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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-12-22
(45)【発行日】2023-01-05
(54)【発明の名称】被験者における興奮性亢進の判定方法及びキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20221223BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20221223BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20221223BHJP
C12Q 1/6813 20180101ALI20221223BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20221223BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20221223BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
C12N15/09 Z
C12N15/11 Z
C12Q1/6813 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6851 Z
【請求項の数】
22
(21)【出願番号】P 2020542919
(86)(22)【出願日】2019-02-12
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-05-27
(86)【国際出願番号】 JP2019004916
(87)【国際公開番号】W WO2019156257
(87)【国際公開日】2019-08-15
【審査請求日】2020-10-06
(31)【優先権主張番号】62/628,324
(32)【優先日】2018-02-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２８年度、平成２９年度 国立研究開発法人日本医療研究開発機構、難治性疾患実用化研究事業、研究開発課題名「神経疾患の集中的な遺伝子解析及び原因究明に関する研究」、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの
(73)【特許権者】
【識別番号】504137912
【氏名又は名称】国立大学法人 東京大学
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100152331
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 拓
(72)【発明者】
【氏名】辻 省次
(72)【発明者】
【氏名】石浦 浩之
【審査官】上村 直子
(56)【参考文献】
【文献】Gene，2000年，Vol.242，pp.65-73
【文献】臨床神経学，2014年，Vol.54, No.12，pp.1142-1145
【文献】Neurogenetics，2010年，Vol.11，pp.409-415
【文献】PLOS ONE，2015年，No.e0125906，pp.1-13
【文献】Nature Genetics，2018年，Vol.50，pp.581-590
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８－１／７０
Ｃ１２Ｎ １５／０９－１５／１１
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者からの核酸サンプル中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡのリピート伸長、又はＴＴＴＣＡの相補的配列及びＴＴＴＴＡの相補的配列のリピート伸長を検出することを含む、前記被験者における振戦及び／又はてんかんを示す興奮性亢進の判定補助方法であって、ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡが前記被験者からの遺伝子のイントロン中に存在し、
前記遺伝子が、ＳＡＭＤ１２遺伝子、ＴＮＲＣ６Ａ遺伝子、及びＲＡＰＧＥＦ２遺伝子の少なくとも１つであり、
ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＣＡの相補的配列、及びＴＴＴＴＡの相補的配列のそれぞれの前記リピート伸長が５０リピート超である、
方法。
【請求項2】
前記核酸サンプルが染色体ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記リピート伸長のサイズに基づいて前記興奮性亢進の予想発症年齢を計算することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記興奮性亢進が脳内の興奮性亢進である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記興奮性亢進が大脳内の興奮性亢進である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記興奮性亢進が皮質ニューロンの興奮性亢進である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記興奮性亢進が良性成人型家族性ミオクローヌスてんかんである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
被験者からのサンプル中にＵＵＵＣＡのリピート伸長を有するＲＮＡ ｆｏｃｉを検出することを含む、前記被験者における振戦及び／又はてんかんを示す興奮性亢進の判定補助方法であって、前記サンプルがニューロンであり、
前記ＲＮＡ ｆｏｃｉが前記ニューロンの核中に存在し、
前記リピート伸長が５０リピート超である、
方法。
【請求項9】
前記興奮性亢進が脳内の興奮性亢進である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記興奮性亢進が大脳内の興奮性亢進である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項11】
前記興奮性亢進が皮質ニューロンの興奮性亢進である、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記興奮性亢進が良性成人型家族性ミオクローヌスてんかんである、請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
被験者からの核酸サンプル中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡのリピート伸長、又はＴＴＴＣＡの相補的配列及びＴＴＴＴＡの相補的配列のリピート伸長を検出するように構成された核酸試薬を含む、前記被験者における振戦及び／又はてんかんを示す興奮性亢進の判定キットであって、ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡが前記被験者からの遺伝子のイントロン中に存在し、
前記遺伝子が、ＳＡＭＤ１２遺伝子、ＴＮＲＣ６Ａ遺伝子、及びＲＡＰＧＥＦ２遺伝子の少なくとも１つであり、
ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、ＴＴＴＣＡの相補的配列、及びＴＴＴＴＡの相補的配列のそれぞれの前記リピート伸長が５０リピート超である、
キット。
【請求項14】
前記核酸試薬が、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの前記相補的配列の前記リピート伸長を検出するように構成されたＰＣＲプライマーを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
前記ＰＣＲプライマーが、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列の相補的配列を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項16】
前記核酸試薬が、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの前記相補的配列の前記リピート伸長を検出するように構成されたハイブリダイゼーションプローブを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項17】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列の相補的配列を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項18】
前記ハイブリダイゼーションプローブが、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列の近接配列の相補的配列を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項19】
前記近接配列のサイズが２０ｋｂ未満である、請求項１８に記載のキット。
【請求項20】
被験者からのサンプル中のＵＵＵＣＡのリピート伸長を検出するように構成されたプローブを含む、前記被験者における振戦及び／又はてんかんを示す興奮性亢進の判定キットであって、前記サンプルがニューロンの核中に存在するＲＮＡ ｆｏｃｉであり、
前記リピート伸長が５０リピート超である、
キット。
【請求項21】
前記プローブがＴＧＡＡＡを含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項22】
前記プローブが蛍光色素を有する標識である、請求項２０又は２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
[0001] 被験者における興奮性亢進の判定方法及びキットが開示される。
[0001] 被験者における興奮性亢進の判定方法及びキットが開示される。
【背景技術】
【0002】
背景技術
[0002] 良性成人型家族性ミオクローヌスてんかん（ＢＡＦＭＥ）は、良性の臨床経過を示すミオクローヌス振戦（皮質振戦）及び、稀に生じるてんかんにより特徴付けられる常染色体優性遺伝性の疾患である（ＭＩＭ６０１０６８）。この疾患は、家族性本態性ミオクローヌスてんかん（ＦＥＭＥ）、良性成人型家族性ミオクローヌスてんかん（ＢＡＦＭＥ）、家族性成人型ミオクローヌスてんかん（ＦＡＭＥ）、常染色体優性遺伝性皮質振戦、ミオクローヌス、及びてんかん（ＡＤＣＭＥ）、並びにてんかんを伴う家族性皮質ミオクローヌス振戦（ＦＣＭＴＥ）をはじめとする各種名称で呼ばれてきた。これまでのところ、少なくとも６０家系が日本で報告されている。これまでに調べられた日本の家系及び中国の家系はすべて、８ｑ２４に連鎖することが示されている。一方、常染色体優性遺伝を示す類似の臨床所見を有するイタリア、フランス、及びタイ出身の家系は、それぞれ、遺伝子座位異質性を示唆する２ｐ（ＦＡＭＥ２／ＦＣＭＴＥ２）、５ｐ（ＦＡＭＥ３／ＦＣＭＴＥ３）、及び３ｑ（ＦＡＭＥ４／ＦＣＭＴＥ４）に連鎖することが示されている。宇山らは、日本の熊本県でＢＡＦＭＥの出現率を１／３５，０００と推定し、日本でＢＡＦＭＥの出現率が高いことを示唆した。
[0002] 良性成人型家族性ミオクローヌスてんかん（ＢＡＦＭＥ）は、良性の臨床経過を示すミオクローヌス振戦（皮質振戦）及び、稀に生じるてんかんにより特徴付けられる常染色体優性遺伝性の疾患である（ＭＩＭ６０１０６８）。この疾患は、家族性本態性ミオクローヌスてんかん（ＦＥＭＥ）、良性成人型家族性ミオクローヌスてんかん（ＢＡＦＭＥ）、家族性成人型ミオクローヌスてんかん（ＦＡＭＥ）、常染色体優性遺伝性皮質振戦、ミオクローヌス、及びてんかん（ＡＤＣＭＥ）、並びにてんかんを伴う家族性皮質ミオクローヌス振戦（ＦＣＭＴＥ）をはじめとする各種名称で呼ばれてきた。これまでのところ、少なくとも６０家系が日本で報告されている。これまでに調べられた日本の家系及び中国の家系はすべて、８ｑ２４に連鎖することが示されている。一方、常染色体優性遺伝を示す類似の臨床所見を有するイタリア、フランス、及びタイ出身の家系は、それぞれ、遺伝子座位異質性を示唆する２ｐ（ＦＡＭＥ２／ＦＣＭＴＥ２）、５ｐ（ＦＡＭＥ３／ＦＣＭＴＥ３）、及び３ｑ（ＦＡＭＥ４／ＦＣＭＴＥ４）に連鎖することが示されている。宇山らは、日本の熊本県でＢＡＦＭＥの出現率を１／３５，０００と推定し、日本でＢＡＦＭＥの出現率が高いことを示唆した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0003】
【文献】[0003]Uyama, E., Fu, Y.H., & Ptacek, L.J. Familial adult myoclonic epilepsy (FAME). In: Delgado-Escueta, A.V., Guerrini, R., Medina, M.T., Genton, P., Bureau, M., Dravet, C., eds. Advances in neurology, Vol. 95: Myoclonic Epilepsies. Philadelphia, Lippincott Willams & Wilkins. 281-288 (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
[0004] コピー数解析を含めて候補領域内に位置する３８遺伝子のすべてのエクソンの包括的変異解析にもかかわらず、原因となる変異は同定されていない。
【課題を解決するための手段】
【0005】
問題の解決策
[0005] 本発明者らは、８ｑ２４に連鎖するＢＡＦＭＥの原因となる変異としてＳＡＭＤ１２のイントロンに非コードＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡペンタヌクレオチド（５塩基）リピート伸長を同定した。さらに、本発明者らは、ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長が除外されたＢＡＦＭＥファミリーのＴＮＲＣ６及びＲＡＰＧＥＦ２Ａに類似のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長を同定した。これらの知見から、ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡペンタヌクレオチドリピート伸長は、伸長リピートが存在する遺伝子に関わらず、おそらくＲＮＡ媒介毒性機序を介して、ＢＡＦＭＥを含めて神経細胞の興奮性亢進の病態機序に本質的な役割を果たすことが強く示唆される。
[0005] 本発明者らは、８ｑ２４に連鎖するＢＡＦＭＥの原因となる変異としてＳＡＭＤ１２のイントロンに非コードＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡペンタヌクレオチド（５塩基）リピート伸長を同定した。さらに、本発明者らは、ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長が除外されたＢＡＦＭＥファミリーのＴＮＲＣ６及びＲＡＰＧＥＦ２Ａに類似のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長を同定した。これらの知見から、ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡペンタヌクレオチドリピート伸長は、伸長リピートが存在する遺伝子に関わらず、おそらくＲＮＡ媒介毒性機序を介して、ＢＡＦＭＥを含めて神経細胞の興奮性亢進の病態機序に本質的な役割を果たすことが強く示唆される。
【0006】
[0006] 本開示のある態様は、被験者からの核酸サンプル中のＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列のリピート伸長を検出することを含む、被験者における興奮性亢進の判定又は診断方法に関する。ＴＴＴＣＡリピートの伸長は、ＢＡＦＭＥ患者に排他的に存在するが、この伸長はまた、限られた割合の健常者にも稀に存在する。
【0007】
[0007] 本開示のある態様は、被験者からの核酸サンプル中のＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列のリピート伸長を検出することと、リピート伸長が検出された場合、被験者に興奮性亢進治療用の医薬組成物を投与することと、を含む、被験者における興奮性亢進の治療方法に関する。
