特許 7161730 顆粒状角膜変性症に対する遺伝子治療薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-10-19

(45)【発行日】2022-10-27

(54)【発明の名称】顆粒状角膜変性症に対する遺伝子治療薬

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20221020BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20221020BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20221020BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20221020BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20221020BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20221020BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20221020BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20221020BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20221020BHJP

   C07K 14/495 20060101ALN20221020BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 120Z

C12N15/09 110

C12N9/16 Z

A61K48/00 ZNA

A61P27/02

A61P43/00 105

A61K31/7105

A61K31/711

A61K38/46

C07K14/495

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2019523958

(86)(22)【出願日】2018-06-07

(86)【国際出願番号】 JP2018021797

(87)【国際公開番号】W WO2018225807

(87)【国際公開日】2018-12-13

【審査請求日】2020-06-29

(31)【優先権主張番号】P 2017112406

(32)【優先日】2017-06-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(73)【特許権者】

【識別番号】304021831

【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】臼井 智彦

(72)【発明者】

【氏名】竹渓 友佳子

(72)【発明者】

【氏名】大内 靖夫

【審査官】平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０８３８５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１３３５５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１３９１３９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／０２１９７３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１６－５０１０３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１６／２１０２７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１９－５２４１４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】日本眼科学会雑誌，2016年，Vol.120，pp.246-263，p.259, 図18

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１）顆粒状角膜変性症に関連する、トランスフォーミング増殖因子β誘発（ＴＧＦＢＩ）遺伝子のＲ１２４変異部位を含む標的配列を標的とする、ガイドＲＮＡ分子であって、当該変異部位の２～４ｂｐ下流に位置するＣＧＧをＴＧＦＢＩ遺伝子のスペーサー前隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列とし、その発現がＵ６プロモーターによって駆動され、
標的配列と相補的な、少なくとも１７～１８塩基から成る領域を含む、アデニン又はグアニンから始まる２２塩基の配列から成るガイド配列であって、ｓｐＣａｓ９と複合体を形成し、それにより標的配列を切断することができるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡ分子と、
２）Ｒ１２４変異を野生型のアミノ酸に相当する塩基に置き換えるノックイン配列であって、
制限酵素部位ＢｓｉＷＩを有するノックイン配列と、ノックイン配列の両端に、各アームが４０～６０塩基の相同性アームとを有するドナーＤＮＡとを含む、
キット。

【請求項2】

Ｒ１２４変異がＲ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｃ及びＲ１２４Ｌからなる群から選択される、請求項１に記載のキット。

【請求項3】

顆粒状角膜変性症が顆粒状角膜ジストロフィー２型（ＧＣＤ２）である、請求項１又は２に記載のキット。

【請求項4】

ガイド配列が配列番号１の塩基配列を有し、ドナーＤＮＡが相同性配向型修復（ＨＤＲ）の鋳型ドナーとしてのｓｓＯＤＮ分子であり、ｓｓＯＤＮ分子が配列番号２の塩基配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット。

【請求項5】

ガイド配列が、ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ ＲＮＡ）配列と結合している、請求項１～４のいずれか１項に記載のキット。

【請求項6】

更にベクターを含み、ガイドＲＮＡとＵ６プロモーターが当該ベクター上で作用可能に連結している、請求項１～５のいずれか一項に記載のキット。

【請求項7】

野生型のアミノ酸に相当する塩基がＣＧＴ又はＣＧＣである、請求項１～６のいずれか一項にに記載のキット。

【請求項8】

ＳｐＣａｓ９を更に含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、顆粒状角膜変性症に対する遺伝子治療薬に関する。

【背景技術】

【0002】

角膜は、その透明性が視力維持に極めて重要であり、角膜が混濁すると視力が著しく低下する。角膜については種々の遺伝性疾患が知られている。例えば、角膜変性症に罹患すると、角膜に白い沈着物が生じ、加齢とともにますます混濁が多くなり、徐々に前が見えなくなる。角膜変性症の中でも日本人に最も頻度の高い疾患が顆粒状角膜変性症である。顆粒状角膜変性症に罹患した患者においては、本来透明である角膜が年齢とともに混濁が強くなり、また、６０歳前後でかなり視力が低下してくる。

【0003】

このような角膜混濁疾患として、常染色体優性の遺伝性疾患である顆粒角膜ジストロフィー（Ｇｒａｎｕｌａｒ ｃｏｒｎｅａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＧＣＤ））が知られている。ＧＣＤは、染色体５ｑ３１上に位置するトランスフォーミング増殖因子β誘発（ＴＧＦＢＩ）遺伝子における点突然変異によって引き起こされ、角膜実質に複数の不規則な形の顆粒状不透明性さをもたらす。ＴＧＦＢＩ関連角ジストロフィーの一つである顆粒状角膜ジストロフィー２型（Ｇｒａｎｕｌａｒ ｃｏｒｎｅａｌ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｔｙｐｅ ２（ＧＣＤ２））は、ＴＧＦＢＩタンパク質の１２４番目アミノ酸のアルギニンがヒスチジンに置換されることで生じる。韓国ではおよそ８７０人に１人がＧＣＤ２に罹患しているとされ、その患者数は５万人以上であると推定されている。

