特許 7174385 膵臓がんを診断するためのラミニン２の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-11-09

(45)【発行日】2022-11-17

(54)【発明の名称】膵臓がんを診断するためのラミニン２の使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20221110BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20221110BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N33/574 A

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021000357

(22)【出願日】2021-01-05

(62)【分割の表示】P 2018516096の分割

【原出願日】2016-09-28

(65)【公開番号】P2021060418

(43)【公開日】2021-04-15

【審査請求日】2021-02-01

(31)【優先権主張番号】62/233,745

(32)【優先日】2015-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/295,607

(32)【優先日】2016-02-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】000109015

【氏名又は名称】アボットジャパン合同会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504137912

【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】吉村 徹

(72)【発明者】

【氏名】吉田 栄作

(72)【発明者】

【氏名】越川 直彦

(72)【発明者】

【氏名】清木 元治

【審査官】海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１５／００７２３４９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１５－５２７５６２（ＪＰ，Ａ）

【文献】A Chan et al，Validation of biomarkers that complement CA19.9 in detecting early pancreatic cancer，Clinical Cancer Research，2014年09月19日，vol.20, no.22，5787-5795

【文献】Hari Kosanam et al，Laminin, gamma 2(LAMC2): a promising new putative pancreatic cancer biomarker identified by proteomic analysis of pancreatic adenocarcinoma tissues，Molecular & Cellular Proteomics，2013年06月24日，vol.12, no.10，2820-2832

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

膵臓がんの診断を必要とする対象における膵臓がんの診断を助ける方法であって、
（ａ）対象からの生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）のレベルを決定すること、並びに
（ｂ）ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の前記レベルを、それぞれ、ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の基準レベルと比較すること、
を含み、
ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の前記レベルが、それぞれ、ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の前記基準レベルより大きい場合は対象が膵臓がんを有することを示す、
方法。

【請求項2】

前記生物学的試料が、全血試料、血漿試料、血清試料、または尿である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の前記レベルが、免疫測定法を使用して決定される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡ、およびＣＡ１９－９の前記基準レベルが、それぞれ、対照試料中のラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡ、およびＣＡ１９－９のレベルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の前記基準レベルが、カットオフレベルである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記カットオフレベルが、複数の対照試料の平均値プラス２標準偏差解析により決定される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルが、キャリブレーター中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

ラミニンガンマ２単量体の前記レベルが、ラミニンガンマ２単量体に特異的に結合する２Ｈ２抗体を使用して決定される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

膵臓がんの検出を必要とする対象における膵臓がんを検出するためのキットであって、
（ａ）ラミニンガンマ２単量体にそれぞれ特異的に結合する１つ以上の抗体、
（ｂ）ＣＥＡにそれぞれ特異的に結合する１つ以上の抗体、および
（ｃ）ＣＡ１９－９にそれぞれ特異的に結合する１つ以上の抗体
を含み、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のそれぞれが、別々の容器中で提供される、キット。

【請求項10】

ラミニンガンマ２単量体に特異的に結合する２Ｈ２抗体を含む、請求項９に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、すべての全内容を参照により本明細書に完全に組み込む、２０１５年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２３３，７４５号および２０１６年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／２９５，６０７号の優先権を主張するものである。

【0002】

本開示は、患者における１種以上のバイオマーカーを検出すること、ならびにその量を決定することによる、患者における肝細胞癌または膵臓がんの予後、診断またはリスク特定を決定するための方法および免疫測定法プラットフォームに関する。１種以上のバイオマーカーは、肝細胞癌もしくは膵臓がんを有する患者を特定するために、肝細胞癌療法もしくは膵臓がん療法の候補としての患者を特定するために、肝細胞癌もしくは膵臓がんを発症する患者のリスクを分類するために、または肝細胞癌もしくは膵臓がんの患者の病期もしくは進行のリスクを分類するために、ならびに診断、予後もしくは治療レジメンを決定するために用いることができる。

【背景技術】

【0003】

がんは、例えば、肝細胞癌および膵臓がんなどの、多くの形態で発生する疾患である。肝細胞癌は、最も一般的な形態の肝がんであり、ウイルス性肝炎および／または肝硬変にしばしば続発する。肝細胞癌の検出は、多くの症状が肝臓疾患に伴う症状と重なるため困難であり得る。場合によって、肝細胞癌は、腹部撮像および／または針生検によって検出することができる。

【0004】

膵臓がんは、早期に検出することが困難であり、急速に広がるため、がんに起因する死亡の主要な原因である。したがって、膵臓がんの検出は、一般的にがんの進行期における症状が出現するまで、行われない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、肝細胞癌および膵臓がんのより早期および／またはより正確な検出を可能にする方法を特定する必要性が本技術分野において存在する。

【課題を解決するための手段】

【0006】

（発明の要旨）
一実施形態において、本発明は、それを必要とする対象における肝細胞癌（ＨＣＣ）を診断する方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得ること、（ｂ）生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定すること、（ｃ）ラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと比較すること、および（ｄ）ラミニンガンマ２単量体のレベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きい場合に対象をＨＣＣを有すると特定することを含む、方法に関する。

【0007】

他の態様において、本発明は、対象が肝細胞癌（ＨＣＣ）を有するまたは発症するリスクがあるかを判定する方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得ること、（ｂ）生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを測定すること、（ｃ）ラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと比較すること、および（ｄ）ラミニンガンマ２単量体のレベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きい場合に対象がＨＣＣを有するまたは発症するリスクがあると判定することを含む、方法に関する。

【0008】

他の態様において、本発明は、それを必要とする対象における肝細胞癌（ＨＣＣ）の進行をモニターする方法であって、（ａ）対象から第１および第２の生物学的試料を得ること、（ｂ）第１の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第１のレベルおよび第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第２のレベルを測定すること、（ｃ）ラミニンガンマ２単量体の第１および第２のレベルを比較すること、ならびに（ｄ）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体の第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の第１のレベルより大きい場合に対象におけるＨＣＣが進行したまたは（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体の第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の第１のレベルと同等もしくはより小さい場合に対象におけるＨＣＣが進行しなかったと判定することを含む、方法に関する。

【0009】

他の態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＨＣＣを検出するためのキットであって、ラミニンガンマ２単量体を検出するための１つ以上の試薬を含む、キットに関する。

【0010】

他の態様において、本発明は、それを必要とする対象における肝細胞癌（ＨＣＣ）を診断する方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得ること、（ｂ）（ｉ）生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルおよびビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ－ＩＩ）（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）のレベル、（ｉｉ）生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルおよびアルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）のレベルまたは（ｉｉｉ）生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベル、ＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルおよびＡＦＰのレベルを決定すること、（ｃ）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルとおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルをＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルと、（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルとおよびＡＦＰのレベルをＡＦＰの基準レベルとまたは（ｉｉｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと、ＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルをＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルとおよびＡＦＰのレベルをＡＦＰの基準レベルと比較すること、ならびに（ｄ）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きく、およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルがＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルより大きい、（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きく、およびＡＦＰのレベルがＡＦＰの基準レベル大きいまたは（ｉｉｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きく、ＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルがＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルより大きく、およびＡＦＰのレベルがＡＦＰの基準レベルより大きい場合に対象をＨＣＣを有すると特定することを含む、方法に関する。

【0011】

他の態様において、本発明は、対象が肝細胞癌（ＨＣＣ）を有するまたは発症するリスクがあるかどうかを判定する方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得ること、（ｂ）（ｉ）生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベル、（ｉｉ）生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルおよびＡＦＰのレベルまたは（ｉｉｉ）生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベル、ＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルおよびＡＦＰのレベルを測定すること、（ｃ）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルとおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルをＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルと、（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルとおよびＡＦＰのレベルをＡＦＰの基準レベルとまたは（ｉｉｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと、ＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルをＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルとおよびＡＦＰのレベルをＡＦＰの基準レベルと比較すること、ならびに（ｄ）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きく、ＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルがＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルより大きい、（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きく、ＡＦＰのレベルがＡＦＰの基準レベル大きいまたは（ｉｉｉ）ラミニンガンマ２単量体のレベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きく、ＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルがＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルより大きく、ＡＦＰのレベルがＡＦＰの基準レベルより大きい場合に対象が肝細胞癌（ＨＣＣ）を有するまたは発症するリスクがあると判定することを含む、方法。

【0012】

他の態様において、本発明は、それを必要とする対象における肝細胞癌（ＨＣＣ）の進行をモニターする方法であって、（ａ）対象から第１および第２の生物学的試料を得ること、（ｂ）（ｉ）第１の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第１のレベルおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの第１のレベルならびに第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第２のレベルおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの第２のレベル、（ｉｉ）第１の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第１のレベルおよびＡＦＰの第１のレベルならびに第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第２のレベルおよびＡＦＰの第２のレベルまたは（ｉｉｉ）第１の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第１のレベル、ＰＩＶＫＡ－ＩＩの第１のレベルおよびＡＦＰの第１のレベルならびに第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第２のレベル、ＰＩＶＫＡ－ＩＩの第２のレベルおよびＡＦＰの第２のレベルを測定すること、（ｃ）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体の第１および第２のレベルをならびにＰＩＶＫＡ－ＩＩの第１および第２のレベルを、（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体の第１および第２のレベルをならびにＡＦＰの第１および第２のレベルをまたは（ｉｉｉ）ラミニンガンマ２単量体の第１および第２のレベルを、ＰＩＶＫＡ－ＩＩの第１および第２のレベルをならびにＡＦＰの第１および第２のレベルを比較すること、ならびに（ｄ）（１）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体の第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の第１のレベルより大きく、ＰＩＶＫＡ－ＩＩの第２のレベルがＰＩＶＫＡ－ＩＩの第１のレベルより大きい、（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体の第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の第１のレベルより大きく、ＡＦＰの第２のレベルがＡＦＰの第１のレベルより大きい、もしくは（ｉｉｉ）ラミニンガンマ２単量体の第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の第１のレベルより大きく、ＰＩＶＫＡ－ＩＩの第２のレベルがＰＩＶＫＡ－ＩＩの第１のレベルより大きく、ＡＦＰの第２のレベルがＡＦＰの第１のレベルより大きい場合に対象におけるＨＣＣが進行したと、または（２）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体の第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の第１のレベルと同等もしくはより低く、ＰＩＶＫＡ－ＩＩの第２のレベルがＰＩＶＫＡ－ＩＩの第１のレベルと同等もしくはより小さい、（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体の第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の第１のレベルと同等もしくはより低く、ＡＦＰの第２のレベルがＡＦＰの第１のレベルと同等もしくはより小さい、もしくは（ｉｉｉ）ラミニンガンマ２単量体の第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の第１のレベルと同等もしくはより低く、ＰＩＶＫＡ－ＩＩの第２のレベルがＰＩＶＫＡ－ＩＩの第１のレベルと同等もしくはより低く、ＡＦＰの第２のレベルがＡＦＰの第１のレベルと同等もしくはより小さい場合に対象におけるＨＣＣが進行しなかったと判定することを含む、方法に関する。

【0013】

他の態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＨＣＣを検出するためのキットであって、（ｉ）ラミニンガンマ２単量体を検出するための１つ以上の試薬およびＰＩＶＫＡ－ＩＩを検出するための１つ以上の試薬、（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体を検出するための１つ以上の試薬およびＡＦＰを検出するための１つ以上の試薬または（ｉｉｉ）ラミニンガンマ２単量体を検出するための１つ以上の試薬、ＰＩＶＫＡ－ＩＩを検出するための１つ以上の試薬およびＡＦＰを検出するための１つ以上の試薬を含む、キットに関する。

【0014】

他の態様において、本発明は、それを必要とする対象における膵臓がんを診断する方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得ること、（ｂ）生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定すること、（ｃ）がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される、生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定すること、（ｄ）ラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと、および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを少なくとも１つの追加のバイオマーカーの連勝レベルと比較すること、ならびに（ｅ）ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルがラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルより大きい場合に対象が膵臓がんを有すると特定することを含む、方法に関する。

【0015】

他の態様において、本発明は、対象が膵臓がんを有するまたは発症するリスクがあるかどうかを判定する方法であって、（ａ）対象から生物学的試料を得ること、（ｂ）生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを測定すること、（ｃ）がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される、生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを測定すること、（ｄ）ラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと、および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルと比較すること、ならびに（ｅ）ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルがラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルより大きい場合に対象が膵臓がんを有するまたは発症するリスクがあると判定することを含む、方法に関する。

【0016】

他の態様において、本発明は、それを必要とする対象における膵臓がんの進行をモニターする方法であって、（ａ）対象から第１および第２の生物学的試料を得ること、（ｂ）第１の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第１のレベルおよび第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第２のレベルを測定すること、（ｃ）第１の生物学的試料中の、がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される、少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第１のレベルならびに第２の生物学的試料中の、がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される、少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第２のレベルを測定すること、（ｄ）ラミニンガンマ２単量体の第１および第２のレベルを比較すること、（ｅ）少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第１および第２のレベルを比較すること、ならびに（ｆ）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第２のレベルがラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第１のレベルより大きい場合に対象における膵臓がんが進行したと、または（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第２のレベルがラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第１のレベルと同等もしくはより小さい場合に対象における膵臓がんが進行しなかったと判定することを含む、方法に関する。

【0017】

他の態様において、本発明は、それを必要とする対象における膵臓がんを検出するためのキットであって、（ａ）ラミニンガンマ２単量体を検出するための１つ以上の試薬および（ｂ）がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される、少なくとも１つの追加のバイオマーカーを検出するための１つ以上の試薬を含む、キットに関する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】ラミニンガンマ２単量体濃度（ｐｇ／ｍＬ）を相対光単位（ＲＬＵ）に対してプロットしたグラフを示す。具体的には、各グラフに実施例２で述べる免疫測定法用の代表的な較正曲線を示す。左側のグラフについては、ラミニンガンマ２単量体濃度は、０ｐｇ／ｍＬ－２００００ｐｇ／ｍＬである。右側のグラフについては、ラミニンガンマ２単量体濃度は、０ｐｇ／ｍＬ－１００ｐｇ／ｍＬである。各較正曲線は、３つの反復実験により得られた。

【図2A】対象の群をラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）に対してプロットしたグラフを示す。各対象群について、括弧内の数は、当該群における対象の数を表し、実線は、当該群のラミニンガンマ２単量体の平均血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。ｘ軸の全長に広がる実線は、８１．３ｐｇ／ｍＬであった、健常ドナー対象群の平均値＋２標準偏差（平均値＋２ＳＤ）を表す。

【図2B】対象の群をラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）に対してプロットしたグラフを示す。各対象群について、括弧内の数は、当該群における対象の数を表し、実線は、当該群のラミニンガンマ２単量体の平均血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。ｘ軸の全長に広がる実線は、７９．５ｐｇ／ｍＬであった、健常ドナー対象群の平均値＋２標準偏差（平均値＋２ＳＤ）を表す。矢印は、指定されたＡＦＰおよびＣＡ１９－９濃度に対する対象を特定したものであった。

【図2C】対象の群をラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）に対してプロットしたグラフを示す。各対象群について、括弧内の数は、当該群における対象の数を表し、実線は、当該群のラミニンガンマ２単量体の平均血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。ｘ軸の全長に広がる実線は、７５．９ｐｇ／ｍＬであった、ＲＯＣ分析により得られたカットオフ値を表す。

【図2D】対象の群をラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）に対してプロットしたグラフを示す。各対象群について、括弧内の数は、当該群における対象の数を表し、実線は、当該群のラミニンガンマ２単量体の平均血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。ｘ軸の全長に広がる実線は、７５．９ｐｇ／ｍＬであった、ＲＯＣ分析により得られたカットオフ値を表す。矢印は、指定されたＡＦＰおよびＣＡ１９－９濃度に対する対象を特定したものであった。

【図3A】対象の群をラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）に対してプロットしたグラフを示す。「Ｉ」、「ＩＩ」、「ＩＩＩ」および「ＩＶ」という表示は、それぞれＩ期ＨＣＣ、ＩＩ期ＨＣＣ、ＩＩＩ期ＨＣＣおよびＩＶ期ＨＣＣを有する対象群を表した。「ＬＣ」は、肝硬変を表し、「ＣＨ」は、肝炎を示した。各対象群について、括弧内の数は、当該群における対象の数を表し、実線は、当該群のラミニンガンマ２単量体の平均血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。ｘ軸の全長に広がる実線は、７９．５ｐｇ／ｍＬであった、健常ドナー対象群の平均値＋２標準偏差（平均値＋２ＳＤ）を表した。矢印は、指定されたＡＦＰ濃度に対する対象を特定したものであった。

【図3B】対象の群をラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）に対してプロットしたグラフを示す。「Ｉ」、「ＩＩ」、「ＩＩＩ」および「ＩＶ」という表示は、それぞれＩ期ＨＣＣ、ＩＩ期ＨＣＣ、ＩＩＩ期ＨＣＣおよびＩＶ期ＨＣＣを有する対象群を表した。「ＬＣ」は、肝硬変を表し、「ＣＨ」は、肝炎を示した。各対象群について、括弧内の数は、当該群における対象の数を表し、実線は、当該群のラミニンガンマ２単量体の平均血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表した。ｘ軸の全長に広がる実線は、７９．５ｐｇ／ｍＬであった、ＲＯＣ分析により得られたカットオフ値を表す。矢印は、指定されたＡＦＰ濃度に対する対象を特定したものであった。

【図4A】ＨＣＣを有する対象を肝硬変（ＬＣ）、肝炎（ＣＨ）および健常ドナー対象と比較した、ラミニンガンマ２単量体（Ｌｎ－γ２）、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰマーカーの受診者動作特性（ＲＯＣ）グラフを示す。

【図4B】ＨＣＣを有する対象を健常ドナー対象と比較した、ラミニンガンマ２単量体（Ｌｎ－γ２）、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰマーカーの受診者動作特性（ＲＯＣ）グラフを示す。

【図4C】ＨＣＣを有する対象を肝炎（ＣＨ）と比較した、ラミニンガンマ２単量体（Ｌｎ－γ２）、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰマーカーの受診者動作特性（ＲＯＣ）グラフを示す。

【図5A】ＨＣＣならびにカットオフ値（７９．５ｐｇ／ｍＬ、健常ドナー群の平均値＋２ＳＤ）と比較してラミニンガンマ２単量体（Ｌｎ－γ２）、ＡＦＰおよび／またはＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルの上昇を有する対象のベン図を示す。各百分率値は、各カットオフ値と比較して表示したマーカーのレベルの上昇を有していたＨＣＣ対象の百分率を表した。

【図5B】ＨＣＣならびにカットオフ値（７５．９ｐｇ／ｍＬ、ＲＯＣ分析から得られた）と比較してラミニンガンマ２単量体（Ｌｎ－γ２）、ＡＦＰおよび／またはＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルの上昇を有する対象のベン図を示す。各百分率値は、各カットオフ値と比較して表示したマーカーのレベルの上昇を有していたＨＣＣ対象の百分率を表した。

【図5C】ＨＣＣならびにカットオフ値（１１６．６ｐｇ／ｍＬ、ＨＣＣを非悪性慢性肝疾患と区別する最適なカットオフ値）と比較してラミニンガンマ２単量体（Ｌｎ－γ２）、ＡＦＰおよび／またはＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルの上昇を有する対象のベン図を示す。各百分率値は、各カットオフ値と比較して表示したマーカーのレベルの上昇を有していたＨＣＣ対象の百分率を表した。

