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特許7184378カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー、及びカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-11-28
(45)【発行日】2022-12-06
(54)【発明の名称】カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー、及びカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6858 20180101AFI20221129BHJP
C12Q 1/6895 20180101ALI20221129BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20221129BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6858 Z
C12Q1/6895 Z
C12N15/29 ZNA
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020186834
(22)【出願日】2020-11-09
(65)【公開番号】P2022076414
(43)【公開日】2022-05-19
【審査請求日】2021-08-10
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100154852
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 太一
(72)【発明者】
【氏名】尾上 典之
(72)【発明者】
【氏名】松崎 隆介
(72)【発明者】
【氏名】東 暁史
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 明彦
【審査官】福間 信子
(56)【参考文献】
【文献】Kanzaki S. et al.，SCAR Markers for Practical Application of Marker-assisted Selection in Persimmon (Diospyros kaki Thunb.) Breeding, 2010, J. Japan Soc. Hort. Sci., vol. 79, no. 2, p. 150-155
【文献】Onoue N. et al.，SSR-based molecular profiling of 237 persimmon (Diospyros kaki Thunb.) germplasms using an ASTRINGENCY-linked marker, 2018, Tree Genetics & Genomes, vol. 14, p. 28
【文献】Kono A. et al.，Characterization of a highly polymorphic region closely linked to the AST locus and its potential use in breeding of hexaploid persimmon (Diospyros kaki Thunb.), Mol. Breeding, 2016, vol. 36, p. 56
【文献】Akagi T. et al.，Quantitative Genotyping for the Astringency Locus in Hexaploid Persimmon Cultivars using Quantitative Real-time PCR, J. Amer. Soc. Hort. Sci., 2010, vol. 135, no. 1, p. 59-66
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法であって、（工程１）カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される非完全甘ガキ性と連鎖している領域の塩基配列（以下、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列とも称する）を検出する工程、
（工程２）カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される完全甘ガキ性と連鎖している領域の塩基配列（以下、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列とも称する）を検出する工程、及び、
（工程３）前記工程１において、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅されず、前記工程２において、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅された場合に、増幅された完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を、制限酵素ＳｔｕＩで切断し、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡを検出する工程、
を含む、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法。
【請求項2】
前記工程１において、前記非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が検出されるか、または、前記工程３において、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡが検出されるカキ植物体は、非完全甘ガキ性を有すると判定し、前記工程１において、前記非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が検出されず、且つ、前記工程３において、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡが検出されないカキ植物体は、完全甘ガキ性を有すると判定する、請求項１に記載の識別方法。
【請求項3】
配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項4】
配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット、及び制限酵素ＳｔｕＩを含む、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキット。
【請求項5】
さらに、配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡを含む、請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー、及びカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキットに関する。
【背景技術】
【0002】
カキには渋ガキと甘ガキがある。甘ガキの中にも種子形成の有無に関わらず成熟期に渋みが無くなる完全甘ガキと、種子形成が不十分な場合は渋みが残る不完全甘ガキがある。
日本のカキ産業を維持および発展させるため、既存品種より良食味で多収性の完全甘ガキの育成が求められている。近交弱勢による低収量化を回避して多収性完全甘ガキを育成するには、完全甘ガキとは遠縁の非完全甘ガキ（渋ガキおよび不完全甘ガキ）を交雑親に利用する必要がある。この際、完全甘ガキと非完全甘ガキが混在する交雑実生集団から完全甘ガキのみをＤＮＡマーカーを用いて早期選抜することで、完全甘ガキ新品種の育成効率を高めている。
日本のカキ産業を維持および発展させるため、既存品種より良食味で多収性の完全甘ガキの育成が求められている。近交弱勢による低収量化を回避して多収性完全甘ガキを育成するには、完全甘ガキとは遠縁の非完全甘ガキ（渋ガキおよび不完全甘ガキ）を交雑親に利用する必要がある。この際、完全甘ガキと非完全甘ガキが混在する交雑実生集団から完全甘ガキのみをＤＮＡマーカーを用いて早期選抜することで、完全甘ガキ新品種の育成効率を高めている。
【0003】
非特許文献１及び非特許文献２には、完全甘ガキと非完全甘ガキを、ＳＣＡＲ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）マーカーを用いて、キャピリーシーケンサーによるフラグメント解析により検出する方法が報告されている。
【0004】
非特許文献３には、ＳＣＡＲマーカーにより、完全甘ガキ性を決定している遺伝子座であるＡＳＴ遺伝子座の近傍に、多型が検出されることが報告されているが、この多型の塩基配列が完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別に関連していることについては記載されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Kanzaki et al., (2010) SCAR Markers for Practical Application of Marker-assisted Selection in Persimmon (Diospyros kaki Thunb.) Breeding. J Jpn Soc Hortic Sci 79(2):150-155.