【0004】

角膜混濁疾患の治療方法として、角膜移植や、フッ化アルコンガスのエキシマレーザー（波長１９３ｎｍ）を用いた角膜表層切除術による角膜混濁除去が知られている。近年採用されている角膜移植には大きく分けて、角膜上皮層、ボーマン膜、角膜実質層、デスメ層、角膜内皮層の五層全てを移植する全層角膜移植（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ（ＰＫＰ））と、表面の三層を入れ替える深層層状角膜移植（Ｄｅｅｐ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｌａｍｅｌｌａｒ Ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｙ（ＤＡＬＫ））の２つがある。いずれも移植成績に優れており、数年にわたり混濁を除去した状態を維持できるという利点がある。しかしながら、侵襲性が高く、移植に伴う合併症が生じる場合があり、再発のリスクもある。

【0005】

エキシマレーザーによる角膜切除にも種々の利点があり、例えば、角膜移植と比べて比較的低侵襲であること、繰り返しの手術が可能であること、そして角膜移植までの期間を延長できることなどが挙げられる。しかしながら、角膜が薄くなることで屈折が変化し、遠視化する場合がある。また、術後不快感を伴うことがあり、角膜移植と同様に再発性の問題も存在する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Mannis MJ and Holland EJ. Cornea-fundamentals, diagnosis and management- Fourth edition, volume1, P781-785, Elsevier

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

現在、ＧＣＤ２を完治できる治療方法は確立されていない。また、角膜移植やエキシマレーザーによる角膜切除には上述したような改善すべき欠点が多く存在する。

【0008】

かかる事情に鑑み、本発明は、顆粒角膜ジストロフィーなどの角膜における遺伝性疾患、特にＧＣＤ２を従来より更に低侵襲で、尚且つ治療後は症状が再発しないような新規なアプローチにより解決することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

根本的な治療を実現するには、ＴＧＦＢＩタンパク質の１２４番目のヒスチジンに対応する遺伝子配列の変異を正常な遺伝子配列に修復する必要がある（図１）。従来、遺伝子改変を行うには遺伝子導入部位に相同的な配列を両端に含んだ外来遺伝子を細胞内に導入することで、偶発的に起きる遺伝子相同組換えを利用する方法が胚性幹細胞に対する発生工学を中心に行われてきたが、細胞のクロマチンの状態とDNAのメチル化の状態に強く影響されることが知られている（Feng Liang, et al., “Studies on the influence of cytosine methylation on DNA recombination and end-joining in mammalian cells., J Biol Chem. 1995 Oct 6;270(40):23838-44（http://www.jbc.org/content/270/40/23838.full.pdf））。このことから、一般にクロマチン構造が凝縮した状態にある分化後の体細胞では、遺伝子相同組換えを利用した遺伝子導入は非常に困難であり、事実、角膜実質細胞では本手法による遺伝子導入の報告は存在しない。

【0010】

近年、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等を利用したゲノム編集技術と呼ばれる新しい遺伝子改変技術の登場により、容易に標的遺伝子配列を切断することが可能となってきた。これらのゲノム編集ツールによって得られたゲノムＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）領域は、非相同性末端結合（Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｎｄ Ｊｏｉｎｉｎｇ （ＮＨＥＪ））と相同性配向型修復（ＨＤＲ）という、２種類の修復機能のいずれかによって修復されるが、切断部位に相同的な配列を持った鋳型核酸を細胞内に導入し、ＨＤＲを誘導することで切断部位の遺伝子配列を置換することが可能である。ＨＤＲ技術はゲノム上の特定配列を標的として、自由に遺伝子配列を編集することを可能とする画期的な技術である。

【0011】

しかしながら、高効率、高い特異性、且つ再現性の良いゲノム編集技術を実現するには、ゲノム編集ツールの高効率での細胞内導入と、ゲノム編集ツールの精緻な設計が必要となる。

【0012】

特にＲＮＡ誘導型のゲノム編集ツールであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、一般的に用いられている化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであるＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を利用した場合、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれる２０塩基の標的配列の認識に必要な配列を持った約１２０塩基ほどのＲＮＡとＳｐＣａｓ９タンパク質の複合体を用いてｇＲＮＡと相補的に結合した任意のＤＮＡ配列を二本鎖切断するが、ＰＡＭ配列（スペーサー前隣接モチーフ）と呼ばれるＮＧＧの３塩基が２０塩基の標的配列の直後に存在しないと切断は不可能である。

【0013】

またＳｐＣａｓ９による二本鎖切断は、このＰＡＭ配列の３－４塩基の上流で起こることから、切断したい部位が決まっている場合、その下流にＰＡＭ配列がなければ、ＳｐＣａｓ９を用いた当該部位の二本鎖切断は不可能となる。さらにはｇＲＮＡの塩基配列におけるＧＣ含有量は４０－８０％の範囲で、ＧＣ含有率が高い方が切断効率が良いことが知られている。またオフターゲット効果による非特異的な切断も報告されており、標的配列に対して３塩基ミスマッチまでの配列が切断されてしまう可能性があることから、ｇＲＮＡの設計の際にはミスマッチとなる配列を可能な限り減らす必要がある。