【図6A】対象の群をラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）に対してプロットしたグラフを示す。「ＩＩＩ」および「ＩＶ」という表示は、それぞれＩＩＩ期膵臓がんおよびＩＶ期膵臓がんを有する対象群を表した。各対象群について、括弧内の数は、当該群における対象の数を表し、実線は、当該群のラミニンガンマ２単量体の平均血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表した。ｘ軸の全長に広がる実線は、７９．５ｐｇ／ｍＬであった、健常ドナー対象群の平均値＋２標準偏差（平均値＋２ＳＤ）を表した。

【図6B】対象の群をラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）に対してプロットしたグラフを示す。「ＩＩＩ」および「ＩＶ」という表示は、それぞれＩＩＩ期膵臓がんおよびＩＶ期膵臓がんを有する対象群を表した。各対象群について、括弧内の数は、当該群における対象の数を表し、実線は、当該群のラミニンガンマ２単量体の平均血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表した。ｘ軸の全長に広がる実線は、７５．９ｐｇ／ｍＬであった、ＲＯＣ分析により得られたカットオフ値を表した。

【図7】膵臓がんを有する対象を膵臓炎を有する対象および健常ドナー対象と比較した、ラミニンガンマ２単量体（Ｌｎ－γ２）、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９マーカーの受診者動作特性（ＲＯＣ）グラフを示す。

【図8】膵臓がんならびにカットオフ値と比較してラミニンガンマ２単量体（Ｌｎ－γ２）、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルの上昇を有する対象のベン図を示す。各百分率値は、各カットオフ値と比較して表示したマーカーのレベルの上昇を有していた膵臓がん対象の百分率を表した。

【図9】正常対象（対照）（ｎ＝５２）、慢性肝疾患（ＣＬＤ）を有する患者（ｎ＝２４）およびＨＣＣを有する患者（ｎ＝５７）からの血清試料中の測定された血清Ｌｎ－γ２濃度の散布図を示す。水平直線は、濃度の中央値を表す。略語：Ｌｎ－γ２、ラミニンγ２

【図10】正常対象（対照）（ｎ＝５２）、慢性肝疾患を有する患者（ｎ＝２４）およびＨＣＣを有する患者（ｎ＝５７）からの血清試料中の測定された血清ＡＦＰ濃度の散布図を示す。略語：ＣＬＤ、慢性肝疾患；ＨＣＣ、肝細胞癌；ＡＦＰ、アルファ胎児型タンパク質；ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ビタミンＫ欠乏により誘導されたプロトロンビン－ＩＩ；ＳＥ、標準誤差

【図11】正常対象（対照）（ｎ＝５２）、慢性肝疾患を有する患者（ｎ＝２４）およびＨＣＣを有する患者（ｎ＝５７）からの血清試料中の測定された血清ＰＩＶＫＡ－ＩＩ濃度の散布図を示す。水平直線は、濃度の中央値を表す。略語：ＣＬＤ、慢性肝疾患；ＨＣＣ、肝細胞癌；ＡＦＰ、アルファ胎児型タンパク質；ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ビタミンＫ欠乏により誘導されたプロトロンビン－ＩＩ；ＳＥ、標準誤差

【図12】ＴＮＭ分類に基づく腫瘍の病期分類別のＬｎ－γ２値を示すグラフである。水平直線は、濃度の中央値を表す。略語：ＣＬＤ、慢性肝疾患

【図13】ＴＮＭ分類に基づく腫瘍の病期分類別のＡＦＰ値を示すグラフである。水平直線は、濃度の中央値を表す。略語：ＣＬＤ、慢性肝疾患

【図14】ＴＮＭ分類に基づく腫瘍の病期分類別のＰＩＶＫＡ－ＩＩ値を示すグラフである。水平直線は、濃度の中央値を表す。略語：ＣＬＤ、慢性肝疾患

【発明を実施するための形態】

【0019】

本開示は、肝細胞癌および／または膵臓がんを検出するためのバイオマーカーに関する。本開示は、対象における肝細胞癌または膵臓がんを診断し、予知し、そのリスクを分類し、その進行をモニターするための、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９－９またはそれらの組合せのレベルを解析することまたは定量することを対象とする。肝細胞癌を検出するためのバイオマーカーは、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰまたはそれらの組合せであり得る。膵臓がんを検出するためのバイオマーカーは、ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡ、ＣＡ１９－９またはそれらの組合せであり得る。

【0020】

本開示は、ラミニンガンマ２単量体バイオマーカーを用いて、肝細胞癌および／または膵臓がんを有する患者を、特定するもしくは診断する助けとすることを含む、特定するもしくは診断することができ、患者が肝細胞癌および／または膵臓がんに罹患しているかどうかを特定するもしくは特定する助けとすることができ、肝細胞癌および／または膵臓がんを発症する患者のリスクを分類することができ、ならびに診断、予後もしくは治療レジメンを決定するもしくは決定する助けとすることができる、方法を開示する。ラミニンガンマ２単量体のレベルは、肝細胞癌もしくは膵臓がんに罹患しているまたは罹患するリスクがある対象において肝細胞癌もしくは膵臓がんに罹患していないまたは罹患するリスクがない対象と比較してより高い。ラミニンガンマ２単量体のレベルは、進行期の肝細胞癌もしくは膵臓がんにより増加し得る。本明細書で述べる方法は、肝細胞癌および／または膵臓がんに罹患している患者を、特定するもしくは診断する助けとすることを含む、特定し、診断するためにＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９－９またはそれらの組合せのような、他のバイオマーカーと共に用いることがきる。

【0021】

この項および本明細書における全開示において用いる項の見出しは、単に構成の目的のためのものであり、限定的なものではない。

【0022】

１． 定義
別途定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。不一致の場合、定義を含む、本文書が優先する。本明細書で述べるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料を以下で述べる。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体として参照により組み込む。本明細書で開示する材料、方法および実施例は、例示的なものであるにすぎず、限定的なものではない。

【0023】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「を有する」、「有する」、「できる」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語およびそれらの変形形態は、本明細書で用いているように、追加の行為または構造の可能性を排除しない開放移行句、用語または語であるものとする。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、前後関係から明らかでない限り、複数の意味を含む。本開示は、明確に示されているか否かを問わず、本明細書で示す実施形態または要素を「含む」、「からなる」および「から本質的になる」他の実施形態も予期する。

【0024】

本明細書における数値範囲の列挙について、同じ精度を有する間に存在する各介在する数が明確に予期される。例えば、６－９の範囲については、７および８の数が６および９に加えて予期され、６．０－７．０の範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明確に予期される。

【0025】

「曲線下面積」または「ＡＵＣ」は、ＲＯＣ曲線の下の面積を意味する。ＲＯＣ曲線下のＡＵＣは、正確さの尺度である。１の面積は、完全な検査（ｐｅｒｆｅｃｔ ｔｅｓｔ）を表すのに対して、０．５の面積は、無意味な検査（ｉｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｅｓｔ）を表す。好ましいＡＵＣは、少なくとも約０．７００、少なくとも約０．７５０、少なくとも約０．８００、少なくとも約０．８５０、少なくとも約０．９００、少なくとも約０．９１０、少なくとも約０．９２０、少なくとも約０．９３０、少なくとも約０．９４０、少なくとも約０．９５０、少なくとも約０．９６０、少なくとも約０．９７０、少なくとも約０．９８０、少なくとも約０．９９０または少なくとも約０．９９５であり得る。

【0026】

「がん」は、本明細書で用いているように体内の異常な細胞が制御されず、調節されない増殖を指す。がん性細胞は、悪性細胞とも呼ばれる。がんは、身体の隣接部位を侵し、リンパ系または血流を介して身体のより遠隔な部位にも広がり得る。がんは、副腎皮質癌、肛門がん、膀胱がん、脳腫瘍、乳がん、カルチノイド腫瘍、消化管原発不明癌、子宮頚がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、肝外胆管がん、ユーイング腫瘍（ＰＮＥＴ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼内黒色腫、眼のがん、胆嚢がん、胃がん（胃）、性腺外胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、頭頸部がん、下咽頭がん、島細胞癌、腎臓がん（腎細胞がん）、喉頭がん、急性リンパ芽球性白血病、白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、口唇がんおよび口腔がん、肝臓がん（肝細胞癌を含む）、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系（原発）リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、悪性中皮腫、黒色腫、メルケル細胞癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、多発性骨髄腫および他の形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻咽頭がん、骨髄芽細胞腫、口腔がん、口咽頭がん、骨肉腫、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵外分泌部のがん、島細胞癌、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、形質細胞腫瘍、前立腺がん、横紋筋肉腫、直腸がん、腎細胞がん（腎臓のがん）、腎盂および尿管移行上皮細胞、唾液腺がん、セザリー症候群、皮膚がん、小腸がん、軟組織肉腫、精巣がん、悪性胸腺腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、まれな小児がん、膣がん、外陰がんならびにウィルムス腫瘍を含み得るが、これらに限定されない。

【0027】

「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」、「複数の成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」または「少なくとも１つの成分」は、一般的に、本明細書で述べる方法および当技術分野で公知の方法に従って、患者の尿、血清または血漿試料のような試験試料のアッセイ用のキットに含めることができる捕捉抗体、検出またはコンジュゲート、キャリブレーター、対照、感度パネル、容器、緩衝液、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液としての）、停止溶液などを意味する。いくつかの成分は、アッセイ用に溶液中に存在または再構成のために凍結乾燥させ得る。

【0028】

「対照対象」は、本明細書で用いているように健常対象、すなわち、肝細胞癌、膵臓がんまたは肝細胞癌もしくは膵臓がん以外のがんの臨床徴候または症状を有さない対象を意味する。対照対象は、肝細胞癌、膵臓がんまたは肝細胞癌もしくは膵臓がん以外のがんのさもなければ検出されない臨床徴候または症状について臨床的に評価され、その評価は、定期健康診断および／または臨床検査を含み得る。

【0029】

「対照群」は、本明細書で用いているように対照対象または健常対象の群、すなわち、肝細胞癌、膵臓がんまたは肝細胞癌もしくは膵臓がん以外のがんの臨床徴候または症状を有さない対象の群を意味する。

【0030】

「標識」および「検出可能な標識」は、本明細書で用いているように抗体と分析物との反応を検出可能にするために抗体または分析物に結合させた部分を意味し、そのように標識された抗体または分析物は、「検出可能に標識された」と呼ばれる。標識は、視覚または計測による手段によって検出可能であるシグナルを発生させ得る。様々な標識は、色原体、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物などのような、シグナル発生物質を含む。標識の代表的な例は、光を発生する部分、例えば、アクリジニウム化合物および蛍光を発生する部分、例えば、フルオレセインを含む。他の標識は、本明細書に記載されている。この点に関して、該部分は、それ自体、検出可能であり得ないが、他の部分との反応により検出可能になり得る。「検出可能に標識された」という用語の使用は、そのような標識化を含むものとする。

【0031】

当技術分野で公知である適切な検出可能な標識を用いることができる。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏおよび１５３Ｓｍのような）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼなどのような）、化学発光標識（アクリジニウムエステル、チオエステルまたはスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステルなどのような）、蛍光標識（フルオレセイン（例えば、５－フルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン、３，６－カルボキシフルオレセイン、５（６）－カルボキシフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、６－テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど）のような）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ－フィコエリスリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛キャップカドミウムセレニド）、温度測定標識または免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識、標識手順および標識の検出の概論は、ＰｏｌａｋおよびＶａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎにより出版された総合ハンドブックおよびカタログである、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）に見いだされる。蛍光標識は、ＦＰＩＡに用いることができる（例えば、それらの全体として参照により本明細書に組み込む、米国特許第５，５９３，８９６号、第５，５７３，９０４号、第５，４９６，９２５号、第５，３５９，０９３号および第５，３５２，８０３号参照）。アクリジニウム化合物は、均一系化学発光アッセイにおける検出可能標識として用いることができる（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １６巻、１３２４－１３２８頁（２００６）； Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． ４巻、２３１３－２３１７頁（２００４）； Ａｄａｍｃｚｙｋら、 Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ． １４巻、３９１７－３９２１頁（２００４）；およびＡｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． ５巻、３７７９－３７８２頁（２００３）参照）。

【0032】

一態様において、アクリジニウム化合物は、アクリジニウム－９－カルボキサミドである。アクリジニウム－９－カルボキサミドを調製する方法は、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ、Ｊ． Ｂｉｏｌｕｍｉｎ． Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ． ６巻、１０７－１１４頁（１９９１）； Ａｄａｍｃｚｙｋら、 Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ６３巻、５６３６－５６３９頁（１９９８）； Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５５巻、１０８９９－１０９１４頁（１９９９）； Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． １巻、７７９－７８１頁（１９９９）； Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． １１巻、７１４－７２４頁（２０００）； Ｍａｔｔｉｎｇｌｙら、 Ｉｎ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ； Ｄｙｋｅ， Ｋ． Ｖ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ： Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、７７－１０５頁（２００２）； Ａｄａｍｃｚｙｋら、Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ． ５巻、３７７９－３７８２頁（２００３）；ならびに米国特許第５，４６８，６４６号、第５，５４３，５２４号および第５，７８３，６９９号（それぞれがそれに関するその教示についてその全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。

【0033】

アクリジニウム化合物の他の例は、アクリジニウム－９－カルボキシレートアリールエステルである。式ＩＩのアクリジニウム－９－カルボキシレートアリールエステルの例は、１０－メチル－９－（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホネート（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩから入手可能）である。アクリジニウム－９－カルボキシレートアリールエステルを調製する方法は、ＭｃＣａｐｒａら、 Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ４巻、１１１１－２１頁（１９６５）； Ｒａｚａｖｉら、 Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ １５巻、２４５－２４９頁（２０００）； Ｒａｚａｖｉら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ １５巻、２３９－２４４頁（２０００）； および米国特許第５，２４１，０７０号（それぞれがそれに関するその教示についてその全体として参照により本明細書に組み込む）に記載されている。そのようなアクリジニウム－９－カルボキシレートアリールエステルは、シグナルの強度および／またはシグナルの速度に関して、少なくとも１つのオキシダーゼによる分析物の酸化で生成する過酸化水素の効率の良い化学発光指示薬である。アクリジニウム－９－カルボキシレートアリールエステルの化学発光過程は、速やかに、すなわち、１秒未満に完了するが、アクリジニウム－９－カルボキサミドの化学発光は、２秒以上に及ぶ。しかし、アクリジニウム－９－カルボキシレートアリールエステルは、タンパク質の存在下でその化学発光特性を失う。したがって、それらを使用するには、シグナルの発生および検出時にタンパク質が存在しないことが要求される。試料中のタンパク質を分離または除去する方法は、当業者に周知であり、限外濾過、抽出、沈殿、透析、クロマトグラフィーおよび／または消化を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｗｅｌｌｓ、Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００３）参照）。試験試料から除去されたまたは分離されたタンパク質の量は、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％であり得る。アクリジニウム－９－カルボキシレートアリールエステルおよびその使用に関するさらなる詳細は、２００７年４月９日に出願された米国特許出願公開第１１／６９７，８３５号に示されている。アクリジニウム－９－カルボキシレートアリールエステルは、脱気無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または水性コール酸ナトリウムのような適切な溶媒に溶解することができる。

【0034】

「肝細胞癌の病期を分類するためのＴＮＭシステム」または「ＨＣＣの病期を分類するためのＴＮＭシステム」は、本明細書で互換的に用い、肝細胞癌（ＨＣＣ）の病期を分類するためのシステムを意味する。「Ｔ」は、センチメートル（ｃｍ）で測定された、原発腫瘍の数およびサイズ、ならびにがんが隣接する血管または臓器中に成長したかどうかを表す。「Ｎ」は、隣接する（局所）リンパ節への広がりの程度を表す。「Ｍ」は、がんが身体の遠隔部位に転移した（広がった）かどうかを示す。数または文字が「Ｔ」、「Ｎ」および「Ｍ」の後に出現して、これらの因子のそれぞれに関するより詳細を示し得る。具体的には、数０－４は、増加しつつある重症度を示す。文字「Ｘ」は、情報が得られなかったため「評価することができない」を示す。

【0035】

「Ｔ」群は、「ＴＸ」、「Ｔ０」、「Ｔ１」、「Ｔ２」、「Ｔ３ａ」、「Ｔ３ｂ」および「Ｔ４」であり得る。「ＴＸ」は、原発腫瘍を評価することができないことを示す。「Ｔ０」は、原発腫瘍の証拠なしを示す。「Ｔ１」は、血管中に成長しなかった単独の腫瘍（任意サイズ）を示す。「Ｔ２」は、血管中に成長した単独の腫瘍（任意サイズ）を示すまたは１つ以上の腫瘍であるが、どの腫瘍も直径で５ｃｍ（約２インチ）より大きくないことを示す。「Ｔ３ａ」は、直径で５ｃｍより大きい少なくとも１つの腫瘍を含む、１つ以上の腫瘍を示す。「Ｔ３ｂ」は、肝臓の大静脈（門脈または肝静脈）の主要な枝中に成長した少なくとも１つの腫瘍（任意サイズ）を示す。「Ｔ４」は、腫瘍（任意サイズ）が隣接臓器（胆嚢以外）中に成長したことまたは腫瘍が肝臓を覆う組織の薄い層（臓側腹膜と呼ばれる）中に成長していることを示す。

【0036】

「Ｎ」群は、「ＮＸ」、「Ｎ０」および「Ｎ１」であり得る。「ＮＸ」は、局所（隣接）リンパ節を評価することができないことを示す。「Ｎ０」は、がんが局所リンパ節に広がらなかったことを示す。「Ｎ１」は、がんが局所リンパ節に広がったことを示す。

【0037】

「Ｍ」群は、「Ｍ０」および「Ｍ１」であり得る。「Ｍ０」は、遠隔リンパ節または他の臓器に広がらなかったことを示す。「Ｍ１」は、がんが遠隔リンパ節または臓器に広がったことを示す。肝細胞癌を含む、肝がんは、腹部の内層（腹膜）、肺および骨に広がり得る。

【0038】

「Ｉ期肝細胞癌」および「Ｉ期ＨＣＣ」は、本明細書で互換的に用いているように、Ｔ１、Ｎ０およびＭ０のＴＮＭ分類を示す。血管中に成長しなかった単独の腫瘍（任意サイズ）が存在する。がんは、隣接リンパ節または遠隔部位に広がらなかった。

【0039】

「ＩＩ期肝細胞癌」および「ＩＩ期ＨＣＣ」は、本明細書で互換的に用いているように、Ｔ２、Ｎ０およびＭ０のＴＮＭ分類を示す。血管中に成長した単独の腫瘍（任意サイズ）が存在するまたはいくつかの腫瘍が存在し、すべてが直径で５ｃｍ（２インチ）またはそれ未満である。がんは、隣接リンパ節または遠隔部位に広がらなかった。

【0040】

「ＩＩＩＡ期肝細胞癌」および「ＩＩＩＡ期ＨＣＣ」は、本明細書で互換的に用い、Ｔ３ａ、Ｎ０およびＭ０のＴＮＭ分類を示す。１つ以上の腫瘍が存在し、少なくとも１つの腫瘍が直径で５ｃｍ（２インチ）より大きい。がんは、隣接リンパ節または遠隔部位に広がらなかった。

【0041】

「ＩＩＩＢ期肝細胞癌」および「ＩＩＩＢ期ＨＣＣ」は、本明細書で互換的に用いているように、Ｔ３ｂ、Ｎ０およびＭ０のＴＮＭ分類を示す。少なくとも１つの腫瘍が肝臓の主要な静脈（門脈または肝静脈）の枝中に成長している。がんは、隣接リンパ節または遠隔部位に広がらなかった。