【0008】
[0008] 上記の方法において、核酸サンプルは染色体ＤＮＡでありうる。上記の方法において、ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡは、被験者からの遺伝子のイントロン中に存在しうる。上記の方法において、遺伝子は、ＳＡＭＤ１２遺伝子、ＴＮＲＣ６Ａ遺伝子、及びＲＡＰＧＥＦ２遺伝子の少なくとも１つでありうる。上記の方法において、リピート伸長は５０リピート超でありうる。以上の方法は、リピート伸長のサイズに基づいて興奮性亢進の予想発症年齢を計算することをさらに含みうる。上記の方法において、興奮性亢進は脳内の興奮性亢進でありうる。上記の方法において、興奮性亢進は大脳内の興奮性亢進でありうる。上記の方法において、興奮性亢進は皮質ニューロンの興奮性亢進でありうる。上記の方法において、興奮性亢進は癲癇でありうる。上記の方法において、興奮性亢進は良性成人型家族性ミオクローヌスてんかんでありうる。
【0009】
[0009] 本開示のある態様は、被験者からのサンプル中のＵＵＵＣＡのリピート伸長を有するＲＮＡ ｆｏｃｉを検出することを含む、被験者における興奮性亢進の判定又は診断方法に関する。
【0010】
[0010] 本開示のある態様は、被験者からのサンプル中のＵＵＵＣＡのリピート伸長を有するＲＮＡ ｆｏｃｉを検出することと、ＲＮＡ ｆｏｃｉが検出された場合、被験者に興奮性亢進治療用の医薬組成物を投与することと、を含む、被験者における興奮性亢進の治療方法に関する。
【0011】
[0011] 上記の方法において、サンプルは神経細胞でありうる。上記の方法において、ＲＮＡ ｆｏｃｉは神経細胞核に存在しうる。上記の方法において、興奮性亢進は脳内の興奮性亢進でありうる。上記の方法において、興奮性亢進は大脳内の興奮性亢進でありうる。上記の方法において、興奮性亢進は皮質神経細胞の興奮性亢進でありうる。上記の方法において、興奮性亢進はてんかんでありうる。興奮性亢進は良性成人型家族性ミオクローヌスてんかんでありうる。
【0012】
[0012] 本開示のある態様は、被験者からの核酸サンプル中のＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列のリピート伸長を検出するように構成された核酸試薬を含む、被験者における興奮性亢進の判定又は診断キットに関する。
【0013】
[0013] 上記のキットにおいて、核酸試薬は、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列のリピート伸長を検出するように構成されたＰＣＲプライマーを含みうる。上記のキットにおいて、ＰＣＲプライマーは、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列の相補的配列を含みうる。上記のキットにおいて、核酸試薬は、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列のリピート伸長を検出するように構成されたハイブリダイゼーションプローブを含みうる。上記のキットにおいて、ハイブリダイゼーションプローブは、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列の相補的配列を含みうる。上記のキットにおいて、ハイブリダイゼーションプローブは、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列の近接配列の相補的配列を含みうる。上記のキットにおいて、近接配列のサイズは、２０ｋｂ未満でありうる。
【0014】
[0014] 本開示のある態様は、被験者からのサンプル中のＵＵＵＣＡのリピート伸長を検出するように構成されたプローブを含む、被験者における興奮性亢進の判定又は診断キットに関する。
【0015】
[0015] 上記のキットにおいて、プローブはＴＧＡＡＡを含みうる。上記のキットにおいて、プローブは蛍光色素で標識しうる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】[0016]ＢＡＦＭＥに対する候補領域のリファインメント。（ａ）連鎖解析及びハプロタイプ解析に使用したＢＡＦＭＥファミリーの家系図。四角及び丸は、それぞれ、男性及び女性を表す。罹患者は、塗潰し記号により表される。記号を通る斜線は、死亡者を表す。（ｂ）３．１の累積多点ロッドスコアを有する単一ピークを示すパラメトリック連鎖解析。従来の研究で同定された候補領域も示される。（ｃ）６家系の詳細なハプロタイプ。家系間の共有ハプロタイプは灰色で示される。（ｄ）ハプロタイプ解析により規定された最小候補領域。これは単一エクソン（ＳＡＭＤ１２のエクソン４）とその周囲のイントロンとを含む。
【図2A】[0016]ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長変異の同定。（ＴＴＴＴＡ）7（ＴＴＡ）（ＴＴＴＴＡ）11又ハ17を含有する３名（Ｆ７３６１のＩＩ－２、ＩＩ－３、及びＩＩＩ－３）におけるＳＡＭＤ１２のイントロン４のＰＣＲ産物のサンガーシーケンシング。ＴＴＡ中断の下流に位置するＴＴＴＴＡリピート単位の数は、一見すると、父親では１７／１７、母親では１１／１１、及び息子では１１／１１であり、メンデルの法則に一致しない。
【図2B】[0016]ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長変異の同定。患者（Ｆ６９０６のＩＩ－６）について、ＴＴＴＴＡリピートの周辺のショートリードの手動アライメント。リピートの参照配列は、マイナス鎖（ｈｇ１９のｃｈｒ８：１１９，３７９，０５５～１１９，３７９，１５７）で（ＴＴＴＴＡ）7（ＴＴＡ）（ＴＴＴＴＡ）13であるが、代表的なショートリードの手動アライメントは、リピートの下流に異常ＴＴＴＣＡリピート伸長を示す。図に示されない他のペアリードがこの領域にユニークにアライメントされることから、伸長ＴＴＴＣＡリピートの存在がさらに支持される。
【図2C】[0016]ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長変異の同定。ＳＡＭＤ１２のエクソン４、イントロン４、及びエクソン５の模式図。伸長ＴＴＴＴＡリピート及びＴＴＴＣＡリピートをそれぞれ検出するために、ＳＡＭＤ１２のイントロン４のＴＴＴＣＡリピート伸長の上流にＴＴＴＴＡリピート伸長が位置すると仮定して、プライマーセット（「Ｐ１、Ｐ２、及びＰ３アンカー」、並びに「Ｐ３、Ｐ４、及びＰ４アンカー」）を設計する。配列（図８）を含有するようにプローブ１ａ及び１ｂを設計し、サザンブロット解析に使用する。
【図2D】[0016]ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長変異の同定。リピートプライムＰＣＲ解析の代表的な結果。２つの独立した実験は類似の結果を示した。４８家系の８２名の患者では、Ｆ６９０６のＩＩ－６に対する結果に示されたのと同様に、ＴＴＴＴＡリピート伸長及びＴＴＴＣＡリピート伸長の両方が実証された（上側パネル）。ファミリーＦ６１１５では、リピートプライムＰＣＲ解析は、ＴＴＴＴＡリピート伸長のみを示した（中間パネル）。対照では、参照配列中のそれに対応する短いＴＴＴＴＡリピートのみが検出される（下側パネル）。
【図2E】[0016]ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長変異の同定。サザンブロット解析により確認されたリピート伸長。ジゴキシゲニン標識プローブ１ａ及び１ｂを用いて、罹患者（Ｆ６９０６のＩＩ－６）は伸長対立遺伝子を示したが、非罹患者（Ｆ６９０６のＩＩ－７）は示さなかった。２つの独立した実験は類似の結果を示した。
【図2F】[0016]ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長変異の同定。Ｆ６１１５のサザンブロット解析。ゲノムＤＮＡをＳａｃＩにより消化し、ジゴキシゲニン標識プローブ１ａ及び１ｂ又はジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9（図８ａ）を用いてサザンブロット解析に付した。罹患者（Ｆ６１１５のＩ－２、ＩＩ－１、及びＩＩ－２）では、ジゴキシゲニン標識プローブ１ａ及び１ｂは、正常対立遺伝子に由来する２．３ｋｂの断片のほかに伸長リピートに対応する追加の断片を示した（左側パネル）。ジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9（図８ａ及び図８ｄ）を用いたサザンブロット解析は、ＴＴＴＣＡを標的とするリピートプライムＰＣＲが図２ｄに示されるように増幅ができなかったという事実にもかかわらず、伸長対立遺伝子にＴＴＴＣＡリピートが含有されることを示した（右側パネル）。こうした知見から、Ｆ６１１５の患者における伸長対立遺伝子は、Ｆ６９０６の患者を含めて他の場合のものとは異なるリピート構成を有することが示唆される。実験は１回実施した。
【図3A】[0016]ＳＡＭＤ１２中の異常リピート伸長の２つのリピート構成。ＳＭＲＴシーケンシングにより決定されたリピート伸長を含むＢＡＣクローンＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。この解析によりＦ６９０６のＩＩ－６で正確なリピート構成が決定された。本発明者らがリピートプライムＰＣＲ解析によりＴＴＴＣＡリピート伸長の検出に失敗したファミリーＦ６１１５で、ＳＭＲＴシーケンシングは、２つのＴＴＴＴＡリピート伸長間にＴＴＴＣＡリピート伸長を示した。
【図3B】[0016]ＳＡＭＤ１２中の異常リピート伸長の２つのリピート構成。ＢＡＦＭＥ１家系のＳＡＭＤ１２中のリピート構成の模式図。ほとんどの家系は、ＴＴＴＴＡ伸長が上流に位置し且つＴＴＴＣＡ伸長が下流に位置するリピート構成１に適合する結果を示した。１家系（Ｆ６１１５）のみは、ＴＴＴＣＡリピート伸長が２つのＴＴＴＴＡリピート伸長間に位置するリピート構成２を有することを、本発明者らは見いだした。
【図4A】[0016]リピート長は、てんかんの発症年齢に逆相関し、且つ世代間不安定性を示す。サザンブロット解析により推定されたＳＡＭＤ１２中の伸長ＴＴＴＣＡリピート及びＴＴＴＴＡリピート（リピート構成１）のサイズ及びてんかんの発症年齢。ゲノムＤＮＡが末梢血白血球（５０名の患者）及びリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）（４名の患者）から抽出されたヘテロ接合変異を有する患者は、それぞれ、黒丸及び黒四角により表される。Ｆ６１１５の伸長リピート（リピート構成２）のデータはこの解析には含まれない。点線は、ヘテロ接合リピート伸長を有する患者（ｎ＝５４）の線形回帰直線を表す。ヘテロ接合リピート伸長を有する患者の伸長リピートの長さは、てんかんの発症年齢に有意に逆相関した（ｐ＝３．５×１０－４、相関係数の有意性の検定）。逆相関は、１８．４ｋｂのリピート長を有する単一の外れ値を除外しても、依然として観測されることに留意すべきである（ｐ＝８．９×１０－４、相関係数の有意性の検定）。ホモ接合変異を有する４名の患者のうち、３名の患者の末梢血白血球における伸長リピートのサイズは、末梢血白血球又はＬＣＬが入手不能であった剖検患者（Ｆ８１４０のＶ－３）を除いて、白丸により表される。てんかんの発症年齢に対する平均リピート長のプロットにより示されるように、ホモ接合リピート伸長を有する患者におけるてんかんの発症年齢は、より若くなる傾向があることから、ホモ接合患者における発症年齢に及ぼす相加的遺伝子効果の可能性が示唆される。
【図4B】[0016]リピート長は、てんかんの発症年齢に逆相関し、且つ世代間不安定性を示す。世代間で不安定なリピート長を示す末梢白血球からのゲノムＤＮＡを用いた代表的なサザンブロット解析。この家系（Ｆ８３９８）では、リピート伸長は後続の世代でより大きくなる。実験は１回実施した。
【図5】[0016]ＢＡＦＭＥ１患者の神経病理学的研究。（ａ～ｄ）ＳＡＭＤ１２中にＴＴＴＣＡペンタヌクレオチドリピート伸長（リピート構成１）を有するＢＡＦＭＥ剖検患者の脳の組織病理学的特徴。ホモ接合変異を有する患者の小脳皮質（ａ～ｃ：Ｆ８１４０のＶ－３）及びヘテロ接合変異を有する患者の小脳皮質（ｄ：Ｆ８１３８のＩＩ－７）。（ａ）細胞体の周辺にハロー様アモルファス物質（体細胞萌芽）を示す残留プルキンエ細胞及び変形した核。（ｂ）銀含浸により実証された体細胞萌芽を有するプルキンエ細胞の他の一例。（ｃ）２つのプルキンエ細胞のハロー様アモルファス物質は、カルビンジンプロテインＤ－２８ｋに対して免疫陽性である。実験を６回実施し、信頼できる同様の結果を得た。（ｄ）体細胞萌芽を有していない３つのプルキンエ細胞。（ａ、ｄ）ヘマトキシリン－エオシン染色、（ｂ）ボディアン染色、及び（ｃ）免疫染色後にヘマトキシリンで対比染色。バー＝２５μｍ（ａ、ｂ、及びｄ）並びに５０μｍ（ｃ）。（ｅ）ＳＡＭＤ１２中にＴＴＴＣＡペンタヌクレオチドリピート伸長（リピート構成１）を有する患者の剖検脳の大きな皮質神経細胞中にＲＮＡ ｆｏｃｉを示す蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析。Ｃｙ３標識（ＴＧＡＡＡ）12プローブを使用したときにＲＮＡ ｆｏｃｉが観測されたので、ＲＮＡ ｆｏｃｉはＵＵＵＣＡリピートからなるとみなされる。類似の結果は、他の４名のヘテロ接合患者及び３名の対照で得られた。ＲＮＡ ｆｏｃｉは、アンチセンスＣｙ３－（ＴＴＴＣＡ）12プローブを用いた場合、罹患脳で検出されなかった。リボヌクレアーゼＡ前処置では、罹患脳で蛍光シグナルを生成しなかったが、デオキシリボヌクレアーゼＩ前処置では、蛍光シグナルが残留した（データは示されていない）。本発明者らは、ＵＵＵＵＡリピート伸長を標的とするＣｙ３－（ＴＡＡＡＡ）12やＣｙ３－（ＴＡＡＡＡ）18プローブを用いた場合には、ＲＮＡ ｆｏｃｉを観察しなかった。
【図6A】[0016]ＴＮＲＣ６Ａ（ＢＡＦＭＥ６）及びＲＡＰＧＥＦ２（ＢＡＦＭＥ７）中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長変異の同定。ＴＮＲＣ６Ａ中のリピート伸長変異の模式図。ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長をそれぞれ検出するように設計されたプライマーセット「Ｐ５、Ｐ６、及びＰ６アンカー」並びに「Ｐ７、Ｐ８、及びＰ８アンカー」は、伸長リピートの模式図の下に示される。配列（図８ｂ）を含有するプローブ６ａ及び６ｂを設計し、サザンブロット解析に使用する。
【図6B】[0016]ＴＮＲＣ６Ａ（ＢＡＦＭＥ６）及びＲＡＰＧＥＦ２（ＢＡＦＭＥ７）中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長変異の同定。リピートプライムＰＣＲ解析の代表的な結果。図は、患者におけるＴＴＴＴＡ及びＴＴＴＣＡリピート伸長の存在を示す（上側パネル）。Ｆ９２８３の全部で５名の罹患者では、ＴＴＴＴＡ及びＴＴＴＣＡリピート伸長の両方が検出される。実験を独立して２回実施し、同様の結果を得た。
【図6C】[0016]ＴＮＲＣ６Ａ（ＢＡＦＭＥ６）及びＲＡＰＧＥＦ２（ＢＡＦＭＥ７）中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長変異の同定。Ｆ９２８３のサザンブロット解析。ジゴキシゲニン標識プローブ６ａ及び６ｂを用いたサザンブロット解析は、罹患者において伸長対立遺伝子に対応する１０ｋｂの断片（矢印）を示した（左側パネル）。実験を独立して２回実施し、同様の結果を得た。ジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9プローブを用いたサザンブロット解析は、罹患者における伸長対立遺伝子（矢印）がＴＴＴＣＡリピート伸長を含有することを示す（右側パネル）。ＴＮＲＣ６Ａ中の伸長リピートの長さは、ＳＡＭＤ１２中のものほど不安定でない。実験は１回実施した。
【図6D】[0016]ＴＮＲＣ６Ａ（ＢＡＦＭＥ６）及びＲＡＰＧＥＦ２（ＢＡＦＭＥ７）中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長変異の同定。ＲＡＰＧＥＦ２中の異常リピート伸長の模式図。ＴＴＴＴＡ及びＴＴＴＣＡリピート伸長をそれぞれ検出するように設計されたプライマーセット「Ｐ９、Ｐ１０、及びＰ１０アンカー」並びに「Ｐ１１、Ｐ１２、及びＰ１２アンカー」は、伸長リピートの模式図の下に示される。配列（図８ｃ）を含有するプローブ７ａ～ｄを設計し、サザンブロット解析に使用する。
