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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-12
(45)【発行日】2022-12-20
(54)【発明の名称】光受容感度の抑制又は低減剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/02 20060101AFI20221213BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20221213BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20221213BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20221213BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221213BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20221213BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20221213BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20221213BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20221213BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20221213BHJP
A23L 33/13 20160101ALI20221213BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20221213BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20221213BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20221213BHJP
C12N 15/52 20060101ALN20221213BHJP
C12N 9/00 20060101ALN20221213BHJP
C12N 9/99 20060101ALN20221213BHJP
A61P 25/18 20060101ALN20221213BHJP
A61P 25/20 20060101ALN20221213BHJP
A61P 25/06 20060101ALN20221213BHJP
A61P 25/08 20060101ALN20221213BHJP
A61K 45/00 20060101ALN20221213BHJP
【ＦＩ】
A61K38/02
A61P27/02
A61P43/00 111
A61K9/08
A61K39/395 D
A61K31/713
A61K31/7105
A61K48/00
A61K31/519
A23L33/18
A23L33/13
C12Q1/02
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C12N15/52 Z
C12N9/00
C12N9/99
A61P25/18
A61P25/20
A61P25/06
A61P25/08
A61K45/00 ZNA
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2019506326
(86)(22)【出願日】2018-03-16
(86)【国際出願番号】 JP2018010660
(87)【国際公開番号】W WO2018169090
(87)【国際公開日】2018-09-20
【審査請求日】2020-12-04
(31)【優先権主張番号】P 2017053811
(32)【優先日】2017-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2017248490
(32)【優先日】2017-12-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504176911
【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学
(74)【代理人】
【識別番号】100077012
【弁理士】
【氏名又は名称】岩谷 龍
(72)【発明者】
【氏名】古川 貴久
【審査官】長谷川 茜
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２６８７０５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００４／０２３５７３３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００２－５００１８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Brain Research Bulletin，2008年，Vol.76，pp.412-423
【文献】Molecular Vision，2017年03月，Vol.23，pp.171-178
【文献】JEONG JOO-WON et al.，Regulation and Destabilization of HIF-1α by ARD1-Mediated Acetylation，Cell，2002年11月27日，vol.111，pp.709-720
【文献】OBIN MARTIN S. et al.，Ubiquitinylation and Ubiquitin-dependent Proteolysis in Vertebrate Photoreceptors (Rod Outer Segments)，The Journal of Biological Chemistry，1996年06月14日，vol.271, No.24，pp.14473-14484
【文献】KIGOSHI YU et al.，Journal of Biological Chemistry，2011年09月23日，vol.286, no.38，pp.33613-33621
【文献】FUJIYAMA-NAKAMURA Sally et al.，BTB protein, dKLHL18/CG3571, serves as an adaptor subunit for a dCul3 ubiquitin ligase complex，Genes to Cells，2009年，vol.14，pp.965-973，DOI:10.1111/j.1365-2443.2009.01323.x
【文献】遠藤 智之 他，網膜色素変性症原因遺伝子産物KLHL7の標的分子の探索，つくば生物ジャーナル，2014年，vol.13, no.1，p.85
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ ２５／
Ａ６１Ｐ ２７／
Ａ２３Ｌ ３３／
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｋｌｈｌ１８を阻害又は抑制する物質を含有する、網膜の光受容感度の抑制又は低減剤であって、Ｋｌｈｌ１８を阻害又は抑制する物質が、Ｋｌｈｌ１８の発現及び／若しくは活性を阻害若しくは抑制する物質、又はＫｌｈｌ１８複合体を構成するタンパク質の活性を阻害する物質であり、
Ｋｌｈｌ１８のＣ末端断片、抗Ｋｌｈｌ１８抗体及び抗Ｕｎｃ１１９抗体から選択されるＫｌｈｌ１８とＵｎｃ１１９との結合を阻害する物質、
Ｋｌｈｌ１８遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド及びアプタマーから選択される核酸、
Ｕｎｃ１１９発現ベクター、
ＭＧ－１３２、ボルテゾミブ、ジスルフィラム、サリノスポラミドＡ、カーフィルゾミブ、ラクタシスチン、ＴＭＣ－９５、ペプチドアルデヒド、ケトアルデヒド、ペプチドホウ酸、及びそれらの薬学的に許容される塩から選択されるプロテアソーム阻害剤、又は
ＭＬＮ４９２４およびＤＩ－５９１から選択されるＫｌｈｌ１８複合体を構成するタンパク質の活性を阻害する物質である、剤。
【請求項2】
網膜を保護、網膜の変性を抑制、網膜の老化を抑制及び／又は感覚過敏を抑制する、請求項１に記載の剤。
【請求項3】
光受容に関連する症状を改善又は予防する、請求項１又は２に記載の剤。
【請求項4】
光受容に関連する症状が、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病及び錐体桿体ジストロフィーから選択された少なくとも一種である、請求項３に記載の剤。
【請求項5】
Ｋｌｈｌ１８が配列番号３又は１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１～４のいずれかに記載の剤。
【請求項6】
請求項１～５のいずれかに記載の剤を含む、光受容に関連する症状の改善又は予防用医薬組成物。
【請求項7】
注射用又は点眼用である請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
請求項１～５のいずれかに記載の剤を含む、光受容に関連する症状の改善又は予防用食品組成物。
【請求項9】
Ｋｌｈｌ１８の発現及び／若しくは活性を誘導又は促進する物質を含有する、網膜の光受容感度を増強又は維持するための剤であって、Ｋｌｈｌ１８の発現及び／若しくは活性を誘導又は促進する物質が、Ｋｌｈｌ１８発現ベクターである、剤。
【請求項10】
Ｋｌｈｌ１８をコードする遺伝子及びＵｎｃ１１９をコードする遺伝子を導入した細胞に被験物質を添加し、該細胞におけるＵｎｃ１１９のユビキチン量が、被験物質を添加しなかった細胞におけるＵｎｃ１１９のユビキチン量と比較して減少する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定する、光受容に関連する症状を改善又は予防する物質のスクリーニング方法。
【請求項11】
Ｋｌｈｌ１８をコードする遺伝子及びＵｎｃ１１９をコードする遺伝子を導入した細胞に被験物質を添加し、該細胞におけるＵｎｃ１１９の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞におけるＵｎｃ１１９の発現量と比較して増加する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定する、光受容に関連する症状を改善又は予防する物質のスクリーニング方法。
【請求項12】
Ｋｌｈｌ１８とＵｎｃ１１９を含む溶液に被験物質を添加し、Ｋｌｈｌ１８とＵｎｃ１１９との相互作用が、被験物質を添加しなかった場合の相互作用と比較して減少する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定する、光受容に関連する症状を改善又は予防する物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ユビキチン化を阻害又は抑制する物質を含有する、光受容感度の抑制又は低減剤に関する。
【背景技術】
【0002】
我々は外界の情報の約９割を視覚で取り入れている。視覚の障害はＱＯＬ(Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ)を著しく低下させ、日常生活、移動、コミュニケーション等の社会活動を大幅に制限し健康寿命を短くするだけでなく、障害を持つ者の介護を担う者にとっても大きな負担となる。高齢者の視覚障害は認知症やうつ病等のリスクも増加させることから、失明につながる網膜関連疾患の治療法や予防法および老化による視覚障害の予防や克服も喫緊の課題となっている。
【0003】
我々が物を見るとき、網膜視細胞が光を受けて光受容反応がおこり電気信号へ変換され、最終的に脳に情報が送られて視覚に至る。その反面、光の長期暴露によって代謝老廃物や細胞ストレスの蓄積が徐々に進み、視細胞や網膜色素上皮の老化や細胞死等を引き起こし、加齢黄斑変性や網膜色素変性を含む視覚障害につながると考えられている。
【0004】
加齢黄斑変性は、中心が見えにくい、ゆがむ等の症状を伴う目疾患であり、先進国では高齢者の失明原因の上位を占める。網膜色素変性症は、視細胞の変性又は脱落による視野欠損及び夜盲を特徴とし、最終的には失明に至る進行性の疾患である。
【0005】
現在、こうした疾患等に対して遺伝子治療、神経保護治療及び再生医療による治療が試みられているが、真に有効な治療方法及び予防方法は存在しない。
【0006】
一方、ユビキチンは、真核生物に存在する進化的に保存された７６アミノ酸残基からなるタンパク質であり、これがユビキチン化酵素により標的タンパク質に鎖状に共有結合し、分解シグナルとして作用する。その後、ユビキチン化された標的タンパク質は、ユビキチンを認識するプロテアソームにより分解される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、光受容感度の抑制又は軽減剤を提供することである。
本発明の他の目的は、光受容感度を増強又は維持するための剤を提供することである。
本発明の他の目的は、光受容感度を増強又は維持するための剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
前記のようなユビキチン化酵素は、網膜においても確認されているものの、その機能については、明らかになっていない。
このような中、本発明者は、意外なことに、網膜におけるユビキチン化と網膜の光受容感度とが関連していることを突き止めた。そして、このような知見に基づいて、さらに、より具体的な検討を進めた結果、網膜に発現するユビキチン化酵素Ｋｌｈｌ１８の遺伝子を欠損又は機能を阻害することにより、桿体視細胞の光に対する応答機能が減弱し、網膜の光受容感度が低下することを見出し、さらに検討を重ねて、種々の新知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
［１］ユビキチン化を阻害又は抑制する物質を含有する、光受容感度の抑制又は低減剤。
［２］網膜を保護、網膜の変性を抑制、網膜の老化を抑制及び／又は感覚過敏を抑制する、前記［１］に記載の剤。
［３］光受容に関連する症状を改善又は予防する、前記［１］又は［２］に記載の剤。
［４］光受容に関連する症状が、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、網膜虚血、光過敏性発作、光感受性てんかん、精神疾患、光線黄斑症、眼精疲労、網膜機能低下、睡眠障害、片頭痛及び光障害から選択された少なくとも一種である、前記［３］に記載の剤。
［５］ユビキチン化を阻害又は抑制する物質が、ユビキチン化酵素を阻害又は抑制する物質及び／又はユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質を含有する前記［１］～［４］のいずれかに記載の剤。
［６］ユビキチン化酵素が、光受容感度を調節又は制御する能力を有する前記［５］に記載の剤。
［７］ユビキチン化酵素が下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である前記［５］又は［６］に記載の剤。
（Ａ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０又は３３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０又は３３に示されるアミノ酸配列において、一個以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
［８］ユビキチン化酵素を阻害又は抑制する物質が、ユビキチン化酵素の結合阻害物質、ユビキチン化酵素タンパク質の一部、プロテアソーム阻害剤、抗体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、遺伝子ターゲティング用物質及びユビキチン化複合体タンパク質の活性阻害物質の少なくともいずれか一種である前記［５］～［７］のいずれかに記載の剤。
［９］ユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質が、ユビキチン化酵素の標的タンパク質の全長又はその一部、ユビキチン化酵素の標的タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導又は促進する物質の少なくともいずれか一種である前記［５］～［８］のいずれかに記載の剤。
［１０］前記［１］～［９］のいずれかに記載の剤を含み、光受容感度を抑制又は低減（又は光受容に関連する症状を改善又は予防）するための組成物。
［１１］注射用組成物又は点眼用組成物である前記［１０］記載の組成物。
［１２］食品組成物である前記［１０］記載の組成物。
［１３］ユビキチン化を阻害又は抑制する物質。
［１４］ユビキチン化酵素の結合阻害物質、ユビキチン化酵素タンパク質の一部、抗体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、遺伝子ターゲティング用物質、ユビキチン化複合体タンパク質の活性阻害物質、ユビキチン化酵素の標的タンパク質の全長又はその一部、ユビキチン化酵素の標的タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導又は促進する物質のいずれか一種である、前記［１３］に記載の物質。
［１５］前記［１］～［１２］のいずれかに記載の剤又は組成物を製造するための、ユビキチン化を阻害又は抑制する物質の使用。
［１６］動物のユビキチン化を阻害又は抑制し、光受容感度を抑制又は低減（又は光受容に関連する症状を改善又は予防）する方法。
［１７］動物に、前記［１］～［１２］のいずれかに記載の剤又は組成物を投与する、前記［１６］に記載の方法。
［１８］ユビキチン化酵素、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子及びユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する能力を有する物質の少なくとも一種を含有し、光受容感度を増強又は維持するための剤。
［１９］ ユビキチン化酵素をコードする遺伝子及び標的タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞に被験物質を添加し、該細胞における前記標的タンパク質のユビキチン量が、被験物質を添加しなかった細胞におけるユビキチン量と比較して減少する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定する、光受容に関連する症状を改善又は予防するための剤のスクリーニング方法。
［２０］ ユビキチン化酵素をコードする遺伝子を導入した細胞に被験物質を添加し、該細胞における前記標的タンパク質の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における該標的タンパク質の発現量と比較して増加する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定する、光受容に関連する症状を改善又は予防するための剤のスクリーニング方法。
［２１］ 被験物質を添加した場合のユビキチン化酵素と標的タンパク質あるいはユビキチン化酵素とユビキチン リガーゼ複合体構成タンパク質との相互作用が、被験物質を添加しなかった場合の相互作用と比較して減少する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定する、光受容に関連する症状を改善又は予防するための剤のスクリーニング方法。
このような中、本発明者は、意外なことに、網膜におけるユビキチン化と網膜の光受容感度とが関連していることを突き止めた。そして、このような知見に基づいて、さらに、より具体的な検討を進めた結果、網膜に発現するユビキチン化酵素Ｋｌｈｌ１８の遺伝子を欠損又は機能を阻害することにより、桿体視細胞の光に対する応答機能が減弱し、網膜の光受容感度が低下することを見出し、さらに検討を重ねて、種々の新知見を得て、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明に関する。
［１］ユビキチン化を阻害又は抑制する物質を含有する、光受容感度の抑制又は低減剤。
［２］網膜を保護、網膜の変性を抑制、網膜の老化を抑制及び／又は感覚過敏を抑制する、前記［１］に記載の剤。
［３］光受容に関連する症状を改善又は予防する、前記［１］又は［２］に記載の剤。
［４］光受容に関連する症状が、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、網膜虚血、光過敏性発作、光感受性てんかん、精神疾患、光線黄斑症、眼精疲労、網膜機能低下、睡眠障害、片頭痛及び光障害から選択された少なくとも一種である、前記［３］に記載の剤。
［５］ユビキチン化を阻害又は抑制する物質が、ユビキチン化酵素を阻害又は抑制する物質及び／又はユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質を含有する前記［１］～［４］のいずれかに記載の剤。
［６］ユビキチン化酵素が、光受容感度を調節又は制御する能力を有する前記［５］に記載の剤。
［７］ユビキチン化酵素が下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である前記［５］又は［６］に記載の剤。
（Ａ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０又は３３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０又は３３に示されるアミノ酸配列において、一個以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
［８］ユビキチン化酵素を阻害又は抑制する物質が、ユビキチン化酵素の結合阻害物質、ユビキチン化酵素タンパク質の一部、プロテアソーム阻害剤、抗体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、遺伝子ターゲティング用物質及びユビキチン化複合体タンパク質の活性阻害物質の少なくともいずれか一種である前記［５］～［７］のいずれかに記載の剤。
［９］ユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質が、ユビキチン化酵素の標的タンパク質の全長又はその一部、ユビキチン化酵素の標的タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導又は促進する物質の少なくともいずれか一種である前記［５］～［８］のいずれかに記載の剤。
［１０］前記［１］～［９］のいずれかに記載の剤を含み、光受容感度を抑制又は低減（又は光受容に関連する症状を改善又は予防）するための組成物。
［１１］注射用組成物又は点眼用組成物である前記［１０］記載の組成物。
［１２］食品組成物である前記［１０］記載の組成物。
［１３］ユビキチン化を阻害又は抑制する物質。
［１４］ユビキチン化酵素の結合阻害物質、ユビキチン化酵素タンパク質の一部、抗体、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、アプタマー、遺伝子ターゲティング用物質、ユビキチン化複合体タンパク質の活性阻害物質、ユビキチン化酵素の標的タンパク質の全長又はその一部、ユビキチン化酵素の標的タンパク質をコードする遺伝子の発現を誘導又は促進する物質のいずれか一種である、前記［１３］に記載の物質。
［１５］前記［１］～［１２］のいずれかに記載の剤又は組成物を製造するための、ユビキチン化を阻害又は抑制する物質の使用。
［１６］動物のユビキチン化を阻害又は抑制し、光受容感度を抑制又は低減（又は光受容に関連する症状を改善又は予防）する方法。
［１７］動物に、前記［１］～［１２］のいずれかに記載の剤又は組成物を投与する、前記［１６］に記載の方法。
［１８］ユビキチン化酵素、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子及びユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する能力を有する物質の少なくとも一種を含有し、光受容感度を増強又は維持するための剤。
［１９］ ユビキチン化酵素をコードする遺伝子及び標的タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞に被験物質を添加し、該細胞における前記標的タンパク質のユビキチン量が、被験物質を添加しなかった細胞におけるユビキチン量と比較して減少する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定する、光受容に関連する症状を改善又は予防するための剤のスクリーニング方法。
［２０］ ユビキチン化酵素をコードする遺伝子を導入した細胞に被験物質を添加し、該細胞における前記標的タンパク質の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における該標的タンパク質の発現量と比較して増加する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定する、光受容に関連する症状を改善又は予防するための剤のスクリーニング方法。
［２１］ 被験物質を添加した場合のユビキチン化酵素と標的タンパク質あるいはユビキチン化酵素とユビキチン リガーゼ複合体構成タンパク質との相互作用が、被験物質を添加しなかった場合の相互作用と比較して減少する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定する、光受容に関連する症状を改善又は予防するための剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明では、光受容感度の抑制又は軽減剤を提供することができる。
また、本発明では、光受容感度を増強又は維持するための剤を提供することができる。
また、本発明では、光受容感度を増強又は維持するための剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
＜剤＞
本発明の剤は、光受容感度を抑制又は軽減するために使用できる。そして、このような剤は、ユビキチン化（網膜におけるユビキチン化）を阻害又は抑制する物質（物質（Ａ）などということがある）を含有する。すなわち、網膜におけるユビキチン化と光受容感度とが関連しており、そのため、ユビキチン化を阻害又は抑制することで、光受容感度を抑制又は軽減でき、ひいては、光受容に関連する症状の改善又は予防につながる。
なお、本発明において、「症状」には疾患等も含まれる。
また、本発明において、「改善」には治療等も含まれ、その改善の程度は特に限定されず、症状の寛解、完治等も含む。「予防」も、その程度は特に限定されるものではなく、発症の阻止、進行の抑制を含む意味に用いる。
物質（Ａ）は、ユビキチン化を阻害又は抑制できればよく、そのユビキチン化を阻害又は抑制するメカニズムは特に限定されない。例えば、物質（Ａ）は、ユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質であってもよく、ユビキチン化に関する酵素（ユビキチン化酵素）を阻害又は抑制する物質であってもよく、ユビキチン化に関する酵素どうしの相互作用を阻害又は抑制する物質であってもよく、いずれの機能を有する物質であってもよい。
物質（Ａ）は、単独で又は２種以上組み合わせて使用してもよい。
物質（Ａ）は、代表的には、ユビキチン化酵素を阻害又は抑制する物質、ユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質である。そのため、物質（Ａ）は、少なくともユビキチン化酵素を阻害又は抑制する物質及びユビキチン化そのもの（自体）を阻害又は抑制する物質の少なくともいずれかを含んでいてもよい。
以下、ユビキチン化酵素などを含め、本発明を詳述する。
本発明の剤は、光受容感度を抑制又は軽減するために使用できる。そして、このような剤は、ユビキチン化（網膜におけるユビキチン化）を阻害又は抑制する物質（物質（Ａ）などということがある）を含有する。すなわち、網膜におけるユビキチン化と光受容感度とが関連しており、そのため、ユビキチン化を阻害又は抑制することで、光受容感度を抑制又は軽減でき、ひいては、光受容に関連する症状の改善又は予防につながる。
なお、本発明において、「症状」には疾患等も含まれる。
また、本発明において、「改善」には治療等も含まれ、その改善の程度は特に限定されず、症状の寛解、完治等も含む。「予防」も、その程度は特に限定されるものではなく、発症の阻止、進行の抑制を含む意味に用いる。
物質（Ａ）は、ユビキチン化を阻害又は抑制できればよく、そのユビキチン化を阻害又は抑制するメカニズムは特に限定されない。例えば、物質（Ａ）は、ユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質であってもよく、ユビキチン化に関する酵素（ユビキチン化酵素）を阻害又は抑制する物質であってもよく、ユビキチン化に関する酵素どうしの相互作用を阻害又は抑制する物質であってもよく、いずれの機能を有する物質であってもよい。
物質（Ａ）は、単独で又は２種以上組み合わせて使用してもよい。
物質（Ａ）は、代表的には、ユビキチン化酵素を阻害又は抑制する物質、ユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質である。そのため、物質（Ａ）は、少なくともユビキチン化酵素を阻害又は抑制する物質及びユビキチン化そのもの（自体）を阻害又は抑制する物質の少なくともいずれかを含んでいてもよい。
以下、ユビキチン化酵素などを含め、本発明を詳述する。
【0012】
［ユビキチン化酵素］
ユビキチン化酵素は、例えば、網膜で機能し、標的にユビキチンを結合させる能力を有するものであってもよい。なかでも、網膜で発現しているユビキチン化酵素であることが好ましい。特に、ユビキチン化酵素は、網膜の光受容感度を調節又は制御する能力を有するものであることが好ましく、網膜の光受容感度に関係するタンパク質をユビキチン化する酵素であることが好ましく、網膜の光受容感度の調節又は制御に関係するタンパク質をユビキチン化する酵素であることがさらに好ましい。
ユビキチン化酵素は、例えば、網膜で機能し、標的にユビキチンを結合させる能力を有するものであってもよい。なかでも、網膜で発現しているユビキチン化酵素であることが好ましい。特に、ユビキチン化酵素は、網膜の光受容感度を調節又は制御する能力を有するものであることが好ましく、網膜の光受容感度に関係するタンパク質をユビキチン化する酵素であることが好ましく、網膜の光受容感度の調節又は制御に関係するタンパク質をユビキチン化する酵素であることがさらに好ましい。
【0013】
ユビキチン化酵素のタンパク質は、例えば、配列番号３又は１２で表されるものであってもよく、配列番号３又は１２で表されるもののアイソフォームであってもよい。アイソフォームとしては、例えば、配列番号６、９、１５、１８、２１、２４、２７、３０又は３３で表されるもの等が挙げられる。
またユビキチン化酵素のタンパク質には、ユビキチン化作用を有する限り、構成アミノ酸の一部が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたものも含まれる。このような場合、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸の数は、１個以上であれば特に限定されず、例えば、２０個以下、１５個以下、１０個以下、７個以下、５個以下、３個以下、１～２個、１個などであってもよい。
またユビキチン化酵素のタンパク質には、ユビキチン化作用を有する限り、構成アミノ酸の一部が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたものも含まれる。このような場合、置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸の数は、１個以上であれば特に限定されず、例えば、２０個以下、１５個以下、１０個以下、７個以下、５個以下、３個以下、１～２個、１個などであってもよい。
【0014】
本発明におけるユビキチン化酵素は、特に生物種の由来を限定されないが、例えば、霊長類、ペット、げっ歯類由来のものが好ましく、霊長類、ペット由来のものがより好ましく、ヒト由来のものがさらに好ましい。
【0015】
ユビキチン化の標的とする対象は、例えば、配列番号３６又は５１で表されるものであってもよく、配列番号３６又は５１で表されるもののアイソフォームであってもよい。アイソフォームとしては、例えば、３９、４２、４５、４８、５４又は５７等で表されるアミノ酸配列からなるもの、配列番号３４、３５、３７、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７、４９、５０、５２、５３、５５又は５６等で表される塩基配列でコードされるタンパク質等であってもよい。
配列番号３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３又は５６で表される塩基配列は、Ｕｎｃ１１９をコードする遺伝子の塩基配列(配列番号３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２又は５５)の第７３位～第８６１位、第２６位～第６１９位、第２６位～第５５３位、第１６５位～第６０２位、第７３位～第７９５位、第７２位～第７９４位、第７２位～第７３４位又は第４２０位～第８５７位にそれぞれ該当する。
配列番号３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３又は５６で表される塩基配列は、Ｕｎｃ１１９をコードする遺伝子の塩基配列(配列番号３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２又は５５)の第７３位～第８６１位、第２６位～第６１９位、第２６位～第５５３位、第１６５位～第６０２位、第７３位～第７９５位、第７２位～第７９４位、第７２位～第７３４位又は第４２０位～第８５７位にそれぞれ該当する。
【0016】
