特許 7201971 人工骨、及び人工骨の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-12-27

(45)【発行日】2023-01-11

(54)【発明の名称】人工骨、及び人工骨の製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/10 20060101AFI20221228BHJP

   A61L 27/56 20060101ALI20221228BHJP

   A61L 27/30 20060101ALI20221228BHJP

【ＦＩ】

A61L27/10

A61L27/56

A61L27/30 100

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2020535774

(86)(22)【出願日】2019-08-05

(86)【国際出願番号】 JP2019030787

(87)【国際公開番号】W WO2020031988

(87)【国際公開日】2020-02-13

【審査請求日】2021-01-19

(31)【優先権主張番号】P 2018150717

(32)【優先日】2018-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度 国立研究開発法人科学技術振興機構 研究成果展開事業「プラズマ照射による多孔質人工骨表面高機能化処理技術の開発」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】504176911

【氏名又は名称】国立大学法人大阪大学

(73)【特許権者】

【識別番号】517363285

【氏名又は名称】株式会社ＡｉｍｅｄｉｃＭＭＴ

(74)【代理人】

【識別番号】110001379

【氏名又は名称】特許業務法人 大島特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】浜口 智志

(72)【発明者】

【氏名】出口 智子

(72)【発明者】

【氏名】▲杉▼本 敏司

(72)【発明者】

【氏名】海渡 貴司

(72)【発明者】

【氏名】吉川 秀樹

(72)【発明者】

【氏名】朝森 千永子

【審査官】横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】特開２００３－０３８６３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１２－０１２３２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１４－００４１６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】バイオマテリアル, 2017, Vol.35 No.2, p.98-105 (ISSN : 1347-71080)

【文献】Diamond Related Materials, 2012, Vol.22, p.128-135

【文献】溶射技術, 2018 Jan, Vol.37 No.3, p.32-36 (ISSN : 0289-422X)

【文献】高分子学会予稿集, 2007, Vol.56 No.1 Disk1, p.2117(2PD182)

【文献】プラズマ科学シンポジウム/プラズマプロセシング研究会プロシーディングス, 2008, Vol.25th, p.245-246

【文献】Journal of Photopolymer Science andTechnology, 2008, Vol.21 No.2, p.225-230

【文献】PLOS One, 2018 Mar, Vol.13 No.3, p.e0194303(p.1-18)

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｌ ２７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

互いに連通する複数の気孔（６）を備えた多孔質セラミックスを含む基材（２）と、
前記基材（２）の外面及び前記気孔（６）の壁面（７）に形成された炭素質薄膜（１０）と、
前記炭素質薄膜（１０）の表面及び内部に設けられたアミノ基（１２）を含む官能基（１３）とを有することを特徴とする人工骨（１）。

【請求項2】

前記炭素質薄膜（１０）はポリマー膜であることを特徴とする請求項１に記載の人工骨（１）。

【請求項3】

前記アミノ基（１２）を構成する原子には窒素が含まれ、
前記炭素質薄膜（１０）の表面及び内部における窒素の存在比は少なくとも３％以上であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の人工骨（１）。

【請求項4】

前記炭素質薄膜（１０）の表面及び内部における窒素の存在比は少なくとも１０％以上であることを特徴とする請求項３に記載の人工骨（１）。

【請求項5】

前記気孔（６）は直径の平均が５０μｍ以上６００μｍ以下の略球状をなし、
２つの前記気孔（６）を連通させる気孔間連通部（８）は直径の平均が５μｍ以上の略円形をなすことを特徴とする請求項１～請求項４のいずれか１つの項に記載の人工骨（１）。

【請求項6】

前記炭素質薄膜（１０）は前記基材（２）の外面から０．３ｍｍ以上の深さの前記気孔（６）の壁面（７）に到るまで形成されていることを特徴とする請求項１～請求項５のいずれか１つの項に記載の人工骨（１）。

【請求項7】

前記炭素質薄膜（１０）は前記基材（２）の外面から１ｍｍ以上の深さの前記気孔（６）の壁面（７）に到るまで形成されていることを特徴とする請求項６に記載の人工骨（１）。

【請求項8】

前記炭素質薄膜（１０）は前記基材（２）の中心部に位置する前記気孔（６）の壁面（７）に到るまで形成されていることを特徴とする請求項１～請求項７のいずれか１つの項に記載の人工骨（１）。

【請求項9】

前記炭素質薄膜（１０）は厚さが０．１μｍ以上３．０μｍ以下であることを特徴とする請求項１～請求項８のいずれか１つの項に記載の人工骨（１）。

【請求項10】

請求項１に記載の人工骨（１）の製造方法であって、
前記基材（２）を準備する工程と、
炭化水素、及び、窒素原子を含む分子を含むプラズマを用いた化学気相堆積法により、前記基材（２）の外面及び前記気孔（６）の壁面（７）に前記炭素質薄膜（１０）を形成する工程とを含むことを特徴とする人工骨（１）の製造方法。

【請求項11】

前記窒素原子を含む分子は、アンモニアを含む請求項１０に記載の人工骨（１）の製造方法。

【請求項12】

前記窒素原子を含む分子は、シクロプロピルアミンを含む請求項１０に記載の人工骨（１）の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、多孔質セラミックスを含む人工骨、及び人工骨の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

