特許7171079遺伝子組換えイネ、並びに当該遺伝子組換えイネに由来するコメ、食品組成物、繁殖材料、種子および細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-07
(45)【発行日】2022-11-15
(54)【発明の名称】遺伝子組換えイネ、並びに当該遺伝子組換えイネに由来するコメ、食品組成物、繁殖材料、種子および細胞
(51)【国際特許分類】
A01H 5/00 20180101AFI20221108BHJP
A01H 5/10 20180101ALI20221108BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20221108BHJP
A23L 33/185 20160101ALI20221108BHJP
C12N 15/29 20060101ALN20221108BHJP
A01H 6/46 20180101ALN20221108BHJP
【ＦＩ】
A01H5/00 A
A01H5/10
C12N5/10
A23L33/185
C12N15/29 ZNA
A01H6/46
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020206236
(22)【出願日】2020-12-11
(65)【公開番号】P2022093127
(43)【公開日】2022-06-23
【審査請求日】2022-08-01
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】若佐 雄也
(72)【発明者】
【氏名】小沢 憲二郎
(72)【発明者】
【氏名】高野 誠
(72)【発明者】
【氏名】川勝 泰二
(72)【発明者】
【氏名】林 晋平
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】特開２００９－２５４２３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】FEBS Leetters，2006年，580，3315-3320
【文献】Plant Biotechnology Journal，2011年，9，729-735
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ０１Ｈ ５／００
Ａ０１Ｈ ５／１０
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ａ２３Ｌ ３３／１８５
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５－９０
Ａ０１Ｈ ６／４６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、遺伝子組換えイネ：（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、且つ野生型のノボキニンペプチドと同じかまたはそれ以上の血圧降下活性を有するポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項2】
前記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、配列番号２で示す塩基配列における１６２５番目の塩基または上記（ｂ２）における対応する塩基から配列番号３で示す塩基配列における１００番目の塩基または上記（ｃ２）における対応する塩基までの領域内に挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子組換えイネ。
【請求項3】
配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、この順に連続してゲノム中に有していることを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子組換えイネ。
【請求項4】
請求項１から３のいずれか１項に記載の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンであり、
前記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、遺伝子組換えイネ。
【請求項5】
請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えイネから収穫されたコメであり、
前記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、コメ。
【請求項6】
請求項５に記載のコメを含む食品組成物。
【請求項7】
請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えイネの繁殖材料であり、
前記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、繁殖材料。
【請求項8】
請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えイネの種子であり、
前記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、種子。
【請求項9】
請求項１から４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えイネに由来する細胞であり、
前記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されていることを特徴とする、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドをゲノム中に有している遺伝子組換えイネ、並びに当該遺伝子組換えイネに由来するコメ、食品組成物、繁殖材料、種子および細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
食生活や生活スタイルの欧米化から、高血圧、高脂血症、糖尿病といった生活習慣病の患者数が増加している。そこで、日本人の主食であるコメに生活習慣病の予防機能または緩和機能を付与することで、毎日の食事を通しての健康維持および健康増進を図ることを可能にし、また疾病予防に役立てようとする試みがある。
【0003】
例えば、ノボキニンペプチドは、卵白アルブミン由来のオボキニンＩＩＩを高機能化した、６アミノ酸からなるペプチドであり、動脈弛緩作用を介して高血圧時特異的に血圧降下能を有する（特許文献１、非特許文献１）。ノボキニンペプチドを可食部に発現する遺伝子組換えイネから収穫したコメを摂取したモデル動物において、血圧降下作用を示すことが報告されている（非特許文献２および３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特開２００２－８０４９６号公報
【非特許文献】
【0005】
【文献】Lijun Yang et. Al., "A transgenic rice seed accumulating an anti-hypertensive peptide reduces the blood pressure of spontaneously hypertensive rats", FEBS Letters, vol.580, no.13, p.3315-3320, 2006
【文献】Kunihiko Onishi et. al., "Optimal designing of β-conglycinin to genetically incorporate RPLKPW, a potent anti-hypertensive peptide", Peptides, vol.25, p.37-43, 2004
【文献】Yuhya Wakasa et al., "Antihypertensive activity of transgenic rice seed containing an 18-repeat novokinin peptide localized in the nucleolus of endosperm cells", Plant Biotechnology Journal, vol.9, p.729-735, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、これまでに開発されたノボキニンペプチド発現イネは、実験目的で使用するには優れているが、食品としての実用化には至っていない。
【0007】
本発明の一態様は、食品として実用化可能なノボキニンペプチド発現イネを実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る遺伝子組換えイネは、下記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されている構成である：
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、且つ野生型のノボキニンペプチドと同じかまたはそれ以上の血圧降下活性を有するポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、且つ野生型のノボキニンペプチドと同じかまたはそれ以上の血圧降下活性を有するポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【0009】
本発明の一態様によれば、「食品」として実用化可能なノボキニンペプチド発現イネを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本態様の遺伝子組換えイネに導入されたＴ－ＤＮＡの構成を模式的に示す図である。
【図2】ＧｌｕＡ２タンパク質およびｎｆＧｌｕＡ２タンパク質のアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。
【図3】実施例において遺伝子組換えイネの作出に使用したプラスミドベクターｐＣＳＰ２ｍＡＬＳ ＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２のマップを示す図である。
【図4】実施例で作出した遺伝子組換えイネ４系統における、ＡＬＳ領域をプローブとしたサザンブロット解析の結果を示す図である。
【図5】実施例で作出した遺伝子組換えイネ４系統の種子における、イムノブロット解析の結果を示す図である。
【図6】実施例で作出した遺伝子組換えイネ２系統の各組織における、抗ノボキニン抗体によるイムノブロット解析の結果を示す図である。
【図7】実施例で作出した遺伝子組換えイネ４系統の種子における、抗ノボキニン抗体によるドットブロット解析の結果を示す図である。
【図8】実施例で作出したＯｓＮＶ３の作出系統図である。
【図9】実施例で作出したＯｓＮＶ３を検出するためのプライマーセットの検討結果を示す図である。
【図10】実施例で作出したＯｓＮＶ３におけるｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲによって確認した結果を示す図である。
【図11】実施例で作出したＯｓＮＶ３における２ｍＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲによって確認した結果を示す図である。
