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特許7181528２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-22
(45)【発行日】2022-12-01
(54)【発明の名称】２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/02 20060101AFI20221124BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20221124BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20221124BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20221124BHJP
【ＦＩ】
C12N9/02 ZNA
A01H1/00 A
A01H1/00 Z
C12Q1/6827 Z
C12N15/53
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2018567505
(86)(22)【出願日】2018-02-09
(86)【国際出願番号】 JP2018004514
(87)【国際公開番号】W WO2018147401
(87)【国際公開日】2018-08-16
【審査請求日】2020-10-01
(31)【優先権主張番号】P 2017023294
(32)【優先日】2017-02-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(73)【特許権者】
【識別番号】000127879
【氏名又は名称】株式会社エス・ディー・エス バイオテック
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】戸澤 譲
(72)【発明者】
【氏名】武井 里美
(72)【発明者】
【氏名】大島 正弘
(72)【発明者】
【氏名】廣瀬 咲子
(72)【発明者】
【氏名】川田 元滋
(72)【発明者】
【氏名】関野 景介
(72)【発明者】
【氏名】山崎 明彦
【審査官】高山 敏充
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／０９０９５０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１４－０１１９６７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法であって、ＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を、塩基性アミノ酸に変異させる工程を含み、
前記ＨＳＬタンパク質が、配列番号：４、２０又は２２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示す、天然のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ
前記塩基性アミノ酸が、ヒスチジン、リジン又はアルギニンである、
製造方法。
【請求項2】
４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、（Ｉ）植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を、塩基性アミノ酸に変異させる工程と、
（II)工程（Ｉ）においてアミノ酸変異が導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、を含み、
前記ＨＳＬタンパク質が、配列番号：４、２０又は２２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示す、天然のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ
前記塩基性アミノ酸が、ヒスチジン、リジン又はアルギニンである、
製造方法。
【請求項3】
前記ＨＳＬタンパク質において、前記１４０位又は該部位に対応するアミノ酸の他、下記（Ａ）に記載のアミノ酸変異を更に導入する、請求項１又は２に記載の方法（Ａ）ＨＳＬタンパク質における、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位又は該部位に対応するアミノ酸をフェニルアラニンに変異させる。
【請求項4】
前記４－ＨＰＰＤ阻害剤が、テフリルトリオン又はスルコトリオンである、請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項5】
植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法であって、被検植物のＨＳＬ遺伝子における配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチドを検出し、該ヌクレオチドが塩基性アミノ酸をコードしている場合に、該被検植物は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を有すると判定し、
前記ＨＳＬ遺伝子が、配列番号：４、２０又は２２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示す、天然のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、かつ
前記塩基性アミノ酸が、ヒスチジン、リジン又はアルギニンである、
方法。
【請求項6】
植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法であって、被検植物のＨＳＬ遺伝子における、
（ｉ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチドと、
（ｉｉ）配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位又は該部位に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチドとを検出し
（ｉ）に記載のヌクレオチドが塩基性アミノ酸をコードし、かつ、
（ｉｉ）に記載のヌクレオチドがフェニルアラニンをコードしている場合に、前記被検植物は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を有すると判定し、
前記ＨＳＬ遺伝子が、配列番号：４、２０又は２２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の同一性を示す、天然のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、かつ
前記塩基性アミノ酸が、ヒスチジン、リジン又はアルギニンである、
方法。
【請求項7】
前記４－ＨＰＰＤ阻害剤が、テフリルトリオン又はスルコトリオンである、請求項５又は６に記載の判定方法。
【請求項8】
４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法であって、（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有する植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を、請求項６又は７に記載の方法により判定する工程、及び
（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法に関する。さらに、本発明は、該方法を利用した、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法に関する。また、本発明は、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法、及び該方法を利用した、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
昨今、ベンゾビシクロン、テフリルトリオン、スルコトリオン、メソトリオン及びテンボトリオン等の除草剤成分が開発され、実用化されている。これら除草剤はいずれも、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（４－ＨＰＰＤ）の機能を阻害する薬剤（４－ＨＰＰＤ阻害剤）であり、この酵素の機能を阻害することにより、図１に示すように、カロテノイド合成系を間接的に阻害し、葉緑素の崩壊を引き起こすことによって、植物を白化、枯死に至らせる。これら阻害剤については、食用品種に対する安全性は十分に確認されているため、イネの栽培等において急速に普及しつつある。
【0003】
一方、品種によっては、４－ＨＰＰＤ阻害剤に弱いものもあり、場合によっては枯死に至る可能性があることが報告されている。そのため、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を高めることができる方法や、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性を確実に識別できる方法の開発が求められている。
【0004】
この点に関し、本発明者らは従前、イネが持つ、２価鉄イオン及び２－オキソグルタル酸に依存する酸化酵素（２－オキソグルタル酸依存的ジオキシゲナーゼ）をコードする遺伝子（４－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｅｎｅ Ｎｏ．１（ＨＩＳ１））及びその相同遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）が、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性に寄与していることを見出している。また、かかる遺伝子を利用することによって、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物体を作出できることも明らかにし、さらには、イネのＨＩＳ１遺伝子と高い相同性を有する遺伝子は、オオムギ、ソルガム、トウモロコシ等においても存在していていることを明らかにしている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開２０１２／０９０９５０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、該方法を利用した、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法、及び該方法を利用した、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、イネのＨＩＳ１タンパク質は、２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化することによって、該阻害剤を分解する活性を有していることを確認した。しかしながら、その一方で、それと極めて高い相同性を示すＯｓＨＳＬ１タンパク質（配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）は、その触媒活性が僅かなものであるということを見出した。
【0008】
そこで、この新たな知見に基づき、本発明者らは、ＨＩＳ１タンパク質とＯｓＨＳＬ１タンパク質とにおける僅かなアミノ酸配列における相違が、前記触媒活性に寄与していると想定した。そして、ＯｓＨＳＬ１タンパク質において、これら触媒活性に寄与していると想定される部位におけるアミノ酸残基を、ＨＩＳ１タンパク質のそれに置換した変異体を作製し、それら変異体における前記触媒活性を評価した。
【0009】
その結果、ＯｓＨＳＬ１タンパク質の１４０位のフェニルアラニンをヒスチジン等の塩基性アミノ酸に置換することによって、前記触媒活性は向上することが明らかになった。また、他の種におけるＨＩＳ１相同タンパク質（ＺｍＨＳＬ２タンパク質及びＳｂＨＳＬ１タンパク質）においても、ＯｓＨＳＬ１タンパク質の１４０位に対応するアミノ酸を塩基性アミノ酸に変異させることによって、前記触媒活性は向上することを見出した。さらに、前記１４０位をヒスチジンに置換したＯｓＨＳＬ１タンパク質を発現させた、シロイヌナズナ及び４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種のイネにおいて、その４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0010】
本発明は、より詳しくは、以下のものである。
＜１＞ ２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法であって、ＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を、塩基性アミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
＜２＞ ４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を、塩基性アミノ酸に変異させる工程と、
（II)工程（Ｉ）においてアミノ酸変異が導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、
を含む製造方法。
＜３＞ 前記塩基性アミノ酸が、ヒスチジン、リジン又はアルギニンである、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞ 植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法であって、被検植物のＨＳＬ遺伝子における配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチドを検出し、該ヌクレオチドが塩基性アミノ酸をコードしている場合に、該被検植物は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を有すると判定する方法。
＜５＞ ４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法であって、
（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有する植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を、＜４＞に記載の方法により判定する工程、及び
（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
＜１＞ ２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法であって、ＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を、塩基性アミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
＜２＞ ４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を、塩基性アミノ酸に変異させる工程と、
（II)工程（Ｉ）においてアミノ酸変異が導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、
を含む製造方法。
＜３＞ 前記塩基性アミノ酸が、ヒスチジン、リジン又はアルギニンである、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞ 植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法であって、被検植物のＨＳＬ遺伝子における配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチドを検出し、該ヌクレオチドが塩基性アミノ酸をコードしている場合に、該被検植物は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を有すると判定する方法。
＜５＞ ４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法であって、
（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有する植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を、＜４＞に記載の方法により判定する工程、及び
（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、ＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸（以下、単に「１４０位のアミノ酸」とも称する）を塩基性アミノ酸に変異させることによって、該タンパク質の、２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性を高めることができる。
【0012】
特に、４－ＨＰＰＤ阻害剤がベンゾビシクロン（以下「ＢＢＣ」とも称する）及びその加水分解体（以下「ベンゾビシクロン加水分解体」又は「ＢＢＣ－ＯＨ」とも称する）である場合には、前記１４０位の他、更に２０４位若しくは２９８位、又は該部位に対応するアミノ酸を、各々他のアミノ酸に置換することによって、当該阻害剤を酸化する触媒活性をより高めることができる。
【0013】
そして、このような２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法を利用することにより、本発明においては、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体を製造することも可能となる。
【0014】
さらに、上述のとおり、ＨＳＬタンパク質において、１４０位のアミノ酸が前記触媒活性に影響するアミノ酸であることを見出したことに基づき、本発明によれば、被検植物のＨＳＬ遺伝子における１４０位のアミノ酸をコードするヌクレオチドを検出することによって、該被検植物の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定することもできる。また、本発明によれば、該方法を利用した、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法も、提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】チロシン代謝経路及びカロテノイド生合成経路と、４－ＨＰＰＤ阻害剤との概要と関連を示す図である。
【図2】ＨＩＳ１タンパク質及びＯｓＨＳＬ１タンパク質の、ベンゾビシクロン加水分解体（ＢＢＣ－ＯＨ）分解活性を、高速液体クロマトグラフィーによって解析した結果を示すスペクトルである。図中の三角は、ＢＢＣ－ＯＨの分解物に由来するピークであることを示す。
【図3】ＨＩＳ１タンパク質及びＯｓＨＳＬ１タンパク質の、テフリルトリオン分解活性を、高速液体クロマトグラフィーによって解析した結果を示すスペクトルである。図中の三角は、テフリルトリオン分解物に由来するピークであることを示す。
【図4】ＨＩＳ１タンパク質及びＯｓＨＳＬ１タンパク質の、スルコトリオン分解活性を、高速液体クロマトグラフィーによって解析した結果を示すスペクトルである。図中の三角は、スルコトリオン分解物に由来するピークであることを示す。
【図5】タンパク質の三次元結晶構造が解かれているシロイヌナズナのアントシアニジン合成酵素（図中右側のパネル参照）を鋳型として作製した、ＨＩＳ１タンパク質及びＯｓＨＳＬ１タンパク質における、基質結合部位として予測されたアミノ酸残基及び周辺の基質ポケットと予想されたアミノ酸残基を示す、三次元構造モデル図である。
