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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-14
(45)【発行日】2022-12-22
(54)【発明の名称】抗原組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20221215BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20221215BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20221215BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20221215BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20221215BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
A61P37/04
A61K39/395 U
A61K39/00 H
C12N15/62 Z
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019535645
(86)(22)【出願日】2018-08-06
(86)【国際出願番号】 JP2018029395
(87)【国際公開番号】W WO2019031446
(87)【国際公開日】2019-02-14
【審査請求日】2021-07-08
(31)【優先権主張番号】P 2017152123
(32)【優先日】2017-08-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504132881
【氏名又は名称】国立大学法人東京農工大学
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100151448
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 孝博
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100203035
【弁理士】
【氏名又は名称】五味渕 琢也
(74)【代理人】
【識別番号】100185959
【弁理士】
【氏名又は名称】今藤 敏和
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100202267
【弁理士】
【氏名又は名称】森山 正浩
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】黒田 裕
(72)【発明者】
【氏名】上岡 哲矢
(72)【発明者】
【氏名】ラフマン ナフスーン
(72)【発明者】
【氏名】イスラム モニール モハマド
(72)【発明者】
【氏名】三浦 史帆
【審査官】松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００４６０３５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特許第５２７３４３８（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特開２００６－１８８５０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Abstracts of the general meeting of the American Society for Microbiology，2013年，Vol.113，p.1440
【文献】生物物理，2008年，Vol.48, No.3，p.185-189
【文献】FEBS Letters，2016年，Vol.590，p.3501-3509
【文献】Biochemical and Biophysical Research Communications，2016年，Vol.471，p.163-168
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ａ６１Ｐ ３７／０４
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ３９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原ペプチド、該抗原ペプチドの末端に結合した２個のＧｌｙまたはＳｅｒで構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した４～６個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成るタグ化ポリペプチドを含む、前記抗原ペプチドに対する抗体を生産するための抗原組成物であって、但し、前記スペーサー・ペプチド及びタグ・ペプチドが抗原ペプチドのＣ末端側に存在する場合、該スペーサー・ペプチド－タグ・ペプチドは、－（Ｇｌｙ）２－（Ａｌａ）５、－（Ｓｅｒ）２－（Ｉｌｅ）５または－（Ｇｌｙ）２－（Ｉｌｅ－Ａｓｎ）２－Ｉｌｅのいずれかであり、及び前記スペーサー・ペプチド及びタグ・ペプチドが抗原ペプチドのＮ末端側に存在する場合、該スペーサー・ペプチド－タグ・ペプチドは－（Ｇｌｙ）２－（Ｉｌｅ）５であり、且つ前記抗原ペプチドはＢＰＴＩである、前記抗原組成物。
【請求項2】
生理学的に許容される担体を含むワクチンの形態である、請求項１に記載の抗原組成物。
【請求項3】
更にアジュバントを含む、請求項１または２に記載の抗原組成物。
【請求項4】
ヒト以外の動物を免疫する方法であって、免疫有効量の請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原組成物を該動物に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、動物の免疫ないし動物に抗体を産生させるための組成物及び方法に関する。特に、特定のアミノ酸配列によりタグ化されたポリペプチドを抗原として使用することに関する。
【背景技術】
【0002】
抗体産生は、抗原刺激の結果、免疫反応によって動物の生体内で誘導される。したがって、ある種の抗原性ポリペプチド（ないしタンパク質）は、それに対する抗体産生を誘導することによって、ウイルスや細菌による感染症の予防のみならず、癌の予防や治療等にも使用されるワクチンとして利用されている。また、ある種の抗原性ポリペプチドは、非ヒト動物において抗血清やモノクローナル抗体を産生させるために利用されている。
【0003】
しかしながら、全ての抗原性ポリペプチドが生体内で十分な抗体産生を誘導するわけではないこともわかっている。例えば、アミノ酸が数十～百数十個程度の残基の比較的小さなポリペプチドの中には免疫原性が一般的に弱いものが多いことが知られている。したがって、そのような免疫原性の弱いポリペプチドを用いて動物を免疫する場合、その免疫原性を増強するためにアジュバントがしばしば同時に投与される。
【0004】
しかしながら、他方で、そのような目的で、動物実験で汎用されている完全フロイント・アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）及びフロイント・アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）は、その潜在的な副作用のためにヒトへの使用が制限されている。したがって、アジュバントを用いずに免疫原性の弱いポリペプチドの免疫原性を増強して十分な抗体産生を誘導することが望まれている。
【0005】