【文献】Kono A, Kobayashi S, Onoue N, Sato A (2016) Characterization of a highly polymorphic region closely linked to the AST locus and its potential use in breeding of hexaploid persimmon (Diospyros kaki Thunb.) Mol Breeding 36:56.
【文献】Onoue et al., (2018) SSR-based molecular profiling of 237 persimmon (Diospyros kaki Thunb.) germplasms using an ASTRINGENCY-linked marker. Tree Genetics & Genomes 14:28.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記ＳＣＡＲマーカーを用いる方法では、表現型では非完全甘ガキであるにもかかわらず、完全甘ガキと判別される植物体があるという問題があった。
従って、本発明では、ＳＣＡＲマーカーを用いる方法では、表現型では非完全甘ガキであるにもかかわらず、完全甘ガキと判別される植物体を、非完全甘ガキと判定することを可能とする、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー、及びカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキットを提供することを目的とする。
従って、本発明では、ＳＣＡＲマーカーを用いる方法では、表現型では非完全甘ガキであるにもかかわらず、完全甘ガキと判別される植物体を、非完全甘ガキと判定することを可能とする、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー、及びカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、カキ植物体において、完全甘ガキ性と連鎖している領域の塩基配列をＳＣＡＲマーカーでＰＣＲ増幅した増幅産物を、制限酵素ＳｔｕＩで処理することにより、ＳＣＡＲマーカーのみでは検出できなかった非完全甘ガキ性と連鎖した多型を識別できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0008】
すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］ カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法であって、
（工程１）カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される非完全甘ガキ性と連鎖している領域の塩基配列（以下、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列とも称する）を検出する工程、
（工程２）カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される完全甘ガキ性と連鎖している領域の塩基配列（以下、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列とも称する）を検出する工程、及び、
（工程３）前記工程１において、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅されず、前記工程２において、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅された場合に、増幅された完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を、制限酵素ＳｔｕＩで切断し、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー（以下、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーとも称する）を検出する工程、
を含む、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法。
［２］ 前記工程１において、前記非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が検出されるか、または、前記工程３において、前記完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーが検出されるカキ植物体は、非完全甘ガキ性を有すると判定し、
前記工程１において、前記非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が検出されず、且つ、前記工程３において、前記完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーが検出されないカキ植物体は、完全甘ガキ性を有すると判定する、［１］に記載の識別方法。
［３］ 配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー。
［４］ 配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット、及び制限酵素ＳｔｕＩを含む、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキット。
［５］ さらに、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカーを含む、［４］に記載のキット。
［１］ カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法であって、
（工程１）カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される非完全甘ガキ性と連鎖している領域の塩基配列（以下、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列とも称する）を検出する工程、
（工程２）カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される完全甘ガキ性と連鎖している領域の塩基配列（以下、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列とも称する）を検出する工程、及び、
