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ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的とする阻害薬とＣＯＸ－２阻害薬との併用

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１を標的とする阻害薬による新たな治療戦略を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明者らは、イヌの腫瘍疾患やウシの感染症における新規制御法の確立をめざして、COX-2阻害薬による免疫活性化効果と、抗PD-L1抗体との併用による効果の増強をin vitro試験にて確認した。本発明は、この知見により完成されたものである。

発明の効果[発明の詳細な説明]から抜粋

PD-1/PD-L1を標的とする阻害薬とCOX-2阻害薬を併用することで、免疫活性化効果が増強される。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2017-140891及び特願2018-016074の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

この特許の権利範囲[特許請求の範囲]

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 イヌ腫瘍細胞株 CMeC、LMeC、CMM-1、CMM-2（メラノーマ由来）およびHM-POS（骨肉腫由来）からのPGE2産生。CMM-1およびHM-POSでPGE2産生量が高い傾向にあった。
【図2】 イヌ腫瘍細胞株 CMeC、LMeC、CMM-1、CMM-2（メラノーマ由来）およびHM-POS（骨肉腫由来）におけるCOX2遺伝子発現量。PGE2産生量に一致してCMM-1およびHM-POSでCOX2遺伝子の発現量が高かった。
【図3】 イヌ末梢血単核球（PBMC）に対するPGE2の影響。イヌPBMCをスーパー抗原SEBおよび抗CD28抗体存在下で3日間刺激培養し、上清中のIL-2およびIFN-γ濃度をELISA法により定量した。PGE2はイヌPBMCからのIL-2およびIFN-γ産生を抑制した。
【図4】 イヌ腫瘍細胞株に対するCOX-2阻害薬のPGE2産生抑制効果。Meloxicamはイヌ腫瘍細胞株CMM-1（メラノーマ由来）およびHM-POS（骨肉腫由来）から産生されるPGE2量を低下させる傾向にあった。
【図5】 イヌPBMCに対するCOX-2阻害薬のPGE2産生抑制効果。Meloxicamはスーパー抗原SEBおよび抗CD28抗体存在下で3日間刺激培養したイヌPBMCから産生されるPGE2量を低下させた。
【図6】 COX-2阻害薬のイヌ免疫担当細胞活性化効果。イヌPBMCをスーパー抗原SEBおよび抗CD28抗体存在下で3日間刺激培養し、上清中のIL-2濃度をELISA法により定量した。MeloxicamはイヌPBMCからのIL-2産生を増加させた。
【図7】 抗PD-L1抗体およびCOX-2阻害薬の併用によるイヌ免疫担当細胞活性化効果。イヌPBMCをスーパー抗原SEBおよび抗CD28抗体存在下で3日間刺激培養し、上清中のIL-2濃度をELISA法により定量した。抗PD-L1抗体は単独でもイヌPBMCからのIL-2産生を増加させたが、Meloxicamを併用することでさらなるIL-2産生の増加が認められた。
【図8】 組み換えイヌPD-1に対する組み換えイヌPD-L1結合の阻害。イヌPD-1-IgへのイヌPD-L1-Igの結合をELISAプレート上で検出した。抗体非添加時の吸光度（O.D.）を100％とし、各抗体濃度におけるO.D.を相対値として表した。イヌPD-L1に交差反応を示したラット抗ウシPD-L1モノクローナル抗体4G12; Rat IgG2a (κ) 、5A2; Rat IgG1 (κ) 、および6G7; Rat IgM (κ)のうち、4G12, 6G7両クローンは結合阻害能が高かった。
【図9】 pDC6ベクターとラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体の模式図。
【図10】 ラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12およびc6G7の発現と精製。非還元条件にてSDS-PAGEを行い、CBB染色によりバンドを可視化した。a：プロテインA精製のみ、b：＋ゲル濾過クロマトグラフィー精製。
【図11】 ラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12およびc6G7のPD-1/PD-L1結合阻害活性。
【図12】 ラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12高発現細胞の樹立。
【図13】 ラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12のSDS-PAGE像。ラット抗ウシPD-L1抗体4G12およびラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12を還元条件および非還元条件にて電気泳動し、CBB染色により可視化した。還元条件では50 kDa付近に抗体重鎖、25 kDa付近に抗体軽鎖のバンドが見られた。目的以外のバンドは検出されなかった。
【図14】 ラット抗ウシPD-L1抗体4G12およびラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12のイヌPD-1/PD-L1結合およびCD80/PD-L1結合阻害活性。ラット抗ウシPD-L1モノクローナル抗体4G12およびラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12はイヌPD-1-IgおよびCD80-IgへのPD-L1-Ig結合量を低下させ、キメラ抗体化による結合阻害活性の変化は認められなかった。
【図15】 ラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12によるイヌ免疫担当細胞活性化効果。イヌPBMCを３日間刺激培養し、上清中のIL-2およびIFN-γ濃度をELISA法により定量した。また、刺激培養２日目に培養液中に核酸アナログEdUを添加し、その取り込み量をフローサイトメトリーにより定量した。ラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12はイヌPBMCからのIL-2およびIFN-γ産生を増大させ、CD4+およびCD8+リンパ球の増殖を亢進した。
【図16】 口腔内メラノーマ（A）および未分化肉腫（B）におけるPD-L1の発現。