本発明者らは、先に、ポリペプチドの末端に１～２０個の親水性アミノ酸から成るタグを付与することにより当該ポリペプチドの溶解度を向上させ得ることを見出している（特許文献１）。また、本発明者らは、生体分子の末端に任意のアミノ酸配列から成るペプチドが付加されたペプチド付加生体分子の溶解度を熱力学的理論に基づき計算する方法及び当該計算方法を用いて所望の溶解度とするペプチドタグを設計する方法、並びにそのような方法を利用して封入体（大腸菌の組換細胞等内に蓄積する不活性型凝集）形成を防止する方法を見出している（特許文献２）。しかしながら、いずれの先行文献も、ポリペプチドの末端に特定のアミノ酸から成るタグが付加されたタグ化ポリペプチドが、当該ポリペプチドの免疫原性を増強し得ることについて、開示も示唆もしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２００６－１８８５０７号公報
【文献】特許第５２７３４３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
したがって、本発明は、抗原ペプチドの免疫原性を増強するための方法及びその方法を利用した抗原組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
発明者らは、末端が様々にタグ化されたポリペプチドの様々な性質に関して研究を行ってきたなかで、驚くべきことに、特定のアミノ酸から成るタグが付加されたタグ化ポリペプチドが当該ポリペプチドの免疫原性を増強し得ること（つまり、タグ化前のポリペプチドに対する免疫応答を向上さること、タグ化前のポリペプチドに対する抗血清及び抗体を生成させること、或いはタグ化前のポリペプチドの免疫原性を向上させることなどを含む。）を見出した。したがって、本発明の第１の局面は、
（１）抗原ペプチド、該抗原ペプチドの末端に結合した０～２個のアミノ酸で構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した３～１２個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成り、該タグ・ペプチドはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏまたはそれらの組合せから構成されることを特徴とするタグ化ポリペプチドを含む、前記抗原ペプチドに対する抗体を生産するための抗原組成物である。
（１）抗原ペプチド、該抗原ペプチドの末端に結合した０～２個のアミノ酸で構成されるスペーサー・ペプチド及び該スペーサー・ペプチドに結合した３～１２個のアミノ酸で構成されるタグ・ペプチドから成り、該タグ・ペプチドはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏまたはそれらの組合せから構成されることを特徴とするタグ化ポリペプチドを含む、前記抗原ペプチドに対する抗体を生産するための抗原組成物である。
【0009】
本発明のタグ・ペプチドがＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＨｉｓまたはＰｒｏにより構成された場合、本発明のタグ化ポリペプチドの免疫原性が特に増強されることが見出された。したがって、本発明の好適な一態様は、
（２）前記タグ・ペプチドを構成するアミノ酸がＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＨｉｓまたはＰｒｏである、上記（１）の抗原組成物である。
（２）前記タグ・ペプチドを構成するアミノ酸がＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＨｉｓまたはＰｒｏである、上記（１）の抗原組成物である。
【0010】
また、タグ・ペプチドが４～６個のアミノ酸である場合でも、タグ化ポリペプチドの免疫原性が有意に増強され得る。したがって、本発明の別の好適な一態様は、
（３）前記タグ・ペプチドが４～６個のアミノ酸で構成される、上記（１）又は（２）の抗原組成物である。
（３）前記タグ・ペプチドが４～６個のアミノ酸で構成される、上記（１）又は（２）の抗原組成物である。
【0011】
更に、本発明のタグ化ポリペプチドは、抗原ペプチドとタグ・ペプチドの間にスペーサーとして機能するアミノ酸、例えばＧｌｙ又はＳｅｒを２個程度有してもよく、そのような場合にも前記抗原ペプチドに対して特異的な抗体が産生されることが見出された。したがって、本発明の別の好適な一態様は、
（４）前記スペーサー・ペプチドを構成するアミノ酸がＧｌｙまたはＳｅｒである、上記（１）～（３）のいずれかの抗原組成物、及び
（５）前記スペーサー・ペプチドが２個のアミノ酸で構成される、上記（１）～（４）のいずれかの抗原組成物である。
（４）前記スペーサー・ペプチドを構成するアミノ酸がＧｌｙまたはＳｅｒである、上記（１）～（３）のいずれかの抗原組成物、及び
（５）前記スペーサー・ペプチドが２個のアミノ酸で構成される、上記（１）～（４）のいずれかの抗原組成物である。
【0012】
また、本発明の特定の一態様ではタグ・ペプチドが抗原ペプチドのＣ末端に結合されてよい。すなわち、
（６）前記抗原ペプチドのＣ末端にスペーサー・ペプチドが結合する、上記（１）～（５）のいずれかの抗原組成物である。
（６）前記抗原ペプチドのＣ末端にスペーサー・ペプチドが結合する、上記（１）～（５）のいずれかの抗原組成物である。
【0013】
本発明のタグ化ポリペプチドは様々な抗原ペプチドに対して適用可能であり、例えばデング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３タンパク質のように免疫原性が弱い抗原ペプチドに対しても好適に適用できる。したがって、本発明の１つの態様は、
（７）前記抗原ペプチドがデング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３タンパク質である、上記（１）～（６）のいずれかの組成物である。
（７）前記抗原ペプチドがデング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３タンパク質である、上記（１）～（６）のいずれかの組成物である。
【0014】
以上の説明から明らかなように、本発明のタグ化ポリペプチドはワクチンとして用いることができる。したがって、本発明の好適な一態様は、
（８）薬学上許容される担体を含むワクチンの形態である、上記（１）～（７）のいずれかの抗原組成物である。
（８）薬学上許容される担体を含むワクチンの形態である、上記（１）～（７）のいずれかの抗原組成物である。
【0015】
本発明のタグ化ポリペプチドは、それ自体で増強された免疫原性を示し得るので、必ずしもアジュバントと共に投与される必要はない。しかしながら、アジュバントと共に使用した場合にはさらに顕著な免疫原性の増強を達成し得ることが示された。そのような態様もまた効率的な免疫の誘導にとって有利であり得る。したがって、本発明の別の態様は、
（９）更にアジュバントを含む、上記（１）～（８）のいずれかの抗原組成物である。
（９）更にアジュバントを含む、上記（１）～（８）のいずれかの抗原組成物である。
【0016】
また、本発明では、免疫が必要とされる動物（例えばヒトやウマ、ウシ、ブタ、イヌ、マーモセット、ヒツジ、ウサギ、ラマ、ラクダ、マウス又はラット等）に対して本発明の抗原組成物の免疫有効量を投与することを包含する、動物の免疫方法が提供される。したがって、本発明の別の局面は、
（１０）動物を免疫する方法であって、免疫有効量の上記（１）～（９）のいずれかの抗原組成物を該動物に投与することを含む、前記方法である。
（１０）動物を免疫する方法であって、免疫有効量の上記（１）～（９）のいずれかの抗原組成物を該動物に投与することを含む、前記方法である。
【0017】
また、本発明は、上記（１）～（７）の抗原組成物との関連で記載したタグ化ポリペプチドを動物の免疫のために使用することを意図する。したがって、本発明のもう１つの局面は、
（１１）動物を免疫するための、上記（１）～（７）のいずれかのタグ化ポリペプチドである。
（１１）動物を免疫するための、上記（１）～（７）のいずれかのタグ化ポリペプチドである。
【発明の効果】
【0018】