（工程３）前記工程１において、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅されず、前記工程２において、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅された場合に、増幅された完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を、制限酵素ＳｔｕＩで切断し、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー（以下、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーとも称する）を検出する工程、
を含む、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法。
［２］ 前記工程１において、前記非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が検出されるか、または、前記工程３において、前記完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーが検出されるカキ植物体は、非完全甘ガキ性を有すると判定し、
前記工程１において、前記非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が検出されず、且つ、前記工程３において、前記完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーが検出されないカキ植物体は、完全甘ガキ性を有すると判定する、［１］に記載の識別方法。
［３］ 配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー。
［４］ 配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット、及び制限酵素ＳｔｕＩを含む、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキット。
［５］ さらに、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカーを含む、［４］に記載のキット。
【発明の効果】
【0009】
本発明により、カキ植物体が完全甘ガキ性を有するか、非完全甘ガキ性を有するかを、遺伝子により効率的に識別することができる、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー、及びカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキットを提供することができる。本発明の識別方法、識別マーカー及びキットにより、非完全甘ガキ親を用いた交雑育種において、完全甘ガキ植物体を効率的に選抜することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ＰＣＮＡ－Ｆと５Ｒ３Ｒとで増幅される完全甘ガキ性連鎖領域と、ＡＳＴ－Ｆと５Ｒ３Ｒとで増幅される非完全甘ガキ性連鎖領域を示した図である。
【図2】実験例１において、ＰＣＮＡ－Ｆと５Ｒ３Ｒとで増幅される完全甘ガキ性連鎖領域と、ＡＳＴ－Ｆと５Ｒ３Ｒとで増幅される非完全甘ガキ性連鎖領域とを、ＡＢＩ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザを用いて検出した結果を示した図である。
【図3】実験例２において、実験例１で得られたＰＣＲ増幅産物を、制限酵素ＳｔｕＩで切断して得られた反応液を、ＡＢＩ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザを用いて検出した結果を示した図である。
【図4】実験例３において、ＰＣＮＡ－Ｆと５Ｒ３Ｒとで増幅される完全甘ガキ性連鎖領域と、ＡＳＴ－Ｆと５Ｒ３Ｒとで増幅される非完全甘ガキ性連鎖領域とを、ＡＢＩ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザを用いて検出した結果を示した図である。
【図5】実験例３で得られたＰＣＲ増幅産物を、制限酵素ＳｔｕＩで切断する前後の反応液を、ＡＢＩ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザを用いて検出した結果を示した図である。左図が、制限酵素ＳｔｕＩで切断する前、右図が、制限酵素ＳｔｕＩで切断した後の検出結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
［カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法］
本発明のカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法は、
（工程１）カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を検出する工程、
（工程２）カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を検出する工程、及び、
（工程３）前記工程１において、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅されず、前記工程２において、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅された場合に、増幅された完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を、制限酵素ＳｔｕＩで切断し、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを検出する工程、
を含む。以下、各工程について詳細に説明する。
本発明のカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法は、
（工程１）カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を検出する工程、
（工程２）カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を検出する工程、及び、
（工程３）前記工程１において、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅されず、前記工程２において、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅された場合に、増幅された完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を、制限酵素ＳｔｕＩで切断し、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを検出する工程、
を含む。以下、各工程について詳細に説明する。
【0012】
（工程１）
工程１は、カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を検出する工程である。