人工歯根等のインプラント材料において、その表面に炭素質薄膜を備えたものが公知である（例えば、特許文献１）。特許文献１のインプラント材料において、炭素質薄膜は酸素を含む官能基（カルボキシル基）と、窒素を含む官能基（アミノ基）とを含んでいる。カルボキシル基及びアミノ基との比を所定の値とすることによって、破骨細胞への分化を抑制できると共に、骨芽細胞への分化を促進することができる。

【0003】

多孔質構造を有する人工骨（例えば、特許文献２）が知られている。特許文献２の人工骨においては、骨を形成する細胞が孔内に入り込むことによって、骨組織形成が早期になされる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】特開２０１１－４５５５９号公報

【文献】特開２００３－３８６３６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

特許文献１の人工骨では、官能基が炭素質薄膜の表面に設けられているため、炭素質薄膜の表面が血液等によって削られると、人工骨と骨を形成する細胞との親和性が低下するという問題があった。

【0006】

本発明は、以上の背景を鑑み、多孔質構造を有する人工骨において骨を形成する細胞との親和性を高めることを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記課題を解決するために本発明のある態様は、人工骨（１）であって、互いに連通する複数の気孔（６）を備えた多孔質セラミックスを含む基材（２）と、前記基材の外面及び前記気孔の壁面（７）に形成された炭素質薄膜（１０）と、前記炭素質薄膜の表面及び内部にアミノ基（１２）を含む官能基（１３）とを有することを特徴とする。

【0008】

この構成によれば、炭素質薄膜の表面及び内部にアミノ基が設けられるため、炭素質薄膜の表面が血液等によって削られたときに、炭素質薄膜の内部に設けられたアミノ基が露出するため、炭素質薄膜の表面が削られることによる人工骨と骨を形成する細胞との親和性が低下を防止することができる。また、気孔の壁面に炭素質膜が形成され、その炭素質膜の表面および内部にアミノ基が形成されるため、基材の内部においても人工骨と骨を形成する細胞との親和性を高めることができる。

【0009】

上記の態様において、前記炭素質薄膜の表面及び内部における窒素の存在比は少なくとも３％以上であるとよい。

【0010】

この構成によれば、炭素質薄膜に人工骨と骨を形成する細胞との親和性を持たせるために十分なアミノ基を設けることができる。

【0011】

上記の態様において、前記炭素質薄膜の表面及び内部における窒素の存在比は少なくとも１０％以上であるとよい。

【0012】

この構成によれば、炭素質薄膜に人工骨と骨を形成する細胞との親和性を高めるために要するより十分な量のアミノ基を設けることができる。

【0013】

上記の態様において、前記気孔は直径の平均が５０μｍ以上６００μｍ以下の略球状をなし、２つの前記気孔を連通させる気孔間連通部（８）は直径の平均が、５μｍ以上の略円形をなすとよい。

【0014】

この構成によれば、骨を形成する細胞を基材の内部に入り込ませることができ、且つ、製造工程において、炭素質薄膜をより基材の内部の気孔の壁面に形成することができる。

【0015】

上記の態様において、前記炭素質薄膜の少なくとも一部は前記基材の外面から１ｍｍ以上の深さの前記気孔の壁面（７）に形成されているとよい。

【0016】

この構成によれば、骨を形成する細胞が基材の内部に入り込み易くなるため、人工骨と骨を形成する細胞との親和性がより高められる。

【0017】

上記の態様において、前記炭素質薄膜は前記基材の中心部に位置する前記気孔の壁面に到るまで形成されているとよい。

【0018】

この構成によれば、人工骨の内部全体において骨を形成する細胞との親和性を高めることができ、骨組織形成をより早めることができる。

【0019】

上記の態様において、前記炭素質薄膜はポリマー膜であるとよい。

【0020】

この構成によれば、高エネルギーイオンを入射することによって、炭素質薄膜を硬化させる工程を要することなく、炭素質薄膜を形成することができるため、人工骨の製造工程が簡素になる。

【0021】

上記課題を解決するために本発明のある態様は、人工骨（１）の製造方法であって、互いに連通する複数の気孔（６）を備えた多孔質セラミックスを含む基材（２）を準備する工程と、炭化水素、窒素原子を含む分子、及び不活性ガスを含むプラズマを用いた化学気相堆積法により、前記基材の外面及び前記気孔の壁面（７）に炭素質薄膜（１０）を形成する工程とを含むことを特徴とする。

【0022】

この構成によれば、炭素質薄膜を成膜すると共に、炭素質薄膜にアミノ基を同時に結合させることができる。すなわち、炭素質薄膜の表面及び内部にアミノ基を設けることができる。これにより、炭素質薄膜の表面が削られた場合であっても、炭素質薄膜の表面にアミノ基が設けられた状態が維持される。よって、炭素質薄膜の表面が削られることによる人工骨と骨を形成する細胞との親和性が低下を防止することができ、骨を形成する細胞と親和性の高い人工骨をより簡素に製造することができる。

【発明の効果】

【0023】

以上の構成によれば、多孔質構造を有する人工骨において骨を形成する細胞との親和性を高めることができる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】実施形態に係る（Ａ）人工骨の模式図、（Ｂ）人工骨の気孔部分を示す模式図、（Ｃ）人工骨の表面の拡大図、及び、（Ｄ）気孔部分の拡大図

