特許 7152733 がん転移抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-04

(45)【発行日】2022-10-13

(54)【発明の名称】がん転移抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/744 20150101AFI20221005BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20221005BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20221005BHJP

【ＦＩ】

A61K35/744

A61P35/04

A23L33/135

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2018012207

(22)【出願日】2018-01-29

(65)【公開番号】P2019131475

(43)【公開日】2019-08-08

【審査請求日】2020-09-18

【微生物の受託番号】IPOD  FERM BP-10902

(73)【特許権者】

【識別番号】591246849

【氏名又は名称】ニチニチ製薬株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】嶋田 貴志

(72)【発明者】

【氏名】日下部 守昭

【審査官】吉川 阿佳里

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－０８５９７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－０５６８５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】Exp. Omcol.，2005年，Vol. 27, Issue 4，p. 336-338

【文献】Cancer，1973年，Vol. 31，p. 1392-1396

【文献】医学と生物学，第143巻, 第3号，2001年，p. 113-118

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

がん転移抑制剤であって、
エンテロコッカス・フェカリスＮＦ－１０１１株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９０２）の死菌体及び前記死菌体の水溶性成分からなる群より選択される少なくとも１種を含有し、且つ
経口製剤形態、食品組成物、又は食品添加物である
、がん転移抑制剤。

【請求項2】

経口製剤形態の医薬である、請求項１に記載のがん転移抑制剤。

【請求項3】

食品組成物、又は食品添加物である、請求項１に記載のがん転移抑制剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がん転移抑制剤等に関する。

【背景技術】

【0002】

厚生労働省が発表した、平成２７年人口動態統計によると、死因の第一位は男女ともに悪性新生物である。悪性新生物とは、ＤＮＡの損傷によって異常な増殖を生じた細胞集団が周囲の組織に浸潤、または転移をし、正常な臓器を機能不全に陥れるもので、一般的にがんと呼ばれる。国立がんセンターの最新がん統計によると、２０１５年にがんで死亡した人は３７０，３４６例（男性２１９，５０８例、女性１５０，８３８例）で、死亡数の多い部位は一位が肺、二位が大腸、三位が胃となっている。

【0003】

がんの治療法としては、がん細胞の塊を手術で取り除く方法、抗がん剤によりがん細胞の増殖を抑える又は死滅させる化学療法、放射線によってがん細胞を死滅させる放射線治療、活性化した免疫細胞を体内に戻しがん細胞の増殖を抑える又は死滅させる免疫療法、がんの増殖に必要な標的分子を特異抗体によって阻害する抗体療法、それらを複合的に用いる治療法等がある。

【0004】

手術によるがんの切除は有効な治療方法である。手術によって、がんの組織を完全に除去してしまえば、がんは完治する。しかし、がん細胞が重要な組織に深く浸潤し、切除によって患者の生命や生活の質（ＱＯＬ）を著しく低下させる場合、完全には除去できず、化学療法と放射線療法を用いて残ったがん細胞を死滅させることが行われている。

【0005】

化学療法で用いられる薬剤としては、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗腫瘍性抗生物質、微小管阻害薬、ホルモン類似薬、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害薬、生物製剤（サイトカイン）、分子標的薬、非特異的免疫賦活薬等がある。アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗腫瘍性抗生物質、白金製剤、及びトポイソメラーゼ阻害薬は、ＤＮＡの合成や複製を阻害し、がん細胞を死滅させる薬剤である。ホルモン類似薬は、ホルモン依存性の腫瘍に対して効果を示す薬剤である。分子標的薬は、がんに特異的な分子生物学的特徴に対応した薬剤であり、抗体によってがんを阻害するものや、酵素に作用してがんの代謝を阻害する小分子がある。非特異的免疫賦活薬は、免疫細胞を活性化することでがん細胞の増殖を抑制するものである（非特許文献１）。いずれもがん細胞の増殖を抑制するものであるが、分子標的薬以外は、正常細胞への影響も強く、強い副作用の問題がある。

【0006】

副作用の軽い治療法として、免疫力を高める乳酸菌製剤を用いる報告もある。例えば、特許文献１には、乳がんの発症リスクを低減するために発症前に乳酸菌の生菌を１０年以上継続摂取する方法が示されている。また、特許文献２には、β－カテニン経路を抑制しがん細胞の増殖を抑制する乳酸菌を含む食品が記載されている。また、特許文献３には、乳酸菌の酵素処理物が腫瘍の成長を抑えることが記載されているが、免疫賦活や転移抑制についての記載はない。