本発明のタグ化ポリペプチドを動物に対して投与することにより、所望の抗体をより多量に産生させ得るので、当該動物を効率的に免疫することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、Ｃ末端にＳＣＰタグを付加したＢＰＴＩのＸ－線結晶構造を示す（Ｉｓｌａｍ Ｍ．Ｍ，ｅｔ ａｌ，２０１５ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｄｅｓｉｇｎ １５（６）；Ｉｓｌａｍ Ｍ．Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５：１５３３４－３９（２００８）参照。）。
【図2】図２は、タグ化しないＢＰＴＩ変異体（「１９Ａ」）及び５個のＩｌｅから成るタグ・ペプチド及び２個のＧｌｙから成るスペーサーを付加したＢＰＴＩ（Ｃ５Ｉ）の免疫抗原性を示す。上段のパネルは、ＥＬＩＳＡによる免疫マウス血清中の抗１９Ａ抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭ）の測定値（吸光度：ＯＤ４９２ｎｍ）を示している（図中、ａ１及びａ２の添え字は、２頭の各マウスの結果を示す。また、「Ｃｎｔｒｌ」はバッファーのみを投与したマウスの血清である。）。下段のパネルは、ＥＬＩＳＡ測定から求めた線形フィッテイング（Ｌｉｎｅａｒ Ｆｉｔｔｉｎｇ）及びポリノミナルフィッテイング（Ｐｏｌｙｎｏｍｉｎａｌ Ｆｉｔｔｉｎｇ）による力価値を示している。
【図3】図３は、８種類のタグ化ＢＰＴＩに対する免疫応答性のタグ配列の依存性を示す。免疫増強剤（Ｆｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ、１回目はＦｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を使用し、６週目に収集した血清中の抗１９Ａ抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭ）のＥＬＩＳＡによる測定値（吸光度：ＯＤ４９２ｎｍ）を示している。上段のパネルに２倍希釈系列で希釈した血清を使用したときのＥＬＩＳＡ希釈依存性を示し、下段のパネルに３倍希釈系列で希釈したときのＥＬＩＳＡ希釈依存性を示す。図中、「１９Ａ」はタグ化しないＢＰＴＩ変異体を投与したマウスであり、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はバッファーのみを投与したマウスである。また、ａ又はｂの添え字はマウスの個体を示す。
【図4】図４は、８種類のタグ化ＢＰＴＩに対する免疫応答性のタグ配列の依存性（２頭のマウスの平均）を示す。上段のパネルに力価値（Ｔｉｔｅｒ）を示す。図中、白抜きのバー（１９Ａ）はプレートを１９Ａ(タグなし）でコートしたときの値を示し、黒塗りのバー（Ｃ５Ｔ）は、５個のＴｈｒから成るタグ・ペプチドと２個のＧｌｙから成るスペーサーを付加した１９Ａでプレートをコートしたときの値である。下段のパネルは、３００倍に希釈した血清中のＥＬＩＳＡによる抗１９Ａ抗体（ＩｇＧ）の測定値（吸光度：ＯＤ４９２ｎｍ）を示している。図中、「１９Ａ」はタグ化しないＢＰＴＩ変異体を投与したマウスである。
【図5】図５は、免疫増強剤（Ｆｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ、１回目はＦｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）と共に、或いは単独で１９Ａ又はＣ５Ｉ（５個のＩｌｅから成るタグ・ペプチドと２個のＧｌｙから成るスペーサーを付加した１９Ａ）を投与した時の免疫マウス血清中の抗１９Ａ抗体（ＩｇＧ及びＩｇＭ）のＥＬＩＳＡによる測定値（吸光度：ＯＤ４５０ｎｍ）を示す。
【図6】図６は、４種類のタグ化ＤＥＮ３－ＥＤ３に対する免疫応答性のタグ配列の依存性（２頭のマウスの平均）を示す。上段のパネルは、タグ化ＤＥＮ３－ＥＤ３を、０．３ｍｇ／ｍＬ（ＰＢＳ中）の用量で１～５回投与し、各投与後（Ｄｏｓｅ１～５）の抗ＤＥＮ３－ＥＤ３抗体の生成（ＥＬＩＳＡによる４９２ｎｍでの測定値）を比較している。免疫増強剤（アドジュバント）は使用していない。ＣｏｎｔｒｏｌはＰＢＳのみで免疫したマウス、「Ｄ３Ｅｄ３」はタグ化しないＤＥＮ３－ＥＤ３により免疫したマウスである。「Ｄ３Ｃ３Ｉ」は３個のＩｌｅから成るタグ・ペプチドと２個のＧｌｙから成るスペーサーを付加したタグ化ＤＥＮ３－ＥＤ３である。同様に、「Ｄ３Ｃ４Ｉ」は４個のＩｌｅから成るタグ・ペプチドと２個のＧｌｙから成るスペーサーを、「Ｄ３Ｃ５Ｄ」は５個のＡｓｐから成るタグ・ペプチドと２個のＧｌｙから成るスペーサーを、「Ｄ３Ｃ５Ｋ」は５個のＬｙｓから成るタグ・ペプチドと２個のＧｌｙから成るスペーサーを付加したタグ化ＤＥＮ３－ＥＤ３である。下段のパネルは、４回目の投与後の力価値を示している。図中、小文字の添え字はマウスの個体を示す。
【図7】図７は、アジュバントを使用した場合の３種類のタグ化ＤＥＮ３－ＥＤ３に対する免疫応答性のタグ配列の依存性（２頭のマウスの平均）を示す。アジュバントとしては、１回目の抗原投与の際にはＦｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを、２回目～４回目の投与の際にはＦｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを用いた。各投与後（Ｄｏｓｅ１～４）の抗ＤＥＮ３－ＥＤ３抗体の力価値を比較している。投与は、０．３ｍｇ/ｍＬの抗原を含む溶液１００μＬにアジュバント１００μＬの合計２００μＬをマウスに投与することにより行った。ＣｏｎｔｒｏｌはＰＢＳのみで免疫したマウス、「Ｄ３Ｅｄ３」はタグ化しないＤＥＮ３－ＥＤ３により免疫したマウスである。「Ｄ３Ｃ４Ｉ」は４個のＩｌｅから成るタグ・ペプチドと２個のＧｌｙから成るスペーサーを、「Ｄ３Ｃ５Ｄ」は５個のＡｓｐから成るタグ・ペプチドと２個のＧｌｙから成るスペーサーを、「Ｄ３Ｃ５Ｋ」は５個のＬｙｓから成るタグ・ペプチドと２個のＧｌｙから成るスペーサーを付加したタグ化ＤＥＮ３－ＥＤ３である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
＜タグ化ポリペプチド＞
本発明では、それに対する特異的抗体を産生させるべきポリペプチド（つまり、「抗原ペプチド」）の免疫原性を増強させるために、特定のアミノ酸配列を有するタグによって当該抗原ペプチドが修飾される。以下に、当該本発明のタグ化ポリペプチドの構造を説明する。なお、本明細書において、特段の断りのない場合には、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に向けて記載される。
本発明では、それに対する特異的抗体を産生させるべきポリペプチド（つまり、「抗原ペプチド」）の免疫原性を増強させるために、特定のアミノ酸配列を有するタグによって当該抗原ペプチドが修飾される。以下に、当該本発明のタグ化ポリペプチドの構造を説明する。なお、本明細書において、特段の断りのない場合には、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に向けて記載される。
【0021】
１．抗原ペプチド
本発明において、それに対する免疫原性を増強させるべき抗原ペプチドについては特に制限がない。後述のように、本発明のタグ化により、その由来もアミノ酸配列も異なる抗原ペプチド（つまり、牛膵臓トリプシン阻害タンパク質やデング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３タンパク質）の抗原性を増強させ得ることが示されている。
本発明において、それに対する免疫原性を増強させるべき抗原ペプチドについては特に制限がない。後述のように、本発明のタグ化により、その由来もアミノ酸配列も異なる抗原ペプチド（つまり、牛膵臓トリプシン阻害タンパク質やデング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３タンパク質）の抗原性を増強させ得ることが示されている。
【0022】