【図2】炭素質薄膜の内部の模式図

【図3】実施形態に係る人工骨の製造に用いられるプラズマ装置の概略図

【図4】基材（比較例）の表面、及び人工骨（実施例１、実施例２、及び実施例３）の表面の炭素質薄膜表面における元素（カルシウム（Ｃａ）、リン（Ｐ）、酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ））の存在比を示すグラフ

【図5】人工骨（実施例２）の表面の炭素質膜表面および内部における元素の存在比の深さ分布を示すグラフ

【図6】（上段）３つの基材、（下段）実施例２の３つの試料に対する４日目におけるＡＬＰ染色実験の結果を示す写真

【図7】比較例の試料及び実施例２の試料それぞれに細胞懸濁培養液を滴下後、２時間経過したときにカウントされた細胞接着数を示すグラフ

【図8】（Ａ）試料１～試料３の元素の存在比を示すグラフ、（Ｂ）プラズマ照射時間を０分、１０分、３０分、及び、９０分とした場合の元素の存在比を示すグラフ、及び、（Ｃ）炭素質薄膜の厚さのプラズマ照射時間依存性を示すグラフ

【図9】実施例２の人工骨１のＣａ（カルシウム）、リン（Ｐ）、酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、及び窒素（Ｎ）の存在比の深さ依存性を示すグラフ

【図10】人工骨と骨芽細胞様細胞との親和性の評価の手順（Ａ）～（Ｄ）を説明するための説明図

【図11】骨芽細胞様細胞の継続培養後の（Ａ）実施例２の人工骨、及び（Ｂ）基材２の染色後の切断面の写真

【図12】（Ａ）基材、（Ｂ）オートクレーブ滅菌後の人工骨、及び（Ｃ）オートクレーブ滅菌処理なしの人工骨に対応するＡＬＰ活性を示すグラフ

【図13】ＳＤラットに移植した（Ａ）基材の側面、（Ｂ）基材の正面、（Ｃ）実施例２の人工骨の側面、及び（Ｄ）実施例２の人工骨の正面に対応するＸ線写真

【図14】ＳＤラットに移植した（Ａ）基材の染色後の断面図の写真、及びその（Ｂ）破線及び（Ｃ）二点鎖線で囲まれる部分の拡大図と、（Ｄ）実施例２の人工骨の染色後の断面図の写真、及びその（Ｅ）破線及び（Ｆ）二点鎖線で囲まれる部分の拡大図

【発明を実施するための形態】

【0025】

以下、本発明に係る人工骨について説明する。

【0026】

図１（Ａ）に示すように、人工骨１はその母材となる基材２を含む。基材２は多孔質セラミックスを主成分として含んでいる。多孔質セラミックスは、ハイドロキシアパタイト、β―ＴＣＰ（β-リン酸三カルシウム）、又は、ハイドロキシアパタイト及びβ―ＴＣＰの混合物によって形成されるとよい。

【0027】

図１（Ｂ）に示すように、本実施形態では基材２は略直方体状をなしている。基材２は複数の気孔６を含み、多孔質構造をなしている。気孔６はそれぞれ孔壁面７によって画定され、略球状をなしている。気孔６の直径の平均は５０μｍ以上６００μｍであり、より好ましくは８０μｍ以上３００μｍである。本実施形態では、気孔６の直径の平均は１５０μｍとなっている。気孔６は気孔間連通部８を介して互いに連通している。気孔間連通部８はそれぞれ略円形をなしている。気孔間連通部８の直径の平均は５μｍ以上であり、より好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下である。本実施形態では、気孔間連通部８の直径の平均は４０μｍとなっている。但し、気孔６の直径の平均は、基材２を樹脂中に包埋したものを研磨して、電子顕微鏡等で観察し、画像解析によりほぼ球状の気孔６を選択して、その気孔面積を測定することによって算出される。気孔面積は少なくとも３００個以上の気孔６の気孔面積を測定して平均することによって算出されることが望ましい。ここで求められる気孔面積は、ほぼ球状の気孔６の一部を通過する平面での断面であり、気孔６の直径ではないため、三次元的な補正を行うとよい。気孔間連通部８の平均直径は、公知の水銀圧入法を用いて測定するとよい。水銀圧入法が適用できない場合、基材２の断面を電子顕微鏡で観察し、気孔間連通部８の直径を測定して、その平均を平均直径として算出するとよい。また、基材２における気孔率は６０％以上９０％以下であることが好ましく、生体組織が進入可能な気孔体積が５０％となっているとよい。但し、気孔率は、基材２と同一組織を有する焼結体を作製し、真密度計を用いて求められた焼結体の真密度（ρ*）と、基材２の寸法から体積を求め、その重量を体積で除して得られた密度（ρ）とを用いて、１－ρ/ρ*として算出されるとよい。

【0028】

基材２の外面及び孔壁面７には、図１（Ｃ）及び（Ｄ）に示すように、それぞれ炭素質薄膜１０が設けられている。炭素質薄膜１０の少なくとも一部は、基材２の外面（表面のうち外輪郭を画定する面）から所定の深さ（吸着深さ）に位置する孔壁面７にまで形成されている。吸着深さは少なくとも０．３ｍｍ以上であり、好ましくは少なくとも１ｍｍ以上である。更に好ましくは吸着深さは２ｍｍ以上である。本実施形態では、吸着深さは２ｍｍ程度となっている。