【図6】ＯｓＨＳＬ１タンパク質変異体（Ｆ１４０Ｈ及びＦ２９８Ｌの二点変異体、Ｆ１４０Ｈ及びＬ２０４Ｆの２点変異体、Ｆ１４０Ｈの単一変異体）の、ＢＢＣ－ＯＨ分解活性を、高速液体クロマトグラフィーによって解析した結果を示すスペクトルである。
【図7】ＯｓＨＳＬ１タンパク質変異体（Ｌ２０４Ｆ及びＦ２９８Ｌの２点変異体、Ｆ２９８Ｌの単一変異体）の、ＢＢＣ－ＯＨ分解活性を、高速液体クロマトグラフィーによって解析した結果を示すスペクトルである。
【図8】ＯｓＨＳＬ１タンパク質変異体（Ｆ１４０Ｈ及びＦ２９８Ｌの２点変異体、Ｆ１４０Ｈ及びＬ２０４Ｆの２点変異体、Ｌ２０４Ｆ及びＦ２９８Ｌの２点変異体）の、スルコトリオンの分解活性を、高速液体クロマトグラフィーによって解析した結果を示すスペクトルである。
【図9】ＨＩＳ１タンパク質及びＯｓＨＳＬ１タンパク質の各種変異体に関し、各種４－ＨＰＰＤ阻害剤の分解活性を、高速液体クロマトグラフィーによって解析した結果を示すグラフである。図中、「ＨＩＳ１」はＨＩＳ１タンパク質の各種４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性を示し、「ＨＳＬ１ １４０Ｈ」はＯｓＨＳＬ１タンパク質の１点変異体（Ｆ１４０Ｈ）のそれらを示し、「ＨＳＬ１ １４０Ｈ ２０４Ｆ」はＯｓＨＳＬ１タンパク質の２点変異体（Ｆ１４０Ｈ及びＬ２０４Ｆ）のそれらを示し、「ＨＳＬ１ １４０Ｈ ２９８Ｌ」はＯｓＨＳＬ１タンパク質の２点変異体（Ｆ１４０Ｈ及びＦ２９８Ｌ）のそれらを示し、「ＨＳＬ１ １４０Ｈ ２０４Ｆ ２９８Ｌ」はＯｓＨＳＬ１タンパク質の３点変異体（Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ及びＦ２９８Ｌ）のそれらを示し、「ＨＳＬ１ １４０Ｈ ２０４Ｆ ２２９Ｔ ２９８Ｌ」はＯｓＨＳＬ１タンパク質の４点変異体（Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ、Ｓ２２９Ｔ及びＦ２９８Ｌ）のそれらを示し、「ＨＳＬ１ １１８Ｉ １４０Ｈ ２０４Ｆ ２２９Ｔ ２９８Ｌ」はＯｓＨＳＬ１タンパク質の５点変異体（Ｖ１１８Ｉ、Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ、Ｓ２２９Ｔ及びＦ２９８Ｌ）のそれらを示す。また、図中縦軸は、ＨＩＳ１タンパク質の４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性の値を各々１００とした際の相対値を示す。
【図10】ベンゾビシクロン（ＢＢＣ）０．０５μＭ又は０．０６μＭ含有寒天培地にて、ＯｓＨＳＬ１タンパク質変異体（Ｖ１１８Ｉ、Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ、Ｓ２２９Ｔ及びＦ２９８Ｌの５点変異体、Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ、Ｓ２２９Ｔ及びＦ２９８Ｌの４点変異体、Ｆ１４０Ｈ、又は、Ｌ２０４Ｆ及びＦ２９８Ｌの３点変異体）を発現させたシロイヌナズナの生育状況を観察した結果を示す写真である。図中、右側二つのプレートにおける各右下１／４の領域は形質転換していないシロイヌナズナの生育状況を観察した結果を示す。また、矢印は、緑色を呈した個体を示す。
【図11】ＢＢＣ含有ＭＳ培地にて、ベンゾビシクロン感受性イネ やまだわら、ＯｓＨＳＬ１タンパク質の野生型を発現させたやまだわら（図中「ＨＳＬ１（野生型）組換え体」）及びＯｓＨＳＬ１タンパク質の変異体（Ｆ１４０Ｈの１点変異体）を発現させたやまだわら（図中「ｍＨＳＬ１（Ｆ１４０Ｈ）組換え体」）の生育状況を観察した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
＜２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法＞
本発明は、２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法であって、ＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を、塩基性アミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法を、提供する。
本発明は、２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法であって、ＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を、塩基性アミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法を、提供する。
【0017】
本発明における「４－ＨＰＰＤ阻害剤」とは、４－ＨＰＰＤ（４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、酵素番号；１．１３．１１．２７，１．１４．２．２）の機能を阻害する薬剤（４－ＨＰＰＤ阻害剤）を意味する。４－ＨＰＰＤ阻害剤は、図１に示すように、４－ＨＰＰＤの機能を阻害することにより、カロテノイド合成系を間接的に阻害し、葉緑素の崩壊を引き起こして植物を白化させ、枯死に至らせる。
【0018】
本発明における「４－ＨＰＰＤ阻害剤」は、（１）シクロヘキサンジオン系、（２）ピラゾール系、（３）ビシクロ系、（４）イソオキサゾール系に分類される（「農薬からアグロバイオギュレーター－病害虫雑草制御の現状と将来」、日本、シーエムシー出版、２００９年１２月 参照）。
（１）シクロヘキサジオン系としては、例えば、テフリルトリオン（Ｔｅｆｕｒｙｌｔｒｉｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：４７３２７８－７６－１）、スルコトリオン（Ｓｕｌｃｏｔｒｉｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：９９１０５－７７－８）、メソトリオン（Ｍｅｓｏｔｒｉｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：１０４２０６－８２－８）、テンボトリオン（Ｔｅｍｂｏｔｒｉｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：３３５１０４－８４－２）、ランコトリオン（Ｌａｎｃｏｔｒｉｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：１４８６６１７－２１－３）、２-［２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）ベンゾイル］－シクロヘキサン－１，３ジオン（２－［２－ｎｉｔｒｏ－４－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１，３－ｄｉｏｎｅ）（Ｎｉｔｉｓｉｎｏｎｅ，ＮＴＢＣ，ＣＡＳ登録番号：１０４２０６－６５－７）が挙げられる。
（２）ピラゾール系としては、例えば、ピラゾレート（Ｐｙｒａｚｏｌｙｎａｔｅ，ＣＡＳ登録番号：５８０１１－６８－０）、ベンゾフェナップ（Ｂｅｎｚｏｆｅｎａｐ，ＣＡＳ登録番号：８２６９２－４４－２）、ピラゾキシフェン（Ｐｙｒａｚｏｘｙｆｅｎ，ＣＡＳ登録番号：７１５６１－１１－０）、トプラメゾン（Ｔｏｐｒａｍｅｚｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：２１０６３１－６８－８）、ピラスルホトール（Ｐｙｒａｓｕｌｆｏｔｏｌｅ，ＣＡＳ登録番号：３６５４００－１１－９）が挙げられる。
（３）ビシクロ系としては、例えば、ベンゾビシクロン（Ｂｅｎｚｏｂｉｃｙｃｌｏｎ，ＢＢＣ，ＣＡＳ登録番号：１５６９６３－６６－５）、ベンゾビシクロン加水分解体（Ｂｅｎｚｏｂｉｃｙｃｌｏｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ＢＢＣ－ＯＨ，ＣＡＳ登録番号：１２６６５６－８８－０）、ビシクロピロン（Ｂｉｃｙｃｌｏｐｙｒｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：３５２０１０－６８－５）が挙げられる。
（４）イソオキサゾール系としては、例えば、イソキサフルトール（Ｉｓｏｘａｆｌｕｔｏｌｅ，ＣＡＳ登録番号：１４１１１２－２９－０）が挙げられる。
（１）シクロヘキサジオン系としては、例えば、テフリルトリオン（Ｔｅｆｕｒｙｌｔｒｉｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：４７３２７８－７６－１）、スルコトリオン（Ｓｕｌｃｏｔｒｉｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：９９１０５－７７－８）、メソトリオン（Ｍｅｓｏｔｒｉｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：１０４２０６－８２－８）、テンボトリオン（Ｔｅｍｂｏｔｒｉｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：３３５１０４－８４－２）、ランコトリオン（Ｌａｎｃｏｔｒｉｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：１４８６６１７－２１－３）、２-［２－ニトロ－４－（トリフルオロメチル）ベンゾイル］－シクロヘキサン－１，３ジオン（２－［２－ｎｉｔｒｏ－４－（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１，３－ｄｉｏｎｅ）（Ｎｉｔｉｓｉｎｏｎｅ，ＮＴＢＣ，ＣＡＳ登録番号：１０４２０６－６５－７）が挙げられる。
（２）ピラゾール系としては、例えば、ピラゾレート（Ｐｙｒａｚｏｌｙｎａｔｅ，ＣＡＳ登録番号：５８０１１－６８－０）、ベンゾフェナップ（Ｂｅｎｚｏｆｅｎａｐ，ＣＡＳ登録番号：８２６９２－４４－２）、ピラゾキシフェン（Ｐｙｒａｚｏｘｙｆｅｎ，ＣＡＳ登録番号：７１５６１－１１－０）、トプラメゾン（Ｔｏｐｒａｍｅｚｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：２１０６３１－６８－８）、ピラスルホトール（Ｐｙｒａｓｕｌｆｏｔｏｌｅ，ＣＡＳ登録番号：３６５４００－１１－９）が挙げられる。
（３）ビシクロ系としては、例えば、ベンゾビシクロン（Ｂｅｎｚｏｂｉｃｙｃｌｏｎ，ＢＢＣ，ＣＡＳ登録番号：１５６９６３－６６－５）、ベンゾビシクロン加水分解体（Ｂｅｎｚｏｂｉｃｙｃｌｏｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ，ＢＢＣ－ＯＨ，ＣＡＳ登録番号：１２６６５６－８８－０）、ビシクロピロン（Ｂｉｃｙｃｌｏｐｙｒｏｎｅ，ＣＡＳ登録番号：３５２０１０－６８－５）が挙げられる。
（４）イソオキサゾール系としては、例えば、イソキサフルトール（Ｉｓｏｘａｆｌｕｔｏｌｅ，ＣＡＳ登録番号：１４１１１２－２９－０）が挙げられる。
【0019】
本発明の対象となる４－ＨＰＰＤ阻害剤としては、ベンゾビシクロン（ＢＢＣ）又はその加水分解体（ベンゾビシクロン加水分解体、ＢＢＣ－ＯＨ）、テフリルトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオン、ランコトリオン、ビシクロピロン、ＮＴＢＣといったシクロヘキサンジオン系、ビシクロ系の４－ＨＰＰＤ阻害剤が好ましく、ＢＢＣ、ＢＢＣ－ＯＨ、テフリルトリオン、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオンがさらに好ましく、ＢＢＣ、ＢＢＣ－ＯＨ、テフリルトリオンがより好ましく、ＢＢＣ、ＢＢＣ－ＯＨが特に好ましい。
【0020】
なお、任意の化合物が４－ＨＰＰＤ阻害活性を有するかは、４－ＨＰＰＤ酵素が促進する４－ヒドロキシフェニルピルビン酸からホモゲンチジン酸の生成が、当該化合物の存在下抑制されるかどうかを解析することによって判定することができる（例えば、Ｓｃｈｕｌｚ，Ａ．Ｏｒｔ，Ｏ．Ｂｅｙｅｒ，Ｐ．Ｋｌｅｉｎｉｇ，Ｈ．（１９９３），ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１８，１６２－１６６、Ｓｅｃｏｒ，Ｊ．（１９９４），Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６，１４２９－１４３３の記載 参照）。
【0021】
本発明における「触媒活性」とは、下記反応式において示すように、２－オキソグルタル酸（下記反応式における「２ＯＧ」）依存的に、基質とする４－ＨＰＰＤ阻害剤（下記反応式における「Ｒ」）の酸化反応を触媒する活性を意味する。
Ｒ＋２ＯＧ＋Ｏ２→ＲＯ＋コハク酸＋ＣＯ２
なお、この反応においては、２ＯＧの脱炭酸によるコハク酸と二酸化炭素の生成を伴う。
Ｒ＋２ＯＧ＋Ｏ２→ＲＯ＋コハク酸＋ＣＯ２
なお、この反応においては、２ＯＧの脱炭酸によるコハク酸と二酸化炭素の生成を伴う。
【0022】
本発明において前記触媒活性が高められる対象となるＨＳＬタンパク質は、ＨＩＳ１タンパク質（典型的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）と高い相同性を有するタンパク質（ＨＳＬタンパク質）を意味する。高い相同性とは、少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上（例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上）の配列の相同性である。配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０，１９９０）を利用して決定することができる。該プログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４－２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７，１９９３）に基づいている。ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【0023】
本発明にかかる「ＨＳＬタンパク質」の由来としては、植物であれば特に制限はなく、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、ソルガムが挙げられる。より具体的に、イネ由来のＨＳＬタンパク質としては、ＯｓＨＳＬ１タンパク質（典型的には、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、ＯｓＨＳＬ２タンパク質（典型的には、配列番号：６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）等が挙げられる。オオムギ由来のＨＳＬタンパク質としては、ＨｖＨＳＬ１タンパク質（典型的には、配列番号：８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、ＨｖＨＳＬ２タンパク質（典型的には、配列番号：１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、ＨｖＨＳＬ３タンパク質（典型的には、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）等が挙げられる。コムギ由来のＨＳＬタンパク質としては、ＴａＨＳＬ１タンパク質（典型的には、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、ＴａＨＳＬ２タンパク質（典型的には、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）等が挙げられる。トウモロコシ由来のＨＳＬタンパク質としては、ＺｍＨＳＬ１タンパク質（典型的には、配列番号：１８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、ＺｍＨＳＬ２タンパク質（典型的には、配列番号：２０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）等が挙げられる。ソルガム由来のＨＳＬタンパク質としては、ＳｂＨＳＬ１タンパク質（典型的には、配列番号：２２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）等が挙げられる。しかしながら、本発明にかかるＨＳＬタンパク質は、これらに特定されるものではない。また、自然界において（すなわち、非人工的に）ヌクレオチド配列が変異することにより、タンパク質のアミノ酸配列も変化が生じ得る。したがって、本発明においては、その対象に、上記典型的なアミノ酸配列を有するもののみならず、このような天然の変異体も含まれることにつき、理解されたし。
【0024】
また、前記触媒活性を高めるため、前述のＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸が置換される「塩基性アミノ酸」としては、例えば、ヒスチジン、リジン、アルギニンが挙げられ、前記触媒活性をより高め易いという観点から、ヒスチジンであることが好ましい。
【0025】
さらに、本発明においては、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を塩基性アミノ酸に変異させる以外に、他の部位のアミノ酸に変異を導入してもよい。かかる「変異」は、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又はそれに対応する部位以外において、ＨＳＬタンパク質の１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されることを意味し、ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常２～４０個、好ましくは２～３０個、より好ましくは２～２０個、さらに好ましくは２～１０個（例えば、２～８個、２～４個、２～２個）である。
【0026】
他の部位に導入される変異としては、特に制限はないが、ＢＢＣ又はＢＢＣ－ＯＨを酸化する触媒活性がより高まり易いという観点から、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位又は該部位に対応するアミノ酸、及び、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２９８位又は該部位に対応するアミノ酸のうちの少なくとも１のアミノ酸が、各々他のアミノ酸に置換されることが好ましく、当該２部位が各々他のアミノ酸に置換されていることがより好ましい。また、かかる「他のアミノ酸」としても特に制限はないが、同観点から、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位又は該部位に対応するアミノ酸は、フェニルアラニンに置換されることが好ましく、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２９８位又は該部位に対応するアミノ酸は、ロイシンに置換されることが好ましい。
【0027】
なお、本発明において、「対応する部位」とは、アミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）を利用し、配列番号：４に記載のアミノ酸配列と、他のＨＳＬタンパク質のアミノ酸配列とを整列させた際に、配列番号：４に記載のアミノ酸配列における１４０位等と同列になる部位のことである。
【0028】
また、ＨＳＬタンパク質における変異導入は、アミノ酸配列レベルでの変異導入法によっても、またヌクレオチド配列レベルでの変異導入法によっても行なうことができる。