具体的なユビキチン化酵素としては、Ｋｌｈｌ１８等が例示される。Ｋｌｈｌ１８は、ショウジョウバエにおいて、Ｅ３ユビキチン リガーゼのＣｕｌｌｉｎ３タンパク質による標的タンパク質のユビキチン化に関与することが報告されており（Sally Fujiyama-Nakamura et al., Genes to Cells, 2009, 14, 965-973）、またＣｕｌｌｉｎ３タンパク質と複合体を形成し、オーロラＡ（Ａｕｒｏｒａ Ａ）タンパク質をユビキチン化すること、及び有糸分裂開始に関与することがこれまでに報告されている（Saili Moghe et al., Biol. Open., 2012, 1(2), 82-91）。
【0017】
Ｋｌｈｌ１８（Ｋｅｌｃｈ－ｌｉｋｅ１８）は、ＢＴＢドメイン、ＢＡＣＫドメイン及び６つのＫｅｌｃｈドメインから構成されている。これらの各ドメインは、タンパク質間相互作用に関与するドメインである。ＢＴＢドメインは、Ｃｕｌｌｉｎファミリータンパク質と相互作用する機能を有し、ＢＡＣＫドメインは、ＢＴＢドメインとＣｕｌｌｉｎファミリータンパク質を相互作用させる機能を有し、Ｋｅｌｃｈドメインは、標的タンパク質と相互作用する機能を有する。
【0018】
具体的なユビキチン化の標的とする対象としては、Ｕｎｃ１１９などが例示される。トランスデューシンａｌｐｈａサブユニットに結合するＵｎｃ１１９は、トランスデューシンａｌｐｈａサブユニットの細胞体から外節への輸送に関与しており、Ｕｎｃ１１９遺伝子欠損マウスでは、暗順応化においてトランスデューシンａｌｐｈａサブユニットの細胞体から外節への輸送が阻害されることが報告されている（Nat Neurosci. 2011 Jun 5;14(7):874-80.）。また、常染色体優性型（ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ）の錐体桿体ジストロフィー（ｃｏｎｅ－ｒｏｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）において、Ｕｎｃ１１９遺伝子の変異が１家系で報告されている（Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Oct;41(11):3268-77.）。
【0019】
ユビキチン化酵素が機能する細胞は、網膜内の細胞であればよく、例えば、視細胞、双極細胞、神経節細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞等が挙げられるが、視細胞が好ましい。ユビキチン化酵素が機能する視細胞は、桿体視細胞、錐体視細胞のどちらであってもよいが、桿体視細胞であることが好ましい。
【0020】
［ユビキチン化を阻害又は抑制する物質］
物質（Ａ）としては、例えば、ユビキチン化酵素の発現及び／又は活性を阻害又は抑制する物質等が挙げられる。このような物質は、例えば、ユビキチン化酵素そのものを阻害又は抑制してもよく、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子の発現を阻害又は抑制してもよく、ユビキチン化酵素と標的タンパク質との相互作用を阻害するドミナントネガティブとして機能してもよく、ユビキチン化複合体タンパク質の活性を阻害又は抑制してもよく、これらのいずれの機能を有していてもよい。
物質（Ａ）としては、例えば、ユビキチン化酵素の発現及び／又は活性を阻害又は抑制する物質等が挙げられる。このような物質は、例えば、ユビキチン化酵素そのものを阻害又は抑制してもよく、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子の発現を阻害又は抑制してもよく、ユビキチン化酵素と標的タンパク質との相互作用を阻害するドミナントネガティブとして機能してもよく、ユビキチン化複合体タンパク質の活性を阻害又は抑制してもよく、これらのいずれの機能を有していてもよい。
【0021】
他の態様として、物質（Ａ）は、例えば、ユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質、ユビキチン化を直接的に阻害又は抑制する物質等であってもよい。このような物質は、例えば、ユビキチン化酵素の標的タンパク質を過剰発現等させることで、ユビキチン化酵素のユビキチン化そのものを阻害又は抑制する機能を有していてもよい。
【0022】
ユビキチン化酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１、２、１０又は１１で表されるポリヌクレオチド、該ユビキチン化酵素と同一又は同様の機能を有するアイソフォームをコードするポリヌクレオチド（配列番号４、５、７、８、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１又は３２）であってもよく、配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１又は３２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｋｌｈｌ１８をコードする塩基配列であってもよい。
配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９又は３２で表される塩基配列は、Ｋｌｈｌ１８をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８又は３１）の第１０１位～第１８２５位、第９６位～第１８３５位、第９９位～第１４３０位、第１２７位～第１８５１位、第２７位～第１７８１位、第２７位～第１７６６位、第２７位～第１７６６位、第２２６位～第１６４４位、第２２６位～第１６２９位、第２２６位～第１６１４位又は第３１９位～第１７３７位にそれぞれ該当する。
配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９又は３２で表される塩基配列は、Ｋｌｈｌ１８をコードする遺伝子の塩基配列（配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８又は３１）の第１０１位～第１８２５位、第９６位～第１８３５位、第９９位～第１４３０位、第１２７位～第１８５１位、第２７位～第１７８１位、第２７位～第１７６６位、第２７位～第１７６６位、第２２６位～第１６４４位、第２２６位～第１６２９位、第２２６位～第１６１４位又は第３１９位～第１７３７位にそれぞれ該当する。
【0023】
配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１又は３２で表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９、３１又は３２で表される塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が用いられる。
【0024】
本明細書において「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用される。本発明の遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、又はＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）で存在することができる。ＤＮＡは、二本鎖でもよく一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）又は非コード鎖（アンチセンス鎖）のいずれであってもよい。また、本発明のポリヌクレオチドは、その５’側又は３’側でタグ標識（タグ配列又はマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合されていてもよい。
【0025】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行うことができる。
本発明において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,1989,Vol2,p11.45等に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度(Ｔｍ)より５～１０℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。
本発明において「ストリンジェントな条件」は、一般的な条件、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,1989,Vol2,p11.45等に記載された条件を指す。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度(Ｔｍ)より５～１０℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合を指す。
【0026】
具体的な物質（Ａ）には、例えば、ユビキチン化酵素の結合阻害物質、ユビキチン化酵素タンパク質の一部、プロテアソーム阻害剤、ユビキチン化酵素に対する抗体、ユビキチン化酵素に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、遺伝子ターゲティング用物質、ユビキチン化複合体タンパク質の活性阻害物質、ユビキチン化酵素のユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質等が挙げられる。これらの物質は、単体であってもよいし、混合したもの等であってもよい。また、これらの物質は、その入手ルートにおいて特に限定されず、人工的に作られたものであってもよく、動植物由来であってもよく、混合物から精製したもの（例えば、抽出物）などのいずれであってもよい。
【0027】
（ユビキチン化酵素の結合阻害物質）
ユビキチン化酵素の結合阻害物質は、ユビキチン化酵素とタンパク質との結合を阻害できる物質であればよい。ユビキチン化酵素が結合するタンパク質としては、例えば、ユビキチン化複合体を構成するタンパク質であってもよいし、ユビキチン化酵素の標的タンパク質等であってもよい。結合阻害物質は、例えば、ユビキチン化酵素を変性又は変質させる物質等であってもよい。ユビキチン化酵素を変性又は変質させる物質は、例えば、ユビキチン化酵素の立体構造を変化させる物質でもよいし、ユビキチン化酵素の結合に関連する部位をブロックする物質等でもよい。立体構造を変化させる物質は、例えば、ユビキチン化酵素の全体又は一部の立体構造を変化させる物質でもよいし、ユビキチン化酵素自体を分解する物質等であってもよい。ユビキチン化酵素の一部の立体構造を変化させる場合には、例えば、当該立体構造は、少なくともその一部にユビキチン化酵素の結合部位等を含んでいてもよい。ユビキチン化酵素の結合に関連する部位は、例えば、結合部位(結合ドメイン)等であってもよい。結合部位（結合ドメイン）をブロックする物質は、例えば、ユビキチン化酵素の結合部位に結合し、標的タンパク質との結合を阻害する物質であってもよいし、ユビキチン化酵素が認識する標的タンパク質の認識部位を隠す物質等であってもよい。
前記ユビキチン化酵素の結合を阻害する物質は、例えば、血液網膜関門又は血液脳関門の透過性を有するものであってもよく、血液網膜関門又は血液脳関門の透過性を上げることができるもの等であってもよい。
ユビキチン化酵素の結合阻害物質は、ユビキチン化酵素とタンパク質との結合を阻害できる物質であればよい。ユビキチン化酵素が結合するタンパク質としては、例えば、ユビキチン化複合体を構成するタンパク質であってもよいし、ユビキチン化酵素の標的タンパク質等であってもよい。結合阻害物質は、例えば、ユビキチン化酵素を変性又は変質させる物質等であってもよい。ユビキチン化酵素を変性又は変質させる物質は、例えば、ユビキチン化酵素の立体構造を変化させる物質でもよいし、ユビキチン化酵素の結合に関連する部位をブロックする物質等でもよい。立体構造を変化させる物質は、例えば、ユビキチン化酵素の全体又は一部の立体構造を変化させる物質でもよいし、ユビキチン化酵素自体を分解する物質等であってもよい。ユビキチン化酵素の一部の立体構造を変化させる場合には、例えば、当該立体構造は、少なくともその一部にユビキチン化酵素の結合部位等を含んでいてもよい。ユビキチン化酵素の結合に関連する部位は、例えば、結合部位(結合ドメイン)等であってもよい。結合部位（結合ドメイン）をブロックする物質は、例えば、ユビキチン化酵素の結合部位に結合し、標的タンパク質との結合を阻害する物質であってもよいし、ユビキチン化酵素が認識する標的タンパク質の認識部位を隠す物質等であってもよい。
前記ユビキチン化酵素の結合を阻害する物質は、例えば、血液網膜関門又は血液脳関門の透過性を有するものであってもよく、血液網膜関門又は血液脳関門の透過性を上げることができるもの等であってもよい。
【0028】
なお、ユビキチン化酵素の結合阻害物質は、公知の物質を利用してもよく、公知又は自体公知の方法等を利用して特定、設計又は探索することもできる。
例えば、ユビキチン化酵素の結合に関連する部位（結合部位など）を特定し、当該特定された部位の情報（例えば、形状、構造、化学的性質など）に基づいて、結合阻害物質を設計してもよい。
このような方法において、ユビキチン化酵素の結合に関連する部位の特定方法としては、特に限定されず、慣用の方法を利用できる。例えば、ユビキチン化酵素のアミノ酸配列（例えば、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０又は３３）又はユビキチン化酵素の標的タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４又は５７）をもとにタンパク質の三次元の立体構造を推定するために、公知のソフトウェア(例えば、分子シミュレーション用ソフト)等を利用してユビキチン化酵素側又はユビキチン化酵素の標的タンパク質側の結合部位を特定してもよい。分子シミュレーション用ソフトとしては、例えば、ＳＷＩＳＳ－ｍｏｄｅｌ（http://swissmodel.expasy.org）、ｍｙＰｒｅｓｔｏ（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｌｙ Ｙｉｅｌｄｉｎｇ ＰＲｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＳｉｍｕｌａＴＯｒ）、ＰＡＬＬＡＳ、ＭＵＳＥＳ等が挙げられる。ＰＡＬＬＡＳは、Ｘ線解析・ＮＭＲ・分子動力学シミュレーションなどによって得られたタンパク質構造アンサンブルの中からドッキングに適した２～３個のタンパク質構造セットを選択することができる。ＭＵＳＥＳは、高精度活性判別システムであって、ＰＡＬＬＡＳによって選択した化合物から、活性化合物と不活性化合物を判別することができる。
また、ユビキチン化酵素の立体構造を変化させる物質は、特に限定されるものではないが、例えば、分子動力学シミュレーション等によって、特定してもよい。分子動力学シミュレーションを用いることにより、例えば、物質との結合又は相互作用前後のユビキチン化酵素の立体構造変化を推定でき、ユビキチン化酵素の立体構造を変化させる物質を特定することができる。分子動力学シミュレーションとしては、例えば、ｍｙＰｒｅｓｔｏ等が挙げられる。
例えば、ユビキチン化酵素の結合に関連する部位（結合部位など）を特定し、当該特定された部位の情報（例えば、形状、構造、化学的性質など）に基づいて、結合阻害物質を設計してもよい。
このような方法において、ユビキチン化酵素の結合に関連する部位の特定方法としては、特に限定されず、慣用の方法を利用できる。例えば、ユビキチン化酵素のアミノ酸配列（例えば、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０又は３３）又はユビキチン化酵素の標的タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４又は５７）をもとにタンパク質の三次元の立体構造を推定するために、公知のソフトウェア(例えば、分子シミュレーション用ソフト)等を利用してユビキチン化酵素側又はユビキチン化酵素の標的タンパク質側の結合部位を特定してもよい。分子シミュレーション用ソフトとしては、例えば、ＳＷＩＳＳ－ｍｏｄｅｌ（http://swissmodel.expasy.org）、ｍｙＰｒｅｓｔｏ（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｌｙ Ｙｉｅｌｄｉｎｇ ＰＲｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＳｉｍｕｌａＴＯｒ）、ＰＡＬＬＡＳ、ＭＵＳＥＳ等が挙げられる。ＰＡＬＬＡＳは、Ｘ線解析・ＮＭＲ・分子動力学シミュレーションなどによって得られたタンパク質構造アンサンブルの中からドッキングに適した２～３個のタンパク質構造セットを選択することができる。ＭＵＳＥＳは、高精度活性判別システムであって、ＰＡＬＬＡＳによって選択した化合物から、活性化合物と不活性化合物を判別することができる。
また、ユビキチン化酵素の立体構造を変化させる物質は、特に限定されるものではないが、例えば、分子動力学シミュレーション等によって、特定してもよい。分子動力学シミュレーションを用いることにより、例えば、物質との結合又は相互作用前後のユビキチン化酵素の立体構造変化を推定でき、ユビキチン化酵素の立体構造を変化させる物質を特定することができる。分子動力学シミュレーションとしては、例えば、ｍｙＰｒｅｓｔｏ等が挙げられる。
【0029】
（ユビキチン化酵素タンパク質の一部）
ユビキチン化酵素タンパク質の一部は、例えば、ユビキチン化酵素と標的タンパク質との相互作用を阻害するドミナントネガティブとしての機能などを有していてもよい。ユビキチン化酵素タンパク質の一部としては、ユビキチン化の活性に関わる領域を含まないＫｌｈｌ１８タンパク質、標的タンパク質結合領域であるＫｌｈｌ１８タンパク質の一部を含み、ユビキチン化の活性に関わる領域を含まないＫｌｈｌ１８タンパク質等が挙げられ、Ｋｌｈｌ１８タンパク質のＣ末端側２９８残基を一部に含み全長でないタンパク質、Ｋｌｈｌ１８タンパク質のＣ末端側２９８残基、Ｋｌｈｌ１８タンパク質のＣ末端側２９８残基中に存在し、ユビキチン化酵素を阻害又は抑制する能力を有する部位等が挙げられる。
ユビキチン化酵素タンパク質の一部は、例えば、ユビキチン化酵素と標的タンパク質との相互作用を阻害するドミナントネガティブとしての機能などを有していてもよい。ユビキチン化酵素タンパク質の一部としては、ユビキチン化の活性に関わる領域を含まないＫｌｈｌ１８タンパク質、標的タンパク質結合領域であるＫｌｈｌ１８タンパク質の一部を含み、ユビキチン化の活性に関わる領域を含まないＫｌｈｌ１８タンパク質等が挙げられ、Ｋｌｈｌ１８タンパク質のＣ末端側２９８残基を一部に含み全長でないタンパク質、Ｋｌｈｌ１８タンパク質のＣ末端側２９８残基、Ｋｌｈｌ１８タンパク質のＣ末端側２９８残基中に存在し、ユビキチン化酵素を阻害又は抑制する能力を有する部位等が挙げられる。
【0030】
（プロテアソーム阻害剤）
プロテアソーム阻害剤としては、例えば、ＭＧ－１３２、ボルテゾミブ、ジスルフィラム、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、サリノスポラミドＡ、カーフィルゾミブ、ラクタシスチン、ＴＭＣ－９５、ペプチドアルデヒド、ペプチド性ケトアミド、ケトアルデヒド、ペプチド性エポキシケトン、ペプチドホウ酸、それらの薬学的に許容される塩等が挙げられる。
プロテアソーム阻害剤としては、例えば、ＭＧ－１３２、ボルテゾミブ、ジスルフィラム、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、サリノスポラミドＡ、カーフィルゾミブ、ラクタシスチン、ＴＭＣ－９５、ペプチドアルデヒド、ペプチド性ケトアミド、ケトアルデヒド、ペプチド性エポキシケトン、ペプチドホウ酸、それらの薬学的に許容される塩等が挙げられる。
【0031】
（抗体）
抗体としては、ユビキチン化酵素を認識するものであればよい。例えば、アンタゴニスト性である抗体、すなわち、ユビキチン化酵素の機能の１又は２以上を阻害する抗体、並びにアゴニスト抗体等が挙げられる。また、ヒト抗体、非ヒト抗体、非ヒト抗体のヒト化抗体等の形態であってもよい。これらの抗体は、市販されているもの、自ら作製したもの等であってもよい。抗体を作製するために、ユビキチン化酵素ポリペプチド又はペプチド（ユビキチン化酵素の抗原性フラグメント）を、別の分子に結合させるか、又はアジュバントとともに投与等して作製してもよい。コード配列は、免疫原をインビボで発現させることができる発現カセット又はベクターの一部であってもよい（例えば、Ｋａｔｓｕｍｉ（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１３３５－９を参照のこと）。ポリクローナル又はモノクローナル抗体を生成する方法は、当業者に公知であり、科学文献及び特許文献等に記載された方法等の公知の方法又は自体公知の方法等を使用してもよい。
抗体としては、ユビキチン化酵素を認識するものであればよい。例えば、アンタゴニスト性である抗体、すなわち、ユビキチン化酵素の機能の１又は２以上を阻害する抗体、並びにアゴニスト抗体等が挙げられる。また、ヒト抗体、非ヒト抗体、非ヒト抗体のヒト化抗体等の形態であってもよい。これらの抗体は、市販されているもの、自ら作製したもの等であってもよい。抗体を作製するために、ユビキチン化酵素ポリペプチド又はペプチド（ユビキチン化酵素の抗原性フラグメント）を、別の分子に結合させるか、又はアジュバントとともに投与等して作製してもよい。コード配列は、免疫原をインビボで発現させることができる発現カセット又はベクターの一部であってもよい（例えば、Ｋａｔｓｕｍｉ（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１３３５－９を参照のこと）。ポリクローナル又はモノクローナル抗体を生成する方法は、当業者に公知であり、科学文献及び特許文献等に記載された方法等の公知の方法又は自体公知の方法等を使用してもよい。
【0032】
ヒト抗体は、例えば、米国特許第５，８７７，３９７号；同第５，８７４，２９９号；同第５，７８９，６５０号；および同第５，９３９，５９８号によって記載されるように、ヒト抗体のみを産生するように操作されたマウスにおいて作製することができる。これらのマウス由来のＢ細胞は、モノクローナルヒト抗体産生細胞を産生するために、標準的な技術を用いて（例えば、ミエローマ等の不死化細胞株と融合させることによって、または、細胞株を永続化させる他の技術によってかかるＢ細胞を操作することによって）不死化することができる（例えば、米国特許第５，９１６，７７１号および同第５，９８５，６１５号を参照のこと）。抗体はまた、伝統的な動物を用いるインビボ方法に加えて、インビトロで、例えば、組み換え抗体結合部位を発現するファージディスプレイライブラリーを用いて、作製することもできる。
【0033】
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」の形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、超可変領域が所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類等の非ヒト種の超可変領域からの残基によって置換されるヒト免疫グロブリンである。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、ヒト抗体又は非ヒト抗体では見られない残基を含む場合がある。これらの修飾は、抗体の能力を更に改善するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、これらのドメインでは、超可変ループの全て又は実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのループに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、一般的にはヒト免疫グロブリンの定常領域を含み、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む。ヒト化技術の例については、例えば、参考として本明細書で援用される、Ｑｕｅｅｎら、の米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号；同第５，６９３，７６２号；及び同第６，１８０，３７０号に記載されている。
【0034】
完全なモノクローナルおよびポリクローナル抗体に加えて、多様な遺伝子操作抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓＦｖフラグメント）、ならびに抗原結合機能および親抗体の特異性を保持する他のフラグメントを、標準的な方法を用いて作製することができる。例えば、モノクローナル抗体の短縮バージョンは、所望のモノクローナル抗体フラグメントを好適な宿主において発現するプラスミドを作製する組み換え方法によって生成することができる。Ｌａｄｎｅｒ（米国特許第４，９４６，７７８号および同第４，７０４，６９２号)は、シグナルポリペプチド鎖抗体を生成するための方法を記載する。
【0035】
本明細書において、「抗原性フラグメント」とは、１または２以上のエピトープを含むポリペプチドの一部を指す。エピトープは、基本的に抗原からの直鎖配列を含む直線的なものであっても、他の配列によって遺伝子的に分離されているがポリペプチドリガンドに対する結合部位においては構造的に一体化する配列を含む立体構造的なものであってもよい。「抗原性フラグメント」は、５０００、１０００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、２５、２０、１０または５アミノ酸長までのいずれであってもよい。
【0036】
本明細書において、用語「フラグメント」とは、ペプチドまたはポリペプチドであって、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の、少なくとも５個の近接するアミノ酸残基、少なくとも１０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも１５個の近接するアミノ酸残基、少なくとも２０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも２５個の近接するアミノ酸残基、少なくとも４０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも５０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも６０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも７０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも８０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも９０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも１００個の近接するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の近接するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の近接するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の近接するアミノ酸残基、少なくとも２００個の近接するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の近接するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むものを指す。
【0037】
特定の態様において、タンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも一つの機能を保持する。別の態様において、タンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、タンパク質またはポリペプチドのフラグメントの少なくとも１、２、３、４、または５つの機能を保持する。好ましくは、抗体のフラグメントは、抗原に対して特異的に結合する能力を保持する。
【0038】
（ｓｉＲＮＡ）
ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、約２０塩基又はそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、細胞内に導入することにより標的となる遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ複合体が形成され、この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。本発明におけるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こしユビキチン化酵素遺伝子からのタンパク質の生成を阻害することができるものであれば特に限定されないが、例えば、人工的に化学合成されるか又は生化学的に合成されたもの、生物体内で合成されたもの、又は約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖RNAが挙げられる。ｓｉＲＮＡの配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致していることが好ましいが、切断活性が残存している限り１００％一致していないものであってもよい。
ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）は、約２０塩基又はそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、細胞内に導入することにより標的となる遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ複合体が形成され、この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。本発明におけるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こしユビキチン化酵素遺伝子からのタンパク質の生成を阻害することができるものであれば特に限定されないが、例えば、人工的に化学合成されるか又は生化学的に合成されたもの、生物体内で合成されたもの、又は約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖RNAが挙げられる。ｓｉＲＮＡの配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致していることが好ましいが、切断活性が残存している限り１００％一致していないものであってもよい。
【0039】
ｓｉＲＮＡは、公知の方法又は自体公知の方法により設計し、調製することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから取得したユビキチン化酵素の配列情報に基づいて、ｍＲＮＡ上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０～約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０～約７０℃で約１～約８時間アニーリングさせることにより調製してもよいし、ｓｉＲＮＡの前駆体となるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を合成し、これを、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）を用いて切断することにより調製してもよい。
【0040】
（ｓｈＲＮＡ）
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことである。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約20塩基の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。本発明におけるｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こしＫｌｈｌ１８遺伝子からのタンパク質の生成を阻害することができるものであれば特に限定されないが、３’突出末端を有していることが好ましく、二本鎖部分の長さは約１０ヌクレオチド以上が好ましく、約２０ヌクレオチド以上がより好ましい。
ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子のことである。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約20塩基の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことができる。本発明におけるｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こしＫｌｈｌ１８遺伝子からのタンパク質の生成を阻害することができるものであれば特に限定されないが、３’突出末端を有していることが好ましく、二本鎖部分の長さは約１０ヌクレオチド以上が好ましく、約２０ヌクレオチド以上がより好ましい。
【0041】
ｓｈＲＮＡは、公知の方法又は自体公知の方法により設計し、調製することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから取得したユビキチン化酵素の配列情報に基づいて、ｍＲＮＡ上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖に対して適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば５～２５塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴＲＮＡをデザインし、これをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成することにより調製してもよい。
【0042】