したがって、本発明の抗原ペプチドは、細菌、真菌及びウイルス等の抗原性ポリペプチド；腫瘍細胞及び免疫細胞等の細胞表面に存在する抗原性ポリペプチド；ペプチドホルモン、サイトカイン及び増殖因子並びにそれらの受容体タンパク質；及び上記のいずれかの断片であってよいがそれらに限定されない。
【0023】
例えば、本発明の抗原ペプチドとして、デング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３、ヒト肝炎ウイルスやインフルエンザウイルスのｇａｇ及びｐｏｌ、ＢＡＧＥ、ＣＡＳＰ８、ＣＥＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＲＴ１、ＭＵＣ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ｐ５３、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ｒａｓ、ＳＡＲＴ－１、ＩＦＮ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１２.ＩＬ－１７及びＩＬ－２３等並びにＶＨＨ抗体や抗ｓｃＦｖなどの抗体断片は興味深い対象である。
【0024】
特に、本発明のタグ化は、比較的分子量が小さくて抗原性が弱いと考えられるような抗原ペプチド（例えば、牛膵臓トリプシン阻害タンパク質等）に対して好適に用いることができる。
【0025】
２．タグ・ペプチド
上記抗原ペプチドの末端に結合される本発明のタグ・ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸で構成される。更に、本発明のタグ・ペプチドは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏまたはそれらの組合せから成ることを特徴とする。後述のように、それらのアミノ酸を選択した場合にタグ化されたポリペプチドの免疫原性が増強されることが示されている。また、当該アミノ酸がＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＨｉｓまたはＰｒｏある場合に、特に顕著な免疫原性の増強が見出されている。
上記抗原ペプチドの末端に結合される本発明のタグ・ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸で構成される。更に、本発明のタグ・ペプチドは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏまたはそれらの組合せから成ることを特徴とする。後述のように、それらのアミノ酸を選択した場合にタグ化されたポリペプチドの免疫原性が増強されることが示されている。また、当該アミノ酸がＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、ＨｉｓまたはＰｒｏある場合に、特に顕著な免疫原性の増強が見出されている。
【0026】
上記のアミノ酸の個数は３個以上であれば本発明の免疫原性増強を達成し得るが、あまりに長いタグを使用することは経済的でないかもしれない。したがって、当該アミノ酸の個数としては３～１２個、好ましくは３～９個、より好ましくは４～９個、特に好ましくは４～６個程度であり得る。
【0027】
本発明のタグ・ペプチドは、全体として、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏまたはそれらの組合せから構成されていればよい。したがって、本発明のタグ・ペプチドの好適な例は、－（Ｖａｌ）１～６－（Ｉｌｅ）３～６、－（Ｉｌｅ）１～６－（Ｖａｌ）３～６、－（Ｉｌｅ）３～６－（Ａｒｇ）２～６、－（Ｉｌｅ）３～６－（Ａｓｎ）２～６、－（Ｌｅｕ）３～６－（Ａｒｇ）２～６、－（Ｌｕｅ）３～６－（Ａｓｎ）２～６、－（Ｉｌｅ）３～６－（Ｖａｌ）１～３－（Ｉｌｅ）３～６、－（Ａｓｎ）１～６－（Ａｓｐ）３～６、－（Ａｓｐ）１～６－（Ａｓｎ）３～６、－（Ａｓｐ）３～６－（Ａｒｇ）２～６、－（Ａｓｎ）３～６－（Ａｒｇ）３～６、－（Ａｓｐ）３～６－（Ａｓｎ）１～３－（Ａｓｐ）３～６、－（Ａｓｎ）３～６－（Ａｓｐ）１～３－（Ａｓｎ）３～６、－（Ｌｙｓ）１～６－（Ａｒｇ）３～６、－（Ａｒｇ）１～６－（Ｌｙｓ）３～６、－（Ｌｙｓ）３～６－（Ｌｙｓ）３～６、－（Ａｒｇ）３～６－（Ａｒｇ）３～６、－（Ａｒｇ）３～６－（Ｌｙｓ）１～３－（Ａｒｇ）３～６、又は－（Ｌｙｓ）３～６－（Ａｒｇ）１～３－（Ｌｙｓ）３～６等を含み得る。また、本発明のタグ・ペプチドの別の好適な態様として、Ｉｌｅと他の上記のアミノ酸の組合せ、例えば、－（Ｉｌｅ－Ａｒｇ）２－Ｉｌｅまたは－（Ｉｌｅ－Ａｓｎ）２－Ｉｌｅ等を挙げることができる。
【0028】
なお、上記の本発明のタグ・ペプチドの例は、抗原ペプチドのＣ末端側に結合するものとして記載したが、本発明のタグ・ペプチドは抗原ペプチドのＮ末端側に結合させてもよく、その場合には、例えば、（Ｉｌｅ）４～６－、（Ｖａｌ）４～６－、（Ｌｙｓ）４～６－、（Ａｒｇ）４～６－、（Ａｓｐ）４～６－、（Ａｓｎ）４～６－、（Ｓｅｒ）４～６－、（Ｌｅｕ）４～６－、（Ａｌａ）４～６－、（Ｈｉｓ）４～６－又は（Ｐｒｏ）４～６－であり得る。
【0029】
３．スペーサー・ペプチド
本発明のタグ化ポリペプチドにおいて、必ずしも必須ではないが、上記ポリペプチドとタグ・ペプチドを、スペーサー・ペプチドを介して結合させることも好適である。理論に拘束されるわけではないが、ある種のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端近傍のアミノ酸配列とタグ・ペプチドのアミノ酸配列の組合せよっては、当該末端をタグ化することによりポリペプチドの立体構造が多少変化することも想定される。また、そのような場合には、当該立体構造の変化等によって、所望される元のポリペプチドに対する特異性が十分でない抗体が産生されることも想定される。しかるに、そのような場合にスペーサー・ペプチドを用いることは有利であり得る。後述のように、異なる抗原ペプチド（牛膵臓トリプシン阻害タンパク質及びデング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３タンパク質）に対して、スペーサー・ペプチド（好ましくは２個のＧｌｙまたはＳｅｒ）を介在させて様々なタグ・ペプチドを結合させた場合でも、元の抗原ペプチドに対して特異的な抗体ないし抗血清が得られることが示されている。
本発明のタグ化ポリペプチドにおいて、必ずしも必須ではないが、上記ポリペプチドとタグ・ペプチドを、スペーサー・ペプチドを介して結合させることも好適である。理論に拘束されるわけではないが、ある種のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端近傍のアミノ酸配列とタグ・ペプチドのアミノ酸配列の組合せよっては、当該末端をタグ化することによりポリペプチドの立体構造が多少変化することも想定される。また、そのような場合には、当該立体構造の変化等によって、所望される元のポリペプチドに対する特異性が十分でない抗体が産生されることも想定される。しかるに、そのような場合にスペーサー・ペプチドを用いることは有利であり得る。後述のように、異なる抗原ペプチド（牛膵臓トリプシン阻害タンパク質及びデング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３タンパク質）に対して、スペーサー・ペプチド（好ましくは２個のＧｌｙまたはＳｅｒ）を介在させて様々なタグ・ペプチドを結合させた場合でも、元の抗原ペプチドに対して特異的な抗体ないし抗血清が得られることが示されている。
【0030】
したがって、本発明のタグ化ポリペプチドは、抗原ペプチドとタグ・ペプチドの間のスペーサーとして２個程度のアミノ酸、好ましくはＧｌｙまたはＳｅｒを有することが好ましい。
【0031】
＜タグ化ポリペプチドの製造＞
本発明のタグ化ポリペプチドは、当業者に公知の方法により製造することができる。好ましくは、目的のタグ化ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを組込んだ発現ベクターにより適切な宿主細胞を形質転換し、当該形質転換細胞の生育に適した条件下で該細胞を生育させることにより本発明のタグ化ポリペプチドを製造することができる。そのような方法は、分子生物学のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、等に記載されている。