【図12】実施例で作出したＯｓＮＶ３における内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲによって確認した結果を示す図である。
【図13】実施例で作出したＯｓＮＶ３の種子におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の細胞内局在を示す図である。
【図14】実施例で作出したＯｓＮＶ３の種子における、抗ノボキニン抗体によるイムノブロット解析の結果を示す図である。
【図15】ＯｓＮＶ３の３世代（Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５）の穀粒における、ＡＬＳ領域をプローブとしたサザンブロット解析の結果を示す図である。
【図16】ＯｓＮＶ３の２世代（Ｔ５、Ｔ６）および戻し交配系統の穀粒における、ＡＬＳ領域をプローブとしたサザンブロット解析の結果を示す図である。
【図17】ＯｓＮＶ３の３世代（Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５）の穀粒における、イネ種子主要アレルゲンに対する抗体によるイムノブロット解析の結果を示す図である。
【図18】ＯｓＮＶ３の２世代（Ｔ５、Ｔ６）および戻し交配系統の穀粒における、抗ノボキニン抗体によるイムノブロット解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
〔遺伝子組換えイネ〕
本態様の遺伝子組換えイネは、下記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されている：
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、且つ野生型のノボキニンペプチドと同じかまたはそれ以上の血圧降下活性を有するポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
本態様の遺伝子組換えイネは、下記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されている：
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、且つ野生型のノボキニンペプチドと同じかまたはそれ以上の血圧降下活性を有するポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【0012】
（配列番号１に示す塩基配列）
配列番号１に示す塩基配列は、本態様の遺伝子組換えイネのゲノム中に導入されたＴ－ＤＮＡの全塩基配列を示している。ここで、本態様の遺伝子組換えイネに導入されたＴ－ＤＮＡの構成を図１に基づき説明する。図１に示すように、Ｔ－ＤＮＡ領域内には、２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットおよびＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセットがこの順で連結されている。
配列番号１に示す塩基配列は、本態様の遺伝子組換えイネのゲノム中に導入されたＴ－ＤＮＡの全塩基配列を示している。ここで、本態様の遺伝子組換えイネに導入されたＴ－ＤＮＡの構成を図１に基づき説明する。図１に示すように、Ｔ－ＤＮＡ領域内には、２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットおよびＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセットがこの順で連結されている。
【0013】
（２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセット）
２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットは、Ｔ－ＤＮＡが導入された細胞を選抜する選抜マーカー遺伝子（２ｍＡＬＳ遺伝子）を発現させるための発現カセットである。２ｍＡＬＳ遺伝子は、２点変異型アセト乳酸合成酵素（２ｍＡＬＳ）をコードしている。２ｍＡＬＳは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来の野生型のアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）（６４４アミノ酸残基）の第９５番目のグリシンをアラニンに、第６２７番目のセリンをイソロイシンに変換したものである。この遺伝子が導入された細胞は、スルホニルウレア系除草剤であるビスピリバックナトリウム塩存在下であってもアセト乳酸合成酵素活性が阻害されず、その結果、イネカルスはＡＬＳ阻害剤耐性を獲得する。
２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットは、Ｔ－ＤＮＡが導入された細胞を選抜する選抜マーカー遺伝子（２ｍＡＬＳ遺伝子）を発現させるための発現カセットである。２ｍＡＬＳ遺伝子は、２点変異型アセト乳酸合成酵素（２ｍＡＬＳ）をコードしている。２ｍＡＬＳは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来の野生型のアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）（６４４アミノ酸残基）の第９５番目のグリシンをアラニンに、第６２７番目のセリンをイソロイシンに変換したものである。この遺伝子が導入された細胞は、スルホニルウレア系除草剤であるビスピリバックナトリウム塩存在下であってもアセト乳酸合成酵素活性が阻害されず、その結果、イネカルスはＡＬＳ阻害剤耐性を獲得する。
【0014】
２ｍＡＬＳ遺伝子は、カルス選抜プロモーター（ＣＳＰ）の下流に連結されている。ＣＳＰは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来の機能未知遺伝子（Ｏｓ１０ｇ０２０７５００）のプロモーターである。ＣＳＰの制御下で２ｍＡＬＳ遺伝子を発現させることで、２ｍＡＬＳ遺伝子をカルスおよび胚に発現させることができる。
【0015】
２ｍＡＬＳ遺伝子の下流には１０ｋＤａプロラミンターミネーター（１０ｋＤａｔｅｒ）が連結されている。１０ｋＤａｔｅｒは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来１０ｋＤａプロラミン遺伝子のターミネーターであり、２ｍＡＬＳ遺伝子の転写終結を規定する。
【0016】
２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットは、全てイネゲノム由来のＤＮＡ配列からなる。
【0017】
（ＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセット）
ＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセットは、本態様の遺伝子組換えイネの種子（コメ）においてノボキニンを発現させるための発現カセットである。
ＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセットは、本態様の遺伝子組換えイネの種子（コメ）においてノボキニンを発現させるための発現カセットである。
【0018】
表１に示すように、ノボキニンは、ニワトリ（Ｇ．ｇａｌｌｕｓ）卵白アルブミンのトリプシン消化によって派生するペプチドであるオボキニンＩＩＩのアミノ酸を４残基置換して得られた改変ペプチド配列である。
【0019】
【表1】
【0020】
次に、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質を図２に基づき説明する。ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質（配列番号１０）は、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）の種子貯蔵タンパク質グルテリンの一種であるＧｌｕＡ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）の第２１１番目～第２２４番目および第２７２番目～第２８４番目のアミノ酸を、２連結したノボキニン（ＲＲＰＬＫＰＷＱＲＲＰＬＫＰＷ：配列番号８）に置換した新規タンパク質である。ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子は、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質をコードしている。ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子は、３’非翻訳領域を有している。３’非翻訳領域は、翻訳の安定化やＧｌｕＡ２タンパク質の細胞内局在に関与する。
【0021】
ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子は、ＧｌｕＢ１プロモーター（ＧｌｕＢ１ｐｒｏ）の下流に連結されている。ＧｌｕＢ１ｐｒｏは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来グルテリンＢ１（ＧｌｕＢ１）遺伝子のプロモーターである。ＧｌｕＢ１ｐｒｏの制御下でｎｆＧｌｕＡ２遺伝子を発現させることで、ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子を胚乳特異的に発現させることができる。
【0022】
ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の下流にはＧｌｕＢ１ターミネーター（ＧｌｕＢ１ｔｅｒ）が連結されている。ＧｌｕＢ１ｔｅｒは、イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）由来グルテリンＢ１（ＧｌｕＢ１）遺伝子のターミネーターであり、ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の転写終結を規定する。
【0023】
ＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセットは、全てイネゲノム由来のＤＮＡ配列からなる。
【0024】
（ゲノム領域Ａ）
ゲノム領域Ａは、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域を指す。配列番号２に示す塩基配列は、コシヒカリ変異系統ａ１２３（以下、「ａ１２３」）の第４染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に相当する。また、配列番号３に示す塩基配列は、ａ１２３の第４染色体に存在する配列番号２の下流側のポリヌクレオチドの塩基配列に相当する。