工程１は、カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を検出する工程である。
【0013】
工程１において、カキ植物体としては、カキの成長した植物体であっても、未熟な植物体であってもよい。植物体としては、特に制限はなく、例えば、葉、茎、芽、花、根、果実等が挙げられる。
【0014】
カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子は、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを制御している遺伝子である。完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性はＡＳＴ遺伝子座により決まっており、完全甘ガキ性が劣性である。カキ栽培種は六倍体であることから、完全甘ガキは完全甘ガキ型アリル（ａアリル）を六つ揃えたホモ型（ａａａａａａ）でなくてはならず、一つ以上の非完全甘ガキ型アリル（Ａアリル）を保有する植物体（例えば、Ａａａａａａ、ＡＡａａａａ等）はすべて非完全甘ガキ（渋ガキ及び不完全甘ガキ）となる。
【0015】
ＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅される。非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列には多型があり、これら全ての多型は、本発明における非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列に含まれる。
【0016】
非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列としては、例えば、配列番号５～１０のいずれかで表される塩基配列、配列番号５～１０のいずれかで表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列等が挙げられる。ここで、複数個とは、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行うことにより増幅された非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列である限り特に限定されず、例えば、２～２０個、２～１８個、２～１６個、２～１４個、２～１２個、２～１０個、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個であってもよい。
【0017】
工程１において、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーが多少変異を含んでいても、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を増幅することができる。したがって、工程１において、配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーにおいて、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーを用いて、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を増幅してもよい。
【0018】
ここで、複数個とは、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を増幅することができる限り特に限定されず、例えば２～４個であってもよく、例えば２～３個であってもよい。
【0019】
工程１において、プライマーは、増幅産物の検出を容易に行うため、蛍光物質等の物質で標識されていてもよい。このような蛍光物質としては、例えば、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ等が挙げられる。プライマーは、必ずしもこのような物質で標識される必要はなく、例えば、ゲル電気泳動で増幅産物のサイズの差異により、増幅産物の検出を行ってもよい。
【0020】
工程１において、増幅した非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を検出する方法としては、特に制限はなく、例えば、蛍光物質等の物質で標識されたプライマーを用いて、標識された増幅産物を検出する方法、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等の電気泳動により、増幅産物のサイズで検出する方法等が挙げられる。増幅産物のサイズで検出する方法の場合、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列のサイズとしては、例えば、２２０～２５４ｂｐが挙げられる。
【0021】
工程１において、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が検出された場合は、カキ植物体は、非完全甘ガキ性を有すると判定することができる。工程１において、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が検出されなかった場合は、次の工程２へ進む。
【0022】
（工程２）
工程２は、カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を検出する工程である。
工程２は、カキ植物体に含まれるＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、増幅される完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を検出する工程である。
【0023】
工程２において、カキ植物体としては、前記したものが挙げられる。
【0024】
ＡＳＴ遺伝子の近傍領域を、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅される。完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列には多型があり、これら全ての多型は、本発明における完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列に含まれる。
【0025】
完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列としては、例えば、配列番号１１～１７のいずれかで表される塩基配列、配列番号１１～１７のいずれかで表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列等が挙げられる。ここで、複数個とは、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行うことにより増幅された完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列である限り特に限定されず、例えば、２～２０個、２～１８個、２～１６個、２～１４個、２～１２個、２～１０個、２～９個、２～８個、２～７個、２～６個、２～５個、２～４個、２～３個であってもよい。