本発明のタグ化ポリペプチドは、当業者に公知の方法により製造することができる。好ましくは、目的のタグ化ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを組込んだ発現ベクターにより適切な宿主細胞を形質転換し、当該形質転換細胞の生育に適した条件下で該細胞を生育させることにより本発明のタグ化ポリペプチドを製造することができる。そのような方法は、分子生物学のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、等に記載されている。
【0032】
例えば、本発明のタグ化ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを組込んだ発現ベクターを製造するためには、タグ化前の抗原ペプチドのｃＤＮＡが組込まれた発現プラスミドを鋳型として用いることができる。そして、例えば部位特異的変異法により目的とするタグ・ペプチドのアミノ酸配列（又はスペーサー・ペプチド及びタグ・ペプチドのアミノ酸配列）をコードするヌクレオチド配列を、前記抗原ペプチドのＯＲＦの５’末端又は３’末端側に対して付加すればよい。そのような方法を実施するためのキットはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社（米国）等から市販されている。また、所望により、上記のようにして作製した本発明のタグ化ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを別の発現ベクター内にクローニングしてもよい。
【0033】
つまり、本発明に用いることのできる発現ベクターは、用いる宿主細胞の種類に応じて、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターであってよい。例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３－３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ１１３－Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７等である。動物宿主細胞のための好適なベクターとしては、ｐＣＤＭ８及びｐＭＴ２ＰＣ、並びにアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等が挙げられる。
【0034】
上記の発現ベクターを宿主細胞に導入する手法としては、共沈、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等の慣用のトランスフェクション法が用い得る。宿主細胞としては、大腸菌等の細菌やＣＨＯ細胞等の動物細胞が好適であり得る。
【0035】
上記のようにして本発明のベクターにより形質転換された宿主細胞を、その細胞の至適培養条件下でインキュベーとすることにより、本発明のタグ化ポリペプチドを生産することができる。その後、培養物から、遠心分離、塩析、等電点沈殿、透析及び各種のクロマトグラフィーを組み合わせることで、本発明のタグ化ポリペプチドを精製することができる。たとえば、本発明のタグ化ポリペプチドの末端にＨｉｓタグを付加しておき、それをアフィニティ・クロマトグラフィーにより精製してもよい。
【0036】
また、本発明のタグ化ポリペプチドは化学的に合成することも可能である。例えば、カルボキシル基と必要に応じて側鎖を保護したアミノ酸及びアミノ基と必要に応じて側鎖を保護したアミノ酸とを用意し、それらをカルボジイミド等の試薬により縮合させた後で、アミノ基の保護基を外して次の保護化アミノ酸を反応させることで、本発明のタグ化ポリペプチドを合成することができる。
【0037】
＜抗原組成物＞
本発明のタグ化ポリペプチドは、１種又は２種以上の本発明のタグ化ポリペプチドを含む抗原組成物として経口的又は非経口的に（例えば、筋肉内、腹腔内又は皮下注射として）動物に投与することが有利である。通常、そのような組成物は生理学的に許容可能な少なくとも１つの担体（賦形剤）を含む。また、本発明の組成物は生理学的に許容可能な塩及び／又は補助剤を更に含んでよい。
本発明のタグ化ポリペプチドは、１種又は２種以上の本発明のタグ化ポリペプチドを含む抗原組成物として経口的又は非経口的に（例えば、筋肉内、腹腔内又は皮下注射として）動物に投与することが有利である。通常、そのような組成物は生理学的に許容可能な少なくとも１つの担体（賦形剤）を含む。また、本発明の組成物は生理学的に許容可能な塩及び／又は補助剤を更に含んでよい。
【0038】
本発明の抗原組成物中におけるタグ化ポリペプチドの濃度は約０．１～９９重量％であり、例えば、使用時に０．３ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ/ｍＬとして調製されるものであり得る。また、当該組成物に用いることのできる生理学的に許容可能な担体は、例えば生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油及びゼラチン等の当業者によく知られている水性又は油性媒体或いはエマルジョンであってよい。
【0039】
本発明の組成物に添加され得る生理学的に許容可能な塩としては、酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、アスコルビン酸、安息香酸、サリチル酸及びメタンスルホン酸等の有機酸の酸付加塩や、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸の酸付加塩が挙げられる。したがって、本発明の組成物は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液として構成されてよい。更に、本発明の組成物は、補助剤として、等張化剤（ショ糖等の糖類）、安定化剤（各種アミノ酸やポリソルベート等の界面活性剤）、ｐＨ調整剤（各種緩衝塩）、防腐剤、乳化剤や分散剤を含んでもよい。
【0040】
本発明のタグ化ポリペプチドは優れた免疫原性を示すので、アジュバントを使用することは必ずしも必須ではない。しかしながら、後述のとおり、本発明のタグ化ポリペプチドをアジュバントと同時に投与することでその免疫原性が更に増強されることが示されている。したがって、本発明の組成物にアジュバントを添加することも好適な態様である。そのようなアジュバントは当業者に知られたいずれのものであってもよく、例えば、アルミニウム塩等の塩類、パラフィン、ラノリン及びフロイント等の油性アジュバント及び結核菌の死菌を含む完全フロイント・アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）であり得る。結核菌の死菌を含まない不完全フロイント・アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）が好適である。
【0041】
＜抗原組成物の使用＞
上記のような本発明の抗原組成物は、ヒト患者のためのワクチンとして用いることができる。当該ワクチンとして患者に投与される本発明のタグ化ポリペプチドの量は、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態等の考慮事項に関連して選択される。一般的には、０．０１μｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重が単回又は複数回用量に分割して投与される。好ましい投与量の範囲は１日当たり２０μｇ～５．０ｍｇであり得る。
