特許 7148770 倒立顕微鏡、操作ツール照明装置、および操作ツールの照明方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-09-28

(45)【発行日】2022-10-06

(54)【発明の名称】倒立顕微鏡、操作ツール照明装置、および操作ツールの照明方法

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/32 20060101AFI20220929BHJP

【ＦＩ】

G02B21/32

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2018142887

(22)【出願日】2018-07-30

(65)【公開番号】P2020020896

(43)【公開日】2020-02-06

【審査請求日】2021-03-08

(73)【特許権者】

【識別番号】390022471

【氏名又は名称】アオイ電子株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】301021533

【氏名又は名称】国立研究開発法人産業技術総合研究所

(74)【代理人】

【識別番号】100123984

【弁理士】

【氏名又は名称】須藤 晃伸

(74)【代理人】

【識別番号】100102314

【弁理士】

【氏名又は名称】須藤 阿佐子

(72)【発明者】

【氏名】森 昭登

(72)【発明者】

【氏名】杠 明日美

(72)【発明者】

【氏名】片岡 正俊

(72)【発明者】

【氏名】梶本 和昭

(72)【発明者】

【氏名】橋本 宗明

【審査官】森内 正明

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００５／０９６０６３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１３－４０８００（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－１１４６３０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平５－２５３８７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－２５５８４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－１３３４３３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０２Ｂ ２１／００ － ２１／３６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

透明基板上の観察試料中の操作対象を操作ツールで操作しつつ観察を行うことができる倒立顕微鏡であって、
観察試料が配置される透明基板と、
観察試料中の操作対象を操作する操作ツールと、
前記透明基板の底部から前記観察試料を照明する落射照明部と、
前記透明基板を介して前記操作ツールを照明する照明光を出射するサイド照明部と、
前記透明基板の側面に入射する前記サイド照明部の照明光の光軸の、前記透明基板に入射する前記落射照明部の照明光の光軸に対する角度を調整する角度調整部とを備える、倒立顕微鏡。

【請求項2】

請求項１に記載の倒立顕微鏡において、
前記角度調整部は、前記透明基板の側面に入射した前記照明光の一部が前記透明基板の界面に対する全反射条件を満たす範囲で前記角度を調整できる、倒立顕微鏡。

【請求項3】

請求項１または２に記載の倒立顕微鏡において、
前記角度調整部は、前記サイド照明部と、前記透明基板及び前記操作ツールとの位置関係に応じて前記角度を調整できる、倒立顕微鏡。

【請求項4】

請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の倒立顕微鏡において、
前記サイド照明部は前記照明光として白色光を出射する、倒立顕微鏡。

【請求項5】

前記操作ツールは開閉可能な一対のアームを備えるナノピンセットである、請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の倒立顕微鏡。

【請求項6】

請求項５に記載の倒立顕微鏡において、
前記透明基板に入射する前記落射照明部の照明光の光軸に直交する方向に、前記ナノピンセット、前記サイド照明部および前記角度調整部を一体で移動させる移動装置をさらに備える、倒立顕微鏡。

【請求項7】

請求項５または６に記載の倒立顕微鏡において、
前記サイド照明部は前記照明光としてスポット状の光を出射する、倒立顕微鏡。

【請求項8】

請求項５から請求項７までのいずれか一項に記載の倒立顕微鏡において、前記一対のアームの少なくとも先端領域に金属膜が形成されている、倒立顕微鏡。

【請求項9】

観察試料が配置される透明基板、観察試料中の操作対象を操作する操作ツール、前記透明基板の底部から前記観察試料を照明する落射照明部、前記透明基板が載置されるステージを有する筐体、および、前記筐体に支柱を介して設けられた移動装置を備え、前記操作対象を前記操作ツールで操作しつつ観察を行うことができる倒立顕微鏡に取り付け可能な操作ツール照明装置であって、
前記移動装置に取り付けられる支持アームと、
前記支持アームに対する固定位置を上下に調整可能な位置調整部と、
前記透明基板を介して前記操作ツールを照明する照明光を出射するサイド照明部と、
前記透明基板の側面に入射する前記サイド照明部の照明光の光軸の、前記透明基板に入射する前記落射照明部の照明光の光軸に対する角度を調整する角度調整部とを備える、操作ツール照明装置。

【請求項10】

請求項１から請求項８までのいずれか一項に記載の倒立顕微鏡を用いた操作ツールの照明方法であって、
前記透明基板に対して、入射した前記サイド照明部の照明光の一部が前記透明基板の界面に対する全反射条件を満たすように前記照明光を入射させ、
前記透明基板に入射した前記サイド照明部の照明光を前記界面での全反射により前記透明基板上の観察試料に導き、前記観察試料の操作対象を操作する操作ツールを照明する、操作ツールの照明方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、操作ツール照明装置、ナノピンセットシステムおよび操作ツールの照明方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞等の観察試料をナノピンセットやピペット等の操作ツールで操作しながら観察する場合、一般には特許文献１に記載のような倒立顕微鏡が用いられる。このような倒立顕微鏡において落射照明系を用いることで、操作ツールによる観察試料の操作が行いやすい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特開２０１７－４９３２５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、蛍光色素により染色された細胞等を蛍光観察する場合には操作ツールが観察し難くいため、操作ツールの取り扱いが非常に難しい。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の第１の態様による操作ツール照明装置は、透明基板上の観察試料中の操作対象を操作ツールで操作しつつ観察を行う倒立顕微鏡に用いられる操作ツール照明装置であって、前記透明基板を介して前記操作ツールを照明する照明光を出射する照明部と、前記透明基板に入射する前記照明光の光軸の、前記倒立顕微鏡の対物レンズの光軸に対する角度を調整する角度調整部とを備える。
本発明の第２の態様によるナノピンセットシステムは、開閉可能な一対のアームを前記操作ツールとして備えるナノピンセットと、前記操作対象を操作する前記一対のアームを前記透明基板を介して照明する前記操作ツール照明装置と、を備える。
本発明の第３の態様による操作ツールの照明方法は、倒立顕微鏡のステージ上に載置された透明基板に対して、入射した照明光の一部が前記透明基板の界面に対する全反射条件を満たすように前記照明光を入射させ、前記透明基板に入射した前記照明光を前記界面での全反射により前記透明基板上の観察試料に導き、前記観察試料の操作対象を操作する操作ツールを照明する。

