｆＣＤＭ培地中に含むＫＳＲ（インビトロジェン社）を１０％から２０％に変更した。
【0144】
培養６０日目に免疫染色を行いＬＨＸ３陽性の細胞が出現していることを確認することで、下垂体原基の性質を備えた細胞塊が分化できたものと判断した。下垂体原基の性質を備えた細胞塊を、以下の実験に使用した。
【0145】
《ハイドロゲルの形成》
ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液をそれぞれ０．５ｍＭで調製した。溶媒として２０％ＫＳＲ（インビトロジェン社）を含むｇｆＣＤＭ培地を使用した。続いて、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液を等容量混合することにより０．２５ｍＭのプレゲル溶液を調製した。
ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液をそれぞれ０．５ｍＭで調製した。溶媒として２０％ＫＳＲ（インビトロジェン社）を含むｇｆＣＤＭ培地を使用した。続いて、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液を等容量混合することにより０．２５ｍＭのプレゲル溶液を調製した。
【0146】
続いて、ＬＨＸ３陽性の細胞塊１個をプレゲル溶液３０μＬに懸濁し、細胞塊含有プレゲル溶液を調製した。続いて、容器１０の孔２１に細胞塊含有プレゲル溶液３０μＬを注入し、３０分間室温で静置して細胞塊含有ハイドロゲルを形成させた。
【0147】
《毒性の検討》
細胞塊含有ハイドロゲルを形成させた容器１０の第１液体貯留部１７Ａ及び第２液体貯留部１７Ｂに、２０％ＫＳＲ（インビトロジェン社）及び終濃度２μＭのＳＡＧを含むｇｆＣＤＭ培地を１．５ｍＬずつ導入した。続いて、容器１０をインキュベーター内に入れて細胞塊を培養した。
細胞塊含有ハイドロゲルを形成させた容器１０の第１液体貯留部１７Ａ及び第２液体貯留部１７Ｂに、２０％ＫＳＲ（インビトロジェン社）及び終濃度２μＭのＳＡＧを含むｇｆＣＤＭ培地を１．５ｍＬずつ導入した。続いて、容器１０をインキュベーター内に入れて細胞塊を培養した。
【0148】
容器１０での培養開始から１週間後、２週間後及び３週間後にハイドロゲルを回収して細胞塊をパラホルムアルデヒド固定し、薄膜切片を作製した。続いて、薄膜切片を、抗副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）抗体、抗ＰｉｔＸ１抗体及び抗Ｅ－カドヘリン抗体で免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した。ＡＣＴＨの発現は副腎皮質刺激ホルモン産生細胞の存在を示し、ＰｉｔＸ１は下垂体前駆細胞マーカーであり、Ｅ－カドヘリンは下垂体前駆細胞を含む口腔外胚葉のマーカーである。
【0149】
図２３（ａ）及び（ｂ）は免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２３（ａ）は容器１０での培養開始から１週間後の写真であり、図２３（ｂ）は容器１０での培養開始から２週間後の写真である。その結果、培養開始から少なくとも２週間は培養細胞への悪影響がないことが明らかとなった。
【0150】
また、孔２１を表面コート処理しなかった場合、培養開始から３週間後には、ハイドロゲルが容器１０の孔２１から外れてしまうことが明らかとなった。
【0151】
［実験例６］
（細胞塊の培養）
図２～５に示したものと同様の容器１０を用いて、分化誘導因子の濃度勾配中で細胞塊を培養した。容器１０の孔２１は、縦×横×高さが３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの立方体の形状であった。
（細胞塊の培養）
図２～５に示したものと同様の容器１０を用いて、分化誘導因子の濃度勾配中で細胞塊を培養した。容器１０の孔２１は、縦×横×高さが３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの立方体の形状であった。
【0152】
《ＬＨＸ３陽性細胞塊の調製》
実験例４と同様にして、下垂体原基の性質を備えた細胞塊（ＬＨＸ３陽性細胞塊）を調製した。
実験例４と同様にして、下垂体原基の性質を備えた細胞塊（ＬＨＸ３陽性細胞塊）を調製した。
【0153】
《表面コート処理》
容器１０の孔２１の表面をポリ－Ｌ－リジンでコートし、更にアジド基を導入した。まず、容器１０に紫外線を３０分間照射して滅菌した。続いて、クリーンベンチ内で、容器１０の孔２１にポリ－Ｌ－リジン溶液（以下、「ＰＬＬ溶液」という。）３０μＬを注入した。ＰＬＬ溶液は、ポリ－Ｌ－リジン（型式「Ｐ２６３６」、シグマ社）を水に５０μＬ／ｍＬの濃度で溶解し、ろ過滅菌して調製した。
容器１０の孔２１の表面をポリ－Ｌ－リジンでコートし、更にアジド基を導入した。まず、容器１０に紫外線を３０分間照射して滅菌した。続いて、クリーンベンチ内で、容器１０の孔２１にポリ－Ｌ－リジン溶液（以下、「ＰＬＬ溶液」という。）３０μＬを注入した。ＰＬＬ溶液は、ポリ－Ｌ－リジン（型式「Ｐ２６３６」、シグマ社）を水に５０μＬ／ｍＬの濃度で溶解し、ろ過滅菌して調製した。
【0154】