【図6E】[0016]ＴＮＲＣ６Ａ（ＢＡＦＭＥ６）及びＲＡＰＧＥＦ２（ＢＡＦＭＥ７）中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長変異の同定。Ｆ８２４１のリピートプライムＰＣＲ解析の結果。図は、ＩＩＩ－２におけるＴＴＴＴＡ及びＴＴＴＣＡリピート伸長の両方の存在を示す（上側パネル）。非罹患兄弟姉妹（ＩＩＩ－１）では、ＴＴＴＴＡリピート伸長は検出されたが、ＴＴＴＣＡリピート伸長は検出されなかった（中間パネル）。母親（ＩＩ－２）では、正常な短いＴＴＴＴＡリピートのみが検出される（下側パネル）。実験を独立して２回実施し、同様の結果を得た。
【図6F】[0016]ＴＮＲＣ６Ａ（ＢＡＦＭＥ６）及びＲＡＰＧＥＦ２（ＢＡＦＭＥ７）中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長変異の同定。Ｆ８２４１のサザンブロット解析。ジゴキシゲニン標識プローブ７ａ～ｄを用いて行ったサザンブロット解析（左側パネル）は、罹患患者（ＩＩＩ－２）において伸長対立遺伝子に対応する２０ｋｂの断片（矢印）を示した。ジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9プローブを用いたサザンブロット解析（右側パネル）は、罹患患者（ＩＩＩ－２）において伸長対立遺伝子（矢印）がＴＴＴＣＡリピート伸長を含有することを示す。非罹患兄弟姉妹（ＩＩＩ－１）では、正常対立遺伝子に対応する８．９ｋｂのバンドのほかに短い伸長に対応する１０．１ｋｂの断片が観測される。しかしながら、ジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9プローブを用いたサザンブロット解析（右側パネル）では、１０．１ｋｂの断片を示さなかったことから、ＩＩＩ－１における短い伸長は、ＴＴＴＣＡリピート伸長を含有しないことが示唆される。これらの実験を独立して２回実施し、同様の結果を得た。
【図7】[0016]ＴＴＴＴＡリピート伸長を示すＳＡＭＤ１２中のリピートの上流領域にアライメントされたショートリード。上段：２名の罹患者の全ゲノム配列解析の結果は、上流領域にＴＴＴＴＡリピート伸長を含有する変異対立遺伝子を示唆する。下段：罹患者の全ゲノム配列解析の結果は、下流領域にＴＴＴＣＡリピート伸長を示唆する。下段の図は、図２ｂのものと同一である。
【図8】[0016]リピート、サザンブロット解析に使用したプローブ、及び制限部位の位置の模式図。（ａ～ｃ）。研究に使用したプローブの模式図。物理的位置はｈｇ１９に基づく。鋳型用に調製されたサブクローン化されたゲンム断片を用いてＰＣＲによりジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブ合成を実施する。プローブ合成に使用したプライマーは図２７に列挙される。必要とされたとき、ハイブリダイゼーションシグナルを増加させるために複数のプローブをハイブリダイゼーション緩衝液（Roche DIG Easy-Hyb）に混合導入した。（ｄ）（ＴＧＡＡＡ）9プローブの模式図。ゲノム断片から作製されたＤＩＧ標識プローブは、正常対立遺伝子及び伸長対立遺伝子の両方にハイブリダイズされるが、ＤＩＧ－（ＴＧＡＡＡ）9プローブは、ＴＴＴＣＡリピート伸長を含有する伸長対立遺伝子に排他的にハイブリダイズされる。
【図9】[0016]ＳＡＭＤ１２中にリピート伸長変異を有するファミリー（リピート構成１）。罹患者は、塗潰し記号により表される。記号を通る斜線は、死亡者を表す。赤色ドットを有する記号は、ゲノムＤＮＡサンプルが入手可能であった者を表す。
【図10】[0016]ＳＡＭＤ１２中にリピート構成１及び２を有する家系の疾患ハプロタイプ。ＳＮＰタイピング、PacBio RSIIを用いたＢＡＣクローンのシーケンシング、及び10X GemCode技術を用いたゲノミックＤＮＡのシーケンシングにより、ハプロタイプを決定した。ｒｓ３９００７６７とｒｓ６２５３３３９７との間で、配列変異体はすべて、リピート伸長変異を除き一致した。そのため、共通の創始者が存在し且つ一方の構成が他方の構成に由来した可能性が高い。
【図11】[0016]リピート伸長を表すアセンブルナノポアリードのドットプロット。２つのサンプルの各々に対するＳＴＲ伸長を有するアセンブルコンティグ（Ｘ軸）と、伸長を有していないＳＴＲ部位（ｃｈｒ８：１１９，３７９，０５２～１１９，３７９，１７２）の周囲のその対応するｈｇ１９領域（Ｙ軸）と、の間のドットプロット。Ｘ軸の下では、４色のインタリーブパターンはゲノム配列を示し、赤色バーは２つのサンプル中のＳＴＲ伸長を表し、赤色及び青色のそれぞれの着色バーは、プラス鎖及びマイナス鎖におけるナノポアリードアライメントを示す。ＳＴＲ伸長を有するナノポア元リードは、ｘ軸のアセンブルコンティグにアライメントされたことから、ＳＴＲ伸長の存在を支持した。これとは対照的に、ＳＴＲ伸長を有していないリードは、ｙ軸のｈｇ１９参照ゲノムにアライメントされた。こうしたアライメントは、ｙ軸の右側に対して示されており、ＳＴＲ伸長のヘテロ接合性を示唆する。（ａ）Ｆ６９０６のＩＩ－６（ＳＡＭＤ１２中のリピート構成１）。（ｂ）Ｆ６１１５のＩＩ－１（ＳＡＭＤ１２中のリピート構成２）。
【図12】[0016]１Ｄ２技術によるＳＡＭＤ１２中のリピート伸長を表すナノポアリード。ＳＡＭＤ１２のリピート構成１（Ｆ６９０６のＩＩ－６、ａ）及びリピート構成２（Ｆ６１１５のＩＩ－１、ｄ）の生のナノポア１Ｄ２リードが示される。Tandem Repeat Finder（バージョン４．０９）を用いてカウントされたＴＴＴＣＡモチーフ及びＴＴＴＴＡモチーフの数が、それぞれ、（ｂ）及び（ｅ）に示される。依然としてエラーを含むおそれがあるので、これらのモチーフ数の解釈には注意を払わなければならない。観測されたリードと推定されたピュアリピートとの間の一致率は約９０％である（それぞれｃ及びｆ）。
【図13】[0016]各種組織／細胞におけるＳＡＭＤ１２中のリピート伸長の体細胞不安定性。実験はすべて、ゲノムＤＮＡのＳａｃＩ消化後に実施し、且つハイブリダイゼーションは、プローブ１ａ及び１ｂを用いて実施した。（ａ）白血球のリピート伸長の長さ及びリンパ芽球様細胞系のリピート伸長の長さは同程度であった。（ｂ～ｄ）脳及び他の組織の各種部分におけるリピート伸長の長さ。Ｆ８１３８のＩＩ－５、Ｆ８１３５のＩＩ－３、Ｆ８１３８のＩＩ－７、及びＦ８１３６のＩＩ－５は、スメアパターンを示し、一方、ホモ接合患者（Ｆ８１４０のＶ－３）は、いくぶん離散したパターンを示す。小脳からのゲノムＤＮＡは、それほど体細胞不安定性を示さない傾向がある。実験は１回実施した。ヘテロはヘテロ接合体、ホモはホモ接合体、ＬＣＬはリンパ芽球様細胞系、ＮＣは非保有者である。
【図14】[0016]ＳＡＭＤ１２中のリピート長の世代間不安定性。（ａ）親子ペアの世代間不安定性。親子ペア（ｎ＝２０）で観測された伸長リピートの長さの平均増加は、＋０．８９ｋｂ（９５％信頼区間＋０．１２～＋１．４８ｋｂ）であった。（ｂ）父子ペア及び母子ペアにおけるリピート長の世代間不安定性。伸長は、父系伝達（ｎ＝９）（＋０．２８ｋｂ、９５％信頼区間－０．３８～＋０．９４ｋｂ）よりも母系伝達（ｎ＝１１）（＋１．２ｋｂ、９５％信頼区間－０．０３～＋２．５ｋｂ）の方が大きい傾向があったが、その差は統計的に有意でなかった（ｐ＝０．２９、両側ウィルコクソン順位和検定）。
【図15】[0016]ホモ接合状態又はヘテロ接合状態の伸長リピートを有する患者の小脳で観測されたＲＮＡ ｆｏｃｉ。オリゴヌクレオチド（Ｃｙ３－（ＴＧＡＡＡ）12及びＣｙ３－（ＴＴＴＣＡ）12）を用いた蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）解析は、ホモ接合状態又はヘテロ接合状態の伸長リピートを有する患者の小脳ではＲＮＡ ｆｏｃｉを示したが、対照の小脳ではＲＮＡ ｆｏｃｉは観測されなかった。実験を２回実施し、同様の結果を得た。
【図16】[0016]ＲＮＡ－ｓｅｑ解析により脳内の不発転写が示唆された。（ａ～ｃ）Integrative Genomic Viewerを用いて可視化されたアライメントショートリード。ＳＡＭＤ１２転写物の模式図は上に示される。ホモ接合患者（１名の患者）及びヘテロ接合患者（２名の代表的な患者）では、リードカバー率は、伸長リピートの下流の領域（領域２）のものと比較して伸長リピートの上流の領域（領域１）で増加した。この増加は、おそらく、伸長リピートでの不発転写に起因する。かかる増加は、患者の肝臓（ｂ）及びリンパ芽球様細胞系（ｃ）では起こらなかった。６つのＢＡＦＭＥ１脳、８つの対照脳、６つのＢＡＦＭＥ１リンパ芽球様細胞系、２つの対照細胞系、及び３つのＢＡＦＭＥ１肝臓で、同様の結果が独立して得られた。（ｄ）領域１及び２の平均リードカバレッジの定量。ホモ接合ＢＡＦＭＥ１患者（ｎ＝１）、ヘテロ接合ＢＡＦＭＥ１患者（ｎ＝５）、及び対照（ｎ＝８）の脳のリードカバー率、ホモ接合ＢＡＦＭＥ１患者（ｎ＝２）、ヘテロ接合ＢＡＦＭＥ１患者（ｎ＝４）、及び非罹患ファミリーメンバー（ｎ＝２）のリンパ芽球様細胞系のリードカバー率、並びにホモ接合患者（ｎ＝１）及びヘテロ接合ＢＡＦＭＥ１患者（ｎ＝２）の肝臓のリードカバー率が示される。患者はすべて、ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長変異（リピート構成１）を有する。図中のラインは比の平均を表す。統計解析にウィルコクソンの順位和検定を使用した。「*」は、有意差（ｐ＜０．０５）が存在することを表す。（ｅ）不発転写のモデル。罹患脳でのみ観測された、領域２と比較した領域１のリードカバレッジ比の増加は、異常リピート伸長に起因する不発転写により引き起こされると推測された（Ameur et al. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 1435-1440 (2011)）。Ｅ１－４はエクソン１～４を表す。（ｆ）エクソン４／５接合及びエクソン５に対するプライマーを用いてｑＲＴ－ＰＣＲ解析により決定された脳内のＳＡＭＤ１２転写物１の発現レベル（ヘテロ接合ＢＡＦＭＥ１患者（ｎ＝４）及び対照（ｎ＝５））。内因性対照としてＲＰＬ１３Ａの発現レベルを使用した。データは平均及び平均の標準誤差として示される。ＳＡＭＤ１２転写物１の発現レベルは、不発転写産物が存在するときでさえも、罹患脳内で変化しなかった（両側スチューデントのｔ検定）。ＳＡＭＤ１２転写物２の厳密な定量は不発転写産物の存在下では困難であることに留意されたい。ホモはホモ接合、ヘテロはヘテロ接合、ＬＣＬはリンパ芽球様細胞系、ｎ．ｓ．は有意でないものである。
【図17】[0016]脳内のＳＡＭＤ１２タンパク質の発現レベル。（ａ）上側パネルは、ＢＡＦＭＥ１脳（後頭葉、ホモ接合患者（ｎ＝１）及びヘテロ接合患者（ｎ＝５））並びに対照（後頭葉、ｎ＝５）のＳＡＭＤ１２タンパク質（アイソフォーム１）のウェスタンブロットの画像である。下側パネルは、β－アクチンのウェスタンブロットの画像である。（ｂ）各脳内のβ－アクチン発現に対するＳＡＭＤ１２タンパク質（アイソフォーム１）の相対発現のグラフ図。（ｃ）ＳＡＭＤ１２アイソフォーム１の相対発現レベルの棒グラフ（ホモ接合患者（ｎ＝１）、ヘテロ接合患者（ｎ＝５）、及び対照（ｎ＝５））。ヘテロ接合リピート伸長を有する患者の脳内のＳＡＭＤ１２アイソフォーム１の発現レベルは、対照の脳よりも低かった（両側ｔ検定、ｐ＝０．００７４、９５％信頼区間０．５９～１．５７対１．５９～２．５８）。データは平均及び平均の標準誤差として示される。「*」は、有意差（ｐ＜０．０５）が存在することを表す。実験を独立して２回繰り返し、類似の結果を得た。
【図18】[0016]ＴＴＴＣＡリピート伸長は、Ｆ９２８３及びＦ８２４１のＴＮＲＣ６Ａ及びＲＡＰＧＥＦ２でそれぞれ同定される。一方のファミリー（Ｆ９２８３）は、ＴＮＲＣ６Ａ中にＴＴＴＣＡリピート伸長変異を有していたが、他方のファミリー（Ｆ８２４１）は、ＲＡＰＧＥＦ２中にＴＴＴＣＡリピート伸長変異を有していた。
【図19】[0016]ＴＮＲＣ６Ａ中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長。変異対立遺伝子は、ショート（２２）ＴＴＴＴＡリピートと伸長ＴＴＴＴＡリピートとの間の伸長ＴＴＴＣＡリピートからなることが、ショートリードの手動アライメントから示された。参照ゲノム配列（ｈｇ１９中のｃｈｒ１６：２４，６２４，７６１～２４，６２４，８５０）中には（ＴＴＴＴＡ）１８が存在する。
【図20】[0016]ＴＮＲＣ６Ａ中の伸長ＴＴＴＣＡリピートの局在化。リピート伸長は、ＲｅｆＳｅｑデータベースに登録されたＴＮＲＣ６Ａのエクソン１の上流領域で同定された。リピート配列の周辺のスプライスされた転写物の存在が脳ＲＮＡ－ｓｅｑデータから示唆され、これはスプライスされたＥＳＴ（HY329817）としても登録されている。（ａ）転写物は、脳、胎盤、腎臓、及び膵臓で発現されることがＲＴ－ＰＣＲ解析によりさらに確認される。（ｂ）伸長リピートは、脳内で発現されたＴＮＲＣ６Ａの転写物のイントロン（イントロン１ａとして表される）に位置することが、こうした知見から示唆される。実験を２回実施し、同様の結果を得た。
【図21】[0016]ＢＡＦＭＥ６ファミリーのパラメトリック連鎖解析。すべての染色体のパラメトリック連鎖解析（ａ）及びＢＡＦＭＥの既知の座位（ｂ）。両矢印は既知の候補領域を表す。解析では、ＢＡＦＭＥ１、ＢＡＦＭＥ２、ＢＡＦＭＥ３、及びＢＡＦＭＥ４の他の座位を排除する。
【図22】[0016]ＲＡＰＧＥＦ２中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長。変異対立遺伝子は、伸長ＴＴＴＴＡリピートとショート（「ｎ」として表される）ＴＴＴＴＡリピートとの間の伸長ＴＴＴＣＡリピートからなることが、ショートリードの手動アライメントから示された。参照ゲノム配列（ｈｇ１９中のｃｈｒ４：１６０，２６３，６７９～１６０，２６３，７６８）には（ＴＴＴＴＡ）5（ＴＡＴＴＡ）（ＴＴＴＴＡ）12が存在する。
【図23】[0016]Ｆ８２４１のハプロタイプ解析。（ａ）Ｆ８２４１のＩＩＩ－１及びＩＩＩ－２は同一父系対立遺伝子を有することが、ハプロタイプ解析から示唆される。このことは高密度ＳＮＰデータ解析によっても確認される（データは示されていない）。（ｂ）発端者（ＩＩＩ－２）の伸長リピートは、大幅な伸長（＞２０ｋｂ）及び体細胞不安定性を示す。非罹患姉妹の伸長対立遺伝子はＴＴＴＴＡリピートのみからなることから、同様に手の震えを有していた父親から伝達されたとき、伸長ＴＴＴＣＡリピートが欠失した可能性がある。
【図24】[0016]マイクロサテライトの解析に使用したプライマー。
【図25】[0016]リピートプライムＰＣＲ解析に使用したプライマーリスト。
【図26】[0016]ＲＮＡ－ｓｅｑ及び全ゲノム配列解析における５’－ＴＴＴＣＡ／５’－ＴＧＡＡＡ、５’－ＣＴＴＣＡ／５’－ＴＧＡＡＧ、及び５’－ＧＴＴＣＡ／５’－ＴＧＡＡＣモチーフが充填されたリードの数。
【図27】[0016]ＴＲｈｉｓｔを用いて全ゲノム配列解析により示された各種リピートモチーフを含有するリードの数。Ｆ９２８３及びＦ８２４１の発端者では、５’－ＡＡＡＴＧ（対向鎖中の５’－ＴＴＴＣＡに等価である）を含有する多数のリードが、ＳＡＭＤ１２中にＴＴＴＴＣＡリピート伸長を有する２名のＢＡＦＭＥ患者（Ｆ８１３５及びＦ８１４０）のときと同様に観察された。ＡＡＡＴＧ（＝ＴＴＴＣＡ）、ＡＡＣＴＧ（＝ＧＴＴＣＡ）、及びＡＡＧＴＧ（＝ＣＴＴＣＡ）リピート伸長はいずれも、７名の対照では観測さなかった。
【図28】[0016]参照配列（ｈｇ１９）中のＴＴＴＣＡ／ＴＧＡＡＡ又はＴＴＴＴＡ／ＴＡＡＡＡリピート。（ａ）参照配列（ｈｇ１９）中の（ＴＴＴＣＡ）>9／（ＴＧＡＡＡ）>9又は（ＴＴＴＴＡ）>9／（ＴＡＡＡＡ）>9リピートの数が示される。これらのうち、ＢＡＦＭＥ２、ＢＡＭＦＥ３、及びＢＡＦＭＥ４の候補領域に位置するもの及びイントロンに位置するものが示される。（ｂ）参照配列中の最長イントロンＴＴＴＴＡ／ＴＡＡＡＡ又はＴＴＴＣＡ／ＴＧＡＡＡリピート。（ｃ）ＢＡＦＭＥの候補領域のイントロンに位置する（ＴＴＴＣＡ）>9／（ＴＧＡＡＡ）>9又は（ＴＴＴＴＡ）>9／（ＴＡＡＡＡ）>9リピートが示される。
【図29】[0016]サザンブロットハイブリダイゼーション解析に使用したジゴキシゲニン標識プローブの生成に使用したプライマー。
【図30】[0016]ＢＡＣクローニングに使用したプライマー配列。
【図31】[0016]剖検患者死亡年齢及びの死亡原因。