【発明の効果】

【0006】

本発明によれば、観察試料を操作している操作ツールを容易に観察することができる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１は、ナノピンセットシステムが取り付けられた顕微鏡装置の側面図である。

【図2】図２は、ナノピンセットシステムを接眼レンズ方向から見た図である。

【図3】図３は、ナノピンセットの平面図である。

【図4】図４は、ホルダに取り付けられたナノピンセットを示す図である。

【図5】図５は、サイド照明による照明方法を説明する図である。

【図6】図６は、観察画像の一例を示す図である。

【図7】図７は、ナノピンセットシステムの概略構成を示すブロック図である。

【図8】図８は、ナノピンセットシステムを用いた細胞の捕集動作手順の一例を示すフローチャートである。

【図9】図９は、ナノピンセットの移動動作を説明する図である。

【図10】図１０は、複数の凹部が形成された透明基板の場合のナノピンセットとサイド照明との位置関係を示す図である。

【図11】図１１は、操作ツール照明装置の詳細を示す図である。

【図12】図１２は、観察試料が保持されたスライドガラスの一例を示す図である。

【図13】図１３は、スライドガラスを用いた場合のナノピンセットによる操作を説明する図である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。図１はナノピンセットシステム１の一実施の形態を示す図であり、ナノピンセットシステム１が取り付けられた顕微鏡装置２の側面図である。また、図２は、ナノピンセットシステム１を接眼レンズ２３の方向から見た図である。

【0009】

顕微鏡装置２は倒立型顕微鏡であり、筐体２０には対物レンズ２１が装着されたレボルバ２２、接眼レンズ２３、落射照明用光源２４、蛍光投光管２５、ｘｙステージ２６および撮像装置２７等を備えている。対物レンズ２１を通った観察光は、不図示のリレー光学系により接眼レンズ２３および撮像装置２７に導かれる。ｘｙステージ２６上には観察試料を有するスライドガラス等の透明基板２８が載置される。撮像装置２７の撮像データは、不図示の出力端子から外部へ出力される。例えば、撮像データは顕微鏡用ソフトウェアがインストールされたＰＣ（パーソナルコンピュータ）に入力され、観察画像がＰＣの表示装置に表示される。

【0010】

図１において、ナノピンセットシステム１は、顕微鏡装置２の筐体２０に固定される支柱３０と、支柱３０の上部に設けられたｘｙ方向移動部３１と、ｘｙ方向移動部３１に取り付けられた支持アーム３２と、支持アーム３２に取り付けられたｚ方向移動部３３と、ｚ方向移動部３３に保持されるホルダ３５に設けられたナノピンセット１０と、操作ツール照明装置３４とを備えている。

【0011】

図１，２では、操作ツール照明装置３４として、操作ツール照明装置３４に含まれる複数の要素の内の位置調整部３４１と、位置調整部３４１に取り付けられたサイド照明３４０と、操作ツール照明装置３４をｘｙ方向移動部３１に固定する支持アーム３４２、を示したが、操作ツール照明装置３４の詳細な構成は後述する。

【0012】

ナノピンセット１０は、ｘｙ方向移動部３１により図示ｘ方向およびｙ方向に移動され、ｚ方向移動部３３により図示ｚ方向に移動される。また、支持アーム３４２に取り付けられたサイド照明３４０も、ｘｙ方向移動部３１によりナノピンセット１０と一体でｘ方向およびｙ方向に移動される。詳細は後述するが、支持アーム３４２に対する位置調整部３４１の固定位置をｚ方向に上下に調整することにより、透明基板２８に対するサイド照明３４０のｚ方向位置を調整することができる。このように、本実施の形態では対物レンズ２１の光軸に直交する方向に、ナノピンセット１０および操作ツール照明装置３４を一体で移動させるｘｙ方向移動部３１を備えたので、ナノピンセット１０とサイド照明３４０とのｘｙ方向の相対位置は一定に保たれる。

【0013】

なお、本実施の形態では、サイド照明３４０を支持する支持アーム３４２をｘｙ方向移動部３１に固定することで、サイド照明３４０をナノピンセット１０と一体でｘ方向およびｙ方向に移動させるようにしたが、支持アーム３４２をｚ方向移動部３３に取り付けるようにしても良い。その場合、サイド照明３４０のｚ方向位置はナノピンセット１０の先端位置とほぼ一致する位置に設定され、ｚ方向移動部３３を駆動してナノピンセット１０をｚ方向に移動すると、サイド照明３４０もナノピンセット１０と一体にｚ方向に移動する。すなわち、ナノピンセット１０とサイド照明３４０との相対位置は一定に保たれる。