上記のような本発明の抗原組成物は、ヒト患者のためのワクチンとして用いることができる。当該ワクチンとして患者に投与される本発明のタグ化ポリペプチドの量は、患者の年齢、体重、性別、全般的な健康状態等の考慮事項に関連して選択される。一般的には、０．０１μｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重が単回又は複数回用量に分割して投与される。好ましい投与量の範囲は１日当たり２０μｇ～５．０ｍｇであり得る。
【0042】
また、本発明の抗原組成物は、ヒト以外の動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、ラット及びマウス等）のためのワクチンとして用いることもできる。更には、それらの動物によりヒト患者治療用の抗血清（ないしポリクローナル抗体）を産生させるために使用することもできる。本発明の抗原組成物はそれらの動物に対しても上記ワクチンに準じた方法で投与してよい。
【0043】
更に、本発明の抗原組成物を投与することで実験動物の免疫特異的応答が増強するので、本発明の抗原組成物により免疫した実験動物から特異性が高いモノクローナル抗体を生産する脾臓細胞を効率的に取得し得ることが予想される。そのような実験動物に対する本発明の抗原組成物の投与も前記に準じて実施可能である。例えば、マウスに対して１回当たり１０～５０μｇ、好ましくは２０μｇ程度の投与量で数週間にわたり複数回投与することができる。
【0044】
以下、本発明について実施例を用いて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【0045】
［方法］
１．タグ化ポリペプチドの調製
以下に、牛膵臓トリプシン阻害タンパク質（以下、「ＢＰＴＩ」と略す。）を抗原ペプチドとして用いた場合の本発明のタグ化ポリペプチドの調製方法を記載する。
１．タグ化ポリペプチドの調製
以下に、牛膵臓トリプシン阻害タンパク質（以下、「ＢＰＴＩ」と略す。）を抗原ペプチドとして用いた場合の本発明のタグ化ポリペプチドの調製方法を記載する。
【0046】
すべてのタグ化ＢＰＴＩを、“Ｋａｔｏ，Ａ．，Ｍａｋｉ，Ｋ．，Ｅｂｉｎａ，Ｔ．，Ｋｕｗａｊｉｍａ，Ｋ．，Ｓｏｄａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．；Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｓｈｏｒｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇｓ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，８５，１２－１８（２００７）”及び“Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｐ．Ｓ．；Ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＢＰＴＩ） ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ａｌｍｏｓｔ ｈａｌｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ ａｌａｎｉｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８，４９３－５０１（２０００）”に記載されたｐＭＭＨａベクター中に構築した。
【0047】
２つのＧｌｙ残基（スペーサーとして）及びタグ・ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、抗原ペプチドのテンプレート（ＢＰＴＩ－１９Ａ：５８残基中１９個のアラニンを含む（Ｉｓｌａｍ，ＭＭ．，Ｓｏｈｙａ，Ｓ．，Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｙｏｈｄａ，Ｍ．， ａｎｄ Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．，“Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｏｖｅｒ ｏｎｅ－ｔｈｉｒｄ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｒｅ ａｌａｎｉｎｅｓ”，Ｐ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０５，１５３３４－１５３３９（２００８）参照。）のＣ末端に対応する配列に対してＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（商品名：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、米国）を用いて付加し、その配列を増幅した。プラスミド配列をＤＮＡ配列決定（ＰＲＩＳＭ ３１３０ｘ１ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名：ＡＢＩ社、米国））により確認した。
【0048】
タグ化ＢＰＴＩは、ＢＰＴＩ－１９ＡのＣ末端に付加されたアミノ酸の数及び種類に従って命名された。例えば、Ｃ５Ａは、ＢＰＴＩ－１９ＡのＣ末端に２つのＧｌｙスペーサーの後に付加された５つのアラニンから成るタグを表す。すべてのタグ化ＢＰＴＩを、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞株内で、１１０ｒｐｍで１３～１４時間振盪しながら３７℃で発現させた。但し、Ｃ５Ｅは大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内で、９０ｒｐｍで１０時間振盪（それ以外は上記と同じ条件）して発現させた。
【0049】
タグ化ＢＰＴＩを等電点沈殿により精製し、続いて“Ｋｈａｎ ＡＭ．，Ｉｓｌａｍ ＭＭ．，Ｋｕｒｏｄａ Ｙ．，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｓｈｏｒｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇｓ”，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１８３４（１０），２１０７－２１１５（２０１３）及びＭＭ. Ｉｓｌａｍ，ＡＭ. Ｋｈａｎ，Ｙ. Ｋｕｒｏｄａ，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｓｈｏｒｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｇｓ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ＢＰＴＩ ｖａｒｉａｎｔ”，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１８２４（１０），１１４４－１１５０（２０１２）”に記載された逆相ＨＰＬＣで精製した。タンパク質同定はＭＡＬＤＩ質量分析法（ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＴＯＦ／ＴＯＦＴＭ（商標） ５８００）により確認し、使用するまで凍結乾燥粉末として－３０℃で保存した。サンプルは、凍結乾燥粉末をＭＱ水に溶解し、最終タンパク質濃度を緩衝液中で調整することによって調製した。測定の直前にサンプルを２５℃で２０分間２００００ｇで遠心分離した。
【0050】
２．免疫原性の測定
（１）動物の免疫
市販のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウスに対して、上記のようにして調製したタグ化ＢＰＴＩ溶液を、それぞれを約２０μｇのタグ化ＢＰＴＩ用量で６週間（週１回；計６回）皮下投与した。陰性対照には緩衝液のみを投与した。また、アジュバントを使用した実験では、タグ化ＢＰＴＩ溶液に対して結核菌の死菌を含まない不完全フロイント・アジュバント（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手）を１：１ ｒａｔｉｏ（１００ｕＬのアドジュバントと１００ｕＬの蛋白質液の計２００ｕＬをそれぞれのマウスに注射）の濃度で添加した。６週目にマウスの尾及び心臓から血液を採取した。採取した血液から、「初心者のための動物実験手技（１） マウス・ラット （ＫＳ医学・薬学専門書）」（鈴木 潔（著））に記載の方法に準じて抗血清を調製した。