【0029】
アミノ酸配列レベルでの変異導入法としては、所望の部位に変異を導入したＨＳＬタンパク質のアミノ酸配列に基づき、市販のペプチド合成機等を用い、かかる変異体を化学的に合成する方法が挙げられる。
【0030】
また、ヌクレオチド配列レベルでの変異導入としては、例えば、部位特異的変異誘発法、ゲノム編集法、所望の部位に変異を導入したＨＳＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列情報に基づくＤＮＡの化学的合成法が挙げられる。そして、かかる変異導入法により調製したヌクレオチドに基づき、生物学的合成系又は無細胞タンパク質合成系を利用して、１４０位を塩基性アミノ酸に置換したＨＳＬタンパク質等を得ることができる。
【0031】
生物学的合成系としては、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等の細胞が挙げられ、かかる細胞に、前記ＨＳＬタンパク質等をコードするヌクレオチドを該細胞において発現させることが可能なカセット（プラスミドベクター等）を導入することによって、当該タンパク質等を調製することができる。
【0032】
また、無細胞タンパク質合成系としては、例えば、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来の合成系が挙げられ、かかる合成系（細胞抽出液等）に、前記ＨＳＬタンパク質等をコードするヌクレオチドを該合成系において発現させることが可能なカセット（プラスミドベクター等）を添加することによって、当該タンパク質等を調製することができる。
【0033】
なお、かかる合成系においては、後述の実施例において示すとおり、前記触媒活性を有するＨＳＬタンパク質を調製し易いという観点から、コムギ胚芽由来の無細胞タンパク質合成系が好ましい。またＨＳＬタンパク質の前記触媒活性への影響を抑えるという観点から、還元剤としてＴｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＣＥＰ）を用いる合成系が好ましい。
【0034】
また、上述の変異導入によって、前記触媒活性が高められたかどうかは、例えば、後述の実施例に示すとおり、変異を導入したＨＳＬタンパク質、２価鉄イオン、２－オキソグルタル酸及び酸素の存在下で、４－ＨＰＰＤ阻害剤を処理した後、高速液体クロマトグラフィー解析にて、直接４－ＨＰＰＤ阻害剤の酸化物、又はその酸化を経て生じる生成物（分解物）の量を測定し、変異を導入する前のＨＳＬタンパク質における量と比較することで評価することができる。さらに、上記反応式に示すとおり、かかる反応によっては、４－ＨＰＰＤ阻害剤の酸化物のみならず、同時にコハク酸も生じる。したがって、変異を導入したＨＳＬタンパク質存在下において生成されたコハク酸の量を測定し、変異を導入する前のＨＳＬタンパク質のそれと比較することによっても、前記触媒活性が高められたかどうかを、判定することができる。
【0035】
＜４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法＞
上述のとおり、ＨＳＬタンパク質の１４０位を塩基性アミノ酸に置換することによって、４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化し、分解する活性を高め、ひいては後述の実施例に示すとおり、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性も当該タンパク質を発現させた植物において向上させることができる。
上述のとおり、ＨＳＬタンパク質の１４０位を塩基性アミノ酸に置換することによって、４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化し、分解する活性を高め、ひいては後述の実施例に示すとおり、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性も当該タンパク質を発現させた植物において向上させることができる。
【0036】
したがって、本発明は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を塩基性アミノ酸に変異させる工程と、
（II)工程（Ｉ）においてアミノ酸変異が導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、を含む製造方法をも、提供することができる。
（Ｉ）植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸を塩基性アミノ酸に変異させる工程と、
（II)工程（Ｉ）においてアミノ酸変異が導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、を含む製造方法をも、提供することができる。
【0037】
本発明の方法によって４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められる植物体としては特に制限はなく、例えば、イネ、オオムギ、コムギ、ソルガム、トウモロコシ、クリーピングベントグラス等のイネ科植物、シロイヌナズナ等のアブラナ科植物、トマト等のナス科植物、ダイズ、アルファルファ、ミヤコグサ等のマメ科植物、ワタ等のアオイ科植物、テンサイ等のアカザ科植物が挙げられる。これら植物において、特に、４－ＨＰＰＤ阻害剤に感受性の品種が、本発明の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を高める適用対象として好ましい。４－ＨＰＰＤ阻害剤に感受性のイネ品種としては、例えば、やまだわら（関東２３９号）、ハバタキ、タカナリ、モミロマン、ミズホチカラ、ルリアオバ、おどろきもち、兵庫牛若丸、カサラスが挙げられるが、これらに制限されない。
【0038】
本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。さらに、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉等が含まれる。
【0039】
そして、植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、１４０位のアミノ酸を塩基性アミノ酸に変異させる方法としては、ゲノム編集が挙げられる。かかるゲノム編集においては、例えば、ＺＦＮｓ（米国特許６２６５１９６号、８５２４５００号、７８８８１２１号、欧州特許１７２０９９５号）、ＴＡＬＥＮｓ（米国特許８４７０９７３号、米国特許８５８６３６３号）、ヌクレアーゼドメインが融合されたＰＰＲ（ｐｅｎｔａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅｒｅｐｅａｔ）（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５３：１１７１－１１７９（２０１２））等の融合タンパク質や、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（米国特許８６９７３５９号、国際公開２０１３／１７６７７２号）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３（３）：７５９－７１，（２０１５））やＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ（Ｋ．Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｆ８７２９，（２０１６））等のガイドＲＮＡとタンパク質の複合体を用いることにより、当業者であれば、植物細胞において１４０位のアミノ酸を塩基性アミノ酸に置換させることができる。
【0040】
また、植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、１４０位のアミノ酸を塩基性アミノ酸に変異させる他の方法として、遺伝子組換え法が挙げられる。かかる方法においては、１４０位のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されたＨＳＬタンパク質をコードするヌクレオチドを、植物細胞に導入し、該細胞のゲノム上のＨＳＬ遺伝子と該ヌクレオチドとの間で相同組換えが生じることにより、前記細胞において１４０位のアミノ酸を塩基性アミノ酸に置換させることができる（所謂、ジーンターゲッティング）。なお、当業者であれば、前記ヌクレオドは、例えば、上述の「ヌクレオチド配列レベルでの変異導入」に記載の方法により適宜調製することができる。また、該ヌクレオチドの植物細胞への導入は、例えば、後述の植物の再生方法に記載の方法を用いて適宜行なうことができる。
【0041】
また、当然のことながら、上述のとおり、本発明の植物体の製造方法においても、１４０位又は該部位に対応するアミノ酸のみならず、他の部位のアミノ酸に変異を導入してもよい。かかる他の部位における変異としては、例えば、ＢＢＣ又はＢＢＣ－ＯＨに対する抵抗性がより高まり易いという観点から、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位又は該部位に対応するアミノ酸、及び、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２９８位又は該部位に対応するアミノ酸のうちの少なくとも１のアミノ酸が、各々他のアミノ酸に置換されることが好ましく、当該２部位が各々他のアミノ酸に置換されていることがより好ましい。また、かかる「他のアミノ酸」としても特に制限はないが、同観点から、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位又は該部位に対応するアミノ酸は、フェニルアラニンに置換されることが好ましく、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２９８位又は該部位に対応するアミノ酸は、ロイシンに置換されることが好ましい。
【0042】
本発明において、アミノ酸変異が導入された植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
【0043】
例えば、イネにおいて、再生植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ Ｅｄｓ．）ｐｐ６６－７４，１９９５）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１００，１５０３－１５０７，１９９２）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７－９６２，１９９１）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．６：２７１－２８２，１９９４）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。
【0044】
また、オオムギに関する再生植物体を作出する手法としては、Ｔｉｎｇａｙら（Ｔｉｎｇａｙ Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．１１：１３６９－１３７６，１９９７）、Ｍｕｒｒａｙら（Ｍｕｒｒａｙ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ２２：３９７－４０２，２００４）、およびＴｒａｖａｌｌａら（Ｔｒａｖａｌｌａ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ２３：７８０－７８９，２００５）に記載された方法を挙げることができる。
【0045】
また、コムギに関する再生植物体を作出する手法としては、例えば、「小川泰一、日本農薬学会誌、２０１０年、３５巻、２号、１６０～１６４ページ」に記載された方法を挙げることができる。
【0046】
また、トウモロコシに関する再生植物体を作出する手法としては、例えば、「Ｉｓｈｉｄａ Ｙ．ら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．、２００７年、２巻、７号、１６１４～１６２１ページ」、「Ｈｉｅｉ Ｙ．ら、Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．、２０１４年、１１月７日；５：６２８．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０１４．００６２８．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１４．」、「樋江井ら、育種学研究、２０００年、２０５～２１３ページ」に記載された方法を挙げることができる。
【0047】
ソルガム植物体を再生させる方法としては、例えば、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法により、未熟胚やカルスに遺伝子導入して植物体を再生させる方法、超音波によって遺伝子導入した花粉を用いて受粉する方法が好適に用いられる（Ｊ．Ａ．Ａｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３７：３４１－３４８，２００１、Ａ．Ｍ．Ｃａｓａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１２１２－１１２１６，１９９３、Ｖ．Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２４：５１３－５２２，２００５、Ｊ．Ｍ．ＪＥＯＵＮＧ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｒｅｄｉｔａｓ １３７：２０－２８，２００２、Ｖ Ｇｉｒｉｊａｓｈａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２４（９）：５１３－５２２，２００５、Ｚｕｏ－ｙｕ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４４：７８９－７９８，２０００、Ｓ．Ｇｕｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２８（３）：４２９－４４４，２００９、ＺＹ Ｚｈａｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ３４３：２３３－２４４，２００６、ＡＫ Ｓｈｒａｗａｔ ａｎｄ Ｈ Ｌｏｒｚ，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ，４（６）：５７５－６０３，２００６、Ｄ Ｓｙａｍａｌａ ａｎｄ Ｐ Ｄｅｖｉ Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ，４１（１２）：１４８２－１４８６，２００３、Ｚ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ，３（６）：５９１－５９９，２００５）。
【0048】
さらに、シロイヌナズナであれば、Ａｋａｍａら（Ａｋａｍａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：７－１１，１９９２）の方法が挙げられ、本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【0049】
また、その他の植物であっても、Ｔａｂｅｉら（田部井豊 編、「形質転換プロトコール［植物編］」、株式会社化学同人、２０１２年９月２０日出版）に記載の方法を用い、形質転換及び植物体への再生を行なうことができる。
【0050】
一旦、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【0051】
また、かかる方法により、植物体の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められたか否かは、例えば、後述の実施例に記載するように、前述の変異を植物に導入することにより、作出した植物において前記抵抗性が高められたか否かを検定することにより判定することができる。すなわち、変異導入前の植物が白化する４－ＨＰＰＤ阻害剤の濃度（例えば、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ：エコタイプＣｏｌｕｍｂｉａ）を用いる場合においては、０．０５μＭ以上）にて、前述のアミノ酸変異を導入した植物体を白化せずに生育できれば、該植物体は前記抵抗性が高められたと判定できる。
【0052】
以上、本発明の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法の好適な実施形態について説明したが、本発明の植物体の製造方法は上記実施形態に限定されるものではない。
【0053】
後述の実施例において示すとおり、上述の遺伝子組換え法において、相同組換えが生じなくとも（例えば、上記ヌクレオチドが、上記植物細胞のゲノム中にランダムに挿入されても）、該ヌクレオチドを植物細胞に導入することにより、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体を製造することができる。
【0054】
したがって、本発明は、
４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）１４０位のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されたＨＳＬタンパク質をコードするヌクレオチドを、植物細胞に導入する工程と、
（II)工程（Ｉ）において前記ヌクレオチドが導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、
を含む製造方法をも、提供することができる。
４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）１４０位のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されたＨＳＬタンパク質をコードするヌクレオチドを、植物細胞に導入する工程と、
（II)工程（Ｉ）において前記ヌクレオチドが導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、
を含む製造方法をも、提供することができる。
【0055】
上述のとおり、当業者であれば、適宜公知の手法を用い、前記ヌクレオチドを調製し、該ヌクレオチドを植物細胞に導入し、また該植物細胞から植物体を得ることができる。また、上述のとおり、この遺伝子組換え法を用いた製造方法においても、１４０位又は該部位に対応するアミノ酸のみならず、他の部位のアミノ酸に変異を導入してもよい。
【0056】
さらに、かかる方法においては、後述の実施例６のように、前記ヌクレオチドが由来とする植物と前記細胞が由来とするそれとが、同種〈例えば、共にイネ）の関係であってもよく、また後述の実施例５のように、前記ヌクレオチドが由来とする植物と前記細胞が由来とするそれとが、異種〈例えば、前者がイネ由来であり、後者がシロイヌナズナ由来）の関係であってもよい。
【0057】
＜植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性の判定方法＞
後述の実施例に示すとおり、ＨＳＬタンパク質の１４０位のアミノ酸は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性に大きく寄与する。したがって、本発明は、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法であって、被検植物のＨＳＬ遺伝子における配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチドを検出し、該ヌクレオチドが塩基性アミノ酸をコードしている場合に、該被検植物は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を有すると判定する方法をも、提供する。