本明細書においては、生体内でユビキチン化酵素遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、ユビキチン化酵素遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、例えば、上記したｓｈＲＮＡやｓｉＲＮＡを発現するように構築された発現ベクター等が挙げられる。ｓｈＲＮＡを発現するベクターには、例えば、タンデムタイプとステムループ（ヘアピン）タイプとがある。前者はｓｉＲＮＡのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより２本鎖のｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成するというものである。一方、後者はｓｈＲＮＡの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でｓｈＲＮＡが発現しｄｉｃｅｒによるプロセシングを受けてｄｓＲＮＡを形成するというものである。プロモーターとしては、例えば、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、マウスおよびヒトのＵ６－ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトＨ１－ＲＮａｓｅＰＲＮＡプロモーター、ヒトバリン－ｔＲＮＡプロモーター等が挙げられる。また、転写終結シグナルとしては、例えば、４個以上Ｔが連続した配列を用いてもよい。
【0043】
上記のようにして構築したｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡ発現カセットを、次いでプラスミドベクターやウイルスベクター等に挿入して用いてもよい。このようなベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド等が挙げられる。
【0044】
（ｄｓＲＮＡ）
ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）は、細胞内で変換されてｓｉＲＮＡを生成する分子のことを意味する。従って、本発明においては上記ｓｉＲＮＡを生成するｄｓＲＮＡを使用しても良い。本発明におけるｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こしユビキチン化酵素遺伝子からのタンパク質の生成を阻害することができるものであれば特に限定されないが、ｄｓＲＮＡの配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ＲＮＡｉによる切断活性が残存する限り、必ずしも１００％一致していないものであってもよい。
ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）は、細胞内で変換されてｓｉＲＮＡを生成する分子のことを意味する。従って、本発明においては上記ｓｉＲＮＡを生成するｄｓＲＮＡを使用しても良い。本発明におけるｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こしユビキチン化酵素遺伝子からのタンパク質の生成を阻害することができるものであれば特に限定されないが、ｄｓＲＮＡの配列と、標的として切断するｍＲＮＡの配列とは１００％一致することが好ましい。しかし、ＲＮＡｉによる切断活性が残存する限り、必ずしも１００％一致していないものであってもよい。
【0045】
ｄｓＲＮＡは、公知の方法又は自体公知の方法により設計し、調製することができる。
【0046】
（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、遺伝子発現を調節し、全長１０～５０個ヌクレオチド、好ましくは、１５～４０個ヌクレオチド、より好ましくは、１７～２５個ヌクレオチドで構成された一本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、細胞内で発現されないオリゴヌクレオチドであって、短いステム－ループ構造を有する。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、１又は２以上のｍＲＮＡと全体又は部分的に相同性を有することが好ましいが、前記ｍＲＮＡと相補的な結合を通じてターゲット遺伝子発現を抑制させるものであれば特に限定されない。
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、遺伝子発現を調節し、全長１０～５０個ヌクレオチド、好ましくは、１５～４０個ヌクレオチド、より好ましくは、１７～２５個ヌクレオチドで構成された一本鎖ＲＮＡ分子を意味する。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、細胞内で発現されないオリゴヌクレオチドであって、短いステム－ループ構造を有する。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、１又は２以上のｍＲＮＡと全体又は部分的に相同性を有することが好ましいが、前記ｍＲＮＡと相補的な結合を通じてターゲット遺伝子発現を抑制させるものであれば特に限定されない。
【0047】
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、公知の方法又は自体公知の方法により設計し、調製することができる。例えば、上述のｓｉＲＮＡについて記載した方法に準じて調製してもよい。
【0048】
（アンチセンスポリヌクレオチド）
アンチセンスポリヌクレオチドは、ユビキチン化酵素遺伝子からのタンパク質の生成を阻害することができるものであれば良く、例えば、ユビキチン化酵素遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５～１００の塩基配列に対しハイブリダイズできるものである。また、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても良く、修飾されたものであっても良い。アンチセンスポリヌクレオチドの塩基数は、好ましくは５～５０、より好ましくは９～２５である。
アンチセンスポリヌクレオチドは、ユビキチン化酵素遺伝子からのタンパク質の生成を阻害することができるものであれば良く、例えば、ユビキチン化酵素遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５～１００の塩基配列に対しハイブリダイズできるものである。また、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても良く、修飾されたものであっても良い。アンチセンスポリヌクレオチドの塩基数は、好ましくは５～５０、より好ましくは９～２５である。
【0049】
アンチセンスポリヌクレオチドは、公知の方法又は自体公知の方法により設計し、調製することができる。
【0050】
（アプタマー）
アプタマーは、特定の分子標的に特異的に結合する核酸分子やペプチドを意味する。本発明では、ユビキチン化酵素の活性や発現を抑制させるものであれば特に限定されない。
アプタマーは、特定の分子標的に特異的に結合する核酸分子やペプチドを意味する。本発明では、ユビキチン化酵素の活性や発現を抑制させるものであれば特に限定されない。
【0051】
（遺伝子ターゲティング用物質）
遺伝子ターゲティングは、内在性の遺伝子の改変に相同組換え等を用いて、遺伝子の削除、遺伝子の導入、点変異の導入等を行うことができる。遺伝子ターゲティング方法としては、例えば、ゲノム編集等が挙げられる。ゲノム編集によれば、目的ゲノム領域のヌクレオチドを特異的に変更すること（削除、置換、挿入）ができる。より具体的には、ゲノム編集は、ゲノム領域の特定部位、例えば特定の遺伝子座において二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ：ＤＳＢ）し、目的のゲノム領域と相同なＤＮＡ配列を単離後、改変を加えて細胞へ導入し、ゲノム配列と外来性相同配列との間で生じる組換えを利用してゲノムを改変することができる。
遺伝子ターゲティング用物質は、ゲノム配列を改変することができるものであればよく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等であってもよい。遺伝子ターゲティング用物質の態様は、ゲノム配列を改変することができる限り、特に限定されるものでなく、例えば、遺伝子ターゲティング用ベクター（プラスミド）であってもよいし、ウイルスのＤＮＡ、ＲＮＡ又はその一部等であってもよい。ゲノム編集の遺伝子ターゲティング用ベクター（プラスミド）は、例えば、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子（ゲノム配列）を改変してユビキチン化を阻害又は抑制できるものであってもよく、ユビキチン化酵素と相互作用してユビキチン化に関係するタンパク質などのゲノム配列を改変してユビキチン化を阻害又は抑制できるもの等であってもよい。遺伝子ターゲティング用物質を含むウイルスは、ゲノム配列を改変することができる限り、特に限定されず、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス等であってもよい。
遺伝子ターゲティングは、内在性の遺伝子の改変に相同組換え等を用いて、遺伝子の削除、遺伝子の導入、点変異の導入等を行うことができる。遺伝子ターゲティング方法としては、例えば、ゲノム編集等が挙げられる。ゲノム編集によれば、目的ゲノム領域のヌクレオチドを特異的に変更すること（削除、置換、挿入）ができる。より具体的には、ゲノム編集は、ゲノム領域の特定部位、例えば特定の遺伝子座において二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ：ＤＳＢ）し、目的のゲノム領域と相同なＤＮＡ配列を単離後、改変を加えて細胞へ導入し、ゲノム配列と外来性相同配列との間で生じる組換えを利用してゲノムを改変することができる。
遺伝子ターゲティング用物質は、ゲノム配列を改変することができるものであればよく、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等であってもよい。遺伝子ターゲティング用物質の態様は、ゲノム配列を改変することができる限り、特に限定されるものでなく、例えば、遺伝子ターゲティング用ベクター（プラスミド）であってもよいし、ウイルスのＤＮＡ、ＲＮＡ又はその一部等であってもよい。ゲノム編集の遺伝子ターゲティング用ベクター（プラスミド）は、例えば、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子（ゲノム配列）を改変してユビキチン化を阻害又は抑制できるものであってもよく、ユビキチン化酵素と相互作用してユビキチン化に関係するタンパク質などのゲノム配列を改変してユビキチン化を阻害又は抑制できるもの等であってもよい。遺伝子ターゲティング用物質を含むウイルスは、ゲノム配列を改変することができる限り、特に限定されず、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス等であってもよい。
【0052】
ゲノム編集としては、特に限定されないが、例えば、公知又は自体公知のゲノム編集を用いてもよい。公知又は自体公知のゲノム編集としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ９）等のシステムが挙げられる。
【0053】
遺伝子ターゲティング用物質は、公知又は自体公知の方法により設計し、作製することができる。また、遺伝子ターゲティング用物質は、公知又は自体公知の方法により、生体、培養細胞などに導入することができる。
【0054】
（ユビキチン化複合体タンパク質の活性阻害物質）
ユビキチン化複合体タンパク質の活性阻害物質としては、例えば、ユビキチン化複合体を構成するタンパク質の活性を阻害する物質等が挙げられる。ユビキチン化複合体を構成するタンパク質の活性を阻害する物質としては、例えば、Ｃｕｌｌｉｎ３タンパク質の活性を阻害する、ＭＬＮ４９２４、ＤＩ－５９１；Ｃｕｌｌｉｎ２，３，４Ａタンパク質の活性を阻害するＳｕｒａｍｉｎ、Ｅ１ユビキチン リガーゼのインヒビターＰＹＲ－４１等が挙げられる。
ユビキチン化複合体タンパク質の活性阻害物質としては、例えば、ユビキチン化複合体を構成するタンパク質の活性を阻害する物質等が挙げられる。ユビキチン化複合体を構成するタンパク質の活性を阻害する物質としては、例えば、Ｃｕｌｌｉｎ３タンパク質の活性を阻害する、ＭＬＮ４９２４、ＤＩ－５９１；Ｃｕｌｌｉｎ２，３，４Ａタンパク質の活性を阻害するＳｕｒａｍｉｎ、Ｅ１ユビキチン リガーゼのインヒビターＰＹＲ－４１等が挙げられる。
【0055】
ユビキチン化複合体タンパク質を構成するタンパク質としては、例えば、Ｃｕｌｌｉｎ１，２，３，４Ａ，４Ｂ，５，７，９、ＲＯＣ１タンパク質、Ｅ１ユビキチン リガーゼ、Ｅ２ユビキチン リガーゼ、ユビキチンタンパク質等が挙げられる。
【0056】
（ユビキチン化酵素のユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質）
ユビキチン化酵素のユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質としては、例えば、ユビキチン化酵素の標的タンパク質、ユビキチン化酵素の標的タンパク質をコードする遺伝子及びユビキチン化酵素の標的タンパク質の発現を誘導又は促進する物質等が挙げられる。ユビキチン化酵素の標的タンパク質としては、例えば、標的タンパク質の全長、標的タンパク質の一部等が挙げられ、標的タンパク質の一部としては、標的タンパク質においてユビキチン化される領域を含む一部のタンパク質等が挙げられる。この標的タンパク質としては、例えば、本願明細書の段落［００１８］に記載のもの等が挙げられる。
ユビキチン化酵素のユビキチン化そのものを阻害又は抑制する物質としては、例えば、ユビキチン化酵素の標的タンパク質、ユビキチン化酵素の標的タンパク質をコードする遺伝子及びユビキチン化酵素の標的タンパク質の発現を誘導又は促進する物質等が挙げられる。ユビキチン化酵素の標的タンパク質としては、例えば、標的タンパク質の全長、標的タンパク質の一部等が挙げられ、標的タンパク質の一部としては、標的タンパク質においてユビキチン化される領域を含む一部のタンパク質等が挙げられる。この標的タンパク質としては、例えば、本願明細書の段落［００１８］に記載のもの等が挙げられる。
【0057】
［光受容に関連する症状及び剤の具体的用途］
本発明の剤は、前記のように、光受容感度（光感度）を抑制又は低減するという機能を有する。そのため、当該機能に関係又は関連する症状の改善や予防に有効である。具体的には、光受容感度の制御は、光受容の根幹（始点）をなすものであるから、光受容感度を抑制又は低減することで、光受容（光受容全体）に関連する症状を改善又は予防することができる。例えば、光受容感度を抑制又は低減することで、直接的に光受容を調節する機能（例えば、明順応、暗順応）などを抑制又は阻害することができるし、さらにそれ以降の一連の光受容機能（例えば、光刺激をシグナルに変換する機能、変換されたシグナルを細胞に伝える機能、変換されたシグナルを脳に伝える機能など）を抑制又は阻害することもできる。
なお、光受容に関連する症状（症状（Ｂ）などということがある）は、光受容により影響を受ける症状であればよく、代表的には、光受容により進行又は悪化する症状であってもよい。
このような症状は、光受容により影響を受ける症状であれば、その発生（発症）原因は特に限定されず、必ずしも光受容に起因するものである必要はない。例えば、網膜変性は、光受容によりその症状が悪化ないし進行するものの、その発生原因は、光受容によらないものもある。本発明では、このような光受容によらない症状の改善又は予防も対象とする。
本発明の剤は、前記のように、光受容感度（光感度）を抑制又は低減するという機能を有する。そのため、当該機能に関係又は関連する症状の改善や予防に有効である。具体的には、光受容感度の制御は、光受容の根幹（始点）をなすものであるから、光受容感度を抑制又は低減することで、光受容（光受容全体）に関連する症状を改善又は予防することができる。例えば、光受容感度を抑制又は低減することで、直接的に光受容を調節する機能（例えば、明順応、暗順応）などを抑制又は阻害することができるし、さらにそれ以降の一連の光受容機能（例えば、光刺激をシグナルに変換する機能、変換されたシグナルを細胞に伝える機能、変換されたシグナルを脳に伝える機能など）を抑制又は阻害することもできる。
なお、光受容に関連する症状（症状（Ｂ）などということがある）は、光受容により影響を受ける症状であればよく、代表的には、光受容により進行又は悪化する症状であってもよい。
このような症状は、光受容により影響を受ける症状であれば、その発生（発症）原因は特に限定されず、必ずしも光受容に起因するものである必要はない。例えば、網膜変性は、光受容によりその症状が悪化ないし進行するものの、その発生原因は、光受容によらないものもある。本発明では、このような光受容によらない症状の改善又は予防も対象とする。
【0058】
症状（Ｂ）は、例えば、網膜における症状であってもよく、網膜を介して発生する症状等であってもよい。網膜を介して発生する症状は、例えば、脳における症状等であってもよい。網膜において発生する症状は、例えば、日常生活において受ける光刺激又は光ストレスが原因となる症状であってもよく、強い光を浴びることが原因となる症状等であってもよい。網膜を介した脳における症状は、例えば、感覚過敏が原因となる症状等であってもよい。
【0059】
具体的には、本発明の剤は、例えば、網膜保護剤［例えば、網膜の状態及び／又は機能を維持又は保持するための剤（例えば、網膜障害、光照射誘導性の網膜変性による視力低下、視野狭窄、失明等の網膜障害、光照射による眼精疲労等を予防又は軽減する剤等）］、網膜変性抑制剤（例えば、網膜細胞の変性を防ぐ又は網膜細胞を変性から保護するための剤）、網膜老化抑制剤（例えば、網膜細胞における傷害の蓄積を抑制するための剤）、感覚過敏の改善剤又は抑制剤（例えば、光刺激に対する感覚過敏により引き起こされ、又は悪化する症状を改善又は抑制するための剤）、光誘発性疾患の改善剤又は予防剤（例えば、光刺激により発症する疾患を改善又は予防するための剤）、光誘発性障害の改善剤又は予防剤（光刺激により誘発される障害を改善又は予防するための剤）等として用いてもよい。
【0060】
より具体的には、本発明の剤は、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病（若年性黄斑変性）、錐体桿体ジストロフィー、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、網膜虚血、光過敏性発作、光感受性てんかん、光線黄斑症、眼精疲労、網膜機能低下（例えば、老化によるもの等）、睡眠障害、片頭痛、光障害（例えば、屋外明所での活動、スポーツ、登山、コンピュータディスプレイ等から発せられる青色光等による光障害）、感覚過敏又は視覚認知障害を伴う精神疾患［例えば、鬱病、抑鬱状態、双極障害（躁鬱病）、自閉症、精神発達障害、統合失調症等］等の改善又は予防のために使用してもよい。
前記記載から光受容感度を抑制することで、上記疾患又は症状を改善又は予防できることは明らかであるが、例えば、ヒト網膜色素変性症の原因遺伝子として知られるＲＰＥ６５遺伝子又はＳａｇ（Ａｒｒｅｓｔｉｎ）遺伝子を欠損させたマウスは、遺伝性の網膜色素変性症モデルマウスとして視細胞の変性が見られる。ここでＲＰＥ６５遺伝子の欠損による視細胞の変性は、ビタミンＡ代謝異常によるものであり、一方、Ｓａｇ遺伝子の欠損による視細胞の変性は、視細胞の光受容反応の異常によるものであり、それぞれの遺伝子欠損による視細胞変性の機序は異なる。またトランスデューシンの１つであるＧｎａｔ１遺伝子を欠損させたマウスは、光受容感度抑制マウスとして知られている。前述のＲＰＥ６５遺伝子欠損マウス又はＳａｇ遺伝子欠損マウスにＧｎａｔ１遺伝子欠損マウスを掛け合わせると、ＲＰＥ６５遺伝子欠損又はＳａｇ遺伝子欠損による遺伝性の網膜変性が抑制されることが報告されている（BioEssays. 2006, 28: 344-354; Nat. Genet., 2002, 32, 254-260）。これらの報告は、本発明の剤が上記疾患又は症状の改善又は予防のために使用できることの理解を助けるものである。
前記記載から光受容感度を抑制することで、上記疾患又は症状を改善又は予防できることは明らかであるが、例えば、ヒト網膜色素変性症の原因遺伝子として知られるＲＰＥ６５遺伝子又はＳａｇ（Ａｒｒｅｓｔｉｎ）遺伝子を欠損させたマウスは、遺伝性の網膜色素変性症モデルマウスとして視細胞の変性が見られる。ここでＲＰＥ６５遺伝子の欠損による視細胞の変性は、ビタミンＡ代謝異常によるものであり、一方、Ｓａｇ遺伝子の欠損による視細胞の変性は、視細胞の光受容反応の異常によるものであり、それぞれの遺伝子欠損による視細胞変性の機序は異なる。またトランスデューシンの１つであるＧｎａｔ１遺伝子を欠損させたマウスは、光受容感度抑制マウスとして知られている。前述のＲＰＥ６５遺伝子欠損マウス又はＳａｇ遺伝子欠損マウスにＧｎａｔ１遺伝子欠損マウスを掛け合わせると、ＲＰＥ６５遺伝子欠損又はＳａｇ遺伝子欠損による遺伝性の網膜変性が抑制されることが報告されている（BioEssays. 2006, 28: 344-354; Nat. Genet., 2002, 32, 254-260）。これらの報告は、本発明の剤が上記疾患又は症状の改善又は予防のために使用できることの理解を助けるものである。
【0061】
［他の成分等］
本発明の剤は、ユビキチン化を阻害又は抑制する物質を含んでいればよく、物質（Ａ）の種類、剤形、投与形態や所望の薬効等に応じて、適宜、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、他の薬理活性成分、担体、添加剤（防腐剤、界面活性剤、安定剤、等張化剤、ｐＨ調整剤など）などが挙げられる。他の成分は、単独で又は２種以上組み合わせてもよい。
本発明の剤は、ユビキチン化を阻害又は抑制する物質を含んでいればよく、物質（Ａ）の種類、剤形、投与形態や所望の薬効等に応じて、適宜、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、他の薬理活性成分、担体、添加剤（防腐剤、界面活性剤、安定剤、等張化剤、ｐＨ調整剤など）などが挙げられる。他の成分は、単独で又は２種以上組み合わせてもよい。
【0062】
［投与方法、剤形等］
本発明の剤又は物質（Ａ）の投与形態（又は剤形）は、光受容に関連する症状の改善又は予防機能を発現できる限り特に限定されず、例えば、経口又は非経口投与（剤）などであってもよい。
非経口剤としては、注射剤（例えば、眼内注射剤、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点眼剤、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）等が挙げられる。経口剤としては、例えば、ユビキチン化酵素を阻害又は抑制する物質を、薬学的に許容される担体と混合して調製した、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等の固形剤；水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等の液剤；例えばゼリー状製剤等の半固形製剤等が挙げられる。
本発明の剤又は物質（Ａ）の投与形態（又は剤形）は、光受容に関連する症状の改善又は予防機能を発現できる限り特に限定されず、例えば、経口又は非経口投与（剤）などであってもよい。
非経口剤としては、注射剤（例えば、眼内注射剤、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点眼剤、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）等が挙げられる。経口剤としては、例えば、ユビキチン化酵素を阻害又は抑制する物質を、薬学的に許容される担体と混合して調製した、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等の固形剤；水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等の液剤；例えばゼリー状製剤等の半固形製剤等が挙げられる。
【0063】
特に、本発明の剤又は物質（Ａ）は、網膜のユビキチン化を効率よく阻害又は抑制できる態様で適用するのが好ましい。このような観点から、本発明の剤は、注射剤（眼内注射剤、硝子体注入）、点眼剤（眼科組成物）などの形態であるのが好ましく、眼内注射、点眼などにより投与するのが好ましい。
【0064】
このように、本発明の剤又は物質（Ａ）は、各種態様の剤（組成物、医薬組成物）を構成する。そのため、本発明には、前記剤（又は物質）を含む組成物［例えば、注射用組成物、眼科組成物（点眼用組成物）など］も含まれる。
【0065】
また、本発明の剤又は物質（Ａ）は、食品の分野で使用されうる。すなわち、本発明の剤（又は物質（Ａ））は、食品用添加剤であってもよい。このような食品用添加剤は、食品を構成する。そのため、本発明には、前記剤（又は物質（Ａ））を含む食品（食品組成物）も含まれる。
【0066】
食品としては、例えば、栄養補助食品、バランス栄養食品、健康食品、栄養機能食品、特定保健用食品、病者用食品等の飲食品が挙げられる。これらの食品の製造方法は、光受容に関連する症状の改善又は予防機能を得られる食品が発揮できるのであれば特に限定されない。当該食品の好適な具体例として、粉末、顆粒、カプセル、錠剤等の形態を有するサプリメントが例示される。また、上記形態以外にも、当該食品としては、ガム、キャンディー、グミ、錠菓、クッキー、ケーキ、チョコレート、アイスクリーム、ゼリー、ムース、プリン、ビスケット、コーンフレーク、チュアブルタブレット、ウエハース、煎餅等の菓子類；炭酸飲料、清涼飲料、乳飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、果汁飲料、栄養飲料、アルコール飲料、ミネラルウォーター等の飲料類；粉末ジュース，粉末スープ等の粉末飲料；ドレッシング、ソース等の調味料；パン類；麺類；かまぼこ等の練り製品；ふりかけ等があげられる。また、経口摂取用の形態以外に、経管摂取用（流動食等）の形態としてもよい。
【0067】
本発明の食品における剤の含有割合については、対象者の年齢、性別、健康状態、その他の条件等により適宜選択できる適用量や食品の形態等に応じて適宜調節することができる。また、本発明の剤による改善又は予防効果をより効果的に発現させるために、剤を多く含む食品として提供してもよい。
【0068】
本発明において、剤を投与する対象となる動物としては、ヒト、非ヒト動物のいずれであってもよく、特に限定されないが、例えば、哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー、ゴリラ等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ニワトリ、アヒル、ガチョウ等の鳥類等が挙げられる。哺乳動物は、好ましくは霊長類（ヒト等）又はペットであり、より好ましくはヒト、イヌ又はネコであり、さらに好ましくはヒトである。
【0069】
本発明の剤又は物質（Ａ）の投与量（又は摂取量）は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート、投与間隔等によっても異なる。例えば、一回量として物質（Ａ）が、約０．０００１ｍｇ～約１００ｇ程度、約０．００１ｍｇ～約５０ｇ程度、約０．０１ｍｇ～約１０ｇ程度、約０．１ｍｇ～約１ｇ程度等含まれていてもよい。抗体は、投与対象（例えば、霊長類）、投与ルート（例えば、硝子体への投与）等にもよるが、例えば、一回量として抗体が、約０．０１ｍｇ～約１００ｍｇ程度、約０．１ｍｇ～約５０ｍｇ程度、約１ｍｇ～約２０ｍｇ程度、約１．５ｍｇ～約１０ｍｇ程度等含まれていてもよい。また、プロテアソーム阻害剤は、投与対象（例えば、ペット）、投与ルート（例えば、硝子体への投与）等にもよるが、例えば、一回量としてプロテアソーム阻害剤が、約０．００１ｍｇ～約１０ｍｇ程度、約０．０１ｍｇ～約１ｍｇ程度、約０．０５ｍｇ～約０．５ｍｇ程度、約０．０７ｍｇ～約０．１ｍｇ程度等含まれていてもよい。
抗体の投与間隔は、投与対象（例えば、霊長類）、投与ルート（例えば、硝子体への投与）等にもよるが、例えば、抗体を１ヶ月ごとに１回の投与を連続して３回行ってもよく、２ヶ月ごとに１回の投与を行う等してもよい。プロテアソーム阻害剤の投与間隔は、投与対象（例えば、ペット）、投与ルート（例えば、硝子体への投与）等にもよるが、例えば、プロテアソーム阻害剤を毎日投与してもよいし、数日ごとに投与してもよいし、数週間ごとに投与等してもよい。
抗体の投与間隔は、投与対象（例えば、霊長類）、投与ルート（例えば、硝子体への投与）等にもよるが、例えば、抗体を１ヶ月ごとに１回の投与を連続して３回行ってもよく、２ヶ月ごとに１回の投与を行う等してもよい。プロテアソーム阻害剤の投与間隔は、投与対象（例えば、ペット）、投与ルート（例えば、硝子体への投与）等にもよるが、例えば、プロテアソーム阻害剤を毎日投与してもよいし、数日ごとに投与してもよいし、数週間ごとに投与等してもよい。
【0070】
本発明の剤又は物質（Ａ）の投与環境は、網膜のユビキチン化を効率よく阻害又は抑制できる態様であれば特に制限されるものでなく、暗い環境（暗所）又は明るい環境（明所）のどちらの環境であってもよい。Ｋｌｈｌ１８のユビキチン化をより抑制させる目的から、明るい環境（明所）において投与されるのが好ましい。
【0071】
本発明の剤又は物質（Ａ）の投与環境において、明るい環境（明所）における照度は、例えば、３００ ｌｕｘ以上、５００ ｌｕｘ以上、８００ ｌｕｘ以上、１，０００ ｌｕｘ以上等であれば特に限定されるものではないが、上限を設けるのであれば、例えば、１，０００，０００ ｌｕｘ以下、２００，０００ ｌｕｘ以下等が挙げられる。暗い環境（暗所）における照度は、例えば、０ ｌｕｘ以上３００ ｌｕｘ未満、０ ｌｕｘ以上２００ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上１００ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上５０ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上１０ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上８ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上５ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上３ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上１ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上０．５ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上０．１ ｌｕｘ以下等が挙げられる。
【0072】
［阻害評価］
ユビキチン化を阻害又は抑制する程度は、例えば、培養細胞を用いた強制発現実験、ＦＲＥＴ法等のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の実験などで評価又は判断してもよい。培養細胞を用いた強制発現実験により評価又は判断する場合は、例えば、２０～１００％の範囲でユビキチン化を阻害又は抑制できればよく、５０～１００％の範囲が好ましく。７０～１００％の範囲がより好ましく、９０～１００％の範囲がさらに好ましい。
ユビキチン化を阻害又は抑制する程度は、例えば、培養細胞を用いた強制発現実験、ＦＲＥＴ法等のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）の実験などで評価又は判断してもよい。培養細胞を用いた強制発現実験により評価又は判断する場合は、例えば、２０～１００％の範囲でユビキチン化を阻害又は抑制できればよく、５０～１００％の範囲が好ましく。７０～１００％の範囲がより好ましく、９０～１００％の範囲がさらに好ましい。
【0073】
＜スクリーニング方法＞
本発明は、ユビキチン化酵素を用いる、ユビキチン化を抑制又は阻害する物質、若しくは光受容に関連する症状を改善又は予防するための剤のスクリーニング方法を包含する。本明細書において「スクリーニング」とは、多数の試験物質の中から目的の活性を有する物質を篩い分けること、又は、ある試験物質について、その物質が目的の性質を有する物質であるか否かを検出することである。
本発明は、ユビキチン化酵素を用いる、ユビキチン化を抑制又は阻害する物質、若しくは光受容に関連する症状を改善又は予防するための剤のスクリーニング方法を包含する。本明細書において「スクリーニング」とは、多数の試験物質の中から目的の活性を有する物質を篩い分けること、又は、ある試験物質について、その物質が目的の性質を有する物質であるか否かを検出することである。
【0074】
本発明の好ましい態様において、指標とする光受容に関連する症状の改善作用又は予防作用は、ユビキチン化酵素の標的タンパク質のユビキチン化の程度で評価される。ユビキチン化の程度の評価は、前記の判断を用いてもよい。
前記標的タンパク質のユビキチン化の程度は、例えば、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子及び標的タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞を用いて、被験物質を添加した細胞における標的タンパク質のユビキチン量が、被験物質を添加しなかった細胞におけるユビキチン量と比較して減少する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定される。また、前記ユビキチン量が増加する場合には、前記被験物質はユビキチン化酵素の活性を増強する物質であると判定することも可能である。さらに、前記ユビキチン量は、例えば、細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティング法等を用いて、定量的な検出を行うことにより測定することができる。
前記標的タンパク質のユビキチン化の程度は、例えば、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子及び標的タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞を用いて、被験物質を添加した細胞における標的タンパク質のユビキチン量が、被験物質を添加しなかった細胞におけるユビキチン量と比較して減少する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定される。また、前記ユビキチン量が増加する場合には、前記被験物質はユビキチン化酵素の活性を増強する物質であると判定することも可能である。さらに、前記ユビキチン量は、例えば、細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティング法等を用いて、定量的な検出を行うことにより測定することができる。