【0014】

通常プラスミドベクターを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集ツールの細胞内導入の際には、ｇＲＮＡを発現させるプロモーターとして通常Ｕ６プロモーターが用いられる。このＵ６プロモーターの転写開始点はプリン塩基（ＧもしくはＡ）でないと十分な発現レベルでｇＲＮＡが発現されないことから、標的配列の設計が制限される。

【0015】

一方、ＨＤＲ技術を用いた標的遺伝子配列の編集は、通常一本鎖オリゴＤＮＡ（ｓｓＯＤＮ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、プラスミドなどをＨＤＲ鋳型ドナーとして用いて行われるが、その効率は非常に効率が低く（２０％以下）、鋳型ドナーの相同性アームの配列の設計もＨＤＲでのゲノム編集を行う上で重要な要素となることが明らかとなっている。

【0016】

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。まず、ゲノム編集技術としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを利用し、一般的な設計手法では不可能であった変異ＴＧＦＢＩ遺伝子を標的とする特殊なｇＲＮＡを設計し、ＨＤＲ鋳型ドナーとして再切断による影響を防ぎ、かつＴＧＦＢＩ遺伝子の正常化と遺伝子修復の容易な確認を実現できる全長１００ｎｔのｓｓＯＤＮを開発することに成功した。その結果、本発明者らは、角膜変性症患者由来の細胞のＴＧＦＢＩタンパク質の１２４番目に位置するアミノ酸の変異に対して、高効率、高い特異性、且つ再現性よく変異遺伝子を修復し、正常なＴＧＦＢＩアミノ酸配列に修復する手段を見出し、本発明を完成させるに至った。

【0017】

即ち、本願発明は以下の発明を包含する：
（１）対象における顆粒状角膜変性症を治療する方法であって、
顆粒状角膜変性症に関連するトランスフォーミング増殖因子β誘発（ＴＧＦＢＩ）遺伝子の変異を修復するために、対象の角膜実質細胞とＣａｓ９及びガイドＲＮＡとを接触させる工程を含む、方法。
（２）ＴＧＦＢＩ遺伝子の変異が点変異である、（１）に記載の方法。
（３）顆粒状角膜変性症が顆粒状角膜ジストロフィー２型（ＧＣＤ２）である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）点変異がＴＧＦＢＩタンパク質の１２４位におけるアミノ酸置換である、（２）に記載の方法。
（５）アミノ酸置換がＲ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｃ及びＲ１２４Ｌからなる群から選択される、（４）に記載の方法。
（６）ガイドＲＮＡが、ＴＧＦＢＩ遺伝子のスペーサー前隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の上流側に隣接した２２塩基の配列から成る標的配列とハイブリダイズすることができるガイド配列を含む、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ＰＡＭ配列がＣＧＧから成る、（６）に記載の方法。
（８）ガイド配列が、標的配列と相補的な、少なくとも１７～１８塩基から成る領域を含む、（６）又は（７）に記載の方法。
（９）ガイド配列が、アデニン又はグアニンから始まる２２塩基の配列から成る、（６）～（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）ガイド配列が配列番号１の塩基配列を有する、（９）に記載の方法。
（１１）ガイド配列が、ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ ＲＮＡ）配列と結合している、（６）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）ガイドＲＮＡの発現がＵ６プロモーターによって駆動される、（１）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）ガイドＲＮＡとＵ６プロモーターが同一又は異なるベクター上に位置する、（１２）に記載の方法。
（１４）ガイドＲＮＡとＵ６プロモーターが同一のベクター上で作用可能に連結している、（１３）に記載の方法。
（１５）ＴＧＦＢＩ遺伝子の変異の修正が、Ｃａｓ９により切断された配列の相同性配向型修復（ＨＤＲ）を介して行われる、（１）～（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）ＨＤＲの鋳型ドナーとして一本鎖オリゴＤＮＡ（ｓｓＯＤＮ）が使用される、（１５）に記載の方法。
（１７）ｓｓＯＤＮが、点変異を野生型のアミノ酸に相当する塩基に置き換えるノックイン配列を有する、（１６）に記載の方法。
（１８）野生型のアミノ酸に相当する塩基がＣＧＴ又はＣＧＣである、（１７）に記載の方法。
（１９）ノックイン配列が制限酵素部位を有する、（１８）に記載の方法。
（２０）野生型のアミノ酸に相当する塩基がＣＧＴであり、制限酵素部位がＢｓｉＷＩ部位である、（１９）に記載の方法。
（２１）ｓｓＯＤＮが更に、切断部位の両端に相同的な５０塩基の相同性アームをノックイン配列の両端に有する、（１７）～（２０）のいずれかに記載の方法。
（２２）細胞との接触の際にＣａｓ９とｇＲＮＡとがリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成している、（１）～（２１）のいずれかに記載の方法。
（２３）顆粒状角膜変性症に関連する、ＴＧＦＢＩ遺伝子の変異部位を含む標的配列とハイブリダイズする、ガイドＲＮＡ分子。
（２４）ＴＧＦＢＩ遺伝子の変異が点変異である、（２３）に記載のガイドＲＮＡ分子。
（２５）顆粒状角膜変性症がＧＣＤ２である、（２３）又は（２４）に記載のガイドＲＮＡ分子。
（２６）点変異がＴＧＦＢＩタンパク質の１２４位におけるアミノ酸置換である、（２３）～（２５）のいずれかに記載のガイドＲＮＡ分子。
（２７）アミノ酸置換がＲ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｃ及びＲ１２４Ｌからなる群から選択される、（２６）に記載のガイドＲＮＡ分子。
（２８）ＴＧＦＢＩ遺伝子のＰＡＭ配列の上流側に隣接した２２塩基の配列から成る標的配列とハイブリダイズすることができるガイド配列を含む、（２３）～（２８）のいずれかに記載のガイドＲＮＡ分子。
（２９）ＰＡＭ配列がＣＧＧから成る、（２８）に記載のガイドＲＮＡ分子。
（３０）ガイド配列が、標的配列と相補的な、少なくとも１７～１８塩基から成る領域を含む、（２８）又は（２９）に記載のガイドＲＮＡ分子。
（３１）ガイド配列が、アデニン又はグアニンから始まる２２塩基の配列から成る、（２８）～（３０）のいずれかに記載のガイドＲＮＡ分子。
（３２）ガイド配列が配列番号１の塩基配列を有する、（２８）～（３１）のいずれかに記載のガイドＲＮＡ分子。
（３３）ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ＲＮＡ配列と結合している、（２８）～（３２）のいずれかに記載のガイドＲＮＡ分子。
（３４）（２３）～（３３）のいずれかに記載のガイドＲＮＡ分子をコードする、核酸。
（３５）（２３）～（３３）のいずれかに記載のガイドＲＮＡ分子を発現する、ベクター。
（３６）ガイドＲＮＡの発現がＵ６プロモーターによって駆動される、（３５）に記載のベクター。
（３７）ガイドＲＮＡとＵ６プロモーターが同一又は異なるベクター上に位置する、（３６）に記載のベクター。
（３８）ガイドＲＮＡとＵ６プロモーターが同一のベクター上で作用可能に連結している、（３６）に記載のベクター。
（３９）（３５）～（３８）のいずれかに記載のベクターと、ＨＤＲの鋳型ドナーとしてのｓｓＯＤＮ分子とを含む、キット。
（４０）ｓｓＯＤＮが、点変異を野生型のアミノ酸に相当する塩基に置き換えるノックイン配列を有する、（３９）に記載のキット。
（４１）野生型のアミノ酸に相当する塩基がＣＧＴ又はＣＧＣである、（４０）に記載のキット。
（４２）ノックイン配列が制限酵素部位を有する、（４０）又は（４１）に記載のキット。
（４３）野生型のアミノ酸に相当する塩基がＣＧＴであり、制限酵素部位がＢｓｉＷＩ部位である、（４２）に記載のキット。
（４４）ｓｓＯＤＮが更に、切断部位の両端に相同的な５０塩基の相同性アームをノックイン配列の両端に有する、（３９）～（４３）のいずれかに記載のキット。
（４５）ｓｓＯＤＮ分子が配列番号２の塩基配列を有する、（３９）～（４４）のいずれかに記載のキット。
（４６）（２３）～（３３）のいずれかに記載のガイドＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９タンパク質とを含む、キット。
（４７）ガイドＲＮＡ分子とＣａｓ９タンパク質とがリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成している、（４６）に記載のキット。
（４８）以下のいずれか１つ以上：
（２３）～（３３）のいずれかに記載のガイドＲＮＡ分子；
（３４）に記載のガイドＲＮＡ分子をコードする、核酸；あるいは
配列番号２の塩基配列を有する、ＨＤＲの鋳型ドナーとしてのｓｓＯＤＮ分子、
を含む医薬組成物。