後述の実施例に示すとおり、ＨＳＬタンパク質の１４０位のアミノ酸は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性に大きく寄与する。したがって、本発明は、植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法であって、被検植物のＨＳＬ遺伝子における配列番号：４に記載のアミノ酸配列の１４０位又は該部位に対応するアミノ酸をコードするヌクレオチドを検出し、該ヌクレオチドが塩基性アミノ酸をコードしている場合に、該被検植物は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を有すると判定する方法をも、提供する。
【0058】
本発明の判定方法における、被験植物からのヌクレオチドの調製は、常法、例えば、ＣＴＡＢ法を用いて行うことができる。ヌクレオチドを調製するための植物としては、成長した植物体のみならず、種子や幼植物体を用いることもできる。
【0059】
また、このようにして得られたヌクレオチドが、ＨＳＬ遺伝子において、配列番号：４に記載の１４０位のアミノ酸をコードしているか否かは、シークエンシングを行なうことにより検出することができる。さらに、このような直接的なヌクレオチド配列の決定以外に、種々の方法により間接的に解析することができる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ－ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、一本鎖高次構造多型）法、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ／ＲＦＬＰ）を利用したＲＦＬＰ法やＰＣＲ－ＲＦＬＰ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ／ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法が挙げられる。
【0060】
＜本発明の植物を育種する方法＞
本発明は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法を提供する。かかる育種方法は、（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有する植物品種と任意の品種とを交配させる工程、（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を、前述の＜植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性の判定方法＞により判定する工程、及び（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法である。
本発明は、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法を提供する。かかる育種方法は、（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有する植物品種と任意の品種とを交配させる工程、（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を、前述の＜植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性の判定方法＞により判定する工程、及び（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法である。
【0061】
４－ＨＰＰＤ阻害剤に対し抵抗性の植物品種と交配させる「任意の植物品種」としては、例えば、４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性品種と４－ＨＰＰＤ阻害剤感受性品種との交配により得られた個体が挙げられるが、これらに制限されない。
【0062】
本発明の育種方法を利用すれば、４－ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性又は感受性の品種を、種子や幼植物の段階で選抜することが可能となり、当該形質を有する品種の育成を、短期間で行うことが可能となる。
【0063】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。
【0064】
後述の実施例において示すとおり、４－ＨＰＰＤ阻害剤としてＢＢＣ又はＢＢＣ－ＯＨを基質とする場合には、１４０位を塩基性アミノ酸に置換しなくとも、ＨＳＬタンパク質の２０４位及び／又は２９８位を、各々他のアミノ酸に置換（例えは、２０４位においてはフェニルアラニンに置換、２９８位においてはロイシンに置換）することによっても、前記薬剤を酸化する触媒活性を高めることができる。また、ＨＳＬタンパク質の２０４位及び２９８位を、各々他のアミノ酸に置換（例えは、２０４位においてはフェニルアラニンに置換、２９８位においてはロイシンに置換）することによって、ＢＢＣ及びＢＢＣ－ＯＨのみならず、スルコトリオン、メソトリオン、テンボトリオンを酸化する触媒活性を高めることができる。
【0065】
したがって、本発明は、以下を提供するものでもある。
＜６＞ ２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法であって、ＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位若しくはそれに対応する部位、及び／又は、２９８位若しくはそれに対応する部位のアミノ酸を、各々他のアミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
＜７＞ ４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位若しくはそれに対応する部位、及び／又は、２９８位若しくはそれに対応する部位のアミノ酸を、各々他のアミノ酸に変異させる工程と、
（II)工程（Ｉ）においてアミノ酸変異が導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、を含む製造方法。
＜８＞ 植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法であって、被検植物のＨＳＬ遺伝子における配列番号：４に記載の２０４位若しくはそれに対応する部位、及び／又は、２９８位若しくはそれに対応する部位のアミノ酸をコードするヌクレオチドを検出し、該ヌクレオチドが、２０４位又はそれに対応する部位においてはフェニルアラニン、及び／又は、２９８位又はそれに対応する部位においてはロイシンをコードしている場合に、該被検植物は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を有すると判定する方法。
＜９＞ ４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法であって、
（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有する植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を、＜８＞に記載の方法により判定する工程、及び
（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
＜６＞ ２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法であって、ＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位若しくはそれに対応する部位、及び／又は、２９８位若しくはそれに対応する部位のアミノ酸を、各々他のアミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
＜７＞ ４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体の製造方法であって、
（Ｉ）植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位若しくはそれに対応する部位、及び／又は、２９８位若しくはそれに対応する部位のアミノ酸を、各々他のアミノ酸に変異させる工程と、
（II)工程（Ｉ）においてアミノ酸変異が導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、を含む製造方法。
＜８＞ 植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法であって、被検植物のＨＳＬ遺伝子における配列番号：４に記載の２０４位若しくはそれに対応する部位、及び／又は、２９８位若しくはそれに対応する部位のアミノ酸をコードするヌクレオチドを検出し、該ヌクレオチドが、２０４位又はそれに対応する部位においてはフェニルアラニン、及び／又は、２９８位又はそれに対応する部位においてはロイシンをコードしている場合に、該被検植物は４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を有すると判定する方法。
＜９＞ ４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法であって、
（ａ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有する植物品種と任意の品種とを交配させる工程、
（ｂ）工程（ａ）における交配により得られた個体における、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を、＜８＞に記載の方法により判定する工程、及び
（ｃ）４－ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性を有すると判定された個体を選抜する工程、を含む方法。
【0066】
一方、４－ＨＰＰＤ阻害剤としてテフリルトリオンを基質とする場合には、後述の実施例において示すとおり、ＨＳＬタンパク質の２０４位及び／又は２９８位を、各々他のアミノ酸に置換（例えは、２０４位においてはフェニルアラニンに置換、２９８位においてはロイシンに置換）することによって、前記薬剤を酸化する触媒活性を低減させることができる。
【0067】
したがって、本発明は、以下も提供するものである。
＜１０＞ ２－オキソグルタル酸依存的にテフリルトリオンを酸化する触媒活性が低減したＨＳＬタンパク質の製造方法であって、ＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位若しくはそれに対応する部位、及び／又は、２９８位若しくはそれに対応する部位のアミノ酸を、各々他のアミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
＜１１＞ ベンゾビシクロン、ベンゾビシクロン加水分解体又はスルコトリオンに対する抵抗性が低減した植物体の製造方法であって、
（Ｉ）植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位若しくはそれに対応する部位、及び／又は、２９８位若しくはそれに対応する部位のアミノ酸を、各々他のアミノ酸に変異させる工程と、
（II)工程（Ｉ）においてアミノ酸変異が導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、を含む製造方法。
＜１０＞ ２－オキソグルタル酸依存的にテフリルトリオンを酸化する触媒活性が低減したＨＳＬタンパク質の製造方法であって、ＨＳＬタンパク質において、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位若しくはそれに対応する部位、及び／又は、２９８位若しくはそれに対応する部位のアミノ酸を、各々他のアミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
＜１１＞ ベンゾビシクロン、ベンゾビシクロン加水分解体又はスルコトリオンに対する抵抗性が低減した植物体の製造方法であって、
（Ｉ）植物細胞において、ＨＳＬタンパク質における、配列番号：４に記載のアミノ酸配列の２０４位若しくはそれに対応する部位、及び／又は、２９８位若しくはそれに対応する部位のアミノ酸を、各々他のアミノ酸に変異させる工程と、
（II)工程（Ｉ）においてアミノ酸変異が導入された植物細胞から、植物体を再生する工程と、を含む製造方法。
【実施例】
【0068】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0069】
本発明者らは、従前、イネが持つ遺伝子（ＨＩＳ１）及びその相同遺伝子（ＨＳＬ１遺伝子）が、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性に寄与していることを見出している。また、かかる遺伝子を利用することによって、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性又は感受性が高められた植物体を作出できることも明らかにし、さらには、イネのＨＩＳ１遺伝子と高い相同性を有する遺伝子は、オオムギ、ソルガム、トウモロコシ等においても存在していていることを見出している（特許文献１）。
【0070】
また、ＨＩＳ１及びＯｓＨＳＬ１は、アミノ酸モチーフ検索より、２価鉄イオン及び２－オキソグルタル酸に依存する酸化酵素、２－オキソグルタル酸依存的ジオキシゲナーゼ（２－ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓ、２ＯＧＤｓ）であると、本発明者らによって推定されている。２ＯＧＤは、非ヘム鉄イオンを含有するタンパク質で、植物においては細胞質に局在する可溶性タンパク質である。２ＯＧＤは、２－オキソグルタル酸（２ＯＧ）と酸素分子を補助基質（ｃｏ－ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）として必要とし、二価鉄イオンを補因子として必要とする。２ＯＧＤは、下記に示すとおり、基質（下記反応式における「Ｒ」）の酸化を触媒し、この触媒は２ＯＧの脱炭酸によるコハク酸と二酸化炭素の生成を伴う。
Ｒ＋２ＯＧ＋Ｏ２→ＲＯ＋コハク酸＋ＣＯ２。
Ｒ＋２ＯＧ＋Ｏ２→ＲＯ＋コハク酸＋ＣＯ２。
【0071】
個々の２ＯＧＤの触媒中心は二本鎖βヘリックス構造をとり、保存された配列モチーフ Ｈｉｓ－Ｘａａ－Ａｓｐ／Ｇｌｕ－（Ｘａａ）ｎ－Ｈｉｓ（配列番号：２３）を持つ。このモチーフは二価鉄イオンと結合し、触媒三残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）を形成する。２ＯＧＤｓはバクテリア、動物、植物に至るまで見られ、ＤＮＡ修飾、コラーゲン合成、抗生物質生産、植物ホルモン合成、ストレス応答など機能も多岐にわたる。遺伝子情報の探索より、イネから１１４種、シロイヌナズナから１３０種が存在すると予想された（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ２－ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ． Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．７８ ｐｐ．３２８－３４３， ２０１４）。
【0072】
＜実施例１＞
ＨＩＳ１タンパク質及びその相同タンパク質（ＯｓＨＳＬ１タンパク質）の４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性についての評価
そこで今回、本発明者らは、ＨＩＳ１及びその相同タンパク質を、後述のコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成法にて合成し、それらの除草剤（４－ＨＰＰＤ阻害剤）分解活性を先ず評価した。
ＨＩＳ１タンパク質及びその相同タンパク質（ＯｓＨＳＬ１タンパク質）の４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性についての評価
そこで今回、本発明者らは、ＨＩＳ１及びその相同タンパク質を、後述のコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成法にて合成し、それらの除草剤（４－ＨＰＰＤ阻害剤）分解活性を先ず評価した。
【0073】
なお、最初は、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成法ではなく、大腸菌のタンパク質発現系（ｐＥＴ系、ｐＣｏｌｄ系等）によって、ＨＩＳ１タンパク質等の合成を試みた。しかしながら、ｐＥＴ系、ｐＣｏｌｄ系等のいずれも不溶性のＨＩＳ１タンパク質しか生産できず、可溶化したタンパク質についても活性は回復できなかった。そのため、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系によりＨＩＳ１タンパク質の合成を行い、可溶性のＨＩＳ１タンパク質を得た。
【0074】
そして、この無細胞タンパク質合成系により調製したＨＩＳ１タンパク質を用い、後述の方法にて、２価鉄イオン、２－オキソグルタル酸、及び分子状酸素の存在下で、４－ＨＰＰＤ阻害剤の分解反応を試験管内で検証した。
【0075】
ここで、市販のコムギ胚芽抽出液では還元剤にｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）が用いられ、タンパク質合成反応液にもＤＴＴが含まれているが、２価鉄イオン及びその安定化剤であるアスコルビン酸の共存下では、このＤＴＴがラジカル化合物を発生し、ＨＩＳ１タンパク質の酵素反応に副次的な影響を及ぼすことを、液体クロマトグラフィーにより事前に確認した。そのため、本実施例においては、ＤＴＴに代わりＴｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（ＴＣＥＰ）を還元剤とする未報告のタンパク質合成反応系を新たに構築し、ＨＩＳ１タンパク質等の合成を行い、それらの４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性について検証した。分解活性はタンパク質と４－ＨＰＰＤ阻害剤の反応液を高速液体クロマトグラフィー（移動相；０．５％酢酸水：アセトニトリル＝６５：３５、流量；１ｍｌ／１分、送液；アイソクラクティック、カラム；ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＤＭＥ Ｓ５）により解析した。
【0076】
その結果、図２～４に示すとおり、ＨＩＳ１タンパク質においては、ベンゾビシクロン加水分解体（ＢＢＣ－ＯＨ）、テフリルトリオン及びスルコトリオン、いずれの４－ＨＰＰＤ阻害剤に対しても高い分解活性を有していることが確認された。
【0077】
なお、ベンゾビシクロン（ＢＢＣ）は、所謂プロドラッグの形態であり、土壌中の水溶性を抑制し、植物の根系周辺で水酸化を受けて主に加水分解体（ＢＢＣ－ＯＨ）の形態にて吸収されて薬効を生ずるものと理解されている。したがって、ＢＢＣ－ＯＨが実際の植物内での有効成分となるため、本実施例の評価対象としてＢＢＣ－ＯＨを用いた。
【0078】