【0075】
他の態様において、指標とする光受容に関連する症状の改善作用又は予防作用は、ユビキチン化酵素の活性で評価されてもよい。前記ユビキチン化酵素の活性は、前記タンパク質の発現量で表されてもよく、例えば、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子を導入した細胞を用いて、被験物質を添加した細胞における前記標的タンパク質の発現量が、被験物質を添加しなかった細胞における該標的タンパク質の発現量と比較して増加する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定される。また、前記標的タンパク質が減少する場合には、前記被験物質はユビキチン化酵素の活性を増強する物質であると判定することも可能である。前記発現量は、例えば、例えば、細胞からタンパク質を抽出し、ウエスタンブロッティング法等を用いて、定量的な検出を行うことにより測定することができる。又は、当該タンパク質の細胞内存在量を、公知又は自体公知の方法で定量的に測定して、タンパク質の発現量としてもよい。
【0076】
スクリーニングに用いる細胞の種類は、ユビキチン化酵素及び／又はユビキチン化酵素の標的タンパク質の存在下で生育でき、導入したユビキチン化酵素及び／又はユビキチン化酵素の標的タンパク質を産生できる細胞であれば特に限定されない。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等が挙げられる。細胞の培養条件としては、通常の培養条件、例えば、市販のＤＭＥＭ培地を用いる他、本発明のスクリーニング方法の実行を妨げない培養条件であれば、特段の限定無く適用することができる。
【0077】
また、本発明のスクリーニング方法の一態様として、ユビキチン化に関する酵素と標的タンパク質同士あるいはユビキチン化に関する酵素とユビキチン リガーゼ複合体構成タンパク質同士の相互作用を阻害又は抑制する物質をスクリーニングする方法を挙げることができる。具体的には、例えば、被験物質を添加した場合のユビキチン化酵素と標的タンパク質あるいはユビキチン化酵素とユビキチン リガーゼ複合体構成タンパク質との相互作用が、被験物質を添加しなかった場合の相互作用と比較して減少する場合に、前記被験物質は光受容に関連する症状に対して改善作用又は予防作用を有すると判定される。また、ユビキチン化酵素と前記標的タンパク質あるいはユビキチン化酵素とユビキチン リガーゼ複合体構成タンパク質との相互作用が増強する場合には、前記被験物質はユビキチン化酵素の活性を増強する物質であると判定することも可能である。ここで、相互作用としては、ユビキチン化酵素と標的タンパク質の複合体（タンパク質会合）を指標とすることができ、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）、Ａｌｐｈａ ｓｃｒｅｅｎ（化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ、Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ａｓｓａｙ）、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、タンパク質の３５Ｓ－メチオニン標識化、タンパク質マイクロシークエンシング、銀染色及び二次元ゲル電気泳動などの公知の手法により評価することができる。一例としては、例えば、被験物質の存在又は非存在下での、Ｋｌｈｌ１８タンパク質とＵｎｃ１１９タンパク質のタンパク質相互作用を、ＦＲＥＴ法により測定して評価する態様を挙げることができる。
【0078】
本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、ユビキチン化を阻害又は抑制する物質であればよい。さらにユビキチン化酵素、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子、ユビキチン化酵素の発現を阻害又は抑制する能力を有することが好ましい。例えば、前記物質（Ａ）等が挙げられる。また前記被験物質は、それらの混合物であってもよい。
【0079】
＜光受容感度を増強又は維持するための剤＞
本発明は、光受容感度を増強又は維持するための剤を包含する。本発明において、光受容感度を増強又は維持するための剤としては、ユビキチン化を誘導、促進又は維持する能力を有する物質を含有していれば特に限定されないが、例えば、ユビキチン化酵素（例えば、前記のユビキチン化酵素）、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子（例えば、前記のユビキチン化酵素をコードする遺伝子）、ユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する能力を有する物質、ユビキチン化酵素の活性を向上する能力を有する物質及びユビキチン化酵素と前記標的タンパク質あるいはユビキチン化酵素とユビキチン リガーゼ複合体構成タンパク質との相互作用を増強する能力を有する物質のいずれかを単独で含有していてもよく、これらの２以上を含有していてもよい。ユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する能力を有する物質は、例えば、転写因子等であってもよい。転写因子としては、ユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する能力を有していればよく、例えば、直接又は間接的にユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進するものであってもよい。直接的とは、例えば、転写因子がユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進すること等をいう。間接的とは、例えば、転写因子が他のタンパク質などを介してユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進すること等をいう。直接的にユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する転写因子としては、例えば、Ｏｔｘ２（Ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｃｒｘ（Ｃｏｎｅ－ｒｏｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、Ｎｒｌ（Ｎｅｕｒａｌ ｒｅｔｉｎａ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ）等が挙げられる。また、ユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する能力を有する物質は、例えば、転写因子をコードする遺伝子等であってもよい。転写因子をコードする遺伝子としては、例えば、転写因子をコードする遺伝子そのものであってもよく、転写因子をコードする遺伝子を一部に含むものなどであってもよい。
転写因子のアミノ酸配列及び塩基配列は、公知のデータベース等から入手することができる。
本発明は、光受容感度を増強又は維持するための剤を包含する。本発明において、光受容感度を増強又は維持するための剤としては、ユビキチン化を誘導、促進又は維持する能力を有する物質を含有していれば特に限定されないが、例えば、ユビキチン化酵素（例えば、前記のユビキチン化酵素）、ユビキチン化酵素をコードする遺伝子（例えば、前記のユビキチン化酵素をコードする遺伝子）、ユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する能力を有する物質、ユビキチン化酵素の活性を向上する能力を有する物質及びユビキチン化酵素と前記標的タンパク質あるいはユビキチン化酵素とユビキチン リガーゼ複合体構成タンパク質との相互作用を増強する能力を有する物質のいずれかを単独で含有していてもよく、これらの２以上を含有していてもよい。ユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する能力を有する物質は、例えば、転写因子等であってもよい。転写因子としては、ユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する能力を有していればよく、例えば、直接又は間接的にユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進するものであってもよい。直接的とは、例えば、転写因子がユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進すること等をいう。間接的とは、例えば、転写因子が他のタンパク質などを介してユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進すること等をいう。直接的にユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する転写因子としては、例えば、Ｏｔｘ２（Ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）、Ｃｒｘ（Ｃｏｎｅ－ｒｏｄ ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、Ｎｒｌ（Ｎｅｕｒａｌ ｒｅｔｉｎａ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ）等が挙げられる。また、ユビキチン化酵素の発現を誘導又は促進する能力を有する物質は、例えば、転写因子をコードする遺伝子等であってもよい。転写因子をコードする遺伝子としては、例えば、転写因子をコードする遺伝子そのものであってもよく、転写因子をコードする遺伝子を一部に含むものなどであってもよい。
転写因子のアミノ酸配列及び塩基配列は、公知のデータベース等から入手することができる。
【0080】
光受容感度を増強又は維持するための剤は、例えば、網膜の光受容感度の低下に関連する症状等に使用してもよい。光受容感度の低下に関連する症状は、光受容により影響を受ける症状であればよく、代表的には、光受容により進行又は悪化する症状であってもよい。
このような症状は、光受容により影響を受ける症状であれば、その発生（発症）原因は特に限定されず、必ずしも光受容に起因するものである必要はない。本発明では、光受容によらない症状の改善又は予防も対象とする。
網膜の光受容感度を増強又は維持するための剤は、例えば、夜盲等の改善剤又は予防剤等として用いてもよい。
このような症状は、光受容により影響を受ける症状であれば、その発生（発症）原因は特に限定されず、必ずしも光受容に起因するものである必要はない。本発明では、光受容によらない症状の改善又は予防も対象とする。
網膜の光受容感度を増強又は維持するための剤は、例えば、夜盲等の改善剤又は予防剤等として用いてもよい。
【0081】
光受容感度を増強又は維持するための剤の投与環境は、網膜のユビキチン化を効率よく増強又は維持できる態様であれば特に制限されるものでなく、暗い環境（暗所）又は明るい環境（明所）のどちらの環境であってもよい。Ｋｌｈｌ１８のユビキチン化作用をより増強させる目的から、暗い環境（暗所）において投与されるのが好ましい。
【0082】
光受容感度を増強又は維持するための剤の投与環境において、明るい環境（明所）における照度は、例えば、３００ ｌｕｘ以上、５００ ｌｕｘ以上、８００ ｌｕｘ以上、１，０００ ｌｕｘ以上等であれば特に限定されるものではないが、上限を設けるのであれば、例えば、１，０００，０００ ｌｕｘ以下、２００，０００ ｌｕｘ以下等が挙げられる。暗い環境（暗所）における照度は、例えば、０ ｌｕｘ以上３００ ｌｕｘ未満、０ ｌｕｘ以上２００ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上１００ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上５０ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上１０ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上８ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上５ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上３ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上１ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上０．５ ｌｕｘ以下、０ ｌｕｘ以上０．１ ｌｕｘ以下等が挙げられる。
【0083】
以下にいくつかの実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものでない。
【実施例】
【0084】
［実施例１］（Ｋｌｈｌ１８遺伝子のマウス組織における発現解析）
（ノーザンブロッティング）
（１）ノーザンブロッティング解析用のプローブ作製
生後１４日齢のＩＣＲマウス（オリエンタル酵母工業株式会社より購入）の網膜から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＲＮＡを抽出した後、定法に従ってｃＤＮＡライブラリを作製した。作製したｃＤＮＡライブラリを鋳型として、Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲを行いＫｌｈｌ１８遺伝子を増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーは、フォワードプライマー（配列番号５８）、及びリバースプライマー（配列番号５９）を用いた。増幅したＰＣＲ断片をｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲ断片をプラスミドに組み込み、ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ－Ｋｌｈｌ１８プラスミドを作製した。
上記で作製したｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ－Ｋｌｈｌ１８プラスミドから、制限酵素ＥｃｏＲＩによりＫｌｈｌ１８ＤＮＡ断片を切り出した。その後、ＲｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ Ｒａｍｄｏｍ Ｐｒｉｍｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、３２Ｐ ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で切り出したＫｌｈｌ１８ＤＮＡ断片を放射性標識して、ノーザンブロッティング用のプローブを作製した。
（２）ＲＮＡの調製及びハイブリダイゼーション
４週齢のＩＣＲマウス（オリエンタル酵母工業株式会社より購入）を定法に従い解剖し、網膜、大脳、小脳、脳幹、胸腺、心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓、筋肉、小腸、卵巣及び精巣を摘出し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＲＮＡを精製した。ＲＮＡに５μＬのホルムアミド、０．７５μＬのＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．０）（０．４Ｍ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＮａＯＡｃ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、及び２μＬのホルムアルデヒドを加え、６５℃で１０分間熱処理した後に氷上で２分間急冷したものを電気泳動サンプルとした。５％のＭＯＰＳバッファー及び１６．５％のホルムアルデヒドを含む変性１％アガロースゲル電気泳動により、得られたＲＮＡを電気泳動（１００Ｖ、１３５分）して分離した。泳動バッファーにはＭＯＰＳを使用した。その後、電気泳動後のアガロースゲルのＲＮＡを２０×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）による毛細管現象により、ナイロンメンブレン（Ｐａｌｌ社製）に転写し、転写したＲＮＡは８０℃で２時間加熱処理することによりナイロンメンブレンに固定した。作製したメンブレンをハイブリダイゼーションバッファー（７％ ＳＤＳ、５０％ ホルムアミド、０．１２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）、０．２５Ｍ 塩化ナトリウム）に浸し、３７℃で１時間以上、前ハイブリダイゼーションを行った。前ハイブリダイゼーション終了後、実施例１の（１）で作製した６０ｎｇのプローブ及び断片化した鮭精子ＤＮＡが終濃度１００μｇ／ｍＬとなるようにハイブリダイゼーションバッファーに加えたものを、前ハイブリダイゼーション後のメンブレンに加え、４３℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション終了後、ナイロンメンブレンを２×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）／０．１％ ＳＤＳを用いて洗浄した後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳを用いて５０℃で洗浄した。洗浄したナイロンメンブレンをＸ線フィルム（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製）で露光し、現像機（ＦＰＭ１００、ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製）を用いてＸ線フィルムを現像した。
（ノーザンブロッティング）
（１）ノーザンブロッティング解析用のプローブ作製
生後１４日齢のＩＣＲマウス（オリエンタル酵母工業株式会社より購入）の網膜から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＲＮＡを抽出した後、定法に従ってｃＤＮＡライブラリを作製した。作製したｃＤＮＡライブラリを鋳型として、Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲを行いＫｌｈｌ１８遺伝子を増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーは、フォワードプライマー（配列番号５８）、及びリバースプライマー（配列番号５９）を用いた。増幅したＰＣＲ断片をｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲ断片をプラスミドに組み込み、ｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ－Ｋｌｈｌ１８プラスミドを作製した。
上記で作製したｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ－Ｋｌｈｌ１８プラスミドから、制限酵素ＥｃｏＲＩによりＫｌｈｌ１８ＤＮＡ断片を切り出した。その後、ＲｅｄｉｐｒｉｍｅＴＭ Ｒａｍｄｏｍ Ｐｒｉｍｅ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、３２Ｐ ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で切り出したＫｌｈｌ１８ＤＮＡ断片を放射性標識して、ノーザンブロッティング用のプローブを作製した。
（２）ＲＮＡの調製及びハイブリダイゼーション
４週齢のＩＣＲマウス（オリエンタル酵母工業株式会社より購入）を定法に従い解剖し、網膜、大脳、小脳、脳幹、胸腺、心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓、筋肉、小腸、卵巣及び精巣を摘出し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＲＮＡを精製した。ＲＮＡに５μＬのホルムアミド、０．７５μＬのＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．０）（０．４Ｍ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＮａＯＡｃ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）、及び２μＬのホルムアルデヒドを加え、６５℃で１０分間熱処理した後に氷上で２分間急冷したものを電気泳動サンプルとした。５％のＭＯＰＳバッファー及び１６．５％のホルムアルデヒドを含む変性１％アガロースゲル電気泳動により、得られたＲＮＡを電気泳動（１００Ｖ、１３５分）して分離した。泳動バッファーにはＭＯＰＳを使用した。その後、電気泳動後のアガロースゲルのＲＮＡを２０×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）による毛細管現象により、ナイロンメンブレン（Ｐａｌｌ社製）に転写し、転写したＲＮＡは８０℃で２時間加熱処理することによりナイロンメンブレンに固定した。作製したメンブレンをハイブリダイゼーションバッファー（７％ ＳＤＳ、５０％ ホルムアミド、０．１２Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）、０．２５Ｍ 塩化ナトリウム）に浸し、３７℃で１時間以上、前ハイブリダイゼーションを行った。前ハイブリダイゼーション終了後、実施例１の（１）で作製した６０ｎｇのプローブ及び断片化した鮭精子ＤＮＡが終濃度１００μｇ／ｍＬとなるようにハイブリダイゼーションバッファーに加えたものを、前ハイブリダイゼーション後のメンブレンに加え、４３℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション終了後、ナイロンメンブレンを２×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）／０．１％ ＳＤＳを用いて洗浄した後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳを用いて５０℃で洗浄した。洗浄したナイロンメンブレンをＸ線フィルム（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製）で露光し、現像機（ＦＰＭ１００、ＦＵＪＩＦＩＬＭ社製）を用いてＸ線フィルムを現像した。
【0085】
（結果）
実施例１より、Ｋｌｈｌ１８遺伝子はマウス網膜組織に特異的に発現していることを明らかにした（図１）。
実施例１より、Ｋｌｈｌ１８遺伝子はマウス網膜組織に特異的に発現していることを明らかにした（図１）。
【0086】
［実施例２］（Ｋｌｈｌ１８遺伝子のマウス網膜における発現解析）
（ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション）
（１）ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション解析用のプローブ作製
実施例１で作製したｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ－Ｋｌｈｌ１８プラスミドを、定法に従い
、制限酵素ＡｐａＩで制限酵素処理し、該プラスミドを直鎖化した。直鎖化したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ジゴキシゲニン(ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ；ＤＩＧ)標識されたアンチセンス鎖ＲＮＡを合成した。アンチセンス鎖ＲＮＡ合成後、鋳型とした直鎖状ＤＮＡはＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて分解した。合成したアンチセンス鎖ＲＮＡはエタノール沈殿により精製後、滅菌水５０μＬに溶解し、－８０℃に保存した。
（２）ハイブリダイゼーション
生後９日齢、生後２１日齢のＩＣＲマウス（オリエンタル酵母工業株式会社より購入）の網膜を定法に従い回収し、４％ パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）を用いて４℃で一晩固定した。固定後の網膜をＰＢＳで洗浄した後、３０％ スクロース／ＰＢＳに浸けて、網膜内の４％ パラホルムアルデヒド／ＰＢＳと置換した。その後、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ社製）を用いて、網膜を包埋した。新鮮凍結法の網膜サンプルは、上記固定操作を省いて包埋した。
クライオスタットにより１６μｍの厚さの網膜凍結切片を作製し、スライドグラス上に貼り付け、その後、凍結切片を室温にて乾燥させた。乾燥後の切片を４％ パラホルムアルデヒド／ＰＢＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳ）で１５分間処理した。切片をＰＢＴで洗浄した後、６％ Ｈ２Ｏ２／ＰＢＴで５分間、脱色処理し、ＰＢＴで洗浄した。次に切片をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｒｏｃｈｅ社製）／ＰＢＴで４分間処理した後、２ｍｇ/ｍＬグリシン／ＰＢＴで１５分間処理してＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋによる反応を停止させた後、ＰＢＴにて洗浄した。次に４％ パラホルムアルデヒド／０．２％ グルタルアルデヒド／ＰＢＴで１５分間、後固定した後、ＰＢＴで洗浄した。続いて５０％ ホルムアミド／５×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ４．５）／５０μｇ ｙｅａｓｔ ＲＮＡ／１％ＳＤＳで７０℃、１時間、前ハイブリダイゼーションを行った。実施例２で作製したプローブを用いて、２μｇ プローブ／５０％ ホルムアミド／５×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ４．５）／５０μｇ ｙｅａｓｔ ＲＮＡ／１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション液を調製し、前ハイブリダイゼーション終了後に、切片に載せ、７０℃で一晩ハイブリダイゼーションした。
（３）発色及び解析
切片を５０％ ホルムアミド/４×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ４．５）／１％ＳＤＳで７０℃、１５分間処理し、これを３回繰り返して切片を洗浄した。次に５０％ ホルムアミド/２×ＳＳＣ(ｐＨ４．５)で６５℃、１５分間処理し、これを３回繰り返して切片を洗浄した。さらに切片を０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０/ＴＢＳで洗浄し、５％正常ヒツジ血清／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳで１時間処理した。続いて抗体反応液（抗ＤＩＧ抗体、１％正常ヒツジ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ＴＢＳ)で４℃、一晩処理した。切片を０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳおよびＮＴＭＴ（１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、５０ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、２ｍＭ レバミゾール（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）)で洗浄した後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰで反応させた。発色後、切片をＮＴＭＴで洗浄し、ＰＢＴ（ｐＨ５．５）により発色反応を停止させた。４％ パラホルムアルデヒド/０．１％グルタルアルデヒド／ＰＢＴで１０分間処理およびＰＢＴで洗浄後、封入剤で封入した。封入した標本は正立型顕微鏡の微分干渉検鏡対物レンズにより観察した。
（ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション）
（１）ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション解析用のプローブ作製
実施例１で作製したｐＧＥＭ－Ｔ－ｅａｓｙ－Ｋｌｈｌ１８プラスミドを、定法に従い
、制限酵素ＡｐａＩで制限酵素処理し、該プラスミドを直鎖化した。直鎖化したＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ジゴキシゲニン(ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ；ＤＩＧ)標識されたアンチセンス鎖ＲＮＡを合成した。アンチセンス鎖ＲＮＡ合成後、鋳型とした直鎖状ＤＮＡはＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて分解した。合成したアンチセンス鎖ＲＮＡはエタノール沈殿により精製後、滅菌水５０μＬに溶解し、－８０℃に保存した。
（２）ハイブリダイゼーション
生後９日齢、生後２１日齢のＩＣＲマウス（オリエンタル酵母工業株式会社より購入）の網膜を定法に従い回収し、４％ パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）を用いて４℃で一晩固定した。固定後の網膜をＰＢＳで洗浄した後、３０％ スクロース／ＰＢＳに浸けて、網膜内の４％ パラホルムアルデヒド／ＰＢＳと置換した。その後、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ社製）を用いて、網膜を包埋した。新鮮凍結法の網膜サンプルは、上記固定操作を省いて包埋した。
クライオスタットにより１６μｍの厚さの網膜凍結切片を作製し、スライドグラス上に貼り付け、その後、凍結切片を室温にて乾燥させた。乾燥後の切片を４％ パラホルムアルデヒド／ＰＢＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳ）で１５分間処理した。切片をＰＢＴで洗浄した後、６％ Ｈ２Ｏ２／ＰＢＴで５分間、脱色処理し、ＰＢＴで洗浄した。次に切片をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｒｏｃｈｅ社製）／ＰＢＴで４分間処理した後、２ｍｇ/ｍＬグリシン／ＰＢＴで１５分間処理してＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋによる反応を停止させた後、ＰＢＴにて洗浄した。次に４％ パラホルムアルデヒド／０．２％ グルタルアルデヒド／ＰＢＴで１５分間、後固定した後、ＰＢＴで洗浄した。続いて５０％ ホルムアミド／５×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ４．５）／５０μｇ ｙｅａｓｔ ＲＮＡ／１％ＳＤＳで７０℃、１時間、前ハイブリダイゼーションを行った。実施例２で作製したプローブを用いて、２μｇ プローブ／５０％ ホルムアミド／５×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ４．５）／５０μｇ ｙｅａｓｔ ＲＮＡ／１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション液を調製し、前ハイブリダイゼーション終了後に、切片に載せ、７０℃で一晩ハイブリダイゼーションした。
（３）発色及び解析
切片を５０％ ホルムアミド/４×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ４．５）／１％ＳＤＳで７０℃、１５分間処理し、これを３回繰り返して切片を洗浄した。次に５０％ ホルムアミド/２×ＳＳＣ(ｐＨ４．５)で６５℃、１５分間処理し、これを３回繰り返して切片を洗浄した。さらに切片を０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０/ＴＢＳで洗浄し、５％正常ヒツジ血清／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳで１時間処理した。続いて抗体反応液（抗ＤＩＧ抗体、１％正常ヒツジ血清、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ＴＢＳ)で４℃、一晩処理した。切片を０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳおよびＮＴＭＴ（１００ｍＭ 塩化ナトリウム、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、５０ｍＭ 塩化マグネシウム、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、２ｍＭ レバミゾール（Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）)で洗浄した後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰで反応させた。発色後、切片をＮＴＭＴで洗浄し、ＰＢＴ（ｐＨ５．５）により発色反応を停止させた。４％ パラホルムアルデヒド/０．１％グルタルアルデヒド／ＰＢＴで１０分間処理およびＰＢＴで洗浄後、封入剤で封入した。封入した標本は正立型顕微鏡の微分干渉検鏡対物レンズにより観察した。
【0087】
（結果）
実施例２より、Ｋｌｈｌ１８遺伝子は生後９日目及び生後２１日目のマウス網膜視細胞層に特異的かつ強く発現していることを明らかにした（図２）。