【0007】

手術による病巣の切除および化学療法の併用により、がん患者の生存率は高まっているが、依然として日本における死因の一位にがんが挙げられていることから、現在の治療法はがんの根絶に十分ではないことがうかがえる。特に、転移というがんの特性は厄介である。がん患部が複数個所に拡大すると、手術時間の延長や回数を増やすことが必要になり、患者への負担増大から、体力の落ちたものや高齢者に手術を適用できなくなる。また、化学療法においても投薬量を増やす必要があるが、副作用から治療を脱落するものもいる。しかしながら、これまでに、がんの転移を抑制し、がんの治療を容易にする有効な薬剤や方法は開発されていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】特開２０１５－１７８５３０号公報

【文献】特開２０１３－２０３６６９号公報

【文献】特開平０９－２２７３９２号公報

【非特許文献】

【0009】

【文献】今日の治療薬（２０１６年度版） 南江堂

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、がん転移抑制剤を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者等は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体及びその菌体成分からなる群より選択される少なくとも１種ががん転移抑制作用を有することを見出した。また、溶菌酵素による処理を含む方法で得られた死菌体、その菌体成分は、免疫賦活作用が極めて低いにも関わらず、がん転移抑制作用を有することを見出した。本発明者等はこれらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。

【0012】

即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
項１． エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体及びその菌体成分からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、がん転移抑制剤．
項２． 前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリスである、項１に記載のがん転移抑制剤．
項３． 前記エンテロコッカス属に属する乳酸菌がエンテロコッカス・フェカリスＮＦ－１０１１株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９０２）である、項１又は２に記載のがん転移抑制剤．
項４． 前記菌体が死菌体である、項１～３のいずれかに記載のがん転移抑制剤．
項５． 前記死菌体が、生菌体の溶菌酵素による処理を含む方法で調製された死菌体である、項４に記載のがん転移抑制剤．
項６． 前記菌体成分が水溶性成分である、項１～５のいずれかに記載のがん転移抑制剤．
項７． 経口製剤形態である、項１～６のいずれかに記載のがん転移抑制剤．
項８． 食品組成物である、項１～７のいずれかに記載のがん転移抑制剤．
項９． 食品添加剤である、項１～７のいずれかに記載のがん転移抑制剤．
項１０． 医薬である、項１～７のいずれかに記載のがん転移抑制剤．

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、がん転移抑制剤を提供することができる。有効成分であるエンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体及びその菌体成分は、従来より食品として摂取されてきた物質である。よって、本発明の剤によれば、より副作用を低減しつつ、がん転移を抑制することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施例１のマクロファージ活性化試験の結果を示す。縦軸は、培養上清中のＴＮＦ－α濃度、すなわちマクロファージの活性化度を示し、横軸は培地に添加した試料を示す。

【図2】実施例２の乳がん細胞転移抑制試験の結果を示す。縦軸は、転移により形成された腫瘍コロニー数を示し、横軸は投与した試料を示す。

【図3】実施例３のメラノーマ細胞転移抑制試験のコロニー数カウント結果を示す。縦軸は、転移により形成された腫瘍コロニー数を示し、横軸は投与した試料を示す。

【図4】実施例３のメラノーマ細胞転移抑制試験の肺写真を示す。黒点が肺に転移したコロニーを示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。

【0016】

本発明は、その一態様において、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体及びその菌体成分からなる群より選択される少なくとも１種（本明細書において、「必須成分」と示すこともある。）を含有する、がん転移抑制剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下にこれについて説明する。

【0017】

エンテロコッカス属に属する乳酸菌は、特に限定されず、例えばエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・アビウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｖｉｕｍ）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ）、エンテロコッカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、エンテロコッカス・フラベセンス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはエンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム等が挙げられ、より好ましくはエンテロコッカス・フェカリスが挙げられる。また、エンテロコッカス・フェカリスの中でも、好ましくは健常者の糞便から分離された菌株であるエンテロコッカス・フェカリスＮＦ－１０１１株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９０２）が挙げられる。

【0018】

エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体は、エンテロコッカス属に属する乳酸菌の構成物全体である限り特に限定されず、生菌体であっても、死菌体であってもよい。菌体は、凍結乾燥物等の乾燥物であってもよい。

【0019】

エンテロコッカス属に属する乳酸菌の生菌体は、ＡＴＣＣ、ＩＦＯ、ＪＣＭ等の国内分譲機関、国際分譲機関等から取り寄せることができるし、生物体から単離することもできる。これらの微生物は、食品中に一般的に存在している細菌、または食品製造に用いられる細菌、もしくは健常者の糞便から分離した細菌であることから、副作用の危険性はない。