ゲノム領域Ａは、前記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域を指す。配列番号２に示す塩基配列は、コシヒカリ変異系統ａ１２３（以下、「ａ１２３」）の第４染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に相当する。また、配列番号３に示す塩基配列は、ａ１２３の第４染色体に存在する配列番号２の下流側のポリヌクレオチドの塩基配列に相当する。
【0025】
本発明の好ましい態様において、ゲノム領域Ａはａ１２３の第４染色体上の領域である。また、本発明の好ましい形態において、配列番号２に示す塩基配列および配列番号３に示す塩基配列はａ１２３の第４染色体に存在するポリヌクレオチドである。
【0026】
（Ｔ－ＤＮＡ挿入位置）
下記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチド（以下、「Ｔ－ＤＮＡ」）のイネゲノム中の挿入位置は、前記ゲノム領域Ａ内であれば特に制限されない。例えば、Ｔ－ＤＮＡは、配列番号２で示す塩基配列における１６２５番目、好ましくは１６７５番目、より好ましくは１７００番目、さらに好ましくは１７２５番目の塩基または上記（ｂ２）における対応する塩基から、配列番号３で示す塩基配列における１００番目、好ましくは５０番目、より好ましくは２５番目、さらに好ましくは１番目の塩基または上記（ｃ２）における対応する塩基までの領域内に挿入されている。
下記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチド（以下、「Ｔ－ＤＮＡ」）のイネゲノム中の挿入位置は、前記ゲノム領域Ａ内であれば特に制限されない。例えば、Ｔ－ＤＮＡは、配列番号２で示す塩基配列における１６２５番目、好ましくは１６７５番目、より好ましくは１７００番目、さらに好ましくは１７２５番目の塩基または上記（ｂ２）における対応する塩基から、配列番号３で示す塩基配列における１００番目、好ましくは５０番目、より好ましくは２５番目、さらに好ましくは１番目の塩基または上記（ｃ２）における対応する塩基までの領域内に挿入されている。
【0027】
本明細書において、「（ｂ２）における対応する塩基」とは、ホモロジー解析により配列番号２に示される塩基配列のＸ番目（Ｘは任意の整数）に相当すると特定される塩基を指す。同様に、「（ｃ２）における対応する塩基」とは、ホモロジー解析により配列番号３に示される塩基配列のＸ番目（Ｘは任意の整数）に相当すると特定される塩基を指す。なお、ホモロジー解析の方法としては、例えば、Needleman-Wunsch法やSmith-Waterman法等のPairwise Sequence Alignmentによる方法や、ClustalW法等のMultiple Sequence Alignmentによる方法が挙げられ、当業者であれば、これら方法に基づき、配列番号２または配列番号３に示される塩基配列を基準配列として用いて、解析対象の塩基配列中における「対応する塩基」を理解することができる。解析は、デフォルトの設定で行ってもよく、適宜、必要に応じてパラメータをデフォルトから変更して行ってもよい。
【0028】
本発明の最も好ましい形態において、本態様の遺伝子組換えイネは、配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、この順に連続してゲノム中に有している。配列番号４に示す塩基配列は、ａ１２３の第４染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に対応し、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の上流の塩基配列を示している。また、配列番号５に示す塩基配列は、ａ１２３の第４染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列に対応し、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の下流の塩基配列を示している。
【0029】
本発明の好ましい態様において、本態様の遺伝子組換えイネは、遺伝子工学的に導入された外来遺伝子をゲノム中の一箇所にのみ有しており、より好ましい態様において、本態様の遺伝子組換えイネは、遺伝子工学的に導入された外来遺伝子をａ１２３の第４染色体中の一箇所にのみ有している。
【0030】
（品種）
本態様の遺伝子組換えイネは、ａ１２３に、前述のＴ－ＤＮＡが導入されたものである。ａ１２３は、水稲品種コシヒカリに由来する、種子貯蔵タンパク質グルテリンの部分欠失変異系統である。ａ１２３は、ＧｌｕＡ１、ＧｌｕＡ２、ＧｌｕＢ４が存在しないことから、コシヒカリと比較して、全グルテリン量が低下している（参考文献：Iida, S. et. al., Theor. Appl. Genet. 94, 177-183, 1997）。ａ１２３のような低グルテリンイネは、外来遺伝子産物（組換えタンパク質）を胚乳に高蓄積させる材料として優れていることが報告されている（参考文献：Tada, Y et. al., PlantBiotechnol. J. 1, 411-422, 2003）。また、ａ１２３は、関東地方で広く栽培可能であり、食味が良いという利点を有している。
本態様の遺伝子組換えイネは、ａ１２３に、前述のＴ－ＤＮＡが導入されたものである。ａ１２３は、水稲品種コシヒカリに由来する、種子貯蔵タンパク質グルテリンの部分欠失変異系統である。ａ１２３は、ＧｌｕＡ１、ＧｌｕＡ２、ＧｌｕＢ４が存在しないことから、コシヒカリと比較して、全グルテリン量が低下している（参考文献：Iida, S. et. al., Theor. Appl. Genet. 94, 177-183, 1997）。ａ１２３のような低グルテリンイネは、外来遺伝子産物（組換えタンパク質）を胚乳に高蓄積させる材料として優れていることが報告されている（参考文献：Tada, Y et. al., PlantBiotechnol. J. 1, 411-422, 2003）。また、ａ１２３は、関東地方で広く栽培可能であり、食味が良いという利点を有している。
【0031】
（変異体）
前記（ａ１）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されている遺伝子組換えイネの変異体も、本発明の範疇に含まれる。つまり、前記（ａ１）、（ｂ１）および（ｃ１）のポリヌクレオチドの内の少なくとも１つ以上は、それぞれ、前記（ａ２）、（ｂ２）および（ｃ２）のポリヌクレオチドであってもよい。
前記（ａ１）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、前記（ｂ１）のポリヌクレオチドおよび前記（ｃ１）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されている遺伝子組換えイネの変異体も、本発明の範疇に含まれる。つまり、前記（ａ１）、（ｂ１）および（ｃ１）のポリヌクレオチドの内の少なくとも１つ以上は、それぞれ、前記（ａ２）、（ｂ２）および（ｃ２）のポリヌクレオチドであってもよい。
【0032】
前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１、２、３の塩基配列と、９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなる。塩基配列の同一性は、遺伝子情報ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．９（株式会社ゼネティクス製）を用いて算出した値である。
【0033】
また、前記（ａ２）、（ｂ２）、（ｃ２）のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１、２、３の塩基配列において５０個以下、好ましくは１５個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下の塩基に変異を有する塩基配列からなる。前記「変異」は、塩基の挿入、欠失、または置換である。配列番号１で示す塩基配列における２１３５番目の塩基から２０１番目の塩基までの領域、６４１６番目の塩基から７９２４番目の塩基までの領域、７０４６番目の塩基から７０９０番目の塩基までの領域および７２３２番目の塩基から７２７６番目の塩基までの領域は、それぞれ、２ｍＡＬＳタンパク質、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質、ノボキニンペプチド１（２連結したノボキニンの内のＮ末端側のノボキニンペプチド）およびノボキニンペプチド２（２連結したノボキニンの内のＣ末端側のノボキニンペプチド）をコードしていることから、前記（ａ２）のポリヌクレオチドにおいては、配列番号１で示す塩基配列におけるこれらの領域以外の部分に変異を有していることが好ましい。
【0034】
本態様の遺伝子組換えイネの変異体において、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされたノボキニンペプチド（被験ノボキニンペプチド）が、野生型のノボキニンペプチドと同じかまたはそれ以上の血圧降下活性を有することは、被験ノボキニンペプチドの血圧降下活性を、野生型のノボキニンペプチドの血圧降下活性と比較することによって確認することができる。例えば、先天性高血圧ラットに、１ｍｇ／ｋｇ体重の被験ノボキニンペプチドを経口投与した場合の血圧降下活性を、同量の野生型のノボキニンペプチドを経口投与した場合の血圧降下活性と比較することによって確認することができる。なお、配列番号２および３の塩基配列は、ａ１２３の第４染色体に存在するポリヌクレオチドの塩基配列を示しており、後述する実施例に記載のとおりこの領域は遺伝子領域でない。このため、配列番号２または３と配列同一性が９５％以上の塩基配列からなる変異ポリヌクレオチドもタンパク質をコードしないため、変異によるタンパク質の活性の変化を考慮する必要はない。
【0035】
（子孫またはクローン）
本態様の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンも本発明の範疇に含まれる。本態様の遺伝子組換えイネから有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。本明細書においては、本態様の遺伝子組換えイネから無性生殖によって得られた子孫を、特に「クローン」と称する。また、本態様の遺伝子組換えイネから有性生殖によって得られた子孫には、本態様の遺伝子組換えイネと原品種であるａ１２３との戻し交配によって得られた子孫、および本態様の遺伝子組換えイネとａ１２３以外の品種との交配によって得られた子孫も含まれる。ａ１２３以外の品種としては、特に限定されないが、例えば、半矮性形質を有するイネ品種もしくは系統等であってもよい。本発明の好ましい形態において、本態様の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンは、前記ゲノム領域Ａ中に下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドをゲノム中に保持している。