【0014】

図３は、ナノピンセット１０の平面図である。ナノピンセット１０は、例えば、ＳＯＩ(Silicon on Insulator)ウエハから一体で作製される（例えば、特開２００７－６９３２２号公報参照）。ＳＯＩウエハは、２枚のＳｉ単結晶板の一方にＳｉＯ_２層を形成し、ＳｉＯ_２層を介して貼り合わせたものである。ナノピンセット１０は、一対のアーム１３ａ，１３ｂ、一対の静電アクチュエータ１４ａ，１４ｂ、一対の支持部１７ａ，１７ｂ、一対の連結部１８ａ，１８ｂ、一対のアーム支持部１９ａ，１９ｂ、および台座１１を備えている。静電アクチュエータ１４ａには、固定電極１５ａおよび可動電極１６ａが設けられ、静電アクチュエータ１４ｂには固定電極１５ｂおよび可動電極１６ｂが設けられている。台座１１は、前述したホルダ３５に接合される。

【0015】

左右対称形状となっているアーム１３ａに関する静電アクチュエータ１４ａとアーム１３ｂに関する静電アクチュエータ１４ｂとは、同一構造を有している。固定電極１５ａおよび可動電極１６ａは、いずれも櫛歯形状を有しており、互いの櫛歯同士が隙間を介して噛み合うような状態で対向配置されている。固定電極１５ａは台座１１上に形成されている。一方、可動電極１６ａは、細いビーム状の支持部１７ａによって台座１１に弾性的に固定されている。固定電極１５ｂおよび可動電極１６ｂも同様の構造となっている。

【0016】

アーム１３ａ，１３ｂは、それぞれ細いビーム状のアーム支持部１９ａ，１９ｂを介して台座１１に弾性的に固定されている。アーム１３ａと可動電極１６ａとは連結部１８ａによって連結され、アーム１３ｂと可動電極１６ｂとは連結部１８ｂによって連結されている。

【0017】

左側のアーム１３ａには端子１２ｃが接続され、固定電極１５ａには端子１２ａが接続され、可動電極１６ａには端子１２ｂが接続されている。一方、右側のアーム１３ｂには端子１２ｄが接続され、可動電極１６ｂには端子１２ｅが接続され、固定電極１５ｂには端子１２ｆが接続されている。端子１２ａ，１２ｂ，１２ｅ，１２ｆ，１２ｇは電圧を印加するための端子である。端子１２ｃ，１２ｄは、アーム１３ａ，１３ｂ間に作用する電気量などを検出するために設けられている。そのため、アーム１３ａ，１３ｂは、それぞれ可動電極１６ａ，１６ｂとは絶縁されている。また、端子１２ｇは、台座１１が浮遊電極となるのを防止するためのアース端子である。

【0018】

図３の固定電極１５ａと可動電極１６ａとの間に電圧を印加すると、可動電極１６ａが固定電極１５ａに近づく方向（図示右方向）に動くことにより、アーム１３ａがアーム１３ｂに近づく方向（図示右方向）に駆動される。電圧印加を解除すると、アーム１３ａは元の位置へ復帰する。右側のアーム１３ｂについては動作が反転するだけであり、同様に、可動電極１６ｂが固定電極１５ｂに近づく方向（図示左方向）に動くことにより、アーム１３ｂがアーム１３ａに近づく方向（図示左方向）に駆動される。その結果、アーム１３ａとアーム１３ｂとの間に微小物体を把持したり、微小物体の把持を解除したりすることができる。

【0019】

図４はホルダ３５に取り付けられたナノピンセット１０を示す図であり、（ａ）は正面図、（ｂ）は側面図である。ナノピンセット１０は、セラミックスなどの絶縁部材を平板状に形成したホルダ３５に接合され、ホルダ３５と一体化されている。各端子１２ａ～１２ｇは、Ａｕワイヤにより対応する配線パターン３６ａ～３６ｇに接続されている。配線パターン３６ｇはアースされている。配線パターン３６ａ～３６ｆは、過電圧印加防止用のチップ抵抗Ｒを介して配線パターン３６ｇに接続されている。チップ抵抗Ｒは、外界の電磁波による交番電界によって導線に生じる起電力が静電アクチュエータ１４ａ，１４ｂ等に印加されるのを防止する目的で設けられたものである。

【0020】

電源回路の配線長さや周囲の環境によっては、上述の交番電界による周期的に変化する起電力がアーム１３ａ，１３ｂの開閉に必要な電圧を大きく越えてしまう可能性がある。そのような過大な起電力が静電アクチュエータ１４ａ，１４ｂ等に印加されると、アーム１３ａ，１３ｂの先端が過度に振動し、互いに接触して破損をもたらしたり、ナノピンセット１０の内部で絶縁破壊を引き起こしたりするおそれがある。上記チップ抵抗Ｒは、このような過電圧が印加されるのを防止するため設けられている。

【0021】

配線パターン３６ａ，３６ｂ，３６ｅ，３６ｆはケーブル３９により不図示のＤＣ電源に接続されている。ケーブル３９と配線パターン３６ａ，３６ｂ，３６ｅ，３６ｆとの接続部分およびＡｕワイヤ３７による接続部分には、配線外れ防止の補強のために樹脂３８ａ，３８ｂが塗布される。なお、チップ抵抗Ｒの代わりにダイオードを用いても良く、同様に過電圧が印加されるのを防止することができる。