【0042】

「ＩＩＩＣ期肝細胞癌」および「ＩＩＩＣ期ＨＣＣ」は、本明細書で互換的に用い、Ｔ４、Ｎ０およびＭ０のＴＮＭ分類を示す。腫瘍が隣接臓器（胆嚢以外）中に成長しているまたは腫瘍が肝臓を覆う外膜（ｏｕｔｅｒ）中に成長した。がんは、隣接リンパ節または遠隔部位に広がらなかった。

【0043】

「ＩＶＡ期肝細胞癌」および「ＩＶＡ期ＨＣＣ」は、本明細書で互換的に用いているように、任意のＴ、Ｎ１およびＭ０のＴＮＭ分類を示す。肝臓における腫瘍は、あらゆるサイズまたは数であり得、腫瘍は、血管または隣接臓器中に成長し得た。がんは、隣接リンパ節に広がった。がんは、遠隔部位に広がらなかった。

【0044】

「ＩＶＢ期肝細胞癌」および「ＩＶＢ期ＨＣＣ」は、本明細書で互換的に用い、任意のＴ、任意のＮおよびＭ１のＴＮＭ分類を示す。がんは、身体の他の部位に広がった。腫瘍は、あらゆるサイズまたは数であり得、隣接リンパ節は、罹患していてもしていなくてもよい。

【0045】

「肝がん」は、本明細書で用いているように肝臓で発生するがんを意味する。肝がんは、肝細胞癌（ＨＣＣ）および線維層板型癌を含み得る。ほとんどの場合、肝がんの原因は、通常、肝臓の瘢痕化（すなわち、肝硬変）である。

【0046】

「肝硬変」は、本明細書で用いているように線維症、瘢痕組織および再生結節（すなわち、損傷組織が再生する過程のために発生し、肝機能の喪失につながる塊）による肝臓組織の置換を特徴とする慢性肝疾患の帰結を意味する。肝臓の機能単位の構造組織が破壊された状態になり、その結果、肝臓の血流が途絶し、肝機能が破綻した状態になる。肝硬変は、アルコール依存症、Ｂ型およびＣ型肝炎ならびに脂肪肝疾患によって最も一般的に引き起こされるが、多くの他の可能な原因を有する。いくつかの例は、特発性である（すなわち、原因不明のもの）。一旦肝硬変が発生したならば、門脈圧亢進症、肝不全および肝がんを含む、肝疾患の重篤な合併症が起こり得る。一旦肝硬変が発生し、硬変が前がん状態であると見なすべきであるならば、肝がんのリスクは、著しく増大する。硬変は、アルコールの乱用、肝臓の自己免疫疾患、ＢまたはＣ型肝炎ウイルス感染、長期（慢性）である肝臓の炎症および体内の鉄の過負荷（ヘモクロマトーシス）によって引き起こされ得る。ＢまたはＣ型肝炎を有する患者は、患者が硬変を発症しなかったとしても、肝がんのリスクがある。

【0047】

「肝疾患」は、本明細書で用いているように肝臓の損傷または疾患を意味する。肝機能不全の症状は、身体的徴候ならびに消化不良、血糖の問題、免疫障害、脂肪の異常吸収および代謝の問題に関連する様々な症状を含む。肝疾患は、肝線維症、肝硬変および肝がんを含む。すべての慢性肝疾患は、肝線維症の原因となり得る。慢性肝疾患は、慢性ウイルス性Ｂ型肝炎およびアルコール性肝疾患によって引き起こされ得る。

【0048】

「肝線維症」は、本明細書で用いているようにほとんどの種類の慢性肝疾患で起こるコラーゲンを含む細胞外マトリックスタンパク質の過剰な蓄積を指す。肝線維症は、損傷または疾病に対する肝臓の反応を表す瘢痕化過程である。肝線維症は、Ｂ型およびＣ型肝炎、寄生虫に起因する感染、過剰なアルコール使用ならびに医薬品を含む有毒な化学物質への曝露および胆管閉塞によって引き起こされ得る。進行肝線維症は、硬変、肝不全および門脈圧亢進症をもたらし、しばしば肝移植を必要とする。

【0049】

「新形成」は、本明細書で用いているように組織の異常な増殖を意味する。新形成は、一般的に腫瘍と呼ばれる。異常な増殖は、通常腫瘤を形成するが、必ずしもそうとは限らない。

【0050】

「正常対照」または「健常対照」は、本明細書で用いているように肝細胞癌、膵臓がんもしくはなんらかのがんを有さない、またはがんを発症するリスクがない、対象から採取された試料もしくは標本、または実際の対象を意味する。

【0051】

「正常」、「健常」および「対照」は、本明細書で互換的に用い、肝細胞癌、膵臓がんもしくはなんらかのがんを有さない、またはがんを発症するリスクがない、対象から採取された試料または対象を意味する。

【0052】

「良性膵疾患」および「膵疾患」は、本明細書で互換的に用いているように、がんでないまたはがんにならなかった膵疾患を意味する。良性膵疾患は、膵炎、様々な種類の嚢胞および腫瘍、膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）および膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）病変ならびに粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮ）を含む。

【0053】

「早期膵臓がん」は、本明細書で用いているように膵臓、膵臓外または隣接リンパ節に限定されるが、隣接する主要な血管もしくは神経または遠隔部位に拡大しなかった膵臓がんを意味する。早期膵臓がんは、０期、Ｉ期およびＩＩ期膵臓がんを含む。Ｙａｃｈｉｄａら（２０１０） Ｎａｔｕｒｅ ４６７巻、１１１４－１１１９頁を参照されたい。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ） Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２０１２ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａも参照されたい。

【0054】

「進行期膵臓がん」は、本明細書で用いているように隣接する主要な血管、神経または遠隔臓器に拡大した膵臓がんを意味する。進行期膵臓がんは、ＩＩＩ期またはＩＶ期膵臓がんを含む。

【0055】

「０期膵臓がん」は、本明細書で用いているように膵臓における細胞の単層に限られた膵臓がんを意味する。膵臓がんは、撮像検査でまたは裸眼で見えない。腫瘍は、膵管細胞の最上層に限定され、より深部の組織に浸潤していないまたは膵外に広がっていない。０期膵臓がんは、膵上皮内癌または膵上皮内腫瘍ＩＩＩ（ＰａｎＩｎ ＩＩＩ）と時折呼ばれる。

【0056】

「Ｉ期膵臓がん」は、本明細書で用いているように膵臓に限定されまたは限られ、隣接するリンパ節に広がらなかったがんを意味する。「ＩＡ期」は、膵臓に限定され、サイズが２ｃｍ未満である腫瘍を指す。「ＩＢ期」は、膵臓に限定され、サイズが２ｃｍより大きい腫瘍を指す。

【0057】

「ＩＩ期膵臓がん」は、本明細書で用いているように膵臓外に成長したまたは隣接リンパ節に広がった局所に広がるがんを意味する。「ＩＩＡ期」は、膵臓外に成長しているが、大血管、隣接リンパ節または遠隔部位に成長していない腫瘍を指す。「ＩＩＢ期」は、膵臓に限定されるまたは膵臓外に成長しているが、隣接大血管もしくは主要な神経中に広がらなかった腫瘍を指す。ＩＩＢ期は、隣接リンパ節に広がり得るが、遠隔部位に広がらなかった。

【0058】

「ＩＩＩ期膵臓がん」は、本明細書で用いているように隣接する主要血管または神経に拡大したが、転移しなかったより広く広がるがんを意味する。腫瘍は、膵臓外の隣接大血管もしくは主要神経中に成長し、隣接リンパ節に広がり得るまたは広がり得ない。それは、遠隔部位に広がらなかった。

【0059】

「ＩＶ期膵臓がん」は、本明細書で用いているように遠隔臓器または部位に広がった確認された広がるがんを意味する。ＩＶＡ期膵臓がんは、局所に限定されるが、隣接臓器または血管を巻き添えにし、それにより、外科的除去を妨げる。ＩＶＡ期膵臓がんは、限局性または局所的に進行したとも呼ばれる。ＩＶＢ期膵臓がんは、遠隔臓器、最も一般的には肝臓に広がった。ＩＶＢ期膵臓がんは、転移性とも呼ばれる。

【0060】

「所定のカットオフ」および「所定のレベル」は、本明細書で用いているようにアッセイ結果を所定のカットオフ／レベルと比較することによって診断、予後または治療有効性結果を評価するために用いられるアッセイカットオフ値を意味し、所定のカットオフ／レベルは、様々な臨床パラメーター（例えば、疾患の存在、病期、疾患の重症度、疾患の進行、非進行または改善等）と既に関連付けられたまたは関連させたものである。本開示は、例示的な所定のレベルを示す。しかし、カットオフ値は、免疫測定法の本質（例えば、用いられる抗体、反応条件、試料の純度等）によって異なり得ることは、周知である。本開示により提供された説明に基づいて他の免疫測定法についての免疫測定法固有のカットオフ値を得るために他の免疫測定法に本明細書における開示を適応することは、さらに十分に当業者の範囲内にある。所定のカットオフ／レベルの正確な値は、アッセイ間で異なり得るが、本明細書で述べる相関は、一般的に適用できる。

【0061】

「前処理試薬」、例えば、溶解、沈殿および／または可溶化試薬は、本明細書で述べる診断アッセイに用いているように、細胞を溶解し、および／または試験試料中に存在する分析物を可溶化するものである。前処理は、本明細書でさらに述べるように、すべての試料について必要ではない。とりわけ、分析物（すなわち、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＫＶＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＫＶＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９の断片、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＫＶＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９の変異体、またはそれらのいずれかの組合せ）を可溶化することは、試料中に存在する内在性結合タンパク質からの分析物の放出を伴う。前処理試薬は、均一（分離ステップを必要としない）または不均一（分離ステップを必要とする）であり得る。不均一前処理試薬の使用により、アッセイの次のステップに進む前に試験試料から沈殿した分析物結合タンパク質が除去される。前処理試薬は、（ａ）１つ以上の溶媒および塩、（ｂ）１つ以上の溶媒、塩および界面活性剤、（ｃ）界面活性剤、（ｄ）界面活性剤および塩または（ｅ）細胞溶解および／もしくは分析物の可溶化に適する試薬もしくは試薬の組合せを任意選択的に含み得る。

【0062】

本明細書で述べる免疫測定法およびキットに関連する「品質管理試薬」は、キャリブレーター、対照および感度パネルを含むが、これらに限定されない。抗体または分析物のような、分析物の濃度の内挿のための較正（標準）曲線を作るために「キャリブレーター」または「標準」を一般的に用いる（例えば、複数のような、１つ以上）。または、所定の陽性／陰性カットオフに近い、単一のキャリブレーターを用いることができる。複数のキャリブレーター（すなわち、１つ以上のキャリブレーターまたは様々な量のキャリブレーター）は、「感度パネル」を含むように組み合わせて用いることができる。

【0063】

対象（例えば、患者）の「リスク評価」、「リスク分類」、「リスクの特定」または「リスク層別化」は、本明細書で用いているように、より多くの情報に基づいて対象に関する治療法の決定を下すことができるように、疾患の発症または疾患の進行を含む将来の事象の発生のリスクを予測するための、バイオマーカーを含む因子の評価を意味する。

【0064】

「試料」、「生物学的試料」、「試験試料」、「標本」、「対象からの試料」、「対象から得られた試料」および「患者試料」は、本明細書で用いているように互換的に用いることができ、血液、組織、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞もしくは組織、内皮細胞、白血球または単球であり得る。試料は、患者から得られたままで直接用いることができるまたは本明細書で述べるようにもしくは別途当技術分野で公知のようになんらかの方法で試料の特性を修正するために、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害成分の不活性化、試薬の添加などによるように、前処理することができる。

【0065】

試料を得るためにあらゆる細胞型、組織または体液を利用することができる。そのような細胞型、組織および液は、生検および剖検試料のような組織の切片、組織学的目的のために採取された凍結切片、血液（全血のような）、血漿、血清、痰、糞便、涙液、粘液、唾液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、毛、皮膚、赤血球、血小板、間質液、水晶体液、脳脊髄液、汗、鼻汁、滑液、月経、羊水、精液等を含み得る。細胞型および組織は、リンパ液、腹水、婦人科体液、尿、腹腔液、脳脊髄液、膣すすぎにより収集された液または膣洗浄により収集された液も含み得る。組織または細胞型は、動物から細胞の試料を除去することによって得ることができるが、以前に単離された細胞（例えば、他人により、他の時点におよび／または他の目的のために単離された）を用いることによっても実現することができる。処理またはアウトカム歴を有するもののような、保管組織も用いることができる。タンパク質またはヌクレオチドの単離および／または精製は、必要でないことがあり得る。

【0066】

尿、血液、血清および血漿ならびに他の体液を採取し、取り扱い、処理する、当技術分野で周知の方法が本開示の実施に際して用いられる。試験試料は、目的の分析物に加えて、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのようなさらなる部分を含み得る。例えば、試料は、対象から得られた全血試料であり得る。試験試料、とりわけ全血は、本明細書で述べるように免疫測定の前に例えば、前処理試薬により処理することが必要でありまたは望ましいことがあり得る。前処理が必要でない場合（例えば、大部分の尿試料、前処理済み保管試料等）でさえ、試料の前処理は、単に便宜のために実施することができる選択肢である（例えば、商業プラットフォームにおけるプロトコールの一部として）。試料は、対象から得られたままで直接または試料の特性を修正するための前処理の後に用いることができる。前処理は、抽出、濃縮、妨害成分の不活性化および／または試薬の添加を含み得る。

【0067】

「感度」という用語は、本明細書で用いているように真の陽性の数に偽陰性の数を加算したもので割った真の陽性の数を意味し、感度（「ｓｅｎｓ」）は、０＜ｓｅｎｓ＜１の範囲内にあり得る。対象が実際には肝細胞癌または膵臓がんを有する場合に対象が肝細胞癌または膵臓がんを有さないと誤って特定されないように、理想的には、本明細書における方法の実施形態は、ゼロに等しいまたはほぼゼロに等しい偽陰性の数を有する。逆に、陰性を正しく分類する予測アルゴリズムの能力の評価、すなわち、感度と相補的な測定がしばしば行われる。

【0068】

「特異度」という用語は、本明細書で用いているように真の陰性の数に偽陽性の数を加算したもので割った真の陰性の数を意味し、特異度（「ｓｐｅｃ」）は、０＜ｓｐｅｃ＜１の範囲内にあり得る。対象が実際には肝細胞癌または膵臓がんを有さない場合に対象が腺腫を有すると誤って特定されないように、理想的には、本明細書で述べる方法は、ゼロに等しいまたはほぼゼロに等しい偽陽性の数を有する。したがって、１または１００％に等しい感度および特異度の両方を有する方法が好ましい。

【0069】

「較正組成物の系列」は、既知濃度のラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９を含む複数の組成物を意味し、組成物のそれぞれは、系列における他の組成物とラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９が異なる。

【0070】

「対象」、「患者」または「方法における対象」という用語は、本明細書で互換的に用いているように、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジー等のようなサル））およびヒトを含むが、これらに限定されない、脊椎動物を意味する。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトまたは非ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、肝細胞癌および／もしくは膵臓がんまたは肝細胞癌もしくは膵臓がん以外のがんを発症するリスクがあるもしくはリスクがあると推測されるまたは既に有するヒト対象であり得る。

【0071】

「治療する」、「治療された」または「治療すること」は、本明細書で用いているように治療を意味し、その目的は、望ましくない生理学的状態、障害または疾患を遅くする（軽減する）こと、または有益なまたは所望の臨床結果を得ることである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能もしくは非検出可能か、または状態、障害もしくは疾患の向上もしくは改善かを問わず、症状の軽減；状態、障害もしくは疾患の程度の低下；状態、障害もしくは疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）；状態、障害もしくは疾患の進行の発生の遅延もしくは緩徐化；状態、障害もしくは疾患状態の改善；ならびに寛解（部分的もしくは完全を問わず）を含むが、これらに限定されない。治療は、治療を受けない場合に予期される生存と比較して生存を延長させることも含む。

【0072】

「変異体」は、核酸に関して本明細書で用いているように（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部もしくは断片；（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列もしくはその一部の相補体；（ｉｉｉ）参照核酸と実質的に同一である核酸もしくはその相補体；または（ｉｖ）参照核酸と厳密条件下でハイブリダイズする核酸、その相補体もしくはそれと実質的に同一である配列を意味する。

【0073】

変異体は、挿入、欠失または同類置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているペプチドまたはポリペプチドとさらに定義することができる。「生物学的活性」の代表的な例は、特異抗体により結合されるまたは免疫反応を促進する能力を含む。変異体は、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を記述するためにも本明細書において用いる。アミノ酸の同類置換、すなわち、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸でアミノ酸を置換することは、一般的にわずかな変化を伴うと当技術分野で認識されている。これらのわずかな変化は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸のハイドロパシーインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することによって、一部、識別することができる。Ｋｙｔｅら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１５７巻、１０５－１３２頁（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシーインデックスは、その疎水性および電荷の考慮に基づいている。類似のハイドロパシーインデックスのアミノ酸は、置換され、依然としてタンパク質機能を保持し得ることは、当技術分野で公知である。一態様において、±２のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸は、置換される。生物学的機能を保持しているタンパク質をもたらす置換を明らかにするためにアミノ酸の親水性を用いることもできる。ペプチドの環境におけるアミノ酸の親水性の考慮により、抗原性および免疫原性と良く相関することが報告された有用な尺度である、当ペプチドの最大局所平均親水性の計算が可能になる。参照により本明細書に米国特許第４，５５４，１０１号を完全に組み込む。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当技術分野で理解されているように、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持しているペプチドを生じさせ得る。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行わせることができる。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方が当アミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。当所見と一致して、生物学的機能と適合性があるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズおよび他の特性によって明らかなように、アミノ酸およびとりわけそれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存すると理解される。「変異体」はまた、タンパク質分解、リン酸化または他の翻訳後修飾によるように、差別的に処理され、それにもかかわらず、その抗原反応性を保持しているポリペプチドまたはその断片を記述するために用いることができる。

【0074】

変異体は、全遺伝子配列またはその断片の全長にわたり実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたり８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。変異体は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたり実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたり８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であり得る。

【0075】

２． ラミニンガンマ２単量体を用いて疾患を診断する方法
本明細書で提供するのは、それを必要とする対象における肝細胞癌（ＨＣＣ）または膵臓がんのような、疾患を診断する方法である。方法は、対象から試料を得ること、試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定することおよび試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと比較することを含む。基準レベルと比べた、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルの変化は、対象が疾患に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。いくつかの実施形態において、ラミニンガンマ２単量体のレベルの変化は、基準レベルと比べた、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルの増加であり得る。ラミニンガンマ２単量体のレベルのそのような増加は、対象が疾患に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示し得る。

【0076】

診断する方法は、対象からの試料中の、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９－９またはそれらの組合せのような、少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定することならびに試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルと比較することも含み得る。基準レベルと比べた、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルの変化も、対象が疾患に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示し得る。いくつかの実施形態において、ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルの変化は、基準レベルと比べた、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルの増加であり得る。ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルのそのような増加は、対象が疾患に罹患しているまたは罹患するリスクがあることをさらに示し得る。