【発明の効果】

【0018】

本発明者らは特に、変異したＴＧＦＢＩ遺伝子の１２４番目アミノ酸に対応する遺伝子配列を切断する為に、その切断部位の４ｂｐ下流に存在するＣＧＧの配列をＰＡＭ配列として利用し、変異配列特異的な核酸配列を有する２２ｎｔのｇＲＮＡを開発した。また通常、ＳｐＣａｓ９に用いられるｇＲＮＡは２０ｎｔの長さで設計されるが、１２４番目アミノ酸に対応する遺伝子配列を切断する場合、ＰＡＭ配列の制約からｇＲＮＡの転写開始点の配列がＴとなり、ｇＲＮＡの発現量と切断効率の低下を引き起こす問題が存在する。さらにはこの従来の２０ｎｔの長さで設計したｇＲＮＡに対しては、３ｎｔミスマッチのオフターゲットとなる標的配列が多く存在することから、非特異的な配列を切断する問題も考えられる。このことから、従来技術において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて当該遺伝子配列を高効率、高い特異性で切断することは不可能であった。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】図１は角膜変性症におけるＴＧＦＢＩ遺伝子の変異例を野生型との比較で示す（Wild type/Wild type：野生型のアミノ酸配列を配列番号３、塩基配列を配列番号４とする；Wild type/R124H：ヘテロ変異型のアミノ酸配列を配列番号５、塩基配列を配列番号６とする）。同図では、ＴＧＦＢＩ遺伝子の１２４番目アミノ酸に対応する遺伝子が変異している。

【図2】図２は、ｈＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ ｇＲＮＡと、ＢｓｉＷＩ部位（Ｃ／ＧＴＡＣＧ）が導入されたｈＴＧＦＢＩ Ｒ１２４Ｈ修復ｓｓＯＤＮの各配列とその近傍の配列を示す。