【0022】

図５は、サイド照明３４０による照明方法を説明する図である。ｘｙステージ２６上に載置された透明基板２８には、観察試料２８１を収容する凹部２８０が形成されている。凹部２８０の平面視形状（ｚ軸負方向から見た形状）は直径１ｍｍ程度の円形であるが、凹部２８０の形状は必ずしも図５に示す形状に限定されない。なお、凹部２８０は、透明基板２８に複数形成されていても良い。図５に示す例では、凹部２８０には複数の細胞２８１ａ，２８１ｂを含んだ緩衝液と呼ばれる液体２８１ｃが観察試料２８１として収容されている。細胞２８１ａは異常細胞であって蛍光物質によって染色されている。細胞２８１ｂは正常細胞である。

【0023】

本実施の形態の顕微鏡装置２は観察試料２８１を蛍光観察する場合の構成を示している。落射照明用光源２４の照明光を励起フィルタ２００に通すと、励起フィルタ２００から励起光Ｌ１が出射される。励起光Ｌ１はダイクロイックミラー２０１により反射され、対物レンズ２１に入射して観察試料２８１に照射される。蛍光物質によって染色されている細胞２８１ａからは蛍光Ｌ２が放射され、蛍光Ｌ２は対物レンズ２１を通ってダイクロイックミラー２０１に入射する。蛍光Ｌ２はダイクロイックミラー２０１を透過し、吸収フィルタ２０２を通って接眼レンズ２３や撮像装置２７へと向かう。対物レンズ２１からの観察光には励起光Ｌ１の反射光や散乱光も含まれているので、それらを吸収フィルタ２０２で除去する。

【0024】

このようにして観察された細胞２８１ａは、ナノピンセット１０のアーム１３ａ，１３ｂでピックアップして採取され、さらに詳細な検査が行われる。そのためには、細胞２８１ａと共にアーム１３ａ，１３ｂも観察できなければならない。本実施の形態におけるナノピンセットシステム１は、アーム１３ａ，１３ｂを照明するためのサイド照明３４０を備えている。サイド照明３４０には、ＬＥＤ光源やハロゲン光源等の白色光源を用いるのが好ましい。

【0025】

図５に示すように、サイド照明３４０の照明光Ｌ３は、対物レンズ２１の光軸の軸外から対物レンズ２１の光軸方向へと照射される、サイド照明３４０の光軸は透明基板２８の側面２８４の法線ｎに対して角度θ１［deg］に設定されている。凹部２８０が形成された透明基板２８は矩形の板材であって、側面２８４は表面２８２および裏面２８３に対してほぼ垂直に形成されている。そのため、サイド照明３４０の光軸は対物レンズ２１の光軸に対して９０－θ１［deg］の角度を成している。なお、ｘｙステージ２６上に載置された透明基板２８の表裏面２８２，２８３は、対物レンズ２１の光軸に対して垂直であると仮定して説明する。なお、本実施の形態では、透明基板２８をｘｙステージ２６上に載置した場合における透明基板２８のｘｙステージ２６側の面を裏面２８３と称し、透明基板２８の裏面２８３とは反対側の面を表面２８２と称することにする。

【0026】

透明基板２８の材料にはサイド照明３４０の光を透過可能な材料であれば種々のものが使用可能であり、例えば、ガラスや透明なプラスチック材等が用いられる。プラスチック材としては、例えば、ポリスチレンやアクリル樹脂やジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ：Polydimethylsiloxane）等を使用される。各材料の屈折率は、ガラスが１．４～１．５程度、ポリスチレンが１．６程度、アクリル樹脂が１．６程度、ＰＤＭＳが１．４程度であり、水は１．３程度である。

【0027】

サイド照明３４０の角度θ１は、側面２８４から入射したサイド照明３４０の照明光Ｌ３が透明基板２８の表面２８２および裏面２８３で全反射される角度に設定される。例えば、透明基板２８の屈折率を１．６とした場合、全反射の臨界角θｍはsinθｍ＝１／１．６からθｍ≒３８．６８となる。よって、図５において角度θ３をθ３≧３８．７［deg］に設定すれば透明基板２８の裏面２８３で全反射される。一方、側面２８４から透明基板２８内に入射する照明光Ｌ３の角度θ２は、θ２≦θｍ（≒３８．６８［deg］）の角度となる。角度θ３はθ３＝９０－θ２なので、角度θ２がθ２＜θｍである場合には上述の条件θ３≧３８．７［deg］を自動的に満足している。

【0028】

すなわち、透明基板２８の屈折率が１．６の場合には、サイド照明３４０の角度θ１がどのような値であっても、透明基板２８に入射した照明光Ｌ３は表裏面２８２，２８３で全反射されることになる。言い換えると、サイド照明３４０を図５の破線Ｌ（側面２８４と一致する直線）よりも図示右側（側面２８４に関して対物レンズ２１の光軸とは反対の側）に配置して、透明基板２８の側面２８４に照明光Ｌ３が入射するようにすれば、照明光Ｌ３は表裏面２８２，２８３で全反射される。

【0029】

次に、透明基板２８の屈折率が１．４の場合について考える。屈折率が１．４の場合の臨界角θｍはθｍ≒４５．５８［deg］となり、照明光Ｌ３が表裏面２８２，２８３で全反射されるためには、θ３＝９０－θ２≧４５．５８［deg］のように設定する必要がある。このとき、θ２≦４４．４２［deg］となるので、スネルの法則により入射角θ１にはθ１≦７８．４８［deg］という条件が課せられる。