【0020】

また、培養により容易に大量に得ることができるため、培養して得られた生菌体を用いると生産コストが安く経済的である。エンテロコッカス属に属する乳酸菌の生菌体は、公知の方法に従って培養することにより、増殖させることもできる。例えば、該乳酸菌を、適量の滅菌ロゴザ液体培地に播種し、３５～３７℃にて１０～１６時間好気的に静置培養し、前培養液を得て、これを大容量の滅菌ロゴザ液体培地に加え同様に静置培養することによって、大量の生菌体を得ることができる。生菌体を採用する場合、例えば培養液そのものを用いてもよいし、該培養液の固形分（例えば、培養液から遠心分離等で生菌体を沈殿させて得られた沈殿物、その後必要に応じて生理食塩水等で洗浄して得られた沈殿物等）を用いてもよいし、該固形分の懸濁液（例えば生理食塩水などの等張液に懸濁して得られた懸濁液等）を用いてもよい。

【0021】

エンテロコッカス属に属する乳酸菌の死菌体は、特に限定されないが、例えば生菌体の細胞壁破壊処理物であることができる。この細胞壁破壊は、生菌体の細胞壁の全体であってもよいし、一部分であってもよい。細胞壁破壊処理方法としては、例えば熱処理、物理的力による処理、溶菌酵素による処理等、或いはこれらを組み合わせた処理が挙げられる。これらの中でも、好ましくは溶菌酵素による処理を含む方法が挙げられ、より好ましくは（ａ）溶菌酵素による処理、並びに（ｂ）熱処理及び物理的力による処理からなる群より選択される少なくとも１種の処理（好ましくは熱処理）を含む方法が挙げられ、さらに好ましくは（ａ）溶菌酵素による処理後に、（ｂ）熱処理及び物理的力による処理からなる群より選択される少なくとも１種の処理（好ましくは熱処理）を行うことを含む方法が挙げられる。

【0022】

熱処理の温度は、１００℃以上であれば特に限定されないが、好ましくはオートクレーブ処理ができる温度（例えば１１０～１２５℃）であることができる。熱処理時間は、細胞壁の一部又は全部を破壊できる限り特に限定されず、熱処理の温度に応じて適宜設定することができる。熱処理時間は、例えば１分間以上、好ましくは５～２０分間、より好ましくは５～１５分間程度であることができる。

【0023】

物理的力による処理の方法は、細胞壁の一部又は全部を破壊できる限り特に限定されない。例えば、超音波処理、フレンチプレス等が挙げられる。

【0024】

溶菌酵素による処理に用いる酵素は、細胞壁の一部又は全部を破壊できる限り特に限定されず、細菌類を溶菌するために普遍的に用いられている酵素を広く用いることができる。溶菌酵素としては、例えば、リゾチーム、アクチナーゼ、ザイモリエース、キタラーゼ、ムタノシリン、アクロモペプチターゼ等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはリゾチームが挙げられる。溶菌酵素は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0025】

溶菌酵素による処理条件は、溶菌酵素の種類、溶菌対象（生菌体）量等に応じて適宜設定することができる。例えば、溶菌酵素を終濃度０．０１～１ｍｇ／ｍＬになるように生菌体懸濁液に添加し、３０～４０℃で１～１０時間処理すればよい。

【0026】

エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【0027】

エンテロコッカス属に属する乳酸菌の菌体成分は、該乳酸菌の菌体を構成する成分である限り特に制限されない。該菌体成分は、好ましくは水溶性成分である。水溶性成分は、例えば、死菌体の水含有溶媒懸濁液から、遠心分離等により固形分を除いて得られる。

【0028】

本発明の剤は、各種分野において、例えば医薬、食品組成物［例えば健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメントなど）、栄養機能食品、特定保健用食品を含む。］、食品添加剤などとして利用することができる。

【0029】

本発明の剤の製剤形態は、特に限定されず、本発明の剤の利用分野に応じて、各利用分野において通常使用される製剤形態をとることができる。必須成分を必要に応じて濃縮状態とすることにより、多量の菌体またはその処理物であっても投与可能な剤形に調製することができる。製剤形態としては、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などの非経口摂取に適した製剤形態（非経口製剤形態）が挙げられ、好ましくは経口製剤形態が挙げられる。特に、食品組成物としては、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばガム、錠菓等の菓子類、栄養飲料等の飲料類などのバランス栄養食、粉末、カプセル、錠剤などが挙げられる。

【0030】

本発明の剤は、必須成分の他に、利用分野、製剤形態等に応じて、他の成分を適宜配合してもよい。配合できる成分としては、特に制限されないが、例えば、水、アミノ酸類、アルコール類、多価アルコール類、糖類、ガム質、多糖類などの高分子化合物、界面活性剤、防腐・抗菌・殺菌剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、抗酸化剤、酵素成分、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、清涼化剤の他、ミネラル類、細胞賦活剤、滋養強壮剤、賦形剤、増粘剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、分散剤、吸着剤、崩壊補助剤、湿潤剤または湿潤調節剤、防湿剤、着色料、着香剤または香料、芳香剤、還元剤、可溶化剤、溶解補助剤、発泡剤、粘稠剤または粘稠化剤、溶剤、基剤、乳化剤、可塑剤、緩衝剤、光沢化剤などを挙げることができる。