【0029】

また、炭素質薄膜１０は基材２の中心部に位置する気孔６の壁面に到るまで形成されていることが好ましい。これにより、基材２の外面から最も深い所に位置する気孔６の壁面、すなわち孔壁面７に形成されていることがより好ましい。

【0030】

ここでいう深さとは試料の端（外面）に位置する基点からの距離を指す。基点はカメラを用いて試料の端の大体の位置を割り出し、その付近において、ランダムに複数の点においてＸＰＳを測定した後、その複数の点の中から最もＸＰＳの信号が取れた点によって定める。

【0031】

炭素質薄膜１０は炭化水素のポリマー膜であって、その厚さが０．１μｍ以上３．０μｍ以下であることが好ましい。炭素質薄膜１０はダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）膜であってもよい。

【0032】

炭素質薄膜１０はその表面及び内部（図２参照）に、アミノ基１２（第１級アミン－ＮＨ_２、第２級アミン－ＮＨ、又は第３級アミン－Ｎ）を含む官能基１３（図２の二点鎖線によって囲まれる部分を参照）を有している。アミノ基１２は炭素質薄膜１０の内部において概ね一様に設けられている。

【0033】

但し、本明細書においては、第１級アミン、第２級アミン、及び第３級アミンを総称してアミノ基と記載する。（ここでいうアミノ基１２には、より厳密には、アンモニア、第１級アミン又は第２級アミンから水素を除去した１価の官能基（－ＮＨ_２，－ＮＨＲ，－ＮＲＲ´）（Ｒは炭化水素残基）を意味する。本明細書においては、必要に応じて、アンモニアから水素を除去した１価の官能基を第１級アミン（－ＮＨ_２）と記載し、第１級アミンから水素を除去した１価の官能基を第２級アミン（－ＮＨ）と記載し、第２級アミンから水素を除去した１価の官能基（－Ｎ）を第３級アミンと記載する。）

【0034】

官能基１３には酸素を含む官能基であるカルボキシル基１４（－ＣＯＯＨ）が含まれていてもよい。また、人工骨１と骨を形成する細胞との親和性を高めるために要する十分な量のアミノ基１２を炭素質薄膜１０に設けるため、炭素質薄膜１０の表面及び内部における窒素の存在比（炭素、酸素等を含んだ炭素質薄膜１０における窒素の存在比）は、３％以上であるとよく、より好ましくは１０％以上であるとよい。より詳細には、各元素の存在比はＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）を用いて得られた光電子のエネルギースペクトルに基づいて定めるものとし、対象となる点を中心としてＸＰＳで用いられるＸ線のスポット径（２ｍｍ～１ｃｍ程度）を直径とする球体内に位置する全原子に対する各元素の原子の割合に相当する。

【0035】

次に、人工骨１の製造方法について説明する。人工骨１の製造には、図３に模式的に示すプラズマ装置２０が使用される。プラズマ装置２０は真空チャンバ２１（以下、チャンバ）を有し、チャンバ２１の内部には上下に対をなす円板状の平行平板電極２２、２３が設けられている。下側の平板電極２２は接地され、上側の平板電極２３には電圧発生器２４が接続されている。チャンバ２１はチャンバ２１内を排気するための真空ポンプ２５に接続されている。

【0036】

人工骨１の製造時には、まず、基材２を下側の平板電極２２の上に配置した後、真空ポンプ２５によって、チャンバ２１を真空排気することにより、成膜するための準備を行う（準備工程）。

【0037】

次に、チャンバ２１の内部を排気しつつ、窒素、炭化水素を含むガス、及び不活性ガスをそれぞれチャンバ２１の内部にそれぞれ一定流量で導入する。炭化水素を含むガスとしてはメタンガスを用いるとよい。このように、小分子量の炭化水素を用いることによって、炭化水素の分子量を小さくできるため、他の炭化水素を使用するよりも、基材２の外面からより深くに炭化水素が侵入し易くなる。また、不活性ガスとしてはヘリウムガス又はアルゴンガスを用いるとよい。

【0038】

次に、上側の平板電極２３に電圧発生器２４から所定の電圧を印加し、平板電極２２、２３の間にプラズマを発生させる。プラズマを発生させる条件は公知のものであってよく、たとえば、窒素ガスの流量は５ｓｃｃｍ、メタンガスの流量を５ｓｃｃｍ、ヘリウムガス又はアルゴンガスの流量は５ｓｃｃｍに設定されているとよい。より詳細なプラズマを発生させる条件については、Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ Ｙ， Ｌｅｅ Ｄ－Ｓ， Ｃｈｉｊｉｍａｔｓｕ Ｒ， Ｔｈａｍｉｎａ Ｋ， Ｍａｓｕｄａ Ｋ， Ｉｔｓｕｋｉ Ｄ， ｅｔ ａｌ． （２０１８） Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌ ｐｌａｓｍａ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｏｒｏｕｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ｃｅｒａｍｉｃｓ ｆｏｒ ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． ＰＬｏＳ ＯＮＥ １３（３）： ｅ０１９４３０３．を参考にするとよい。