【図3】図３は、変異ＴＧＦＢＩ遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲティングプラスミドベクターの構造を模式した図を示す。

【図4】図４は、ＢｓｉＷＩを用いたＰＣＲ－ＲＦＬＰによるノックインの確認結果を示す。

【図5】図５は、ノックイン後の配列の遺伝子解析結果を示す。

【図6】図６は、ノックインにより、６３クローン中１３クローン（２０．６％）で片アレルの編集が認められ、２６クローン（４１．３％）で両アレルの編集が確認された結果を示す。

【図7】図７ａは、オフターゲットの候補となるゲノム配列の解析結果を示す。図７ｂはオフターゲット候補となるゲノム配列を示す。図７ｃはオフターゲット配列に対して、ＰＣＲ法にてゲノム配列を増幅し、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ法を用いて解析した結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

（顆粒状角膜変性症の治療方法）
一態様において、本発明は、ゲノム編集の機構を通じて、ＴＧＦＢＩ遺伝子の変異を修復することにより顆粒状角膜変性症を治療する方法を提供する。本発明においては、顆粒状角膜変性症に関与する、あらゆるＴＧＦＢＩ遺伝子の変異、例えば点変異を修復することが意図される。

【0021】

顆粒状角膜変性症の一つである顆粒状角膜ジストロフィー２型（ＧＣＤ２）においては、ＴＧＦＢＩタンパク質の１２４番目に位置するアルギニンが、ヒスチジンなどの他のアミノ酸に置換されている。このようなＲ１２４Ｈの点変異以外にも、ＧＣＤ２の原因となる点変異にはＲ１２４ＣやＲ１２４Ｌなどが知られている。

【0022】

理論的には、ゲノム編集ツールを用いて、ＴＧＦＢＩ遺伝子における点変異に対応する塩基配列の変異を正常な塩基配列に置き換えることにより、顆粒状角膜変性症を治療することができる。しかしながら、高効率、高い特異性、且つ再現性の良いゲノム編集技術を実現し、延いては、顆粒状角膜変性症を確実に治療するには、ゲノム編集ツールの高効率での細胞内導入と、ゲノム編集ツールの精緻な設計が必要となる。

【0023】

ゲノム編集ツールの中でも、特にＲＮＡ誘導型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９について、一般的に用いられている化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであるＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を利用した場合を例に説明する。このようなＲＮＡ誘導型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれる２０塩基の標的配列の認識に必要な配列を持った約１２０塩基ほどのＲＮＡとＳｐＣａｓ９タンパク質の複合体を用いてｇＲＮＡと相補的に結合した任意のＤＮＡ配列が二本鎖切断される。

【0024】

本発明においては、顆粒状角膜変性症に関与するＴＧＦＢＩ遺伝子における標的配列を切断するために、顆粒状角膜変性症に罹患した対象から得られた角膜実質細胞と、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡとが接触される。Ｃａｓタンパク質とｇＲＮＡは別々に添加してもよいが、オフターゲット効果を抑制するため、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の状態で使用するのが好ましい。

【0025】

本発明で使用されるＣａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲシステムに属するものであれば限定されないが、Ｃａｓ９が好ましい。Ｃａｓ９としては、例えば化膿性連鎖球菌由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）等が挙げられる。中でも標的部位の切断にはＰＡＭ配列の制限があるため、一般的にゲノム編集に用いられるＳｐＣａｓ９が好ましい。細胞内へのＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡの送達は、それらをコードするベクターを介して、当業者に公知の方法、例えば標準的なトランスフェクション法、エレクトロポレーション、レンチウイルスのトランスダクションなどを使用することができる。Ｃａｓを発現するためのベクター及びｇＲＮＡを発現するためのベクターは、同一のベクターであっても、互いに異なるベクターであってもよい。また、リコンビナントＣａｓ９タンパク質、ｇＲＮＡの複合体（ＲＮＰ、リボ核タンパク質）を形成させ、当業者に公知の方法、すなわちトランスフェクション法、エレクトロポレーションなどにて直接、ＲＮＰを細胞内に送達することもできる。

【0026】

角膜実質細胞は、角膜の透明性を保つのに重要な角膜実質層内に存在する扁平な細胞である。それぞれの細胞は突起を有し、隣接する角膜実質細胞とその突起を介して接触し、網目状の構造を呈している。顆粒状角膜変性症の角膜実質細胞においては、変異ＴＧＦＢＩタンパク質が蓄積することで、透明性が障害される。角膜実質細胞は、深層層状角膜移植などの外科処置の際に、角膜上皮を除去後、間質から採取し、コラゲナーゼ処理を施すことで得られる。

【0027】

被験者の角膜実質細胞への遺伝子導入は、当業者に公知の方法、例えば標準的なトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、アデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターを用いた方法を利用する。角膜はNaked DNA delivery法によって、特殊な導入試薬を用いることなくＤＮＡを細胞内導入できることができる組織であり、ＤＮＡの直接注入による細胞内伝達も可能である（Brain Res Bull. 2010 Feb 15; 81(2-3): 256-261）。また、リコンビナントＣａｓ９タンパク質とｇＲＮＡの複合体を形成させたのちに、当業者に公知の方法、すなわちトランスフェクション法、エレクトロポレーション法を用いることで細胞内に送達する。