【0026】
工程２において、配列番号３で表される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーが多少変異を含んでいても、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を増幅することができる。したがって、工程２において、配列番号２又は３で表される塩基配列からなるプライマーにおいて、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーを用いて、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を増幅してもよい。ここで、複数個とは、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を増幅することができる限り特に限定されず、例えば２～４個であってもよく、例えば２～３個であってもよい。
【0027】
工程２において、プライマーは、増幅産物の検出を容易に行うため、蛍光物質等の物質で標識されていてもよい。このような蛍光物質としては、例えば、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ等が挙げられる。プライマーは、必ずしもこのような物質で標識される必要はなく、例えば、ゲル電気泳動で増幅産物のサイズの差異により、増幅産物の検出を行ってもよい。
【0028】
工程２において、増幅した完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を検出する方法としては、特に制限はなく、例えば、蛍光物質等の物質で標識されたプライマーを用いて、標識された増幅産物を検出する方法、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等の電気泳動により、増幅産物のサイズで検出する方法等が挙げられる。増幅産物のサイズで検出する方法の場合、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列のサイズとしては、例えば、３４７～３５５ｂｐが挙げられる。
【0029】
前記工程１において、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅されず、前記工程２において、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅された場合は、次の工程３に進む。
【0030】
（工程３）
工程３は、工程１において、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅されず、工程２において、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅された場合に、増幅された完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を、制限酵素ＳｔｕＩで切断し、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを検出する工程である。
工程３は、工程１において、非完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅されず、工程２において、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列が増幅された場合に、増幅された完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を、制限酵素ＳｔｕＩで切断し、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを検出する工程である。
【0031】
工程３において、増幅された完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列を、制限酵素ＳｔｕＩで切断して得られる配列番号４で表される塩基配列が多少変異を含んでいても、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーとして検出することができる。したがって、工程３において、配列番号４で表される塩基配列からなる完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーにおいて、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを用いて、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別してもよい。ここで、複数個とは、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーとして検出することができる限り特に限定されず、例えば、２～４個であってもよく、例えば２～３個であってもよい。
【0032】
工程３において、工程２において増幅される完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列は、増幅産物の検出を容易に行うため、蛍光物質等の物質で標識されていてもよい。このような蛍光物質としては、例えば、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ等が挙げられる。プライマーは、必ずしもこのような物質で標識される必要はなく、例えば、ゲル電気泳動で増幅産物のサイズの差異により、増幅産物の検出を行ってもよい。
【0033】
工程３において、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを検出する方法としては、特に制限はなく、例えば、蛍光物質等の物質で標識された完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを用いて、標識された完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを検出する方法、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等の電気泳動により、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーのサイズで検出する方法等が挙げられる。完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーのサイズで検出する方法の場合、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列のサイズとしては、例えば、１８３ｂｐが挙げられる。