実施例２より、Ｋｌｈｌ１８遺伝子は生後９日目及び生後２１日目のマウス網膜視細胞層に特異的かつ強く発現していることを明らかにした（図２）。
【0088】
［実施例３］（Ｋｌｈｌ１８遺伝子欠損マウスの作製）
（１）Ｋｌｈｌ１８遺伝子へテロ相同組換えＥＳ細胞株の取得
ＥＳ細胞として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス系統由来のＥＳ細胞株ＪＭ８Ａ３を用いた。ＥＳ細胞には、ＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社製）に非動化仔牛血清（ＦＢＳ）、Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ社製）、ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ社製）、Ｎａ－ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社製）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００μｇ/ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ/ｍＬ）（ナカライテスク社製）、２－メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）、ＬＩＦ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を添加したＥＳ細胞用培地を用いた。また、フィーダ細胞として、ネオマイシン耐性遺伝子をトランスジーンとして持つマウス胎児由来初代繊維芽細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ）をマイトマイシンＣ処理により分裂停止させたものを用いた。Ｋｌｈｌ１８ＫＯベクターは、ＫＯＭＰ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ、米国）より購入したもの（Ｃｌｏｎｅ ｎａｍｅ：ＰＲＰＧＳ０００３６＿Ｃ＿Ｄ０９）を使用した。Ｋｌｈｌ１８ＫＯベクターをＡｓｉＳＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で切断することにより直鎖化し、次いで直鎖化ＤＮＡ断片を２４０Ｖ、５００μＦの条件でマウスＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、ターゲティングベクターの導入を行った。
エレクトロポレーション実施後２４時間後から、２６０μｇ／ｍＬの抗生物質Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を含有する培地中でＥＳ細胞を培養することにより、ネオマイシン耐性クローン（ターゲティングベクターが導入されたＥＳ細胞）を選別し、選別開始後８～１０日後のＥＳ細胞のコロニーを回収した。回収したＥＳ細胞のコロニーは、０.２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡにより、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃、５分間処理することで細胞をほぐした。その後９６ｗｅｌｌのフィーダープレートへ移し、ＥＳ細胞がコンフルエントになるまで培養した。フィーダープレート内のＥＳ細胞が９０％～１００％コンフルエントになったら、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡにより再度細胞をほぐし、一部をＤＮＡ抽出用に準備した９６ｗｅｌｌプレートへ移し、残りのＥＳ細胞はｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ(ＤＭＳＯ：ＦＢＳ：ＥＳＤＭＥＭ＋ＬＩＦ（ＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社製）、Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ社製）、ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ社製）、Ｎａ－ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社製）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００μｇ/ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ/ｍＬ）（ナカライテスク社製）、２－メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）、ＬＩＦ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）、ＦＢＳ）＝１：１：３)を加えて－８０℃で凍結保存した。
ＥＳ細胞をＤＮＡ抽出用に準備した９６ｗｅｌｌプレートで９０％～１００％コンフルエントになるまで増殖させた後、各ｗｅｌｌのＥＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄した。Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５)、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．５％ ｓａｒｃｏｓｙｌ、２００μｇ/ｍＬ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ加え、６０℃で一晩処理した。翌日１０ｍＭ塩化ナトリウム／エタノールを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ加え、液を混ぜずにそのまま４℃で３０分間以上静置した。その後上清を除き、７０％エタノールによりＤＮＡを洗浄した。ＤＮＡを風乾させ、ＲＮａｓｅ（２０μｇ/ｍＬ）を添加した１０倍希釈ＴＥにＤＮＡを溶解した。その後、取得した各クローンのゲノムＤＮＡを試料として以下のようにサザンブロッティングを行うことにより、目的とする変異型アリルを含むヘテロ相同組換え体をスクリーニングした。
サザンブロッティング用のプローブは、以下の方法で作製した。５’側のプローブを作製するために、ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、かつ５０μＭのフォワードプライマーＦｏｗａｒｄ５’（配列番号６０）、５０μＭのリバースプライマーＲｅｖｅｒｓｅ５’（配列番号６１）及びＥｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従いＰＣＲを行った。同様にして、３’側のプローブを作製するために、ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、かつ５０μＭのフォワードプライマーＦｏｗａｒｄ３’（配列番号６２）、５０μＭのリバースプライマーＲｅｖｅｒｓｅ３’（配列番号６３）及びＥｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動した後、当該ゲル上で検出された、それぞれ約３３０ｂｐ及び約５３６ｂｐのバンドを切り出し、Ｔ－ＥＡＳＹベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングした。クローニングされたプラスミドをＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ社）で消化した後、消化物（ＤＮＡ）をアガロースゲル電気泳動した。３３０ｂｐ及び５３６ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ切り出し、得られたＤＮＡ断片をグラスビーズを用いて精製した。精製されたＤＮＡ断片を３２Ｐ ｄＣＴＰ標識して以下で用いた。
各クローンから調製したゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を制限酵素ＫｐｎＩ（遺伝子相同組換え領域の５’側の確認用）又はＢａｍＨＩ（遺伝子相同組換え領域の３’側の確認用）で完全消化した後、消化物を０．８％アガロースゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルからニトロセルロース膜（ＰＡＬＬ社製）に転写した後、上記で３２Ｐ標識した５’側のプローブ又は３’側のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、オートラジオグラフィーにて検出した結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。目的とする変異が導入されていれば、野生型アリルを示すＫｐｎＩ断片２９Ｋｂは９．６Ｋｂの大きさに縮小して検出されるはずである。さらに目的とする変異が導入されていれば、野生型アリルを示すＢａｍＨＩ断片９Ｋｂは７．１Ｋｂの大きさに縮小して検出されるはずである。サザンブロッティングの結果、野生型細胞では、ＫｐｎＩ断片２９Ｋｂのみが検出され、ＢａｍＨＩ断片９Ｋｂのみが検出された。これに対して、Ｋｌｈｌ１８遺伝子へテロ相同組換えのクローン（クローン番号Ｂ５，Ｃ５、Ｄ４，Ｆ１、Ｇ４，Ｈ３，Ｈ４及びＨ５）では、９．６ＫｂのＫｐｎＩ断片及び７．１ＫｂのＢａｍＨＩ断片が検出された（図３Ａ及び３Ｂ）。以上のことから、上記クローンにおいて目的とする相同組換えが生じたＫｌｈｌ１８遺伝子へテロ相同組換えＥＳ細胞株であることが確認できた。
（１）Ｋｌｈｌ１８遺伝子へテロ相同組換えＥＳ細胞株の取得
ＥＳ細胞として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス系統由来のＥＳ細胞株ＪＭ８Ａ３を用いた。ＥＳ細胞には、ＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社製）に非動化仔牛血清（ＦＢＳ）、Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ社製）、ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ社製）、Ｎａ－ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社製）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００μｇ/ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ/ｍＬ）（ナカライテスク社製）、２－メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）、ＬＩＦ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）を添加したＥＳ細胞用培地を用いた。また、フィーダ細胞として、ネオマイシン耐性遺伝子をトランスジーンとして持つマウス胎児由来初代繊維芽細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ）をマイトマイシンＣ処理により分裂停止させたものを用いた。Ｋｌｈｌ１８ＫＯベクターは、ＫＯＭＰ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｍｏｕｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ、米国）より購入したもの（Ｃｌｏｎｅ ｎａｍｅ：ＰＲＰＧＳ０００３６＿Ｃ＿Ｄ０９）を使用した。Ｋｌｈｌ１８ＫＯベクターをＡｓｉＳＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で切断することにより直鎖化し、次いで直鎖化ＤＮＡ断片を２４０Ｖ、５００μＦの条件でマウスＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、ターゲティングベクターの導入を行った。
エレクトロポレーション実施後２４時間後から、２６０μｇ／ｍＬの抗生物質Ｇ４１８（ナカライテスク社製）を含有する培地中でＥＳ細胞を培養することにより、ネオマイシン耐性クローン（ターゲティングベクターが導入されたＥＳ細胞）を選別し、選別開始後８～１０日後のＥＳ細胞のコロニーを回収した。回収したＥＳ細胞のコロニーは、０.２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡにより、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃、５分間処理することで細胞をほぐした。その後９６ｗｅｌｌのフィーダープレートへ移し、ＥＳ細胞がコンフルエントになるまで培養した。フィーダープレート内のＥＳ細胞が９０％～１００％コンフルエントになったら、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡにより再度細胞をほぐし、一部をＤＮＡ抽出用に準備した９６ｗｅｌｌプレートへ移し、残りのＥＳ細胞はｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ(ＤＭＳＯ：ＦＢＳ：ＥＳＤＭＥＭ＋ＬＩＦ（ＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社製）、Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ社製）、ＭＥＭ Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＧＩＢＣＯ社製）、Ｎａ－ｐｙｒｕｖａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社製）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００μｇ/ｍＬ）／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００μｇ/ｍＬ）（ナカライテスク社製）、２－メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）、ＬＩＦ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製）、ＦＢＳ）＝１：１：３)を加えて－８０℃で凍結保存した。
ＥＳ細胞をＤＮＡ抽出用に準備した９６ｗｅｌｌプレートで９０％～１００％コンフルエントになるまで増殖させた後、各ｗｅｌｌのＥＳ細胞をＰＢＳで２回洗浄した。Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５)、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．５％ ｓａｒｃｏｓｙｌ、２００μｇ/ｍＬ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を各ｗｅｌｌに５０μＬずつ加え、６０℃で一晩処理した。翌日１０ｍＭ塩化ナトリウム／エタノールを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ加え、液を混ぜずにそのまま４℃で３０分間以上静置した。その後上清を除き、７０％エタノールによりＤＮＡを洗浄した。ＤＮＡを風乾させ、ＲＮａｓｅ（２０μｇ/ｍＬ）を添加した１０倍希釈ＴＥにＤＮＡを溶解した。その後、取得した各クローンのゲノムＤＮＡを試料として以下のようにサザンブロッティングを行うことにより、目的とする変異型アリルを含むヘテロ相同組換え体をスクリーニングした。
サザンブロッティング用のプローブは、以下の方法で作製した。５’側のプローブを作製するために、ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、かつ５０μＭのフォワードプライマーＦｏｗａｒｄ５’（配列番号６０）、５０μＭのリバースプライマーＲｅｖｅｒｓｅ５’（配列番号６１）及びＥｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従いＰＣＲを行った。同様にして、３’側のプローブを作製するために、ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを鋳型に用いて、かつ５０μＭのフォワードプライマーＦｏｗａｒｄ３’（配列番号６２）、５０μＭのリバースプライマーＲｅｖｅｒｓｅ３’（配列番号６３）及びＥｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動した後、当該ゲル上で検出された、それぞれ約３３０ｂｐ及び約５３６ｂｐのバンドを切り出し、Ｔ－ＥＡＳＹベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）にクローニングした。クローニングされたプラスミドをＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ社）で消化した後、消化物（ＤＮＡ）をアガロースゲル電気泳動した。３３０ｂｐ及び５３６ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ切り出し、得られたＤＮＡ断片をグラスビーズを用いて精製した。精製されたＤＮＡ断片を３２Ｐ ｄＣＴＰ標識して以下で用いた。
各クローンから調製したゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を制限酵素ＫｐｎＩ（遺伝子相同組換え領域の５’側の確認用）又はＢａｍＨＩ（遺伝子相同組換え領域の３’側の確認用）で完全消化した後、消化物を０．８％アガロースゲル電気泳動した。電気泳動後のゲルからニトロセルロース膜（ＰＡＬＬ社製）に転写した後、上記で３２Ｐ標識した５’側のプローブ又は３’側のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、オートラジオグラフィーにて検出した結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。目的とする変異が導入されていれば、野生型アリルを示すＫｐｎＩ断片２９Ｋｂは９．６Ｋｂの大きさに縮小して検出されるはずである。さらに目的とする変異が導入されていれば、野生型アリルを示すＢａｍＨＩ断片９Ｋｂは７．１Ｋｂの大きさに縮小して検出されるはずである。サザンブロッティングの結果、野生型細胞では、ＫｐｎＩ断片２９Ｋｂのみが検出され、ＢａｍＨＩ断片９Ｋｂのみが検出された。これに対して、Ｋｌｈｌ１８遺伝子へテロ相同組換えのクローン（クローン番号Ｂ５，Ｃ５、Ｄ４，Ｆ１、Ｇ４，Ｈ３，Ｈ４及びＨ５）では、９．６ＫｂのＫｐｎＩ断片及び７．１ＫｂのＢａｍＨＩ断片が検出された（図３Ａ及び３Ｂ）。以上のことから、上記クローンにおいて目的とする相同組換えが生じたＫｌｈｌ１８遺伝子へテロ相同組換えＥＳ細胞株であることが確認できた。
【0089】
（２）Ｋｌｈｌ１８遺伝子欠損マウスの作製
上記（１）で得られたＫｌｈｌ１８遺伝子へテロ相同組換えＥＳ細胞株のうち、１種類の株（クローン番号Ｃ５）をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス胚盤胞へ注入することにより、キメラマウスを作製した。即ち、上記Ｋｌｈｌ１８遺伝子へテロ相同組換えＥＳ細胞株をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス胚盤胞に注入し、仮親の子宮に移植して、キメラマウスを得た。得られたキメラマウスの雄をさらに野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの雌と交配して初代（Ｆ１）マウスを得た。これらのＦ１マウスから、サザンブロッティングにより、Ｋｌｈｌ１８ｆｌｏｘ／ｗｔマウスを選別した。その後、このＦ１のＫｌｈｌ１８ｆｌｏｘ／ｗｔマウスは、ＣＡＧ－Ｃｒｅ＋マウス（熊本大学生命資源研究・支援センターより入手、MGI ID: MGI:2176435）との交配によって、Ｋｌｈｌ１８ｆｌｏｘ／ｗｔ ＣＡＧ－Ｃｒｅ＋／－マウス（以下、Ｋｌｈｌ１８ ヘテロＫＯマウスという）を得た。このＫｌｈｌ１８ｆｌｏｘ／ｗｔ ＣＡＧ－Ｃｒｅ＋／－マウス同士を交配させることにより、Ｋｌｈｌ１８遺伝子を完全に欠損するＫｌｈｌ１８ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ ＣＡＧ－Ｃｒｅ＋／－マウス（以下、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスという）を得た。
上記（１）で得られたＫｌｈｌ１８遺伝子へテロ相同組換えＥＳ細胞株のうち、１種類の株（クローン番号Ｃ５）をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス胚盤胞へ注入することにより、キメラマウスを作製した。即ち、上記Ｋｌｈｌ１８遺伝子へテロ相同組換えＥＳ細胞株をＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウス胚盤胞に注入し、仮親の子宮に移植して、キメラマウスを得た。得られたキメラマウスの雄をさらに野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの雌と交配して初代（Ｆ１）マウスを得た。これらのＦ１マウスから、サザンブロッティングにより、Ｋｌｈｌ１８ｆｌｏｘ／ｗｔマウスを選別した。その後、このＦ１のＫｌｈｌ１８ｆｌｏｘ／ｗｔマウスは、ＣＡＧ－Ｃｒｅ＋マウス（熊本大学生命資源研究・支援センターより入手、MGI ID: MGI:2176435）との交配によって、Ｋｌｈｌ１８ｆｌｏｘ／ｗｔ ＣＡＧ－Ｃｒｅ＋／－マウス（以下、Ｋｌｈｌ１８ ヘテロＫＯマウスという）を得た。このＫｌｈｌ１８ｆｌｏｘ／ｗｔ ＣＡＧ－Ｃｒｅ＋／－マウス同士を交配させることにより、Ｋｌｈｌ１８遺伝子を完全に欠損するＫｌｈｌ１８ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ ＣＡＧ－Ｃｒｅ＋／－マウス（以下、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスという）を得た。
【0090】
［実施例４］（Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスにおけるＫｌｈｌ１８遺伝子の発現量の確認）
実施例３で得られたＫｌｈｌ１８ ＫＯマウス及び野生型マウスを１２週齢まで、室温２３℃、湿度５５％、明暗各１２時間に維持された飼育室で飼育した。飼育されたマウスを定法に従い解剖し、マウス網膜を摘出した。即ち、マウス網膜組織にＴｒｉｚｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１ｍＬ加え、これをホモジナイザーでホモジナイズした。このホモジナイズされた混和物を室温で５分間保持した後、これに２００μＬのクロロホルムを加えた。得られた混合物をボルテックスで十分に混合した後、更に室温で３分間保持した。その後、得られた上清に上清と等量のイソプロパノールを加えた後、これを遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、半径 ５ｃｍ、４℃、１５分間）することによりＲＮＡを沈殿させた。沈殿させたＲＮＡを回収し、これを１００μＬの滅菌水に懸濁した。得られたＲＮＡ溶液中のＲＮＡ濃度を分光光度計を用いて測定した。そして、このようにして調製されたＲＮＡ２μｇを鋳型に用いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写を行った。得られた逆転写物２０μＬのうち１μＬを鋳型に用いて、マウスＫｌｈｌ１８遺伝子用プライマー（ＫＯ用フォワード、ＫＯ用リバース）及びｒＴａｑ（ＰＣＲ用酵素、ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲを行った。陽性コントロールには、β－アクチンを使用し、マウスβ－アクチン用プライマー（フォワードプライマー（配列番号６４）；リバースプライマー（配列番号６５））を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲを行った。
実施例３で得られたＫｌｈｌ１８ ＫＯマウス及び野生型マウスを１２週齢まで、室温２３℃、湿度５５％、明暗各１２時間に維持された飼育室で飼育した。飼育されたマウスを定法に従い解剖し、マウス網膜を摘出した。即ち、マウス網膜組織にＴｒｉｚｏｌ試薬（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１ｍＬ加え、これをホモジナイザーでホモジナイズした。このホモジナイズされた混和物を室温で５分間保持した後、これに２００μＬのクロロホルムを加えた。得られた混合物をボルテックスで十分に混合した後、更に室温で３分間保持した。その後、得られた上清に上清と等量のイソプロパノールを加えた後、これを遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、半径 ５ｃｍ、４℃、１５分間）することによりＲＮＡを沈殿させた。沈殿させたＲＮＡを回収し、これを１００μＬの滅菌水に懸濁した。得られたＲＮＡ溶液中のＲＮＡ濃度を分光光度計を用いて測定した。そして、このようにして調製されたＲＮＡ２μｇを鋳型に用いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写を行った。得られた逆転写物２０μＬのうち１μＬを鋳型に用いて、マウスＫｌｈｌ１８遺伝子用プライマー（ＫＯ用フォワード、ＫＯ用リバース）及びｒＴａｑ（ＰＣＲ用酵素、ＴａＫａＲａ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲを行った。陽性コントロールには、β－アクチンを使用し、マウスβ－アクチン用プライマー（フォワードプライマー（配列番号６４）；リバースプライマー（配列番号６５））を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲを行った。
【0091】
（結果）
実施例４より、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスにおいて、Ｋｌｈｌ１８遺伝子の発現は消失していることを明らかにした（図４）。
実施例４より、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスにおいて、Ｋｌｈｌ１８遺伝子の発現は消失していることを明らかにした（図４）。
【0092】
［実施例５］（Ｋｌｈｌ１８遺伝子欠損によるマウス網膜組織への影響）
（トルイジンブルー染色）
１ヶ月齢のＫｌｈｌ１８ ＫＯマウス及び野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系）マウス（日本ＳＬＣ社より購入）を用いて、実施例２の（２）に記載の方法により、各マウス網膜の切片を作製した。作製したマウス網膜の切片をＰＢＳで洗浄し、０．１％ ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ社製）／ＰＢＳで１分間染色した。染色後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、標本を封入剤で封入した。封入した標本は正立型顕微鏡の微分干渉検鏡対物レンズにより観察した。
（トルイジンブルー染色）
１ヶ月齢のＫｌｈｌ１８ ＫＯマウス及び野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系）マウス（日本ＳＬＣ社より購入）を用いて、実施例２の（２）に記載の方法により、各マウス網膜の切片を作製した。作製したマウス網膜の切片をＰＢＳで洗浄し、０．１％ ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ社製）／ＰＢＳで１分間染色した。染色後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、標本を封入剤で封入した。封入した標本は正立型顕微鏡の微分干渉検鏡対物レンズにより観察した。
【0093】
（結果）
実施例５より、マウス網膜組織における各細胞層（視細胞外節、視細胞層、内神経細胞層及び神経節細胞層）において、Ｋｌｈｌ１８遺伝子を欠損させることによるマウス網膜組織への影響は見られなかった（図５）。
実施例５より、マウス網膜組織における各細胞層（視細胞外節、視細胞層、内神経細胞層及び神経節細胞層）において、Ｋｌｈｌ１８遺伝子を欠損させることによるマウス網膜組織への影響は見られなかった（図５）。
【0094】
［実施例６］（Ｋｌｈｌ１８タンパク質の標的Ｕｎｃ１１９タンパク質への影響）
（ウエスタンブロッティング）
１ヶ月齢のＫｌｈｌ１８ ＫＯマウス及び野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系）マウス（日本ＳＬＣより購入）より、定法に従い採取した網膜組織は、２×サンプルバッファー (０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ６．８)、１％ ＳＤＳ、５％ βメルカプトエタノール、１０％ グリセロール、０．０２％ ＢＰＢ)に溶解し、１００℃で５分間熱処理を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に１２Ｖ、９０分間の条件で電気的に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜はブロッキング溶液（５％ スキムミルク、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳ）を用いて、室温で１時間振盪してブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＶＤＦ膜はブロッキング溶液で希釈した一次抗体と４℃で一晩反応させた。一次抗体には、抗Ｕｎｃ１１９抗体（マウスモノクローナル、Ｄｒ. Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、米国）より譲渡（Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ、２００８）、１：１０希釈）及びα－Ｔｕｂｌｉｎ（マウスモノクローナル、Ｓｉｇｍａ社製、１：６，０００希釈）をそれぞれ使用した。一次抗体反応終了後のＰＶＤＦ膜は０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳを用いて室温で１０分間振盪して３回洗浄した。洗浄後のＰＶＤＦ膜はブロッキング溶液で希釈した二次抗体と室温で１時間反応させた。二次抗体には、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ付加抗体（ヤギポリクローナル、Ｚｙｍｅｄ社製、１：６，０００希釈）を使用した。二次抗体反応終了後、再び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳを用いて室温で１０分間振盪して３回洗浄した。洗浄後、ＰＶＤＦ膜を化学発光試薬（Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）またはＰｉｅｒｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社））に反応させ、Ｘ線フィルムに感光させた後、現像機を用いて目的タンパク質の検出を行った。
（ウエスタンブロッティング）
１ヶ月齢のＫｌｈｌ１８ ＫＯマウス及び野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系）マウス（日本ＳＬＣより購入）より、定法に従い採取した網膜組織は、２×サンプルバッファー (０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ６．８)、１％ ＳＤＳ、５％ βメルカプトエタノール、１０％ グリセロール、０．０２％ ＢＰＢ)に溶解し、１００℃で５分間熱処理を行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った後、ゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に１２Ｖ、９０分間の条件で電気的に転写した。タンパク質を転写したＰＶＤＦ膜はブロッキング溶液（５％ スキムミルク、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳ）を用いて、室温で１時間振盪してブロッキングした。ブロッキング終了後、ＰＶＤＦ膜はブロッキング溶液で希釈した一次抗体と４℃で一晩反応させた。一次抗体には、抗Ｕｎｃ１１９抗体（マウスモノクローナル、Ｄｒ. Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、米国）より譲渡（Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ、２００８）、１：１０希釈）及びα－Ｔｕｂｌｉｎ（マウスモノクローナル、Ｓｉｇｍａ社製、１：６，０００希釈）をそれぞれ使用した。一次抗体反応終了後のＰＶＤＦ膜は０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳを用いて室温で１０分間振盪して３回洗浄した。洗浄後のＰＶＤＦ膜はブロッキング溶液で希釈した二次抗体と室温で１時間反応させた。二次抗体には、抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ付加抗体（ヤギポリクローナル、Ｚｙｍｅｄ社製、１：６，０００希釈）を使用した。二次抗体反応終了後、再び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／ＴＢＳを用いて室温で１０分間振盪して３回洗浄した。洗浄後、ＰＶＤＦ膜を化学発光試薬（Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ（ナカライテスク社製）またはＰｉｅｒｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社））に反応させ、Ｘ線フィルムに感光させた後、現像機を用いて目的タンパク質の検出を行った。