また、図には示さないが、ＨＩＳ１タンパク質を用い、ＢＢＣ－ＯＨの修飾反応を検証した結果、反応物が安定に得られた。その結果、２価鉄イオン及び２－オキソグルタル酸の存在下でのみ、ＢＢＣ－ＯＨの修飾が確認された。さらに、ＨＩＳ１タンパク質によるＢＢＣ－ＯＨ、テフリルトリオン及びスルコトリオンの修飾体を質量分析にて解析した結果、いずれの４－ＨＰＰＤ阻害剤も酸素原子が一つ付加した産物に変換されていることが確認された。
【0079】
その一方で、ＯｓＨＳＬ１タンパク質は、ＨＩＳ１タンパク質とアミノ酸配列レベルにて高い相同性を持つものの、図２及び３に示すとおり、ＢＢＣ－ＯＨ及びスルコトリオンに対する分解活性はほとんど認められなかった。なお、図４に示すとおり、テフリルトリオンに対しては、ＨＩＳ１タンパク質より劣るものの、分解活性を有していることが明らかになった。
【0080】
＜実施例２＞
ＨＩＳ１タンパク質における４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性に関与するアミノ酸残基の推定
そこで、本発明者らは、この新たな知見に基づき、ＨＩＳ１タンパク質とＯｓＨＳＬ１タンパク質とにおける僅かなアミノ酸配列における相違が、4-ＨＰＰＤ阻害剤の分解活性に寄与していると想定した。そして、ＨＩＳ１タンパク質において、以下に示す方法にて、4-ＨＰＰＤ阻害剤分解活性に関与するアミノ酸残基を推定した。
ＨＩＳ１タンパク質における４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性に関与するアミノ酸残基の推定
そこで、本発明者らは、この新たな知見に基づき、ＨＩＳ１タンパク質とＯｓＨＳＬ１タンパク質とにおける僅かなアミノ酸配列における相違が、4-ＨＰＰＤ阻害剤の分解活性に寄与していると想定した。そして、ＨＩＳ１タンパク質において、以下に示す方法にて、4-ＨＰＰＤ阻害剤分解活性に関与するアミノ酸残基を推定した。
【0081】
先ず、ＨＩＳ１タンパク質の三次元構造の予測を行う目的で、結晶構造解析を試みた。しかしながら、精製タンパク質が極めて不安定で容易に不溶化してしまうため断念した。
【0082】
代わりに、タンパク質結晶構造が解かれている２価鉄イオン及び２－オキソグルタル酸に依存する酸化酵素の中で、ＨＩＳ１に最も配列類似性が高いシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の酵素 アントシアニジン合成酵素（Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ）を鋳型としてＨＩＳ１の構造モデルを作製した。方法は次のとおりである。
【0083】
先ず、シロイヌナズナのアントシアニジン合成酵素のアミノ酸配列と、イネＨＩＳ１タンパク質及びＯｓＨＳＬ１タンパク質のそれらとを、ソフトウエア ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．２２ ｐｐ．４６７３－４６８０，１９９４）によって解析し、アラインメントを作製した。アミノ酸配列におけるシロイヌナズナのアントシアニジン合成酵素との相同性は、ＨＩＳ１との間では２８．５％、ＯｓＨＳＬ１との間では２８．８％であった。続いて、シロイヌナズナアントシアニジン合成酵素のタンパク質三次元結晶構造を報告した論文（Ｗｉｌｍｏｕｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｖｏｌ．１０ ｐｐ．９３－１０３，２００２）の情報に基づき、タンパク質構造の公共データバンクであるＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）より、シロイヌナズナアントシアニジン合成酵素タンパク質の構造として登録されたアクセッション番号１ＧＰ６を選択した。この１ＧＰ６を鋳型としてソフトウェアＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（Ｂｉａｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ：ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｅｒｔｉａｒｙ ａｎｄ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ．４２ （Ｗ１）ｐｐ．Ｗ２５２－Ｗ２５８，２０１４．）を利用し、ＨＩＳ１及びＯｓＨＳＬ１の三次元構造モデルを作製した。
【0084】
その結果、２価鉄イオンが配位するアミノ酸残基が３種のタンパク質に共通して保存されていることを確認し、この残基を他のアミノ酸に置換するとＨＩＳ１の酵素活性が消失することを確認した。
【0085】
さらに、アントシアニジン合成酵素タンパク質の三次元結晶構造を報告した論文（Ｗｉｌｍｏｕｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｖｏｌ．１０ ｐｐ．９３－１０３，２００２）で基質結合部位として予測されたアミノ酸残基及び周辺の基質ポケットと予想されたアミノ酸残基について、ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬで作製した三次元構造モデルに基づき（図５ 参照）、二次構造、すなわちαヘリックス、βシート構造を中心に比較を行い、ＨＩＳ１とＯｓＨＳＬ１とで異なるアミノ酸残基を選択した。
【0086】
すなわち、基質ポケットに露出していると予想したＨＩＳ１タンパク質のアミノ酸残基のうち、１１９番目イソロイシンがＯｓＨＳＬ１では１１８番目バリンに、１４１番目ヒスチジンがＯｓＨＳＬ１では１４０番目フェニルアラニンに、２０５番目フェニルアラニンがＯｓＨＳＬ１では２０４番目ロイシンに、２２９番目トレオニンがＯｓＨＳＬ１では２３０番目セリンに、２９９番目ロイシンがＯｓＨＳＬ１では２９８番目フェニルアラニンに、それぞれ置換されている可能性を見出した。
【0087】
＜実施例３＞
ＯｓＨＳＬ１タンパク質変異体の作製、及びそれら変異体の４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性についての評価
そこで、かかる可能性を検証すべく、ＯｓＨＳＬ１タンパク質においてＨＩＳ１タンパク質と相違しているアミノ酸残基を、適宜ＨＩＳ１のそれに置換することによって、当該タンパク質にＨＩＳ１型の酵素活性が付与できるかにつき、以下に示す方法にて分析を進めた。
ＯｓＨＳＬ１タンパク質変異体の作製、及びそれら変異体の４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性についての評価
そこで、かかる可能性を検証すべく、ＯｓＨＳＬ１タンパク質においてＨＩＳ１タンパク質と相違しているアミノ酸残基を、適宜ＨＩＳ１のそれに置換することによって、当該タンパク質にＨＩＳ１型の酵素活性が付与できるかにつき、以下に示す方法にて分析を進めた。
【0088】
＜変異導入用プライマーの設計＞
先ず、ＯｓＨＳＬ１タンパク質の１１８番目、１４０番目、２０４番目、２２９番目及び２９８番目のいずれかのアミノ酸残基を、ＨＩＳ１タンパク質のそれに、部位特異的変異法によって置換すべく、該方法に用いる変異導入用プライマーを、以下の例示のとおり、設計した。
先ず、ＯｓＨＳＬ１タンパク質の１１８番目、１４０番目、２０４番目、２２９番目及び２９８番目のいずれかのアミノ酸残基を、ＨＩＳ１タンパク質のそれに、部位特異的変異法によって置換すべく、該方法に用いる変異導入用プライマーを、以下の例示のとおり、設計した。
【0089】
１） ＯｓＨＳＬ１ １１８番目のバリン残基をイソロイシン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｖ１１８Ｉ）
ＯｓＨＳＬ１ １１８番目のバリン残基をイソロイシン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｖ１１８ＩＦＷ：５’－ＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧａｔｔＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣ－３’（配列番号：２４）
Ｖ１１８ＩＲＶ：５’－ＧＴＣＡＧＴＴＣＣＡＴＡＣＣＣＴＴＣａａｔＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号：２５）
プライマーＶ１１８ＩＦＷの２０番目から２２番目のａｔｔ（イソロイシン、Ｉに相当するコドン）及びプライマーＶ１１８ＩＲＶの１９番目から２１番目のａａｔ（イソロイシン、Ｉに相当するコドンａｔｔの相補配列）は、野生型ＯｓＨＳＬ１のＧＴＧ（バリン、Ｖ）よりデザインした。コドンＧＴＧをＡＴＴにすることにより１１８番目のバリン残基がイソロイシン残基へ置換される。
ＯｓＨＳＬ１ １１８番目のバリン残基をイソロイシン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｖ１１８ＩＦＷ：５’－ＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＣＡＧａｔｔＧＡＡＧＧＧＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣ－３’（配列番号：２４）
Ｖ１１８ＩＲＶ：５’－ＧＴＣＡＧＴＴＣＣＡＴＡＣＣＣＴＴＣａａｔＣＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＴＧＣＣＧＴＣＧ－３’（配列番号：２５）
プライマーＶ１１８ＩＦＷの２０番目から２２番目のａｔｔ（イソロイシン、Ｉに相当するコドン）及びプライマーＶ１１８ＩＲＶの１９番目から２１番目のａａｔ（イソロイシン、Ｉに相当するコドンａｔｔの相補配列）は、野生型ＯｓＨＳＬ１のＧＴＧ（バリン、Ｖ）よりデザインした。コドンＧＴＧをＡＴＴにすることにより１１８番目のバリン残基がイソロイシン残基へ置換される。
【0090】
２） ＯｓＨＳＬ１ １４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｆ１４０Ｈ）
ＯｓＨＳＬ１ １４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｆ１４０ｔｏＨ１４１ＦＷ：５’－ＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＧＣＴＧｃａｔＣＴＣＡＧＡＧＴＴＧＡＡＣＣＣ－３’（配列番号：２６）
Ｆ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶ：５’－ＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧａｔｇＣＡＧＣＣＧＡＴＣＡＧＡＣＣ－３’（配列番号：２７）
プライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＦＷの１５番目から１７番目のｃａｔ（ヒスチジン、Ｈに相当するコドン）及びプライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶの１６番目から１８番目のａｔｇ（ヒスチジン、Ｈに相当するコドンｃａｔの相補配列）は、野生型ＯｓＨＳＬ１のＴＴＴ（フェニルアラニン、Ｆ）よりデザインした。コドンＴＴＴをＣＡＴにすることにより１４０番目のフェニルアラニン残基がヒスチジン残基へ置換される。
ＯｓＨＳＬ１ １４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｆ１４０ｔｏＨ１４１ＦＷ：５’－ＧＧＴＣＴＧＡＴＣＧＧＣＴＧｃａｔＣＴＣＡＧＡＧＴＴＧＡＡＣＣＣ－３’（配列番号：２６）
Ｆ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶ：５’－ＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧａｔｇＣＡＧＣＣＧＡＴＣＡＧＡＣＣ－３’（配列番号：２７）
プライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＦＷの１５番目から１７番目のｃａｔ（ヒスチジン、Ｈに相当するコドン）及びプライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶの１６番目から１８番目のａｔｇ（ヒスチジン、Ｈに相当するコドンｃａｔの相補配列）は、野生型ＯｓＨＳＬ１のＴＴＴ（フェニルアラニン、Ｆ）よりデザインした。コドンＴＴＴをＣＡＴにすることにより１４０番目のフェニルアラニン残基がヒスチジン残基へ置換される。
【0091】
３） ＯｓＨＳＬ１ ２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｌ２０４Ｆ）
ＯｓＨＳＬ１ ２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｌ２０４ｔｏＦ２０５ＦＷ：５’－ＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡｔｔｔＧＣＡＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣ－３’（配列番号：２８）
Ｌ２０４ｔｏＦ２０５ＲＶ：５’－ＧＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣａａａＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧ－３’（配列番号：２９）
プライマーＬ２０４ｔｏＦ２０５ＦＷの１７番目から１９番目のｔｔｔ（フェニルアラニン、Ｆに相当するコドン）及びプライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶの２１番目から２２番目のａａａ（フェニルアラニン、Ｆに相当するコドンｔｔｔの相補配列）は、野生型ＯｓＨＳＬ１のＣＴＴ（ロイシン、Ｌ）よりデザインした。コドンＣＴＴをＴＴＴにすることにより２０４番目のロイシン残基がフェニルアラニン残基へ置換される。
ＯｓＨＳＬ１ ２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｌ２０４ｔｏＦ２０５ＦＷ：５’－ＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡｔｔｔＧＣＡＡＧＡＴＴＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣ－３’（配列番号：２８）
Ｌ２０４ｔｏＦ２０５ＲＶ：５’－ＧＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣａａａＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＧ－３’（配列番号：２９）
プライマーＬ２０４ｔｏＦ２０５ＦＷの１７番目から１９番目のｔｔｔ（フェニルアラニン、Ｆに相当するコドン）及びプライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶの２１番目から２２番目のａａａ（フェニルアラニン、Ｆに相当するコドンｔｔｔの相補配列）は、野生型ＯｓＨＳＬ１のＣＴＴ（ロイシン、Ｌ）よりデザインした。コドンＣＴＴをＴＴＴにすることにより２０４番目のロイシン残基がフェニルアラニン残基へ置換される。
【0092】
４） ＯｓＨＳＬ１ ２２９番目のセリン残基をトレオニン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｓ２０４Ｔ）
ＯｓＨＳＬ１ ２２９番目のセリン残基をトレオニン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｓ２２９ＴＦＷ：５’－ＣＣＴＣＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣａｃｃＣＴＣＴＴＴＡＣＧＡＴＴＣＴＴＣ－３’（配列番号：３０）
Ｓ２２９ＴＲＶ：５’－ＧＡＡＧＡＡＴＣＧＴＡＡＡＧＡＧｇｇｔＧＣＣＧＴＣＧＧＡＧＴＧＡＧＧ－３’（配列番号：３１）
プライマーＳ２２９ＴＦＷの１６番目から１８番目のａｃｃ（トレオニン、Ｔに相当するコドン）及びプライマーＳ２２９ＴＲＶの１７番目から１９番目のｇｇｔ（トレオニン、Ｔに相当するコドンａｃｃの相補配列）は、野生型ＯｓＨＳＬ１のＴＣＣ（セリン、Ｓ）よりデザインした。コドンＴＣＣをＡＣＣにすることにより２２９番目のセリン残基がトレオニン残基へ置換される。
ＯｓＨＳＬ１ ２２９番目のセリン残基をトレオニン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｓ２２９ＴＦＷ：５’－ＣＣＴＣＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣａｃｃＣＴＣＴＴＴＡＣＧＡＴＴＣＴＴＣ－３’（配列番号：３０）
Ｓ２２９ＴＲＶ：５’－ＧＡＡＧＡＡＴＣＧＴＡＡＡＧＡＧｇｇｔＧＣＣＧＴＣＧＧＡＧＴＧＡＧＧ－３’（配列番号：３１）
プライマーＳ２２９ＴＦＷの１６番目から１８番目のａｃｃ（トレオニン、Ｔに相当するコドン）及びプライマーＳ２２９ＴＲＶの１７番目から１９番目のｇｇｔ（トレオニン、Ｔに相当するコドンａｃｃの相補配列）は、野生型ＯｓＨＳＬ１のＴＣＣ（セリン、Ｓ）よりデザインした。コドンＴＣＣをＡＣＣにすることにより２２９番目のセリン残基がトレオニン残基へ置換される。
【0093】
５） ＯｓＨＳＬ１ ２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｆ２９８Ｌ）
ＯｓＨＳＬ１ ２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｆ２９８ｔｏＬ２９９ＦＷ：５’－ＧＧＡＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧｔｔａＴＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧ－３’（配列番号：３２）
Ｆ２９８ｔｏＬ２９９ＲＶ：５’－ＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＡＣＡＣＴＧＴＡｔａａＣＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＡＴＣＣ－３’（配列番号：３３）
プライマーＦ２９８ｔｏＬ２９９ＦＷの１８番目から２０番目のｔｔａ（ロイシン、Ｌに相当するコドン）、及びプライマーＦ２９８ｔｏＬ２９９ＲＶの１９番目から２１番目のｔａａ（ロイシン、Ｌに相当するコドンｔｔａの相補配列）は、野生型ＯｓＨＳＬ１のＴＴＴ（フェニルアラニン、Ｆ）よりデザインした。コドンＴＴＴをＴＴＡにすることにより２９８番目のフェニルアラニン残基がロイシン残基へ置換される。
ＯｓＨＳＬ１ ２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｆ２９８ｔｏＬ２９９ＦＷ：５’－ＧＧＡＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧｔｔａＴＡＣＡＧＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧ－３’（配列番号：３２）
Ｆ２９８ｔｏＬ２９９ＲＶ：５’－ＣＴＣＡＴＣＡＴＴＣＡＣＡＣＴＧＴＡｔａａＣＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＡＴＣＣ－３’（配列番号：３３）
プライマーＦ２９８ｔｏＬ２９９ＦＷの１８番目から２０番目のｔｔａ（ロイシン、Ｌに相当するコドン）、及びプライマーＦ２９８ｔｏＬ２９９ＲＶの１９番目から２１番目のｔａａ（ロイシン、Ｌに相当するコドンｔｔａの相補配列）は、野生型ＯｓＨＳＬ１のＴＴＴ（フェニルアラニン、Ｆ）よりデザインした。コドンＴＴＴをＴＴＡにすることにより２９８番目のフェニルアラニン残基がロイシン残基へ置換される。