【0034】
工程３において、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーが検出された場合は、カキ植物体は、非完全甘ガキ性を有すると判定し、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーが検出されない場合は、カキ植物体は、完全甘ガキ性を有すると判定することができる。
【0035】
［完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカー］
本発明の完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーは、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーである。
本発明の完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーは、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーである。
【0036】
配列番号４で表される塩基配列が多少変異を含んでいても、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーとして検出することができる。したがって、本発明の完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーは、配列番号４で表される塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーであってもよい。ここで、複数個とは、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーとして検出することができる限り特に限定されず、例えば、２～４個であってもよく、例えば２～３個であってもよい。
【0037】
完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーは、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーの検出を容易に行うため、蛍光物質等の物質で標識されていてもよい。このような蛍光物質としては、例えば、６－ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ等が挙げられる。完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーは、必ずしもこのような物質で標識される必要はなく、例えば、ゲル電気泳動でのサイズの差異で確認することもできる。
【0038】
完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを検出する方法としては、特に制限はなく、例えば、蛍光物質等の物質で標識された完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを用いて、標識された完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを検出する方法、アガロースゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等の電気泳動により、完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーのサイズで検出する方法等が挙げられる。完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーのサイズで検出する方法の場合、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列のサイズとしては、例えば、１８３ｂｐが挙げられる。
【0039】
本発明のカキ植物体の完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法の工程３において、本発明の完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーが検出された場合は、カキ植物体は、非完全甘ガキ性を有すると判定し、本発明の完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーが検出されない場合は、カキ植物体は、完全甘ガキ性を有すると判定することができる。
【0040】
本発明の完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを有する非完全甘ガキとしては、アブラデン、甘百目、紅衣紋、紅早生、エボー、烏帽子、絵御所、Ｇａｉｌｅｙ、祇園坊、御所ガキ－寒河江、Ｈａｒｂｉｙｅ、Ｈｅｉｘｉｎｓｈｉ（Ｈｅｉ－ｘｉｎ－ｓｈｉ）、宝生丸、Ｈｕｏ－ｓｈｉ、市田柿、一両、稲佐、甘草、甲州丸、国富、黒熊、水島、岡山晩御所、Ｒｏｊｏ Ｂｒｉｌｌａｎｔｅ、渋妙丹、新蜂屋、Ｓｈｏｇａｔｓｕ－Ｉｔａｌｙ、東洋一、Ｔｒｉｕｍｐｈ、月夜、Ｕｍｕｒｂｅｙ、八つ寺、吉田御所、四谷、四ツ溝、禅寺丸等が挙げられる。従って、これらの非完全甘ガキと、完全甘ガキとの交配種において、本発明の完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを検出することにより、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別を効率的に行うことができる。
【0041】
［カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキット］
本発明のカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキットは、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット、及び制限酵素ＳｔｕＩを含む。本発明のキットは、本発明のカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法に用いることができる。
本発明のカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキットは、配列番号１で表される塩基配列、又は配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット、配列番号３で表される塩基配列、又は配列番号３で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーと、配列番号２で表される塩基配列、又は配列番号２で表される塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット、及び制限酵素ＳｔｕＩを含む。本発明のキットは、本発明のカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法に用いることができる。