【0028】

対象は、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類に限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の偶蹄類、ウマ等の奇蹄類、イヌ、ネコ等のペットが意図される。しかしながら、対象はヒト角膜変性症患者であることが好ましい。

【0029】

ＤＮＡ切断酵素であるＣａｓ９は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能し、標的ＤＮＡが存在する部位でＤＮＡを切断することができる。ｇＲＮＡは、その５’末端に標的ＤＮＡに相補的な配列を有し、該相補的な配列を介して標的ＤＮＡに結合することにより、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに導く機能を有する。なお、Ｃａｓ９タンパク質とｇＲＮＡは、室温条件下、１０分程度で複合体を形成し、即座に標的ＤＮＡの切断能を発揮する。

【0030】

高効率で標的配列の二本鎖切断を行うためには、ｇＲＮＡの設計が重要になる。例えば、ＰＡＭ配列（スペーサー前隣接モチーフ）と呼ばれるＮＧＧの３塩基が２０塩基の標的配列の直後に存在する必要がある。またＳｐＣａｓ９による二本鎖切断は、このＰＡＭ配列の３－４塩基の上流で起こることから、切断したい部位が決まっている場合、その下流にＰＡＭ配列がなければ、ＳｐＣａｓ９を用いた当該部位の二本鎖切断は不可能となる。切断すべき箇所がＴＧＦＢＩ遺伝子の１２４番目アミノ酸に対応する遺伝子配列である場合、その遺伝子配列の４塩基下流に存在するＣＧＧの配列をＰＡＭ配列として利用することができる。

【0031】

ｇＲＮＡを設計するにあたり、当業者は、塩基配列におけるＧＣ含有量を４０－８０％の範囲から適宜選択することができる。切断効率を向上させる観点からは、ＧＣ含有率が高い方が好ましく、例えば５０％以上であることが好ましい。

【0032】

ｇＲＮＡは更に、オフターゲット効果による非特異的な切断を極力減らすよう設計される。例えば、塩基長は通常採用される２０塩基としてもよいが、オフターゲット候補が多数見つかることがある。この場合、塩基長を２２に増大することで、オフターゲットとなる配列を大幅に低減させ、３塩基ミスマッチまでのオフターゲット配列がヒトゲノム上に存在しないという、高い特異性を持ったｇＲＮＡを提供することができる。

【0033】

十分量のｇＲＮＡを発現させるためには、その駆動に適切なプロモーターを選択する必要がある。このようなプロモーターとして、通常、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存型のＵ６プロモーター又はＴ７プロモーターなどが使用されるが、使用するプロモーターに応じてｇＲＮＡを設計する必要もある。例えば、Ｕ６プロモーターを使用する場合、転写開始点はプリン塩基（Ｇ又はＡ）でないと十分な発現レベルでｇＲＮＡが発現されないことから、Ｕ６プロモーターの存在下でｇＲＮＡを発現させる場合、ｇＲＮＡはアデニン又はグアニンから始まる塩基配列とするのが好ましい。

【0034】

ｇＲＮＡは通常、適切なプロモーターとともに、１又は複数のプラスミドベクターに配置された状態で細胞内に導入され得る。この場合、ガイドＲＮＡとプロモーターは同一のベクター上で作用可能に連結していてもよいし、あるいは異なるベクター上に存在していてもよい。

【0035】

ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズできるよう、標的配列と相補的な、少なくとも１７～１８塩基から成る領域を含むように設計される。本明細書において、標的配列とはＴＧＦＢＩ遺伝子の変異部位を含む領域、例えば、ＰＡＭ配列の上流側に隣接した２２塩基の配列を意味する。

【0036】

より好ましい態様において、ｇＲＮＡは、配列番号１の塩基配列：
5′- acucagcuguacacggaccaca -3′を有するように設計される。このようなｇＲＮＡは化学的に合成することができる。

【0037】

Ｃａｓタンパク質をリクルートするために、ｇＲＮＡを更にｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒ ＲＮＡ）配列と結合してもよい。

【0038】

変異部位を含む標的配列の二本鎖を切断した後、切断箇所に正常配列を含むドナーＤＮＡをノックインすることで変異部位を修復することができる。ドナーＤＮＡはＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡと同時に細胞内に導入することができる。二本鎖切断（ＤＳＢ）形成時にドナーが存在することで、相同性配向型修復（ＨＤＲ）が可能になる。

【0039】

様々なノックインの方法が存在するが、修正精度の高い相同組換え（ＨＲ）を介したノックインが好ましい。正常配列をコードするドナーＤＮＡ存在下で相同組換えを行うことにより、変異部位を含む染色体上の遺伝的情報がドナー由来の新規情報へと置換される。ドナーＤＮＡは、ｓｓＯＤＮ、ｄｓＤＮＡ又はプラスミドのいずれでもよいが、Ｒ１２４Ｈのような一塩基多型を置換する場合、正常配列を含むｓｓＯＤＮを利用して変異箇所を修復するのが好ましい。