【図32】[0016]ＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマー配列。
【図33】[0016]ＳＡＭＤ１２中にリピート伸長変異を有する４名のヘテロ接合ＢＡＦＭＥ患者及び８名の対照被験者のＲＮＡ－ｓｅｑ解析。データはすべて、デフォルト設定条件でCufflinks, Cuffquant, and Cuffdiff（v2.2.1）により計算される（Trapnell, C. et al. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010)）。
【発明を実施するための形態】
【0017】
[0017] てんかんはよくみられる神経疾患であり、イオンチャネル又はニューロトランスミッター受容体の変異が、単一遺伝子の異常によるてんかんの原因になることが多い。以下の実施例に記載されるように、ＳＡＭＤ１２のイントロン４中の異常ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長が良性成人型家族性ミオクローヌスてんかん（ＢＡＦＭＥ）を引き起こすことを、本発明者らは見いだした。ＢＡＣクローンの単一分子リアルタイムシーケンシング及びゲノムＤＮＡのナノポアシーケンシングは、ＳＡＭＤ１２中の２つのリピート構成を示した。興味深いことに、ＳＡＭＤ１２中にリピート伸長が観測されなかったＢＡＦＭＥの臨床診断を有する２つの家系では、ＴＮＲＣ６Ａ及びＲＡＰＧＥＦ２のイントロン中に類似のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長がさらに同定されたことから、同一のリピートモチーフの伸長が、伸長リピートが位置する遺伝子のいかんを問わずＢＡＦＭＥを含めて興奮性亢進の病理発生に関与することが示唆される。非コードリピート伸長が、ミオクローヌス振戦及びてんかんの原因となるニューロン機能不全もたらすというこうした知見は、非コードリピート伸長疾患の理解の範囲をさらに拡大する。
【0018】
[0018] 以下の実施例に記載されるように、本発明者らは、ＢＡＦＭＥの原因としてＳＡＭＤ１２中にＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長の２つの構成を見いだした（ＢＡＦＭＥ１として表される）。２つのリピート構成のどちらかのリピート伸長が５１ファミリー中４９ファミリーで確認されたことから、ＢＡＦＭＥ１は、各種形態のＢＡＦＭＥの中でも群を抜いて最も多く見受けられる形態であることが示唆される。伸長ＴＴＴＴＡリピートの長さが伸長ＴＴＴＣＡリピートに匹敵することがゲノムＤＮＡのナノポアシーケンシングにより示されたことから、ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長がＢＡＦＭＥの病態機序にどのように関与するかを研究する必要性が示唆される。
【0019】
[0019] 本発明者らはさらに、ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長が除外された２つのＢＡＦＭＥ家系のＴＮＲＣ６Ａ（ＢＡＦＭＥ６として表される）及びＲＡＰＧＥＦ２（ＢＡＦＭＥ７として表される）中にＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長を見いだした。ＳＡＭＤ１２、ＴＮＲＣ６Ａ、及びＲＡＰＧＥＦ２の遺伝子産物は、脳内で発現している。参照ゲノム中のこれらの遺伝子のリピート配列は、主にＴＴＴＴＡリピートのショートストレッチからなり、そのうち２つはＡｌｕ配列のポリＡテールに位置する。
【0020】
[0020] ＳＡＭＤ１２、ＴＮＲＣ６Ａ、及びＲＡＰＧＥＦ２中のＴＴＴＣＡリピート伸長は、対照被験者では見いだされなかったが、ＳＡＭＤ１２、ＴＮＲＣ６Ａ、及びＲＡＰＧＥＦ２中に、それぞれ、対照被験者の５．９％、０．９％、及び０．５％は、ＴＴＴＴＡリピート伸長を有することが、３つの座位のＴＴＴＴＡリピートを標的とするＲＰ－ＰＣＲ解析から示された。対照被験者に０．２～３ｋｂからさらに大きなサイズに及ぶＴＴＴＴＡリピートが存在することから、伸長ＴＴＴＴＡリピートは、おそらく疾患に寄与しないことが示唆される。同様の現象は、ＳＣＡ３１でも記載されている。
【0021】
[0021] ＳＡＭＤ１２中に伸長リピートを有する脳内のＳＡＭＤ１２タンパク質レベルは、わずかではあるが有意に減少することが、ウェスタンブロット解析により示されたことから、ＳＡＭＤ１２タンパク質レベルの減少は、疾患に寄与する可能性がある。しかしながら、同一の伸長リピートモチーフが別個の遺伝子で同定されたという知見から、ＵＵＵＣＡ及びＵＵＵＵＡリピート伸長自体を含有するＲＮＡ分子の発現は、各個別遺伝子の生理学的機能の変化ではなくＢＡＦＭＥの病理発生に関与することが強く主張される。以上に記載したように、ＴＴＴＴＡリピートの伸長はまた、限られた割合の対照被験者でも観察されることから、伸長ＴＴＴＣＡリピートが主にＢＡＦＭＥの病理発生に関与することが裏付けられる。ＳＡＭＤ１２中に伸長リピートを有する剖検脳内の神経細胞の核内に、ＵＵＵＣＡリピートを有するがＵＵＵＵＡリピートを有していないＲＮＡ ｆｏｃｉが存在することは、この見解をさらに支持する。ＲＮＡ ｆｏｃｉは、非コードリピート伸長を有するいくつかの神経変性障害で観測されており、それらにおける特徴的な神経病理学的知見であると考えられる。ＵＵＵＣＡリピートがＲＮＡ ｆｏｃｉにどのように優先的には組み込まれるかはまだ解明されてないが、ＲＮＡ媒介毒性、とくに、伸長ＵＵＵＣＡリピート媒介毒性は、ＢＡＦＭＥの病理発生の根底にある機序であることが、こうした一連の証拠から強く示唆される。
【0022】
[0022] てんかんは、家族性発生が稀ではない、よく診られる神経疾患である。イオンチャネル又はニューロトランスミッターレセプターの変異が単一遺伝子の異常によるてんかんの原因であるという従来の知見とは対照的に、本発明者の知見は、てんかんにおける非コードリピート伸長の役割を強調する。注目すべきこととして、臨床所見は、何十年にもわたり手のミオクローヌス振戦のきわめて緩徐な進行を示したにすぎず、且つ神経病理学的検査は、ホモ接合変異を有する患者でのみプルキンエ細胞の軽度の消失を示したが、かかる変化は、ヘテロ接合変異を有する患者では顕在化せず、それ以外では、ホモ接合変異又はヘテロ接合変異のどちらを有する患者でも中枢神経系の他の領域に明らかな変化はなかった。こうした知見は、非コードリピート伸長に起因する他の疾患とは著しく対照的であることから、ＢＡＦＭＥの主要の疾患機序は、皮質神経細胞の興奮性亢進をもたらす機能障害であることが示唆される。しかしながら、手の皮質振戦は緩徐に進行し、且つ体性感覚誘発電位の大きさは何十年もかけて大きくなることが、ＢＡＦＭＥ患者の綿密な臨床所見から示唆されることから、てんかんは、神経変性、神経回路網に生じる撹乱、及び／又は適正な電気生理学的ネットワークの維持の鍵となるタンパク質の撹乱に起因する可能性がある。
【0023】
[0023] 本発明者らは、罹患脳のＲＮＡ－ｓｅｑデータに変化したリピートモチーフの蓄積を見い出した。興味深いことに、ＣＵＵＣＡ及びＧＵＵＣＡリピートは、患者のＬＣＬ又は肝臓からのものでは観察されなかった。これとは対照的に、本発明者らは、３名の剖検患者からの全ゲノム配列データ中にＣＴＴＣＡ及び／又はＧＴＴＣＡリピートが充填された痕跡量の配列を観測したにすぎなかった（図２６ｂ）。ＣＵＵＣＡ及び／又はＧＵＵＣＡリピートは、罹患脳でのみ観測されたことから、ＣＵＵＣＡ及びＧＵＵＣＡリピート配列は、ＳＡＭＤ１２の変異対立遺伝子に由来するという解釈が支持される。こうした知見からＲＮＡ編集の可能性を生じるが、他の機序も考えられる。改変ＲＮＡ配列をもたらす厳密な機序をさらに調べる必要があるが、非コードリピート伸長疾患の疾患機序を調べる際にこうした知見を考慮に入れるべきである。本発明者らは、ＵＵＵＣＡ及びＵＵＵＵＡリピートに特異的なもののほかにＣＵＵＵＡ又はＧＵＵＣＡリピートに特異的なものを含めてより広範にわたるＲＮＡ結合タンパク質を考慮する必要がある。本発明者らはまた、ＣＵＵＣＡ、ＧＵＵＣＡ、ＵＵＵＵＡ、及びＵＵＵＣＡリピートからそれぞれ予測されるポリ－（ＬＨＦＴＳ）、ポリ－（ＶＱＦＳＳ）、ポリ－（ＦＹＦＩＬ）、及びポリ－（ＦＨＦＩＳ）を含めてより広範にわたるリピート関連非ＡＴＧ依存転写によって合成されるタンパク質を考慮する必要があろう。
【0024】
[0024] ショートリードシーケンサーによる非コードリピート伸長の検出は困難である。本発明者らは、以前、伸長ＣＡＧリピートとのハイブリダイゼーション用としてとくに設計されたプローブを用いて、伸長ＣＡＧリピートを直接同定するために、リピート伸長の直接同定及びクローニング技術（ＤＩＲＥＣＴ）という方法を開発し、ＳＣＡ２に対する遺伝子をクローニングした。この際、本発明者らは、全ゲノムシーケンシングにより得られたペアエンドリードを用いて、伸長リピートモチーフを直接同定するために、ＤＩＲＥＣＴのｉｎ ｓｉｌｉｃｏバージョンを考案した。この方策により、我々は、ＴＮＲＣ６Ａ及びＲＡＰＧＥＦ２中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長を発見することが可能であった。この方策は、広範にわたる神経学的疾患における非コードリピート伸長の捜索を加速するであろうと、本発明者らは考える。さらに、３つの独立した遺伝子に由来する同一の伸長リピートモチーフが発見されれば、非コードリピート伸長に起因することがすでに同定されている疾患でさえも、追加の遺伝子が十分に関与しうる可能性が高まる。とくに、参照配列（ｈｇ１９）のＢＡＦＭＥ２（２ｑ）、ＢＡＦＭＥ３（５ｐ）、及びＢＡＦＭＥ４（３ｑ）の候補領域に９リピート単位超のＴＴＴＣＡリピートは登録されていないが、ＢＡＦＭＥ２の候補領域に位置するＳＴＡＲＤ７のイントロン１中のＴＴＴＴＡリピート並びにＢＡＦＭＥ３の候補領域に位置するＭＡＲＣＨ６のイントロン１中及びＴＲＩＯのイントロン３４中のＴＴＴＴＡリピートは、こうした疾患に対する潜在的に良好な候補である（図２８）。
【0025】
[0025] 本発明者らは、ＳＡＭＤ１２、ＴＮＲＣ６Ａ、及びＲＡＰＧＥＦ２中の非コードＴＴＴＣＡリピート伸長がＢＡＦＭＥの原因になることを見い出した。このことは、てんかんの分子基盤に関する我々の知見を拡大し、解明された疾患の分子機序に基づいてＢＡＦＭＥを含めて興奮性亢進に対する有効な治療手段の開発をもたらすはずである。本発明者らは、本発明が非コードリピート伸長に起因する他の疾患の発見をさらに加速するであろうと予想する。
【0026】
[0026] 本発明者らによる以上の知見に基づいて、本発明の実施形態に係る被験者における興奮性亢進の判定又は診断方法は、被験者からの核酸サンプル中のＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列のリピート伸長を検出することを含む。核酸サンプル中のリピート伸長の存在は、被験者が興奮性亢進を有するか又は興奮性亢進を有すリスクがあることを示唆する。本方法は、被験者が興奮性亢進を有するか又はそのリスクがあるかの決定に使用可能である。
【0027】
[0027] 興奮性亢進は、脳内の興奮性亢進、大脳内の興奮性亢進、皮質神経細胞の興奮性亢進、てんかん、又は良性成人型家族性ミオクローヌスてんかん（ＢＡＦＭＥ）でありうる。
【0028】
[0028] 被験者は、ヒト又はヒト以外の動物である。被験者は、興奮性亢進を有する患者でありうる。核酸サンプルは、リピート伸長の検出前に被験者から採取しうる。本方法はｉｎ ｖｉｖｏで行いうる。核酸サンプルは、染色体ＤＮＡなどのＤＮＡでありうるか、又は代替的に核酸サンプルは、ＲＮＡでありうる。
【0029】
[0029] ＴＴＴＣＡリピート伸長は、５０リピート超、１００リピート、１５０リピート超、２００リピート超、２５０リピート超、３００リピート超、３５０リピート超、又は４００リピート超でありうる。
【0030】
[0030] 伸長ＴＴＴＣＡは、１５０塩基対超、５００塩基対、７５０塩基対超、１，０００塩基対超、１，２５０塩基対超、１，５００塩基対超、１，７５０塩基対超、又は２，０００超塩基対のサイズでありうる。
【0031】
[0031] 伸長ＴＴＴＴＡは、５００塩基対超、７５０塩基対超、１，０００塩基対超、１，２５０塩基対超、１，５００塩基対超、１，７５０塩基対超、又は２，０００超塩基対のサイズでありうる。
【0032】
[0032] ＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡは、被験者からのいずれかの遺伝子のイントロン中に存在しうる。たとえば、遺伝子は、ＳＡＭＤ１２遺伝子、ＴＮＲＣ６Ａ遺伝子、及びＲＡＰＧＥＦ２遺伝子の少なくとも１つでありうる。
【0033】
[0033] 実施形態に係る被験者における興奮性亢進の判定又は診断方法は、リピート伸長のサイズに基づいて興奮性亢進の予想発症年齢を計算することをさらに含みうる。
【0034】
[0034] 本発明者らは、リピート長を含めてリピート伸長のサイズが興奮性亢進の発症年齢に逆相関することを見いだした。したがって、たとえば、リピート伸長のサイズと興奮性亢進の発症年齢との間の逆相関を表す式を用いることにより、検出されたリピート伸長のサイズに基づいて興奮性亢進の予想発症年齢を計算することが可能である。
【0035】
[0035] 本発明の実施形態に係る被験者における興奮性亢進の判定又は診断キットは、被験者からの核酸サンプル中のＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列のリピート伸長を検出するように構成された核酸試薬を含む。
【0036】
[0036] キットは、本発明の実施形態に係る被験者における興奮性亢進の判定又は診断方法に使用可能である。キットはｉｎ ｖｉｖｏで使用しうる。
【0037】
[0037] 核酸試薬は、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列のリピート伸長を検出するように構成されたＰＣＲプライマーを含みうる。ＰＣＲプライマーは、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列の相補的配列を含みうる。
【0038】
[0038] ＰＣＲは、リピートプライムＰＣＲ及びロングレンジＰＣＲでありうる。リピートプライムＰＣＲ及びロングレンジＰＣＲは、リピート伸長を検出可能である。リピートプライムＰＣＲの適用は、Neuron 72, 257-268, October 20, 2011に記載されている。リピートプライムＰＣＲでは、核酸は、初期段階でフォワードプライマーとリバースプライマーとの間で増幅される。フォワードプライマーの濃度は低いので、フォワードプライマーは使い尽くされる。その後、核酸は、アンカープライマーとリバースプライマーとの間で増幅される。アンカープライマーが存在しない場合、リピート配列はランダムにアニールされる。かかる場合には、ごく短いＰＣＲ産物が生成され、リピート伸長の検出は困難である。アンカープライマーが存在する場合、ＰＣＲ産物は、アンカープライマーとリバースプライマーとの間で生成されるので、フォワードプライマーのアニーリングにより初期段階で生成されたＰＣＲ産物の分布を反映する。ＰＣＲ産物の櫛状分布を得ることが可能である。アンカープライマーはいずれの特定の配列にも限定しないことに留意すべきである。
【0039】
[0039] 代替的に、キット中の核酸試薬は、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列のリピート伸長を検出するように構成されたハイブリダイゼーションプローブを含みうる。ハイブリダイゼーションプローブは、たとえば、サザンブロッティングに使用可能である。サザンブロッティングは、リピート伸長を検出可能である。ハイブリダイゼーションプローブは、伸長リピート配列を含有する断片化核酸を検出するように構成される。断片化核酸は、制限酵素を用いることにより調製される。制限酵素は、適切に選択される。好ましくは、伸長リピート配列に近接する制限部位が選択される。制限酵素により調製された断片化核酸のサイズは、２０ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、又は５ｋｂ未満でありうる。
【0040】