【0077】

ａ． ラミニンガンマ２単量体
肝細胞癌（ＨＣＣ）または膵臓がんのような、疾患を診断する方法は、対象からの試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを測定することを含む。ラミニンガンマ２単量体（「ラミニンガンマ２」または「Ｌｎ－γ２」とも呼ばれる）は、細胞外マトリックス糖タンパク質であり、基底膜の成分である、タンパク質のラミニンファミリーのメンバーである。各ヘテロ三量体ラミニンは、３つの同一でない鎖：ラミニンアルファ、ラミニンベータおよびラミニンガンマからなっている。異なるアルファ、ベータおよびガンマ鎖異性体は、結合して、異なるヘテロ三量体ラミニンアイソフォームを生じ得る。ラミニンガンマ２は、１つのガンマ鎖異性体であり、ラミニンアルファ３およびラミニンベータ３と一緒になってラミニン５を形成する。ラミニン５は、基底板および基底膜に主として局在する。ヒトにおいて、ラミニンガンマ２単量体は、ヒト１番染色体の長（ｑ）腕上２５位と３１位の間（１ｑ２５－１ｑ３１）に位置する、ＬＡＭＣ２遺伝子によりコードされる。ヒトラミニンガンマ２単量体は、シグナルペプチド、またはシグナルペプチドが切断により除去された、分泌タンパク質を含む、前駆タンパク質であり得る。

【0078】

ｂ． 追加のバイオマーカー
肝細胞癌（ＨＣＣ）または膵臓がんのような、疾患を診断する方法は、対象かの試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルおよび少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを測定することを含み得る。少なくとも１つの追加のバイオマーカーは、ビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）、アルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ｃａｒ抗原１９－９（ＣＡ１９－９）またはそれらのいずれかの組合せであり得る。

【0079】

（１）ビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）
肝細胞癌（ＨＣＣ）のような、疾患を診断する方法は、ラミニンガンマ２単量体のレベルおよびビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）のレベルを測定することを含み得る。ＰＩＶＫＡ－ＩＩ（デス－ガンマ－カルボキシプロトロンビン（ＤＣＰ）としても公知）は、異常な形態の凝固タンパク質プロトロンビンである。ＰＩＶＫＡ－ＩＩは、ＨＣＣのリスクファクター（硬変のような）に対して最も感受性が低く、したがって、ＨＣＣを予測するのに有用である。それは、ＨＣＣを非悪性肝疾患と識別するが、肝内胆汁うっ滞に起因する重度の閉塞性黄疸を有する患者に、または長期にわたるビタミンＫ欠乏を有する個体においてビタミンＫの作用が減じられている条件下、およびワルファリンもしくは広域スペクトルの抗生物質を服用した患者にＰＩＶＫＡ－ＩＩ濃度の偽増加が見いだされる。

【0080】

（２）アルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）
肝細胞癌（ＨＣＣ）のような、疾患を診断する方法は、ラミニンガンマ２単量体のレベルおよびアルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）のレベルを測定することを含み得る。ＡＦＰ（α－フェトプロテイン、アルファ－１－フェトプロテイン、アルファ－フェトグロブリンおよびアルファ－フェトプロテインとしても公知）は、卵黄嚢および胎児発育中の肝臓により産生される主要な血漿タンパク質であり、血清アルブミンの胎児型であると考えられる。ヒトにおいて、ＡＦＰは、４番染色体の長（ｑ）腕上に位置する、ＡＦＰ遺伝子によりコードされる。ＡＦＰは、銅、ニッケル、脂肪酸およびビリルビンに結合し、単量体、二量体および三量体で見いだされる。ＡＦＰは、５９１アミノ酸の糖タンパク質であり、炭水化物部分である。ＡＦＰは、Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＡＦＰを用いて検出し、定量することができる。

【0081】

（３）がん胎児抗原（ＣＥＡ）
膵臓がんのような、疾患を診断する方法は、ラミニンガンマ２単量体のレベルおよびがん胎児抗原（ＣＥＡ）のレベルを測定することを含み得る。ＣＥＡは、細胞接着に関与しており、その特殊化シアロフコシル化糖型が機能性結腸癌Ｌ－セレクチンおよびＥ－セレクチンリガンドとしての役割を果たすグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）－細胞表面固定化糖タンパク質である。ＣＥＡは、サイズが約２００ｋＤａである糖タンパク質によって特徴付けられる腫瘍関連抗原である。ＣＥＡは、ＦＤＡ承認済みであり、ＣＥＡの濃度の変化によるがん患者の予後診断および管理に補助として使用することが意図されている。

【0082】

さらに、ＣＥＡは、大腸直腸がん（ＣＲＣ）に関連するマーカーであり、ＣＲＣを含む消化管（ＧＩ）がんのモニタリングに臨床的に承認された。ある種のＣＲＣを検出するその能力が特徴付けられた。臨床的関連性は、大腸直腸、胃、肺、前立腺、膵臓および卵巣がんにおいて示された（Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＣＥＡ添付文書３４－４０６７／Ｒ４）。ＣＥＡは、Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＥＡを用いて検出し、定量することができる。

【0083】

（４）炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）
膵臓がんのような、疾患を診断する方法は、ラミニンガンマ２単量体のレベルおよび炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９またはＣＡ １９－９）のレベルを測定することを含み得る。ＣＡ１９－９は、ヒト大腸直腸癌細胞株に由来するムチン糖タンパク質であり、ルイス式血液型タンパク質に関連する。具体的には、ＣＡ１９－９は、シアリル化ルイス式血液型抗原に属し、ルイス抗原陰性である個体において検出できないことがあり得る。さらに、ＣＡ１９－９は、胃、胆嚢、膵臓および前立腺の上皮組織に存在する。

【0084】

ＣＡ１９－９は、膵臓がんの管理における補助としての使用がＦＤＡ承認され、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像（ＭＲＩ）法のような他の診断情報と共に使用されることが意図されている。血清ＣＡ１９－９は、膵炎および他の消化管障害のような非悪性疾患を有する患者においても上昇し得る（Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＣＡ１９－９ ＸＲ添付文書０１５－５５０ １１／０５）。ＣＡ１９－９のレベルの上昇は、ある種の大腸直腸（ＣＲＣ）がんの情報を与えるものであり得る。ＣＡ１９－９は、Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）ＣＡ１９－９ ＸＲを用いて検出し、定量することができる。

【0085】

ｃ． ラミニンガンマ２単量体および追加のバイオマーカーの組合せ
上述のように、肝細胞癌（ＨＣＣ）または膵臓がんのような、疾患を診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルおよび少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを測定することを含み得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルのレベルの増加は、対象が疾患に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示し得る。

【0086】

いくつかの実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡもしくはＣＡ１９－９またはそれらの組合せのレベルを検出し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡもしくはＣＡ１９－９またはそれらの組合せのレベルの増加は、対象が疾患に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示し得る。

【0087】

他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルを検出し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルの増加は、対象が疾患（例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ））に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示し得る。

【0088】

さらに他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰのレベルを検出し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰのレベルの増加は、対象が疾患（例えば、ＨＣＣ）に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示し得る。

【0089】

他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルを検出し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルの増加は、対象が疾患（例えば、ＨＣＣ）に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示し得る。

【0090】

いくつかの実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＥＡのレベルを検出し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体およびＣＥＡのレベルの増加は、対象が疾患（例えば、膵臓がん）に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示し得る。

【0091】

他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＡ１９－９のレベルを検出し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体およびＣＡ１９－９のレベルの増加は、対象が疾患（例えば、膵臓がん）に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示し得る。

【0092】

他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルを検出し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルの増加は、対象が疾患（例えば、膵臓がん）に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示し得る。

【0093】

ｄ． 疾患
本明細書で述べる方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定することによって疾患を有する対象の診断を下すために用いることができる。基準と比べた、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルの変化は、対象が疾患に罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。疾患は、肝細胞癌（ＨＣＣ）または膵臓がんであり得る。

【0094】

（１）肝細胞癌（ＨＣＣ）
本明細書で述べる方法は、肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する対象の診断を下すために用いることができる。ＨＣＣ（悪性肝癌としても公知）は、最も一般的な種類の肝臓がんであり、ＨＣＣの多くの症例は、ウイルス性肝炎感染（ＢもしくはＣ型肝炎）または肝硬変に続発する。疾患が肝細胞癌（ＨＣＣ）である場合、診断の方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルおよび／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定し得る。基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体のレベルおよび／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルの変化は、対象がＨＣＣに罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。そのような変化は、基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体のレベルおよび／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルの増加であり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加のバイオマーカーは、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ－ＩＩまたはそれらの組合せであり得る。

【0095】

いくつかの実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを測定し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体のレベルの変化は、対象がＨＣＣに罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体のレベルの変化は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルが基準レベルと比べて増加しているようなことであり得る。

【0096】

他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰのレベルを測定し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰのレベルの変化は、対象がＨＣＣに罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰのレベルの変化は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰのレベルが基準レベルと比べて増加しているようなことであり得る。

【0097】

さらに他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルを測定し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルの変化は、対象がＨＣＣに罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルの変化は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルが基準レベルと比べて増加しているようなことであり得る。

【0098】

他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルを測定し得る。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルの変化は、対象がＨＣＣに罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。基準レベルと比べた、ラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルの変化は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルが基準レベルと比べて増加しているようなことであり得る。

【0099】

（ａ）ＨＣＣの病期
本明細書で述べる方法は、特定の病期の肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する対象の診断を下すために用いることができる。疾患は、Ｉ期ＨＣＣ、ＩＩ期ＨＣＣ、ＩＩＩ期ＨＣＣ（ＩＩＩＡ期ＨＣＣ、ＩＩＩＢ期ＨＣＣおよびＩＩＩＣ期ＨＣＣを含む）またはＩＶ期ＨＣＣ（ＩＶＡ期ＨＣＣおよびＩＶＢ期ＨＣＣを含む）であり得る。ラミニンガンマ２単量体のレベルは、ＨＣＣの病期とともに増加し得る。したがって、ラミニンガンマ２単量体のレベルは、ＩＩ期ＨＣＣ、ＩＩＩ期ＨＣＣまたはＩＶ期ＨＣＣにおいてＩ期ＨＣＣにおけるラミニンガンマ２単量体のレベルより高い可能性がある。ラミニンガンマ２単量体のレベルは、ＩＩＩ期ＨＣＣまたはＩＶ期ＨＣＣにおいてＩ期ＨＣＣまたはＩＩ期ＨＣＣにおけるラミニンガンマ２単量体のレベルより高い可能性がある。ラミニンガンマ２単量体のレベルは、ＩＶ期ＨＣＣにおいてＩ期ＨＣＣ、ＩＩ期ＨＣＣまたはＩＩＩ期ＨＣＣにおけるラミニンガンマ２単量体のレベルより高い可能性がある。したがって、ラミニンガンマ２単量体の次第に増加するレベルは、対象におけるＨＣＣが１つの病期から他の病期に進行していることを示すものであり得る。

【0100】

（２）膵臓がん
本明細書で述べる方法は、膵臓がんを有する対象の診断を下すために用いることができる。膵臓がんは、膵臓に発生するがんである。膵臓がんは、膵腺癌、腺房細胞癌、腺癌、腺扁平上皮癌、巨細胞腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、膵芽腫、漿液性嚢胞腺癌、ソリッド・プソイドパピラリー腫瘍（ｓｏｌｉｄ ａｎｄ ｐｓｅｕｄｏｐａｐｉｌｌａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ）および乳頭状嚢胞状腫瘍のような外分泌膵臓がん、膵神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）、島細胞腫瘍、島細胞癌、膵カルチノイド、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）、ガストリノーマ（ゾリンジャー－エリソン症候群）、グルカゴン産生腫瘍、膵島細胞腺腫、非機能性島細胞腫瘍、ソマトスタチノーマおよび血管作動性腸ペプチド放出腫瘍（ＶＩＰｏｍａまたはヴァーナー－モリソン症候群）のような内分泌膵臓がんならびに膵臓のリンパ腫を含み得るが、これらに限定されない。腺癌は、良性管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）から発生し得る。

【0101】

疾患が膵臓がんである場合、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルおよび／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定し得る。基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体のレベルおよび／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルの変化は、対象が膵臓がんに罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。そのような変化は、基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体のレベルおよび／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルの増加であり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加のバイオマーカーは、ＣＥＡ、ＣＡ１９－９またはそれらの組合せであり得る。

【0102】

いくつかの実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを測定し得る。基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体のレベルの変化は、対象が膵臓がんに罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体のレベルの変化は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルが基準レベルと比べて増加しているようなことであり得る。

【0103】

他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＥＡのレベルを測定し得る。基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体およびＣＥＡのレベルの変化は、対象が膵臓がんに罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体およびＣＥＡのレベルの変化は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＥＡのレベルが基準レベルと比べて増加しているようなことであり得る。

【0104】

他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＡ１９－９のレベルを測定し得る。基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体およびＣＡ１９－９のレベルの変化は、対象が膵臓がんに罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体およびＣＡ１９－９のレベルの変化は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＡ１９－９のレベルが基準レベルと比べて増加しているようなことであり得る。

【0105】

他の実施形態において、診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルを測定し得る。基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルの変化は、対象が膵臓がんに罹患しているまたは罹患するリスクがあることを示す。基準レベルと比べたラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルの変化は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルが基準レベルと比べて増加しているようなことであり得る。

【0106】

（ａ）膵臓がんの病期
本明細書で述べる方法は、特定の病期の膵臓がんを有する対象の診断を下すために用いることができる。疾患は、０期膵臓がん、Ｉ期膵臓がん、ＩＩ期膵臓がん、ＩＩＩ期膵臓がんまたはＩＶ期膵臓がんであり得る。ラミニンガンマ２単量体のレベルは、膵臓がんの病期とともに増加し得る。例えば、ラミニンガンマ２単量体のレベルは、ＩＶ期膵臓がんにおいてＩＩＩ期膵臓がんにおけるラミニンガンマ２単量体のレベルより高い可能性がある。したがって、ラミニンガンマ２単量体の次第に増加するレベルは、対象における膵臓がんが１つの病期から他の病期に進行していることを示すものであり得る。

【0107】

ｅ． ラミニンガンマ２単量体のおよび／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定するための免疫測定法
診断する方法は、対象から得られた試料中のラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定するための免疫測定法を用い得る。免疫測定法は、ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを定量化し得る。

【0108】

ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーの存在または量は、各バイオマーカー（例えば、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９ならびにそのような追加の分析物が用いられる場合には追加の分析物）に特異的に結合する抗体を用いて決定することができる。用いることができる抗体の例は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、免疫グロブリン分子、ジスルフィド結合Ｆｖ、モノクローナル抗体、アフィニティ成熟、ｓｃＦｖ、キメラ抗体、単一ドメイン抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ、ヒト化抗体、多重特異的抗体、Ｆａｂ、二重特異的（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、ＤＶＤ、Ｆａｂ’、二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖおよびそれらの組合せを含む。

【0109】

例えば、免疫学的方法は、（ａ）（ｉ）試験試料を少なくとも１つの捕捉抗体と接触させ、捕捉抗体がラミニンガンマ２単量体もしくはラミニンガンマ２単量体の断片上のエピトープに結合して、捕捉抗体－ラミニンガンマ２単量体複合体を形成する、ステップ；（ｉｉ）捕捉抗体－ラミニンガンマ２単量体複合体を検出可能標識を含む少なくとも１つの検出抗体と接触させ、検出抗体が捕捉抗体により結合されていないラミニンガンマ２単量体上のエピトープに結合し、捕捉抗体－ラミニンガンマ２－検出抗体複合体を形成する、ステップ；および（ｉｉｉ）（ａ）（ｉｉ）において形成された捕捉抗体－ラミニンガンマ２－検出抗体複合体における検出可能標識により発せられるシグナルに基づいて試験試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定するステップにより、ラミニンガンマ２単量体のレベルを測定すること、（ｂ）（ｉ）試験試料を少なくとも１つの捕捉抗体と接触させ、捕捉抗体が少なくとも１つの追加のバイオマーカーもしくは少なくとも１つの追加のバイオマーカーの断片上のエピトープに結合して、捕捉抗体－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複合体を形成するステップ；（ｉｉ）捕捉抗体－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複合体を検出可能標識を含む少なくとも１つの検出抗体と接触させ、検出抗体が捕捉抗体により結合されていない少なくとも１つの追加のバイオマーカー上のエピトープに結合し、捕捉抗体－少なくとも１つの追加のバイオマーカー－検出抗体複合体を形成するステップ；および（ｉｉｉ）（ｂ）（ｉｉ）において形成された捕捉抗体－少なくとも１つの追加のバイオマーカー－検出抗体複合体における検出可能標識により発せられるシグナルに基づいて試験試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定するステップにより、少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを測定すること；またはそれらの組合せを含み得る。

【0110】

任意の免疫測定法を用いることができる。免疫測定法は、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、フォーワードもしくはリバース競合阻害アッセイのような競合阻害アッセイ、蛍光偏光アッセイまたは競合結合アッセイであり得る。ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡであり得る。マーカーに対する抗体の特異的免疫学的結合は、抗体に結合させた蛍光もしくは化学発光タグ、金属および放射性核種のような、直接標識により、またはアルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼのような、間接標識により検出することができる。

【0111】

固定化された抗体またはその断片の使用を免疫測定法に組み込むことができる。抗体は、磁気またはクロマトグラフマトリックス粒子、アッセイプレート（マイクロタイターウエルのような）の表面、固体基板材料などのような、様々な担体上に固定化することができる。固体担体上のアレイにおける抗体または複数の抗体を被覆することによってアッセイストリップを作製することができる。このストリップを次に試験生物学的試料中に浸し、次に洗浄および検出ステップにより速やかに処理して、着色スポットのような測定可能シグナルを発生させることができる。

【0112】

サンドイッチＥＬＩＳＡは、抗体の２つの層（すなわち、捕捉抗体および検出抗体（検出可能な標識で標識することができる））の間の抗原の量を測定する。測定されるべきラミニンガンマ２単量体ならびに／または少なくとも１つの追加のバイオマーカー、すなわち、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／もしくはＣＡ１９－９は、抗体に結合することができる少なくとも２つの抗原性部位を含み得る。モノクローナルまたはポリクローナル抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡにおける捕捉および検出抗体として用いることができる。

【0113】

一般的に、少なくとも２つの抗体を用いて、試験もしくは生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体または少なくとも１つの追加のバイオマーカー、すなわち、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／もしくはＣＡ１９－９（ならびに追加の分析物）を分離し、定量する。より具体的には、少なくとも２つの抗体は、ラミニンガンマ２単量体または少なくとも１つの追加のバイオマーカーの特定のエピトープに結合して免疫複合体を形成するが、これが「サンドイッチ」と呼ばれる。１つ以上の抗体を用いて、試験試料中のラミニンガンマ２単量体または少なくとも１つの追加のバイオマーカーを捕捉することができ（これらの抗体はしばしば「捕捉」抗体または「捕捉」抗体と呼ばれる）、１つ以上の抗体を用いて、検出可能な（すなわち、定量可能な）標識をサンドイッチに結合させる（これらの抗体はしばしば「検出」抗体または「検出」抗体と呼ばれる）。サンドイッチアッセイにおいて、それらのエピトープに結合する両抗体は、その各エピトープへのアッセイにおける他の抗体の結合によって減少し得ない。言い換えれば、ラミニンガンマ２単量体または少なくとも１つの追加のバイオマーカーを含むと疑われた試験試料と接触した１つ以上の一次抗体が二次もしくは後の抗体により認識されるエピトープのすべてもしくは一部に結合せず、それにより、ラミニンガンマ２単量体または少なくとも１つの追加のバイオマーカーに結合する１つ以上の二次検出抗体の能力を妨げるように抗体を選択することができる。

【0114】

好ましい実施形態において、ラミニンガンマ２単量体ならびに／または少なくとも１つの追加のバイオマーカー、すなわち、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／もしくはＣＡ１９－９を含むと推測される試験もしくは生物学的試料を少なくとも１つの一次捕捉抗体（または複数の抗体）および少なくとも１つの二次検出抗体と同時にまたは連続して接触させることができる。サンドイッチアッセイ方式において、ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーを含むと推測される試験試料を最初に一次抗体－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複合体の形成を可能にする条件下で特定のエピトープに特異的に結合する少なくとも１つの一次捕捉抗体と接触させる。１つを超える捕捉抗体を用いる場合、複数の一次捕捉抗体－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗体は、試験試料中の予測されるラミニンガンマ２単量体または少なくとも１つの追加のバイオマーカーの最大量のモル過剰量で用いる。