【0040】

点変異を修復するためのドナーＤＮＡは、１）点変異を野生型のアミノ酸に相当する塩基に置き換えるノックイン配列と、２）置き換えられるべき配列の両端に隣接する配列と同一の「左腕」と「右腕」の相同性アームを有する。相同性アームの塩基長は５０塩基程度が好ましいが、４０前後又は６０前後の長さの塩基長を排除することを意図しておらず、当業者は相同性アームの長さを適宜変更することができる。

【0041】

任意に、ドナーＤＮＡは更に制限酵素部位を有する。ドナーＤＮＡ中に制限酵素部位を設けることで、遺伝子改変効率の確認を簡便化することができる。ＴＧＦＢＩタンパク質の１２４番目に位置する点変異を修復する場合を例に説明すると、野生型のアミノ酸に相当する塩基はＣＧＣであるが、例えば、ＣＧＣの代わりにＣＧＴをノックイン配列に含めることで、制限酵素部位としてのＢｓｉＷＩ部位（Ｃ／ＧＴＡＣＧ）の導入が可能になる。

【0042】

制限酵素部位以外の必要な配列、例えばレポーター遺伝子や薬剤耐性遺伝子をドナーＤＮＡ中に挿入してもよい。例えば、正常配列のＣ末端にレポーター遺伝子をインフレームで連結させると、正常配列の検出が容易になる。レポーター遺伝子としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子や、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。

【0043】

配列番号２で表されるｓｓＯＤＮは、制限酵素部位としてのＢｓｉＷＩ部と各アームが５０塩基の相同性アームを有しており、相同性組換え修復ＨＤＲ鋳型ドナーとして再切断による影響を防ぎ、且つＴＧＦＢＩ遺伝子の正常化と遺伝子修復の容易な確認を実現することができる。

【0044】

（ガイドＲＮＡ及びその用途）
一態様において、本発明は更に、ＴＧＦＢＩ遺伝子の変異部位を含む標的配列とハイブリダイズする、ガイドＲＮＡ分子及び／又はそれをコードする核酸、あるいはそれらの用途を提供する。ガイドＲＮＡ分子が有するガイド配列等の詳細は上述したとおりである。

【0045】

別の態様において、本発明はガイドＲＮＡ分子をコードする核酸等を含むベクターを提供する。本発明によって提供されるベクターは、環状のベクターであってもよく、直鎖状のベクターであってもよい。好ましくは、本発明によって提供されるベクターは環状ベクターである。本発明のベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。人工染色体ベクターとしては、酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣ）、細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）、Ｐ１人工染色体ベクター（ＰＡＣ）、マウス人工染色体ベクター（ＭＡＣ）、ヒト人工染色体ベクター（ＨＡＣ）が挙げられる。

【0046】

ガイドＲＮＡをコードするベクターと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを発現するためのベクターは、同一のベクターであっても互いに異なるベクターであってもよい。また、これらのベクターとｓｓＯＤＮ等のドナーＤＮＡをコードするベクターも、同一でも異なっていてもよい。

【0047】

一態様において、本発明は、上記ガイドＲＮＡ分子若しくはそれをコードする核酸、及び／又は鋳型ドナー分子（例えばｓｓＯＤＮ）若しくはそれをコードする核酸、をコードする１又は複数のベクターを含むキットを提供する。本発明のキットは顆粒状角膜変性症を治療するために好適に使用することができる。また、変異ＴＧＦＢＩ遺伝子に対してゲノム編集を行った後に、当該配列を含む領域をＰＣＲなどで増幅し、ＨＤＲにて遺伝子導入したＢｓｉＷＩ制限酵素切断配列を利用してＢｓｉＷＩによる消化を行うことで、修復したＴＧＦＢＩ遺伝子の検出による診断技術にも利用が可能である。

【0048】

別の態様において、本発明は、上記ガイドＲＮＡ分子若しくはそれをコードする核酸、及び／又は鋳型ドナー分子（例えばｓｓＯＤＮ）若しくはそれをコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は顆粒状角膜変性症を治療するために好適に使用することができる。

【0049】

以下に実施例、比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0050】

上述したようなｇＲＮＡの設計上の留意点を考慮し、本件特許発明のｇＲＮＡを設計した（配列番号１）。例えば、塩基長を通常採用される２０塩基とすると、オフターゲット候補が多数見つかったため、塩基長を２２に増大してオフターゲットとなる配列を大幅に低減させた。配列番号１のｇＲＮＡはＧＣ含有率が５０％以上となっており、ｓｐＣａｓ９と複合体を形成し、標的配列を切断する上で理想的な値となっている。

【0051】

また、ＨＤＲ鋳型ドナーとして、切断領域に対して相同的な５０ｂｐの相同性アームを両端に持ったｓｓＯＤＮ（5′-GAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACCGTACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCT-3′（配列番号２））を設計した。また本ＨＤＲ鋳型ドナーは、ＴＧＦＢＩ遺伝子変異部位に導入する塩基配列を野生型ＴＧＦＢＩのアルギニン（ＣＧＣ）とは異なるコドン（ＣＧＴ）を導入できるように設計してあり、遺伝子配列の正常化、遺伝子改変効率の確認の簡便化（ＢｓｉＷＩ制限酵素サイトの導入）、遺伝子配列正常化後の再切断の防止を可能とした（図２）。