【0095】
（結果）
実施例６より、網膜ユビキチン化酵素Ｋｌｈｌ１８タンパク質がＵｎｃ１１９タンパク質を標的とすることが、野生型及びＫｌｈｌ１８ ＫＯタンパク質由来のバンドを比較することで確認された（図６）。さらに、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスの網膜において、ユビキチン化の欠損によりＵｎｃ１１９タンパク質量が増加することが確認された（図６）。
実施例６より、網膜ユビキチン化酵素Ｋｌｈｌ１８タンパク質がＵｎｃ１１９タンパク質を標的とすることが、野生型及びＫｌｈｌ１８ ＫＯタンパク質由来のバンドを比較することで確認された（図６）。さらに、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスの網膜において、ユビキチン化の欠損によりＵｎｃ１１９タンパク質量が増加することが確認された（図６）。
【0096】
［実施例７］（Ｋｌｈｌ１８タンパク質欠損による視覚機能への影響）
（網膜電図（Ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ；ＥＲＧ）検査）
生後２ヶ月齢の野生型又はＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスを明順応又は暗順応させた。明順応は約１０００ｌｕｘ下で１時間以上、暗順応は暗室で４時間以上マウスを置いて行った。暗順応又は明順応させたマウスにケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ、マウス体重あたり１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ、マウス体重あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を混合した生理食塩水を腹腔内注射し麻酔を行った。次に、マウス瞳孔を０．５％トロピカミド（ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ）及び０．５％フェニレフリン塩酸塩（ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ ＨＣｌ）混合液を点眼して散瞳させた。ＥＲＧ検査は白色ＬＥＤストロボ光を発する電極（ＰｕＲＥＣ；メイヨー社製）を被験マウス眼球の角膜に接触させ、ＬＥＤ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＬＳ－１００，メイヨー社製）にて刺激光で刺激し、ＴＡ－１００（メイヨー社製）にて波形を記録して行った（図７Ａ及び図８Ａ）。暗条件下網膜電図（ｓｃｏｔｏｐｉｃ ＥＲＧ）においては、－４．０～１．０ ｌｏｇ ｃｄ－ｓ／ｍ２の光度範囲に渡る４段階強度（－４．０、－３．０、－１．０及び１ ｌｏｇ ｃｄ－ｓ／ｍ２）のストロボ光刺激による桿体視細胞機能検査測定を行い、明条件下網膜電図（ｐｈｏｔｏｐｉｃ ＥＲＧ）においては、－０．５～１．０ ｌｏｇ ｃｄ－ｓ／ｍ２の光度範囲に渡る４段階強度（－０．５、０、０．５及び１ ｌｏｇ ｃｄ－ｓ／ｍ２）のストロボ光刺激による錐体視細胞機能測定を行った。得られた波形データから、ａ波及びｂ波を数値化し、それぞれの測定値は平均値±標準誤差で示した。明条件下網膜電図は桿体視細胞機能を抑制するために１．３ ｌｏｇ ｃｄ／ｍ２の白色背景光を照射する条件下において測定した。
（網膜電図（Ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ；ＥＲＧ）検査）
生後２ヶ月齢の野生型又はＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスを明順応又は暗順応させた。明順応は約１０００ｌｕｘ下で１時間以上、暗順応は暗室で４時間以上マウスを置いて行った。暗順応又は明順応させたマウスにケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ、マウス体重あたり１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ、マウス体重あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を混合した生理食塩水を腹腔内注射し麻酔を行った。次に、マウス瞳孔を０．５％トロピカミド（ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ）及び０．５％フェニレフリン塩酸塩（ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ ＨＣｌ）混合液を点眼して散瞳させた。ＥＲＧ検査は白色ＬＥＤストロボ光を発する電極（ＰｕＲＥＣ；メイヨー社製）を被験マウス眼球の角膜に接触させ、ＬＥＤ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＬＳ－１００，メイヨー社製）にて刺激光で刺激し、ＴＡ－１００（メイヨー社製）にて波形を記録して行った（図７Ａ及び図８Ａ）。暗条件下網膜電図（ｓｃｏｔｏｐｉｃ ＥＲＧ）においては、－４．０～１．０ ｌｏｇ ｃｄ－ｓ／ｍ２の光度範囲に渡る４段階強度（－４．０、－３．０、－１．０及び１ ｌｏｇ ｃｄ－ｓ／ｍ２）のストロボ光刺激による桿体視細胞機能検査測定を行い、明条件下網膜電図（ｐｈｏｔｏｐｉｃ ＥＲＧ）においては、－０．５～１．０ ｌｏｇ ｃｄ－ｓ／ｍ２の光度範囲に渡る４段階強度（－０．５、０、０．５及び１ ｌｏｇ ｃｄ－ｓ／ｍ２）のストロボ光刺激による錐体視細胞機能測定を行った。得られた波形データから、ａ波及びｂ波を数値化し、それぞれの測定値は平均値±標準誤差で示した。明条件下網膜電図は桿体視細胞機能を抑制するために１．３ ｌｏｇ ｃｄ／ｍ２の白色背景光を照射する条件下において測定した。
【0097】
（結果）
実施例７により、暗順応条件下において、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスでは、ａ波及びｂ波ともに値が低下していた（図７Ｂ及び７Ｃ）。これにより、暗所における機能（主に網膜桿体視細胞由来の機能）において、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスは、野生型マウスと比較して、光刺激に対する反応が弱く、桿体視細胞の機能が減弱していることが確認された（図７Ａ～Ｃ）。これは、Ｋｌｈｌ１８遺伝子を欠損し、網膜視細胞においてＫｌｈｌ１８タンパク質の機能が失われることにより、網膜視細胞全体が明順応化した状態にあることを示している。
これに対し、明順応条件下において、ａ波及びｂ波の値は、野生型マウス及びＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスともに正常であった（図８Ｂ及び８Ｃ）。これにより、明所における機能（主に網膜錐体視細胞由来の機能）において、光刺激に対する反応は、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスと野生型マウスの間に違いは見られず、明所における機能は正常であった（図８Ａ～Ｃ）。
実施例７により、暗順応条件下において、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスでは、ａ波及びｂ波ともに値が低下していた（図７Ｂ及び７Ｃ）。これにより、暗所における機能（主に網膜桿体視細胞由来の機能）において、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスは、野生型マウスと比較して、光刺激に対する反応が弱く、桿体視細胞の機能が減弱していることが確認された（図７Ａ～Ｃ）。これは、Ｋｌｈｌ１８遺伝子を欠損し、網膜視細胞においてＫｌｈｌ１８タンパク質の機能が失われることにより、網膜視細胞全体が明順応化した状態にあることを示している。
これに対し、明順応条件下において、ａ波及びｂ波の値は、野生型マウス及びＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスともに正常であった（図８Ｂ及び８Ｃ）。これにより、明所における機能（主に網膜錐体視細胞由来の機能）において、光刺激に対する反応は、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスと野生型マウスの間に違いは見られず、明所における機能は正常であった（図８Ａ～Ｃ）。
【0098】
［実施例８］（Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウス網膜における光シグナル伝達タンパク質トランスデューシンαの局在解析）
（１）明条件及び暗条件下マウス網膜の採取
生後２ヶ月齢の野生型又はＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスを明順応又は暗順応させた。明順応は約１０００ｌｕｘ下で１時間以上、暗順応は暗室で４時間以上マウスを置いて行った。眼球を明順応条件では約１０００ｌｕｘ下、暗順応条件では暗室において赤ランプ下で回収し、４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ/ＰＢＳを用いて６０分から９０分間固定した。固定終了後ＰＢＳで洗浄し、ＯＣＴコンパウンドで包埋した。
（１）明条件及び暗条件下マウス網膜の採取
生後２ヶ月齢の野生型又はＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスを明順応又は暗順応させた。明順応は約１０００ｌｕｘ下で１時間以上、暗順応は暗室で４時間以上マウスを置いて行った。眼球を明順応条件では約１０００ｌｕｘ下、暗順応条件では暗室において赤ランプ下で回収し、４％ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ/ＰＢＳを用いて６０分から９０分間固定した。固定終了後ＰＢＳで洗浄し、ＯＣＴコンパウンドで包埋した。
【0099】
（２）免疫組織化学染色
上記条件のもと採取した網膜を用いて、実施例２の（２）に記載の方法により、各マウス網膜の切片を作製した。切片をＰＢＳで２回洗浄した後、ブロッキングバッファー（４％ Ｎｏｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ／０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ）で室温、１時間ブロッキングした。その後、一次抗体を４℃で、一晩反応させた。切片をＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体を室温で、２時間反応させた。一次抗体には、抗ＧαＴ１抗体（トランスデューシン、ウサギポリクローナル、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、１：５００希釈)を用い、二次抗体には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８標識抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１：５００希釈）を用いた。二次抗体の反応終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、封入剤を用いて封入した。全ての蛍光画像は、共焦点レーザスキャン顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて獲得した。
上記条件のもと採取した網膜を用いて、実施例２の（２）に記載の方法により、各マウス網膜の切片を作製した。切片をＰＢＳで２回洗浄した後、ブロッキングバッファー（４％ Ｎｏｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ／０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ）で室温、１時間ブロッキングした。その後、一次抗体を４℃で、一晩反応させた。切片をＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体を室温で、２時間反応させた。一次抗体には、抗ＧαＴ１抗体（トランスデューシン、ウサギポリクローナル、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、１：５００希釈)を用い、二次抗体には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８標識抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１：５００希釈）を用いた。二次抗体の反応終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、封入剤を用いて封入した。全ての蛍光画像は、共焦点レーザスキャン顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて獲得した。
【0100】
（結果）
実施例８により、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウス網膜では、野生型マウス網膜と比較して、暗条件下においても光シグナル伝達タンパク質であるトランデューシンαタンパク質が視細胞層に局在していることが確認された（図９）。網膜の視細胞において、明順応下ではトランスデューシンａｌｐｈａ（α）サブユニットが外節から細胞体へと移動することにより光受容感度が下がること、暗順応下では逆に細胞体から外節に移動することにより光受容感度が上がることが知られている。これはＫｌｈｌ１８ ＫＯマウス網膜が、暗条件下にもかかわらず明順応化していることを示している。
実施例８により、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウス網膜では、野生型マウス網膜と比較して、暗条件下においても光シグナル伝達タンパク質であるトランデューシンαタンパク質が視細胞層に局在していることが確認された（図９）。網膜の視細胞において、明順応下ではトランスデューシンａｌｐｈａ（α）サブユニットが外節から細胞体へと移動することにより光受容感度が下がること、暗順応下では逆に細胞体から外節に移動することにより光受容感度が上がることが知られている。これはＫｌｈｌ１８ ＫＯマウス網膜が、暗条件下にもかかわらず明順応化していることを示している。
【0101】
［実施例９］（網膜ユビキチン化酵素Ｋｌｈｌ１８タンパク質の機能阻害実験；Ｋｌｈｌ１８タンパク質のＣ末断片）
（１）プラスミドの作製
（ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８）
マウスＫｌｈｌ１８遺伝子のタンパク質（５７４残基）翻訳領域全長はｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６－Ｋｌｈｌ１８プラスミドＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＢＣ０２５５６３）（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマー配列はフォワードプライマー（配列番号６６）及びリバースプライマー（配列番号６７）を用いた。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）及びＮｏｔＩ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて制限酵素処理した。同様に制限酵素ＣｌａＩ及びＮｏｔＩを用いてｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ（Ｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ.、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７，２２６７１－２２６７６，２０１０）プラスミドを制限酵素処理した。制限酵素処理したＤＮＡ断片及びｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧプラスミドをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ.２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って組み込み、ＦＬＡＧタグ付加全長Ｋｌｈｌ１８タンパク質発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８を作製した。
（ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｃ－Ｋｌｈｌ１８）
マウスＫｌｈｌ１８遺伝子のＣ末側タンパク質（Ｃ末側２９８残基）翻訳領域は、上記のＦＬＡＧタグ付加Ｋｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８を鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマー配列はフォワードプライマー（配列番号６８）及びリバースプライマー（配列番号６９）を用いた。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ社製）及びＳａｌＩ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて制限酵素処理した。同様にｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて制限酵素処理した。制限酵素処理したＣ末側タンパク質断片及びｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧプラスミドを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ.２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って組み込み、ＦＬＡＧタグ付加Ｃ末側Ｋｌｈｌ１８タンパク質発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｃ－Ｋｌｈｌ１８を作製した。
（ｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９）
マウスＵｎｃ１１９遺伝子のタンパク質（２６２残基）翻訳領域全長は、成体Ｃ５７ＢＬ/６Ｎ野生型マウス網膜ｃＤＮＡを定法に従い作製し、それを鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマー配列はフォワードプライマー（配列番号７０）及びリバースプライマー（配列番号７１）を用いた。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ社製）及びＮｏｔＩを用いて制限酵素処理した。同様にｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡプラスミドを制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩを用いて制限酵素処理した。制限酵素処理したＤＮＡ断片及びｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡプラスミドを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ.２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って組み込み、ＨＡタグ付加Ｕｎｃ１１９タンパク質発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９を作製した。
（１）プラスミドの作製
（ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８）
マウスＫｌｈｌ１８遺伝子のタンパク質（５７４残基）翻訳領域全長はｐＣＭＶ－ＳＰＯＲＴ６－Ｋｌｈｌ１８プラスミドＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＢＣ０２５５６３）（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマー配列はフォワードプライマー（配列番号６６）及びリバースプライマー（配列番号６７）を用いた。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＣｌａＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社製）及びＮｏｔＩ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて制限酵素処理した。同様に制限酵素ＣｌａＩ及びＮｏｔＩを用いてｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ（Ｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ.、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７，２２６７１－２２６７６，２０１０）プラスミドを制限酵素処理した。制限酵素処理したＤＮＡ断片及びｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧプラスミドをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ.２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って組み込み、ＦＬＡＧタグ付加全長Ｋｌｈｌ１８タンパク質発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８を作製した。
（ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｃ－Ｋｌｈｌ１８）
マウスＫｌｈｌ１８遺伝子のＣ末側タンパク質（Ｃ末側２９８残基）翻訳領域は、上記のＦＬＡＧタグ付加Ｋｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８を鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマー配列はフォワードプライマー（配列番号６８）及びリバースプライマー（配列番号６９）を用いた。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ社製）及びＳａｌＩ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて制限酵素処理した。同様にｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて制限酵素処理した。制限酵素処理したＣ末側タンパク質断片及びｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧプラスミドを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ.２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って組み込み、ＦＬＡＧタグ付加Ｃ末側Ｋｌｈｌ１８タンパク質発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｃ－Ｋｌｈｌ１８を作製した。
（ｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９）
マウスＵｎｃ１１９遺伝子のタンパク質（２６２残基）翻訳領域全長は、成体Ｃ５７ＢＬ/６Ｎ野生型マウス網膜ｃＤＮＡを定法に従い作製し、それを鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従い、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲに用いたプライマー配列はフォワードプライマー（配列番号７０）及びリバースプライマー（配列番号７１）を用いた。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩ（ＴＯＹＯＢＯ社製）及びＮｏｔＩを用いて制限酵素処理した。同様にｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡプラスミドを制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩを用いて制限酵素処理した。制限酵素処理したＤＮＡ断片及びｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡプラスミドを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ.２（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って組み込み、ＨＡタグ付加Ｕｎｃ１１９タンパク質発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９を作製した。
【0102】
（２）阻害実験
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、抗生物質（ペニシリン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１００μｇ／ｍＬ））及び１０％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（和光純薬社製）を用い、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＦＬＡＧタグ付加全長Ｋｌｈｌ１８タンパク質発現プラスミド及び／又はＦＬＡＧタグ付加Ｃ末側Ｋｌｈｌ１８タンパク質発現プラスミド及び／又はＨＡタグ付加Ｕｎｃ１１９タンパク質発現プラスミド導入は、定法に従い、リン酸カルシウム法により行った。詳細には、プラスミド導入を行う前日に細胞を１００ｍｍシャーレに1×１０6細胞となるように播きなおした。プラスミド導入を行う直前に培養培地を交換した。各プラスミドＤＮＡをそれぞれの組合せに応じて１μｇ、滅菌水と混合し、このＤＮＡ溶液に０．５Ｍ 塩化カルシウム（終濃度 １２５ｍＭ）を加え、さらにこの混合溶液と等量の２×ＢＥＳ（５０ｍＭ ＢＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．９５）を加えて混合した。この混合液を細胞に滴下して２４時間培養した。２４時間後に培地を新しいものに交換し、さらに２４時間培養した後に細胞を回収した。
回収した細胞は、実施例６と同様の方法により、ウエスタンブロッティングに用いた。一次抗体は、抗ＨＡ抗体（ラットモノクローナル、Ｒｏｃｈｅ社製、１：１０，０００希釈)を用い、二次抗体は、抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ付加抗体（ヤギポリクローナル、Ｚｙｍｅｄ社製、１：６，０００希釈）を使用した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、抗生物質（ペニシリン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、１００μｇ／ｍＬ））及び１０％ ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（和光純薬社製）を用い、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＦＬＡＧタグ付加全長Ｋｌｈｌ１８タンパク質発現プラスミド及び／又はＦＬＡＧタグ付加Ｃ末側Ｋｌｈｌ１８タンパク質発現プラスミド及び／又はＨＡタグ付加Ｕｎｃ１１９タンパク質発現プラスミド導入は、定法に従い、リン酸カルシウム法により行った。詳細には、プラスミド導入を行う前日に細胞を１００ｍｍシャーレに1×１０6細胞となるように播きなおした。プラスミド導入を行う直前に培養培地を交換した。各プラスミドＤＮＡをそれぞれの組合せに応じて１μｇ、滅菌水と混合し、このＤＮＡ溶液に０．５Ｍ 塩化カルシウム（終濃度 １２５ｍＭ）を加え、さらにこの混合溶液と等量の２×ＢＥＳ（５０ｍＭ ＢＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．９５）を加えて混合した。この混合液を細胞に滴下して２４時間培養した。２４時間後に培地を新しいものに交換し、さらに２４時間培養した後に細胞を回収した。
回収した細胞は、実施例６と同様の方法により、ウエスタンブロッティングに用いた。一次抗体は、抗ＨＡ抗体（ラットモノクローナル、Ｒｏｃｈｅ社製、１：１０，０００希釈)を用い、二次抗体は、抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ付加抗体（ヤギポリクローナル、Ｚｙｍｅｄ社製、１：６，０００希釈）を使用した。
【0103】
（結果）
実施例９により、マウスＫｌｈｌ１８遺伝子のＣ末側タンパク質（Ｃ末側２９８残基）は、全長Ｋｌｈｌ１８タンパク質による標的Ｕｎｃ１１９タンパク質の分解を抑制できることが確認された（図１０）。
実施例９により、マウスＫｌｈｌ１８遺伝子のＣ末側タンパク質（Ｃ末側２９８残基）は、全長Ｋｌｈｌ１８タンパク質による標的Ｕｎｃ１１９タンパク質の分解を抑制できることが確認された（図１０）。
【0104】
［実施例１０］（網膜ユビキチン化酵素Ｋｌｈｌ１８タンパク質の機能阻害実験；プロテオソーム阻害剤（ＭＧ－１３２））
実施例９で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８プラスミド及び／又はｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９プラスミドのＨＥＫ２９３Ｔ細胞への導入は、定法に従い、リン酸カルシウム法により行った。プロテオソーム阻害剤ＭＧ－１３２（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）は、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に１０ｍＭになるように溶解したストック溶液を作製した。その後、０．１％ ＭＧ－１３２含有培地（最終濃度１０μＭ）又はコントロールとして、０．１％ ＤＭＳＯ含有培地と交換し、培地交換６時間後に細胞を回収した。回収した細胞は、実施例９と同じ方法により、ウエスタンブロッティングを行った。
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に対しても、同様の実験手順に従って実験を行った。
実施例９で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８プラスミド及び／又はｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９プラスミドのＨＥＫ２９３Ｔ細胞への導入は、定法に従い、リン酸カルシウム法により行った。プロテオソーム阻害剤ＭＧ－１３２（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）は、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に１０ｍＭになるように溶解したストック溶液を作製した。その後、０．１％ ＭＧ－１３２含有培地（最終濃度１０μＭ）又はコントロールとして、０．１％ ＤＭＳＯ含有培地と交換し、培地交換６時間後に細胞を回収した。回収した細胞は、実施例９と同じ方法により、ウエスタンブロッティングを行った。
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞に対しても、同様の実験手順に従って実験を行った。
【0105】
（結果）
実施例１０により、プロテアソーム阻害剤ＭＧ－１３２は、全長Ｋｌｈｌ１８タンパク質による標的Ｕｎｃ１１９タンパク質の分解を抑制できることが確認された（図１１）。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞においても、同様の効果が確認された。
実施例１０により、プロテアソーム阻害剤ＭＧ－１３２は、全長Ｋｌｈｌ１８タンパク質による標的Ｕｎｃ１１９タンパク質の分解を抑制できることが確認された（図１１）。Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞においても、同様の効果が確認された。
【0106】
［実施例１１］（Ｋｌｈｌ１８とＵｎｃ１１９の結合解析実験１）
（１）プラスミドの作製
（ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９）
実施例９において作製したｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９からＵｎｃ１１９ ｃＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理した後、同じくＸｈｏＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理したｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡプラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して組み込み、ＨＡタグ付加Ｕｎｃ１１９発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９を作製した。
（ｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｋｌｈｌ１８）