【0030】

このように、透明基板２８に用いられる材料の屈折率に応じて照明光Ｌ３の入射角θ１に課せられる条件は異なるが、照明光Ｌ３を対物レンズ２１の光軸の軸外から対物レンズ２１の光軸方向へと照射することで、凹部２８０の液体２８１ｃに浸かったアーム１３ａ，１３ｂの先端部分を照明することができる。なお、サイド照明３４０から出射される光が全てＬ３の方向に揃っている場合を除き、照明光Ｌ３が開き角度を有する光束である場合には、水平方向から側面２８４に対して垂直に照明した場合でも、透明基板２８内を斜めに進行して表裏面２８２，２８３で全反射される光線が存在し、アーム１３ａ，１３ｂが照明されることになる。

【0031】

このように、照明光Ｌ３を透明基板２８と透明基板２８に接する空気との境界である界面（表裏面２８２，２８３）で全反射させるためには、透明基板２８に対するサイド照明３４０の配置が重要である。そのため、本実施の形態では、サイド照明３４０のｚ方向位置および角度θ１を調整できるような構成とした。

【0032】

図１１は、操作ツール照明装置３４の詳細を示す図である。操作ツール照明装置３４は、図１，２に示したサイド照明３４０、位置調整部３４１および支持アーム３４２に加えて、角度調整用のボルト３４３とｚ位置調整用のボルト３４４とを備えている。位置調整部３４１はボルト３４４により支持アーム３４２に固定されている。支持アーム３４２にはｚ軸方向に長い長穴３４２ａが形成されており、ボルト３４４は長穴３４２ａを貫通して位置調整部３４１のネジ穴３４１ａに螺合している。サイド照明３４０は、ボルト３４３により位置調整部３４１に固定されている。

【0033】

サイド照明３４０の照明光Ｌ３の角度を調整する場合には、ボルト３４３を緩めてサイド照明３４０の傾き（対物レンズ２１の光軸に対する傾き）を調整する。その結果、透明基板２８の屈折率に応じて、照明光Ｌ３の入射角度θ１を最適に調整することができる。また、サイド照明３４０のｚ軸方向位置を調整する場合には、ボルト３４４を緩めて、支持アーム３４２に対する位置調整部３４１のｚ軸方向位置を調整する。その結果、ｘｙステージ２６（図２参照）の高さや透明基板２８を厚さに応じて、サイド照明３４０の高さを最適に調整することができる。

【0034】

なお、上述した説明では、サイド照明３４０の角度および高さを調整できるような構成としたが、一定の角度および高さで支持アーム３４２に固定する構成であっても良い。また、位置調整部３４１に角度変更用アクチュエータおよび角度検出センサを設けて、角度検出センサの検出値およびｘｙ方向移動部３１の位置検出装置の検出値に基づいて、サイド照明３４０の角度θ１を自動で所定の角度に調整するようにしても良い。

【0035】

本実施の形態では、図１１に示すように角度調整部であるボルト３４３を備えたので、透明基板２８の屈折率に応じて、透明基板２８に入射する照明光Ｌ３の光軸の対物レンズ２１の光軸に対する角度を、透明基板２８に入射した照明光Ｌ３の一部が透明基板２８の界面に対する全反射条件を満たす範囲に調整することができる。また、透明基板２８のｙ軸方向の寸法が異なる場合も、ボルト３４３を緩めてサイド照明３４０の角度を調整することで、照明光Ｌ３が透明基板２８の側面２８４に確実に入射するように角度θ１を調整することができる。

【0036】

上述のように図５の角度θ１を設定することで、透明基板２８内に入射した照明光Ｌ３内の全反射条件を満たすものは入射側の側面２８４から反対方向の側面側へと透明基板２８内を進行することになる。透明基板２８と液体２８１ｃとの間の屈折率差は小さいのでこれらの境界面では全反射はほぼ生じず、図５に示すように、透明基板２８内を図示左方向へ進む光は凹部２８０に収容された液体２８１ｃ内へ進入する。その結果、液体２８１ｃ内に浸かっているアーム１３ａ，１３ｂは照明光Ｌ３により照明され、アーム１３ａ，１３ｂの先端面で反射・散乱される。

【0037】

アーム１３ａ，１３ｂの先端面で反射・散乱された光Ｌ４の一部は、対物レンズ２１を通ってダイクロイックミラー２０１に入射する。上述したように、サイド照明３４０の光源には白色光源が用いられるので、光Ｌ４の内でダイクロイックミラー２０１を透過する波長成分はダイクロイックミラー２０１を透過して接眼レンズ２３および撮像装置２７に導かれる。その結果、図６に示すように、観察画像４０内に、蛍光により光っている細胞（異常細胞）２８１ａとサイド照明３４０により照明されているアーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１の像（以下では、アーム像と称する）１３１Ａ，１３１Ｂが観察される。

【0038】

上述のように、本実施の形態では、サイド照明３４０は、対物レンズ２１の光軸の軸外から、顕微鏡装置２のｘｙステージ２６上に載置された透明基板２８に照明光Ｌ３を入射する。その際、透明基板２８に対して、入射した照明光Ｌ３の一部が透明基板２８の界面に対する全反射条件を満たすように照明光Ｌ３を入射させる。透明基板２８に入射した照明光Ｌ３は、透明基板２８と透明基板２８に接する空気との境界である界面で全反射されて透明基板２８上の観察試料２８１に導かれ、観察試料２８１の操作対象である細胞２８１ａを操作する操作ツールであるアーム１３ａ，１３ｂを照明する。