【0052】

変異ＴＧＦＢＩ遺伝子特異的ｇＲＮＡの配列（配列番号１）を、ｇＲＮＡとＳｐＣａｓ９－２Ａ－ＧＦＰ遺伝子の同時発現を可能とするｐＸ４５８ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社製：カタログ番号４８１３８）に導入し、変異ＴＧＦＢＩ遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲティングプラスミドベクターを作成した（図３）。プラスミドのＤＮＡ塩基配列を配列番号７とし、下記のガイドＲＮＡのＲＮＡ塩基配列を配列番号とする。
pX458-hTGFBI(R124H)gRNA, RNA塩基配列（全長）：
5-ACUCAGCUGUACACGGACCACAguuuuagagcuaGAAAuagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu-3′

【0053】

続いて、上記プラスミドベクターをヒト角膜変性症患者由来角膜実質細胞に対して、ｓｓＯＤＮ ＨＤＲ鋳型ドナー（配列番号２）とともに共遺伝子導入を行い、１週間後遺伝子導入細胞をＧＦＰ遺伝子の発現を指標に細胞分離した。得られた細胞を培養して増幅後、ゲノム編集効率の確認をＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、制限酵素断片長多型）法および遺伝子配列の解析を行うことで確認した。

【0054】

その結果、変異ＴＧＦＢＩ遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲティングプラスミドベクター及びＨＤＲ鋳型ｓｓＯＤＮを導入することによって、ヒト角膜変性症患者由来角膜実質細胞におけるＴＧＦＢＩ遺伝子の変異を正常な配列に修復することに成功した（図４、５）。

【0055】

ＴＧＦＢＩ遺伝子Ｒ１２４Ｈ変異部位に対応する遺伝子配列をＰＣＲにて増幅し、ＲＦＬＰ法、遺伝子配列解析を行うことで、ゲノム編集効率の確認を行った。ＴＧＦＢＩ変異部位のＰＣＲによる遺伝子配列解析に用いたＰＣＲプライマー配列を以下に示す。
フォワード： 5′-GTTGAGTTCACGTAGACAGGC-3′（配列番号９）
リバース： 5′-GACTCCCATTCATCATGCCCA-3’（配列番号１０）

【0056】

その結果、コントロールのＴＧＦＢＩ野生型角膜実質細胞では４６１ｂｐのバンドが検出されたのに対して、ゲノム編集を行ったヒト角膜変性症患者由来角膜実質細胞では、ゲノム編集によりＢｓｉＷＩ制限酵素サイトが導入され、ＢｓｉＷＩにて消化することにより、２８８ｂｐと１７３ｂｐのバンドに切断された。遺伝子導入細胞全８９クローンに対して、本解析を行ったところ、６３クローン中１３クローン（２０．６％）で片アレルの編集が認められ、２６クローン（４１．３％）で両アレルの編集が確認された。この結果から、本発明を利用することにより、合計６１．９％という極めて高いゲノム編集効率で、ヒト角膜変性症患者由来角膜実質細胞におけるＴＧＦＢＩ遺伝子の変異を正常に修復できることが分かる（図６）。

【0057】

さらには本発明により、従来技術で設計したｇＲＮＡよりもオフターゲットとなる配列候補の数を減少させることができた。一般にｇＲＮＡはその標的配列に対して３塩基異なる配列に対しては切断活性を持たなくなることが報告されているが（Nature Biotechnology 31, 822-826 (2013)）、設計したｇＲＮＡに対してオフターゲット配列の解析を行った結果、設計したｇＲＮＡに対する１～３塩基ミスマッチの配列は存在しないことが明らかとなった（図７ａ）。一方、３箇所の染色体領域内に（染色体２０番24871179-24871203、２番98321072-98321097、８番1150445-1150469）に４、５塩基ミスマッチの配列が確認された（図７ａ、ｂ）。当該配列を含むゲノム領域をＰＣＲにて増幅し、一般的なＴ７エンドヌクレアーゼＩ法にて解析を行った。
Ｏｆｆ ｔａｒｇｅｔ解析に用いたＰＣＲプライマー一式を以下に示す。
ＯＴＳ１
5′-ATGTCAGAAGTCCCGCTGTG-3′（配列番号１１）
5′-TGATGGGGTCAGAGGGCATA-3′（配列番号１２）

【0058】

ＯＴＳ２
5′-CTTCCTGCTCTGTGTTTAGCCA-3′（配列番号１３）
5′-ACCTCCAAGTTGAGCAGTGTC-3′（配列番号１４）

【0059】

ＯＴＳ３
5′-GCAGCAAAGCACTCAAGAGG-3′（配列番号１５）
5′-CAAACTTCTGCCTGGGCATC-3′（配列番号１６）

【0060】

Ｔ７エンドヌクレアーゼＩはオフターゲット切断に由来のＰＣＲ増副産物と野生型産物との二本鎖のミスマッチを認識し、ヘテロ二本鎖のミスマッチ部分を切断する。その結果、全てのＰＣＲ産物において、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩによる切断は検出されなかった。すなわち、どの配列に対してもオフターゲット効果による非特異的な切断は認められなかった（図７ｃ）

【0061】

上記結果からこのことから本発明に係る変異ＴＧＦＢＩ遺伝子特異的ｇＲＮＡは、実際にオフターゲット効果による切断を低減できることが示唆された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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