【0042】
本発明のキットは、上述したプライマーセット、及び制限酵素ＳｔｕＩのほか、配列番号４で表される塩基配列、又は配列番号４に記載の塩基配列において１又は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなる完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーを含んでいてもよい。ここで、複数個とは、前記した通りである。
本発明のキットにおいて、前記完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーは、陽性コントロールとして用いることができる。また、本発明のキットは、ＰＣＲ反応を行うための、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、陰性コントロール、ＤＮＡ抽出試薬等を含んでいてもよい。
本発明のキットにおいて、前記完全甘ガキ性・非完全甘ガキ性識別マーカーは、陽性コントロールとして用いることができる。また、本発明のキットは、ＰＣＲ反応を行うための、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、陰性コントロール、ＤＮＡ抽出試薬等を含んでいてもよい。
【実施例】
【0043】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0044】
［実験例１］
（１）ＤＮＡ抽出
完全甘ガキである富有と、非完全甘ガキである吉田御所との交配種の約１．０ｃｍ２の葉を液体窒素で凍結後、－２０℃で保存したものを試料として用いた。試料を液体窒素で冷却した状態で粉砕し、５００μＬの前処理バッファー（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、１０ｍＭ ジチオスレイトール）を加えてボルテックスでよく撹拌した。ジチオスレイトールは、使用直前に添加した。２０，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した後、上清を捨て、得られた沈殿物を、前処理バッファー１ｍＬを用いて溶解し、２０，０００×ｇ、４℃で、３分間遠心分離し、上清を捨てた。この操作を計３回繰り返した後、得られた沈殿物について、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に添付のプロトコルに従って、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度の測定にはＱｕｂｉｔ ３．０ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。
（１）ＤＮＡ抽出
完全甘ガキである富有と、非完全甘ガキである吉田御所との交配種の約１．０ｃｍ２の葉を液体窒素で凍結後、－２０℃で保存したものを試料として用いた。試料を液体窒素で冷却した状態で粉砕し、５００μＬの前処理バッファー（０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ、１０ｍＭ ジチオスレイトール）を加えてボルテックスでよく撹拌した。ジチオスレイトールは、使用直前に添加した。２０，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した後、上清を捨て、得られた沈殿物を、前処理バッファー１ｍＬを用いて溶解し、２０，０００×ｇ、４℃で、３分間遠心分離し、上清を捨てた。この操作を計３回繰り返した後、得られた沈殿物について、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に添付のプロトコルに従って、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ濃度の測定にはＱｕｂｉｔ ３．０ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。
【0045】
（２）ＰＣＲ反応
ＰＣＲ反応は、以下の条件でマルチプレックスＰＣＲ反応により行なった。
（ＰＣＲ反応液１０μＬの組成）
・５μＬの２×ＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏバッファー（ＴＯＹＯＢＯ社製）
・ｄＮＴＰｓ（終濃度０．４ｍＭ）
・ＦＡＭ－ＡＳＴ－Ｆ（ＡＳＴ－Ｆは配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマー：終濃度０．４μＭ）
・ＨＥＸ－ＰＣＮＡ－Ｆ（ＰＣＮＡ－Ｆは配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマー：終濃度０．２μＭ）
・５Ｒ３Ｒ（５Ｒ３Ｒは配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマー：終濃度０．６μＭ）
・（１）で得られた１０～２０ｎｇの抽出ＤＮＡ
ＰＣＲ反応は、以下の条件でマルチプレックスＰＣＲ反応により行なった。
（ＰＣＲ反応液１０μＬの組成）
・５μＬの２×ＫＯＤ ＦＸ ｎｅｏバッファー（ＴＯＹＯＢＯ社製）
・ｄＮＴＰｓ（終濃度０．４ｍＭ）
・ＦＡＭ－ＡＳＴ－Ｆ（ＡＳＴ－Ｆは配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマー：終濃度０．４μＭ）
・ＨＥＸ－ＰＣＮＡ－Ｆ（ＰＣＮＡ－Ｆは配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマー：終濃度０．２μＭ）
・５Ｒ３Ｒ（５Ｒ３Ｒは配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマー：終濃度０．６μＭ）
・（１）で得られた１０～２０ｎｇの抽出ＤＮＡ
【0046】
（ＰＣＲサイクル条件）
９４℃で２分、９８℃で１０秒－５５℃で３０秒－６８℃で３０秒（３０サイクル）、６８℃で７分
９４℃で２分、９８℃で１０秒－５５℃で３０秒－６８℃で３０秒（３０サイクル）、６８℃で７分
【0047】
図１に、ＰＣＮＡ－Ｆと５Ｒ３Ｒとで増幅される完全甘ガキ性連鎖領域と、ＡＳＴ－Ｆと５Ｒ３Ｒとで増幅される非完全甘ガキ性連鎖領域を示す。
【0048】