【図17】 口腔内メラノーマ罹患犬を対象に行ったラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12投与治療試験における腫瘍のCT画像および外観。(a,d) 治療開始前、(b,e) 治療10週時点、(c,f) 治療34週時点。5回の抗体投与（治療開始後10週）で顕著な抗腫瘍効果が認められ、34週時点ではさらなる腫瘍の縮小が確認された。
【図18】 図１７で示した口腔内メラノーマ罹患犬における腫瘍長径の推移。ベースライン長径に比して、30%以上の縮小を部分奏功（PR）とした。
【図19】 未分化肉腫罹患犬を対象に行ったラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12投与治療試験におけるCT画像。(a,c) 治療開始前、(b,d) 治療3週時点。2回の抗体投与で顕著な腫瘍の縮小が認められた。
【図20】 口腔内メラノーマ罹患犬（肺転移症例）を対象に行ったラット－イヌキメラ抗PD-L1抗体c4G12投与治療試験におけるCT画像。(a,d,g) 治療開始前、(b,e,h) 治療6週時点、(c,f,i) 治療18週時点。9回の抗体投与により複数の肺転移巣が消失した。
【図21】 口腔内メラノーマ罹患犬の肺転移発生後の生存率の推移。抗体投与群では、対照群と比べて生存期間が延長された可能性がある。
【図22】 ラット抗ウシPD-L1抗体4G12のL鎖可変領域及びH鎖可変領域における、CDR1、CDR2及びCDR3領域を図示する。
【図23】 PGE2によるウシのT細胞応答への影響。
【図24】 ウシPBMCにおける免疫関連遺伝子の発現に対するPGE2の影響。
【図25】 ウシPBMCにおけるPD-L1の発現に対するPGE2の影響。
【図26】 ウシPBMCにおけるCOX-2阻害剤の免疫活性化効果。
【図27】 ヨーネ菌感染牛におけるPGE2の動態解析。
【図28】 ヨーネ菌感染牛における抗原刺激によるPD-L1発現量の変化。
【図29】 ヨーネ病病変部でのPGE2、EP2およびPD-L1の発現解析。
【図30】 COX-2阻害剤によるヨーネ菌特異的な免疫応答の活性化効果。
【図31】 ヨーネ菌感染牛におけるラット抗ウシPD-L1抗体の免疫活性化効果。
【図32】 COX-2阻害剤とラット抗ウシPD-L1抗体の併用によるヨーネ菌特異的な免疫活性化効果。
【図33】 COX-2阻害剤とラット－ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体の併用によるヨーネ菌特異的な免疫活性化効果。
【図34】 BLV感染牛におけるPGE2の動態解析。
【図35】 BLV感染牛におけるCOX2およびEP4遺伝子の発現解析。
【図36】 BLV感染牛における抗原刺激によるPGE2産生量の変化。
【図37】 BLV感染牛由来PBMC中のBLVプロウイルスに対するPGE2の影響。
【図38】 BLV感染牛における抗原刺激によるPD-L1発現量の変化。
【図39】 COX-2阻害剤によるBLV特異的な免疫応答の活性化効果。
【図40】 BLV感染牛におけるCOX-2阻害剤の抗ウイルス作用。
【図41】 COX-2阻害剤とラット抗ウシPD-L1抗体の併用によるBLV特異的な免疫活性化効果。
【図42】 COX-2阻害剤とラット－ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体の併用によるBLV特異的な免疫活性化効果。
【図43】 BLV感染牛におけるCOX-2阻害剤とラット－ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体の併用による抗ウイルス作用。
【図44】 Mycoplasma bovis感染牛におけるPGE2の動態解析。
【図45】 Mycoplasma bovis感染牛における血漿PGE2量と免疫抑制の指標の相関性。
【図46】 Mycoplasma bovis感染牛におけるCOX2およびEP4遺伝子の発現解析。
【図47】 Mycoplasma bovis感染牛におけるCOX-2阻害剤とラット抗ウシPD-L1抗体の併用による免疫活性化効果。
【図48】 ラット－ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体ch4G12の アミノ酸配列。ラット抗ウシPD-L1抗体4G12のL鎖可変領域及びH鎖可変領域における、CDR1、CDR2及びCDR3領域を示し、さらに、ウシIgG1（CH2ドメイン）に変異を加えたアミノ酸（アミノ酸番号および変異：250 E→P, 251 L→V, 252 P→A, 253 G→deletion, 347 A→S, 348 P→S）も示す。
【図49】 pDC6ベクターとラット－ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体ch4G12の模式図。
【図50】 ラット－ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体ch4G12の精製純度の確認。
【図51】 ラット-ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体ch4G12の結合特異性。
【図52】 ラット-ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体ch4G12のウシPD-1/PD-L1結合阻害活性（ウシPD-L1発現細胞と可溶性ウシPD-1の結合阻害試験の結果）。
【図53】 ラット-ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体ch4G12のウシPD-1/PD-L1結合阻害活性（ウシPD-1発現細胞と可溶性ウシPD-L1の結合阻害試験の結果）。
【図54】 ラット-ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体ch4G12のBLV抗原に対する応答性（細胞増殖）。
【図55】 ラット-ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体ch4G12のBLV抗原に対する応答性（IFN-γ産生量）。
【図56】 ラット-ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体ch4G12を投与したBLV実験感染牛におけるBLV抗原に対するT細胞の細胞増殖応答。
【図57】 ラット-ウシキメラ抗ウシPD-L1抗体ch4G12を投与したBLV実験感染牛におけるBLVプロウイルス量の変化。

代表図 図1本件の代表的な図

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