【0094】
＜変異導入ＤＮＡの調製＞
次に、上記のとおり、変異を導入して設計したプライマー及びＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用い、部位特異的変異をＯｓＨＳＬ１タンパク質に導入した。
次に、上記のとおり、変異を導入して設計したプライマー及びＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用い、部位特異的変異をＯｓＨＳＬ１タンパク質に導入した。
【0095】
すなわち先ず、ＯｓＨＳＬ１タンパク質をコードするｃＤＮＡがクローン化してあるプラスミド ＡＫ２４１９４８／ｐＦＬＣ１（農業生物資源研究所ＧｅｎｅＢａｎｋより分譲）を鋳型として、上記変異導入用プライマーセットを用いてｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行い、前記ｃＤＮＡに変異を導入したＰＣＲ産物を得た。
【0096】
具体的には、ＰＣＲ反応の組成は、キット付属バッファー ５μｌ、キット付属 ｄＮＴＰ ｍｉｘ １μｌ、キット付属ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ（２．５ｕｎｉｔｓ）、Ｆｗ及びＲｖプライマー各１μｌ（１２５ｎｇ）、鋳型プラスミドＤＮＡ １μｌ（１０ｎｇ）と蒸留水４０μｌを混合してなる。そして、この５０μｌの反応液を、ＰＣＲ反応装置（宝酒造社製、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ ＴＰ３５０型）を用いて、９５℃で３０秒間保持した後、９５℃で３０秒間、５５℃で１分、６８℃で４．５分の反応を１６サイクル繰り返した後４℃に冷却することにより、前記ＰＣＲ産物を調製した。
【0097】
次いで、増幅したＰＣＲ産物にキット付属のＤｐｎＩ １μｌ（１０ ｕｎｉｔｓ）を添加し、３７℃で１時間保持した。この反応により変異の導入されていない鋳型プラスミドを切断した。
【0098】
前記反応終了後、ＤｐｎＩ処理済みＰＣＲ産物 １μｌをキット付属の大腸菌コンピテントセルの形質転換を行い、出現した薬剤耐性コロニーより変異導入プラスミドを調製した。
【0099】
そして、作製した変異導入型ＯｓＨＳＬ１タンパク質は、コムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成法により調製した（Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｂａｓｅｄ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ Ｓｙｎｔｈａｓｅ， ａ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｋｅｙ Ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１３８ ｐｐ．２２６０－２２６８，２００５）。
【0100】
なお、反応後、反応液をＳＤＳ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供した。そして、泳動後、ＣＢＢ染色し、所望の分子量のタンパク質が合成されていることの確認を行った。
【0101】
＜多重変異導入＞
また、ＯｓＨＳＬ１タンパク質の１１８番目、１４０番目、２０４番目、２２９番目及び２９８番目のいずれかにおける複数のアミノ酸残基を、上記と同様の方法にて、以下に示すとおり、ＨＩＳ１タンパク質のそれらに置換した。
また、ＯｓＨＳＬ１タンパク質の１１８番目、１４０番目、２０４番目、２２９番目及び２９８番目のいずれかにおける複数のアミノ酸残基を、上記と同様の方法にて、以下に示すとおり、ＨＩＳ１タンパク質のそれらに置換した。
【0102】
６） ＯｓＨＳＬ１ １４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基に、２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｆ１４０Ｈ Ｌ２０４Ｆ）
ＯｓＨＳＬ１ ２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｌ２０４Ｆ）を鋳型として、上記プライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＦＷ及びＦ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶを用いて１４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
ＯｓＨＳＬ１ ２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｌ２０４Ｆ）を鋳型として、上記プライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＦＷ及びＦ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶを用いて１４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
【0103】
７） ＯｓＨＳＬ１ １４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基に、２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｆ１４０Ｈ Ｆ２９８Ｌ）
ＯｓＨＳＬ１ ２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｆ２９８Ｌ）を鋳型として、上記プライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＦＷ及びＦ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶを用いて１４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
ＯｓＨＳＬ１ ２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｆ２９８Ｌ）を鋳型として、上記プライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＦＷ及びＦ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶを用いて１４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
【0104】
８） ＯｓＨＳＬ１ ２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、さらに２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｌ２０４Ｆ Ｆ２９８Ｌ）
２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｆ２９８Ｌ）を鋳型として、上記プライマーＬ２０４ｔｏＦ２０５ＦＷ及びＬ２０４ｔｏＦ２０５ＲＶを用いて２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｆ２９８Ｌ）を鋳型として、上記プライマーＬ２０４ｔｏＦ２０５ＦＷ及びＬ２０４ｔｏＦ２０５ＲＶを用いて２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
【0105】
９） ＯｓＨＳＬ１ １４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基に、２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、さらに２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｆ１４０Ｈ Ｌ２０４Ｆ Ｆ２９８Ｌ）
ＯｓＨＳＬ１ ２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、さらに２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｌ２０４Ｆ Ｆ２９８Ｌ）を鋳型として、上記プライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＦＷ及びＦ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶを用いて１４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
ＯｓＨＳＬ１ ２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、さらに２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｌ２０４Ｆ Ｆ２９８Ｌ）を鋳型として、上記プライマーＦ１４０ｔｏＨ１４１ＦＷ及びＦ１４０ｔｏＨ１４１ＲＶを用いて１４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
【0106】
１０） ＯｓＨＳＬ１ １４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基に、２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、２２９番目のセリン残基をトレオニン残基に、さらに２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｆ１４０Ｈ Ｌ２０４Ｆ Ｓ２２９Ｔ Ｆ２９８Ｌ）
ＯｓＨＳＬ１ １４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基に、２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｆ１４０Ｈ Ｌ２０４Ｆ Ｆ２９８Ｌ）を鋳型として、上記プライマーＳ２２９ＴＦＷ及びＳ２２９ＴＲＶを用いて２２９番目のセリン残基をトレオニン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
ＯｓＨＳＬ１ １４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基に、２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｆ１４０Ｈ Ｌ２０４Ｆ Ｆ２９８Ｌ）を鋳型として、上記プライマーＳ２２９ＴＦＷ及びＳ２２９ＴＲＶを用いて２２９番目のセリン残基をトレオニン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
【0107】
１１） ＯｓＨＳＬ１ １１８番目のバリン残基をイソロイシン残基に、１４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基に、２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、２２９番目のセリン残基をトレオニン残基に、さらに２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ１ Ｖ１１８Ｉ Ｆ１４０Ｈ Ｌ２０４Ｆ Ｓ２２９Ｔ Ｆ２９８Ｌ）
１４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基に、２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、２２９番目のセリン残基をトレオニン残基に、２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｆ１４０Ｈ Ｌ２０４Ｆ Ｓ２２９Ｔ Ｆ２９８Ｌ）を鋳型として、上記プライマーＶ１１８ＩＦＷ及びＶ１１８ＩＲＶを用いて１１８番目のバリン残基をイソロイシン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
１４０番目のフェニルアラニン残基をヒスチジン残基に、２０４番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、２２９番目のセリン残基をトレオニン残基に、２９８番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換したプラスミドｐＦＬＣ１－ＨＳＬ１（Ｆ１４０Ｈ Ｌ２０４Ｆ Ｓ２２９Ｔ Ｆ２９８Ｌ）を鋳型として、上記プライマーＶ１１８ＩＦＷ及びＶ１１８ＩＲＶを用いて１１８番目のバリン残基をイソロイシン残基にアミノ酸置換するように変異導入を行った。
【0108】
＜実施例４＞
ＨＳＬ１タンパク質（ＯｓＨＳＬ１タンパク質を除く）変異体の作製、及びそれら変異体の４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性についての評価
また、ＯｓＨＳＬ１を除くイネ由来のＨＳＬタンパク質群、及びイネ以外の種における、ＨＩＳ１に相同性を示すＨＳＬタンパク質群についても、４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性について評価すべく、以下の示す方法にて、これらタンパク質も調製した。
ＨＳＬ１タンパク質（ＯｓＨＳＬ１タンパク質を除く）変異体の作製、及びそれら変異体の４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性についての評価
また、ＯｓＨＳＬ１を除くイネ由来のＨＳＬタンパク質群、及びイネ以外の種における、ＨＩＳ１に相同性を示すＨＳＬタンパク質群についても、４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性について評価すべく、以下の示す方法にて、これらタンパク質も調製した。
【0109】
（ＨＳＬタンパク質の無細胞発現用コンストラクトの作製）
ＨＩＳ１及びＯｓＨＳＬ１を除くイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｏｃｏｌｏｒ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来のＨＩＳ１相同遺伝子（ＨＳＬ遺伝子）の翻訳領域（イネ由来のＯｓＨＳＬ２遺伝子については、配列番号：５に記載のヌクレオチド配列。オオムギ由来のＨｖＨＳＬ１遺伝子については、配列番号：７に記載のヌクレオチド配列。オオムギ由来のＨｖＨＳＬ２遺伝子については、配列番号：９に記載のヌクレオチド配列。オオムギ由来のＨｖＨＳＬ３遺伝子については、配列番号：１１に記載のヌクレオチド配列。コムギ由来のＴａＨＳＬ１遺伝子については、配列番号：１３に記載のヌクレオチド配列。コムギ由来のＴａＨＳＬ２遺伝子については、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列。トウモロコシ由来のＺｍＨＳＬ１については、配列番号：１７に記載のヌクレオチド配列。トウモロコシ由来のＺｍＨＳＬ２については、配列番号：１９に記載のヌクレオチド配列。ソルガム由来のＳｂＨＳＬ１については、配列番号：２１に記載のヌクレオチド配列）の上流にＳｐｅＩ認識配列、下流にＳａｌＩ認識配列を付与した人工合成ＤＮＡの調製を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓに委託した。得られた人工合成ＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩ及びＳａｌＩ処理に供し、目的遺伝子を単離した。得られた遺伝子は、同様の制限酵素処理を施した無細胞翻訳用プラスミドベクターｐＹＴ０８へ導入し、無細胞発現用コンストラクトｐＹＴ０８－ＯｓＨＳＬ２，ＴａＨＳＬ１，ＴａＨＳＬ２，ＨｖＨＳＬ１，ＨｖＨＳＬ２，ＨｖＨＳＬ３，ＳｂＨＳＬ１，ＺｍＨＳＬ１，ＺｍＨＳＬ２を作製した。
ＨＩＳ１及びＯｓＨＳＬ１を除くイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｏｃｏｌｏｒ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来のＨＩＳ１相同遺伝子（ＨＳＬ遺伝子）の翻訳領域（イネ由来のＯｓＨＳＬ２遺伝子については、配列番号：５に記載のヌクレオチド配列。オオムギ由来のＨｖＨＳＬ１遺伝子については、配列番号：７に記載のヌクレオチド配列。オオムギ由来のＨｖＨＳＬ２遺伝子については、配列番号：９に記載のヌクレオチド配列。オオムギ由来のＨｖＨＳＬ３遺伝子については、配列番号：１１に記載のヌクレオチド配列。コムギ由来のＴａＨＳＬ１遺伝子については、配列番号：１３に記載のヌクレオチド配列。コムギ由来のＴａＨＳＬ２遺伝子については、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列。トウモロコシ由来のＺｍＨＳＬ１については、配列番号：１７に記載のヌクレオチド配列。トウモロコシ由来のＺｍＨＳＬ２については、配列番号：１９に記載のヌクレオチド配列。ソルガム由来のＳｂＨＳＬ１については、配列番号：２１に記載のヌクレオチド配列）の上流にＳｐｅＩ認識配列、下流にＳａｌＩ認識配列を付与した人工合成ＤＮＡの調製を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓに委託した。得られた人工合成ＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩ及びＳａｌＩ処理に供し、目的遺伝子を単離した。得られた遺伝子は、同様の制限酵素処理を施した無細胞翻訳用プラスミドベクターｐＹＴ０８へ導入し、無細胞発現用コンストラクトｐＹＴ０８－ＯｓＨＳＬ２，ＴａＨＳＬ１，ＴａＨＳＬ２，ＨｖＨＳＬ１，ＨｖＨＳＬ２，ＨｖＨＳＬ３，ＳｂＨＳＬ１，ＺｍＨＳＬ１，ＺｍＨＳＬ２を作製した。
【0110】
＜ＺｍＨＳＬ２及びＳｂＨＳＬ１への変異導入＞
さらに、イネ由来のＯｓＨＳＬ２、トウモロコシ由来のＺｍＨＳＬ２及びソルガム由来のＳｂＨＳＬ１に関しては、ＨＩＳ１型のアミノ酸残基を導入した変異導入タンパク質を作製し、その４－ＨＰＰＤ阻害剤修飾活性を検証した。
さらに、イネ由来のＯｓＨＳＬ２、トウモロコシ由来のＺｍＨＳＬ２及びソルガム由来のＳｂＨＳＬ１に関しては、ＨＩＳ１型のアミノ酸残基を導入した変異導入タンパク質を作製し、その４－ＨＰＰＤ阻害剤修飾活性を検証した。
【0111】
具体的には、上述のとおり、ＨＩＳ１とＯｓＨＳＬ１の比較よりＨＩＳ１ １４１番目ヒスチジンと２９９番目ロイシンがＢＢＣ－ＯＨ修飾活性に関与していると推定された。ＺｍＨＳＬ２及びＳｂＨＳＬ１は、ＨＩＳ１の２９９番目ロイシンに相当するアミノ酸がＨＩＳ１と同じで、もう一方（ＨＩＳ１ １４１番目ヒスチジンに相当）はＨＩＳ１とは異なる残基を持つ。そこで、ＺｍＨＳＬ２及びＳｂＨＳＬ１についてＨＩＳ１ １４１番目相当の残基にヒスチジンを変異導入し、その活性を検証した。一方、ＯｓＨＳＬ２は、ＨＩＳ１の１４０番目ロイシンに相当するアミノ酸がＨＩＳ１と同じで、ＨＩＳ１の２９９番目ロイシンに相当するアミノ酸はＨＩＳ１とは異なる残基を持つ。そこで、ＯｓＨＳＬ２についてＨＩＳ１ ２９９番目相当の残基にロイシンを変異導入し、その活性を検証した。
【0112】
（変異導入用プライマー）
１） ＯｓＨＳＬ２ ３０１番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ２ Ｆ３０１Ｌ）
上記実施例３と同様にして、ＯｓＨＳＬ２ ３０１番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｏｓ２＿Ｆ３０１Ｌ＿Ｆｗ：５’－ｔｔｇＴＡＴＧＣＧＧＴＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧ－３’（配列番号：３４）