【0039】

上側の平板電極２３に電圧が印加されると、チャンバ２１内の窒素分子および炭化水素を含むガスの一部は解離して化学的に活性なラジカルとなる。また、平板電極２２、２３の間に生じた電界によって加速された電子と衝突することにより、プラズマ中の分子やラジカルの電子状態が励起されて化学的にさらに活性となりえる。活性化したこれらの化学種（プラズマ中の分子やラジカル）は基材２の外面及び、基材２の外面から所定の深さまでの孔壁面７に吸着し、炭素質薄膜１０を形成する（成膜工程）。すなわち、成膜工程において、窒素、炭化水素（メタン）、及び不活性ガス（ヘリウム又はアルゴン）を含むプラズマを用いた、化学気相堆積法の一つであるいわゆるプラズマＣＶＤによって炭素質薄膜１０が成膜される。

【0040】

成膜工程においては、窒素が一定流量で導入されているため、炭素質薄膜１０はアミノ基１２によって終端されつつ成膜される。これにより、アミノ基１２は炭素質薄膜１０の表面及び内部に概ね一様に分布する。

【0041】

成膜工程を所定時間継続することによって、基材２の外面、及び外面から少なくとも０．３ｍｍ以上、より好ましくは１ｍｍ以上の深さまでの孔壁面７に形成された炭素質薄膜１０の表面及び内部にアミノ基１２が設けられる。

【0042】

このように、孔壁面７に形成された炭素質薄膜１０の表面及び内部にアミノ基１２を設けることによって、孔壁面７と骨を形成する細胞との親和性が高められる。これによって、骨を形成する細胞が基材２の内部に入り込み易くなり、気孔６の内部においても骨を形成する細胞と人工骨１とが結合し易くなる。

【0043】

また、炭素質薄膜１０は基材２の中心部に位置する気孔６の壁面に到るまで形成されているとよい。より詳細には、炭素質薄膜１０は基材２の外面から最も深い所に位置する気孔６の壁面（孔壁面７）に達していることがより好ましい。これにより、人工骨１の内部に形成されたいかなる深さの気孔６にも炭素質薄膜１０が形成される。よって、人工骨１が血液などによって削られた場合であっても細胞との親和性を保つことができるとともに、人工骨１の内部全体において骨を形成する細胞との親和性を高めることができる。

【0044】

また、成膜工程では、炭素質薄膜１０がポリマー膜として形成されればよく、必ずしもダイヤモンドライクカーボンとして形成されることを要しない。これにより、ダイヤモンドライクカーボンを形成するときのように高エネルギーイオンを入射することによって、炭素質薄膜１０を硬化させる工程を要せず、より簡素な工程によって炭素質薄膜１０を形成することができる。

【0045】

成膜工程が完了した後、チャンバ２１の内部を排気する。その後、チャンバ２１の内部に窒素又は大気等を導入して、チャンバ２１をベントし、基材２を取り出す（取出工程）ことによって、人工骨１の製造が完了する。

【0046】

次に本発明に係る人工骨１の効果について説明する。上記の製造工程を行うことによって、多孔質のハイドロキシアパタイトからなる基材２を導入してメタン、窒素及びアルゴンを導入して３０分プラズマ照射した人工骨１（実施例１）、同様の基材２にメタン、窒素及びヘリウムを導入して３０分プラズマ照射した人工骨１（実施例２）、及び同様の基材２にメタン、窒素及びヘリウムを導入して２０分プラズマ照射した人工骨１（実施例３）を用意した。但し、実施例１、実施例２、及び実施例３において、メタンの流量、アルゴンの流量、及びヘリウムの流量は同一に設定した。また、実施例１の窒素ガスの流量は、他のガスの流量と同じであり、実施例２及び実施例３の成膜工程においては、窒素ガスの流量を実施例１の場合に比べて２倍にした。また、実施例２では、プラズマ照射時のチャンバ内の圧力を実施例1及び実施例３の場合の７割に設定した。また、実施例１～実施例３の人工骨１の製造には、半径５ｍｍ、厚さ２ｍｍの円柱状の基材２を用いた。

【0047】

次に、基材２（比較例）の表面と、実施例１、実施例２、及び実施例３の外面に設けられた炭素質薄膜１０の表面とにおけるカルシウム（Ｃａ）、リン（Ｐ）、酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、及び窒素（Ｎ）の存在比（％）をそれぞれ、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって測定して、図４に示した。より具体的には、ＸＰＳ装置である株式会社島津製作所製のＥＳＣＡ８５０Ｍを用い、各試料の表面にＭｇＫα線（１２５３．６ｅＶ）を照射して、生じた光電子のエネルギースペクトルを測定することによって、各原子の存在比（％）を算出した。なお、ＸＰＳでは水素を検出できないので、図４では水素の存在比は無視されている。また、ＥＳＣＡ８５０Ｍでは、Ｘ線のスポット径は１ｃｍ程度となっている。

【0048】

図４に示すように、実施例１、実施例２、及び実施例３においてそれぞれ、比較例に比べてリン及び酸素の存在比が減少している。これは、実施例１、実施例２及び実施例３の基材２の表面が炭素質薄膜１０によって覆われて、下地となる基材２（ハイドロキシアパタイト）を構成する原子から放出される光電子が少なくなっていることを示している。また、実施例１、実施例２及び実施例３においてそれぞれ、比較例に比べて炭素及び窒素の存在比が増加している。これは、実施例１、実施例２及び実施例３の表面に形成された炭素質薄膜１０にアミノ基１２が設けられていることを示している。