本態様の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンも本発明の範疇に含まれる。本態様の遺伝子組換えイネから有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。本明細書においては、本態様の遺伝子組換えイネから無性生殖によって得られた子孫を、特に「クローン」と称する。また、本態様の遺伝子組換えイネから有性生殖によって得られた子孫には、本態様の遺伝子組換えイネと原品種であるａ１２３との戻し交配によって得られた子孫、および本態様の遺伝子組換えイネとａ１２３以外の品種との交配によって得られた子孫も含まれる。ａ１２３以外の品種としては、特に限定されないが、例えば、半矮性形質を有するイネ品種もしくは系統等であってもよい。本発明の好ましい形態において、本態様の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンは、前記ゲノム領域Ａ中に下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドをゲノム中に保持している。
【0036】
（本態様の遺伝子組換えイネの特徴）
本態様の遺伝子組換えイネは、ａ１２３の第４染色体において、配列番号１に示す塩基配列を有するＴ－ＤＮＡが１コピー挿入されており、Ｔ－ＤＮＡの前後に配列番号２からなるポリヌクレオチドおよび配列番号３からなるポリヌクレオチドがそれぞれ連続している。本態様の遺伝子組換えイネでは、Ｔ－ＤＮＡ以外の余計な配列が挿入されていない。従って、本態様の遺伝子組換えイネは、食品として安全である。また、本態様の遺伝子組換えイネは、ａ１２３の第４染色体の特定位置にＴ－ＤＮＡが挿入されたことにより、食品として摂取するに適した量のノボキニンペプチドを発現することができるという優れた効果を奏する。
本態様の遺伝子組換えイネは、ａ１２３の第４染色体において、配列番号１に示す塩基配列を有するＴ－ＤＮＡが１コピー挿入されており、Ｔ－ＤＮＡの前後に配列番号２からなるポリヌクレオチドおよび配列番号３からなるポリヌクレオチドがそれぞれ連続している。本態様の遺伝子組換えイネでは、Ｔ－ＤＮＡ以外の余計な配列が挿入されていない。従って、本態様の遺伝子組換えイネは、食品として安全である。また、本態様の遺伝子組換えイネは、ａ１２３の第４染色体の特定位置にＴ－ＤＮＡが挿入されたことにより、食品として摂取するに適した量のノボキニンペプチドを発現することができるという優れた効果を奏する。
【0037】
〔コメ〕
本態様の遺伝子組換えイネから収穫されたコメも本発明の範疇に含まれる。本態様のコメは、玄米であってもよく、胚芽精米であってもよく、精白米であってもよい。
本態様の遺伝子組換えイネから収穫されたコメも本発明の範疇に含まれる。本態様のコメは、玄米であってもよく、胚芽精米であってもよく、精白米であってもよい。
【0038】
本態様の遺伝子組換えイネから収穫されたコメを炊飯米として摂取後、十二指腸における消化酵素の働きによりｎｆＧｌｕＡ２タンパク質内のノボキニンペプチドが切り出され、血圧降下作用を発揮することが期待される。
【0039】
〔食品組成物〕
本態様のコメを含む食品組成物も本発明の範疇に含まれる。本態様の食品組成物は、本態様のコメを含んでいればよく、その含有量は特に限定されない。また、本態様の食品組成物の種類は特に限定されない。例えば、加工飯米、米麹、米粉、米粉を利用した食品等を挙げることができる。
本態様のコメを含む食品組成物も本発明の範疇に含まれる。本態様の食品組成物は、本態様のコメを含んでいればよく、その含有量は特に限定されない。また、本態様の食品組成物の種類は特に限定されない。例えば、加工飯米、米麹、米粉、米粉を利用した食品等を挙げることができる。
【0040】
また、本態様の食品組成物は、本態様のコメから抽出されたノボキニンペプチドを含む抽出物を含むものであってもよい。また、例えば、本態様のコメを利用した発酵食品（甘酒等）、本態様のコメ由来の米粉のでん粉を酵素等で分解し、残った残渣を加工したもの等であってもよい。
【0041】
本態様の食品組成物は、本態様のコメをノボキニン換算で２．５ｍｇ以上、６．３ｍｇ以下含んでいることが好ましい。これは、本態様のコメの玄米６０ｇをパック米飯に加工したと仮定した場合に、１パックあたりに含まれるノボキニン含有量に相当する。本態様の食品組成物は、高血圧症が気になる消費者が食生活の一環として取り入れることによって当該消費者の健康の維持および増進に役立つことが期待される。
【0042】
本態様の食品組成物は、本態様のコメ以外の成分として、例えば、安定化剤、保存剤、着色料、香料、ビタミン等の配合物を適宜添加し、混合し、常法により、錠剤、粒状、顆粒状、粉末状、カプセル状、液状、クリーム状、飲料等の組成物に適した形態とすることができる。または、本態様の食品組成物は、本態様のコメにさらに複数種の物質が添加されている必要はなく、本態様のコメのみから構成される食品であってもよい。
【0043】
〔繁殖材料、細胞〕
本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に当該遺伝子組換えイネを量産することも可能である。従って、本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンの繁殖材料または種子あるいは本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンに由来する細胞も本発明の範疇に含まれる。これらの繁殖材料および細胞は、公知の方法により本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンから取得することができる。
本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンから繁殖材料（例えば、種子、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に当該遺伝子組換えイネを量産することも可能である。従って、本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンの繁殖材料または種子あるいは本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンに由来する細胞も本発明の範疇に含まれる。これらの繁殖材料および細胞は、公知の方法により本態様の遺伝子組換えイネやその子孫またはクローンから取得することができる。
【0044】
〔まとめ〕
本発明の態様１に係る遺伝子組換えイネは、下記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されている構成である：
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、且つ野生型のノボキニンペプチドと同じかまたはそれ以上の血圧降下活性を有するポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
本発明の態様１に係る遺伝子組換えイネは、下記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）または（ｂ２）のポリヌクレオチドおよび下記（ｃ１）または（ｃ２）のポリヌクレオチドをそれぞれ５’側の端部および３’側の端部に有するイネのゲノム領域Ａ内に挿入されている構成である：
（ａ１）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ａ２）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなり、且つ野生型のノボキニンペプチドと同じかまたはそれ以上の血圧降下活性を有するポリペプチドを発現させることができるポリヌクレオチド；
（ｂ１）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ２）配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ１）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｃ２）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと配列同一性が９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【0045】
本発明の態様２に係る遺伝子組換えイネは、前記の態様１において、前記（ａ１）または（ａ２）のノボキニンポリペプチドを有する改変グルテリンタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドが、配列番号２で示す塩基配列における１６２５番目の塩基または上記（ｂ２）における対応する塩基から配列番号３で示す塩基配列における１００番目の塩基または上記（ｃ２）における対応する塩基までの領域内に挿入されている構成としてもよい。
【0046】
本発明の態様３に係る遺伝子組換えイネは、前記の態様１または２において、配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド、および配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドを、この順に連続してゲノム中に有している構成としてもよい。
【0047】
本発明の態様４に係る遺伝子組換えイネは、前記の態様１から３のいずれかに記載の遺伝子組換えイネの子孫またはクローンであってもよい。
【0048】
本発明の態様５に係るコメは、前記の態様１から４のいずれかに記載の遺伝子組換えイネから収穫されたコメである。
【0049】
本発明の態様６に係る食品組成物は、前記の態様５に記載のコメを含む食品組成物である。
【0050】
本発明の態様７に係る繁殖材料は、前記の態様１から４のいずれかに記載の遺伝子組換えイネの繁殖材料である。
【0051】
本発明の態様８に係る種子は、前記の態様１から４のいずれかに記載の遺伝子組換えイネの種子である。
【0052】
本発明の態様９に係る細胞は、前記の態様１から４のいずれかに記載の遺伝子組換えイネに由来する細胞である。
【実施例】
【0053】
〔１．遺伝子組換えイネの作出〕
（宿主）
コシヒカリ変異系統ａ１２３を用いた。
（宿主）
コシヒカリ変異系統ａ１２３を用いた。
【0054】
（プラスミドベクター）
２種類のプラスミドベクターｐＣＳＰ２ｍＡＬＳ ＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２（図３、以下「プラスミド１」）およびｐＣＳＰ２ｍＡＬＳ Ｇｌｂ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２（図示しない、以下「プラスミド２」）を用いた。
２種類のプラスミドベクターｐＣＳＰ２ｍＡＬＳ ＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２（図３、以下「プラスミド１」）およびｐＣＳＰ２ｍＡＬＳ Ｇｌｂ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２（図示しない、以下「プラスミド２」）を用いた。
【0055】