[0040] ハイブリダイゼーションプローブは、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列の相補的配列を含みうる。ハイブリダイゼーションプローブは、伸長リピート配列の周りのゲノム配列の相補的配列を含みうる。ハイブリダイゼーションプローブは、ＴＴＴＣＡ、ＴＴＴＴＡ、又はそれらの相補的配列の近接配列の相補的配列を含みうる。近接配列のサイズは、２０ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、又は５ｋｂ未満でありうる。ハイブリダイゼーションプローブは、伸長リピート配列を含有する断片化核酸の部分配列のゲノム配列の相補的配列を含みうる。
【0041】
[0041] 本発明の実施形態に係る被験者における興奮性亢進の判定又は診断方法は、被験者からのサンプル中のＵＵＵＣＡのリピート伸長を有するＲＮＡ ｆｏｃｉを検出することを含む。サンプル中のＵＵＵＣＡのリピート伸長を有するＲＮＡ ｆｏｃｉの存在は、被験者が興奮性亢進を有するか又は興奮性亢進を有するリスクがあることを示唆する。本方法は、被験者が興奮性亢進を有するか又は興奮性亢進を有するリスクがあるかの決定に使用可能である。
【0042】
[0042] サンプルは、ＵＵＵＣＡのリピート伸長を有するＲＮＡ ｆｏｃｉの検出前に被験者から採取しうる。本方法はｉｎ ｖｉｖｏで行いうる。サンプルはニューロンでありうる。ＲＮＡ ｆｏｃｉはニューロン核に存在しうる。
【0043】
[0043] リピート伸長は、５０リピート超、１００リピート、１５０リピート超、２００リピート超、２５０リピート超、３００リピート超、３５０リピート超、又は４００リピート超でありうる。
【0044】
[0044] 伸長ＵＵＵＣＡは、１５０塩基対超、５００塩基対、７５０塩基対超、１，０００塩基対超、１，２５０塩基対超、１，５００塩基対超、１，７５０塩基対超、又は２，０００塩基対超のサイズでありうる。
【0045】
[0045] 本発明の実施形態に係る被験者における興奮性亢進の判定又は診断キットは、被験者からのサンプル中のＵＵＵＣＡのリピート伸長を検出するように構成されたプローブを含む。
【0046】
[0046] キットは、本発明の実施形態に係る被験者における興奮性亢進の判定又は診断方法に使用可能である。キットはｉｎ ｖｉｖｏで使用しうる。
【0047】
[0047] キット中のプローブは、ＴＧＡＡＡを含みうる。プローブは、Ｃｙ－３や放射性物質などの蛍光色素で標識しうる。
【実施例】
【0048】
[0048] （実施例１：患者）
書面によるインフォームドコンセントを得た後、５１家系から９１名の罹患患者及び９名の非罹患家系メンバーを本研究に登録した。５１家系はすべて、常染色体優性遺伝に合致する多発家系であった。患者は、良性臨床経過を伴うミオクローヌス振戦及び／又はてんかんを示した。神経変性疾患が示唆される孤発性疾患又は明らかな進行性疾患を有する患者は除外した。研究は、東京大学、新潟大学、及び他の参加施設の施設内審査委員会により承認された。ゲノムＤＮＡは、標準的手順を用いて末梢血白血球、ＬＣＬ、又は剖検組織から抽出した。死亡原因を図３１に示す。
書面によるインフォームドコンセントを得た後、５１家系から９１名の罹患患者及び９名の非罹患家系メンバーを本研究に登録した。５１家系はすべて、常染色体優性遺伝に合致する多発家系であった。患者は、良性臨床経過を伴うミオクローヌス振戦及び／又はてんかんを示した。神経変性疾患が示唆される孤発性疾患又は明らかな進行性疾患を有する患者は除外した。研究は、東京大学、新潟大学、及び他の参加施設の施設内審査委員会により承認された。ゲノムＤＮＡは、標準的手順を用いて末梢血白血球、ＬＣＬ、又は剖検組織から抽出した。死亡原因を図３１に示す。
【0049】
[0049] （実施例２：ＳＮＰジェノタイピング）
製造業者の説明書に従ってGenome-Wide Human SNPアレイ6.0（Affymetrix）を用いてＳＮＰジェノタイピングを行った。Genotyping Console 3.0.2（Affymetrix）を用いてＳＮＰをコールし抽出した。対照サンプルのハーディー・ワインベルグ検定で＞０．０５のｐ値、＞０．９８のコール率、及び＞０．０５のマイナー対立遺伝子頻度を有するＳＮＰのみをさらなる解析に使用した。
製造業者の説明書に従ってGenome-Wide Human SNPアレイ6.0（Affymetrix）を用いてＳＮＰジェノタイピングを行った。Genotyping Console 3.0.2（Affymetrix）を用いてＳＮＰをコールし抽出した。対照サンプルのハーディー・ワインベルグ検定で＞０．０５のｐ値、＞０．９８のコール率、及び＞０．０５のマイナー対立遺伝子頻度を有するＳＮＰのみをさらなる解析に使用した。
【0050】
[0050] （実施例３：ゲノムワイド連鎖研究）
完全浸透度を有する常染色体優性モデルによりマーカー間距離８０ｋｂ～１２０ｋｂでパイプラインソフトウェアSNP-HiTLink及びAllegroバージョン２を用いてゲノムワイド連鎖研究を実施した。疾患対立遺伝子頻度を１０-6に設定した。Allegroを用いてハプロタイプを再構築した。罹患者からのゲノムＤＮＡサンプルのPacBio RSII及びドロップレットディジタルＰＣＲ解析を用いたＢＡＣクローンの配列解析により同定されたＳＮＰもまた、ハプロタイプ再構築に使用した。
完全浸透度を有する常染色体優性モデルによりマーカー間距離８０ｋｂ～１２０ｋｂでパイプラインソフトウェアSNP-HiTLink及びAllegroバージョン２を用いてゲノムワイド連鎖研究を実施した。疾患対立遺伝子頻度を１０-6に設定した。Allegroを用いてハプロタイプを再構築した。罹患者からのゲノムＤＮＡサンプルのPacBio RSII及びドロップレットディジタルＰＣＲ解析を用いたＢＡＣクローンの配列解析により同定されたＳＮＰもまた、ハプロタイプ再構築に使用した。
【0051】
[0051] （実施例４：マイクロサテライトタイピング）
図２４に示されるプライマー対、ABI PRISM 3130xl又は3730シーケンサー（Life Technologies）、及びGeneScanソフトウェア（Life Technologies）を用いてマイクロサテライトマーカーをタイピングした。組換え事象を最小限に抑えるようにハプロタイプを手動で再構築した。
図２４に示されるプライマー対、ABI PRISM 3130xl又は3730シーケンサー（Life Technologies）、及びGeneScanソフトウェア（Life Technologies）を用いてマイクロサテライトマーカーをタイピングした。組換え事象を最小限に抑えるようにハプロタイプを手動で再構築した。
【0052】
[0052] （実施例５：全ゲノム配列解析）
製造業者の説明書に従ってHiSeq2000又はHiSeq2500（Illumina、１００、１０１、又は１５０ｂｐペアエンド）を用いて患者又は対照の全ゲノム配列解析を実施した。デフォルトパラメーターでBWA（v0.5.9）を用いてショートリードをNCBI37/hg19にアライメントした。マルチアライメントリード又はデュプリケートリードを除去し、SAMtools（v0.1.12）mpileupコマンドを用いて変異体をコールした。RefSeq（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/RefSeq/）、dbSNP134（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）、1000 genomesデータベース（http://www.1000genomes.org/）、及びExACデータベース（http://exac.broadinstitute.org/）を用いて変異体をアノテートした。
製造業者の説明書に従ってHiSeq2000又はHiSeq2500（Illumina、１００、１０１、又は１５０ｂｐペアエンド）を用いて患者又は対照の全ゲノム配列解析を実施した。デフォルトパラメーターでBWA（v0.5.9）を用いてショートリードをNCBI37/hg19にアライメントした。マルチアライメントリード又はデュプリケートリードを除去し、SAMtools（v0.1.12）mpileupコマンドを用いて変異体をコールした。RefSeq（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/RefSeq/）、dbSNP134（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）、1000 genomesデータベース（http://www.1000genomes.org/）、及びExACデータベース（http://exac.broadinstitute.org/）を用いて変異体をアノテートした。
【0053】
[0053] （実施例６：リピートプライムＰＣＲ解析）
図２５に示されるプライマーを用いてリピートプライムＰＣＲ解析を実施した。ABI PRISM 3130xl又は3730のシーケンサー（Life Technologies）を用いてフラグメント解析を実施した。
図２５に示されるプライマーを用いてリピートプライムＰＣＲ解析を実施した。ABI PRISM 3130xl又は3730のシーケンサー（Life Technologies）を用いてフラグメント解析を実施した。
【0054】
[0054] （実施例７：サザンブロット解析）
１０μｇのゲノミックＤＮＡを制限酵素で消化してから、０．８％アガロースゲル中で電気泳動した。分離されたＤＮＡ断片をキャピラリーブロッティングにより正荷電ナイロンメンブレン（Roche Applied Science）に移し、紫外光に暴露して架橋させた。プラスミド中にクローン化されたゲノム断片のＰＣＲ増幅によりジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブを作製した（プライマー対及び制限酵素は図２９に示される）。反復配列を回避するようにプローブを設計し、且つＰＣＲによる標識反応でジゴキシゲニンの取込みを最適化するように＜６００ｂｐ及び６００～１，５００ｂｐのサイズ範囲に対してＤＩＧ－ｄＵＴＰ：ｄＴＴＰの比をそれぞれ０．７：１．３及び０．３５：１．６５に調整した。サザンブロット解析でプローブの高感度を達成するために複数のプローブの組合せを利用した。ＤＩＧ標識（ＴＧＡＡＡ）9は、Eurofins Genomicsから購入した。プレハイブリダイゼーション後、Rocheのプロトコルを用いて４２℃でハイブリダイゼーションを一晩行った。最後に、ＰＣＲ増幅により作製されたプローブに対して６５℃及びＤＩＧ標識（ＴＧＡＡＡ）9オリゴヌクレオチドプローブに対して６０℃の０．５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中でメンブレンを毎回１５分間にわたり２回洗浄した。抗ＤＩＧ－ＡＰ抗体、Ｆａｂフラグメント（Roche）、CDP-star（Roche）、及びLAS3000mini（富士フイルム）を用いてプローブを検出した。
１０μｇのゲノミックＤＮＡを制限酵素で消化してから、０．８％アガロースゲル中で電気泳動した。分離されたＤＮＡ断片をキャピラリーブロッティングにより正荷電ナイロンメンブレン（Roche Applied Science）に移し、紫外光に暴露して架橋させた。プラスミド中にクローン化されたゲノム断片のＰＣＲ増幅によりジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識プローブを作製した（プライマー対及び制限酵素は図２９に示される）。反復配列を回避するようにプローブを設計し、且つＰＣＲによる標識反応でジゴキシゲニンの取込みを最適化するように＜６００ｂｐ及び６００～１，５００ｂｐのサイズ範囲に対してＤＩＧ－ｄＵＴＰ：ｄＴＴＰの比をそれぞれ０．７：１．３及び０．３５：１．６５に調整した。サザンブロット解析でプローブの高感度を達成するために複数のプローブの組合せを利用した。ＤＩＧ標識（ＴＧＡＡＡ）9は、Eurofins Genomicsから購入した。プレハイブリダイゼーション後、Rocheのプロトコルを用いて４２℃でハイブリダイゼーションを一晩行った。最後に、ＰＣＲ増幅により作製されたプローブに対して６５℃及びＤＩＧ標識（ＴＧＡＡＡ）9オリゴヌクレオチドプローブに対して６０℃の０．５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中でメンブレンを毎回１５分間にわたり２回洗浄した。抗ＤＩＧ－ＡＰ抗体、Ｆａｂフラグメント（Roche）、CDP-star（Roche）、及びLAS3000mini（富士フイルム）を用いてプローブを検出した。
【0055】
[0055] （実施例８：ＢＡＣライブラリーの構築物、伸長リピートを有するゲノムＤＮＡ断片を含有するクローンの単離、及びPacBio RSIIによる単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング）
２名の患者（ＳＡＭＤ１２中にリピート構成１を保有するＦ６９０６のＩＩ－６及びＳＡＭＤ１２中にリピート構成２を保有するＦ６１１５のＩＩ－１）に由来するリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）から構築されたＢＡＣライブラリーから、リピート伸長を含有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを単離した。簡潔に述べると、ＳａｃＩによる部分消化後、ゲノムＤＮＡ断片をｐＫＳ１４５ベクター中にライゲートした。標準的ＢＡＣライブラリー構築／スクリーニング手順とは異なり、リピート領域の周りのユニーク配列に対するプライマー対（図３０）を用いて、直接ＰＣＲ増幅の繰返しにより、アレイ化せずに、元のトランスフェクタントのプールから候補クローンを直接単離した。最後に、リピートプライムＰＣＲ解析により、Ｆ６９０６のＩＩ－６からの１つのクローン及びＦ６１１５のＩ－２からの２つのクローンがリピート伸長変異を有することを確認した。Ｐ４－Ｃ２化学を用いたPacific Biosciences RSIIシーケンサーにより３つのクローンをＳＭＲＴシーケンシングに付した。
２名の患者（ＳＡＭＤ１２中にリピート構成１を保有するＦ６９０６のＩＩ－６及びＳＡＭＤ１２中にリピート構成２を保有するＦ６１１５のＩＩ－１）に由来するリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）から構築されたＢＡＣライブラリーから、リピート伸長を含有する細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを単離した。簡潔に述べると、ＳａｃＩによる部分消化後、ゲノムＤＮＡ断片をｐＫＳ１４５ベクター中にライゲートした。標準的ＢＡＣライブラリー構築／スクリーニング手順とは異なり、リピート領域の周りのユニーク配列に対するプライマー対（図３０）を用いて、直接ＰＣＲ増幅の繰返しにより、アレイ化せずに、元のトランスフェクタントのプールから候補クローンを直接単離した。最後に、リピートプライムＰＣＲ解析により、Ｆ６９０６のＩＩ－６からの１つのクローン及びＦ６１１５のＩ－２からの２つのクローンがリピート伸長変異を有することを確認した。Ｐ４－Ｃ２化学を用いたPacific Biosciences RSIIシーケンサーにより３つのクローンをＳＭＲＴシーケンシングに付した。
【0056】
[0056] （実施例９：MinIONシーケンサーを利用した全ゲノム配列解析）
R9.4及びR9.5フローセルを備えたMinIONシーケンサー（Oxford Nanopore Technologies）を用いて全ゲノム配列解析を実施した。NGM-LRを用いて参照ゲノムｈｇ１９へのアライメントを実施した。miniasmアセンブラーを用いてＳＡＭＤ１２中のリピート伸長変異を有するリードのコンティグへのアセンブリーを行った。ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡモチーフの数をカウントするためにTandem Repeat Finder（バージョン４．０９）を使用された。
R9.4及びR9.5フローセルを備えたMinIONシーケンサー（Oxford Nanopore Technologies）を用いて全ゲノム配列解析を実施した。NGM-LRを用いて参照ゲノムｈｇ１９へのアライメントを実施した。miniasmアセンブラーを用いてＳＡＭＤ１２中のリピート伸長変異を有するリードのコンティグへのアセンブリーを行った。ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡモチーフの数をカウントするためにTandem Repeat Finder（バージョン４．０９）を使用された。
【0057】
[0057] （実施例１０：GemCode技術を用いたハプロタイプ解析）