Ｏｓ２＿Ｆ３０１Ｌ＿Ｒｖ：５’－ＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣ－３’（配列番号：３５）
プライマーＯｓ２＿Ｆ３０１Ｌ＿Ｆｗの１番目から３番目のｔｔｇ（ロイシン、Ｌに相当するコドン）は、野生型ＯｓＨＳＬ２のＴＴＣ（フェニルアラニン、Ｆ）よりデザインした。コドンＴＴＣをＴＴＧにすることにより３０１番目のフェニルアラニン残基がロイシン残基へ置換される。
１） ＯｓＨＳＬ２ ３０１番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換（ＨＳＬ２ Ｆ３０１Ｌ）
上記実施例３と同様にして、ＯｓＨＳＬ２ ３０１番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドン又はそのアンチコドンを示す。
Ｏｓ２＿Ｆ３０１Ｌ＿Ｆｗ：５’－ｔｔｇＴＡＴＧＣＧＧＴＣＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧ－３’（配列番号：３４）
Ｏｓ２＿Ｆ３０１Ｌ＿Ｒｖ：５’－ＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＧＡＣＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣ－３’（配列番号：３５）
プライマーＯｓ２＿Ｆ３０１Ｌ＿Ｆｗの１番目から３番目のｔｔｇ（ロイシン、Ｌに相当するコドン）は、野生型ＯｓＨＳＬ２のＴＴＣ（フェニルアラニン、Ｆ）よりデザインした。コドンＴＴＣをＴＴＧにすることにより３０１番目のフェニルアラニン残基がロイシン残基へ置換される。
【0113】
２） ＺｍＨＳＬ２ １４０番目のグルタミン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換（ＺｍＨＳＬ２ Ｑ１４０Ｈ）
上記実施例３と同様にして、ＺｍＨＳＬ２ １４０番目のグルタミン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドンを示す。
Ｚｍ２＿Ｑ１４０Ｈ＿Ｆｗ：５’－ｃａｔＣＴＡＡＡＧＧＴＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧ－３’（配列番号：３６）
Ｚｍ２＿Ｑ１４０Ｈ＿Ｒｖ：５’－ＣＡＡＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＴＧ－３’（配列番号：３７）。
上記実施例３と同様にして、ＺｍＨＳＬ２ １４０番目のグルタミン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドンを示す。
Ｚｍ２＿Ｑ１４０Ｈ＿Ｆｗ：５’－ｃａｔＣＴＡＡＡＧＧＴＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧ－３’（配列番号：３６）
Ｚｍ２＿Ｑ１４０Ｈ＿Ｒｖ：５’－ＣＡＡＣＣＴＧＴＣＡＴＴＣＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＴＧ－３’（配列番号：３７）。
【0114】
３） ＳｂＨＳＬ１ １４０番目のグルタミン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換（ＳｂＨＳＬ１ Ｑ１４０Ｈ）
上記実施例３と同様にして、ＳｂＨＳＬ１ １４０番目のグルタミン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドンを示す。
Ｓｂ１＿Ｑ１４０Ｈ＿Ｆｗ：５’－ｃａｔＣＴＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＣＧＧＡＧＧ－３’（配列番号：３８）
Ｓｂ１＿Ｑ１４０Ｈ＿Ｒｖ：５’－ ＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＧＴＣＧＡＧＡＡＴＧ－３’（配列番号：３９）
４） ＺｍＨＳＬ２ ２０５番目のチロシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換（ＺｍＨＳＬ２ Ｙ２０５Ｆ）
上記実施例３と同様にして、ＺｍＨＳＬ２ ２０５番目のチロシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドンを示す。
Ｚｍ２＿Ｙ２０５Ｆ＿Ｆｗ：５’－ｔｔｔＧＣＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣ－３’（配列番号：４０）
Ｚｍ２＿Ｙ２０５Ｆ＿Ｒｖ：５’－ＧＧＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＴＧＣＴＣ－３’（配列番号：４１）。
上記実施例３と同様にして、ＳｂＨＳＬ１ １４０番目のグルタミン残基をヒスチジン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドンを示す。
Ｓｂ１＿Ｑ１４０Ｈ＿Ｆｗ：５’－ｃａｔＣＴＧＡＡＧＧＴＴＧＡＧＣＣＧＧＡＧＧ－３’（配列番号：３８）
Ｓｂ１＿Ｑ１４０Ｈ＿Ｒｖ：５’－ ＧＡＧＴＣＴＧＴＣＧＣＴＣＣＡＧＴＣＧＡＧＡＡＴＧ－３’（配列番号：３９）
４） ＺｍＨＳＬ２ ２０５番目のチロシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換（ＺｍＨＳＬ２ Ｙ２０５Ｆ）
上記実施例３と同様にして、ＺｍＨＳＬ２ ２０５番目のチロシン残基をフェニルアラニン残基にアミノ酸置換するように変異導入用プライマーをデザインした。変異導入用プライマーの塩基配列は下記のとおりである。なお、小文字は変異導入コドンを示す。
Ｚｍ２＿Ｙ２０５Ｆ＿Ｆｗ：５’－ｔｔｔＧＣＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣ－３’（配列番号：４０）
Ｚｍ２＿Ｙ２０５Ｆ＿Ｒｖ：５’－ＧＧＣＴＴＧＧＧＧＡＣＴＴＧＣＴＣ－３’（配列番号：４１）。
【0115】
（変異導入ＤＮＡの調製）
部位特異的変異は変異を導入して設計したプライマーを用いたｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲによって導入した。前述のとおりにして作製したｐＹＴ０８－ＺｍＨＳＬ２ベクターを鋳型として、上記変異導入用プライマーセットを用いてｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行い、変異を導入したＰＣＲ産物を得た。
部位特異的変異は変異を導入して設計したプライマーを用いたｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲによって導入した。前述のとおりにして作製したｐＹＴ０８－ＺｍＨＳＬ２ベクターを鋳型として、上記変異導入用プライマーセットを用いてｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲを行い、変異を導入したＰＣＲ産物を得た。
【0116】
ＰＣＲ反応の組成は、１×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｎｅｏ（東洋紡社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．０２ｕｎｉｔｓ／μｌ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｎｅｏ（東洋紡社製）、０．３μＭ Ｆｗ及びＲｖプライマー、１ｎｇ 鋳型ＤＮＡからなり、それを、ＰＣＲ反応装置（宝酒造社製、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ ＴＰ３５０型）を用いて、９４℃で２分間保持した後、９８℃で１０秒間、６８℃で２分１５秒間の反応を５サイクル繰り返した後４℃に冷却することによって、ＰＣＲ産物を調製した。
【0117】
増幅したＰＣＲ産物２０μｌにＤｐｎＩ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）（Ｂｉｏ ｒａｂ社製）１μｌを添加し、３７℃で１時間保持した。この反応により変異の導入されていない鋳型プラスミドを切断した。
【0118】
上記反応終了後、ＤｐｎＩ処理済みＰＣＲ産物１μｌをＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ２．５μｌ（東洋紡社製）、ＭｉｌｌｉＱ ３．５μｌと混合し、１６℃で１時間保持した。以上の反応により変異が導入されたＰＣＲ産物がＳｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎすることにより環状化し、変異導入プラスミドを構築した。
【0119】
（コムギ胚芽無細胞システムによるタンパク質合成）
先ず、以下の手順にてＰＣＲによる転写鋳型のＤＮＡの合成を行った。作製したプラスミドはｐＹＴ０８＿Ｆｗ２プライマー：５’－ＣＧＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣ－３’（配列番号：４２）とｐＹＴ０８＿Ｒｖプライマー：５’－ＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＧ－３’（配列番号：４３）を用いたＰＣＲによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型準備に使用した。ＰＣＲ反応の組成は１×ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．０２５ｕｎｉｔｓ／μｌ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｎｅｏ（東洋紡社製）、０．２μＭ Ｆｗ及びＲｖプライマー、１ｎｇ 鋳型ＤＮＡとし、ＰＣＲ反応装置（宝酒造社製、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ ＴＰ３５０型）を用いて、９４℃で２分間保持した後、９８℃で１０秒間、６８℃で２分１５秒間の反応を５サイクル繰り返した後４℃に冷却した。
先ず、以下の手順にてＰＣＲによる転写鋳型のＤＮＡの合成を行った。作製したプラスミドはｐＹＴ０８＿Ｆｗ２プライマー：５’－ＣＧＣＡＴＣＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣ－３’（配列番号：４２）とｐＹＴ０８＿Ｒｖプライマー：５’－ＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＧ－３’（配列番号：４３）を用いたＰＣＲによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型準備に使用した。ＰＣＲ反応の組成は１×ＥｘＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．０２５ｕｎｉｔｓ／μｌ ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｎｅｏ（東洋紡社製）、０．２μＭ Ｆｗ及びＲｖプライマー、１ｎｇ 鋳型ＤＮＡとし、ＰＣＲ反応装置（宝酒造社製、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ ＴＰ３５０型）を用いて、９４℃で２分間保持した後、９８℃で１０秒間、６８℃で２分１５秒間の反応を５サイクル繰り返した後４℃に冷却した。
【0120】
次に、得られたＰＣＲ産物を鋳型として転写反応を行い、ｍＲＮＡを合成した。得られたＰＣＲ産物を直接鋳型として用いてｍＲＮＡを合成（転写）した。すなわち、ＰＣＲ産物を、転写反応液［８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１６ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、１０ｍＭ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１０ｍＭ ＤＴＴ、３ｍＭ ＮＴＰ、１ｕｎｉｔ／μｌ ＲＮａｓｉｎ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、１ｕｎｉｔ／μｌ ＳＰ６ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）］に１／１０量添加した。３７℃で２時間反応後、エタノール沈殿、７０％エタノール洗浄を行い、適当量の滅菌水に溶解した。２６０ｎｍの吸光度を測定してＲＮＡ量を算出した。
【0121】
次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、コムギ胚芽抽出液を用いた透析法によるタンパク質合成を行った。すなわち、５０μｌのコムギ胚芽無細胞タンパク質合成液を入れた透析カップに上記ｍＲＮＡ（約３０－３５μｇ）を添加し、１ウェルあたり６５０μｌの基質液を入れた２４穴プレートに上記透析カップを浸漬し、１６℃で４８時間インキュベートした。反応後、反応液０．５μｌを１×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ １０μｌと混合し熱変性（９５°Ｃ，５ｍｉｎ）を行い、１２％ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。そして、泳動後、ＣＢＢ染色し、所望の分子量のタンパク質が合成されていることの確認を行った。
【0122】
そして、以上のとおり実施例１～４にて得られた合成タンパク質を、以下のとおりにして各量を見積もった上で、４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性の分析を行った。
【0123】
（液体シンチレーションカウンターを用いた合成タンパク質量の見積もり）
合成反応液に［１４Ｃ］－Ｌｅｕｃｉｎｅを添加し無細胞タンパク質合成を行い、合成タンパク質に取り込まれた１４Ｃカウントを測定することで合成タンパク質量の見積もりを行った。すなわち、５０μｌのコムギ胚芽無細胞タンパク質合成液を入れた透析カップにｍＲＮＡ、さらに［１４Ｃ］－Ｌｅｕｃｉｎｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を内外液に１／１００量添加し、１ウェルあたり６５０μｌの基質液を入れた２４穴プレートに上記透析カップを浸漬し、１６℃で４８時間インキュベートした。反応終了後、反応液５μｌを濾紙 ３ＭＭ ＣＨＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にスポットし、ＴＣＡ沈殿、エタノール洗浄を行い、クリアゾル（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製）に浸け、液体シンチレーションカウンターによって合成タンパク質に取り込まれた１４Ｃカウントを測定、合成タンパク質に含まれる全１４Ｃカウントを算出した（Ａ）。さらに反応液中に含まれる総１４Ｃを濾紙にスポットし同様に１４Ｃカウントを測定（Ｂ）し、これらの値から合成タンパク質への［１４Ｃ］Ｌｅｕの取り込み率（Ｂ／Ａ）を算出した（Ｃ）。これをタンパク質のアミノ酸配列中に含まれるＬｅｕ数（Ｄ）で除することで合成タンパク質アミノ酸配列中の特定の１残基の取り込み率（Ｃ／Ｄ）を算出し（Ｅ）、これに反応液中のアミノ酸含有量（Ｆ）、そして合成タンパク質の分子量（Ｇ）を乗することで合成タンパク質量（Ｆ×Ｅ×Ｇ）を算出した。
合成反応液に［１４Ｃ］－Ｌｅｕｃｉｎｅを添加し無細胞タンパク質合成を行い、合成タンパク質に取り込まれた１４Ｃカウントを測定することで合成タンパク質量の見積もりを行った。すなわち、５０μｌのコムギ胚芽無細胞タンパク質合成液を入れた透析カップにｍＲＮＡ、さらに［１４Ｃ］－Ｌｅｕｃｉｎｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を内外液に１／１００量添加し、１ウェルあたり６５０μｌの基質液を入れた２４穴プレートに上記透析カップを浸漬し、１６℃で４８時間インキュベートした。反応終了後、反応液５μｌを濾紙 ３ＭＭ ＣＨＲ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にスポットし、ＴＣＡ沈殿、エタノール洗浄を行い、クリアゾル（ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製）に浸け、液体シンチレーションカウンターによって合成タンパク質に取り込まれた１４Ｃカウントを測定、合成タンパク質に含まれる全１４Ｃカウントを算出した（Ａ）。さらに反応液中に含まれる総１４Ｃを濾紙にスポットし同様に１４Ｃカウントを測定（Ｂ）し、これらの値から合成タンパク質への［１４Ｃ］Ｌｅｕの取り込み率（Ｂ／Ａ）を算出した（Ｃ）。これをタンパク質のアミノ酸配列中に含まれるＬｅｕ数（Ｄ）で除することで合成タンパク質アミノ酸配列中の特定の１残基の取り込み率（Ｃ／Ｄ）を算出し（Ｅ）、これに反応液中のアミノ酸含有量（Ｆ）、そして合成タンパク質の分子量（Ｇ）を乗することで合成タンパク質量（Ｆ×Ｅ×Ｇ）を算出した。
【0124】
（酵素調製）
合成量の見積と同条件で［１４Ｃ］－Ｌｅｕｃｉｎｅを添加せずに無細胞タンパク質合成を行い、この翻訳反応液のタンパク質濃度を上記の見積により推定した。翻訳反応液１００μｌをｉｌｌｕｓｔｒａ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ－２５ ｃｏｕｌｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて翻訳基本Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ＝７．８），１００ｍＭ ＫＯＡｃ）にＢｕｆｆｅｒ交換を行った。バッファー交換前後の溶液量を測定し、見積もったタンパク質濃度を補正した。
合成量の見積と同条件で［１４Ｃ］－Ｌｅｕｃｉｎｅを添加せずに無細胞タンパク質合成を行い、この翻訳反応液のタンパク質濃度を上記の見積により推定した。翻訳反応液１００μｌをｉｌｌｕｓｔｒａ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ－２５ ｃｏｕｌｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて翻訳基本Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ＝７．８），１００ｍＭ ＫＯＡｃ）にＢｕｆｆｅｒ交換を行った。バッファー交換前後の溶液量を測定し、見積もったタンパク質濃度を補正した。
【0125】
（酵素解析法）
２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．０）に、０．２５ｍＭ ＦｅＣｌ２、１．５ｍＭ アスコルビン酸、１．５ｍＭ ２－オキソグルタル酸、０．７５ｍＭ基質を含む混合液を４０％、合成した酵素タンパク質を含む翻訳反応液を６０％の割合で混合して酵素反応液を調製した。３０℃で３時間インキュベートして、酵素反応液と等量の１００％ メタノールを添加し、十分に混合した後に氷上で５分静置した。これを遠心分離（２０，４００ｇ、２０分、４℃）し、上清をコスモナイスフィルターＷ（０．４５μｍ）（ナカライテスク社製）に通し、高速液体クロマトグラフィーのサンプルとした。酵素反応前後の基質及び生成物の解析は、高速液体クロマトグラフィー装置＿ＥＬＩＴＥ ＬａＣｈｒｏｍ Ｌ－２０００シリーズ（日立社製）にカラム＿Ｐｒｏ Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．）（ＹＭＣ社製）を装填して行った。流速は１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃にて、溶媒条件は、アセトニトリル：水（１％酢酸）＝５５：４５又は５０：５０（ＢＢＣ－ＯＨ）、アセトニトリル：水（１％酢酸）＝４５：５５（Ｓｕｌｃｏｔｒｉｏｎｅ）、アセトニトリル：水（１％酢酸）＝４５：５５（Ｍｅｓｏｔｒｉｏｎｅ）、アセトニトリル：水（１％酢酸）＝５５：４５又は５０：５０（Ｔｅｆｒｙｌｔｒｏｎｅ）、アセトニトリル：水（１％酢酸）＝５５：４５又は５０：５０（Ｔｅｍｂｏｔｒｉｏｎｅ）でそれぞれ溶出を行い、化合物は、紫外波長＿２８６ｎｍで検出した。