図３に示すプラスミド１は、ｐＰＺＰ２００系バイナリーベクターｐＣＳＰ２ｍＡＬＳ－ＧＷ（参考文献：Wakasa, Y. et. al., Plant Cell Rep. 31, 2075-2084, 2012；Hajdukiewicz, P. et. al., Plant Mol. Biol. 25, 989-994, 1994）を基に構築したものであり、Ｔ－ＤＮＡ領域内に２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセットおよびＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセットがこの順で連結されている（図１）。「２ｍＡＬＳ遺伝子発現カセット」および「ＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセット」の詳細は、前述したとおりである。
【0056】
図３に示すプラスミド１の各エレメントは以下のとおりである：ｐＶＳ１ ＳｔａＡ，ＤＮＡ複製タンパク質；ｐＶＳ１ ｏｒｉＶ，アグロバクテリウム内でのプラスミドの複製に機能する；ｂｏｍ，プラスミドの接合安定性に機能する；ＳｍＲ，スペクチノマイシン耐性遺伝子；ｏｒｉ，大腸菌でのプラスミドの複製に機能する；ＬＢ，レフトボーダー；Ｎｏｓ Ｔ，ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター；１０ｋＤａ Ｔ，１０ｋＤａプロラミン遺伝子ターミネーター；２ｍＡＬＳ，２点変異型アセト乳酸合成酵素コード領域；ＣＳＰ，カルス選抜プロモーター；ＧｌｕＢ１ ｐｒｏ，グルテリンＢ１（ＧｌｕＢ１）遺伝子プロモーター；ｎｆＧｌｕＡ２，ノボキニン融合型グルテリンＡ２（ＧｌｕＡ２）コード領域；ＧｌｕＡ２ ３’ＵＴＲ，ＧｌｕＡ２遺伝子３’非翻訳領域；ＧｌｕＢ１ Ｔ，ＧｌｕＢ１遺伝子ターミネーター；ＲＢ，ライトボーダー；ａｔｔ，Ｇａｔｅｗａｙ（インビトロジェン）アタッチメント配列。
【0057】
プラスミド２は、ＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセットの代わりに、Ｇｌｂ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセット（図示しない）が連結されている以外は、プラスミド１の構成と同じである。Ｇｌｂ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセットは、グロブリンプロモーター（Ｇｌｂ－１ ｐｒｏ）の代わりに、グルテリンＢ１プロモーター（ＧｌｕＢ１ ｐｒｏ）を用いたこと以外は、ＧｌｕＢ１ｐｒｏ ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子発現カセットの構成と同じである。
【0058】
（宿主への核酸の移入方法）
公知のアグロバクテリウム法に従って行った。
公知のアグロバクテリウム法に従って行った。
【0059】
（遺伝子組換えイネの選抜方法）
プラスミド１または２を保持したアグロバクテリウムを宿主イネ種子胚盤由来のカルスに感染させ、スルホニルウレア系除草剤であるビスピリバックナトリウム塩（０．５μＭ）を含む選抜培地で２ｍＡＬＳ遺伝子が導入されたカルスを選抜した。その後、選抜したカルスを再分化させることにより、遺伝子組換えイネ再分化当代（Ｔ０）を得た。Ｔ０個体群を閉鎖系温室で育成し、これらの成葉由来全ＤＮＡのサザンブロット解析により、Ｔ－ＤＮＡが１コピー挿入されている系統を選抜した。
プラスミド１または２を保持したアグロバクテリウムを宿主イネ種子胚盤由来のカルスに感染させ、スルホニルウレア系除草剤であるビスピリバックナトリウム塩（０．５μＭ）を含む選抜培地で２ｍＡＬＳ遺伝子が導入されたカルスを選抜した。その後、選抜したカルスを再分化させることにより、遺伝子組換えイネ再分化当代（Ｔ０）を得た。Ｔ０個体群を閉鎖系温室で育成し、これらの成葉由来全ＤＮＡのサザンブロット解析により、Ｔ－ＤＮＡが１コピー挿入されている系統を選抜した。
【0060】
候補系統の育成を続行し、自殖種子（Ｔ１系統群）を得た。種子より全タンパク質を調製し、抗ノボキニンウサギ抗体（以下、単に「抗ノボキニン抗体」または「ノボキニン抗体」）によるイムノブロット解析により、目的遺伝子産物（ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質）が蓄積している４系統を選抜した。取得した４系統を、以下、ＯｓＮＶ２、ＯｓＮＶ３、ＯｓＮＶ４およびＯｓＮＶ８と称する。なお、ＯｓＮＶ２およびＯｓＮＶ４には、プラスミド２が移入されており、ＯｓＮＶ３およびＯｓＮＶ８には、プラスミド１が移入されている。
【0061】
組換えイネの各系統のＴ１種子について、５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液を用いて滅菌し、アグロバクテリウムや他の雑菌の除去後にＭＳ培地上に無菌播種を行った。発芽時にＭＳ培地上にアグロバクテリウムが増殖しないことを観察し、アグロバクテリウムの残存していないことを確認したＴ１からＴ２種子を得、これらから導入遺伝子がホモの系統候補を選抜した。
【0062】
〔２．選抜した４系統の比較〕
（核酸の存在状態）
移入した核酸が染色体上に存在するか否かを調べるため、組換えイネの各系統のＴ２世代において、移入した核酸の分離比をカイ二乗検定で分析した。組換えイネの各系統について、形質転換された再分化当代（Ｔ０）、その自殖後代であるＴ１世代を複数個体栽培し、自殖して得られたＴ２種子について、イムノブロット法でｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の蓄積の有無を解析し、移入した核酸の有無を確認した。Ｔ２種子で分離が確認された集団についてはその親であるＴ１個体は移入した核酸をヘミに持つことが推察される。このＴ２分離集団におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の発現の有無の分離について、メンデル分離に適合しているかカイ二乗検定を行った。その結果、選抜した４系統の全てにおいて、実測値と理論値との間に統計学的有意差は認められなかったことから、移入した核酸の分離はメンデル分離に適合していることが確認された。したがって、選抜した４系統の全てにおいて、移入した核酸は染色体上に存在していると考えられた。
（核酸の存在状態）
移入した核酸が染色体上に存在するか否かを調べるため、組換えイネの各系統のＴ２世代において、移入した核酸の分離比をカイ二乗検定で分析した。組換えイネの各系統について、形質転換された再分化当代（Ｔ０）、その自殖後代であるＴ１世代を複数個体栽培し、自殖して得られたＴ２種子について、イムノブロット法でｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の蓄積の有無を解析し、移入した核酸の有無を確認した。Ｔ２種子で分離が確認された集団についてはその親であるＴ１個体は移入した核酸をヘミに持つことが推察される。このＴ２分離集団におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の発現の有無の分離について、メンデル分離に適合しているかカイ二乗検定を行った。その結果、選抜した４系統の全てにおいて、実測値と理論値との間に統計学的有意差は認められなかったことから、移入した核酸の分離はメンデル分離に適合していることが確認された。したがって、選抜した４系統の全てにおいて、移入した核酸は染色体上に存在していると考えられた。
【0063】
（核酸のコピー数）
組換えイネの各系統のＴ１世代について、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩで消化した全ＤＮＡをナイロンメンブレンにブロットし、ＡＬＳ領域をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションをおこなった。図４にサザンブロット解析の結果を示す。矢印を付したシグナルは導入遺伝子（Ｔ－ＤＮＡ）を示し、その他のシグナルは内生ＡＳＬ遺伝子由来である。図４に示すように、４系統の全てにおいて、Ｔ－ＤＮＡがゲノム中に１コピー移入されていることを確認した。また、それぞれの系統におけるサザンブロット解析のシグナルは異なっており、系統毎に異なる遺伝子座にＴ－ＤＮＡが導入されていることが示唆された。
組換えイネの各系統のＴ１世代について、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩで消化した全ＤＮＡをナイロンメンブレンにブロットし、ＡＬＳ領域をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションをおこなった。図４にサザンブロット解析の結果を示す。矢印を付したシグナルは導入遺伝子（Ｔ－ＤＮＡ）を示し、その他のシグナルは内生ＡＳＬ遺伝子由来である。図４に示すように、４系統の全てにおいて、Ｔ－ＤＮＡがゲノム中に１コピー移入されていることを確認した。また、それぞれの系統におけるサザンブロット解析のシグナルは異なっており、系統毎に異なる遺伝子座にＴ－ＤＮＡが導入されていることが示唆された。
【0064】
（種子におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質発現）
ａ１２３および組換えイネの各系統のＴ２世代について、種子４粒粉末に対し、５００ｍＬの抽出バッファ（４％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ６．８、８Ｍ ウレア、２０％グリセロール、５％２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗ノボキニン抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供した。抗ノボキニン抗体によりｎｆＧｌｕＡ２タンパク質を検出した。図５にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図５中のａのレーンは、ａ１２３の結果を示している。図５に示すように、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質は、ａのレーンに示す内生グルテリンタンパク質と同様に、酸性サブユニットと前駆体との２本のシグナルとして検出された。ことから、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質は内生ＧｌｕＡ２タンパク質の特徴を保持していることが判った。
ａ１２３および組換えイネの各系統のＴ２世代について、種子４粒粉末に対し、５００ｍＬの抽出バッファ（４％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ６．８、８Ｍ ウレア、２０％グリセロール、５％２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗ノボキニン抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供した。抗ノボキニン抗体によりｎｆＧｌｕＡ２タンパク質を検出した。図５にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図５中のａのレーンは、ａ１２３の結果を示している。図５に示すように、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質は、ａのレーンに示す内生グルテリンタンパク質と同様に、酸性サブユニットと前駆体との２本のシグナルとして検出された。ことから、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質は内生ＧｌｕＡ２タンパク質の特徴を保持していることが判った。