【0049】

実施例２、実施例２、実施例３において、窒素の存在比に比べて酸素の存在比は少ないことから、炭素質薄膜１０の表面には、カルボキシル基１４はアミノ基１２の数に比べて少ないと推察される。

【0050】

炭素質薄膜１０の成膜時に窒素が導入されているため、炭素質薄膜１０の表面のみならず、内部にもアミノ基１２を構成する窒素原子が存在していることが期待できる。これを確かめるため、実施例２の炭素質薄膜１０をアルゴンイオンビームよってエッチングしながら、株式会社島津製作所製のＥＳＣＡ８５０Ｍを用いてカルシウム（Ｃａ）、リン（Ｐ）、酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、及び窒素（Ｎ）の存在比を測定した。図５には、測定された各元素の存在比のエッチング深さ依存性、すなわち、人工骨１（実施例２）の外面に設けられた炭素質薄膜１０の表面および内部における元素の存在比の深さ分布を示すグラフが示されている。図５から、窒素の存在比が炭素質薄膜１０の表面から１００Å（０．０１μｍ）の深さまで概ね一定であることが分かる。これにより、炭素質薄膜１０の表面及び内部にアミノ基１２が設けられていることが確かめられる。このように、窒素、炭化水素、及びアルゴンを含むプラズマを用いることによって、炭素質薄膜１０の表面及び内部にアミノ基１２を設けることができる。これにより、炭素質薄膜１０の表面が血液等によって削られた場合でも、アミノ基１２が炭素質薄膜１０の表面に露出して、炭素質薄膜１０の表面にアミノ基１２が設けられた状態が維持されるため、人工骨１と骨を形成する細胞との親和性を維持することができる。

【0051】

本実施形態では、成膜時に窒素の流量が一定に保たれているため、アミノ基１２は炭素質薄膜１０の表面及び内部において概ね一様に分布している。そのため、炭素質薄膜１０の削られた量によらず、人工骨１と骨を形成する細胞との親和性が概ね一定に保たれる。

【0052】

人工骨１と骨を形成する細胞との親和性を持たせるため、炭素質薄膜１０の表面及び内部における窒素の存在比は３％以上、より好ましくは１０％以上であるとよい。これにより、炭素質薄膜１０に人工骨１と骨を形成する細胞との親和性を持たせるために十分なアミノ基１２を設けることができる。

【0053】

本実施形態では、窒素の存在比はそれぞれ、１０．２％（実施例１）、１７％（実施例２）、及び１３％（実施例３）となっている。これにより、人工骨１と骨を形成する細胞との親和性が高められている。実施例１～実施例３において窒素の存在比は１０％以上であることから、炭素の存在比に対する窒素の存在比もまた、それぞれ１０％以上となっている。

【0054】

次に、炭素質薄膜１０を設けることによる効果を確かめるため、比較例の３つの試料、及び実施例２の３つの試料を用いて、マウス骨芽細胞様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅを用いてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色実験を行った。図６に示すように、４日目におけるＡＬＰ染色実験においては、上段に示す比較例の場合には、ＡＬＰ染色ではほとんど染色が認められない。一方、下段に示す実施例２の３つの試料においてそれぞれ、ＡＬＰ染色が認められる。これにより、炭素質薄膜１０を設けることによって、骨芽細胞の増殖及び分化が促進され、骨を形成する細胞との親和性を高められていることが確認された。

【0055】

さらに、炭素質薄膜１０を設けることによる効果を確かめるため、マウス骨芽細胞様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅを用いた細胞接着を評価する実験を行った。細胞懸濁培養液を実施例２及び比較例のそれぞれの試料に滴下し、２時間後にそれぞれの試料に接着した細胞の数（接着細胞数）をカウントした。図７に示すように、実施例２の試料では、比較例の試料に比べて有意に接着細胞数が増加していることから、炭素質薄膜１０を設けることによる細胞接着促進効果が確認された。

【0056】

成膜時の窒素の導入によってアミノ基１２が炭素質薄膜１０に形成されることを確認するため、窒素流量のみを変更して成膜を行うことによって、３つの試料（試料１、試料２，試料３）を作成した。但し、試料１は、基材２の代わりにシリコンウエハを用いたこと、及びアルゴンの代わりにヘリウムを用いたこと以外は、実施例１と同様のプラズマ条件によって３０分プラズマ照射することによって作製した。試料２は、シリコンウエハに、試料１の作成時のプラズマ条件において、窒素の流量のみを倍に変更して３０分プラズマ照射することによって作製した。試料３は、シリコンウエハに、試料１の作成時のプラズマ条件において、窒素の流量のみを０に変更して３０分プラズマ照射することによって作製した。但し、試料１～試料３は、シリコンウエハ上にプラズマを照射することによって作製されているが、シリコンウエハを用いた場合であっても、基材２を用いた場合と同様の組成の炭素質薄膜１０が形成される。成膜後、試料１～３のそれぞれの表面に成膜された炭素質薄膜１０に対してＸＰＳを測定した。但し、ＸＰＳの測定には、株式会社島津製作所製のＫＲＡＴＯＳ ＡＸＩＳ－１６５Ｘを用いた。ＫＲＡＴＯＳ ＡＸＩＳ－１６５Ｘでは、Ｘ線のスポット径は２ｍｍ程度となっている。