Ｆ６９０６及びＦ６１１５にファウンダー染色体が存在するかを解明するために、Ｆ６９０６とＦ６１１５との間で疾患ハプロタイプを比較した。Ｆ６１１５のＩ－２では、２つのＢＡＣクローンが得られた。一方のクローンは、リピート伸長のセントロメア側の１１８ｋｂ領域をカバーし、且つ他方のクローンは、リピートのテロメア側の８９ｋｂ領域をカバーする。これに対して、Ｆ６９０６のＩＩ－６では、リピート伸長及び伸長リピート配列のセントロメア側の１００ｋｂ領域をカバーする単一のＢＡＣクローンのみが得られた。Ｆ６９０６のテロメア側領域の疾患ハプロタイプを決定するために、Gemcode技術（10X Genomics）を使用した。GemCodeゲルビーズ及びライブラリーキット（10X Genomics）を用いてバーコード付きライブラリーを作製した後、HiSeq2500の３レーンを用いて（１００ｂｐ、ペアエンド）シーケンシングを実施し、結合されたリードを生成した。Long Rangerパイプラインv2.1.2（10X Genomics）を用いて、バーコード付きライブラリーのショートリードデータをプレコールされた変異データ（ｖｃｆファイル）と共に解析した。Loupeソフトウェアv2.1.1（10X Genomics）を用いて、フェージングされたハプロタイプを可視化した。
Ｆ６９０６及びＦ６１１５にファウンダー染色体が存在するかを解明するために、Ｆ６９０６とＦ６１１５との間で疾患ハプロタイプを比較した。Ｆ６１１５のＩ－２では、２つのＢＡＣクローンが得られた。一方のクローンは、リピート伸長のセントロメア側の１１８ｋｂ領域をカバーし、且つ他方のクローンは、リピートのテロメア側の８９ｋｂ領域をカバーする。これに対して、Ｆ６９０６のＩＩ－６では、リピート伸長及び伸長リピート配列のセントロメア側の１００ｋｂ領域をカバーする単一のＢＡＣクローンのみが得られた。Ｆ６９０６のテロメア側領域の疾患ハプロタイプを決定するために、Gemcode技術（10X Genomics）を使用した。GemCodeゲルビーズ及びライブラリーキット（10X Genomics）を用いてバーコード付きライブラリーを作製した後、HiSeq2500の３レーンを用いて（１００ｂｐ、ペアエンド）シーケンシングを実施し、結合されたリードを生成した。Long Rangerパイプラインv2.1.2（10X Genomics）を用いて、バーコード付きライブラリーのショートリードデータをプレコールされた変異データ（ｖｃｆファイル）と共に解析した。Loupeソフトウェアv2.1.1（10X Genomics）を用いて、フェージングされたハプロタイプを可視化した。
【0058】
[0058] （実施例１１：神経病理学的検査）
４つのファミリーからの６名のＢＡＦＭＥ１患者（図９及び図３１に示されるように、１名のホモ接合患者：Ｆ８１４０のＶ－３、並びに５名のヘテロ接合患者：Ｆ８１３５のＩ－２及びＩＩ－３、Ｆ８１３６のＩＩ－５、並びにＦ８１３８のＩＩ－５及びＩＩ－７）の一般的な剖検を死後６時間以内に実施した。脳及び脊髄を２０％緩衝ホルマリンで固定し、複数の組織ブロックをパラフィンに包埋した。ヘマトキシリンとエオシン及びボディアンを含めていくつかの染色を用いて、厚さ４μｍのセクションで病理組織学的検査を実施した。カルビンジンプロテインＤ－２８ｋに対するマウスモノクローナル抗体でセクションを免疫染色した（ＣａＢＰ、Swant、１：５０）。色素原としてジアミノベンジジンを用いてHistofine Simple Stain MAX-POキット（Nichirei）によりペルオキシダーゼ－ポリマーベース法で結合抗体を可視化した。
４つのファミリーからの６名のＢＡＦＭＥ１患者（図９及び図３１に示されるように、１名のホモ接合患者：Ｆ８１４０のＶ－３、並びに５名のヘテロ接合患者：Ｆ８１３５のＩ－２及びＩＩ－３、Ｆ８１３６のＩＩ－５、並びにＦ８１３８のＩＩ－５及びＩＩ－７）の一般的な剖検を死後６時間以内に実施した。脳及び脊髄を２０％緩衝ホルマリンで固定し、複数の組織ブロックをパラフィンに包埋した。ヘマトキシリンとエオシン及びボディアンを含めていくつかの染色を用いて、厚さ４μｍのセクションで病理組織学的検査を実施した。カルビンジンプロテインＤ－２８ｋに対するマウスモノクローナル抗体でセクションを免疫染色した（ＣａＢＰ、Swant、１：５０）。色素原としてジアミノベンジジンを用いてHistofine Simple Stain MAX-POキット（Nichirei）によりペルオキシダーゼ－ポリマーベース法で結合抗体を可視化した。
【0059】
[0059] （実施例１２：ＲＮＡ ｆｏｃｉの検出のための蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）
６名の罹患患者（１名のホモ接合変異保有者及び５名のヘテロ接合変異保有者）並びに６名の対照被験者からのホルマリン固定パラフィン包埋脳組織を検査した。Ｃｙ３標識６０マーオリゴヌクレオチドプローブ（［ＴＧＡＡＡ］12、［ＴＴＴＣＡ］12、［ＴＡＡＡＡ］12、及び［ＴＡＡＡＡ］18）をEurofins Genomicsから購入した。Ventana XTシステム及びRiboMapキット（Roche）を用いて、脱パラフィン、固定（RiboPrep、３７℃で３０分間）、前処置（３７℃で１０分間）、プロテアーゼ処置（プロテアーゼ２［Roche］、３７℃で４分間）、ハイブリダイゼーション（１００ｐｍｏｌプローブ／スライド、３７℃で１２時間）、及び洗浄（２×RiboWashで３回、３７℃で６分間）を実施した。ＰＢＳ中１．２μＭのTOTO-3（Invitrogen）で核を３０分間対比染色した。自己蛍光シグナルを低減するために、７０％エタノール中０．１％スダンブラックＢで組織を５分間処置した。DAPI（VectaShield）を含む封入媒体を用いてスライドにカバースリップを載せ、共焦点レーザー顕微鏡法（Zeiss LSM510）により画像をキャプチャーした。
６名の罹患患者（１名のホモ接合変異保有者及び５名のヘテロ接合変異保有者）並びに６名の対照被験者からのホルマリン固定パラフィン包埋脳組織を検査した。Ｃｙ３標識６０マーオリゴヌクレオチドプローブ（［ＴＧＡＡＡ］12、［ＴＴＴＣＡ］12、［ＴＡＡＡＡ］12、及び［ＴＡＡＡＡ］18）をEurofins Genomicsから購入した。Ventana XTシステム及びRiboMapキット（Roche）を用いて、脱パラフィン、固定（RiboPrep、３７℃で３０分間）、前処置（３７℃で１０分間）、プロテアーゼ処置（プロテアーゼ２［Roche］、３７℃で４分間）、ハイブリダイゼーション（１００ｐｍｏｌプローブ／スライド、３７℃で１２時間）、及び洗浄（２×RiboWashで３回、３７℃で６分間）を実施した。ＰＢＳ中１．２μＭのTOTO-3（Invitrogen）で核を３０分間対比染色した。自己蛍光シグナルを低減するために、７０％エタノール中０．１％スダンブラックＢで組織を５分間処置した。DAPI（VectaShield）を含む封入媒体を用いてスライドにカバースリップを載せ、共焦点レーザー顕微鏡法（Zeiss LSM510）により画像をキャプチャーした。
【0060】
[0060] （実施例１３：ＲＮＡ－ｓｅｑ解析）
５名の罹患者及び７名の対照からの剖検脳（後頭葉）、３名の罹患者からの肝臓、並びに６名の罹患者及び２名の非罹患ファミリーメンバーからのＬＣＬから全ＲＮＡを抽出した。ＤＮアーゼ処置後、Ribo-Zero Gold（Epicentre）を用いてｒＲＮＡを枯渇させた。TruSeq RNAサンプル調製キットｖ２（Illumina）を用いてライブラリーを構築し、配列解析（１０１ｂｐペアエンド、HiSeq2000）に付した。TopHat2（v2.0.8b）を用いてショートリードを参照ゲノムNCBI37/hg19にアライメントした。シンプルモチーフが充填されたリードの同定のためにTRhistを使用した。差次的発現遺伝子の検出のために、TopHat v2.0.8bを用いてショートリードを参照ゲノム（ｈｇ１９）及びトランスクリプトーム配列（GENCODEバージョン１４、https://www.gencodegenes.org/）にアライメントした。デフォルト設定を用いてCufflinks, Cuffquant, and Cuffdiff（v2.2.1）により差次的発現遺伝子の転写物定量及び検出を実施した。ＳＡＭＤ１２中にＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長を有するＢＡＦＭＥ脳内の転写制御の異常を探究するために、４つのヘテロ接合ＢＡＦＭＥ１脳及び８つの対照脳（後頭葉）のＲＮＡ－ｓｅｑデータをトランスクリプトーム解析に付した。ＳＡＭＤ１２中にヘテロ接合変異を有する１つの脳からのＲＮＡサンプルは、バイオアナライザー（Agilent）により評価されたＲＩＮスコア（＜３）が低いため使用しなかった。
５名の罹患者及び７名の対照からの剖検脳（後頭葉）、３名の罹患者からの肝臓、並びに６名の罹患者及び２名の非罹患ファミリーメンバーからのＬＣＬから全ＲＮＡを抽出した。ＤＮアーゼ処置後、Ribo-Zero Gold（Epicentre）を用いてｒＲＮＡを枯渇させた。TruSeq RNAサンプル調製キットｖ２（Illumina）を用いてライブラリーを構築し、配列解析（１０１ｂｐペアエンド、HiSeq2000）に付した。TopHat2（v2.0.8b）を用いてショートリードを参照ゲノムNCBI37/hg19にアライメントした。シンプルモチーフが充填されたリードの同定のためにTRhistを使用した。差次的発現遺伝子の検出のために、TopHat v2.0.8bを用いてショートリードを参照ゲノム（ｈｇ１９）及びトランスクリプトーム配列（GENCODEバージョン１４、https://www.gencodegenes.org/）にアライメントした。デフォルト設定を用いてCufflinks, Cuffquant, and Cuffdiff（v2.2.1）により差次的発現遺伝子の転写物定量及び検出を実施した。ＳＡＭＤ１２中にＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長を有するＢＡＦＭＥ脳内の転写制御の異常を探究するために、４つのヘテロ接合ＢＡＦＭＥ１脳及び８つの対照脳（後頭葉）のＲＮＡ－ｓｅｑデータをトランスクリプトーム解析に付した。ＳＡＭＤ１２中にヘテロ接合変異を有する１つの脳からのＲＮＡサンプルは、バイオアナライザー（Agilent）により評価されたＲＩＮスコア（＜３）が低いため使用しなかった。
【0061】
[0061] （実施例１４：定量ＲＴ－ＰＣＲ解析によるＳＡＭＤ１２ ｍＲＮＡ発現レベルの決定）
オリゴｄＴプライマーと脳から抽出された０．４μｇの全ＲＮＡとを含有する１０μｌの全体積中でPrimeScript第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（タカラ）を用いてｃＤＮＡを合成した。製造業者のプロトコルに従ってPower SYBR Green PCRマスターミックス（Thermo Fisher Scientific）を用いて定量ＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲに使用したプライマーセットは図３２に列挙される。StepOne機器（Thermo Fisher Scientific）を用いて、次のように、すなわち、９５℃で１５秒間の変性と６５℃で５０秒間のアニーリング及び伸長とを含むサイクルを４０又は４５回行う２工程ＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡを増幅した。StepOneソフトウェアv2.1を用いて比較ＣＴ法によりデータを解析した。特定のＰＣＲ反応を確認するためにＰＣＲ産物もシーケンスした。
オリゴｄＴプライマーと脳から抽出された０．４μｇの全ＲＮＡとを含有する１０μｌの全体積中でPrimeScript第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（タカラ）を用いてｃＤＮＡを合成した。製造業者のプロトコルに従ってPower SYBR Green PCRマスターミックス（Thermo Fisher Scientific）を用いて定量ＰＣＲを実施した。ｑＰＣＲに使用したプライマーセットは図３２に列挙される。StepOne機器（Thermo Fisher Scientific）を用いて、次のように、すなわち、９５℃で１５秒間の変性と６５℃で５０秒間のアニーリング及び伸長とを含むサイクルを４０又は４５回行う２工程ＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡを増幅した。StepOneソフトウェアv2.1を用いて比較ＣＴ法によりデータを解析した。特定のＰＣＲ反応を確認するためにＰＣＲ産物もシーケンスした。
【0062】
[0062] （実施例１５：ウェスタンブロッティング）
ウェスタンブロット解析のために、ＳＡＭＤ１２中に伸長リピートを有する６名のＢＡＦＭＥ患者（１名のホモ接合患者及び５名のヘテロ接合患者）並びに５名の対照被験者の剖検脳組織サンプル（後頭葉）を切除し、１０体積の放射性免疫沈降アッセイ緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液）で溶解した。２－メルカプトエタノールを含有するLaemmliサンプル緩衝液を添加して８０℃で５分間煮沸した後、１５％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（E-T15S、日本のアトー）を用いて６０μｇの全タンパク質を分離し、続いてＰＶＤＦメンブレン（Merck KGaA）上にエレクトロブロッティングした。EZblockCAS（アトー）で４５分間ブロッキングした後、一次抗体（１：６０００希釈の抗ヒトＳＡＭＤ１２ウサギ抗体（ab121831、Abcam）及び１：１０００希釈の抗ヒトβ－アクチンマウス抗体（C-4、Santa-Cruz））と共にメンブレンを４℃で一晩インキュベートした。一次抗体と共にインキュベートした後、メンブレンを２０分間洗浄し、次いでＨＲＰ結合二次抗体（１：５０００希釈の抗マウスＩｇＧ抗体（NA931、GE healthcare）又は１：５０００希釈の抗ウサギＩｇＧ抗体（NA934、GE healthcare）と共に室温で１時間インキュベートした。０．０５％Tween 20（TBS-T）を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中でメンブレンを１５０分間洗浄し、続いてイ－ジ－ウエストルミプラス（アトー）で可視化した。ＳＡＭＤ１２バンドのシグナルを内部対照としてのβ－アクチンバンドに対応するものに規格化した。デンシトメトリーソフトウェア（ImageJ ver1.51k）を用いてシグナルを定量した。
ウェスタンブロット解析のために、ＳＡＭＤ１２中に伸長リピートを有する６名のＢＡＦＭＥ患者（１名のホモ接合患者及び５名のヘテロ接合患者）並びに５名の対照被験者の剖検脳組織サンプル（後頭葉）を切除し、１０体積の放射性免疫沈降アッセイ緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液）で溶解した。２－メルカプトエタノールを含有するLaemmliサンプル緩衝液を添加して８０℃で５分間煮沸した後、１５％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（E-T15S、日本のアトー）を用いて６０μｇの全タンパク質を分離し、続いてＰＶＤＦメンブレン（Merck KGaA）上にエレクトロブロッティングした。EZblockCAS（アトー）で４５分間ブロッキングした後、一次抗体（１：６０００希釈の抗ヒトＳＡＭＤ１２ウサギ抗体（ab121831、Abcam）及び１：１０００希釈の抗ヒトβ－アクチンマウス抗体（C-4、Santa-Cruz））と共にメンブレンを４℃で一晩インキュベートした。一次抗体と共にインキュベートした後、メンブレンを２０分間洗浄し、次いでＨＲＰ結合二次抗体（１：５０００希釈の抗マウスＩｇＧ抗体（NA931、GE healthcare）又は１：５０００希釈の抗ウサギＩｇＧ抗体（NA934、GE healthcare）と共に室温で１時間インキュベートした。０．０５％Tween 20（TBS-T）を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中でメンブレンを１５０分間洗浄し、続いてイ－ジ－ウエストルミプラス（アトー）で可視化した。ＳＡＭＤ１２バンドのシグナルを内部対照としてのβ－アクチンバンドに対応するものに規格化した。デンシトメトリーソフトウェア（ImageJ ver1.51k）を用いてシグナルを定量した。