【0115】

任意選択で、試験試料を少なくとも１つの一次捕捉抗体と接触させる前に、少なくとも１つの一次捕捉抗体は、試験試料から一次抗体－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複合体の分離を促進する固体担体に結合させることができる。ウエル、管またはビーズの形態のポリマー材料製の固体担体を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の固体担体を用いることができる。抗体は、吸着により、化学結合剤を用いる共有結合または当技術分野で公知の他の手段により固体担体に結合させることができる。ただし、そのような結合は、マーカーに結合する抗体の能力を妨げないものとする。さらに、必要な場合、固体単体は抗体上の様々な官能基との反応性を持たせるために誘導体化することができる。そのような誘導体化には、例えば、無水マレイン酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドおよび１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどであるが、これらに限定されない特定のカップリング剤が必要である。

【0116】

ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーを含むと推測される試験試料を少なくとも１つの一次捕捉抗体と接触させた後、一次捕捉抗体（または複数の抗体）－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複合体の形成を可能にするために試験試料をインキュベートする。インキュベーションは、約４．５から約１０．０までのｐＨ、約２℃から約４５℃までの温度で、約１分から１８時間まで、約２分から６分または約３分から４分まで行うことができる。

【0117】

一次／複数の捕捉抗体－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複合体の形成の後、複合体を少なくとも１つの二次検出抗体と接触させる（一次／複数の捕捉抗体－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複合体の形成を可能にする条件下で）。一次抗体－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複合体を２つ以上の検出抗体と接触させる場合、一次／複数の捕捉抗体－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複数抗体検出複合体が形成される。一次抗体の場合と同様に、少なくとも二次（および後の）抗体を一次抗体－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー複合体と接触させる場合、一次／複数の抗体－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー／複数抗体複合体の形成のために上述と同様の条件下でのインキュベーションの期間が必要である。好ましくは、少なくとも１つの二次抗体は、検出可能な標識を含む。検出可能な標識は、一次／複数の抗体－ラミニンガンマ２単量体または－少なくとも１つの追加のバイオマーカー／複数抗体複合体の形成の前、同時にまたは後に少なくとも１つの二次抗体に結合させることができる。当技術分野で公知の任意の検出可能な標識を用いることができる。

【0118】

ｆ． 基準レベル
本明細書で述べる診断する方法は、対象が疾患に罹患しているまたは罹患するリスクがあるか否かを識別し、判定するためにラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルを使用し得る。対象から得られた試料中で測定され、それぞれの基準レベルより大きいラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルは、疾患に罹患しているまたは罹患するリスクがあると対象を識別し得る。それぞれの基準レベルより低いまたは等しいラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルは、疾患に罹患していないまたは罹患するリスクがないと対象を識別し得る。

【0119】

（１）ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９の基準レベル
一般的に、所定または基準レベルは、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９－９またはそれらに組合せについて試験試料をアッセイすることにより得られる結果を評価するためのベンチマークとして用いることができる。一般的に、そのような比較を行うに際して、分析物の存在、量または濃度と特定の兆候を有する疾患の特定の病期またはエンドポイントとのつながりまたは関連性の評価を行うことができるような十分な回数および適切な条件下で特定のアッセイを行うことによって所定のレベルが得られる。一般的に、所定のレベルは、参照対象（または対象の集団）のアッセイにより得られる。参照対象は、対照対象であり得る。参照集団または参照群は、対照群であり得る。測定されたラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９は、そのラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／もしくはＣＡ１９－９断片、それらの分解生成物ならびに／またはそれらの酵素切断生成物を含み得る。

【0120】

特に、疾患の進行および／または治療をモニターするために用いられる所定のレベルに対して、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９断片の量または濃度は、「不変」、「好ましい」（または「好ましく変化した」）または「好ましくない」（または「好ましくなく変化した」）であり得る。「上昇した」または「増加した」は、対照群もしくは対照試料に見いだされる一般的もしくは正常レベルのような、一般的もしくは正常レベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）より高いもしくは大きい、または他の基準レベルもしくは範囲（例えば、初期もしくはベースライン試料）より高いもしくは大きい試験試料中の量もしくは濃度を意味する。「低下した」または「減少した」という用語は、対照群もしくは対照試料に見いだされる一般的もしくは正常レベルのような、一般的もしくは正常レベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）より低いもしくは少ない、または他の基準レベルもしくは範囲（例えば、初期もしくはベースライン試料）より低いもしくは少ない試験試料中の量もしくは濃度を意味する。「変化した」という用語は、対照群もしくは対照試料に見いだされる一般的もしくは正常レベルのような、一般的もしくは正常レベルもしくは範囲（例えば、所定のレベル）と比べて、または他の基準レベルもしくは範囲（例えば、初期もしくはベースライン試料）と比べて変化（増加もしくは減少）している試験試料中の量もしくは濃度を意味する。

【0121】

ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９の一般的もしくは正常レベルもしくは範囲は、標準慣例に従って規定される。いわゆるレベルの変化または変化は、実験誤差もしくは試料の変動によって説明することができない一般的もしくは正常レベルもしくは範囲、または基準レベルもしくは範囲と比較して正味の変化が存在する場合に起こったと見なすことができる。いくつかの実施形態において、特定の試料中の測定されたレベルは、いわゆる正常対象、すなわち、対照対象からの類似の試料中の決定されたレベルまたはレベルの範囲と比較される。これに関連して、「正常」（時として「対照」または「健常」）対象は、検出可能なＨＣＣまたは膵臓がんを有さない個体であり、「正常」患者または集団は、例えば、検出可能なＨＣＣまたは膵臓がんを示さない患者または集団である。「一見したところ正常な対象」は、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９が評価されなかったまたは評価されていない対象である。分析物が通常検出できない（例えば、正常レベルがゼロであるまたは正常集団の約２５から約７５百分位数の範囲内である）が、試験試料中で検出される場合、ならびに分析物が正常レベルより高いレベルで試験試料中に存在する場合、分析物のレベルは、「上昇した」と言われる。

【0122】

一実施形態において、血清中のラミニンガンマ２単量体の基準レベルは、約８１．３ｐｇ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のラミニンガンマ２単量体の基準レベルは、約８１．３ｐｇ／ｍＬであり得る。一実施形態において、血清中のラミニンガンマ２単量体の基準レベルは、約７９．５ｐｇ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のラミニンガンマ２単量体の基準レベルは、約７９．５ｐｇ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のラミニンガンマ２単量体の基準レベルは、約７０．０ｐｇ／ｍＬ、７１．０ｐｇ／ｍＬ、７２．０ｐｇ／ｍＬ、７３．０ｐｇ／ｍＬ、７４．０ｐｇ／ｍＬ、７５．０ｐｇ／ｍＬ、７６．０ｐｇ／ｍＬ、７６．３ｐｇ／ｍＬ、７６．４ｐｇ／ｍＬ、７６．５ｐｇ／ｍＬ、７６．６ｐｇ／ｍＬ、７６．７ｐｇ／ｍＬ、７６．８ｐｇ／ｍＬ、７６．９ｐｇ／ｍＬ、７７．０ｐｇ／ｍＬ、７８．０ｐｇ／ｍＬ、７９．０ｐｇ／ｍＬ、７９．１ｐｇ／ｍＬ、７９．２ｐｇ／ｍＬ、７９．３ｐｇ／ｍＬ、７９．４ｐｇ／ｍＬ、７９．５ｐｇ／ｍＬ、７９．６ｐｇ／ｍＬ、７９．７ｐｇ／ｍＬ、７９．８ｐｇ／ｍＬ、７９．９ｐｇ／ｍＬ、８０．０ｐｇ／ｍＬ、８０．１ｐｇ／ｍＬ、８０．２ｐｇ／ｍＬ、８０．３ｐｇ／ｍＬ、８０．４ｐｇ／ｍＬ、８０．５ｐｇ／ｍＬ、８０．６ｐｇ／ｍＬ、８０．７ｐｇ／ｍＬ、８０．８ｐｇ／ｍＬ、８０．９ｐｇ／ｍＬ、８１．０ｐｇ／ｍＬ、８１．１ｐｇ／ｍＬ、８１．２ｐｇ／ｍＬ、８１．３ｐｇ／ｍＬ、８１．４ｐｇ／ｍＬ、８１．５ｐｇ／ｍＬ、８１．６ｐｇ／ｍＬ、８１．７ｐｇ／ｍＬ、８１．８ｐｇ／ｍＬ、８１．９ｐｇ／ｍＬ、８２．０ｐｇ／ｍＬ、８２．１ｐｇ／ｍＬ、８２．３ｐｇ／ｍＬ、８２．４ｐｇ／ｍＬ、８２．５ｐｇ／ｍＬ、８２．６ｐｇ／ｍＬ、８２．７ｐｇ／ｍＬ、８２．８ｐｇ／ｍＬ、８２．９ｐｇ／ｍＬ、８３．０ｐｇ／ｍＬ、８４．０ｐｇ／ｍＬ、８５．０ｐｇ／ｍＬ、８６．０ｐｇ／ｍＬ、８７．０ｐｇ／ｍＬ、８８．０ｐｇ／ｍＬ、８９．０ｐｇ／ｍＬ、９０．０ｐｇ／ｍＬ、９１．０ｐｇ／ｍＬ、９２．０ｐｇ／ｍＬ、９３．０ｐｇ／ｍＬ、９４．０ｐｇ／ｍＬ、９５．０ｐｇ／ｍＬ、９６．０ｐｇ／ｍＬ、９７．０ｐｇ／ｍＬ、９８．０ｐｇ／ｍＬ、９９．０ｐｇ／ｍＬ、１００．０ｐｇ／ｍＬ、１０１．０ｐｇ／ｍＬ、１０２．０ｐｇ／ｍＬ、１０３．０ｐｇ／ｍＬ、１０４．０ｐｇ／ｍＬ、１０５．０ｐｇ／ｍＬ、１０６．０ｐｇ／ｍＬ、１０７．０ｐｇ／ｍＬ、１０８．０ｐｇ／ｍＬ、１０９．０ｐｇ／ｍＬ、１１０．０ｐｇ／ｍＬ、１１１．０ｐｇ／ｍＬ、１１２．０ｐｇ／ｍＬ、１１３．０ｐｇ／ｍＬ、１１４．０ｐｇ／ｍＬ、１１５．０ｐｇ／ｍＬ、１１５．０５ｐｇ／ｍＬ、１１６．０ｐｇ／ｍＬ、１１６．４ｐｇ／ｍＬ、１１６．５ｐｇ／ｍＬ、１１６．６ｐｇ／ｍＬ、１１６．７ｐｇ／ｍＬ、１１６．８ｐｇ／ｍＬ、１１６．９ｐｇ／ｍＬ、１１７．０ｐｇ／ｍＬ、１１８．０ｐｇ／ｍＬ、１１９．０ｐｇ／ｍＬ、１２０．０ｐｇ／ｍＬであり得る。

【0123】

一実施形態において、血清中のＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルは、約４０ｍＡＵ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルは、約４０ｍＡＵ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルは、約３０ｍＡＵ／ｍＬ、３１ｍＡＵ／ｍＬ、３２ｍＡＵ／ｍＬ、３３ｍＡＵ／ｍＬ、３４ｍＡＵ／ｍＬ、３５ｍＡＵ／ｍＬ、３６ｍＡＵ／ｍＬ、３７ｍＡＵ／ｍＬ、３８ｍＡＵ／ｍＬ、３９ｍＡＵ／ｍＬ、４０ｍＡＵ／ｍＬ、４１ｍＡＵ／ｍＬ、４２ｍＡＵ／ｍＬ、４３ｍＡＵ／ｍＬ、４４ｍＡＵ／ｍＬ、４５ｍＡＵ／ｍＬ、４６ｍＡＵ／ｍＬ、４７ｍＡＵ／ｍＬ、４８ｍＡＵ／ｍＬ、４９ｍＡＵ／ｍＬまたは５０ｍＡＵ／ｍＬであり得る。

【0124】

一実施形態において、血清中のＡＦＰの基準レベルは、約２０ｎｇ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のＡＦＰの基準レベルは、約２０ｎｇ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のＡＦＰの基準レベルは、約１０ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１３ｎｇ／ｍＬ、１４ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、１７ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、１９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２１ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、２３ｎｇ／ｍＬ、２４ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、２６ｎｇ／ｍＬ、２７ｎｇ／ｍＬ、２８ｎｇ／ｍＬ、２９ｎｇ／ｍＬまたは３０ｎｇ／ｍＬであり得る。

【0125】

一実施形態において、血清中のＣＥＡの基準レベル、約５．０ｎｇ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のＣＥＡの基準レベルは、約５．０ｎｇ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のＣＥＡの基準レベルは、約１．０ｎｇ／ｍＬ、１．５ｎｇ／ｍＬ、２．０ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、３．０ｎｇ／ｍＬ、３．５ｎｇ／ｍＬ、４．０ｎｇ／ｍＬ、４．５ｎｇ／ｍＬ、５．０ｎｇ／ｍＬ、５．５ｎｇ／ｍＬ、６．０ｎｇ／ｍＬ、６．５ｎｇ／ｍＬ、７．０ｎｇ／ｍＬ、７．５ｎｇ／ｍＬ、８．０ｎｇ／ｍＬ、８．５ｎｇ／ｍＬ、９．０ｎｇ／ｍＬ、９．５ｎｇ／ｍＬまたは１０．０ｎｇ／ｍＬであり得る。

【0126】

一実施形態において、血清中のＣＡ１９－９の基準レベルは、約３７．０Ｕ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のＣＡ１９－９の基準レベルは、約３７．０Ｕ／ｍＬであり得る。他の実施形態において、血清中のＣＡ１９－９の基準レベルは、約２７．０Ｕ／ｍＬ、２７．５Ｕ／ｍＬ、２８．０Ｕ／ｍＬ、２８．５Ｕ／ｍＬ、２９．０Ｕ／ｍＬ、２９．５Ｕ／ｍＬ、３０．０Ｕ／ｍＬ、３０．５Ｕ／ｍＬ、３１．０Ｕ／ｍＬ、３１．５Ｕ／ｍＬ、３２．０Ｕ／ｍＬ、３２．５Ｕ／ｍＬ、３３．０Ｕ／ｍＬ、３３．５Ｕ／ｍＬ、３４．０Ｕ／ｍＬ、３４．５Ｕ／ｍＬ、３５．０Ｕ／ｍＬ、３５．５Ｕ／ｍＬ、３６．０Ｕ／ｍＬ、３６．５Ｕ／ｍＬ、３７．０Ｕ／ｍＬ、３７．５Ｕ／ｍＬ、３８．０Ｕ／ｍＬ、３８．５Ｕ／ｍＬ、３９．０Ｕ／ｍＬ、３９．５Ｕ／ｍＬ、４０．０Ｕ／ｍＬ、４０．５Ｕ／ｍＬ、４１．０Ｕ／ｍＬ、４１．５Ｕ／ｍＬ、４２．０Ｕ／ｍＬ、４２．５Ｕ／ｍＬ、４３．０Ｕ／ｍＬ、４３．５Ｕ／ｍＬ、４４．０Ｕ／ｍＬ、４４．５Ｕ／ｍＬ、４５．０Ｕ／ｍＬ、４５．５Ｕ／ｍＬ、４６．０Ｕ／ｍＬ、４６．５Ｕ／ｍＬまたは４７．０Ｕ／ｍＬであり得る。

【0127】

カットオフ値（または所定のカットオフ値）は、適応指標モデル（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｍｏｄｅｌ）（ＡＩＭ）法により決定することができる。カットオフ値（または所定のカットオフ値）は、患者群の生物学的試料からの受診者動作曲線（ＲＯＣ）分析により決定することができる。ＲＯＣ分析は、生物学分野で一般的に公知のように、例えば、ＣＲＣを有する患者を特定する際の各マーカーの能力を判断するための１つの状態と他の状態とを識別する検査の能力を判定するものである。本開示により適用されるＲＯＣ分析の説明は、その開示をその全体として参照により組み込む、Ｐ．Ｊ． Ｈｅａｇｅｒｔｙら、Ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＯＣ ｃｕｒｖｅｓ ｆｏｒ ｃｅｎｓｏｒｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｄａｔａ ａｎｄ ａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ、５６巻、３３７－４４頁（２０００）に示されている。

【0128】

または、カットオフ値は、患者群の生物学的試料の四分位解析により決定することができる。例えば、カットオフ値は、２５－７５百分位数範囲におけるいずれかの値に対応する値、好ましくは２５百分位数、５０百分位数または７５百分位数に対応する値、より好ましくは７５百分位数に対応する値を選択することにより決定することができる。

【0129】

そのような統計解析は、当技術分野で公知の方法を用いて実施することができ、多くの市販のソフトウエアパッケージ（例えば、Ａｎａｌｙｓｅ－ｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ．、Ｌｅｅｄｓ、ＵＫ；ＳｔａｔａＣｏｒｐ ＬＰ、Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＴＸ；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ．製）により遂行することができる。

【0130】

３． 疾患を発症するリスクを判断する方法
また本明細書で提供するのは、対象が疾患を発症するリスクがあるかどうかを判断する方法である。リスクを判断する方法は、対象が疾患を発症するリスクがあるかどうかを判断するために上述の診断の方法を適用し得る。

【0131】

リスクを判断する方法は、対象から生物学的試料を得ることおよび生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを測定することを含み得る。リスクを判断する方法は、生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと比較することおよび生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きい場合に対象が疾患を発症するリスクがあることを判断することも含み得る。

【0132】

リスクを判断する方法は、生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定すること、および生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルと比較することをさらに含み得る。生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルがそれぞれラミニンガンマ２単量体の基準レベルおよび少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルより大きい場合、対象は、疾患を発症するリスクがあると特定することもできる。

【0133】

４． 疾患の進行をモニターする方法
また本明細書で提供するのは、それを必要とする対象における疾患の進行をモニターする方法である。モニターする方法は、疾患が対象において進行したまたはしなかったかどうかを判断するために上述の診断する方法を適用し得る。

【0134】

モニターする方法は、対象から第１の生物学的試料および対象から第２の生物学的試料を得ることを含み得る。第１の生物学的試料は、対象から第２の生物学的試料を得る少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、３２日、３３日、３４日、３５日、３６日、３７日、３８日、３９日、４０日、４１日、４２日、４３日、４４日、４５日、４６日、４７日、４８日、４９日、５０日、５１日、５２日、５３日、５４日、５５日、５６日、５７日、５８日、５９日、６０日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、５２週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、１３ヵ月、１４ヵ月、１５ヵ月、１６ヵ月、１７ヵ月、１８ヵ月、１９ヵ月、２０ヵ月、２１ヵ月、２２ヵ月、２３ヵ月、２４ヵ月、１年、２年、３年、４年または５年前に対象から得ることができる。

【0135】

モニターする方法は、第１の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第１のレベルおよび第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第２のレベルを測定することも含み得る。モニターする方法は、ラミニンガンマ２単量体の第１および第２のレベルを比較することならびに（ｉ）ラミニンガンマ２単量体の第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の第１のレベルより大きい場合に疾患が対象において進行したこと、または（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体の第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の第１のレベルと同等もしくはより小さい場合に疾患が対象において進行しなかったことを判断することをさらに含み得る。