２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．０）に、０．２５ｍＭ ＦｅＣｌ２、１．５ｍＭ アスコルビン酸、１．５ｍＭ ２－オキソグルタル酸、０．７５ｍＭ基質を含む混合液を４０％、合成した酵素タンパク質を含む翻訳反応液を６０％の割合で混合して酵素反応液を調製した。３０℃で３時間インキュベートして、酵素反応液と等量の１００％ メタノールを添加し、十分に混合した後に氷上で５分静置した。これを遠心分離（２０，４００ｇ、２０分、４℃）し、上清をコスモナイスフィルターＷ（０．４５μｍ）（ナカライテスク社製）に通し、高速液体クロマトグラフィーのサンプルとした。酵素反応前後の基質及び生成物の解析は、高速液体クロマトグラフィー装置＿ＥＬＩＴＥ ＬａＣｈｒｏｍ Ｌ－２０００シリーズ（日立社製）にカラム＿Ｐｒｏ Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．）（ＹＭＣ社製）を装填して行った。流速は１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は４０℃にて、溶媒条件は、アセトニトリル：水（１％酢酸）＝５５：４５又は５０：５０（ＢＢＣ－ＯＨ）、アセトニトリル：水（１％酢酸）＝４５：５５（Ｓｕｌｃｏｔｒｉｏｎｅ）、アセトニトリル：水（１％酢酸）＝４５：５５（Ｍｅｓｏｔｒｉｏｎｅ）、アセトニトリル：水（１％酢酸）＝５５：４５又は５０：５０（Ｔｅｆｒｙｌｔｒｏｎｅ）、アセトニトリル：水（１％酢酸）＝５５：４５又は５０：５０（Ｔｅｍｂｏｔｒｉｏｎｅ）でそれぞれ溶出を行い、化合物は、紫外波長＿２８６ｎｍで検出した。
【0126】
以上の方法にて、ＨＩＳ１タンパク質及びその相同タンパク質（ＨＳＬタンパク質）、並びにそれらの変異導入体について、４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性を評価した結果を、表１～６に示す。また代表的な結果を図６～８に示す。さらに、ＨＳＬ１タンパク質の変異導入体に関する結果をグラフとしてまとめたものを、図９に示す。
【0127】
【表1】
【0128】
【表2】
【0129】
【表3】
【0130】
【表4】
【0131】
【表5】
【0132】
【表6】
【0133】
なお、表1～６における分解活性の５段階評価は、ＨＰＬＣによって検出された基質由来のピーク面積における減少の程度を、ＨＩＳ１タンパク質におけるそれを５とした場合の相対値に基づく。さらに、表１、５及び６において示すアミノ酸部位は、配列番号：４に記載したＯｓＨＳＬ１タンパク質における位置を示すものであり、表２、３及び４に関しては、当該位置に相当するアミノ酸を示すものと読み替えるものとする。また、表７において、ＯｓＨＳＬ１タンパク質の各部位におけるアミノ酸と、その他のタンパク質において前記アミノ酸に対応する各アミノ酸と、各その他のタンパク質における該各アミノ酸の位置とを、示す。
【0134】
【表7】
【0135】
＜ＯｓＨＳＬ１タンパク質における変異導入＞
ＯｓＨＳＬ１タンパク質に関し、基質がＢＢＣ－ＯＨの場合、表１及び図２に示すとおり、野生型のそれにおいては微弱な分解活性しか認められなかった。しかしながら、表１、図６及び図９に示すとおり、Ｆ１４０Ｈ変異の導入によって、その活性は大幅に上昇した。さらには、Ｌ２０４Ｆ変異の追加又はＦ２９８Ｌ変異の追加によって、ＢＢＣ－ＯＨの分解活性はより向上することが明らかになった。
ＯｓＨＳＬ１タンパク質に関し、基質がＢＢＣ－ＯＨの場合、表１及び図２に示すとおり、野生型のそれにおいては微弱な分解活性しか認められなかった。しかしながら、表１、図６及び図９に示すとおり、Ｆ１４０Ｈ変異の導入によって、その活性は大幅に上昇した。さらには、Ｌ２０４Ｆ変異の追加又はＦ２９８Ｌ変異の追加によって、ＢＢＣ－ＯＨの分解活性はより向上することが明らかになった。
【0136】
さらに、表１に示すとおり、Ｆ１４０Ｈ変異の導入には劣るものの、当該部位をヒスチジンと同じ塩基性アミノ酸であるリシンに置換しても、ＯｓＨＳＬ１タンパク質のＢＢＣ－ＯＨの分解活性は向上することが明らかになった。
【0137】
また、表１及び図７に示すとおり、Ｆ２９８Ｌ変異の導入によっても、Ｆ１４０Ｈ変異よりは劣るものの、ＯｓＨＳＬ１タンパク質のＢＢＣ－ＯＨ分解活性は向上することが明らかになった。さらに、Ｌ２０４Ｆ変異の追加によって、その活性はより向上することが明らかになった。
【0138】
また、ＯｓＨＳＬ１タンパク質に関し、基質がテフリルトリオンの場合、表５及び図３に示すとおり、ＨＩＳ１タンパク質より劣るものの、野生型でも分解活性を有していることが認められた。さらに、表５に示すとおり、Ｆ１４０Ｈ変異の導入によって、その活性は向上し、ＨＩＳ１タンパク質並みに高くなることが明らかになった。一方、Ｆ２９８Ｌ変異導入では、ＯｓＨＳＬ１タンパク質のテフリルトリオン分解活性が減少するものの、両変異（Ｆ１４０Ｈ及びＦ２９８Ｌ）を加えることによって、再びＨＩＳ１タンパク質並みに高いテフリルトリオン分解活性を奏することが明らかになった。
【0139】
さらに、表５に示すとおり、Ｆ１４０Ｈ変異の導入には劣るものの、当該部位をヒスチジンと同じ塩基性アミノ酸であるリシンに置換しても、ＯｓＨＳＬ１タンパク質のテフリルトリオン分解活性は向上することが明らかになった。
【0140】
また、ＯｓＨＳＬ１タンパク質に関し、基質がスルコトリオンの場合、表６及び図４に示すとおり、野生型のそれにおいては微弱な分解活性しか認められなかった。しかしながら、表６及び図９に示すとおり、Ｆ１４０Ｈ変異の導入によって、その活性は向上し、ＨＩＳ１タンパク質並みに高くなることが明らかになった。一方、図８及び図９に示すとおり、Ｌ２０４Ｆ変異の追加又はＦ２９８Ｌ変異の追加によって、そのスルコトリオンの分解活性は低減してしまうことも明らかになった。
【0141】
また、表６に示すとおり、Ｆ１４０Ｈ変異を導入せずとも、Ｌ２０４Ｆ変異及びＦ２９８Ｌ変異の導入によって、スルコトリオンの分解活性は向上することが明らかになった。さらに、図表には示さないが、メソトリオン及びテンボトリオンに関しても、この２点変異導入により、分解活性が向上することを見出している。
【0142】
さらに、表６に示すとおり、Ｆ１４０Ｈ変異の導入には劣るものの、当該部位をヒスチジンと同じ塩基性アミノ酸であるアルギニンに置換しても、ＯｓＨＳＬ１タンパク質のスルコトリオン分解活性は向上することが明らかになった。
【0143】
また、ＯｓＨＳＬ１タンパク質に関し、基質がメソトリオン又はテンボトリオンの場合、図表には示していないが、野生型のそれにおいては微弱な分解活性しか認められなかった。しかしながら、Ｆ１４０Ｈ変異の導入によって、それらの活性は向上し、共にＨＩＳ１タンパク質並みに高くなることが明らかになった。
【0144】
＜ＯｓＨＳＬ２タンパク質における変異導入＞
ＯｓＨＳＬ２タンパク質に関し、基質がＢＢＣ－ＯＨの場合、表２に示すとおり、野生型のそれにおいては微弱な分解活性しか認められなかった。しかしながら、Ｆ２９８Ｌ変異の導入によって、ＯｓＨＳＬ２タンパク質のＢＢＣ－ＯＨ分解活性は向上することが明らかになった。
ＯｓＨＳＬ２タンパク質に関し、基質がＢＢＣ－ＯＨの場合、表２に示すとおり、野生型のそれにおいては微弱な分解活性しか認められなかった。しかしながら、Ｆ２９８Ｌ変異の導入によって、ＯｓＨＳＬ２タンパク質のＢＢＣ－ＯＨ分解活性は向上することが明らかになった。
【0145】
＜ＺｍＨＳＬ２タンパク質における変異導入＞
ＺｍＨＳＬ２タンパク質に関し、基質がＢＢＣ－ＯＨの場合、表３に示すとおり、ＨＩＳ１タンパク質より劣るものの、野生型でも分解活性を有していることが認められた。さらに、Ｑ１４０Ｈ変異の導入によって、その活性は向上し、ＨＩＳ１タンパク質並みに高くなることが明らかになった。また、Ｙ２０４Ｆ変異を更に導入することによって、その活性はより向上することも明らかになった。
ＺｍＨＳＬ２タンパク質に関し、基質がＢＢＣ－ＯＨの場合、表３に示すとおり、ＨＩＳ１タンパク質より劣るものの、野生型でも分解活性を有していることが認められた。さらに、Ｑ１４０Ｈ変異の導入によって、その活性は向上し、ＨＩＳ１タンパク質並みに高くなることが明らかになった。また、Ｙ２０４Ｆ変異を更に導入することによって、その活性はより向上することも明らかになった。
【0146】
また、図表には示していないが、ＺｍＨＳＬ２タンパク質に関し、基質がスルコトリオンの場合、Ｑ１４０Ｈ変異の導入によって、その活性が向上することも見出している。
【0147】
＜ＳｂＨＳＬ１タンパク質における変異導入＞
ＳｂＨＳＬ１タンパク質に関し、基質がＢＢＣ－ＯＨの場合、表４に示すとおり、ＨＩＳ１タンパク質より劣るものの、野生型でも分解活性を有していることが認められた。さらに、Ｑ１４０Ｈ変異の導入によって、その活性は向上し、ＨＩＳ１タンパク質並みに高くなることが明らかになった。
ＳｂＨＳＬ１タンパク質に関し、基質がＢＢＣ－ＯＨの場合、表４に示すとおり、ＨＩＳ１タンパク質より劣るものの、野生型でも分解活性を有していることが認められた。さらに、Ｑ１４０Ｈ変異の導入によって、その活性は向上し、ＨＩＳ１タンパク質並みに高くなることが明らかになった。
【0148】
以上説明したように、ベンゾビシクロンの加水分解体（ＢＢＣ－ＯＨ）、テフリルトリオン、スルコトリオン、メソトリオン及びテンボトリオン、これらいずれの４－ＨＰＰＤ阻害剤を基質とした場合においても、１４０位のアミノ酸を塩基性アミノ酸、特にヒスチジンにすることによって、ＨＳＬタンパク質の分解活性は向上することが明らかになった。
【0149】
また、図９に示すとおり、ＢＢＣ－ＯＨを基質とした場合には、Ｌ２０４変異の追加又はＦ２９８変異の追加によって、その分解活性はより向上する一方で、テフリルトリオン、スルコトリオン又はメソトリオンを基質とした場合に、その分解活性は変わらない又は低減するということも明らかになった。
【0150】
さらに、Ｆ１４０、Ｌ２０４及びＦ２９８の３点に変異を導入すれば、ＢＢＣ－ＯＨ、テフリルトリオン、スルコトリオン、メソトリオン及びテンボトリオンの分解活性はいずれも、ＨＩＳ１タンパク質並みに高くなることが明らかになった。
【0151】
＜実施例５＞
植物体（シロイヌナズナ）における、ＯｓＨＳＬ１変異体の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性の評価
上記インビトロの系において、ベンゾビシクロン加水分解体（ＢＢＣ－ＯＨ）の分解活性が付与されたＯｓＨＳＬ１変異体（Ｖ１１８Ｉ、Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ、Ｓ２２９Ｔ及びＦ２９８Ｌの５点変異体、Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ、Ｓ２２９Ｔ及びＦ２９８Ｌの４点変異体、Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ及びＦ２９８Ｌの３点変異体）を、植物において発現させ、プロドラッグ形態であるベンゾビシクロン（ＢＢＣ）に対する抵抗性が高められるかを、以下に示す方法にて評価した。
植物体（シロイヌナズナ）における、ＯｓＨＳＬ１変異体の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性の評価
上記インビトロの系において、ベンゾビシクロン加水分解体（ＢＢＣ－ＯＨ）の分解活性が付与されたＯｓＨＳＬ１変異体（Ｖ１１８Ｉ、Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ、Ｓ２２９Ｔ及びＦ２９８Ｌの５点変異体、Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ、Ｓ２２９Ｔ及びＦ２９８Ｌの４点変異体、Ｆ１４０Ｈ、Ｌ２０４Ｆ及びＦ２９８Ｌの３点変異体）を、植物において発現させ、プロドラッグ形態であるベンゾビシクロン（ＢＢＣ）に対する抵抗性が高められるかを、以下に示す方法にて評価した。
【0152】
すなわち先ず、上記同様に、各ＯｓＨＳＬ１変異体をコードする遺伝子を調製した。そして、各遺伝子を３５Ｓプロモーターの下流に繋ぎ、カナマイシン抵抗性遺伝子カセットとともに、バイナリ―ベクターにてクローニングした。このようにして得られたベクターを各々、フローラルディップ法にてシロイヌナズナ（コロンビア）に導入し、形質転換した。得られたＴ０種子をカナマイシン含有培地に播種し、耐性個体を取得した。そして、前記遺伝子が導入されたと判断される個体を選抜し、そこからＴ１種子を採種してＢＢＣ含有培地に播種し、それらの生育状況を観察した。得られた結果を図１０に示す。
【0153】
図１０に示した結果から明らかなとおり、いずれの変異体についても、非組換えのコントロール個体が白化する条件で、緑色を呈する個体の出現が認められた。より具体的には、ＢＢＣに対する明らかな抵抗性が、前記３点変異体を発現させたシロイヌナズナにおいては、３系統中１系統にて認められ、前記４点変異体を発現させたシロイヌナズナにおいては、４系統中１系統にて認められ、前記５点変異体を発現させたシロイヌナズナにおいては、４系統中３系統にて認められた。すなわち、４－ＨＰＰＤ阻害剤分解活性が付与されたＯｓＨＳＬ１変異体を、植物体に発現させることによって、該植物体の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高まることが確認された。
【0154】
また、Ｆ１４０Ｈの１点変異体又はＦ２９８Ｌの１点変異体を、シロイヌナズナにおいて発現させ、スルコトリオン（培地中の含有濃度：０．１μＭ）、メソトリオン（培地中の含有濃度：０．１μＭ）又はテンボトリオン（培地中の含有濃度：０．０５μＭ）に対する抵抗性が高められるかを、上記同様に評価した。
【0155】
その結果、図表には示していないが、Ｆ１４０Ｈの１点変異体について、非組換えのコントロール個体（ＨＳＬ１（野生型））が白化する条件で、緑色を呈する個体の出現が認められ、上述のインビトロの系同様に、当該変異の前記薬剤に対する抵抗性向上における有効性が確認された。一方、Ｆ２９８Ｌの１点変異体では、前記薬剤に対する抵抗性向上が認められなかった。
【0156】
＜実施例６＞
植物体（イネ）における、ＯｓＨＳＬ１変異体の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性の評価
次に、イネを用いてＦ１４０Ｈ変異の有効性を確認した。すなわち、先ず、イネＨＳＬ１ｃＤＮＡ遺伝子の１４０番目のフェニルアラニンをヒスチジンに改変したｍＨＳＬ１遺伝子を作成した。次いで、当該変異遺伝子又は変異を導入していないＨＳＬ１遺伝子を、それぞれ３５Ｓプロモーターの下流に繋ぎ、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子発現カセットとともにバイナリ―ベクターにクローニングした、そして、これらベクターを各々、ベンゾビシクロン感受性品種「やまだわら」にアグロバクテリウム法で導入し、組換えイネを育成した。
植物体（イネ）における、ＯｓＨＳＬ１変異体の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性の評価
次に、イネを用いてＦ１４０Ｈ変異の有効性を確認した。すなわち、先ず、イネＨＳＬ１ｃＤＮＡ遺伝子の１４０番目のフェニルアラニンをヒスチジンに改変したｍＨＳＬ１遺伝子を作成した。次いで、当該変異遺伝子又は変異を導入していないＨＳＬ１遺伝子を、それぞれ３５Ｓプロモーターの下流に繋ぎ、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子発現カセットとともにバイナリ―ベクターにクローニングした、そして、これらベクターを各々、ベンゾビシクロン感受性品種「やまだわら」にアグロバクテリウム法で導入し、組換えイネを育成した。
【0157】
作出した組換えイネ（Ｔ１）種子及び原品種「やまだわら」の種子を供試して、０．２５μＭ ＢＢＣ含有のＭＳ培地に無菌播種し、３０℃明所で８日間育成した。得られた結果を図１１に示す。
【0158】
図１１に示した結果から明らかなように、非組換えのコントロール（原品種）及び改変無しのＨＳＬ１組換えイネが白化する条件にて、ｍＨＳＬ１組換えイネでは緑色を呈する個体が出現した（なお、ヘテロな集団なので、白化個体も出現するが、本実験では遺伝分離で生じるヌル個体は除去している）。
【0159】
このように、イネにおいても、ｍＨＳＬ１（Ｆ１４０Ｈ）遺伝子を過剰発現させることにより、ＢＢＣ感受性品種にＢＢＣ耐性が付与されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0160】
以上説明したように、本発明によれば、ＨＳＬタンパク質において、１４０位を塩基性アミノ酸に変異させることによって、該タンパク質の、２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性を高めることができる。そして、このような２－オキソグルタル酸依存的に４－ＨＰＰＤ阻害剤を酸化する触媒活性が高められたＨＳＬタンパク質の製造方法を利用することにより、本発明においては、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物体を製造することも可能となる。
【0161】
さらに、上述のとおり、ＨＳＬタンパク質において、１４０位のアミノ酸が前記触媒活性に影響するアミノ酸であることを見出したことに基づき、本発明によれば、被検植物のＨＳＬ遺伝子における１４０位のアミノ酸をコードするヌクレオチドを検出することによって、該被検植物の４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定することもできる。また、本発明によれば、該方法を利用した、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を育種する方法も、提供することが可能となる。
【0162】
したがって、本発明によって、４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性が高められた植物を用いて栽培を行えば、栽培田や栽培畑の雑草防除を効率的に行うことができる。また、本発明の植物における４－ＨＰＰＤ阻害剤に対する抵抗性を判定する方法は、例えば、輪作体系における前年作のこぼれ種の発芽リスク等の軽減に利用することができる。このように、本発明は、有用植物の収穫量の安定や増大に大きく貢献し得るものである。
【配列表フリーテキスト】
【0163】
配列番号：２３
＜２２３＞ 触媒三残基
＜２２３＞ ２位のＸａａはいかなるアミノ酸もとり得る。
＜２２３＞ ３位のＸａａはアスパラギン酸又はグルタミン酸である。
＜２２３＞ ４位のＸａａはいかなるアミノ酸もとり得る
配列番号：２４～４３
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列
＜２２３＞ 触媒三残基
＜２２３＞ ２位のＸａａはいかなるアミノ酸もとり得る。
＜２２３＞ ３位のＸａａはアスパラギン酸又はグルタミン酸である。
＜２２３＞ ４位のＸａａはいかなるアミノ酸もとり得る
配列番号：２４～４３
＜２２３＞ 人工的に合成されたプライマーの配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】