【0039】

観察画像４０内のアーム像は、アーム１３ａ，１３ｂの先端面で反射・散乱された照明光Ｌ３が対物レンズ２１を通ることにより観察される。そのため、アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１に金属膜（例えば、Ａｕの膜）を形成することで反射率が向上し、より明るいアーム像が得られる。また、視認性を確保しつつサイド照明３４０の照度を抑えることができる。金属膜は、アーム１３ａ，１３ｂの少なくとも先端面１３１を含む先端領域に形成するのが好ましい。なお、図５に示す例では、アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１を対物レンズ２１の光軸に垂直な面としているが、先端面１３１を傾斜面としても良い。

【0040】

顕微鏡の焦点深度は比較的浅く、顕微鏡観察時には観察試料２８１の細胞２８１ａ，２８１ｂにピントが合っている。アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１が焦点深度の範囲内にあればアーム像はシャープであるが、先端面１３１が液面近くであって焦点深度の範囲から外れてしまうとぼやけたアーム像となる。また、液体２８１ｃの屈折率が水の屈折率（１．３３３）と同程度であると仮定すると、液面から空気中に出射される照明光Ｌ３は少ない。そのため、アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１が液体２８１ｃの外へ出てしまうと、アーム１３ａ，１３ｂは非常に弱い照明光で照明されると共にぼやけたアーム像となり、アーム１３ａ，１３ｂはほとんど観察されなくなる。

【0041】

次に、ナノピンセットシステム１を用いた細胞２８１ａの捕集動作の手順について説明する。まず、図７のブロック図を用いて、制御部も含むナノピンセットシステム１の概略構成を説明する。なお、図７はナノピンセットシステム１の概略構成を示すブロック図であるが、捕集動作の説明に必要な他の構成も記載した。

【0042】

図７において、ナノピンセットシステム１は、前述した図１にも示したように、ナノピンセット１０とｘｙ方向移動部３１、ｚ方向移動部３３およびサイド照明３４０と、それらを制御する制御装置６０とを備えている。制御装置６０は、ｘｙ方向移動部３１およびｚ方向移動部３３を制御する移動制御部６００と、ナノピンセット１０のアーム１３ａ，１３ｂの開閉動作を制御する開閉制御部６０１と、サイド照明３４０のオンオフおよび照度を制御する照明制御部６０２と、外部からの指令が入力される入力部６０３を備えている。図示は省略したが、入力部６０３にはオペレータが操作して移動指令や開閉指令や照明に関する指令を入力するための操作部（スイッチやジョイスティック等）が設けられている。

【0043】

図示していないが、ｘｙ方向移動部３１およびｚ方向移動部３３にはそれらの位置を検出するための位置検出装置（例えば、エンコーダ等）がそれぞれ設けられており、位置検出装置で検出された位置情報は移動制御部６００に入力される。移動制御部６００は、それらの位置情報に基づいてｘｙ方向移動部３１およびｚ方向移動部３３の位置を制御する。初期状態ではｘｙ方向移動部３１およびｚ方向移動部３３は原点位置に位置決めされており、そのときナノピンセット１０は図５に示した対物レンズ２１の光軸上に位置決めされる。

【0044】

顕微鏡装置２には、ｘｙステージ２６を駆動制御するステージ制御部２１０と、ステージ制御部２１０への移動指令を手動入力するための入力装置２１１とが設けられている。ｘｙステージ２６はステージ位置を検出する位置検出装置が設けられており、ステージ制御部２１０は位置検出装置からの位置情報に基づいてｘｙステージ２６の位置を制御する。また、顕微鏡装置２の撮像装置２７から出力される撮像データは、顕微鏡用ソフトウェアがインストールされたＰＣ（パーソナルコンピュータ）３００に入力される。ＰＣ３００は画像処理装置として機能し、ＰＣ３００に接続された表示装置３０１に観察画像を表示する。なお、顕微鏡装置２の入力装置２１１に代えて、ＰＣ３００から移動指令をステージ制御部２１０に入力するようにしても良い。

【0045】

図８は、ナノピンセットシステム１を用いた細胞２８１ａの捕集動作手順の一例を示すフローチャートである。ステップＳ１０では、ステージ制御部２１０は、透明基板２８が載置された顕微鏡装置２のｘｙステージ２６を移動して、観察試料２８１が収容されている凹部２８０を対物レンズ２１の光軸上に位置決めする。凹部２８０の位置情報は入力装置２１１により予め入力されている。ステップＳ２０では、オペレータは、観察試料２８１を蛍光観察して異常細胞である細胞２８１ａの位置を確認する。

【0046】

ステップＳ３０では、照明制御部６０２は入力部６０３に入力される照明点灯指令に基づいて、サイド照明３４０を点灯する。オペレータはナノピンセットシステム１の入力部６０３を操作して、照明制御部６０２に照明点灯指令を入力する。ステップＳ４０では、移動制御部６００は、入力部６０３に入力されるｚ軸正方向の移動指令に基づいてｚ方向移動部３３を移動し、ナノピンセット１０を降下させる。オペレータは、表示装置３０１に表示された観察画像４０を見ながら、または、接眼レンズ２３で観察しながら、入力部６０３を操作してｚ方向移動部３３をｚ軸正方向へ移動させる移動指令を入力する。