上記ＰＣＲ反応で増幅したＰＣＲ増幅産物を、ＡＢＩ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて解析した。ＤＮＡのサイズはＧｅｎｅＳｃａｎ ５００ ＲＯＸ Ｄｙｅサイズスタンダード（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を元にＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ｖｅｒ．５．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて計算した。その結果を図２に示す。
図２に示したように、６５２－０３、６５２－０４、６５２－０５、６５２－０６及び６５２－０７の全ての交配種において、完全甘ガキ性連鎖領域のピークである、３４７～３５５ｂｐのピークが検出された。このうち、６５２－０３及び６５２－７は完全甘ガキであったが、６５２－０４、６５２－０５及び６５２－０６は非完全甘ガキであり、３４７～３５５ｂｐのピークのみの検出では、完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別はできなかった。
図２に示したように、６５２－０３、６５２－０４、６５２－０５、６５２－０６及び６５２－０７の全ての交配種において、完全甘ガキ性連鎖領域のピークである、３４７～３５５ｂｐのピークが検出された。このうち、６５２－０３及び６５２－７は完全甘ガキであったが、６５２－０４、６５２－０５及び６５２－０６は非完全甘ガキであり、３４７～３５５ｂｐのピークのみの検出では、完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別はできなかった。
【0049】
［実験例２］
実験例１で得られたＰＣＲ増幅産物の５μＬを、制限酵素処理反応液（１μＬの１０Ｘ ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（ＮＥＢ社製）、制限酵素ＳｔｕＩ（終濃度０．５Ｕ／μＬ））１０μＬに添加し、３７℃で２時間インキュベートし、ＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳｔｕＩで切断した。得られた反応液を、実験例１と同様にＡＢＩ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて解析した。その結果を、図３に示す。
実験例１で得られたＰＣＲ増幅産物の５μＬを、制限酵素処理反応液（１μＬの１０Ｘ ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（ＮＥＢ社製）、制限酵素ＳｔｕＩ（終濃度０．５Ｕ／μＬ））１０μＬに添加し、３７℃で２時間インキュベートし、ＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳｔｕＩで切断した。得られた反応液を、実験例１と同様にＡＢＩ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて解析した。その結果を、図３に示す。
【0050】
図３に示したように、交配種のうち、６５２－０３及び６５２－０７においては、１８３ｂｐのピークが検出されなかったが、６５２－０４、６５２－０５及び６５２－０６には、１８３ｂｐのピークが検出された。１８３ｂｐのピークが検出されなかった６５２－０３及び６５２－０７は、完全甘ガキであり、１８３ｂｐのピークが検出された６５２－０４、６５２－０５及び６５２－０６は、非完全甘ガキであった。この結果、完全甘ガキ性連鎖領域塩基配列のＰＣＲ増幅産物を制限酵素ＳｔｕＩで切断して得らえた１８３ｂｐのピークの検出の有無により、完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性を識別できることが明らかとなった。
【0051】
［実験例３］
試料として、完全甘ガキである富有と、非完全甘ガキである吉田御所との交配種の代わりに、交配種の親である、富有と吉田御所を用いる以外は、実験例１及び実験例２と同様に行い、ＰＣＲ増幅産物及び制限酵素ＳｔｕＩで切断した反応液を、ＡＢＩ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて解析した。その結果を図４及び図５に示す。図４に示したように、完全甘ガキである富有は、１８３ｂｐのピークが検出されなかったが、非完全甘ガキである吉田御所は、１８３ｂｐのピークが検出された。この結果、１８３ｂｐが検出されるカキは、非完全甘ガキであり、１８３ｂｐのピークが検出されなかったカキは、完全甘ガキであると識別できることが確認された。
また、図５に示すように、制限酵素ＳｔｕＩで切断する前（左図）は、完全甘ガキである富有には、３５２．５ｂｐのピークは検出されなかったが、非完全甘ガキである吉田御所には、３５２．５ｂｐのピークが検出された。吉田御所において制限酵素ＳｔｕＩで切断する前に検出された３５２．５ｂｐのピークは、制限酵素ＳｔｕＩで切断した後（右図）では検出されなかった。この結果から、吉田御所で検出された３５２．５ｂｐの増幅産物が、ＳｔｕＩにより切断され、１８３ｂｐのピークが生成することが確認された。
試料として、完全甘ガキである富有と、非完全甘ガキである吉田御所との交配種の代わりに、交配種の親である、富有と吉田御所を用いる以外は、実験例１及び実験例２と同様に行い、ＰＣＲ増幅産物及び制限酵素ＳｔｕＩで切断した反応液を、ＡＢＩ ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて解析した。その結果を図４及び図５に示す。図４に示したように、完全甘ガキである富有は、１８３ｂｐのピークが検出されなかったが、非完全甘ガキである吉田御所は、１８３ｂｐのピークが検出された。この結果、１８３ｂｐが検出されるカキは、非完全甘ガキであり、１８３ｂｐのピークが検出されなかったカキは、完全甘ガキであると識別できることが確認された。
また、図５に示すように、制限酵素ＳｔｕＩで切断する前（左図）は、完全甘ガキである富有には、３５２．５ｂｐのピークは検出されなかったが、非完全甘ガキである吉田御所には、３５２．５ｂｐのピークが検出された。吉田御所において制限酵素ＳｔｕＩで切断する前に検出された３５２．５ｂｐのピークは、制限酵素ＳｔｕＩで切断した後（右図）では検出されなかった。この結果から、吉田御所で検出された３５２．５ｂｐの増幅産物が、ＳｔｕＩにより切断され、１８３ｂｐのピークが生成することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0052】
本発明によれば、カキ植物体が完全甘ガキ性を有するか、非完全甘ガキ性を有するかを、遺伝子により効率的に識別することができる、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別する識別方法、カキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性との識別マーカー、及びカキの完全甘ガキ性と非完全甘ガキ性とを識別するためのキットを提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】