【0057】

図８（Ａ）には、ＸＰＳのＣ（炭素）１ｓスペクトル、Ｎ（窒素）１ｓスペクトル、Ｏ（酸素）１ｓスペクトル、Ｓｉ（シリコン）２ｐスペクトルに基づいて得られた試料１～３の炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及びシリコン（Ｓｉ）の存在比（％）が示されている。試料３では窒素の存在比がおおむね０％であり、試料１、及び試料２では窒素の存在比が１０％以上であることが確認できる。これにより、成膜時の窒素の導入によって、窒素の存在比が０％より大きな有意な値（例えば、３％以上、より明瞭には１０％以上）となり、窒素の流量が増加するにつれて、窒素の存在比が増加することが確認できる。

【0058】

次に、アミノ基１２が炭素質薄膜１０の内部に設けられていることを更に確認するため、試料１作成時のプラズマ条件を用い、プラズマ照射時間を変えて、シリコンウエハにプラズマ照射を行った。その後、ＫＲＡＴＯＳ ＡＸＩＳ－１６５Ｘを用いてＸＰＳを測定して、各元素の存在比を求めた。図８（Ｂ）には、プラズマ照射時間を０分（すなわち、プラズマ照射なし）、１０分、３０分、及び９０分とした場合の炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及びシリコン（Ｓｉ）の存在比（％）が示されている。但し、存在比の算出には、図８（Ａ）と同様に、Ｃ（炭素）１ｓスペクトル、Ｎ（窒素）１ｓスペクトル、Ｏ（酸素）１ｓスペクトル、Ｓｉ（シリコン）２ｐスペクトルを用いた。図８（Ｂ）に示すように、窒素の存在比は約１２％で一定であり、窒素の存在比はプラズマの照射時間に依存しないことが分かる。図８（Ｃ）に示すように、プラズマの照射時間に応じて、炭素質薄膜１０の厚さは単調に増加していくことから、炭素質薄膜１０の内部においても窒素、すなわち、アミノ基１２が均一に存在していることが確認できる。

【0059】

次に、実施例２の人工骨１のＣａ（カルシウム）、リン（Ｐ）、酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、及び窒素（Ｎ）の存在比の深さ依存性を評価して、図９に示すグラフを得た。但し、存在比はＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）を用いて得られた光電子のエネルギースペクトルに基づいて定めるものとし、測定にはＰＨＩ社製のＱｕａｎｔｅｒａＳＸＭを用いた。但し、深さの基準（すなわち深さ０の点）である基点を、ＱｕａｎｔｅｒａＳＸＭに付属のカメラによって、測定対象である実施例２の人工骨１の上端の大体の位置を割り出し、その付近において、ランダムに複数の点においてＸＰＳを測定した後、その複数の点の中から最もＸＰＳの信号が取れた点によって定めた。

【0060】

図９に示すように、炭素及び窒素の存在比は上面側で最も高く、０～０．５ｍｍの深さまでは深くなるにつれてともに減少している。その後、下面近傍（～２ｍｍ）で、炭素及び窒素はどちらも僅かに増加する傾向が確認できる。窒素は０～０．５ｍｍの深さまでは深くなるにつれて減少していること、また、成膜工程を行わない場合には窒素の存在比は０．５％程度であることから、成膜工程の結果、窒素が深さ０．５～１．０ｍｍまで存在していることが確認できた。これにより、実施例２の人工骨１において、アミノ基１２は０．５～１．０ｍｍの深さまで形成されているといえる。

【0061】

次に、人工骨１と骨を形成する細胞である骨芽細胞様細胞との親和性の評価を行った。まず、製造から１カ月経過した実施例２の人工骨１をオートクレーブ滅菌した。滅菌後、１日経過した人工骨１の上面に、マウス骨芽細胞様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１を含む細胞懸濁液（３×１０^５ｃｅｌｌｓ／３５μｌ）を滴下し（図１０（Ａ）を参照）、約１時間接着させた（図１０（Ｂ）参照）。接着後、人工骨１をシャーレに収容し、さらに培地を入れて、約２時間継続培養を行った（図１０（Ｃ）参照）。その後、人工骨１を取出し、Ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ染色した。その後、染色後の人工骨１を中央で切断し、図１１（Ａ）に示す切断面の画像を得た。同様の処理を、基材２に対しても行い、図１１（Ｂ）に示す切断面の画像を得た。図１１（Ｂ）では、図１１（Ａ）に比べて内部が染色されていることから、骨を形成する細胞が人工骨１に侵入し易いことが確認できる。

【0062】

さらに、基材２、オートクレーブ滅菌後の実施例２の人工骨１、及び、オートクレーブ滅菌処理なしの実施例２の人工骨１をそれぞれ、図１０に示す処理を行った後、ＡＬＰ活性を測定した。図１２（Ａ）は基材２、（Ｂ）はオートクレーブ滅菌後の実施例２の人工骨１、（Ｃ）はオートクレーブ滅菌なしの実施例２の人工骨１それぞれにおいて測定されたＡＬＰ活性値を示している。図１２（Ａ）と、図１２（Ｃ）とを比較することによって、人工骨１は基材２に比べて、骨を形成する細胞との親和性が高いことが確認できる。また、図１２（Ｂ）と（Ｃ）とを比較することによって、オートクレーブ滅菌処理を行った場合でも、人工骨１と骨を形成する細胞との親和性が大きくは低下していないことから、人工骨１の内部に骨を形成する細胞が侵入していることを示している。