【0063】
[0063] （実施例１６：リピート配列の検索）
全ゲノム配列解析及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析のために、TRhistプログラムを用いてリピート配列を保有するショートリード配列をカウントした。ミスマッチのない１３塩基以下のリピートモチーフで完全充填されたリードのみをカウントした。図２７では、１５０ｂｐペアエンドリードを用いて全ゲノム配列解析が実施された４名のＢＡＦＭＥ患者及び７名の対照被験者が列挙されている。１１名の被験者すべてで９リード未満が観測されたリピートモチーフは省略した。
全ゲノム配列解析及びＲＮＡ－ｓｅｑ解析のために、TRhistプログラムを用いてリピート配列を保有するショートリード配列をカウントした。ミスマッチのない１３塩基以下のリピートモチーフで完全充填されたリードのみをカウントした。図２７では、１５０ｂｐペアエンドリードを用いて全ゲノム配列解析が実施された４名のＢＡＦＭＥ患者及び７名の対照被験者が列挙されている。１１名の被験者すべてで９リード未満が観測されたリピートモチーフは省略した。
【0064】
[0064] （実施例１７：統計解析）
リピート長とてんかん又はミオクローヌス振戦の発症年齢とのピアソン相関係数及び両側検定のｐ値を計算した（図４ａ）。ウィルコクソンの順位和検定を用いて母系伝達対父系伝達におけるリピート長の変化を比較した（図１４）。ウィルコクソンの順位和検定を用いてＲＮＡ－ｓｅｑデータの領域１及び２のリードカバレッジ比を比較した（図１６ｄ）。両側スチューデントのｔ検定を用いてＳＡＭＤ１２転写物１対ＲＰＬ１３Ａの相対発現を比較した（図１６ｆ）。等分散を確認した後、両側スチューデントのｔ検定を用いてウェスタンブロット解析の結果の統計解析を実施した（図１７）。０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。
リピート長とてんかん又はミオクローヌス振戦の発症年齢とのピアソン相関係数及び両側検定のｐ値を計算した（図４ａ）。ウィルコクソンの順位和検定を用いて母系伝達対父系伝達におけるリピート長の変化を比較した（図１４）。ウィルコクソンの順位和検定を用いてＲＮＡ－ｓｅｑデータの領域１及び２のリードカバレッジ比を比較した（図１６ｄ）。両側スチューデントのｔ検定を用いてＳＡＭＤ１２転写物１対ＲＰＬ１３Ａの相対発現を比較した（図１６ｆ）。等分散を確認した後、両側スチューデントのｔ検定を用いてウェスタンブロット解析の結果の統計解析を実施した（図１７）。０．０５未満のｐ値を有意であるとみなした。
【0065】
[0065] （実施例１８：ペンタヌクレオチドリピート伸長の同定）
３０Ｍｂを包含する８ｑ２２．１～８ｑ２４．１３において３．１の累積多点ロッドスコアを有する単一ピークが連鎖解析により示されたことから、従来の研究が確認された（図１ａ及び図１ｂ及び図２１）。ハプロタイプ解析（図１ａ及び図２１）により６ファミリーすべてに共有されるコアハプロタイプ（ｒｓ２３２５９４５－ｒｓ７４６４６５９－ｒｓ６９９４２７０－ｒｓ９６４３１２４－ｒｓ４８７６８２８－ｒｓ２５１４９９１）が示された（図１ｃ）。Ｄ８Ｓ０３７９ｉとｒｓ４８７６８３３とにより区切られた領域は、ＳＡＭＤ１２（ステライルαモチーフドメイン含有１２）のエクソン４とフランキングイントロン部分とのみを含有する（図１ｄ）。
３０Ｍｂを包含する８ｑ２２．１～８ｑ２４．１３において３．１の累積多点ロッドスコアを有する単一ピークが連鎖解析により示されたことから、従来の研究が確認された（図１ａ及び図１ｂ及び図２１）。ハプロタイプ解析（図１ａ及び図２１）により６ファミリーすべてに共有されるコアハプロタイプ（ｒｓ２３２５９４５－ｒｓ７４６４６５９－ｒｓ６９９４２７０－ｒｓ９６４３１２４－ｒｓ４８７６８２８－ｒｓ２５１４９９１）が示された（図１ｃ）。Ｄ８Ｓ０３７９ｉとｒｓ４８７６８３３とにより区切られた領域は、ＳＡＭＤ１２（ステライルαモチーフドメイン含有１２）のエクソン４とフランキングイントロン部分とのみを含有する（図１ｄ）。
【0066】
[0066] 患者（Ｆ６９０６のＩＩ－６）の全ゲノム配列解析によりエクソン４に非同義変異は示されなかった。本発明者らは、ＳＡＭＤ１２のイントロン４に位置するＴＴＴＴＡペンタヌクレオチドリピートに注目した。参照ゲノム中のそのリピート構成は、転写ストランド中の（ＴＴＴＴＡ）7（ＴＴＡ）（ＴＴＴＴＡ）13である。家系の３名のリピート長は、一見、メンデル遺伝に合致しないので（図２ａ）、罹患した父親及び子孫の疾患対立遺伝子は、ＰＣＲにより増幅されなかった可能性がある。興味深いことに、ＳＡＭＤ１２のイントロン４のユニーク配列にアライメントされたリードを一方に有する患者からのペアリードを検査することにより、本発明者らは、参照ゲノムに存在しない「追加」のＴＴＴＣＡリピート配列を見いだした（図２ｂ）。さらに、本発明者らは、罹患者（Ｆ８１３５のＩＩ－３及びＦ６９０６のＩＩ－６）の追加のＴＴＴＣＡリピート伸長の上流にＴＴＴＴＡリピート伸長の存在を表す配列を観測した（図７）。こうした知見に基づいて、本発明者らは、伸長リピートの構造を仮定し（図２ｃ）、ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピートを標的とするリピートプライムＰＣＲ（ＲＰ－ＰＣＲ）解析用のプライマーセットを設計した（図２５）。実際に、ＲＰ－ＰＣＲ解析により、Ｆ６９０６のＩＩ－６における伸長ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピートを含有するこの仮定されたリピート構成に合致するＰＣＲ産物が実証された（図２ｄ）。サザンブロット解析（図８ａ）により、伸長対立遺伝子の存在がさらに確認された（図２ｅ）。
【0067】
【表1】
【0068】
[0067] ５１家系からの患者に対してＳＡＭＤ１２中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピートを標的とするＲＰ－ＰＣＲ解析を実施したところ、３家系（Ｆ６１１５、Ｆ９２８３、及びＦ８２４１）を除く４８家系（図９）からの８２名の患者で両方のリピート伸長の存在が確認された。
【0069】
[0068] ＳＡＭＤ１２中のＴＴＴＣＡリピートを標的とするＲＰ－ＰＣＲにより解析されたＴＴＴＣＡリピート伸長は、１，０００名の対照被験者では観察されなかった。これとは対照的に、ＳＡＭＤ１２中のＴＴＴＴＡリピートを標的とするＲＰ－ＰＣＲ解析では、対照被験者の５．９％（５９名／１，０００名）はＴＴＴＴＡリピートの伸長を有することが示された。リピートにフランキングするプライマーを利用したＰＣＲベース解析に基づいて、ＴＴＴＴＡリピート伸長のサイズは、２８名の対照被験者における１００～３００ＴＴＴＴＡリピート単位に対応する約０．５～１．５ｋｂであった。しかしながら、３１名の対照被験者（３．１％）ではＰＣＲ増幅に失敗したことから、かなり大きなＴＴＴＴＡ伸長が少ない割合の対照被験者に存在することが示唆される。
【0070】
[0069] 注目すべきこととして、Ｆ６１１５の３名の患者（Ｉ－２、ＩＩ－１、及びＩＩ－２）は、ＴＴＴＣＡリピートを標的とするＲＰ－ＰＣＲ解析により決定したとき、リピート伸長を示さなかったが、ＴＴＴＴＡリピートを標的とするＲＰ－ＰＣＲ解析により決定したときのみ、リピート伸長を示した（図２ｄ）。しかしながら、リピート近傍のユニークプローブ（１ａ及び１ｂ、図８ａ）又はジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9オリゴヌクレオチドプローブを用いたサザンブロット解析では、伸長対立遺伝子が罹患者に存在し、且つＴＴＴＣＡリピート伸長が伸長対立遺伝子内に含まれることが示唆された（図２ｆ）。残りの２ファミリー（Ｆ９２８３及びＦ８２４１）ではＳＡＭＤ１２中の伸長ＴＴＴＣＡリピートも伸長ＴＴＴＴＡリピートも見いだされなかった。
【0071】
[0070] （実施例１９：単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシングにより決定された伸長リピートの構造）
伸長リピート構成をさらに明確化するために、本発明者らは、２名の患者（Ｆ６９０６のＩＩ－６及びＦ６１１５のＩ－２）から変異対立遺伝子を細菌人工染色体（ＢＡＣ）中にクローニングした。ＢＡＣクローンの全ヌクレオチド配列は、Pacific Biosciences RSIIシーケンサーを利用してＳＭＲＴシーケンシングにより決定した。
伸長リピート構成をさらに明確化するために、本発明者らは、２名の患者（Ｆ６９０６のＩＩ－６及びＦ６１１５のＩ－２）から変異対立遺伝子を細菌人工染色体（ＢＡＣ）中にクローニングした。ＢＡＣクローンの全ヌクレオチド配列は、Pacific Biosciences RSIIシーケンサーを利用してＳＭＲＴシーケンシングにより決定した。
【0072】
[0071] Ｆ６９０６の患者ＩＩ－６からのＢＡＣクローンの配列解析により、ＴＴＴＣＡリピート伸長はＴＴＴＴＡリピート伸長の下流に位置することが示された（リピート構成１、図３ａ）。
【0073】
[0072] 他の１名の患者（Ｆ６１１５のＩ－２）からのＢＡＣクローンのＳＭＲＴシーケンシングにより、２つのＴＴＴＴＡリピート伸長間のＴＴＴＣＡリピート伸長が実際に示された（リピート構成２、図３ａ及び図３ｂ）。ＴＴＴＣＡリピートを標的とするＲＰ－ＰＣＲ解析の失敗（図２ｄ）は、ＴＴＴＣＡリピートとプライマーＰ３との間の距離が長いことに起因すると結論付けられた。
【0074】
[0073] ＳＮＰタイピング、ＳＭＲＴシーケンシング、及び10×GemCode技術（10X Genomics）を利用したハプロタイプ解析により、Ｆ６９０６（リピート構成１）及びＦ６１１５（リピート構成２）の疾患ハプロタイプに見いだされた変異体はすべて、リピート伸長変異を除く１１１．７ｋｂ領域で完全にマッチしたことから、２つのハプロタイプの共通の創始者の可能性が示された（図１０）。
【0075】
[0074] （実施例２０：ナノポアシーケンシングにより決定された伸長リピートの構造）
ＢＡＣクローンのＳＭＲＴシーケンシングにより決定された伸長リピートのサイズ（Ｆ６９０６のＩＩ－６の０．９４ｋｂ及びＦ６１１５のＩ－２の１．０ｋｂ）は、サザンブロット解析により決定されたもの（Ｆ６９０６のＩＩ－６の５．９ｋｂ及びＦ６１１５のＩ－２の３．９ｋｂ）よりも短かったことから、ＢＡＣクローニング時の伸長リピートの短縮が示唆されたので、本発明者らは、MinIONシーケンサー（Oxford Nanopore Technologies）を利用して、Ｆ６９０６のＩＩ－６及びＦ６１１５のＩＩ－１の末梢血白血球から抽出された２つのゲノムＤＮＡをさらにシーケンスした。我々は、伸長リピートの周辺のゲノム配列にマップされたリードを収集し、miniasm assembler 14を用いてリピート伸長を有するものをコンティグにアセンブルした（図１１）。本発明者らは、ナノポアシーケンシングのエラーリード及び／又は伸長リピートの体細胞不安定性を反映する思われるリピート長のかなり大きな変動を見いだしたが、本発明者らは、ＩＩ－６（Ｆ６９０６）及びＩＩ－１（Ｆ６１１５）の各々で１Ｄ2シーケンシングキット（Oxford Nanopore Technologies）を用いて同一のＤＮＡ断片のプラス鎖及びマイナス鎖に由来する一対の２つのリードを見いだした。本発明者らは、対向鎖の配列情報を用いることにより１つの鎖におけるエラーを部分修正することが可能であったため、２つのサンプルで変異対立遺伝子の配列を生成した（図１２）。次いで、本発明者らは、Tandem Repeat Finderを用いてリピート伸長を２つのモチーフに分割しＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡモチーフの数をカウントした。伸長リピートは、解析により（ＴＴＴＴＡ）598（ＴＴＴＣＡ）458（Ｆ６９０６のＩＩ－６）及び（ＴＴＴＴＡ）221（ＴＴＴＣＡ）225（ＴＴＴＴＡ）81（Ｆ６１１５のＩＩ－１）（図１２ｂ及び図１２ｅ）として推定された。
ＢＡＣクローンのＳＭＲＴシーケンシングにより決定された伸長リピートのサイズ（Ｆ６９０６のＩＩ－６の０．９４ｋｂ及びＦ６１１５のＩ－２の１．０ｋｂ）は、サザンブロット解析により決定されたもの（Ｆ６９０６のＩＩ－６の５．９ｋｂ及びＦ６１１５のＩ－２の３．９ｋｂ）よりも短かったことから、ＢＡＣクローニング時の伸長リピートの短縮が示唆されたので、本発明者らは、MinIONシーケンサー（Oxford Nanopore Technologies）を利用して、Ｆ６９０６のＩＩ－６及びＦ６１１５のＩＩ－１の末梢血白血球から抽出された２つのゲノムＤＮＡをさらにシーケンスした。我々は、伸長リピートの周辺のゲノム配列にマップされたリードを収集し、miniasm assembler 14を用いてリピート伸長を有するものをコンティグにアセンブルした（図１１）。本発明者らは、ナノポアシーケンシングのエラーリード及び／又は伸長リピートの体細胞不安定性を反映する思われるリピート長のかなり大きな変動を見いだしたが、本発明者らは、ＩＩ－６（Ｆ６９０６）及びＩＩ－１（Ｆ６１１５）の各々で１Ｄ2シーケンシングキット（Oxford Nanopore Technologies）を用いて同一のＤＮＡ断片のプラス鎖及びマイナス鎖に由来する一対の２つのリードを見いだした。本発明者らは、対向鎖の配列情報を用いることにより１つの鎖におけるエラーを部分修正することが可能であったため、２つのサンプルで変異対立遺伝子の配列を生成した（図１２）。次いで、本発明者らは、Tandem Repeat Finderを用いてリピート伸長を２つのモチーフに分割しＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡモチーフの数をカウントした。伸長リピートは、解析により（ＴＴＴＴＡ）598（ＴＴＴＣＡ）458（Ｆ６９０６のＩＩ－６）及び（ＴＴＴＴＡ）221（ＴＴＴＣＡ）225（ＴＴＴＴＡ）81（Ｆ６１１５のＩＩ－１）（図１２ｂ及び図１２ｅ）として推定された。
【0076】
[0075] （実施例２１：伸長リピートは体細胞不安定性を呈する）
伸長リピートの存在は、末梢血白血球、リンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）、又は剖検組織から抽出された４１家系からの７７名の患者のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット解析によりさらに確認された。ＳＡＭＤ１２中の伸長ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピートのサイズは、４４０～３，６８０リピート単位に対応する２．２～１８．４ｋｂの範囲内であると推定された。伸長リピートの長さは、同一個体からの末梢血白血球とＬＣＬとの間で類似していることから、これらの細胞では伸長リピートの安定性が示唆される（図１３ａ）。しかしながら、患者の脳、肝臓、及び腎臓を含む剖検組織の大多数では、広範なスミアパターンがサザンブロット解析により示されたことから（図１３ｂ～ｄ）、末梢血白血球又はＬＣＬと比較してこれらの組織では伸長されたリピートの体細胞不安定性が増加していることが示唆される。
伸長リピートの存在は、末梢血白血球、リンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）、又は剖検組織から抽出された４１家系からの７７名の患者のゲノムＤＮＡを用いてサザンブロット解析によりさらに確認された。ＳＡＭＤ１２中の伸長ＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピートのサイズは、４４０～３，６８０リピート単位に対応する２．２～１８．４ｋｂの範囲内であると推定された。伸長リピートの長さは、同一個体からの末梢血白血球とＬＣＬとの間で類似していることから、これらの細胞では伸長リピートの安定性が示唆される（図１３ａ）。しかしながら、患者の脳、肝臓、及び腎臓を含む剖検組織の大多数では、広範なスミアパターンがサザンブロット解析により示されたことから（図１３ｂ～ｄ）、末梢血白血球又はＬＣＬと比較してこれらの組織では伸長されたリピートの体細胞不安定性が増加していることが示唆される。
【0077】
[0076] （実施例２２：リピート長は癲癇の発症年齢に逆相関し且つ世代間不安定性を示す）