【0031】

本発明の剤における必須成分の含有量は、その使用形態により適宜選択することができるので特に限定されない。本発明の剤中に必須成分を有効量配合すればよいが、本発明の剤の重量に対して必須成分を乾燥重量で、通常、０．００１～６０％、より好ましくは０．０１～４０％、特に好ましくは０．１～３０％の比率で配合できる。

【0032】

本発明の剤の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、症状、患者の年齢、体重、製剤形態等に応じて適宜増減することができる。成人１日あたり必須成分を乾燥重量として、通常、０．００１～０．５ｇ／Ｋｇ体重を、好ましくは、０．００２～０．１ｇ／Ｋｇ体重を適用することができ、さらに、１日１回又は数回に分けて適用することができる。

【実施例】

【0033】

以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0034】

参考例１．生菌体試料の調製
エンテロッコカス・フェカリスＮＦ－１０１１株（特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－１０９０２）をロゴサ液体培地１０ｍｌに播種し、３７℃にて１５時間好気的に静置培養（前培養）し、菌体濃度が約１０^９個／ｍｌの菌体液（シード）を得た。これをロゴサ液体培地１０Ｌに播種（菌体濃度：１０^６個／ｍｌ）し、３７℃で１６時間好気的に静置培養し、生菌数約１０^９個／ｍｌの菌体液を得た。得られた菌体液を遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分間）して集菌し、これを生理食塩水（０．８５％塩化ナトリウム水溶液）で２回洗浄して、蒸留水１００ｍｌに懸濁し、菌体懸濁液を得た。

【0035】

参考例２．死菌体試料の調製
生菌体試料（参考例１）である菌体懸濁液にリゾチームを終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ量となるよう添加し、３７℃で４時間処理後、１１０℃で１０分間加熱処理して、菌体処理物を得た。

【0036】

参考例３．死菌体水溶性成分試料の調製
死菌体試料（参考例２）である菌体処理物を遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間）し、上清を回収した。

【0037】

実施例１．マクロファージ活性化試験
３％チオグリコレート培地でマウス腹腔に誘導したマクロファージを回収し、ＦＣＳ１０％含有ＲＰＭＩ培地（ニッスイ）で１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整した。９６穴細胞培養プレートにて、生菌体試料（参考例１）あるいは死菌体試料（参考例２）と共に３時間培養し、培養上清中のＴＮＦ－α量をＥＬＩＳＡ法（ＲＳＤ社 ＴＮＦ－α Ｍｏｕｓｅ ＤｕｏＳｅｔ）にて測定した。

【0038】

結果を図１に示す。生菌体試料（参考例１）を添加した場合は、ＴＮＦ－αが検出されマクロファージが活性化されていることが確認されたが、死菌体試料（参考例２）を添加した場合はＴＮＦ－αがほとんど検出されなかった。

【0039】

実施例２．乳がん細胞転移抑制試験
雄性のＢＡＬＢ／ｃマウス８週齢を２群に分け、対照群には生理食塩水を、試験群には死菌体試料（参考例２）（６０ｍｇ／匹）を、試験期間中連日経口投与した。投与開始から３日目に、ＢＪＭＣ３８７９マウス乳がん細胞（入手元：大阪医科大学）（５×１０^５ｃｅｌｌｓ／匹）を眼窩静脈叢より接種させた。乳がん細胞接種７日目に肺を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン包埋、薄切、ＨＥ染色を行い、切片上の腫瘍コロニー数をカウントした。

【0040】

結果を図２に示す。死菌体試料（参考例２）を投与した群では肺に生着したがん細胞が有意に少ないことが分かった。

【0041】

実施例３．メラノーマ転移抑制試験
雌性のＣ５７ＢＬ／６Ｌ－ＣＡＳマウスを２群に分け、対照群には生理食塩水を、試験群には死菌体水溶性成分試料（参考例３）（死菌体試料（参考例２）６０ｍｇ分／匹）を、試験期間中連日経口投与した。投与開始３日目に、メラノーマ細胞（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／匹）を眼窩静脈叢より接種させた。メラノーマ細胞接種１４日目に肺を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定した後、グリセリン浸漬で透明化を行った。実体顕微鏡下で肺に生着しているメラノーマの写真を撮影し、コロニー数をカウントした。

【0042】

結果を図３に示す。死菌体水溶性成分試料（参考例３）を投与した群では肺に生着したがん細胞が有意に少ないことが分かった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】