実施例９において作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８からＫｌｈｌ１８ ｃＤＮＡ断片をＣｌａＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理した後、同じくＣｌａＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理したｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡプラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して組み込み、ＦＬＡＧタグ付加全長Ｋｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｋｌｈｌ１８を作製した。
（１）プラスミドの作製
（ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９）
実施例９において作製したｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９からＵｎｃ１１９ ｃＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理した後、同じくＸｈｏＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理したｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡプラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して組み込み、ＨＡタグ付加Ｕｎｃ１１９発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９を作製した。
（ｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｋｌｈｌ１８）
実施例９において作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８からＫｌｈｌ１８ ｃＤＮＡ断片をＣｌａＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理した後、同じくＣｌａＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理したｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡプラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して組み込み、ＦＬＡＧタグ付加全長Ｋｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｋｌｈｌ１８を作製した。
【0107】
（２）免疫沈降法
実施例９で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８及びｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９、並びに実施例１１で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９及びｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｋｌｈｌ１８を使用して免疫沈降法を行った。免疫沈降にはＡｎｔｉ－ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＫｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８とＵｎｃ１１９発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９、並びにＫｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｋｌｈｌ１８とＵｎｃ１１９発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９の組み合わせで共発現させ、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＳ，１％ ＮＰ－４０，１ ｍＭ ＥＤＴＡ，５μｇ／μＬ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２ μｇ／μＬ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，３ μｇ／μＬ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ，１ ｍＭ ＰＭＳＦ）で細胞をｌｙｓｉｓし、遠心（１４，０００ ｒｐｍ、半径 ５．４ｃｍ、４℃、１０分間）した。遠心後、上清にＡｎｔｉ-ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを加え４℃で一晩反応させた。沈降物の溶出にはＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。免疫沈降のサンプルはウエスタンブロッティングにより解析した。
実施例９で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８及びｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９、並びに実施例１１で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９及びｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｋｌｈｌ１８を使用して免疫沈降法を行った。免疫沈降にはＡｎｔｉ－ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＫｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８とＵｎｃ１１９発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９、並びにＫｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｋｌｈｌ１８とＵｎｃ１１９発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９の組み合わせで共発現させ、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＳ，１％ ＮＰ－４０，１ ｍＭ ＥＤＴＡ，５μｇ／μＬ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２ μｇ／μＬ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，３ μｇ／μＬ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ，１ ｍＭ ＰＭＳＦ）で細胞をｌｙｓｉｓし、遠心（１４，０００ ｒｐｍ、半径 ５．４ｃｍ、４℃、１０分間）した。遠心後、上清にＡｎｔｉ-ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌを加え４℃で一晩反応させた。沈降物の溶出にはＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。免疫沈降のサンプルはウエスタンブロッティングにより解析した。
【0108】
（結果）
実施例１１により、ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８とｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９が相互作用することが確認された（図１２Ａ）。また、ＦｌａｇタグとＨＡタグを入れ替えて実験を行った場合でも、同様にｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９とｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｋｌｈｌ１８が相互作用することが確認された（図１２Ｂ）。
実施例１１により、ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８とｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９が相互作用することが確認された（図１２Ａ）。また、ＦｌａｇタグとＨＡタグを入れ替えて実験を行った場合でも、同様にｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９とｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｋｌｈｌ１８が相互作用することが確認された（図１２Ｂ）。
【0109】
［実施例１２］（Ｋｌｈｌ１８タンパク質によるＵｎｃ１１９タンパク質のユビキチン化解析）
（１）プラスミド作製
（ｐＣＡＧ－Ｎ－６ｘＨｉｓ－Ｕｂ）
マウスユビキチンタンパク質（７６残基）翻訳領域全長は成体Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス網膜ｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲにはフォワードプライマー（配列番号７２）及びリバースプライマー（配列番号７３）を使用した。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理した後、同様にＸｈｏＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理したｐＣＡＧ－Ｎ－６ｘＨｉｓプラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用してそれぞれ組み込み、６Ｈｉｓタグ付加ユビキチンタンパク質発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－６ｘＨｉｓ－Ｕｂを作製した。
（ｐＣＡＧ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐ）
マウスＫｌｈｌ１８遺伝子の蛋白質（５７４残基）翻訳領域全長は、成体１２９Ｓｖ／Ｅｖ野生型マウス網膜ｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには、フォワードプライマー（配列番号７４）とリバースプライマー（配列番号７５）を使用した。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩプラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して組み込み、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐを作製した。次にｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐプラスミドとｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦｌａｇ－Ｋｌｈｌ１８プラスミドをＸｍａＩとＳａｃＩを用いて制限酵素処理し、ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦｌａｇ－Ｋｌｈｌ１８から切り出されたＸｍａＩ－ＳａｃＩ ＤＮＡ断片をｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐから切り出されたＸｍａＩ－ＳａｃＩ ＤＮＡ断片と入れ替える形でＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して組み込み、Ｆｌａｇタグ付加Ｋｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦｌａｇ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐを作製した。
作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦｌａｇ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐを鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）により以下に示す配列のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには、フォワードプライマー（配列番号７６）及びリバースプライマー（配列番号７７）を使用した。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して組み込み、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｋｌｈｌ１８－Ｎ末＋Ｋｏｚａｋプラスミドを作製した。ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｋｌｈｌ１８－Ｎ末＋ＫｏｚａｋプラスミドはＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｐＣＡＧ－ Ｎ－３ｘＦｌａｇ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐプラスミドはＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理し、インサートＤＮＡ断片を得た。これらのインサートＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理したｐＣＡＧＧＳＩＩ（Ｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ., ２０１０）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用してそれぞれ組み込み、タグ付加なしＫｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐを作製した。
（１）プラスミド作製
（ｐＣＡＧ－Ｎ－６ｘＨｉｓ－Ｕｂ）
マウスユビキチンタンパク質（７６残基）翻訳領域全長は成体Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス網膜ｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲにはフォワードプライマー（配列番号７２）及びリバースプライマー（配列番号７３）を使用した。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をＸｈｏＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理した後、同様にＸｈｏＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理したｐＣＡＧ－Ｎ－６ｘＨｉｓプラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用してそれぞれ組み込み、６Ｈｉｓタグ付加ユビキチンタンパク質発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－６ｘＨｉｓ－Ｕｂを作製した。
（ｐＣＡＧ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐ）
マウスＫｌｈｌ１８遺伝子の蛋白質（５７４残基）翻訳領域全長は、成体１２９Ｓｖ／Ｅｖ野生型マウス網膜ｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには、フォワードプライマー（配列番号７４）とリバースプライマー（配列番号７５）を使用した。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩプラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して組み込み、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐを作製した。次にｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐプラスミドとｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦｌａｇ－Ｋｌｈｌ１８プラスミドをＸｍａＩとＳａｃＩを用いて制限酵素処理し、ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦｌａｇ－Ｋｌｈｌ１８から切り出されたＸｍａＩ－ＳａｃＩ ＤＮＡ断片をｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐから切り出されたＸｍａＩ－ＳａｃＩ ＤＮＡ断片と入れ替える形でＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して組み込み、Ｆｌａｇタグ付加Ｋｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦｌａｇ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐを作製した。
作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦｌａｇ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐを鋳型として、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）により以下に示す配列のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには、フォワードプライマー（配列番号７６）及びリバースプライマー（配列番号７７）を使用した。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用して組み込み、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｋｌｈｌ１８－Ｎ末＋Ｋｏｚａｋプラスミドを作製した。ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－Ｋｌｈｌ１８－Ｎ末＋ＫｏｚａｋプラスミドはＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ｐＣＡＧ－ Ｎ－３ｘＦｌａｇ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐプラスミドはＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理し、インサートＤＮＡ断片を得た。これらのインサートＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩを用いて制限酵素処理したｐＣＡＧＧＳＩＩ（Ｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ., ２０１０）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用してそれぞれ組み込み、タグ付加なしＫｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐを作製した。
【0110】
（２）ユビキチン化解析実験
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞にｐＣＡＧ－Ｎ－６ｘＨｉｓ－Ｕｂプラスミド、ｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９プラスミド、ｐＣＡＧ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐプラスミドを定法に従い導入し、それらを発現させ、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５），０．５ Ｍ ＮａＣｌ，８ Ｍ Ｕｒｅａ，５ ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で細胞を溶解し、ソニケーターで破砕した後、遠心（１４，０００ ｒｐｍ、半径 ５．４ｃｍ、４℃、１０分間）した。遠心後、上清にＮｉ－ＮＴＡ－ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を加え４℃で一晩反応させた。沈降物はＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、２ｘＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えサンプル化し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングにより解析した。
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞にｐＣＡＧ－Ｎ－６ｘＨｉｓ－Ｕｂプラスミド、ｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９プラスミド、ｐＣＡＧ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐプラスミドを定法に従い導入し、それらを発現させ、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５），０．５ Ｍ ＮａＣｌ，８ Ｍ Ｕｒｅａ，５ ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で細胞を溶解し、ソニケーターで破砕した後、遠心（１４，０００ ｒｐｍ、半径 ５．４ｃｍ、４℃、１０分間）した。遠心後、上清にＮｉ－ＮＴＡ－ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（ＱＩＡＧＥＮ）を加え４℃で一晩反応させた。沈降物はＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、２ｘＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えサンプル化し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウエスタンブロッティングにより解析した。
【0111】
（結果）
実施例１２により、Ｋｌｈｌ１８タンパク質が、Ｕｎｃ１１９タンパク質をユビキチン化することが確認された（図１３）。
実施例１２により、Ｋｌｈｌ１８タンパク質が、Ｕｎｃ１１９タンパク質をユビキチン化することが確認された（図１３）。
【0112】
［実施例１３］（Ｋｌｈｌ１８タンパク質とＵｎｃ１１９タンパク質との結合解析実験２）
（１）プラスミド作製
（ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｎ－Ｋｌｈｌ１８）
マウスＫｌｈｌ１８遺伝子のＮ末側タンパク質（Ｎ末側２７６残基） 翻訳領域は作製したｐＣＡＧ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐプラスミドを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（Ｔａｋａｒａ社）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには、フォワードプライマー（配列番号７８）及びリバースプライマー（配列番号７９）を用いた。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧプラスミドに組み込み、ＦＬＡＧタグ付加Ｎ末側Ｋｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｎ－Ｋｌｈｌ１８を作製した。
（１）プラスミド作製
（ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｎ－Ｋｌｈｌ１８）
マウスＫｌｈｌ１８遺伝子のＮ末側タンパク質（Ｎ末側２７６残基） 翻訳領域は作製したｐＣＡＧ－Ｋｌｈｌ１８－ｓｗａｐプラスミドを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ（Ｔａｋａｒａ社）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには、フォワードプライマー（配列番号７８）及びリバースプライマー（配列番号７９）を用いた。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧプラスミドに組み込み、ＦＬＡＧタグ付加Ｎ末側Ｋｌｈｌ１８発現プラスミドｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｎ－Ｋｌｈｌ１８を作製した。
【0113】
（２）免疫沈降法
実施例９で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９プラスミド及びｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｃ－Ｋｌｈｌ１８プラスミド、並びに実施例１３で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｎ－Ｋｌｈｌ１８プラスミドを使用して、実施例１１と同様の方法により免疫沈降法を行った。
実施例９で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９プラスミド及びｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｃ－Ｋｌｈｌ１８プラスミド、並びに実施例１３で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｎ－Ｋｌｈｌ１８プラスミドを使用して、実施例１１と同様の方法により免疫沈降法を行った。
【0114】
（結果）
実施例１３により、Ｕｎｃ１１９タンパク質は、Ｋｌｈｌ１８の全長タンパク質及びＫｌｈｌ１８のＣ末端側タンパク質と相互作用することが確認された（図１４）。これらの結果から、Ｕｎｃ１１９タンパク質は、Ｋｌｈｌ１８タンパク質のＣ末端領域を介して相互作用していることが確認された。
実施例１３により、Ｕｎｃ１１９タンパク質は、Ｋｌｈｌ１８の全長タンパク質及びＫｌｈｌ１８のＣ末端側タンパク質と相互作用することが確認された（図１４）。これらの結果から、Ｕｎｃ１１９タンパク質は、Ｋｌｈｌ１８タンパク質のＣ末端領域を介して相互作用していることが確認された。
【0115】
［実施例１４］（網膜ユビキチン化酵素Ｋｌｈｌ１８タンパク質の機能阻害実験；Ｎｅｄｄ８活性化酵素阻害剤（ＭＬＮ４９２４））
実施例１０と同様の方法で、ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８プラスミド及び／又はｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ導入した。ＭＬＮ４９２４（Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ社）は、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解した１００ μＭストック溶液を作製し、細胞回収の６時間前に０．３％ ＭＬＮ４９２４ストック溶液（最終濃度 ０．３ μＭ) または０．３％ ＤＭＳＯ（コントロール）となるように０．１％ ＤＭＳＯ含有培地と交換し、培地交換６時間後に細胞を回収した。回収した細胞は、実施例９と同じ方法により、ウエスタンブロッティングを行った。
実施例１０と同様の方法で、ｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｋｌｈｌ１８プラスミド及び／又はｐＣＡＧ－Ｎ－２ｘＨＡ－Ｕｎｃ１１９プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞へ導入した。ＭＬＮ４９２４（Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ社）は、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解した１００ μＭストック溶液を作製し、細胞回収の６時間前に０．３％ ＭＬＮ４９２４ストック溶液（最終濃度 ０．３ μＭ) または０．３％ ＤＭＳＯ（コントロール）となるように０．１％ ＤＭＳＯ含有培地と交換し、培地交換６時間後に細胞を回収した。回収した細胞は、実施例９と同じ方法により、ウエスタンブロッティングを行った。
【0116】
（結果）
実施例１４により、Ｎｅｄｄ８活性化酵素阻害剤ＭＬＮ４９２４は、全長Ｋｌｈｌ１８タンパク質による標的Ｕｎｃ１１９タンパク質の分解を抑制できることが確認された（図１５）。
実施例１４により、Ｎｅｄｄ８活性化酵素阻害剤ＭＬＮ４９２４は、全長Ｋｌｈｌ１８タンパク質による標的Ｕｎｃ１１９タンパク質の分解を抑制できることが確認された（図１５）。
【0117】
［実施例１５］（ｉｎ ｖｉｖｏ エレクトロポレーション）
（１）プラスミド作製
（ｐＣＡＧＩＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９）
実施例１１で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９をＳａｌＩとＮｏｔＩで制限酵素処理することにより得られたＣＡＧプロモーターとＮ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９領域を、同じくＳａｌＩとＮｏｔＩで制限酵素処理したｐＣＡＧＩＧ（Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｃｅｐｋｏ，２００４）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２を使用して組み込むことで、ＦＬＡＧタグ付加Ｕｎｃ１１９－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ発現プラスミドを作製した（図１６）。
（１）プラスミド作製
（ｐＣＡＧＩＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９）
実施例１１で作製したｐＣＡＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９をＳａｌＩとＮｏｔＩで制限酵素処理することにより得られたＣＡＧプロモーターとＮ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９領域を、同じくＳａｌＩとＮｏｔＩで制限酵素処理したｐＣＡＧＩＧ（Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｃｅｐｋｏ，２００４）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２を使用して組み込むことで、ＦＬＡＧタグ付加Ｕｎｃ１１９－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰ発現プラスミドを作製した（図１６）。
【0118】
（２）ｉｎ ｖｉｖｏ エレクトロポレーション
ｐＣＡＧＩＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９プラスミド及びコントロール用のｐＣＡＧＩＧプラスミドの導入は、生後０日（Ｐ０）のＩＣＲマウス（オリエンタル酵母工業株式会社から購入）に対して行った。マウスを氷冷麻酔し、３０ゲージの注射針（ＴＥＲＵＭＯ）を用いて瞼を切り開き、角膜と網膜の境界に小孔をあけた。この小孔に３３ゲージのマイクロシリンジ（伊藤製作所）を挿入し、網膜下に０．３ μＬのＤＮＡ溶液（５ μｇ/μＬ）を導入し、定法に従って、電極を用いて８０ Ｖ、５０ ｍｓの電気パルスを９５０ ｍｓの間隔をおいて５回加えた。エレクトロポレーションを行った網膜は１か月齢で回収し、定法に従って免疫染色を行った。
ｐＣＡＧＩＧ－Ｎ－３ｘＦＬＡＧ－Ｕｎｃ１１９プラスミド及びコントロール用のｐＣＡＧＩＧプラスミドの導入は、生後０日（Ｐ０）のＩＣＲマウス（オリエンタル酵母工業株式会社から購入）に対して行った。マウスを氷冷麻酔し、３０ゲージの注射針（ＴＥＲＵＭＯ）を用いて瞼を切り開き、角膜と網膜の境界に小孔をあけた。この小孔に３３ゲージのマイクロシリンジ（伊藤製作所）を挿入し、網膜下に０．３ μＬのＤＮＡ溶液（５ μｇ/μＬ）を導入し、定法に従って、電極を用いて８０ Ｖ、５０ ｍｓの電気パルスを９５０ ｍｓの間隔をおいて５回加えた。エレクトロポレーションを行った網膜は１か月齢で回収し、定法に従って免疫染色を行った。
【0119】
（結果）
実施例１５により、暗条件下において、Ｕｎｃ１１９タンパク質が過剰発現したＥＧＦＰ陽性の視細胞において、細胞体でのトランスデューシンαのシグナルが増加していることが確認された（図１７）。以上の結果から、Ｋｌｈｌ１８欠損マウスにおけるトランスデューシンαの局在変化は、過剰量のＵｎｃ１１９により引き起こされることが示唆された。
実施例１５により、暗条件下において、Ｕｎｃ１１９タンパク質が過剰発現したＥＧＦＰ陽性の視細胞において、細胞体でのトランスデューシンαのシグナルが増加していることが確認された（図１７）。以上の結果から、Ｋｌｈｌ１８欠損マウスにおけるトランスデューシンαの局在変化は、過剰量のＵｎｃ１１９により引き起こされることが示唆された。
【0120】
［実施例１６］（マウス網膜に対する光障害実験）
（１）光障害