【0136】

モニターする方法は、第１の生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第１のレベルおよび第２の生物学的試料中の第２のレベルを測定することならびに少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第１および第２のレベルを比較することをさらに含み得る。モニターする方法は、ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第２のレベルがそれぞれラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第１のレベルより大きい場合に疾患が対象において進行したこと、またはラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第２のレベルがそれぞれラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第１のレベルと同等もしくはより小さい場合に疾患が対象において進行しなかったことも判断し得る。

【0137】

５． キット
また本明細書で提供するのは、上述の方法を実施する際に用いるキットである。キットは、ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーを検出することに関する取扱説明書を含み得る。キットに含められる取扱説明書は、包装材料に添付することができるまたは添付文書として含めることができる。取扱説明書は、書かれたまたは印刷物であり得るが、そのようなものに限定されない。そのような取扱説明書を保存し、それらをエンドユーザーに伝達することができる媒体は、本開示により予期されている。そのような媒体は、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などを含むが、これらに限定されない。本明細書で用いているように、「取扱説明書」という用語は、取扱説明書を提供するインターネットサイトのアドレスも含み得る。

【0138】

キットは、（１）対象から単離された生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを定量化するためのラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカー（すなわち、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９）のそれぞれに特異的に結合することができる試薬ならびに（２）ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカー（すなわち、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９）のそれぞれの基準レベルを示す参照標準を備え得るものであり、少なくとも１つの試薬は、適切なバイオマーカーに特異的に結合することができる少なくとも１つの抗体を含む。

【0139】

いくつかの実施形態において、キットは、生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９のそれぞれの濃度を定量化するためのラミニンガンマ２単量体に特異的に結合することができる試薬、ＰＩＶＫＡ－ＩＩに特異的に結合することができる試薬、ＡＦＰに特異的に結合することができる試薬、ＣＥＡに特異的に結合することができる試薬および／またはＣＡ１９－９に特異的に結合することができる試薬ならびにラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９のそれぞれの基準レベルを示す参照標準を含み得る。

【0140】

キットは、バイアルまたはビンのような、各容器が別個の試薬を含む、１つ以上の容器も含み得る。

【0141】

例えば、キットは、免疫測定法、例えば、化学発光微粒子免疫測定法によりラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーについて試験試料をアッセイすることに関する取扱説明書を含み得る。取扱説明書は、紙の形態またはディスク、ＣＤ、ＤＶＤもしくは同種のもののような、コンピュータ可読の形態であり得る。抗体は、ラミニンガンマ２単量体および／もしくは少なくとも１つの追加のバイオマーカー捕捉抗体ならびに／またはラミニンガンマ２単量体および／もしくは少なくとも１つの追加のバイオマーカー検出抗体（検出可能な標識で標識された抗体を意味する）であり得る。例えば、キットは、ラミニンガンマ２単量体に特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩに特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体、ＡＦＰに特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体、ＣＥＡに特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体および／またはＣＡ１９－９に特異的に結合する少なくとも１つの捕捉抗体を含み得る。キットは、各捕捉抗体のコンジュゲート抗体（検出可能な標識により標識された抗体のような）（すなわち、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９にそれぞれ特異的に結合する捕捉抗体のそれぞれのコンジュゲート抗体）も含み得る。代替的にまたは追加的に、キットは、アッセイを行うためのキャリブレーターもしくは対照、例えば、精製された、任意選択的に凍結乾燥された、（例えば、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９）、および／または少なくとも１つの容器（ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９モノクローナル抗体で既に被覆され得る、例えば、管、マイクロタイタープレートもしくはストリップ）、および／またはそのいずれか１つが濃縮溶液、検出可能な標識（例えば、酵素標識）用の基質溶液もしくは停止溶液として供給され得る、アッセイ緩衝液もしくは洗浄緩衝液を含み得る。好ましくは、キットは、アッセイを実施するために必要である、すべての構成要素、すなわち、試薬、標準、緩衝液、希釈剤等を含む。取扱説明書は、ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカー（例えば、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９）を定量化する目的のための標準曲線または参照標準を作製することに関する取扱説明書も含み得る。

【0142】

上で暗示したように、ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカー（例えば、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９）に特異的な組換え抗体のような、キットに備えられている、抗体は、発蛍光団、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識もしくは同種のもののような、検出可能な標識を組み込み得る、またはキットは、抗体を標識するための試薬または抗体（例えば、検出抗体）を検出するためのおよび／もしくは分析物を標識するための試薬または分析物を検出するための試薬を含み得る。抗体、キャリブレーターおよび／または対照は、別個の容器に入れてまたは適切なアッセイ形式、例えば、マイクロタイタープレートに事前に分注されて供給され得る。

【0143】

任意選択的に、キットは、品質管理構成要素（例えば、感度パネル、キャリブレーターおよび陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は、当技術分野で周知であり、様々な免疫診断製品のインサートシートに記載されている。感度パネルメンバーは、アッセイの性能特性を立証するために任意選択的に用いられ、免疫測定法キット試薬の完全性およびアッセイの標準化のさらに任意選択的に有用な指標である。

【0144】

キットは、緩衝液、塩、酵素、酵素補因子、基体、検出試薬などのような、診断アッセイを実施するためまたは品質管理評価を促進するために必要な他の試薬も任意選択的に含み得る。単離および／または試験試料の処理用の緩衝液および溶液（例えば、前処理試薬）のような、他の構成要素もキットに含まれ得る。キットは、１つ以上の他の対照をさらに含み得る。キットの１つ以上の構成要素を凍結乾燥することができ、その場合、キットは、凍結乾燥構成要素の再構成に適する試薬をさらに含み得る。

【0145】

キットの様々な構成要素は、任意選択的に必要に応じて適切な容器、例えば、マイクロタイタープレートに入れて供給される。キットは、試料を保持するまたは保存するための容器（例えば、血液試料用の容器またはカートリッジ）をさらに含み得る。適切な場合、キットは、任意選択的に反応容器、混合容器および試薬または試験試料の調製を促進する他の構成要素も含み得る。キットは、注射器、ピペット、ピンセット、計量スプーンまたは同種のもののような、試験試料を得ることを補助する１つ以上の器具も含み得る。

【0146】

検出可能標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットは、少なくとも１つのアクリジニウム－９－カルボキサミド、少なくとも１つのアクリジニウム－９－カルボキシレートアリールエステルまたはそれらのいずれかの組合せを含み得る。検出可能標識が少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットは、緩衝液、溶液および／または少なくとも１つの塩基性溶液のような、過酸化水素の源も含み得る。

【0147】

所望の場合、キットは、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、濾紙、石英結晶、ディスクまたはチップのような、固相を含み得る。キットは、検出抗体として機能する抗体のような、抗体にコンジュゲートさせることができるまたはコンジュゲートされている検出可能な標識も含み得る。検出可能な標識は、例えば、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、化学発光団、発蛍光団、蛍光消光剤、化学発光消光剤またはビオチンであり得る、直接標識であり得る。キットは、標識を検出するために必要な追加の試薬を任意選択的に含み得る。

【0148】

所望の場合、キットは、がんのバイオマーカーのような、バイオマーカーであり得る、他の分析物について試験試料をアッセイするための、単独でのまたは取扱説明書とさらに組み合わされた、１つ以上の構成要素をさらに含み得る。分析物の例は、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９ならびにラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９の断片、そのうえ本明細書で述べた、または当技術分野で別途公知の他の分析物およびバイオマーカーを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカー（例えば、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９）について試験試料をアッセイするための１つ以上の構成要素は、ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカー（例えば、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９）の存在、量または濃度の決定を可能にする。血清試料のような、試料は、ＴＯＦ－ＭＳおよび内部標準を用いてラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカー（例えば、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９）についてもアッセイすることができる。

【0149】

本明細書で述べたように免疫測定法により試験試料中のラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカー（例えば、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９）の濃度を検出する、キット（またはその構成要素）ならびに上述の方法は、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号に記載され、例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）としてＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）により市販されているような、様々な自動および半自動システム（固相が微粒子を含むものを含む）用に適応させることができる。

【0150】

非自動システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較した自動または半自動システムとのいくつかの差は、第１の特異的結合パートナー（例えば、分析物抗体または捕捉抗体）が結合している基体（サンドイッチの形成および分析物の反応性に影響を及ぼし得る）ならびに捕捉、検出および／または任意選択の洗浄ステップの時間の長さおよび時期を含む。ＥＬＩＳＡのような非自動方式は、試料および捕捉試薬との比較的により長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）を必要とし得るが、自動または半自動方式（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）およびサクセッサープラットフォーム、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、比較的により短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）について約１８分）を有し得る。同様に、ＥＬＩＳＡのような非自動方式は、比較的により長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）にわたりコンジュゲート試薬のような検出抗体をインキュベートし得るが、自動または半自動方式（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）およびサクセッサープラットフォーム）は、比較的により短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）およびサクセッサープラットフォームについて約４分）を有し得る。

【0151】

Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームは、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、その全体として参照により組み込む、米国特許第５，２９４，４０４号参照）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩならびに他のプラットフォームを含むが、これらに限定されない。さらに、アッセイ、キットおよびキット構成要素は、他の方式で、例えば、電気化学または他の携帯式もしくは臨床現場即時システムにおいて用いることができる。本開示は、例えば、サンドイッチ免疫測定法を実施する市販のＡｂｂｏｔｔ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ （ｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学免疫測定システムに適用できる。免疫センサーならびにそれらの製造および使い捨て試験装置における操作の方法は、例えば、それらに関するそれらの教示について参照によりそれらの全体として組み込む、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号、米国特許出願公開第２００５／００５４０７８号および米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号に記載されている。

【0152】

特に、Ｉ－ＳＴＡＴ（登録商標）システムへのアッセイの適応に関して、以下の構成が好ましい。金アンペロメトリー作用電極および銀－塩化銀参照電極の対を有する、微細加工シリコンチップを製造する。作用電極の１つにおいて、固定化捕捉抗体を有するポリスチレンビーズ（直径０．２ｍｍ）を電極上のパターン化ポリビニルアルコールのポリマーコーティングに付着させる。このチップを免疫測定法に適する流体工学方式のＩ－ＳＴＡＴ（登録商標）カートリッジにアセンブルする。カートリッジの試料保持チャンバーの壁の一部にアルカリホスファターゼ（または他の標識）で標識された検出抗体を含む層が存在する。カートリッジの液体パウチ内にｐ－アミノフェノールホスフェートを含む水性試薬が存在する。

【0153】

操作に際して、ラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカーを含むと推測される試料を試験カートリッジの保持チャンバーに加え、カートリッジをＩ－ＳＴＡＴ（登録商標）リーダーに挿入する。二次抗体（検出抗体）が試料中に溶解した後、カートリッジ内のポンプエレメントが試料をチップを含む管路中に強制的に通す。ここでそれが振動させられて、一次捕捉抗体と標識二次検出抗体との間のサンドイッチの形成を促進する。アッセイの最後から２番目のステップにおいて、流体がパウチから強制的に管路に排出されて、試料をチップから洗い流し、廃棄チャンバーに入る。アッセイの最終ステップにおいて、アルカリホスファターゼレベルがｐ－アミノフェノールホスフェートと反応して、リン酸基を切断し、放出されたｐ－アミノフェノールが作用電極において電気化学的に酸化される。測定電流に基づいて、リーダーは、内蔵アルゴリズムおよび製造所決定較正曲線により試料中のラミニンガンマ２単量体および／または少なくとも１つの追加のバイオマーカー（例えば、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰ、ＣＥＡおよび／またはＣＡ１９－９）の量を計算することができる。

【0154】

本発明は、以下の非限定的実施例によって例示される、複数の態様を有する。

【実施例】

【0155】

［実施例１］
方法および方法
抗体および抗原 組換え単量体Ｌｎ－γ２タンパク質は、Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞形質転換体から精製した。組換えヘテロ三量体Ｌｎ－３３２は、Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）から購入した。ＣＬＩＡおよびウエスタンブロッティングのために、モノクローナル抗Ｌｎ－γ２抗体（２Ｈ２）およびポリクローナル抗Ｌｎ－γ２ドメインＩＩＩ抗体を実施例２で述べるように調製した。マウスモノクローナル抗Ｌｎ－α３抗体は、Ｏｒｉｅｎｔａｌ Ｙｅａｓｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。

【0156】

ＨＣＣの腫瘍マーカーの分析 血清ＡＦＰレベルは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴシステムを用いることにより測定し、ＰＩＶＫＡ－ＩＩレベルは、ＳＲＬ Ｔｏｋｙｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）におけるＬＵＭＩＰＵＬＳＥ（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ Ｉｎｃ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いることにより測定した。

【0157】

統計解析 血清Ｌｎ－γ２レベルは、平均値±標準偏差（ＳＤ）および中央値：範囲として報告した。血清ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩレベルは、中央値：範囲として報告した。ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩ値についてＨＣＣを有する患者における両マーカーの大きい範囲を説明するために対数変換を用いた。連続データについてＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いた。０．０５未満のｐ値を有意と見なした。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＡｎａｌｙｓｅ－ｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（図２－６および９－１４）を用いて、散布図、受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、ＲＯＣ（ＡＵＣ）曲線下面積の計算を行った。最適カットオフポイントは、（０、１）に最も近いＲＯＣ曲線上のポイントを含んでいた。

【0158】

［実施例２］
ラミニンガンマ２単量体免疫測定法
ラミニンガンマ２単量体を特異的に検出した免疫測定法が確立された。

【0159】

完全自動化化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ） ヒトＬｎ－γ２タンパク質濃度は、２Ｈ２抗体（Ｎａｋａｇａｗａ Ｍら、原稿作成中）およびアクリジニウムで標識されたウサギポリクローナルにより被覆された常磁性微粒子を用いて２ステップサンドイッチアッセイにより測定した。アッセイ方法は、完全自動検出装置（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ）への適用のために調整した。

【0160】

ラミニンガンマ２単量体に対するポリクローナル抗体の生成 ラミニンガンマ２単量体に対するポリクローナル抗体は、ヒトラミニンガンマ２単量体の精製ドメインＩＩＩ（アミノ酸３８３－６０８）によりウサギに免疫付与することによって生成させた。この組換えドメインＩＩＩは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、それから精製した。具体的には、ドメインＩＩＩは、Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧＳＴ融合タンパク質として発現させた。ウサギ血清は、プロテインＡカラムを用いて精製した。ポリクローナル抗体のさらなる精製は、ジメチルピメルイミデート二塩酸塩（ＤＭＰ）によりドメインＩＩＩとコンジュゲートした抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体磁気アガロース（ＭＢＬ）を用いて実施した。精製ポリクローナル抗体も濃縮した。

【0161】

２Ｈ２モノクローナル抗体 ２Ｈ２ ｍＡｂは、Ｎ． Ｋｏｓｈｉｋａｗａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００８）、６８巻（２号）、５３０－５３６頁に記載されているマウスモノクローナル抗体である。２Ｈ２ ｍＡｂは、プロテインＧカラムにより培養ハイブリドーマの上清から精製した。

【0162】

組換えラミニンガンマ２単量体の生成 全長ラミニンガンマ２単量体をコードする遺伝子をＭＤＣＫ細胞に導入して、ラミニンガンマ２単量体を発現するトランスフェクトＭＤＣＫ細胞を作製した。限界希釈により、高レベルのラミニンガンマ２単量体を発現するＭＤＣＫ細胞を選択し、血清不含有ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ラミニンガンマ２単量体は、２Ｈ２モノクローナル抗体（２Ｈ２ ｍＡｂ）カラムを用いて精製し、硫酸アルミニウム沈殿により濃縮した。

【0163】

免疫測定法 ２Ｈ２ ｍＡｂを常磁性微粒子上に固定化した。具体的には、微粒子をＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で洗浄し、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチル－カルボジイミドヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を洗浄済み微粒子に加えた。室温で３０分のインキュベーションの後、微粒子を洗浄し、２Ｈ２ ｍＡｂをＭＥＳ緩衝液で希釈し、洗浄済み微粒子に加えた。室温で２時間のインキュベーションの後、微粒子をＴＢＳ、１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で洗浄し、次いで保存した。

【0164】

微粒子希釈緩衝液は、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ、０．２％スキムミルク、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（登録商標）、０．２ｍｇ／ｍＬ ＨＢＲ、０．２ｍｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００および１００ｐｐｍ Ｆｏａｍａｗａｙを含むＴＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４であった。微粒子を微粒子希釈緩衝液で０．０５％の最終固体濃度に希釈した。

【0165】

ヒトラミニンガンマ２単量体のドメインＩＩＩに対する上述のウサギポリクローナル抗体を検出抗体として用いた。具体的には、このポリクローナル抗体を０．５％ ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ緩衝液中でアクリジニウムにコンジュゲートさせた。過剰のアクリジニウムをＺｅｂａ Ｍｉｃｒｏ Ｄｅｓａｌｔ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ （Ｔｈｅｒｍｏ）により除去した。得られたアクリジニウム標識抗体を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．０９％ ＴｒｉｔｏｎＸ４０５、２．０ｍｇ／ｍＬウシガンマグロブリン、５％ＢＳＡ、２％ Ｔｗｅｅｎ－２０（登録商標）、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ３００および１００ｐｐｍ Ｆｏａｍａｗａｙを含むＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．３に溶解した。

【0166】

免疫測定法希釈溶液は、１％ ＢＳＡ、１６．１％スクロース、０．０７５％アジ化ナトリウム、０．１％ ＰｒｏＣｌｉｎ９５０および１００ｐｐｍ Ｆｏａｍａｗａｙを含むＴＢＳ緩衝液、ｐＨ８．０であった。試料希釈剤は、１％ ＢＳＡおよび０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（登録商標）を含むＰＢＳ緩衝液であった。免疫測定法用のキャリブレーターは、試料希釈剤で希釈した組換えラミニンガンマ２単量体であった。具体的には、ラミニンガンマ２単量体のキャリブレーターは、０ｎｇ／ｍＬから２０ｎｇ／ｍＬまでの範囲にあった。具体的な量は、０．００、０．０１、０．０２、０．０５、０．１０、１．００、１０．００および２０．００ｎｇ／ｍＬであった。

【0167】

免疫測定法は、免疫測定器具、すなわち、ｉ２０００ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ分析装置で実施した。ラミニンガンマ２単量体の較正曲線は、キャリブレーターを用いて作成した。例示的較正曲線を図１に示す。

【0168】

［実施例３］
標本中のラミニンガンマ２単量体の検出
上記の実施例２で述べた免疫測定法を用いて、様々な標本中のラミニンガンマ２単量体の血清濃度を検出した。血清試料は、標本から採取し、上述の試料希釈剤で希釈した。

【0169】

標本 標本は、肝細胞癌（ＨＣＣ）標本、膵臓がん標本、大腸直腸がん（ＣＲＣ）標本、胃がん標本、肝硬変（ＬＣ）標本、肝炎標本、膵炎／胆管炎標本、多発がん／転移標本、肝不全標本、良性標本、健常ドナー標本および他のがん標本であった。標本は、Ｓｔ． Ｍａｒｉａｎｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおいて採取された。正常対照のために、肝疾患の病歴を有さず、アルコール摂取が４０ｇ／週未満であり、ウイルス性肝炎のリスクファクターを有さない健常志願者から健常ドナー標本を採取した。Ｌｎ－γ２のカットオフ値を確立するために、５２例の健常日本人志願者からの対照血清を分析した。健常志願者および慢性肝疾患またはＨＣＣを有する患者の人口統計学的および臨床特性を表１に示す。健常志願者の血清Ｌｎ－γ２レベルの平均値および中央値は、それぞれ４４．３±１７．６ｐｇ／ｍＬ（平均値±ＳＤ）および４１．１ｐｇ／ｍＬ（範囲：１０．９－７９．０ｐｇ／ｍＬ）であった。