【0063】

さらに、人工骨１と骨を形成する細胞との親和性を評価するため、基材２、及び実施例２の人工骨１をそれぞれオートクレーブ滅菌後、生後１０週齢のオスのＳＤラットのホストとなる骨に移植し、術後６週間にレントゲン撮影を行った。図１３（Ａ）及び（Ｂ）は基材２、図１３（Ｃ）及び（Ｄ）は実施例２の人工骨１に対応するＸ線写真である。図１３（Ａ）及び（Ｃ）や、図１３（Ｂ）及び（Ｂ）の破線で囲まれた部分から、骨を形成する細胞が内部に侵入することによって、基材２に対して実施例２の人工骨１では内部が白くなっていることが確認できる。よって、基材２に比べて人工骨１において骨を形成する細胞が侵入し易いことが確認できる。

【0064】

図１４には移植後の（Ａ）基材２、及び（Ｄ）実施例２の人工骨１をそれぞれＳＤラットから取り出し、染色した後の写真が示されている。図１４（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれ移植後の基材２の中央部（図１４（Ａ）の破線で囲まれる部分）、及びラットの骨との接触部分（図１４（Ａ）の一点鎖線で囲まれる部分）の拡大写真である。図１４（Ｅ）及び（Ｆ）はそれぞれ移植後の実施例２の人工骨１の中央部（図１４（Ｄ）の破線で囲まれる部分）、及びラットの骨との接触部分（図１４（Ｄ）の一点鎖線で囲まれる部分）の拡大写真である。図１４（Ｂ）では、気孔６の内部は線維組織が主体であって骨形成は少量のみ確認されるのに対して、図１４（Ｅ）では、大部分の気孔内への骨形成が確認できた。また、図１４（Ｃ）では、ホスト骨界面には線維組織が介在し、偽関節となっているのに対し、図１４（Ｆ）では、ホスト骨界面での骨癒合が確認できる。

【0065】

以上で具体的実施形態の説明を終えるが、本発明は上記実施形態に限定されることなく幅広く変形実施することができる。上記実施形態において、基材２は略直方体状であったが、これには限定されず、例えば、基材２は顆粒状、円柱状、又は柱状であってもよい。

【0066】

成膜工程において、チャンバ２１の内壁に吸着した酸素やチャンバ２１のリーク等によってカルボキシル基１４が形成される虞がある場合には、平板電極２２、２３に電圧を印加する前に、不活性ガスを流した状態で５分～１０分程度維持するとよい。これによって、チャンバ２１の内部が不活性ガスによって換気され、酸素濃度が低下するため、炭素質薄膜１０にカルボキシル基１４が結合され難くなる。また、成膜工程の前に、チャンバ２１の内部を不活性ガス（例えば、アルゴン）によって置換し、真空ポンプ２５によって排気する工程（パージ・フラッシュ）を複数回繰り返すことによって、チャンバ２１の内部の酸素濃度を低下させてもよい。

【0067】

上記実施形態では、炭素質薄膜１０はポリマー膜であったが、これには限定されず、いかなる態様の薄膜であってもよい。炭素質薄膜１０は例えば、グラファイト状炭素、アモルファス炭素であってもよい。

【0068】

上記実施形態では、炭化水素、不活性ガス、及び窒素を含むプラズマを用いた化学気相堆積法により、表面及び内部にアミノ基１２を含む官能基１３を有する炭素質薄膜１０を成膜していたが、この方法には限定されない。例えば、窒素の代わりに窒素原子を含有する分子を含むガスを用いればよく、窒素、アンモニア、シクロプロピルアミンからなる群から選択された少なくとも１種類の分子を含むガスを用いてもよい。窒素、アンモニア、シクロプロピルアミンからなる群から選択された少なくとも１種類の分子を含むガス用いることで、炭素質薄膜１０の表面及び内部にアミノ基１２をより確実に設けることができる。

【0069】

上記実施形態では、炭化水素としてメタンが用いられていたが、この態様には限定されず、例えば、エタンやプロパン、エチレンであってもよい。

【0070】

上記実施形態では、炭素質薄膜１０の表面及び内部における窒素の存在比（炭素、酸素等を含む炭素質薄膜１０における窒素の存在比）に基づいて、人工骨１と骨を形成する細胞との親和性を評価したが、この態様には限定されない。例えば、炭素質薄膜１０の表面及び内部における炭素の存在比に対する窒素の存在比の比率に基づいて評価を行ってもよく、この場合は、炭素質薄膜１０の表面及び内部における窒素の存在比が、炭素の存在比の少なくとも１０％以上であるとよい。

【符号の説明】

【0071】

１ ：人工骨
２ ：基材
６ ：気孔
７ ：孔壁面
８ ：気孔間連通部
１０ ：炭素質薄膜
１２ ：アミノ基
１３ ：官能基

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】