【0065】
なお、組換えイネの種子は、ａ１２３と比較して外観に大きな違いはなく、Ｇｌｂ－１タンパク質およびＲＭ１タンパク質の発現量にほとんど差が認められなかった。Ｇｌｂ－１タンパク質およびＲＭ１タンパク質は種子に悪影響が出ると発現量が減少するタンパク質の代表であることから、ａ１２３系統イネにおいて、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の発現による種子形質への影響はほとんどないと結論付けた。
【0066】
（ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の発現部位）
ａ１２３並びに組換えイネの各系統の葉、茎、根および種子組織から５００μＬの抽出バッファを使用して全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗ノボキニン抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供して、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質を検出した。図６にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図６中、Ｌ，葉；Ｓｔ，茎；Ｒ，根；Ｓ，種子を示す。図６に示すように、全ての組換えイネ系統において、種子由来タンパク質のみでｎｆＧｌｕＡ２タンパク質のシグナルが検出された。この結果から、組換えイネの各系統においてｎｆＧｌｕＡ２タンパク質が種子特異的に蓄積していることを確認した。
ａ１２３並びに組換えイネの各系統の葉、茎、根および種子組織から５００μＬの抽出バッファを使用して全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗ノボキニン抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供して、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質を検出した。図６にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図６中、Ｌ，葉；Ｓｔ，茎；Ｒ，根；Ｓ，種子を示す。図６に示すように、全ての組換えイネ系統において、種子由来タンパク質のみでｎｆＧｌｕＡ２タンパク質のシグナルが検出された。この結果から、組換えイネの各系統においてｎｆＧｌｕＡ２タンパク質が種子特異的に蓄積していることを確認した。
【0067】
（種子におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の蓄積量の確認）
組換えイネの各系統のＴ２世代について、種子におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の蓄積量を定量した。種子１粒粉末に対し、１ｍＬの抽出バッファを使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液１μＬを抗ノボキニン抗体によるドットブロットに使用した。定量のための比較対象として、大腸菌から精製したｎｆＧｌｕＡ２タンパク質を用いた。
組換えイネの各系統のＴ２世代について、種子におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の蓄積量を定量した。種子１粒粉末に対し、１ｍＬの抽出バッファを使用して種子中の全タンパク質を抽出した。抽出液１μＬを抗ノボキニン抗体によるドットブロットに使用した。定量のための比較対象として、大腸菌から精製したｎｆＧｌｕＡ２タンパク質を用いた。
【0068】
結果を図７に示す。図７に示すように、組換えイネの各系統の種子におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の蓄積量が系統間で異なることが示された。組換えイネの各系統における１粒の種子あたりのおおよそのノボキニンペプチドの蓄積量を、以下のとおり推測した：
ＯｓＮＶ２：約４．６μｇ
ＯｓＮＶ４：約６．６μｇ
ＯｓＮＶ３：約３．９μｇ
ＯｓＮＶ８：約７．８μｇ。
ＯｓＮＶ２：約４．６μｇ
ＯｓＮＶ４：約６．６μｇ
ＯｓＮＶ３：約３．９μｇ
ＯｓＮＶ８：約７．８μｇ。
【0069】
（Ｔ－ＤＮＡ挿入位置の特定）
公知の次世代シークエンス解析を行い、組換えイネの各系統のＦ３世代について、Ｔ－ＤＮＡ挿入位置の特定を行った。次世代シークエンス解析は、対象のゲノムの塩基配列を迅速に且つ網羅的に解読する手法である。通常のシークエンスでは、Ｔ－ＤＮＡが挿入された遺伝子組換え植物のＴ－ＤＮＡの特定が極めて困難である。一方で、次世代シークエンス解析では、得られた網羅的塩基配列データをリファレンスゲノムにマッピングしていくことで、格段に速くＴ－ＤＮＡのゲノム中の挿入位置を特定することが可能となる。次世代シークエンス解析の結果、系統毎に異なる遺伝子座にプラスミドが導入されていることが明らかになった。中でもＯｓＮＶ３は、ａ１２３の第４染色体の特定のゲノム領域に挿入されていた。具体的には、次世代シークエンス解析の結果、ＯｓＮＶ３は、配列番号２、配列番号１、配列番号３の順に連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドをゲノム中に有していた。なお、配列番号１に示す塩基配列は、ＯｓＮＶ３のゲノム中に導入されたＤＮＡの全塩基配列を示し、プラスミド１のＴ－ＤＮＡ領域の全塩基配列に相当する。配列番号２に示す塩基配列は、ａ１２３の第４染色体に存在する、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の上流の塩基配列を示している。配列番号３に示す塩基配列は、ａ１２３の第４染色体に存在する、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の下流の塩基配列を示している。
公知の次世代シークエンス解析を行い、組換えイネの各系統のＦ３世代について、Ｔ－ＤＮＡ挿入位置の特定を行った。次世代シークエンス解析は、対象のゲノムの塩基配列を迅速に且つ網羅的に解読する手法である。通常のシークエンスでは、Ｔ－ＤＮＡが挿入された遺伝子組換え植物のＴ－ＤＮＡの特定が極めて困難である。一方で、次世代シークエンス解析では、得られた網羅的塩基配列データをリファレンスゲノムにマッピングしていくことで、格段に速くＴ－ＤＮＡのゲノム中の挿入位置を特定することが可能となる。次世代シークエンス解析の結果、系統毎に異なる遺伝子座にプラスミドが導入されていることが明らかになった。中でもＯｓＮＶ３は、ａ１２３の第４染色体の特定のゲノム領域に挿入されていた。具体的には、次世代シークエンス解析の結果、ＯｓＮＶ３は、配列番号２、配列番号１、配列番号３の順に連続した塩基配列からなるポリヌクレオチドをゲノム中に有していた。なお、配列番号１に示す塩基配列は、ＯｓＮＶ３のゲノム中に導入されたＤＮＡの全塩基配列を示し、プラスミド１のＴ－ＤＮＡ領域の全塩基配列に相当する。配列番号２に示す塩基配列は、ａ１２３の第４染色体に存在する、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の上流の塩基配列を示している。配列番号３に示す塩基配列は、ａ１２３の第４染色体に存在する、Ｔ－ＤＮＡ挿入部位の下流の塩基配列を示している。
【0070】
ＯｓＮＶ３においてＴ－ＤＮＡが挿入されていたゲノム領域は、公知の「日本晴」のゲノムデータベースであるイネアノテーションプロジェクトデータベース（ＲＡＰ－ＤＢ）で配列が公開されていないゲノム領域であった。そこで、インディカコメ等の他のゲノムシークエンスを元に、ＯｓＮＶ３におけるＴ－ＤＮＡ挿入位置のゲノム領域３ｋｂの塩基配列を解析し、ＢＬＡＳＴ検索をした結果、ｃＤＮＡとして全くヒットしなかったことから、ＯｓＮＶ３におけるＴ－ＤＮＡ挿入位置は遺伝子領域ではないと判断した。さらには、次世代シークエンス解析の結果から、ＯｓＮＶ３は、ｐＰＺＰ２００系バイナリーベクターのＴ－ＤＮＡ領域外の余計な配列が挿入されることなくＴ－ＤＮＡがほぼ期待通り（理論通り）に挿入されていることが示され、食品として安全であることが確認された。一方、ＯｓＮＶ３以外の３系統では、ゲノムの遺伝子領域にＴ－ＤＮＡが挿入されており、且つＴ－ＤＮＡ以外の余計な配列が挿入されていることが明らかになった。
【0071】
Ｔ－ＤＮＡのゲノム挿入位置、Ｔ－ＤＮＡの挿入様式、および種子におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の蓄積量の観点から、選抜した４系統の内、ＯｓＮＶ３が食品として最も適した系統であると結論付けた。選抜した４系統は全てＴ－ＤＮＡが１コピー挿入されているにも関わらず、種子におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の蓄積量に大きな違いがある。選抜した４系統は全てＴ－ＤＮＡのゲノム挿入位置が異なっていることから、この違い、すなわち位置効果が、種子におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の蓄積量の違いをもたらしていると考えられた。つまり、ＯｓＮＶ３は、ａ１２３の第４染色体の特定位置にＴ－ＤＮＡが挿入されたことにより、食品として摂取するに適した量のノボキニンペプチドを発現することができると言える。
【0072】
〔３．ＯｓＮＶ３の解析〕
（作出系統）
図８にＯｓＮＶ３の作出系統図を示す。Ｔ３ホモ系統で戻し交配を実施し、得られたＦ１の後代にあたるＦ３で選抜系統ＯｓＮＶ３－１０を得た。ＯｓＮＶ３－１０を次世代シークエンス解析に供試し、この後代およびａ１２３閉花系統との交配で得た系統の後代を分析に用いた。ただし、一部の分析ではＴ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６も材料として用いた。
（作出系統）
図８にＯｓＮＶ３の作出系統図を示す。Ｔ３ホモ系統で戻し交配を実施し、得られたＦ１の後代にあたるＦ３で選抜系統ＯｓＮＶ３－１０を得た。ＯｓＮＶ３－１０を次世代シークエンス解析に供試し、この後代およびａ１２３閉花系統との交配で得た系統の後代を分析に用いた。ただし、一部の分析ではＴ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６も材料として用いた。
【0073】
（ＰＣＲによる特定）