【0170】

【表1】

【0171】

結果 図２Ａおよび２Ｂに表示した標本についてのラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）のドットプロットを示す。各標本を黒丸によって示した。標本の各群の平均血清濃度を実線によって示した。健常ドナー（ＨＤ）の平均値プラス２標準偏差（平均値＋２ＳＤ）もｘ軸の全長に広がる実線で示し、７９．５ｐｇ／ｍＬであった。図２Ｃおよび２Ｄに表示した標本についてのラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）のドットプロットを示す。各標本を黒丸によって示した（図２Ｃおよび２Ｄ）。標本の各群の平均血清濃度を実線によって示した。健常ドナー（ＨＤ）と比較したＨＣＣのＲＯＣ分析から得られたカットオフ値もｘ軸の全長に広がる実線で示し、７５．９ｐｇ／ｍＬであった。ラミニンガンマ２単量体の血清濃度は、ＨＣＣおよび膵臓がん標本において健常ドナー標本および他の消化器癌（すなわち、大腸直腸がんおよび胃がん）を有する標本と比較してより高かった。

【0172】

さらに、ラミニンガンマ２単量体の血清濃度は、ＨＣＣおよび膵臓がん標本において肝硬変標本、ＣＨ標本および膵炎／胆管炎標本と比較してより高かった。しかし、ラミニンガンマ２単量体のより高い血清濃度を有する１つの肝硬変標本は、３９．９ｎｇ／ｍＬのアルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）のレベルを有していた（図２Ｂおよび２Ｄ）。ラミニンガンマ２単量体のより高い血清濃度を有する１つのＣＨ標本は、３９．０ｎｇ／ｍＬのアルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）のレベルを有していた（図２Ｂおよび２Ｄ）。ラミニンガンマ２単量体のより高い血清濃度を有する１つの膵炎／胆管炎標本は、７９．０Ｕ／ｍＬの炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）のレベルを有していた。したがって、ラミニンガンマ２単量体のより高い血清濃度を有していたＨＣＣおよび膵臓がん以外の標本は、異常なレベルのＡＦＰおよびＣＡ１９－９のような他のがんマーカーを有していた。

【0173】

［実施例４］
Ｉ－ＩＶ期のＨＣＣにおけるラミニンガンマ２単量体の血清濃度
実施例３で述べたように、ラミニンガンマ２単量体の血清濃度は、ＨＣＣ標本において高かった。ＨＣＣの異なる病期におけるラミニンガンマ２単量体の血清濃度に関してＨＣＣ標本をさらに検討した。具体的には、上記の実施例２で述べた免疫測定法を用いて、Ｉ期ＨＣＣ、ＩＩ期ＨＣＣ、ＩＩＩ期ＨＣＣおよびＩＶ期ＨＣＣ標本ならびに肝硬変（ＬＣ）、肝炎（ＣＨ）および健常ドナー標本のラミニンガンマ２単量体の血清濃度を検出した。血清試料は、標本から採取し、上述の試料希釈剤で希釈した。

【0174】

結果 これらの試験の結果を図３Ａ－３Ｂに示す。図には表示した標本の各群のラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。各標本を黒丸で示した。各標本群のラミニンガンマ２単量体の平均血清濃度を実線で示した。ｘ軸の全長に広がる実線は、健常ドナー標本の平均値プラス２標準偏差（平均値＋２ＳＤ）を示し、これは図３Ａにおいて７９．５ｐｇ／ｍＬであった。ｘ軸の全長に広がる実線は、健常ドナー（ＨＤ）と比較したＨＣＣのＲＯＣ分析から得られたカットオフ値を示したものであり、これもｘ軸の全長に広がる実線で示し、図３Ｂにおいて７５．９ｐｇ／ｍＬであった。

【0175】

図３Ａ－３Ｂに示すように、ラミニンガンマ２単量体の血清濃度の上昇が、ＬＣ、ＣＨおよび健常ドナー標本と比較したときＩ期ＨＣＣ、ＩＩ期ＨＣＣ、ＩＩＩ期ＨＣＣおよびＩＶ期ＨＣＣ標本において認められた。ラミニンガンマ２単量体のより高い血清濃度を有するＬＣおよびＣＨ標本は、がんマーカーアルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）の異常なレベル、すなわち３９．９ｎｇ／ｍＬおよび ３９．０ｎｇ／ｍＬを有していた。したがって、これらの結果は、ラミニンガンマ２単量体が早期ＨＣＣ標本からの血清中に検出されたことおよび血清中のラミニンガンマ２単量体のレベルがＨＣＣの病期とともに増加した（すなわち、ＨＣＣの病期依存的に増加した）ことを示すものであった。

【0176】

ＴＮＭ分類によれば、１０例の患者がＩ期と、１８例がＩＩ期と、２１例がＩＩＩ期と、８例がＩＶ期と診断された。Ｌｎ－γ２レベルは、Ｉ期からＩＶ期へと増加し、それぞれ１１４．３ｐｇ／ｍＬ（範囲：６５．３－３２３．６ｐｇ／ｍＬ）、１８４．３ｐｇ／ｍＬ（範囲：３９．５－５４９．１ｐｇ／ｍＬ）、１７４．６ｐｇ／ｍＬ（範囲：３２．４－９８５．８ｐｇ／ｍＬ）および２４８．１ｐｇ／ｍＬ（範囲：５９．８－５２９．４ｐｇ／ｍＬ）のレベルの中央値（範囲）を有していた（図１２）。対応するＡＦＰ値は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ期ＨＣＣについてそれぞれ５．３ｎｇ／ｍＬ（範囲：２．２－４４．６ｎｇ／ｍＬ）、１６．２ｎｇ／ｍＬ（範囲：１．５－８９９ｎｇ／ｍＬ）、７２．５ｎｇ／ｍＬ（範囲：３．２－２３６４ｎｇ／ｍＬ）および１１１６ｎｇ／ｍＬ（範囲：５．３－４１７１９８ｎｇ／ｍＬ）ｎｇ／ｍＬであった（図１３）。対応するＰＩＶＫＡ－ＩＩ値は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ期ＨＣＣについてそれぞれ５５．０ｍＡＵ／ｍＬ（範囲：１４．０－３０２ｍＡＵ／ｍＬ）、４７．５ｍＡＵ／ｍＬ（範囲：１３．０－５３８０）ｍＡＵ／ｍＬ、１６２ｍＡＵ／ｍＬ（範囲：１１．０－２０７７９）および６８３ｍＡＵ／ｍＬ（範囲：３２．０－７５０００ｍＡＵ／ｍＬ）であった（図１４）。早期ＨＣＣ（Ｔ１またはＴ２）を有する患者では、Ｌｎ－γ２、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの陽性率は、それぞれ１７／２８（６１％）、１１／２８（３９％）および１６／２８（５７％）であった。

【0177】

［実施例５］
ＨＣＣのマーカーとしてのラミニンガンマ２単量体の特異度および感度
ＨＣＣのマーカーとしてのラミニンガンマ２単量体、アルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）およびビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）の特異度および感度を検討した。具体的には、５７個のＨＣＣ標本および７６個の健常ドナー、肝硬変（ＬＣ）または肝炎（ＣＨ）標本の合計１３３個の標本における各マーカーのレベルを検討した。

【0178】

ＨＣＣ標本におけるラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの観測された真の陽性率を健常ドナー、ＬＣおよびＣＨ標本におけるラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの観測された偽陽性率に対してプロットすることによって受診者動作特性（ＲＯＣ）グラフを作成した。したがって、ＲＯＣグラフは、特異度（偽陽性頻度（ＦＰＦ））に対する感度（真の陽性頻度（ＴＰＦ））のプロットであった。１．０００の値は、１００％の感度および１００％の特異度を表していた。このＲＯＣグラフを図４Ａに示し、ラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩのそれぞれの曲線下面積（ＡＵＣ）を表２に示す。

【0179】

【表2】

【0180】

ＨＣＣのマーカーとしてのラミニンガンマ２単量体、アルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）およびビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）の特異度および感度を検討した。具体的には、５７個のＨＣＣ標本および５２個の健常ドナーの合計１０９個の標本における各マーカーのレベルを検討した。血清Ｌｎ－γ２レベルは、慢性肝疾患を有する２４例の患者およびＨＣＣを有する５７例の患者において測定した（図９）。ＨＣＶの感染が肝疾患を有する対象の２つの群間の最も一般的な病因であった。Ｌｎ－γ２濃度の中央値は、７６．７ｐｇ／ｍＬで、範囲が３８．７ｐｇ／ｍＬから２１５．９ｐｇ／ｍＬまで（慢性肝疾患を有する患者）および１７３．２ｐｇ／ｍＬで、範囲が３２．４ｐｇ／ｍＬから９８６ｐｇ／ｍＬまで（ＨＣＣを有する患者）であった。慢性肝疾患を有する患者および健常志願者と比較した場合、Ｌｎ－γ２レベルの有意な増加がＨＣＣを有する患者に認められた（ｐ＜０．０１）。

【0181】

ＨＣＣ標本におけるラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの観測された真の陽性率を健常ドナー標本におけるラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの観測された偽陽性率に対してプロットすることによって受診者動作特性（ＲＯＣ）グラフを作成した。したがって、ＲＯＣグラフは、特異度（偽陽性頻度（ＦＰＦ））に対する感度（真の陽性頻度（ＴＰＦ））のプロットであった。１．０００の値は、１００％の感度および１００％の特異度を表していた。このＲＯＣグラフを図４Ｂに示し、ラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩのそれぞれの曲線下面積（ＡＵＣ）を表３に示す。

【0182】

【表3】

【0183】

カットオフ値を７５．９ｐｇ／ｍＬに設定した場合、感度および特異度は、それぞれ８６％（９５％信頼区間［ＣＩ］、７４－９４％）および９８％（９５％ＣＩ、９０－９９％）であった。健常志願者とＨＣＣを有する患者とを比較した場合、Ｌｎ－γ２の識別能力（ＲＯＣ曲線ＡＵＣ＝０．９５２；９５％ＣＩ、９１－９９％）は、ＰＩＶＫＡ－ＩＩのそれ（ＲＯＣ曲線ＡＵＣ＝０．８２５；９５％ＣＩ、７３－９２％、ｐ＜０．０５）を有意に上回り、それは、ＡＦＰ（ＲＯＣ曲線ＡＵＣ＝０．９２９；９５％ＣＩ、８８－９８％）と同様に有効であった。健常志願者を、非悪性慢性肝疾患を有する患者と比較した場合、このカットオフ値は、Ｌｎ－γ２の識別能力（ＲＯＣ曲線ＡＵＣ＝０．８１９；９５％ＣＩ、７２－９２％）とそれぞれ５０％（９５％ＣＩ、２９－７１％）および９６％（９５％ＣＩ、８７－９９％）の感度および特異度をもたらした。このカットオフ値により、Ｌｎ－γ２陽性は、健常志願者、慢性肝疾患を有する患者およびＨＣＣを有する患者におけるそれぞれ１例（２％）、１２例（５０％）および５０例（８６％）の対象において見いだされた。これらの結果は、このカットオフ値（＞７５．９ｐｇ／ｍＬ）が、ＨＣＣを伴うまたは伴わない、慢性肝疾患を有する患者と健常対象とを区別するのに有用であることを示すものである。

【0184】

ＨＣＣのマーカーとしてのラミニンガンマ２単量体、アルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）およびビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）の特異度および感度を検討した。具体的には、５７個のＨＣＣ標本および２４個の肝炎（ＣＨ）標本の合計８１個の標本における各マーカーのレベルを検討した。

【0185】

ＨＣＣ標本におけるラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの観測された真の陽性率をＣＨ標本におけるラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの観測された偽陽性率に対してプロットすることによって受診者動作特性（ＲＯＣ）グラフを作成した。したがって、ＲＯＣグラフは、特異度（偽陽性頻度（ＦＰＦ））に対する感度（真の陽性頻度（ＴＰＦ））のプロットであった。１．０００の値は、１００％の感度および１００％の特異度を表していた。このＲＯＣグラフを図４Ｃに示し、ラミニンガンマ２単量体、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩのそれぞれの曲線下面積（ＡＵＣ）を表４に示す。

【0186】

【表4】

【0187】

ＨＣＣと非悪性慢性肝疾患とを区別するための最適カットオフ値は、１１６．６ｐｇ／ｍＬであり（図４Ｃ）、それぞれ６３％（９５％ＣＩ、４９－７６％）および８３％（９５％ＣＩ、６３－９５％）の感度および特異度であった。慢性肝疾患を有する患者とＨＣＣを有する患者とを区別する場合、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ（ＲＯＣ曲線ＡＵＣ＝０．８４５；９５％ＣＩ、７６－９３％）が、Ｌｎ－γ２（ＲＯＣ曲線ＡＵＣ＝０．７９３；９５％ＣＩ、６９－８９％；差は統計的に有意でなかった）およびＡＦＰ（ＲＯＣ曲線ＡＵＣ＝０．７８８；９５％ＣＩ、６９－８９％）より性能が優れていた。Ｌｎ－γ２陽性（＞１１６．６ｐｇ／ｍＬ）は、健常志願者、慢性肝疾患を有する患者およびＨＣＣを有する患者におけるそれぞれ０例／５２例（０％）、４例／２４例（１７％）および３６例／５７例（６３％）の対象において認められた。ＡＦＰ陽性（＞２０ｎｇ／ｍＬ；日本人対象における報告された正常上限）（６）は、健常志願者、慢性肝疾患を有する患者およびＨＣＣを有する患者におけるそれぞれ０例／５２例（０％）、４例／２４例（１７％）および３０例／５７例（５３％）の対象において認められた。ＡＦＰの濃度の中央値（範囲）は、２．３ｎｇ／ｍＬ（健常対照、範囲：０．９－８．２ｎｇ／ｍＬ）、３．８ｎｇ／ｍＬ（慢性肝疾患患者、範囲：１．２－１０９．７ｎｇ／ｍＬ）および２４．４ｎｇ／ｍＬ（ＨＣＣ患者、範囲：１．５－４１７１９９ｎｇ／ｍＬ）であった（図１０）。ＰＩＶＫＡ－ＩＩ陽性（＞４０ｍＡＵ／ｍＬ、日本人対象における報告された正常上限）（６）は、健常志願者、慢性肝疾患を有する患者およびＨＣＣを有する患者におけるそれぞれ１例／５２例（１．９％）、１例／２４例（４．２％）および３９例／５７例（６８％）の対象において認められた。ＰＩＶＫＡ－ＩＩの濃度の中央値（範囲）は、２４．５ｍＡＵ／ｍＬ（健常対照、範囲：１５．０－４５．０ｍＡＵ／ｍＬ）、２１．０ｍＡＵ／ｍＬ（慢性肝疾患を有する患者、範囲：１２．０－５８．０ｍＡＵ／ｍＬ）および１０３ｍＡＵ／ｍＬ（ＨＣＣを有する患者、範囲：１１．０－７５０００ｍＡＵ／ｍＬ）であった（図１１）。Ｌｎ－γ２、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩレベルは、ＨＣＣを有する患者の血清において健常志願者および慢性肝疾患を有する患者の両方の血清と比較して有意に上昇した（ｐ＜０．００１）ことが見いだされた。Ｌｎ－γ２およびＡＦＰレベルは、慢性肝疾患を有する患者の血清において健常志願者の血清と比較して有意に上昇した（ｐ＜０．０１）ことが見いだされた。

【0188】

これらの結果は、ラミニンガンマ２単量体がＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩよりもＨＣＣのマーカーとしての高い感度および特異度を示し、したがって、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩよりもＨＣＣの正確なマーカーであったことを示すものであった。

【0189】

さらに、図５Ａおよび表５にラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰおよびそれらの組合せのＨＣＣを検出する陽性率を示す。ラミニンガンマ２単量体のカットオフは、７９．５ｐｇ／ｍＬであった、健常ドナー標本の平均値プラス２標準偏差（平均値＋２ＳＤ）であった。３つのＨＣＣ標本は、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの３つすべてについて陰性であった。

【0190】

【表5】

【0191】

これらの結果は、ラミニンガンマ２単量体がＰＩＶＫＡ－ＩＩまたはＡＦＰよりもＨＣＣを検出する高い陽性率を有していたことを示すものであった。ＨＣＣを検出する陽性率は、ラミニンガンマ２単量体とＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの組合せで同じ、すなわち、８０％であった。

【0192】

ＨＣＣを検出する陽性率は、ラミニンガンマ２単量体をＰＩＶＫＡ－ＩＩまたはＡＦＰと組み合わせた場合にラミニンガンマ２単量体単独と比較して増加した、すなわち、９３．０％または８６．０％対７７．２％であった。しかし、３つのマーカーのすべての組合せは、ラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの組合せによってもたらされたＨＣＣを検出する陽性率（９３．０％）と同等であったＨＣＣを検出する陽性率（９４．７％）をもたらした。したがって、ラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの組合せへのＡＦＰの追加は、ＨＣＣを検出する陽性率をさらに増加させなかった。

【0193】

図５Ｂおよび表６にラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＡＦＰおよびそれらの組合せのＨＣＣを検出する陽性率を示す。ラミニンガンマ２単量体カットオフは、健常ドナー（ＨＤ）と比較したＨＣＣのＲＯＣ分析から計算し、これは７５．９ｐｇ／ｍＬであった。３つのＨＣＣ標本は、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの３つすべてについて陰性であった。

【0194】

【表6】

【0195】

これらの結果は、ラミニンガンマ２単量体がＰＩＶＫＡ－ＩＩまたはＡＦＰよりもＨＣＣを検出する高い陽性率を有していたことを示すものであった。ＨＣＣを検出する陽性率は、ラミニンガンマ２単量体とＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの組合せで同じ、すなわち、８０％であった。

【0196】

ＨＣＣを検出する陽性率は、ラミニンガンマ２単量体をＰＩＶＫＡ－ＩＩまたはＡＦＰと組み合わせた場合にラミニンガンマ２単量体単独と比較して増加した、すなわち、８４．２％または９４．７％対８７．７％であった。しかし、３つのマーカーのすべての組合せは、ラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの組合せによってもたらされたＨＣＣを検出する陽性率（９４．７％）と同等であったＨＣＣを検出する陽性率（９４．７％）をもたらした。したがって、ラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの組合せへのＡＦＰの追加は、ＨＣＣを検出する陽性率をさらに増加させなかった。

【0197】

図５Ｃおよび表７にラミニンガンマ２単量体（＞１１６．６ｐｇ／ｍＬ）、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ（＞４０ｍＡＵ／ｍＬ）、ＡＦＰ（＞２０ｎｇ／ｍＬ）およびそれらの組合せのＨＣＣを検出する陽性率を示す。ラミニンガンマ２単量体カットオフ値は、肝炎（ＣＨ）標本と比較したＨＣＣのＲＯＣ分析から計算し、これは１１６．６ｐｇ／ｍＬであった。Ｌｎ－γ２およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの組合せは、５１例／５７例の患者（８９．５％）において検出されたが、Ｌｎ－γ２およびＡＦＰの組合せは、４６例／５７例（８０．７％）においてならびにＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの組合せは、４７例／５７例（８２．５％）において検出された。３つのマーカーのすべての組合せは、５４例／５７例の患者（９４．７％）において検出された。興味深いことに、ＰＩＶＫＡ－ＩＩについて陰性であった患者の６７％（１２例／１８例）がＬｎ－γ２について陽性を示した。３つのＨＣＣ標本は、ラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの３つすべてについて陰性であった。

【0198】

【表7】

【0199】

これらの結果は、ラミニンガンマ２単量体がＰＩＶＫＡ－ＩＩまたはＡＦＰよりもＨＣＣを検出する高い陽性率を有していたことを示すものであった。ＨＣＣを検出する陽性率は、ラミニンガンマ２単量体とＡＦＰおよびＰＩＶＫＡ－ＩＩの組合せで同じ、すなわち、８０％であった。