（１）動物の免疫
市販のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌマウスに対して、上記のようにして調製したタグ化ＢＰＴＩ溶液を、それぞれを約２０μｇのタグ化ＢＰＴＩ用量で６週間（週１回；計６回）皮下投与した。陰性対照には緩衝液のみを投与した。また、アジュバントを使用した実験では、タグ化ＢＰＴＩ溶液に対して結核菌の死菌を含まない不完全フロイント・アジュバント（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手）を１：１ ｒａｔｉｏ（１００ｕＬのアドジュバントと１００ｕＬの蛋白質液の計２００ｕＬをそれぞれのマウスに注射）の濃度で添加した。６週目にマウスの尾及び心臓から血液を採取した。採取した血液から、「初心者のための動物実験手技（１） マウス・ラット （ＫＳ医学・薬学専門書）」（鈴木 潔（著））に記載の方法に準じて抗血清を調製した。
【0051】
（２）特異抗体の測定
ＥＬＩＳＡ法を用いて抗血清中のＢＰＴＩに特異的な抗体の量を測定した。具体的に、プレート（ＩＷＡＫＩ社製）にタグ化していない抗原ペプチド（ＢＰＴＩ－１９Ａ）の溶液（２．５μｇ／ＰＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭリン酸二水素カリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４））を添加し、約２５℃で約１２時間超インキュベートすることにより、プレート表面を抗原ペプチドでコートした。ＰＢＳを用いてプレート洗浄し、１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）を添加した。プレートを３７℃で４５分間インキュベートしたのち、添加液を除去した。次に、上記（１）で得た抗血清を、ＰＢＳで適切な倍率に希釈したのち、抗原ペプチドでコートしたプレートに添加した。プレートを３７℃で１２０分間インキュベートしたのち、抗血清希釈液を除去した。プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳに０．０５％Ｖ／ＶになるようＴｗｅｅｎ２０（ＷＡＫＯ社））で３回洗浄し、次いでＰＢＳで２回洗浄したのち、市販の抗マウスＩｇＧ抗体及び抗マウスＩｇＭ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号６２－６５２０及び６２－６８２０）を用いて、製造元の指示に従ってＥＬＩＳＡを実施した。
ＥＬＩＳＡ法を用いて抗血清中のＢＰＴＩに特異的な抗体の量を測定した。具体的に、プレート（ＩＷＡＫＩ社製）にタグ化していない抗原ペプチド（ＢＰＴＩ－１９Ａ）の溶液（２．５μｇ／ＰＢＳ（１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭリン酸二水素カリウム、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４））を添加し、約２５℃で約１２時間超インキュベートすることにより、プレート表面を抗原ペプチドでコートした。ＰＢＳを用いてプレート洗浄し、１％ＢＳＡ（ＰＢＳ）を添加した。プレートを３７℃で４５分間インキュベートしたのち、添加液を除去した。次に、上記（１）で得た抗血清を、ＰＢＳで適切な倍率に希釈したのち、抗原ペプチドでコートしたプレートに添加した。プレートを３７℃で１２０分間インキュベートしたのち、抗血清希釈液を除去した。プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳに０．０５％Ｖ／ＶになるようＴｗｅｅｎ２０（ＷＡＫＯ社））で３回洗浄し、次いでＰＢＳで２回洗浄したのち、市販の抗マウスＩｇＧ抗体及び抗マウスＩｇＭ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号６２－６５２０及び６２－６８２０）を用いて、製造元の指示に従ってＥＬＩＳＡを実施した。
【0052】
測定に際しては、抗血清の希釈系列を試料として用いた。各希釈率でのＥＬＩＳＡの吸光度を縦軸に、また希釈率を横軸にして濃度依存曲線を作成した。
【0053】
（３）力価の計算
上記のように作成した濃度依存曲線を線形及び／又は多項式回帰に基づいて解析し、それぞれの回帰式を得た。それらの回帰式から外挿した、ＥＬＩＳＡの吸光度が０となる希釈率を当該タグ化ＢＰＴＩの力価とした。
上記のように作成した濃度依存曲線を線形及び／又は多項式回帰に基づいて解析し、それぞれの回帰式を得た。それらの回帰式から外挿した、ＥＬＩＳＡの吸光度が０となる希釈率を当該タグ化ＢＰＴＩの力価とした。
【0054】
なお、同一の希釈率での比較が可能な場合には、ＥＬＩＳＡの吸光度どうしを直接比較した。
【0055】
［実施例１］ ＩｌｅタグによるＢＰＴＩの免疫原性の増強
上記の手順にしがたって、ＢＰＴＩ－１９ＡのＣ末端にスペーサー・ペプチドとして２つのＧｌｙを結合させ、そのＣ末端にタグ・ペプチドとして５つの連続したＩｌｅを結合させたＩｌｅタグ化ＢＰＴＩ（Ｃ５Ｉ）を調製した（図１）。当該タグ化ＢＰＴＩにより上記の手順に従って免疫したマウスから抗血清を取得した。そして、当該抗血清のＢＰＴＩ特異的抗体量を上記のＥＬＩＳＡ法により測定した。この実験では、アジュバントを使用しなかった。
上記の手順にしがたって、ＢＰＴＩ－１９ＡのＣ末端にスペーサー・ペプチドとして２つのＧｌｙを結合させ、そのＣ末端にタグ・ペプチドとして５つの連続したＩｌｅを結合させたＩｌｅタグ化ＢＰＴＩ（Ｃ５Ｉ）を調製した（図１）。当該タグ化ＢＰＴＩにより上記の手順に従って免疫したマウスから抗血清を取得した。そして、当該抗血清のＢＰＴＩ特異的抗体量を上記のＥＬＩＳＡ法により測定した。この実験では、アジュバントを使用しなかった。
【0056】
陰性対照としてタグ化ＢＰＴＩを調製する際に使用した緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔ）のみを投与したマウスからの抗血清を試料とした。比較例としてタグ化していないＢＰＴＩ－１９Ａ（１９Ａ）を投与したマウスからの抗血清を試料とした。いずれの試料についても２匹のマウスを用いて実験を行った。
【0057】
ＥＬＩＳＡ測定による濃度依存曲線を図２の上段のパネルに示した。図は、タグ化していないＢＰＴＩ－１９Ａ（１９Ａ）及びＩｌｅタグ化ＢＰＴＩ（Ｃ５Ｉ）の場合は３００倍希釈から６５６１００倍の抗血清についての結果を示している。また、線形回帰（Ｌｉｎｅａｒ ｆｉｔｔｉｎｇ）及び多項式回帰（Ｐｏｌｙｎｏｍｉｎａｌ ｆｉｔｔｉｎｇ）に基づいた回帰式から外挿した力価を図２の下段のパネルに示した。図２から明らかなように、本発明のＩｌｅタグ化ＢＰＴＩ（Ｃ５Ｉ）を用いることにより、アジュバントを使用しなくてもＢＰＴＩの免疫原性は顕著に増強した。
【0058】
［実施例２］ アジュバントの効果
アジュバントを併用することによりさらに免疫原性が増強されるかどうかを調べるために、マウスを免疫する際の溶液にアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ、ただし１回目の免疫の際はＦｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を添加したこと以外は実施例１と同様にして実験した。比較例としてタグ化していないＢＰＴＩ－１９Ａを前記アジュバントと共に投与したマウスからの抗血清を試料とした。
アジュバントを併用することによりさらに免疫原性が増強されるかどうかを調べるために、マウスを免疫する際の溶液にアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ、ただし１回目の免疫の際はＦｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を添加したこと以外は実施例１と同様にして実験した。比較例としてタグ化していないＢＰＴＩ－１９Ａを前記アジュバントと共に投与したマウスからの抗血清を試料とした。