ＯｓＮＶ３においてＴ－ＤＮＡおよびそのゲノムへの挿入領域近辺が安定的に次世代に遺伝することを調べるため、ＰＣＲに用いるプライマーセットの検討を行った。ＰＣＲには、ａ１２３（ｗ）およびＯｓＮＶ３の３世代（Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５）の全ＤＮＡをテンプレートとして用いた。検討に用いたプライマーセットは、以下のとおりである。
ＯｓＮＶ３においてＴ－ＤＮＡおよびそのゲノムへの挿入領域近辺が安定的に次世代に遺伝することを調べるため、ＰＣＲに用いるプライマーセットの検討を行った。ＰＣＲには、ａ１２３（ｗ）およびＯｓＮＶ３の３世代（Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５）の全ＤＮＡをテンプレートとして用いた。検討に用いたプライマーセットは、以下のとおりである。
【0074】
・プライマーセット１：
5'-ＴＡＣＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＧＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号１１）
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧ-3' （配列番号１２）
・プライマーセット２：
5'-ＧＡＣＣＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＣＡＣＣ-3' （配列番号１３）
5'-ＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣＣＧＴＴＣＧＡＡＴＧＧ-3' （配列番号１４）
・プライマーセット３：
5'-ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣ-3' （配列番号１５）
5'-ＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣ-3' （配列番号１６）
・プライマーセット４：
5'-ＧＣＡＧＣＧＴＡＧＡＣＣＴＣＴＴＡＡＧＣＣＣＴＧ-3' （配列番号１７）
5'-ＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＴＡＣ-3' （配列番号１８）
・プライマーセット５：
5'-ＡＡＣＧＧＴＡＴＴＡＡＧＡＴＣＡＡＴＡＧＴＧＴＣＣ-3' （配列番号１９）
5'-ＴＧＧＧＴＣＴＡＣＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧ-3' （配列番号２０）
5'-ＴＡＣＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＧＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号１１）
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧ-3' （配列番号１２）
・プライマーセット２：
5'-ＧＡＣＣＧＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＣＡＣＣ-3' （配列番号１３）
5'-ＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣＣＧＴＴＣＧＡＡＴＧＧ-3' （配列番号１４）
・プライマーセット３：
5'-ＣＡＡＡＴＴＡＣＡＡＧＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣ-3' （配列番号１５）
5'-ＣＣＴＴＣＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＴＴＡＡＣ-3' （配列番号１６）
・プライマーセット４：
5'-ＧＣＡＧＣＧＴＡＧＡＣＣＴＣＴＴＡＡＧＣＣＣＴＧ-3' （配列番号１７）
5'-ＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＴＡＣ-3' （配列番号１８）
・プライマーセット５：
5'-ＡＡＣＧＧＴＡＴＴＡＡＧＡＴＣＡＡＴＡＧＴＧＴＣＣ-3' （配列番号１９）
5'-ＴＧＧＧＴＣＴＡＣＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧ-3' （配列番号２０）
【0075】
図９は、プライマーセットの検討結果を示す図であり、９０１は、検討に用いた各プライマーセットによって増幅される領域を模式的に示す図であり、９０２は、各プライマーを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。図９の９０２に示すように、プライマーセットの検討の結果、全てのプライマーセットでＤＮＡの増幅が認められた。また、少なくともＴ－ＤＮＡとゲノムとのジャンクション領域二か所を増幅するプライマーセット１およびプライマーセット５を用いてＰＣＲを行うことで、ＯｓＮＶ３においてＴ－ＤＮＡおよびそのゲノムへの挿入領域近辺が安定的に次世代に遺伝することを十分に確認できることが判った。
【0076】
（ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の発現の組織特異性の検討）
ノボキニン発現遺伝子であるｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲ（以下、「ｑＰＣＲ」）によって確認した。ａ１２３およびＯｓＮＶ３のＦ５世代の幼葉、幼根、成葉、種子組織およびカルスからそれぞれＲＮＡを抽出しテンプレートとして用いた。用いたプライマーセットは、以下のとおりである：
5'-ＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴＧＴＴＧＧＴＡＴＣＣＴＣ-3' （配列番号２１）
5'-ＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＴＡＣ-3' （配列番号２２）。
ノボキニン発現遺伝子であるｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の発現の組織特異性を定量的ＰＣＲ（以下、「ｑＰＣＲ」）によって確認した。ａ１２３およびＯｓＮＶ３のＦ５世代の幼葉、幼根、成葉、種子組織およびカルスからそれぞれＲＮＡを抽出しテンプレートとして用いた。用いたプライマーセットは、以下のとおりである：
5'-ＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴＧＴＴＧＧＴＡＴＣＣＴＣ-3' （配列番号２１）
5'-ＣＡＧＡＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＴＡＣ-3' （配列番号２２）。
【0077】
プラスミド１をテンプレートとして用いたｑＰＣＲを行って検量線を作成し、ｑＰＣＲによる検出限界を特定した。その結果、図１０の１００１に示すように、１００コピーまで定量性が認められた。各組織におけるｑＰＣＲの結果を図１０の１００２に示す。なお、１００２のグラフ中の「７ｄａｆ」、「１４ｄａｆ」は、それぞれ開花後７日目、１４日目を示している。ｑＰＣＲの結果、ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の転写物は種子由来ＲＮＡでのみ検出されたことから、ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子は、種子特異的に発現していることが確認された。
【0078】
（２ｍＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性の検討）
選抜マーカー遺伝子である２ｍＡＬＳ遺伝子および内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性をｑＰＣＲによって確認した。テンプレートは、前述の「ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の発現の組織特異性の検討」の項で調製したＲＮＡを用いた。用いたプライマーセットは、以下のとおりである：
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号２３）
5'-ＡＴＴＡＣＴＡＧＡＧＴＡＣＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＣＧ-3' （配列番号２４）。
選抜マーカー遺伝子である２ｍＡＬＳ遺伝子および内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性をｑＰＣＲによって確認した。テンプレートは、前述の「ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の発現の組織特異性の検討」の項で調製したＲＮＡを用いた。用いたプライマーセットは、以下のとおりである：
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号２３）
5'-ＡＴＴＡＣＴＡＧＡＧＴＡＣＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＣＧ-3' （配列番号２４）。
【0079】
プラスミド１をテンプレートとして用いたｑＰＣＲを行って検量線を作成し、ｑＰＣＲによる検出限界を特定した。その結果、図１１の１１０１に示すように、１００コピーまで定量性が認められた。各組織におけるｑＰＣＲの結果を図１１の１１０２に示す。ｑＰＣＲの結果、２ｍＡＬＳ遺伝子の転写物はカルスで強く、根と登熟初期の種子で弱く検出された。イネ植物体の根および葉では２ｍＡＬＳ遺伝子の転写物の量は検出限界以下であった。この結果は、カルスにおいては除草剤であるビスピリバックナトリウム塩に耐性であるが、発芽後は耐性を示さないＯｓＮＶ３の形質とほぼ一致していた。
【0080】
（内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性の検討）
内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性をｑＰＣＲによって確認した。テンプレートは、前述の「ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の発現の組織特異性」の項で調製したＲＮＡを用いた。用いたプライマーセットは、以下のとおりである：
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号２３）
5'-ＣＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧ-3' （配列番号２５）
内生ＡＬＳ遺伝子の発現の組織特異性をｑＰＣＲによって確認した。テンプレートは、前述の「ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子の発現の組織特異性」の項で調製したＲＮＡを用いた。用いたプライマーセットは、以下のとおりである：
5'-ＣＣＡＴＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＣ-3' （配列番号２３）