【0047】

ステップＳ５０では、ナノピンセット１０のアーム１３ａ，１３ｂが視認可能となった否かを判定する。判定は、オペレータが観察画像を見て判断しても良いし、ＰＣ３００にインストールされた顕微鏡用ソフトウェアによって自動的に判定しても良い。上述したように初期状態ではナノピンセット１０は対物レンズ２１の光軸上に位置している。アーム１３ａ，１３ｂの先端部分が液体２８１ｃの液面よりも降下して液体２８１ｃに浸かると、アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１が照明光Ｌ３により照明されて光り、アーム像１３１Ａ，１３１Ｂが図９（ａ）のように視野中央（観察画像４０の中央）に観察されることになる。図９（ａ）では、アーム像１３１Ａ，１３１Ｂを破線で表示することで、アーム像１３１Ａ，１３１Ｂがぼけていることを表現している。

【0048】

アーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１が液面付近に浸かっている場合には、焦点深度範囲から外れているのでアーム像１３１Ａ，１３１Ｂは図９（ａ）のようにぼけているが、ナノピンセット１０が降下してアーム１３ａ，１３ｂの先端面１３１が焦点深度範囲に近づくとアーム像１３１Ａ，１３１Ｂは徐々にシャープになる。そこで、観察画像４０内におけるアーム１３ａ，１３ｂの位置が認識できる程度までアーム像１３１Ａ，１３１Ｂのぼけが低減したならば、オペレータは視認可能と判断する。

【0049】

オペレータは、観察画像４０内におけるアーム１３ａ，１３ｂの位置が認識できる程度までアーム像１３１Ａ，１３１Ｂのボケが低減したならば、アーム１３ａ，１３ｂが視認可能と判断し、ｚ軸正方向への移動を停止する命令を入力部６０３により入力する。ステップＳ６０では、移動制御部６００は、入力部６０３により入力されたｚ軸正方向への移動を停止する命令に基づいて、ｚ方向移動部３３のｚ軸正方向への移動を停止する。その結果、ナノピンセット１０の降下が停止する。

【0050】

ステップＳ７０では、移動制御部６００は、入力部６０３により入力されたｘｙ方向移動指令に基づいてｘｙ方向移動部３１を移動し、アーム１３ａ，１３ｂを細胞２８１ａの位置へ移動させる。オペレータは、制御装置６０の入力部６０３を操作してｘｙ方向移動指令を入力する。図９（ｂ）に示すように観察画像４０内において一対のアーム像１３１Ａ，１３１Ｂの間にピックアップすべき細胞２８１ａが位置したら、オペレータは、ｘｙ方向移動指令の入力を停止する。

【0051】

ステップＳ８０では、開閉制御部６０１は、入力部６０３により入力されるオペレータの閉動作指令に基づいてアーム１３ａ，１３ｂの閉動作を行わせ、アーム１３ａ，１３ｂによって細胞２８１ａを把持させる。次いで、オペレータによりピックアップ指令が入力部６０３により入力されると、ステップＳ９０において、移動制御部６００は、ｘｙ方向移動部３１およびｚ方向移動部を移動して、細胞２８１ａをアーム１３ａ，１３ｂで把持した状態のナノピンセット１０を所定位置（例えば、初期位置）まで移動させる。この所定位置は、ｘｙステージ２６を移動しても透明基板２８とナノピンセット１０とが干渉しない位置に設定される。

【0052】

ステップＳ１００では、オペレータは、顕微鏡装置２の入力装置２１１を操作して、ｘｙステージ２６上に載置された捕集容器２１２が対物レンズ２１の光軸上に位置するようにｘｙステージ２６を移動させる。ステップＳ１１０では、オペレータは、アーム１３ａ，１３ｂで把持している細胞２８１ａを捕集容器２１２（図７参照）へ移動させる。具体的には、オペレータは、入力部６０３を操作してｚ方向移動部３３を移動させてナノピンセット１０を捕集容器２１２の上方所定位置まで下げた後に、開閉制御部６０１によりアーム１３ａ，１３ｂを開動作させ、細胞２８１ａを捕集容器２１２内へリリースさせる。

【0053】

図５に示した例では、透明基板２８に凹部２８０が１つ形成されている場合を示した。図１０に示す透明基板２８のように複数の凹部２８０ａ～２８０ｌが形成されている場合、それぞれの凹部２８０ａ～２８０ｌに観察試料２８１が収容される。そして、各凹部２８０ａ～２８０ｌの観察試料２８１に含まれている細胞（異常細胞）２８１ａに対して、図８に示した捕集動作が行われることになる。

【0054】

ところで、細胞２８１ａに照明光Ｌ３が長時間照射されると細胞２８１ａの蛍光物質からの蛍光が減光されやすくなるので、照明光Ｌ３を細胞２８１ａに長時間照射するのは好ましくない。図１に示したナノピンセットシステム１では、光束の断面積が比較的小さなスポット状のサイド照明３４０をナノピンセット１０と一体で移動させて、アーム１３ａ，１３ｂの先端領域を照明するような構成としている。そのため、図１０に示すように凹部２８０ｅの観察試料２８１を操作する場合には、凹部２８０ａ～２８０ｃ，２８０ｇ～２８０ｌに収容されている観察試料２８１にサイド照明３４０の照明光Ｌ３が入射するのを低減することができる。なお、ナノピンセット１０のアーム１３ａ，１３ｂの先端部分の厚さ寸法は１～６０μｍ程度なので、照明光Ｌ３の光束の直径は１ｍｍ程度あれば十分である。