伸長リピートの長さとてんかんの発症年齢との間の相関を調べるために、末梢血白血球（ｎ＝５０）又はＬＣＬ（ｎ＝４）から抽出されたゲノミックＤＮＡのサザンブロット解析により、伸長リピートの長さを決定した。てんかんの発症年齢を入手可能であったヘテロ接合変異（リピート構成１）を有する５４名の患者では、伸長リピートの長さは、てんかんの発症年齢に逆相関した（図４ａ、ｒ＝－０．４７、ｐ＝３．５×１０－４）。同様に、リピート長はまた、ミオクローヌス振戦の発症年齢に逆相関した（ｒ＝－０．３４、ｐ＝０．０１３、ｎ＝５３、データは示されていない）。
伸長リピートの長さとてんかんの発症年齢との間の相関を調べるために、末梢血白血球（ｎ＝５０）又はＬＣＬ（ｎ＝４）から抽出されたゲノミックＤＮＡのサザンブロット解析により、伸長リピートの長さを決定した。てんかんの発症年齢を入手可能であったヘテロ接合変異（リピート構成１）を有する５４名の患者では、伸長リピートの長さは、てんかんの発症年齢に逆相関した（図４ａ、ｒ＝－０．４７、ｐ＝３．５×１０－４）。同様に、リピート長はまた、ミオクローヌス振戦の発症年齢に逆相関した（ｒ＝－０．３４、ｐ＝０．０１３、ｎ＝５３、データは示されていない）。
【0078】
[0077] 本発明者らは、ホモ接合伸長を有する４名の患者（Ｆ８１１５の１名の患者、Ｆ８１４０の２名の患者、及びＦ８３９８の１名の患者）を同定した。末梢白血球から得られた２つの対立遺伝子の平均リピート長（ｎ＝３）を考えると、それらのてんかんの発症年齢は、同様のサイズの伸長リピートを有するヘテロ接合患者よりも早くなる傾向があった（図４ａ）。ホモ接合変異を有する患者の一部では、脚にミオクローヌスも現れて６０歳代で歩行が障害され、且つ脳萎縮を伴う認知低下が観察され、ヘテロ接合変異を有する患者よりも重篤な臨床所見を示した。
【0079】
【0080】
[0079] （実施例２３：ＳＡＭＤ１２中にリピート伸長を有する患者の神経病理学的知見）
ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長（リピート構成１）を有する６名の患者の剖検脳で神経病理学的検査を行った。最も顕著な特徴は、ホモ接合変異を有する患者の小脳皮質で観察され、プルキンエ細胞の軽度なびまん性の消失及びいくつかのプルキンエ細胞の細胞質の周りのハロー様アモルファス物質が顕在化した（図５ａ及び図５ｂ）。この物質は、カルビンジンＤ－２８ｋに対して明らかに免疫陽性であった（図５ｃ）。残りのプルキンエ細胞のサブセットのこうした変性の特徴は、３１型脊髄小脳失調症（ＳＣＡ３１、ＭＩＭ１１７２１０）、ペンタヌクレオチドリピート伸長を有する疾患、及び両対立遺伝子ＴＢＣＤ変異（ＭＩＭ６１７１９３）に起因する早発性神経変性脳症を有する患者で観察される体細胞萌芽に類似していた。これに対して、ヘテロ接合変異を有する患者の小脳では、この特徴は顕在化しなかった（図５ｄ）。ヘテロ接合変異又はホモ接合変異のどちらを有する患者でも、他の脳領域では明らかな変化はなかった。
ＳＡＭＤ１２中のリピート伸長（リピート構成１）を有する６名の患者の剖検脳で神経病理学的検査を行った。最も顕著な特徴は、ホモ接合変異を有する患者の小脳皮質で観察され、プルキンエ細胞の軽度なびまん性の消失及びいくつかのプルキンエ細胞の細胞質の周りのハロー様アモルファス物質が顕在化した（図５ａ及び図５ｂ）。この物質は、カルビンジンＤ－２８ｋに対して明らかに免疫陽性であった（図５ｃ）。残りのプルキンエ細胞のサブセットのこうした変性の特徴は、３１型脊髄小脳失調症（ＳＣＡ３１、ＭＩＭ１１７２１０）、ペンタヌクレオチドリピート伸長を有する疾患、及び両対立遺伝子ＴＢＣＤ変異（ＭＩＭ６１７１９３）に起因する早発性神経変性脳症を有する患者で観察される体細胞萌芽に類似していた。これに対して、ヘテロ接合変異を有する患者の小脳では、この特徴は顕在化しなかった（図５ｄ）。ヘテロ接合変異又はホモ接合変異のどちらを有する患者でも、他の脳領域では明らかな変化はなかった。
【0081】
[0080] （実施例２４：ＲＮＡ ｆｏｃｉが神経細胞で観察される）
ＳＡＭＤ１２中に伸長リピートを有する患者の脳にＲＮＡ ｆｏｃｉが存在するかを決定するめに、Ｃｙ３標識（ＴＧＡＡＡ）12又は（ＴＴＴＣＡ）12オリゴヌクレオチドプローブを用いて６名の患者及び５名の対照からの剖検脳で蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。ＵＵＵＣＡリピートを標的とするＣｙ３－（ＴＧＡＡＡ）12プローブを使用したとき、ＲＮＡ ｆｏｃｉは、罹患脳では皮質神経細胞で明らかに観察され、且つそれほどでもないがプルキンエ細胞で観察されたが、ＲＮＡ ｆｏｃｉは、対照脳ではＣｙ３－（ＴＧＡＡＡ）12を用いて観察されなかった（図５ｅ及び図１５）。
ＳＡＭＤ１２中に伸長リピートを有する患者の脳にＲＮＡ ｆｏｃｉが存在するかを決定するめに、Ｃｙ３標識（ＴＧＡＡＡ）12又は（ＴＴＴＣＡ）12オリゴヌクレオチドプローブを用いて６名の患者及び５名の対照からの剖検脳で蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を行った。ＵＵＵＣＡリピートを標的とするＣｙ３－（ＴＧＡＡＡ）12プローブを使用したとき、ＲＮＡ ｆｏｃｉは、罹患脳では皮質神経細胞で明らかに観察され、且つそれほどでもないがプルキンエ細胞で観察されたが、ＲＮＡ ｆｏｃｉは、対照脳ではＣｙ３－（ＴＧＡＡＡ）12を用いて観察されなかった（図５ｅ及び図１５）。
【0082】
[0081] （実施例２５：脳内のグローバルトランスクリプトーム解析及び不発転写）
差次的に発現された８４種（ダウンレギュレートされた４０種及びアップレギュレートされた４４種）の遺伝子が剖検脳のＲＮＡ－ｓｅｑ解析により示されたが（図３３）、示差的にスプライシングされたいずれの転写物も検出されなかった。しかしながら、ＳＡＭＤ１２座位を調べることにより、本発明者らは、リピートの上流に位置する過剰のイントロンリードを見いだしたので、おそらく、伸長リピートにおける不発転写が原因であろう（図１６ａ、図１６ｄ、図１６ｅ）。かかる過剰のリード数は、ＬＣＬでも肝臓でも観察されなかった（図１６ｂ～ｄ）。
差次的に発現された８４種（ダウンレギュレートされた４０種及びアップレギュレートされた４４種）の遺伝子が剖検脳のＲＮＡ－ｓｅｑ解析により示されたが（図３３）、示差的にスプライシングされたいずれの転写物も検出されなかった。しかしながら、ＳＡＭＤ１２座位を調べることにより、本発明者らは、リピートの上流に位置する過剰のイントロンリードを見いだしたので、おそらく、伸長リピートにおける不発転写が原因であろう（図１６ａ、図１６ｄ、図１６ｅ）。かかる過剰のリード数は、ＬＣＬでも肝臓でも観察されなかった（図１６ｂ～ｄ）。
【0083】
[0082] （実施例２６：ＲＮＡ－ｓｅｑ解析は罹患脳への改変リピートモチーフの蓄積を示した）
特定のリピートモチーフが充填されたショートリードを本発明者らが検索したとき、本発明者らは、ＴＴＴＣＡリピート伸長を有するＳＡＭＤ１２の転写物に対応する、５’－ＴＴＴＣＡ又は５’－ＴＧＡＡＡリピートが充填されたショートリードを患者の脳内に排他的に見いだした（表２）。きわめて興味深いことに、５’－ＣＴＴＣＡ又は５’－ＴＧＡＡＧリピートが充填されたショートリード及び５’－ＧＴＴＣＡ又は５’－ＴＧＡＡＣリピートが充填されたものもまた、罹患脳内に見いだされたが、かかる配列は、患者からの肝臓（ｎ＝３）にもＬＣＬ（ｎ＝６）にも、対照被験者（図２６）からの脳（ｎ＝８）にもＬＣＬ（ｎ＝２）にも観察されなかった。こうした観察から、とくに罹患脳内の伸長リピートの改変リピートモチーフの存在が示唆される。
特定のリピートモチーフが充填されたショートリードを本発明者らが検索したとき、本発明者らは、ＴＴＴＣＡリピート伸長を有するＳＡＭＤ１２の転写物に対応する、５’－ＴＴＴＣＡ又は５’－ＴＧＡＡＡリピートが充填されたショートリードを患者の脳内に排他的に見いだした（表２）。きわめて興味深いことに、５’－ＣＴＴＣＡ又は５’－ＴＧＡＡＧリピートが充填されたショートリード及び５’－ＧＴＴＣＡ又は５’－ＴＧＡＡＣリピートが充填されたものもまた、罹患脳内に見いだされたが、かかる配列は、患者からの肝臓（ｎ＝３）にもＬＣＬ（ｎ＝６）にも、対照被験者（図２６）からの脳（ｎ＝８）にもＬＣＬ（ｎ＝２）にも観察されなかった。こうした観察から、とくに罹患脳内の伸長リピートの改変リピートモチーフの存在が示唆される。
【0084】
【表2】
【0085】
[0083] （実施例２７：脳内のＳＡＭＤ１２転写物及びＳＡＭＤ１２タンパク質の発現レベルの解析）
剖検脳内のＳＡＭＤ１２転写物の発現レベルを調べるために、定量逆転写ＰＣＲ解析を実施したところ、罹患脳内のＳＡＭＤ１２転写物１のレベルに有意な変化を示さなかった（図１６ｆ）。ＳＡＭＤ１２転写物２の厳密な定量は不発転写産物の存在下では困難であったことに留意されたい。しかしながら、ウェスタンブロット解析により、罹患脳内でわずかではあるがＳＡＭＤ１２タンパク質のレベルの有意な減少が示された（図１７）。
剖検脳内のＳＡＭＤ１２転写物の発現レベルを調べるために、定量逆転写ＰＣＲ解析を実施したところ、罹患脳内のＳＡＭＤ１２転写物１のレベルに有意な変化を示さなかった（図１６ｆ）。ＳＡＭＤ１２転写物２の厳密な定量は不発転写産物の存在下では困難であったことに留意されたい。しかしながら、ウェスタンブロット解析により、罹患脳内でわずかではあるがＳＡＭＤ１２タンパク質のレベルの有意な減少が示された（図１７）。
【0086】
[0084] （実施例２８：他のファミリーにおけるＴＮＲＣ６Ａ及びＲＡＰＧＥＦ２中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡペンタヌクレオチドリピート伸長）
以上に記載したように、ＳＡＭＤ１２中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡペンタヌクレオチドリピート伸長は、２つのファミリー（Ｆ９２８３及びＦ８２４１、図１８）では観測されなかったので、他の遺伝子中の類似のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長が病原性変異に関与するという仮説を立てた。全ゲノム配列解析（図２７）及びジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9プローブを用いたサザンブロット解析（図６ｃ及び図６ｆ）のデータを用いてリピートモチーフを検索したところ、２つのファミリー（Ｆ９２８３及びＦ８２４１）でも、それぞれ、ＴＮＲＣ６Ａ（トリヌクレオチドリピート含有遺伝子６Ａ）及びＲＡＰＧＥＦ２（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子２）に異常なＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長を有することが示された。
以上に記載したように、ＳＡＭＤ１２中のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡペンタヌクレオチドリピート伸長は、２つのファミリー（Ｆ９２８３及びＦ８２４１、図１８）では観測されなかったので、他の遺伝子中の類似のＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長が病原性変異に関与するという仮説を立てた。全ゲノム配列解析（図２７）及びジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9プローブを用いたサザンブロット解析（図６ｃ及び図６ｆ）のデータを用いてリピートモチーフを検索したところ、２つのファミリー（Ｆ９２８３及びＦ８２４１）でも、それぞれ、ＴＮＲＣ６Ａ（トリヌクレオチドリピート含有遺伝子６Ａ）及びＲＡＰＧＥＦ２（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子２）に異常なＴＴＴＣＡ及びＴＴＴＴＡリピート伸長を有することが示された。
【0087】
[0085] アライメントに基づいて、本発明者らは、伸長ＴＴＴＣＡリピートが、ＴＮＲＣ６Ａのエクソン１の上流非コード領域の（ＴＴＴＴＡ）22と伸長ＴＴＴＴＡリピートとの間に位置すると仮定した（図１９、図２０、及び図６ａ）。このことは、ＲＰ－ＰＣＲ（図６ｂ）及びリピート近傍のプローブを用いたサザンブロット解析（６ａ及び６ｂ、図８ｂ）又はジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9プローブ（図６ｃ）により確認された。伸長リピートの共分離は、Ｆ９２８３ファミリーの５名の罹患者及び１名の非罹患者でさらに確認された（図１８）。ＴＮＲＣ６Ａ中のＴＴＴＣＡリピート伸長は、１，０００名の対照被験者でもＳＡＭＤ１２中にリピート伸長を有する患者でも見いだされなかった。ＴＮＲＣ６Ａ中のＴＴＴＴＡリピートを標的とするＲＰ－ＰＣＲ解析では、対照被験者の０．９％（９／１，０００）はＴＴＴＴＡリピート伸長を有することが示された。リピートにフランキングするプライマーを利用したＰＣＲ解析では、伸長ＴＴＴＴＡリピートのサイズは７名の対照被験者で約０．２～０．６ｋｂの範囲内であることが示された。しかしながら、２名の対照被験者（０．２％）ではＰＣＲ増幅に失敗したことから、かなり大きなＴＴＴＴＡ伸長が非常に小さな割合の対照被験者に存在することが示唆される。
【0088】
[0086] Ｆ８２４１ファミリーでは、ＴＴＴＣＡリピート伸長は、ユニーク配列にアンカーされたペアリードを用いて染色体４ｑ３２．１上のＲＡＰＧＥＦ２のイントロン１４中に同様に同定された（図２２及び図６ｄ）。ＲＰ－ＰＣＲ（図６ｅ）並びにリピート近傍のプローブ（７ａ～ｄ、図８ｃ）及びジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9プローブを用いたサザンブロット解析（図６ｆ）では、非罹患母親には見いだされなかったＴＴＴＣＡリピート伸長の存在が罹患患者（ＩＩＩ－２）で確認された。プローブ７ａ～ｄを用いたサザンブロット解析では、非罹患兄弟姉妹で追加のバンドが示された（ＩＩＩ－１、図６ｆ）。しかしながら、ジゴキシゲニン標識（ＴＧＡＡＡ）9プローブを用いたサザンブロット解析では、ＩＩＩ－１のＴＴＴＣＡリピートの存在は除外された（図６ｆ）。ＰＣＲ増幅産物のより大きなサブクローン断片のサンガーシーケンシングでは（ＩＩＩ－１）、シンプルＴＴＴＴＡリピートのみが示された。興味深いことに、ハプロタイプ解析では、非罹患兄弟姉妹（ＩＩＩ－１）は、同様に振戦運動を示した父親から伝達された発端者のものと同一のハプロタイプを有することが示された（図２３ａ）。まとめると、ＴＴＴＴＡリピート間に位置する伸長ＴＴＴＣＡリピートは、伸長対立遺伝子が父親（ＩＩ－１）から子孫（ＩＩＩ－１）に伝達されるとき、欠失された（図２３ｂ）。こうした観察は、ＲＡＰＧＥＦ２中のＴＴＴＣＡリピート伸長の病原性をさらに支持する。ＲＡＰＧＥＦ２中のＴＴＴＣＡリピート伸長は、１，０００名の対照被験者でもＳＡＭＤ１２中にリピート伸長を有する患者でも見いだされなかった。ＲＡＰＧＥＦ２中のＴＴＴＴＡリピートを標的とするＲＰ－ＰＣＲ解析では、対照被験者の０．５％（５／１，０００）は伸長を有することが示された。ＰＣＲ解析では、伸長ＴＴＴＴＡリピートのサイズは３名の対照被験者で約０．３～３ｋｂの範囲内であることが示された。しかしながら、２名の対照被験者（０．２％）では伸長ＴＴＴＴＡリピートのＰＣＲ増幅に失敗されたことから、かなり大きなＴＴＴＴＡ伸長が非常に小さな割合の対照被験者に存在することが示唆される。
[0087] リピートプローブ
[0088] プローブ１ａ
[0089] プローブ１ｂ
[0090] プローブ６ａ
[0091] プローブ６ｂ
[0092] プローブ７ａ
[0093] プローブ７ｂ
[0094] プローブ７ｃ
[0095] プローブ７ｄ
[0087] リピートプローブ
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【0089】
[0096] ヌクレオチド位置はｈｇ３８に基づく。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図6E】
【図6F】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図12E】
【図12F】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図24】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【図27】
【図28A】
【図28B】
【図28C】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33A】
【図33B】
【図33C】
【配列表】