5'-ＣＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＡＧ-3' （配列番号２５）
【0081】
配列番号２３、２５に示すプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した内生ＡＬＳ遺伝子の部分領域を含むベクターをテンプレートとして用いたｑＰＣＲを行って検量線を作成し、ｑＰＣＲによる検出限界を特定した。その結果、図１２の１２０１に示すように、１０００コピーまで定量性が認められた。各組織におけるｑＰＣＲの結果を図１２の１２０２に示す。ｑＰＣＲの結果、内生ＡＬＳ遺伝子の転写物は全組織で検出された。この結果から、カルス以外の組織で、２ｍＡＬＳタンパク質がイネの生長等に影響を与える可能性は低いと考えられた。
【0082】
（ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の細胞内局在の検討）
ａ１２３およびＯｓＮＶ３のＴ４世代の種子を、抗ノボキニン抗体を用いて免疫染色を行い、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の細胞内局在を確認した。図１３の１３０１は、ａ１２３およびＯｓＮＶ３の種子の免疫染色の結果を示している。マージした画像中の矢頭はＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｏｄｙ Ｉ（ＰＢ－Ｉ）を、矢印はＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｏｄｙ ＩＩ（ＰＢ－ＩＩ）をそれぞれ指している。図１３の１３０２は、１３０１に示したａ１２３のマージした画像を拡大した図であり、図１３の１３０３は、１３０１に示したＯｓＮＶ３のマージした画像を拡大した図である。図１３に示すように、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質は、内生のグルテリンと同様にＰＢ－ＩＩ中のみに種子貯蔵タンパク質として蓄積されていることが判った。
ａ１２３およびＯｓＮＶ３のＴ４世代の種子を、抗ノボキニン抗体を用いて免疫染色を行い、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の細胞内局在を確認した。図１３の１３０１は、ａ１２３およびＯｓＮＶ３の種子の免疫染色の結果を示している。マージした画像中の矢頭はＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｏｄｙ Ｉ（ＰＢ－Ｉ）を、矢印はＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｏｄｙ ＩＩ（ＰＢ－ＩＩ）をそれぞれ指している。図１３の１３０２は、１３０１に示したａ１２３のマージした画像を拡大した図であり、図１３の１３０３は、１３０１に示したＯｓＮＶ３のマージした画像を拡大した図である。図１３に示すように、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質は、内生のグルテリンと同様にＰＢ－ＩＩ中のみに種子貯蔵タンパク質として蓄積されていることが判った。
【0083】
（既知アレルゲンタンパク質の量の検討）
イネ種子主要アレルゲン（１４～１６ｋＤａアレルゲン、２６ｋＤａアレルゲン、３３ｋＤａアレルゲン、５６ｋＤａアレルゲン）の量を検討した。ａ１２３およびＯｓＮＶ３のＦ５世代の種子から５００μＬの抽出バッファを使用して全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）並びに各アレルゲンに対する抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供して、各アレルゲンを検出した。図１４にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図１４に示すように、ＯｓＮＶ３のイネ種子主要アレルゲン量はａ１２３と比較して目立った増減は認められなかった。
イネ種子主要アレルゲン（１４～１６ｋＤａアレルゲン、２６ｋＤａアレルゲン、３３ｋＤａアレルゲン、５６ｋＤａアレルゲン）の量を検討した。ａ１２３およびＯｓＮＶ３のＦ５世代の種子から５００μＬの抽出バッファを使用して全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）並びに各アレルゲンに対する抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供して、各アレルゲンを検出した。図１４にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図１４に示すように、ＯｓＮＶ３のイネ種子主要アレルゲン量はａ１２３と比較して目立った増減は認められなかった。
【0084】
（Ｔ－ＤＮＡの後代における安定性の確認）
導入されたＴ－ＤＮＡの後代における安定性を確認するために、ａ１２３（ｗ）およびＯｓＮＶ３の３世代（Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５）の穀粒からゲノムＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩで消化したゲノミックＤＮＡをナイロンメンブレンにブロットし、ＡＬＳ領域をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションをおこなった。図１５にサザンブロット解析の結果を示す。図１５中、矢頭を付したシグナルはＴ－ＤＮＡを示し、その他のシグナルは内生ＡＳＬ遺伝子由来である。図１５に示すように、導入されたＴ－ＤＮＡが世代間で安定して遺伝していることが確認された。
導入されたＴ－ＤＮＡの後代における安定性を確認するために、ａ１２３（ｗ）およびＯｓＮＶ３の３世代（Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５）の穀粒からゲノムＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩで消化したゲノミックＤＮＡをナイロンメンブレンにブロットし、ＡＬＳ領域をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションをおこなった。図１５にサザンブロット解析の結果を示す。図１５中、矢頭を付したシグナルはＴ－ＤＮＡを示し、その他のシグナルは内生ＡＳＬ遺伝子由来である。図１５に示すように、導入されたＴ－ＤＮＡが世代間で安定して遺伝していることが確認された。
【0085】
同様に、ＯｓＮＶ３の戻し交配により得られたＦ１世代の後代についてもゲノミックＤＮＡのサザンブロット解析を行った。ゲノミックＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩで消化し、ＡＬＳ領域をプローブとした。図１６にサザンブロット解析の結果を示す。図１６中、矢頭を付したシグナルはＴ－ＤＮＡを示し、その他のシグナルは内生ＡＳＬ遺伝子由来である。レーン１、ａ１２３；レーン２、Ｔ５；レーン３、Ｆ４；レーン４、Ｆ５；レーン５、Ｆ４×ａ１２３閉花Ｆ１；レーン６、Ｆ４×ａ１２３閉花Ｆ２の結果を表している。図１６に示すように、ＯｓＮＶ３の戻し交配により得られたＦ１世代の後代についても、Ｔ－ＤＮＡが世代間で安定して遺伝していることが確認された。
【0086】
（後代におけるｎｆＧｌｕＡ２タンパク質の発現量の確認）
特定網室内で育成したａ１２３（ｗ）およびＯｓＮＶ３の３世代（Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５）について、各系統の種子４粒ずつ、１粒あたり５００μＬの抽出バッファを使用して全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗ノボキニン抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供して、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質を検出した。図１７にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図１７中、ｗはａ１２３を示す。図１７に示すように、系統間でｎｆＧｌｕＡ２タンパク質量に大きな差は認められず、種子中に安定して蓄積していた。
特定網室内で育成したａ１２３（ｗ）およびＯｓＮＶ３の３世代（Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５）について、各系統の種子４粒ずつ、１粒あたり５００μＬの抽出バッファを使用して全タンパク質を抽出した。抽出液２μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗ノボキニン抗体によるイムノブロット（ＩＢ）へ供して、ｎｆＧｌｕＡ２タンパク質を検出した。図１７にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図１７中、ｗはａ１２３を示す。図１７に示すように、系統間でｎｆＧｌｕＡ２タンパク質量に大きな差は認められず、種子中に安定して蓄積していた。
【0087】
同様に、隔離ほ場で栽培したＯｓＮＶ３のＴ５世代、Ｔ６世代および戻し交配系統Ｆ５、Ｆ６についてもＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＣＢＢ）および抗ノボキニン抗体によるイムノブロット（ＩＢ）を行った。図１８にＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析の結果を示す。図１８中、ｗはａ１２３を示す。図１８に示すように、これらの系統についても、系統間でｎｆＧｌｕＡ２タンパク質量に大きな差は認められず、種子中に安定して蓄積していた。
【0088】
以上の結果から、ｎｆＧｌｕＡ２遺伝子は、同等の栽培条件下においては登熟中の種子で安定的に発現し、一定量のｎｆＧｌｕＡ２タンパク質を種子に蓄積させることが示唆された。
【0089】
（形質）
以下の項目について、ａ１２３とＯｓＮＶ３とを比較した。
・出穂期等（出穂開始日、出穂期、穂ぞろい期）
・草型（稈長、穂長、穂数）
・一株粒数および稔実率
・花粉の充実度および直径
・脱粒性（出穂から４０日目の全穂を片手で握り、脱粒した種子の割合を調査した）
・アレロパシー活性
その結果、これらの全ての項目に関して、ＯｓＮＶ３と宿主である原品種との間で有意な差はみられなかった。
以下の項目について、ａ１２３とＯｓＮＶ３とを比較した。
・出穂期等（出穂開始日、出穂期、穂ぞろい期）
・草型（稈長、穂長、穂数）
・一株粒数および稔実率
・花粉の充実度および直径
・脱粒性（出穂から４０日目の全穂を片手で握り、脱粒した種子の割合を調査した）
・アレロパシー活性
その結果、これらの全ての項目に関して、ＯｓＮＶ３と宿主である原品種との間で有意な差はみられなかった。
【産業上の利用可能性】
【0090】
本発明は、食品としての利用が期待できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】