【0055】

さらにまた、サイド照明３４０を顕微鏡装置２のｘｙステージ２６上に設置するようにしても良い。その場合、図１０に示すように透明基板２８に複数の凹部２８０ａ～２８０ｌが形成されている場合は、凹部２８０ａ～２８０ｌのいずれにナノピンセット１０が移動しても、アーム１３ａ，１３ｂの先端領域がサイド照明により照明されるようにするために、透明基板２８の一側面全体に照明光Ｌ３を入射できるようなバー状のサイド照明３４０ａを用いるのが好ましい。

【0056】

図５に示す例では、透明基板２８の凹部２８０に収容された観察試料２８１をナノピンセット１０で操作する場合を例に説明したが、例えば、図１２，１３に示すようなスライドガラス２９上に保持された観察試料２８１に関しても同様に適用することができる。図１２は観察試料２８１が保持されたスライドガラス２９の一例を示す図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は断面図である。透明基板であるスライドガラス２９上には、観察試料２８１を保持するための枠２９１が設けられている。矩形リング状の枠２９１は、例えばアクリル材で形成される。もちろん、枠２９１の形状は矩形リング状に限定されず円形リング状等であっても良いし、材質についてもアクリル材に限定されない。

【0057】

図１２のようなスライドガラス２９を透明基板として使用する場合も、図１３に示すようにサイド照明３４０をスライドガラス２９の側方に配置し、サイド照明３４０の照明光Ｌ３を、スライドガラス２９を介してアーム１３ａ，１３ｂの先端領域を照明する。スライドガラス２９の側面２９４からスライドガラス２９内に入射した照明光Ｌ３は、スライドガラス２９の表面２９２および裏面２９３で全反射され、観察試料２８１の液体２８１ｃに進入し、アーム１３ａ，１３ｂの先端領域を照明する。

【0058】

上述した実施の形態では、観察試料２８１を操作する操作ツールがナノピンセット１０である場合について説明したが、サイド照明３４０は、ナノピンセット１０以外の操作ツールの照明にも適用することができる。例えば、操作ツールとして観察試料中の細胞を吸引するガラス製細管の場合には、細管の先端に照明光Ｌ３を反射する金属膜を形成することで、照明光Ｌ３によって照明された細管先端部を容易に観察することが可能となる。

【0059】

なお、上述した実施の形態では、サイド照明３４０をｘｙステージ２６の透明基板２８を載置する面（載置面）よりも上方側（ナノピンセット１０が配置される側）に配置し、透明基板２８の側面２８４に照明光Ｌ３を入射させた。しかし、ｘｙステージ２６の載置面よりも下方側（対物レンズ２１側）にサイド照明３４０を配置するスペースが確保でき、照明光Ｌ３がｘｙステージ２６により遮られない場合には、ｘｙステージ２６の載置面よりも下方側にサイド照明３４０を配置して、載置面よりも下方側から透明基板２８の側面２８４に照明光Ｌ３を入射させるようにしても良い。その場合も、載置面よりも上方側から照明光Ｌ３を入射させる場合と同様に、照明光Ｌ３を透明基板２８内で全反射させて液体２８１ｃ内のアーム１３ａ，１３ｂを照明することができる。

【0060】

上述のように、本実施の形態の操作ツール照明装置３４は、透明基板２８上の観察試料２８１中の操作対象である細胞２８１ａを操作ツールであるナノピンセット１０で操作しつつ観察を行う倒立型の顕微鏡装置２に用いられる。そして、透明基板２８を介してナノピンセット１０を照明する照明光Ｌ３を出射する照明部であるサイド照明３４０と、透明基板２８に入射する照明光Ｌ３の光軸の、顕微鏡装置２の対物レンズ２１の光軸に対する角度を調整する角度調整部であるボルト３４３を備える。

【0061】

角度調整部であるボルト３４３を調整することにより、透明基板２８に入射する照明光Ｌ３の光軸の、対物レンズ２１の光軸に対する角度を、透明基板２８の屈折率に応じて適切に調整することができる。そのように調整することで、サイド照明３４０は、照明光Ｌ３を透明基板２８に入射し、透明基板２８を介してナノピンセット１０を照明する。ナノピンセット１０は、サイド照明３４０から出射された照明光Ｌ３により透明基板２８を介して照明されることにより、顕微鏡観察視野内にて光って見える。オペレータは、接眼レンズ２３を通して観察される観察像、または、ＰＣ３００にインストールされた顕微鏡用ソフトウェアにより表示装置３０１の観察画像により、観察試料２８１中の操作対象物である細胞１８１ａを操作しているナノピンセット１０のアーム１３ａ，１３ｂの識別が可能となる。

【0062】

上記では、種々の実施の形態および変形例を説明したが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。

【符号の説明】

【0063】

１…ナノピンセットシステム、２…顕微鏡装置、１０…ナノピンセット、１３ａ，１３ｂ…アーム、２１…対物レンズ、２６…ｘｙステージ、２８…透明基板、２９…スライドガラス、３１…ｘｙ方向移動部、３２，３４２…支持アーム、３３…ｚ方向移動部、３４…操作ツール照明装置、１３１…先端面、２８１…観察試料、２８１ａ，２８１ｂ…細胞、３４０，３４０ａ…サイド照明、３４１…位置調整部、３４３，３４４…ボルト、Ｌ３…照明光

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】