【0200】

ＨＣＣを検出する陽性率は、ラミニンガンマ２単量体をＰＩＶＫＡ－ＩＩまたはＡＦＰと組み合わせた場合にラミニンガンマ２単量体単独と比較して増加した、すなわち、６３．２％または８９．５％対８０．７％であった。しかし、３つのマーカーのすべての組合せは、ラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの組合せによってもたらされたＨＣＣを検出する陽性率（８９．５％）と同等であったＨＣＣを検出する陽性率（９４．７％）をもたらした。したがって、ラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの組合せへのＡＦＰの追加は、ＨＣＣを検出する陽性率をさらに増加させなかった。

【0201】

［実施例６］
ＩＩＩおよびＩＶ期の膵臓がんにおけるラミニンガンマ２単量体の血清濃度
実施例３で述べたように、ラミニンガンマ２単量体の血清濃度は、膵臓がん標本においてより高かった。膵臓がんの異なる病期におけるラミニンガンマ２単量体の血清濃度に関して膵臓がん標本をさらに検討した。具体的には、実施例２で述べた免疫測定法を用いて、ＩＩＩ期膵臓がんおよびＩＶ期膵臓がん標本ならびに膵炎および健常ドナー標本のラミニンガンマ２単量体の血清濃度を検出した。血清試料を標本から採取し、上述の試料希釈剤で希釈した。

【0202】

結果 これらの試験の結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。図には表示した標本の各群のラミニンガンマ２単量体の血清濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。各標本を黒丸で示した。各標本群のラミニンガンマ２単量体の平均血清濃度を実線で示した。ｘ軸の全長に広がる実線は、健常ドナー標本の平均値プラス２標準偏差（平均値＋２ＳＤ）を示し、これは図６Ａにおいて７９．５ｐｇ／ｍＬであった。ｘ軸の全長に広がる実線は、ＲＯＣ分析から得られたカットオフ値を示したものであり、これは、図６Ｂにおいて７５．９ｐｇ／ｍＬであった。

【0203】

図６Ａおよび６Ｂに示すように、ラミニンガンマ２単量体の血清濃度の上昇が、膵炎および健常ドナー標本と比較したときＩＩＩ期膵臓がんおよびＩＶ期膵臓がんにおいて認められた。したがって、これらの結果は、血清中のラミニンガンマ２単量体のレベルが膵臓がんの病期とともに増加した（すなわち、病期依存的に増加した）ことを示すものであった。

【0204】

［実施例７］
膵臓がんのマーカーとしてのラミニンガンマ２単量体の特異度および感度
膵臓がんのマーカーとしてのラミニンガンマ２単量体、がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）の特異度および感度を検討した。具体的には、２０個の膵臓がん標本および６０個の膵炎または健常ドナー標本の合計８０個の標本における各マーカーのレベルを検討した。膵臓がん標本におけるラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の観測された真の陽性率を健常ドナーまたは膵炎標本におけるラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の観測された偽陽性率に対してプロットすることによって受診者動作特性（ＲＯＣ）グラフを作成した。したがって、ＲＯＣグラフは、特異度（偽陽性頻度（ＦＰＦ））に対する感度（真の陽性頻度（ＴＰＦ））のプロットであった。１．０００の値は、１００％の感度および１００％の特異度を表していた。このＲＯＣグラフを図７に示し、ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のそれぞれの曲線下面積（ＡＵＣ）を表８に示す。

【0205】

【表8】

【0206】

これらの結果は、ラミニンガンマ２単量体がＣＡ１９－９よりも膵臓がんのマーカーとしての高い感度および特異度を示し、したがって、ＣＡ１９－９よりも膵臓がんの正確なマーカーであったことを示すものであった。

【0207】

さらに、図８および表９にラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９ならびにそれらの組合せの膵臓がんを検出する陽性率を示す。１つの膵臓がんは、ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の３つすべてについて陰性であった。

【0208】

【表9】

【0209】

これらの結果は、ラミニンガンマ２単量体が膵臓がんの診断のためのマーカーであったことを示すものであった。さらに、膵臓がんを検出する陽性率は、ラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のそれぞれの膵臓がんを検出する陽性率と比較してラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の組合せでより高かった。

【0210】

７． 条項
完全性の理由で、本発明の様々な態様を以下の番号付き条項に示す。

【0211】

条項１． それを必要とする対象における肝細胞癌（ＨＣＣ）を診断する方法であって、（ａ）前記対象から生物学的試料を得ること、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定すること、（ｃ）ラミニンガンマ２単量体の前記レベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと比較すること、および（ｄ）ラミニンガンマ２単量体の前記レベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きい場合に対象をＨＣＣを有すると特定することを含む、方法。

【0212】

条項２． 前記生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定することをさらに含み、前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーがビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）、アルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、条項１に記載の方法。

【0213】

条項３． 前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記レベルを前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルと比較すること、および前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記レベルが前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルより大きい場合に対象をＨＣＣを有すると特定することを含む、条項２に記載の方法。

【0214】

条項４． （ａ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルを決定する、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰのレベルを決定する、または（ｃ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルを決定する、条項１から３のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0215】

条項５． （ａ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルがラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの前記基準レベルより大きい場合、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰのレベルがラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰの前記基準レベルより大きい場合、または（ｃ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルがラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの前記基準レベルより大きい場合、対象がＨＣＣを有すると特定される、条項４に記載の方法。

【0216】

条項６． 前記生物学的試料が全血試料、血漿試料および血清試料からなる群から選択される、条項１から５のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0217】

条項７． 前記生物学的試料が血清試料である、条項６に記載の方法。

【0218】

条項８． 前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定することが免疫測定法によりラミニンガンマ２単量体を検出することを含む、条項１から７のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0219】

条項９． 前記生物学的試料中のＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルを決定することが免疫測定法によりＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰを検出することを含む、条項２から８のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0220】

条項１０． 前記免疫測定法がサンドイッチ免疫測定法である、条項８または９に記載の方法。

【0221】

条項１１． ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの前記基準レベルが対照試料中のＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルである、条項２から１０のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0222】

条項１２． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルが対照試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項１から１１のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0223】

条項１３． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがカットオフレベルである、条項１から１２のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0224】

条項１４． 前記カットオフレベルが複数の対照試料の平均値プラス２標準偏差解析により決定される、条項１３に記載の方法。

【0225】

条項１５． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがキャリブレーター中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項１から１４のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0226】

条項１６． 対象が肝細胞癌（ＨＣＣ）を有するまたは発症するリスクがあるかを判定する方法であって、（ａ）前記対象から生物学的試料を得ること、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを測定すること、（ｃ）ラミニンガンマ２単量体の前記レベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと比較すること、および（ｄ）ラミニンガンマ２単量体の前記レベルがラミニンガンマ２単量体の基準レベルより大きい場合に対象がＨＣＣを有するまたは発症するリスクがあると判定することを含む、方法。

【0227】

条項１７． 前記生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを測定することをさらに含み、前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーがビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）、アルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、条項１６に記載の方法。

【0228】

条項１８． 前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記レベルを前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルと比較すること、および前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記レベルが前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルより大きい場合に対象がＨＣＣを有するまたは発症するリスクがあると判定することを含む、条項１７に記載の方法。

【0229】

条項１９． （ａ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルを決定する、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰのレベルを決定する、または（ｃ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルを決定する、条項１６から１８のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0230】

条項２０． （ａ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの前記レベルがラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの基準レベルより大きい場合、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰの前記レベルがラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰの基準レベルより大きい場合、または（ｃ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの前記レベルがラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの基準レベルより大きい場合、対象がＨＣＣを有すると特定される、条項１９に記載の方法。

【0231】

条項２１． 前記生物学的試料が全血試料、血漿試料および血清試料からなる群から選択される、条項１６から２０のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0232】

条項２２． 前記生物学的試料が血清試料である、条項２１に記載の方法。

【0233】

条項２３． 前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定することが免疫測定法によりラミニンガンマ２単量体を検出することを含む、条項１６から２２のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0234】

条項２４． 前記生物学的試料中のＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルを決定することが免疫測定法によりＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰを検出することを含む、条項１７から２３のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0235】

条項２５． 前記免疫測定法がサンドイッチ免疫測定法である、条項２３または２４に記載の方法。

【0236】

条項２６． ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの前記基準レベルが対照試料中のＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルである、条項１７から２５のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0237】

条項２７． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルが対照試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項１６から２６のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0238】

条項２８． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがカットオフレベルである、条項１６から２７のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0239】

条項２９． 前記カットオフレベルが複数の対照試料の平均値プラス２標準偏差解析により決定される、条項２８に記載の方法。

【0240】

条項３０． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがキャリブレーター中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項１６から２９のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0241】

条項３１． それを必要とする対象における肝細胞癌（ＨＣＣ）の進行をモニターする方法であって、（ａ）前記対象から第１および第２の生物学的試料を得ること、（ｂ）前記第１の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第１のレベルおよび前記第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第２のレベルを測定すること、（ｃ）ラミニンガンマ２単量体の前記第１および第２のレベルを比較すること、ならびに（ｄ）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体の前記第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の前記第１のレベルより大きい場合に対象におけるＨＣＣが進行した、または（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体の前記第２のレベルがラミニンガンマ２単量体の前記第１のレベルと同等もしくはより小さい場合に対象におけるＨＣＣが進行しなかったと判定することを含む、方法。

【0242】

条項３２． 前記第１の生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第１のレベルおよび前記第２の生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第２のレベルを測定することをさらに含み、前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーがビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）、アルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、条項３１に記載の方法。

【0243】

条項３３． 前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記第１および第２のレベルを比較すること、ならびに前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記第２のレベルが前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記第１のレベルより大きい場合に対象におけるＨＣＣが進行した、または前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記第２のレベルが前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記第１のレベルと同等もしくはより小さい場合に対象におけるＨＣＣが進行しなかったと判定することをさらに含む、条項３２に記載の方法。

【0244】

条項３４． （ａ）前記第１および第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの前記第１および第２のレベルを測定する、（ｂ）前記第１および第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰの第１および第２のレベルを測定する、または（ｃ）前記第１および第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの前記第１および第２のレベルを測定する、条項３１から３３のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0245】

条項３５． （ａ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩのレベルがラミニンガンマ２単量体およびＰＩＶＫＡ－ＩＩの前記基準レベルより大きい、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰのレベルがラミニンガンマ２単量体およびＡＦＰの前記基準レベルより大きい、または（ｃ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルがラミニンガンマ２単量体、ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの前記基準レベルより大きい場合に対象がＨＣＣを有すると特定される、条項３４に記載の方法。

【0246】

条項３６． 前記第１および第２の生物学的試料が全血試料、血漿試料または血清試料である、条項３１から３５のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0247】

条項３７． 前記第１および第２の生物学的試料が血清試料である、条項３６に記載の方法。

【0248】

条項３８． 前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定することが免疫測定法によりラミニンガンマ２単量体を検出することを含む、条項３１から３７のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0249】

条項３９． 前記生物学的試料中のＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルを決定することが免疫測定法によりＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰを検出することを含む、条項３２から３８のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0250】

条項４０． 前記免疫測定法がサンドイッチ免疫測定法である、条項３８または３９に記載の方法。

【0251】

条項４１． ＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰの前記基準レベルが対照試料中のＰＩＶＫＡ－ＩＩおよびＡＦＰのレベルである、条項３２から４０のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0252】

条項４２． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルが対照試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項３１から４１のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0253】

条項４３． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがカットオフレベルである、条項３１から４２のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0254】

条項４４． 前記カットオフレベルが複数の対照試料の平均値プラス２標準偏差解析により決定される、条項４３に記載の方法。

【0255】

条項４５． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがキャリブレーター中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項３１から４４のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0256】

条項４６． それを必要とする対象におけるＨＣＣを検出するためのキットであって、ラミニンガンマ２単量体を検出するための１つ以上の試薬を含む、キット。

【0257】

条項４７． （ａ）ビタミンＫ依存性凝固因子前駆体ＩＩ（ＰＩＶＫＡ－ＩＩ）を検出するための１つ以上の試薬、および（ｂ）アルファ胎児型タンパク質（ＡＦＰ）を検出するための１つ以上の試薬をさらに含む、条項４６に記載のキット。

【0258】

条項４８． それを必要とする対象における膵臓がんを診断する方法であって、（ａ）前記対象から生物学的試料を得ること、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定すること、（ｃ）がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される、生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを決定すること、（ｄ）ラミニンガンマ２単量体の前記レベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと、および少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルと比較すること、ならびに（ｅ）ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記レベルがラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルより大きい場合に対象が膵臓がんを有すると特定することを含む、方法。

【0259】

条項４９． （ａ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＥＡのレベルを決定する、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＡ１９－９のレベルを決定する、または（ｃ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルを決定する、条項４８に記載の方法。

【0260】

条項５０． 前記生物学的試料が全血試料、血漿試料および血清試料からなる群から選択される、条項４８または４９に記載の方法。

【0261】

条項５１． 前記生物学的試料が血清試料である、条項５０に記載の方法。

【0262】

条項５２． 前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定することが免疫測定法によりラミニンガンマ２単量体を検出することを含む、条項４８から５１のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0263】

条項５３． 前記生物学的試料中のＣＥＡおよびＣＡ１９－９の前記レベルを決定することが免疫測定法によりＣＥＡおよびＣＡ１９－９を検出することを含む、条項４９から５２のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0264】

条項５４． 前記免疫測定法がサンドイッチ免疫測定法である、条項５２または５３に記載の方法。

【0265】

条項５５． ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の前記基準レベルが対照試料中のＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルである、条項４９から５４のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0266】

条項５６． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルが対照試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項４８から５５のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0267】

条項５７． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがカットオフレベルである、条項４８から５６のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0268】

条項５８． 前記カットオフ値が複数の対照試料の平均値プラス２標準偏差解析により決定される、条項５７に記載の方法。

【0269】

条項５９． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがキャリブレーター中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項４８から５８のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0270】

条項６０． 対象が膵臓がんを有するまたは発症するリスクがあるかどうかを判定する方法であって、（ａ）前記対象から生物学的試料を得ること、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを測定すること、（ｃ）がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される、前記生物学的試料中の少なくとも１つの追加のバイオマーカーのレベルを測定すること、（ｄ）ラミニンガンマ２単量体の前記レベルをラミニンガンマ２単量体の基準レベルと、および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記レベルを少なくとも１つの追加のバイオマーカーの基準レベルと比較すること、ならびに（ｅ）ラミニンガンマ２単量体および前記少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記レベルがラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記基準レベルより大きい場合に対象が膵臓がんを有するまたは発症するリスクがあると判定することを含む、方法。

【0271】

条項６１． （ａ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＥＡのレベルを測定する、（ｂ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＡ１９－９のレベルを測定する、または（ｃ）前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルを測定する、条項６０に記載の方法。

【0272】

条項６２． 前記生物学的試料が全血試料、血漿試料および血清試料からなる群から選択される、条項６０または６１に記載の方法。

【0273】

条項６３． 前記生物学的試料が血清試料である、条項６２に記載の方法。

【0274】

条項６４． 前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定することが免疫測定法によりラミニンガンマ２単量体を検出することを含む、条項６０から６３のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0275】

条項６５． 前記生物学的試料中のＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルを決定することが免疫測定法によりＣＥＡおよびＣＡ１９－９を検出することを含む、条項６１から６４のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0276】

条項６６． 前記免疫測定法がサンドイッチ免疫測定法である、条項６４または６５に記載の方法。

【0277】

条項６７． ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の前記基準レベルが対照試料中のＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルである、条項６１から６６のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0278】

条項６８． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルが対照試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項６０から６７のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0279】

条項６９． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがカットオフレベルである、条項６０から６８のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0280】

条項７０． 前記カットオフ値が複数の対照試料の平均値プラス２標準偏差解析により決定される、条項６９に記載の方法。

【0281】

条項７１． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがキャリブレーター中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項６０から７０のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0282】

条項７２． それらを必要とする対象における膵臓がんの進行をモニターする方法であって、（ａ）対象から第１および第２の生物学的試料を得ること、（ｂ）前記第１の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第１のレベルおよび前記第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体の第２のレベルを測定すること、（ｃ）前記第１の生物学的試料中の、がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される、少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第１のレベルならびに前記第２の生物学的試料中の、がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される、少なくとも１つの追加のバイオマーカーの第２のレベルを測定すること、（ｄ）ラミニンガンマ２単量体の前記第１および第２のレベルを比較すること、（ｅ）少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記第１および第２のレベルを比較すること、ならびに（ｆ）（ｉ）ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記第２のレベルがラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記第１のレベルより大きい場合に対象における膵臓がんが進行したと、または（ｉｉ）ラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記第２のレベルがラミニンガンマ２単量体および少なくとも１つの追加のバイオマーカーの前記第１のレベルと同等もしくはより小さい場合に対象における膵臓がんが進行しなかったと判定することを含む、方法。

【0283】

条項７３． （ｉ）前記第１および第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＥＡの第１および第２のレベルを測定する、（ｉｉ）前記第１および第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体およびＣＡ１９－９の第１および第２のレベルを測定する、または（ｉｉｉ）前記第１および第２の生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体、ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の第１および第２のレベルを測定する、条項７２に記載の方法。

【0284】

条項７４． 前記第１および第２の生物学的試料が全血試料、血漿試料および血清試料である、条項７２または７３に記載の方法。

【0285】

条項７５． 前記第１および第２の生物学的試料が血清試料である、条項７４に記載の方法。

【0286】

条項７６． 前記生物学的試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルを決定することが免疫測定法によりラミニンガンマ２単量体を検出することを含む、条項７２から７５のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0287】

条項７７． 前記生物学的試料中のＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルを決定することが免疫測定法によりＣＥＡおよびＣＡ１９－９を検出することを含む、条項７３から７６のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0288】

条項７８． 前記免疫測定法がサンドイッチ免疫測定法である、条項７６または７７に記載の方法。

【0289】

条項７９． ＣＥＡおよびＣＡ１９－９の前記基準レベルが対照試料中のＣＥＡおよびＣＡ１９－９のレベルである、条項７３から７８のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0290】

条項８０． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルが対照試料中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項７２から７９のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0291】

条項８１． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがカットオフレベルである、条項７２から８０のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0292】

条項８２． 前記カットオフ値が複数の対照試料の平均値プラス２標準偏差解析により決定される、条項８１に記載の方法。

【0293】

条項８３． ラミニンガンマ２単量体の前記基準レベルがキャリブレーター中のラミニンガンマ２単量体のレベルである、条項７２から８２のいずれか１つの条項に記載の方法。

【0294】

条項８４． それらを必要とする対象における膵臓がんを検出するためのキットであって、（ａ）ラミニンガンマ２単量体を検出するための１つ以上の試薬および（ｂ）がん胎児抗原（ＣＥＡ）および炭水化物抗原１９－９（ＣＡ１９－９）からなる群から選択される、少なくとも１つの追加のバイオマーカーを検出するための１つ以上の試薬を含む、キット。

【0295】

前述の詳細な説明および添付の実施例は、単に例示的なものであり、添付の特許請求の範囲およびそれらと同等のものによってのみ規定される、本発明の範囲に対する制限と解釈すべきでないことは、理解される。

【0296】

開示した実施形態の様々な変更および修正は、当業者に明らかである。化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤または本発明の使用方法に関するものを制限なく含む、そのような変更および修正は、その精神および範囲から逸脱することなしに行うことができる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】