【0059】
ＥＬＩＳＡ測定によるそれらの試料の吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）を図５に示した。図５から、Ｉｌｅタグを付加することによりＢＰＴＩ－１９Ａをアジュバントと共に用いた場合よりも免疫原性が増強されることがわかった。また、Ｉｌｅタグ化ＢＰＴＩの免疫原性がアジュバントとの併用によりさらに増強されることが示された。
【0060】
［実施例３Ａ］ その他のタグによるＢＰＴＩの免疫原性の増強
様々なアミノ酸により構成されたタグ・ペプチドを有するＢＰＴＩ－１９Ａを調製し、それらの力価を実施例１と同様して測定した。この実験ではアジュバントを併用した。また、いずれの試料についても２匹のマウスを用いて実験を行った。
様々なアミノ酸により構成されたタグ・ペプチドを有するＢＰＴＩ－１９Ａを調製し、それらの力価を実施例１と同様して測定した。この実験ではアジュバントを併用した。また、いずれの試料についても２匹のマウスを用いて実験を行った。
【0061】
結果を表１に示した。表中、力価は線形回帰に基づいた回帰式から外挿した力価である。また、各試料における力価の増強を、タグ化していないＢＰＴＩ－１９Ａ（１９Ａ）を投与したマウス抗血清に対する力価との比として示している。
【0062】
【表1】
【0063】
また、本発明のタグ化ＢＰＴＩで免疫した代表的なマウス血清希釈液のＥＬＩＳＡ値の濃度依存曲線を図３に示した。さらに、マウスから得た血清の力価及び３００倍希釈した血清を用いたＥＬＩＳＡの平均値（２頭のマウス）を、プレートを１９Ａでコートした場合とＣ５Ｔでコートした場合のそれぞれについて、図４に示した。つまり、ここで生成された血清は、ＢＰＴＩそのものを認識しており、ペプチド・タグが認識されているのではないことが示された。さらに、表１並びに図３及び図４から明らかなように、本発明のタグ化ＢＰＴＩを用いることによりＢＰＴＩの免疫原性は顕著に増強した。
【0064】
［実施例３Ｂ］ その他のタグ及びスペーサーによる免疫原性の増強
更に、他のアミノ酸により構成されたタグ・ペプチドまたは他のスペーサーを有するＢＰＴＩ－１９Ａ、及びＮ末端にタグ・ペプチド及びスペーサーを有するＢＰＴＩ－１９Ａを調製し、実施例１と同様にしてそれらの力価を測定した。いずれの試料についても２匹以上（殆どの変異体は３個以上）のマウスを用いて実験を行った。また、採血は心臓から行った。
更に、他のアミノ酸により構成されたタグ・ペプチドまたは他のスペーサーを有するＢＰＴＩ－１９Ａ、及びＮ末端にタグ・ペプチド及びスペーサーを有するＢＰＴＩ－１９Ａを調製し、実施例１と同様にしてそれらの力価を測定した。いずれの試料についても２匹以上（殆どの変異体は３個以上）のマウスを用いて実験を行った。また、採血は心臓から行った。
【0065】
結果を表２に示した。表中、力価は線形回帰に基づいた回帰式から外挿した力価である。また、各試料における力価の増強を、タグ化していないＢＰＴＩ－１９Ａ（１９Ａ）を投与したマウス抗血清に対する力価との比として示している。
【0066】
【表2】
【0067】
また、上記の本発明のタグ化ＢＰＴＩで免疫したマウス血清希釈液のＥＬＩＳＡ値の濃度依存曲線を図８に示した。これらの結果は、タグ・ペプチドがＡｌａ、ＨｉｓまたはＰｒｏで構成されている場合や、２種以上のアミノ酸の組合せで構成されている場合でも、免疫原性が顕著に増強することを示している。また、スペーサーがＳｅｒで構成されている場合でも、依然として最も高い免疫原性の増強を示していることから、表１の結果と合わせて、本発明のスペーサーを任意のアミノ酸で構成し得ることを示唆している。さらに、本発明のタグ・ペプチドをＮ末端側に結合させた場合でも、免疫原性の増強が見られた。
【0068】
［実施例３Ｃ］ アジュバントの効果
本発明のタグ・ペプチドとしてＩｌｅを用い、スペーサーとしてＳｅｒを用いたもの（ｓｓＣ５Ｉ）についても、アジュバントを併用した場合と使用しなかった場合についても比較した。アジュバントの併用は、実施例２と同様にして行った。
本発明のタグ・ペプチドとしてＩｌｅを用い、スペーサーとしてＳｅｒを用いたもの（ｓｓＣ５Ｉ）についても、アジュバントを併用した場合と使用しなかった場合についても比較した。アジュバントの併用は、実施例２と同様にして行った。
【0069】
図９に示されるように、スペーサーとしてＳｅｒを用いた場合、アジュバントなしでも免疫原性の増強は十分なものであったが、アジュバントの併用により、更に顕著な免疫原性の増強が見られた。
【0070】
［実施例４］ タグ化によるデング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３タンパク質の免疫原性の増強
本発明のタグ化により異なる抗原ペプチドの免疫原性も増強させ得ることを調べるため、デング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３タンパク質（以下、「ＤＥＮ３－ＥＤ３」と略す。）を本発明に従ってタグ化した。
本発明のタグ化により異なる抗原ペプチドの免疫原性も増強させ得ることを調べるため、デング熱ウイルスＤＥＮ３－ＥＤ３タンパク質（以下、「ＤＥＮ３－ＥＤ３」と略す。）を本発明に従ってタグ化した。
【0071】
上記ＢＰＴＩに関して説明した方法に準じて各種のタグ化ＤＥＮ３－ＥＤ３を調製した。すなわち、タグ化ＤＥＮ３－ＥＤ３は、ＲＭ. Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｎ．Ｎｕｍｏｔｏ，Ｎ．Ｉｔｏ，Ｙ．Ｋｕｒｏｄａ，“Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｂｕｒｉｅｄ Ｌｅｕ－Ｉｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｅｎｇｕｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ ＩＩＩ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４７１（１）：１６３－８（２０１６ Ｊａｎ）に記載されたｐＥＴ－１５ベクター中に構築して得た。得られた各種タグ化ＤＥＮ３－ＥＤ３を用いて、マウスへの抗原投与回数ごとに血清を測定すること及びプレートをタグ化前のＤＥＮ３－ＥＤ３でコートした以外は、上記の実施例１に準じて実験を実施した。タグ化ＤＥＮ３－ＥＤ３の命名法は、上記タグ化ＢＰＴＩに準じた（たとえば、「Ｃ３Ｉ」は３個のＩｌｅから成るタグをＣ末端に付加したＤＥＮ３－ＥＤ３を表す。）。対照のマウス（Ｄ３Ｅｄ３）には、タグ化していないＤＥＮ３－ＥＤ３を投与した。抗原を４回投与した後に得られた結果を表３に示した。表３中、力価は線形回帰に基づいた回帰式から外挿した力価である。また、各試料における力価の増強を、対照（Ｄ３Ｅｄ３）マウスの抗血清に対する力価との比として示している。
【0072】
【表3】
【0073】
さらに、アジュバントを使用した場合の抗原（ＤＥＮ３－ＥＤ３）を４回投与後の力価を図７に示した。アジュバントとしては、１回目の抗原投与の際にはＦｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを、２回目～４回目の投与の際にはＦｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔを用いた。投与は、０．３ｍｇ/ｍＬ相当の抗原を含む溶液１００μＬにアジュバント１００μＬの合計２００μＬをマウスに投与することにより行った。
【産業上の利用可能性】
【0074】
本発明のタグ化ポリペプチドはワクチンとして利用でき、また抗血清やモノクローナル抗体の製造等にも用い得るので、医薬品や試薬品製造に利用可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】