成体マウス（Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスをＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ）と掛け合わせてアルビノ化し、Ｒｐｅ６５遺伝子がコードする蛋白質の４５０番目のアミノ酸が両アレルともロイシンになっているマウス、４～５週齢）を約２４時間暗黒下で飼育し、十分に暗順応させる。散瞳剤サイプレジン（参天製薬株式会社）を点眼したのち、周囲の４面と床が鏡張りの箱の中にマウスを入れ、３０分後にブルーＬＥＤライトから青色の光を照射する。ライトの波長は約４５０ｎｍで、マウスに到達する光は約７０００ルクスである。３時間青色ライトを照射したのち通常の環境で飼育する。２日目からは、１２時間明暗サイクルの室内照明に合わせて、約１１時間の暗所飼育の後に散瞳剤（サイプレジン）を与え、３０分後にブルーライトを３時間照射する。ブルーライトの照射を計６日間繰り返した。以上のタイムラインを図１８に示した。翌日、実施例７と同様の方法でＥＲＧを測定した。
（１）光障害
成体マウス（Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスをＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ）と掛け合わせてアルビノ化し、Ｒｐｅ６５遺伝子がコードする蛋白質の４５０番目のアミノ酸が両アレルともロイシンになっているマウス、４～５週齢）を約２４時間暗黒下で飼育し、十分に暗順応させる。散瞳剤サイプレジン（参天製薬株式会社）を点眼したのち、周囲の４面と床が鏡張りの箱の中にマウスを入れ、３０分後にブルーＬＥＤライトから青色の光を照射する。ライトの波長は約４５０ｎｍで、マウスに到達する光は約７０００ルクスである。３時間青色ライトを照射したのち通常の環境で飼育する。２日目からは、１２時間明暗サイクルの室内照明に合わせて、約１１時間の暗所飼育の後に散瞳剤（サイプレジン）を与え、３０分後にブルーライトを３時間照射する。ブルーライトの照射を計６日間繰り返した。以上のタイムラインを図１８に示した。翌日、実施例７と同様の方法でＥＲＧを測定した。
【0121】
（結果）
実施例１６により、光障害を誘導したＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスの網膜電図では、ａ波（視細胞活動）及びｂ波（双極細胞活動）の電位が光障害を誘導した野生型コントロールマウスより、数値が高くなっていることが確認された（図１９）。この結果は、Ｋｌｈｌ１８を欠損又は阻害などすることにより、光障害による視細胞の障害が抑制されることを支持するものである。
実施例１６により、光障害を誘導したＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスの網膜電図では、ａ波（視細胞活動）及びｂ波（双極細胞活動）の電位が光障害を誘導した野生型コントロールマウスより、数値が高くなっていることが確認された（図１９）。この結果は、Ｋｌｈｌ１８を欠損又は阻害などすることにより、光障害による視細胞の障害が抑制されることを支持するものである。
【0122】
（２）トルイジンブルー染色による視細胞層の厚みの計測
実施例２の（２）に記載の方法により、光障害を誘導した野生型コントロール及びＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスの網膜の切片を作製した。作製したマウス網膜の切片を用いて、実施例５に記載の方法により視細胞層の厚みを計測した。具体的には、作製した切片をＰＢＳで洗浄し、０．１％ ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ社）／ＰＢＳで１分間染色した。染色後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、標本を封入剤で封入した。封入した標本は正立型顕微鏡の微分干渉検鏡対物レンズにより観察した。視細胞層の厚みを視神経の距離に応じて計測した。
実施例２の（２）に記載の方法により、光障害を誘導した野生型コントロール及びＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスの網膜の切片を作製した。作製したマウス網膜の切片を用いて、実施例５に記載の方法により視細胞層の厚みを計測した。具体的には、作製した切片をＰＢＳで洗浄し、０．１％ ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ社）／ＰＢＳで１分間染色した。染色後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、標本を封入剤で封入した。封入した標本は正立型顕微鏡の微分干渉検鏡対物レンズにより観察した。視細胞層の厚みを視神経の距離に応じて計測した。
【0123】
（結果）
光障害を誘導したＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスの網膜では、光障害を誘導した野生型コントロールマウス網膜より、視細胞層の厚みが保持されていることが確認された（図２０）。この結果は、Ｋｌｈｌ１８を欠損又は阻害などすることにより、光障害による視細胞の変性が抑制されることを支持するものである。
光障害を誘導したＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスの網膜では、光障害を誘導した野生型コントロールマウス網膜より、視細胞層の厚みが保持されていることが確認された（図２０）。この結果は、Ｋｌｈｌ１８を欠損又は阻害などすることにより、光障害による視細胞の変性が抑制されることを支持するものである。
【0124】
（３）蛍光免疫染色
作製したマウス網膜の切片を用いて、蛍光免疫染色を行った。具体的には、実施例２の（２）に記載の方法により作製したマウス網膜の切片をＰＢＳで２回洗浄した後、ブロッキングバッファー（４％ Ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ／０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ）で室温、１時間ブロッキングした。その後、一次抗体を４℃で、一晩反応させた。切片をＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体を室温で、２時間反応させた。一次抗体には、抗Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ抗体（ロドプシン、ウサギポリクローナル、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、１：５００希釈)又は抗Ｓ－ｏｐｓｉｎ抗体（Ｓ－オプシン（青色錐体オプシン）、ヤギポリクローナル、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、１：５００希釈）を用い、二次抗体には、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８標識抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１：５００希釈）及びＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１:５００希釈）抗体を使用した。二次抗体の反応終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、封入剤を用いて封入した。全ての蛍光画像は、共焦点レーザスキャン顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて獲得した。
作製したマウス網膜の切片を用いて、蛍光免疫染色を行った。具体的には、実施例２の（２）に記載の方法により作製したマウス網膜の切片をＰＢＳで２回洗浄した後、ブロッキングバッファー（４％ Ｎｏｒｍａｌ ｄｏｎｋｅｙ ｓｅｒｕｍ／０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ）で室温、１時間ブロッキングした。その後、一次抗体を４℃で、一晩反応させた。切片をＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体を室温で、２時間反応させた。一次抗体には、抗Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ抗体（ロドプシン、ウサギポリクローナル、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、１：５００希釈)又は抗Ｓ－ｏｐｓｉｎ抗体（Ｓ－オプシン（青色錐体オプシン）、ヤギポリクローナル、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、１：５００希釈）を用い、二次抗体には、それぞれＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８標識抗ウサギ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、１：５００希釈）及びＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１:５００希釈）抗体を使用した。二次抗体の反応終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、封入剤を用いて封入した。全ての蛍光画像は、共焦点レーザスキャン顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて獲得した。
【0125】
（結果）
光障害を誘導したＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスの網膜の蛍光免疫染色解析において、桿体視細胞（マーカー：ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）及び錐体視細胞（マーカー：Ｓ－ｏｐｓｉｎ）のシグナルの強さと厚みが、光障害を誘導した野生型コントロールマウスに比べてより保持されていることが確認された（図２１）。この結果は、Ｋｌｈｌ１８を欠損又は阻害などすることにより、光障害による視細胞の変性が阻害され、視細胞が維持されていることを支持するものである。
光障害を誘導したＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスの網膜の蛍光免疫染色解析において、桿体視細胞（マーカー：ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）及び錐体視細胞（マーカー：Ｓ－ｏｐｓｉｎ）のシグナルの強さと厚みが、光障害を誘導した野生型コントロールマウスに比べてより保持されていることが確認された（図２１）。この結果は、Ｋｌｈｌ１８を欠損又は阻害などすることにより、光障害による視細胞の変性が阻害され、視細胞が維持されていることを支持するものである。
【0126】
［実施例１７］（明暗条件下の網膜におけるＵｎｃ１１９の発現量解析）
（１）抗マウスＵｎｃ１１９抗体作製
（１－１）プラスミド作製
（ｐＧＥＸ４Ｔ－１－Ｕｎｃ１１９）
抗マウスＵｎｃ１１９抗体作製のための抗原部位は１２９ Ａｄｕｌｔ ｒｅｔｉｎａ ｃＤＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには、フォワードプライマー（配列番号８０）及びリバースプライマー（配列番号８１）を使用した。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＳａｌＩを用いて制限酵素処理した後、同じくＥｃｏＲＩとＳａｌＩを用いて制限酵素処理したｐＧＥＸ４Ｔ－１プラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２を使用して組み込み、ＧＳＴタグ付加Ｕｎｃ１１９発現プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ－１－Ｕｎｃ１１９を作製した。
（１）抗マウスＵｎｃ１１９抗体作製
（１－１）プラスミド作製
（ｐＧＥＸ４Ｔ－１－Ｕｎｃ１１９）
抗マウスＵｎｃ１１９抗体作製のための抗原部位は１２９ Ａｄｕｌｔ ｒｅｔｉｎａ ｃＤＮＡを鋳型として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲには、フォワードプライマー（配列番号８０）及びリバースプライマー（配列番号８１）を使用した。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＳａｌＩを用いて制限酵素処理した後、同じくＥｃｏＲＩとＳａｌＩを用いて制限酵素処理したｐＧＥＸ４Ｔ－１プラスミドにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２を使用して組み込み、ＧＳＴタグ付加Ｕｎｃ１１９発現プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ－１－Ｕｎｃ１１９を作製した。
【0127】
（１－２）ＧＳＴタグ付加Ｕｎｃ１１９タンパク質の発現及び精製
ｐＧＥＸ４Ｔ－１－Ｕｎｃ１１９プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションした。この大腸菌を１００ ｍＬ ＬＢ培地（Ａｍｐ＋）で一晩前培養し、その大腸菌培養液を吸光度ＯＤ６００が０．２前後になるようにＬＢ培地（Ａｍｐ＋）で希釈した。その後、培養液の吸光度ＯＤ６００が０．６前後になるまで大腸菌を培養し、終濃度１ ｍＭ ＩＰＴＧを加えて２５℃で３．５時間、ＧＳＴ－Ｕｎｃ１１９タンパク質を発現誘導した。
ＧＳＴ－Ｕｎｃ１１９タンパク質の発現を誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）を０．１ Ｍ ＥＤＴＡ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１ｍＭ ＰＭＳＦ，２μｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，５μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，３μｇ／ｍｌ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ ｉｎ ＰＢＳ中で超音波破砕した。遠心分離（１０，０００ ｒｐｍ、半径 ５．４ｃｍ、１０分間、４℃）後、上清をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に吸着させ、１％ ＮＰ－４０，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），５ ｍＭ ＥＤＴＡ，１ ｍＭ ＰＭＳＦ，２ｕｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，５μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，３μｇ／ｍｌ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡで樹脂を洗った。樹脂からの溶出には２０ ｍＭ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ／１２０ ｍＭ ＮａＣｌ／１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）を用いた。
ｐＧＥＸ４Ｔ－１－Ｕｎｃ１１９プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションした。この大腸菌を１００ ｍＬ ＬＢ培地（Ａｍｐ＋）で一晩前培養し、その大腸菌培養液を吸光度ＯＤ６００が０．２前後になるようにＬＢ培地（Ａｍｐ＋）で希釈した。その後、培養液の吸光度ＯＤ６００が０．６前後になるまで大腸菌を培養し、終濃度１ ｍＭ ＩＰＴＧを加えて２５℃で３．５時間、ＧＳＴ－Ｕｎｃ１１９タンパク質を発現誘導した。
ＧＳＴ－Ｕｎｃ１１９タンパク質の発現を誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）を０．１ Ｍ ＥＤＴＡ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，１ｍＭ ＰＭＳＦ，２μｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，５μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，３μｇ／ｍｌ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ ｉｎ ＰＢＳ中で超音波破砕した。遠心分離（１０，０００ ｒｐｍ、半径 ５．４ｃｍ、１０分間、４℃）後、上清をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に吸着させ、１％ ＮＰ－４０，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），５ ｍＭ ＥＤＴＡ，１ ｍＭ ＰＭＳＦ，２ｕｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，５μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，３μｇ／ｍｌ ＰｅｐｓｔａｔｉｎＡで樹脂を洗った。樹脂からの溶出には２０ ｍＭ Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ／１２０ ｍＭ ＮａＣｌ／１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）を用いた。
【0128】
（１－３）抗マウスＵｎｃ１１９抗体の作製
定法に従って、精製した抗原を２週間おきに５回モルモットに注射した。最後の抗原注射から１週間後に採血してＵｎｃ１１９に対する抗血清を得た。
定法に従って、精製した抗原を２週間おきに５回モルモットに注射した。最後の抗原注射から１週間後に採血してＵｎｃ１１９に対する抗血清を得た。
【0129】
（２）明暗条件下のマウス網膜タンパク質の回収
明順応は約１，０００ ｌｕｘ下で約４時間、暗順応は暗室で約４時間マウスを置いて行った。明順応、暗順応条件下で野生型マウス、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスそれぞれの眼球から網膜を回収し、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＳ，１％ ＮＰ－４０，１ ｍＭ ＥＤＴＡ，５ μｇ／μＬ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２ μｇ／μＬ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，３ μｇ／μＬ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ，１ ｍＭ ＰＭＳＦ) でピペッティングにより溶解させ、氷上に３０分間静置した。遠心（１４，０００ ｒｐｍ、半径 ５．４ｃｍ、１０分間、４℃）した後、上清を回収し、等量の２×サンプルバッファー（０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．８），１％ ＳＤＳ，βメルカプトエタノール，グリセロール，ＢＰＢ）を加え、室温で３０分間静置した。
明順応は約１，０００ ｌｕｘ下で約４時間、暗順応は暗室で約４時間マウスを置いて行った。明順応、暗順応条件下で野生型マウス、Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウスそれぞれの眼球から網膜を回収し、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＳ，１％ ＮＰ－４０，１ ｍＭ ＥＤＴＡ，５ μｇ／μＬ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２ μｇ／μＬ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，３ μｇ／μＬ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ，１ ｍＭ ＰＭＳＦ) でピペッティングにより溶解させ、氷上に３０分間静置した。遠心（１４，０００ ｒｐｍ、半径 ５．４ｃｍ、１０分間、４℃）した後、上清を回収し、等量の２×サンプルバッファー（０．１ Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ６．８），１％ ＳＤＳ，βメルカプトエタノール，グリセロール，ＢＰＢ）を加え、室温で３０分間静置した。
【0130】
（３）ウエスタンブロッティング及び免疫染色による解析
実施例６と同様の方法により、回収したタンパク質を用いてウエスタンブロッティングを行った。ウエスタンブロッティングにおける抗Ｕｎｃ１１９抗体は１:５００希釈で使用した。
明順応、暗順応条件下で野生型マウス及びＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスからそれぞれ眼球を回収し、４％ ＰＦＡ／ＰＢＳ中で室温３０分間静置した。固定終了後ＰＢＳで洗浄し３０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢＳに一晩置いた。すべてのサンプルはＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドで包埋し、実施例２の（２）に記載の方法により、切片を作製し、免疫染色を行った。一次抗体は抗Ｕｎｃ１１９抗体を１:２００希釈で使用した。
実施例６と同様の方法により、回収したタンパク質を用いてウエスタンブロッティングを行った。ウエスタンブロッティングにおける抗Ｕｎｃ１１９抗体は１:５００希釈で使用した。
明順応、暗順応条件下で野生型マウス及びＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスからそれぞれ眼球を回収し、４％ ＰＦＡ／ＰＢＳ中で室温３０分間静置した。固定終了後ＰＢＳで洗浄し３０％ Ｓｕｃｒｏｓｅ／ＰＢＳに一晩置いた。すべてのサンプルはＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドで包埋し、実施例２の（２）に記載の方法により、切片を作製し、免疫染色を行った。一次抗体は抗Ｕｎｃ１１９抗体を１:２００希釈で使用した。
【0131】
（結果）
実施例１７により、明条件下の野生型マウス網膜におけるＵｎｃ１１９タンパク質量が、暗条件下の野生型マウス網膜におけるＵｎｃ１１９タンパク質量よりも多いことが確認された（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウス網膜におけるＵｎｃ１１９タンパク質量は、明暗条件下のどちらにおいても、野生型マウス網膜のＵｎｃ１１９タンパク質量よりも多いことが確認された（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。この結果より、明条件下よりも暗条件下において、Ｋｌｈｌ１８タンパク質はＵｎｃ１１９タンパク質を効率よく分解することが示唆された。
実施例１７により、明条件下の野生型マウス網膜におけるＵｎｃ１１９タンパク質量が、暗条件下の野生型マウス網膜におけるＵｎｃ１１９タンパク質量よりも多いことが確認された（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。Ｋｌｈｌ１８ ＫＯマウス網膜におけるＵｎｃ１１９タンパク質量は、明暗条件下のどちらにおいても、野生型マウス網膜のＵｎｃ１１９タンパク質量よりも多いことが確認された（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。この結果より、明条件下よりも暗条件下において、Ｋｌｈｌ１８タンパク質はＵｎｃ１１９タンパク質を効率よく分解することが示唆された。
【0132】
［実施例１８］（ＲＰＥ６５遺伝子欠損マウスにおけるＫｌｈｌ１８タンパク質欠損による視覚機能への影響）
（１）ＲＰＥ６５遺伝子欠損マウスの作製
ＲＰＥ６５欠損マウスはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて作製した。マウスＲＰＥ６５遺伝子のエクソン２内とエクソン３内に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的となる２種類のガイドＲＮＡ配列をデザインし、ガイドＲＮＡの配列を含むオリゴＤＮＡを作製して、ＲＰＥ６５ ＣＲＩＳＰＲ－５１とＲＰＥ６５ ＣＲＩＳＰＲ－３１、ＲＰＥ６５ ＣＲＩＳＰＲ－５２とＲＰＥ６５ ＣＲＩＳＰＲ－３２をそれぞれ等量（１００ｐｇ）ずつ混ぜ、６５℃で１０分加温した後、２０℃で３０分静置しアニーリングさせ２本鎖ＤＮＡとした。アニーリングはＢｂｓＩ（ＮＥＢ社）で処理したｐＸ３３０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２キット（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて組み込んだ。ガイドＲＮＡの配列を含むオリゴＤＮＡとして、配列番号８２～８５で示されるＤＮＡを用いた。
作製した２種類のプラスミドＤＮＡを生理食塩水にそれぞれ３ｎｇ／μＬ（計６ｎｇ／μＬ）の濃度になるように調整し、それをマイクロピペットプラー装置（Ｐ－９７／ＩＶＦ、Ｓｕｔｔｅｒ社）を用いて先端を鋭利化しガラス針にしたガラスキャピラリー（Ｇ１．２、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ社）に充填し、倒立顕微鏡下（ＡｘｉｏＶｅｒｔ２００、Ｚｅｉｓｓ社）においてマニュピレーター（ＴｒａｎｆｅｒＭａｎ ＮＫ２、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いて、ＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雌とＤＢＡ２雄を掛け合わせた子、日本ＳＬＣ社）の受精卵前核にインジェクションし、インジェクションした受精卵を偽妊娠雌マウス（ＩＣＲマウス、ＳＬＣ社）に卵管移植して、生まれてきたマウスのうちＲＰＥ６５遺伝子にＤＮＡ塩基欠損変異を持つ個体をシークエンス解析によって選別し、ＲＰＥ６５ヘテロ欠損マウスを作製した。ＲＰＥ６５ヘテロ欠損マウス同士を交配し、ＲＰＥ６５完全欠損マウス（ＲＰＥ６５ ＫＯマウスという）を得た。
（１）ＲＰＥ６５遺伝子欠損マウスの作製
ＲＰＥ６５欠損マウスはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて作製した。マウスＲＰＥ６５遺伝子のエクソン２内とエクソン３内に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的となる２種類のガイドＲＮＡ配列をデザインし、ガイドＲＮＡの配列を含むオリゴＤＮＡを作製して、ＲＰＥ６５ ＣＲＩＳＰＲ－５１とＲＰＥ６５ ＣＲＩＳＰＲ－３１、ＲＰＥ６５ ＣＲＩＳＰＲ－５２とＲＰＥ６５ ＣＲＩＳＰＲ－３２をそれぞれ等量（１００ｐｇ）ずつ混ぜ、６５℃で１０分加温した後、２０℃で３０分静置しアニーリングさせ２本鎖ＤＮＡとした。アニーリングはＢｂｓＩ（ＮＥＢ社）で処理したｐＸ３３０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社）にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ ｖｅｒ．２キット（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて組み込んだ。ガイドＲＮＡの配列を含むオリゴＤＮＡとして、配列番号８２～８５で示されるＤＮＡを用いた。
作製した２種類のプラスミドＤＮＡを生理食塩水にそれぞれ３ｎｇ／μＬ（計６ｎｇ／μＬ）の濃度になるように調整し、それをマイクロピペットプラー装置（Ｐ－９７／ＩＶＦ、Ｓｕｔｔｅｒ社）を用いて先端を鋭利化しガラス針にしたガラスキャピラリー（Ｇ１．２、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ社）に充填し、倒立顕微鏡下（ＡｘｉｏＶｅｒｔ２００、Ｚｅｉｓｓ社）においてマニュピレーター（ＴｒａｎｆｅｒＭａｎ ＮＫ２、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を用いて、ＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ雌とＤＢＡ２雄を掛け合わせた子、日本ＳＬＣ社）の受精卵前核にインジェクションし、インジェクションした受精卵を偽妊娠雌マウス（ＩＣＲマウス、ＳＬＣ社）に卵管移植して、生まれてきたマウスのうちＲＰＥ６５遺伝子にＤＮＡ塩基欠損変異を持つ個体をシークエンス解析によって選別し、ＲＰＥ６５ヘテロ欠損マウスを作製した。ＲＰＥ６５ヘテロ欠損マウス同士を交配し、ＲＰＥ６５完全欠損マウス（ＲＰＥ６５ ＫＯマウスという）を得た。
【0133】
（２）ＲＰＥ６５遺伝子とＫｌｈｌ１８遺伝子のダブル欠損マウスの作製
上記で得られたＲＰＥ６５ ＫＯマウスと、実施例３で作製したＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスとを交配させることにより、ＲＰＥ６５遺伝子とＫｌｈｌ１８遺伝子のヘテロ欠損マウスを得た。ＲＰＥ６５遺伝子とＫｌｈｌ１８遺伝子のヘテロ欠損マウス同士を交配し、ＲＰＥ６５遺伝子とＫｌｈｌ１８遺伝子を完全に欠損するマウス（ダブルＫＯマウスという）を得た。
上記で得られたＲＰＥ６５ ＫＯマウスと、実施例３で作製したＫｌｈｌ１８ ＫＯマウスとを交配させることにより、ＲＰＥ６５遺伝子とＫｌｈｌ１８遺伝子のヘテロ欠損マウスを得た。ＲＰＥ６５遺伝子とＫｌｈｌ１８遺伝子のヘテロ欠損マウス同士を交配し、ＲＰＥ６５遺伝子とＫｌｈｌ１８遺伝子を完全に欠損するマウス（ダブルＫＯマウスという）を得た。
【0134】
（３）網膜電図（Ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｍ；ＥＲＧ）検査
生後６ヶ月齢のＲＰＥ６５欠損マウス又はダブルＫＯマウスを用意する以外は、実施例７と同様にして、明順応又は暗順応させ、ＥＲＧを測定した。
生後６ヶ月齢のＲＰＥ６５欠損マウス又はダブルＫＯマウスを用意する以外は、実施例７と同様にして、明順応又は暗順応させ、ＥＲＧを測定した。
【0135】
（結果）
上記より、ダブルＫＯマウスの網膜電図では、暗所条件下及び明所条件下のいずれにおいても電位がＲＰＥ６５欠損マウスより高くなっていることが確認された（図２３）。この結果は、ＲＰＥ６５欠損マウスの網膜視細胞の変性が、Ｋｌｈｌ１８の欠損によって抑制されることを示しており、Ｋｌｈｌ１８を欠損又は阻害などすることが遺伝性の網膜色素変性症の改善又は予防に有効であることが示唆される。
上記より、ダブルＫＯマウスの網膜電図では、暗所条件下及び明所条件下のいずれにおいても電位がＲＰＥ６５欠損マウスより高くなっていることが確認された（図２３）。この結果は、ＲＰＥ６５欠損マウスの網膜視細胞の変性が、Ｋｌｈｌ１８の欠損によって抑制されることを示しており、Ｋｌｈｌ１８を欠損又は阻害などすることが遺伝性の網膜色素変性症の改善又は予防に有効であることが示唆される。
【0136】
［実施例１９］（ユビキチン化複合体タンパク質の活性阻害物質を投与したマウスに対する光障害実験）
暗黒下で７時間飼育し暗順応させた４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社）に、暗所下でＭＬＮ４９２４（Ｃｈｅｍｓｃｅｎｅ社）を背中部に皮下注射した（６０ｍｇ／ｋｇ）。４時間後に、周囲の４面と床が鏡張りの箱の中にマウスを入れてブルーＬＥＤライトから青色の光を照射した。ライトの波長は約４５０ｎｍで、マウスに到達する光は約７０００ルクスである。３時間青色ライトを照射したのち通常の環境で１０時間飼育した。これを１サイクルとし、計３日間繰り返した。最後の青色光照射から４日後に、実施例１６と同様にして、網膜電図（ＥＲＧ）測定および網膜解剖により組織解析を行った。なお、コントロールとしては、ＤＭＳＯを投与したマウスを用いた。
暗黒下で７時間飼育し暗順応させた４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社）に、暗所下でＭＬＮ４９２４（Ｃｈｅｍｓｃｅｎｅ社）を背中部に皮下注射した（６０ｍｇ／ｋｇ）。４時間後に、周囲の４面と床が鏡張りの箱の中にマウスを入れてブルーＬＥＤライトから青色の光を照射した。ライトの波長は約４５０ｎｍで、マウスに到達する光は約７０００ルクスである。３時間青色ライトを照射したのち通常の環境で１０時間飼育した。これを１サイクルとし、計３日間繰り返した。最後の青色光照射から４日後に、実施例１６と同様にして、網膜電図（ＥＲＧ）測定および網膜解剖により組織解析を行った。なお、コントロールとしては、ＤＭＳＯを投与したマウスを用いた。
【0137】
（結果）
上記より、ＭＬＮ４９２４を投与したマウスにおいては、ａ波（視細胞活動）及びｂ波（双極細胞活動）の電位がコントロールマウスより高くなっていることが確認された（図２４）。この結果は、ＭＬＮ４９２４投与により、光障害による網膜生理機能低下が抑制されることを示している。
上記より、ＭＬＮ４９２４を投与したマウスにおいては、ａ波（視細胞活動）及びｂ波（双極細胞活動）の電位がコントロールマウスより高くなっていることが確認された（図２４）。この結果は、ＭＬＮ４９２４投与により、光障害による網膜生理機能低下が抑制されることを示している。
【0138】
また、網膜の蛍光免疫染色解析において、桿体視細胞（マーカー：ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）及び錐体視細胞（マーカー：Ｓ－ｏｐｓｉｎ、Ｍ－ｏｐｓｉｎ）のシグナルの強さと厚みが、ＭＬＮ４９２４を投与したマウスの方がコントロールマウスに比べてより保持されていることが確認された（図２５）。この結果は、ＭＬＮ４９２４投与により、光障害による視細胞の変性が阻害され、視細胞が維持されていることを支持するものである。
【0139】
さらに、ＭＬＮ４９２４を投与したマウスの網膜では、コントロールマウスの網膜より、視細胞層の厚みが保持されていることが確認された（図２６）。この結果は、ＭＬＮ４９２４投与により、光障害による視細胞の変性が抑制されることを支持するものである。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】