続いて、８０℃に設定した乾燥機内で容器１０を乾燥させた。続いて、クリーンベンチ内で、容器１０の孔２１にＡｚｉｄｅ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ溶液３０μＬを注入し、３０分間放置した。Ａｚｉｄｅ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ溶液は、Ａｚｉｄｅ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ（型式「ＡＺ１０３」、Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｏｏｌｓ社）をＤＭＳＯ（型式「２７６８５５」、シグマ社）に１ｗ／ｖ％の濃度で溶解して調製した。続いて、クリーンベンチ内で、孔２１からＡｚｉｄｅ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ溶液を吸い取り、滅菌水で４回洗浄し乾燥させた。
【0155】
《ハイドロゲルの形成》
ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液をそれぞれ０．５ｍＭで調製した。溶媒として５％ＫＳＲ（インビトロジェン社）を含むｇｆＣＤＭ培地を使用した。続いて、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液を等容量混合することにより０．２５ｍＭのプレゲル溶液を調製した。
ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液をそれぞれ０．５ｍＭで調製した。溶媒として５％ＫＳＲ（インビトロジェン社）を含むｇｆＣＤＭ培地を使用した。続いて、ＤＢＣＯ－４ａｒｍＰＥＧ溶液及びＡｚｉｄｅ－４ａｒｍＰＥＧ溶液を等容量混合することにより０．２５ｍＭのプレゲル溶液を調製した。
【0156】
続いて、ＬＨＸ３陽性の細胞塊１個をプレゲル溶液３０μＬに懸濁し、細胞塊含有プレゲル溶液を調製した。続いて、容器１０の孔２１に細胞塊含有プレゲル溶液３０μＬを注入し、３０分間室温で静置して細胞塊含有ハイドロゲルを形成させた。
【0157】
《細胞塊の培養》
細胞塊含有ハイドロゲルを形成させた容器１０の第１液体貯留部１７Ａに２０％ＫＳＲ（インビトロジェン社）、終濃度１μＭのデキサメタゾン及び終濃度２μＭのＳＡＧを含むｇｆＣＤＭ培地を１．５ｍＬ導入した。また、第２液体貯留部１７Ｂに、２０％ＫＳＲ（インビトロジェン社）及び終濃度２μＭのＳＡＧを含むｇｆＣＤＭ培地を１．５ｍＬ導入した。
細胞塊含有ハイドロゲルを形成させた容器１０の第１液体貯留部１７Ａに２０％ＫＳＲ（インビトロジェン社）、終濃度１μＭのデキサメタゾン及び終濃度２μＭのＳＡＧを含むｇｆＣＤＭ培地を１．５ｍＬ導入した。また、第２液体貯留部１７Ｂに、２０％ＫＳＲ（インビトロジェン社）及び終濃度２μＭのＳＡＧを含むｇｆＣＤＭ培地を１．５ｍＬ導入した。
【0158】
続いて、容器１０をインキュベーター内に入れて細胞塊を培養した。１０日間の培養後にハイドロゲルを回収して細胞塊をパラホルムアルデヒド固定し、薄膜切片を作製した。続いて、薄膜切片を、抗副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）抗体、抗成長ホルモン（ＧＨ）抗体、抗成長ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＨＲＨ－Ｒ）抗体で免疫染色し、蛍光顕微鏡で観察した。ＡＣＴＨの発現は副腎皮質刺激ホルモン産生細胞の存在を示し、ＧＨの発現は成長ホルモン産生細胞の存在を示し、ＧＨＲＨ－Ｒの発現は成長ホルモン産生細胞の成熟を示す。
【0159】
図２４は免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２４中、「デキサメタゾン（＋）」は、細胞塊のうち、デキサメタゾンを添加した第１液体貯留部１７Ａ側の領域の結果であることを示し、「デキサメタゾン（－）」は、細胞塊のうち、デキサメタゾンを添加しなかった第２液体貯留部１７Ｂ側の領域の結果であることを示す。
【0160】
その結果、第１液体貯留部１７Ａ側では、成長ホルモン産生細胞が顕在化しており、表面に成長ホルモン放出ホルモン受容体を発現していることから機能的に成熟していることが明らかとなった。
【0161】
一方、第２液体貯留部１７Ｂ側ではわずかなデキサメタゾンの影響を受けたと考えられ、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞が、成長ホルモンをわずかに発現する現象が観察された。
【0162】
従来の３Ｄ培養法では、下垂体ホルモン産生細胞を１種類ごとに誘導することはできるが、複数種類の下垂体ホルモン産生細胞を偏在させて同時に誘導することはできなかった。これに対し、本実験例では、複数種類の下垂体ホルモン産生細胞を、デキサメタゾンの濃度勾配に応じて偏在させて分化させることができたことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0163】
本発明によれば、対象物質の濃度勾配を形成する技術を提供することができる。
【符号の説明】
【0164】
２…隔壁、２ａ，２ｂ，３ａ，３ｂ，１１ａ，１３Ａａ，１３Ｂａ…面、２ｅ，１２Ａｂ，１２Ｂｂ，１３Ａｂ，１３Ｂｂ，２１ｃ…上縁、２ｄ，２１ａ…下縁、２ｆａ，２ｆｂ，２１ｂａ，２１ｂｂ…側縁、３…ハイドロゲル、４…細胞、１０…容器、１１…底板、１２Ａ，１２Ｂ…側板、１３Ａ，１３Ｂ…端板、１４…主部、１７Ａ，１７Ａ１，１７Ａ２，１７Ｂ…液体貯留部、２１…孔、２３ａ，２３ｂａ，２３ｂｂ，２３ｃ…面、３０…培養装置、１００…成形型、１０１…第１型、１０２…第２型、１０３…孔形成用駒、１０４，１０５…下部駒、１０６…底板、１１１…第１形成部、１１２…第２形成部、Ｐ…樹脂。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】